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Grundlagen: Ampicillin Plasmid ohne Resistenzgenen Bakterien besitzen die Fähigkeit Antibiotika In ihrer Wirkung abzuschwächen oder total unwirksam zu machen. Die dafür notwendige Information findet sich auf den sogenannten Resistenzgenen. Befindet sich innerhalb des Resistenzgens eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym, so kann das Plasmid für die Identifizierung transformierte Bakterien verwendet werden. Tetracyclin Plasmid mit Resistenzgenen Öffnung des Plasmidringes erfolgt innerhalb der Gensequenz für die Antibiotikaresistenz. Dadurch wird die Resistenz gegen Tetracyclin zerstört! Ablauf: Plasmid Fremdgen Restriktionsenzym Das Restriktionsenzym schneidet Plasmidring und Fremd-DNA an den durch das Restriktionsenzym bestimmten Stellen auf. TCGAATTCGC AGCTTAAGCG Ablauf: Plasmid Fremdgen Restriktionsenzym Das Restriktionsenzym schneidet Plasmidring und Fremd-DNA an den durch das Restriktionsenzym bestimmten Stellen auf. Dadurch entstehen sticky ends. Diese sind spiegelbildlich und lagern sich auf Grund des „klebrigen Effektes“ leicht wieder zusammen Jedoch ist auch der Einbau einer Fremd-DNA auf Grund der gleichartigen sticky ends möglich. TCGAATTCGC AGCTTAAGCG Im Versuchsansatz sind zwei strukturell unterschiedliche Plasmidringe vorhanden. Die Plasmidringe sollen nun in eine Bakterienzelle eingebracht werden Das Einbringen der Plasmide erfolgt durch eine Kombination von Hitze- und Kälteschock bei gleichzeitiger Zugabe von CalciumChlorid. Dies führt zu einer Perforation der Zellmembran, die das Eindringen erleichtert. Bakterienzelle Bakterienzelle Für den Wissenschaftler stellt sich nun die Frage welches Bakterium die Fremd-DNA enthält und damit transformiert ist. Die Lösung des Problems erfolgt mit Hilfe einer Stempeltechnik Die Bakteriensuspension, die beide Typen von Bakterien enthält, wird auf eine Agarplatte mit Ampicillin ausgebracht. Da beide resistent sind werden sie auf dem Nährboden heranwachsen. Durch Verwendung eines Stempels, der auf die Kolonien gedrückt wird, kann das Muster auf einen Nährboden übertragen werden der Tetracyclin enthält. Diejenigen Bakterien , die darauf heranwachsen sind nicht transformierte Zellen, da sie ihre Resistenz gegen Tetracylin noch besitzen. Die transformierten Bakterienzellen können nun aus dem Nährboden herausgestochen, in eine Nährlösung überführt und darin vermehrt werden. Sie stehen für weitere Experimente zur Verfügung.
