Der Einfluss chronischer Nachlasterhöhung auf die respiratorische

Aus der Abteilung Herz- und Gefäßchirurgie der Chirurgischen Universitätsklinik
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
Der Einfluss chronischer Nachlasterhöhung auf die
respiratorische Aktivität und Kontrolle von
isolierten Rattenherzmitochondrien
INAUGURAL – DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
Vorgelegt 2007
von Walid Fazeli
geboren in Bonn
Dekan: Prof. Dr. med. Christoph Peters
1. Gutachter: Prof. Dr. med. Torsten Doenst
2. Gutachter: Prof. Dr. med. Sven Dittrich
Jahr der Promotion: 2007
-1-
INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
2.
MATERIAL UND METHODEN
3
11
2.1 Material
11
2.1.1 Geräte
11
2.1.2 Tiere, Tierhaltung
12
2.1.3 Reagenzien
12
2.2 Methoden
3.
13
2.2.1 Chirurgische Eingriffe
13
2.2.2 Herstellung von Herzmuskelhomogenat
14
2.2.3 Isolation von Mitochondrien
15
2.2.4 Bestimmung der Citratsynthase- Aktivität
17
2.2.5 Polarographische Atmungsmessung
18
2.2.6 Statistik
24
ERGEBNISSE
25
3.1 Untersuchung eines Einflusses chronischer Nachlasterhöhung auf das Verhältnis von
25
Ventrikel- zu Körpergewicht
3.2 Untersuchung eines Einflusses chronischer Nachlasterhöhung auf das
26
Isolationsverfahren
3.3 Untersuchung eines Einflusses chronischer Nachlasterhöhung auf die
Atmungsaktivität isolierter Mitochondrien
30
4.
DISKUSSION
38
5.
ZUSAMMENFASSUNG
52
6.
LITERATURVERZEICHNIS
53
7.
CURRICULUM VITAE
61
8.
DANKSAGUNG
63
-2-
1. EINLEITUNG
Die Energie, die das Herz benötigt, um den Körper mit ausreichend Blut zu versorgen, hängt
direkt mit der Arbeitslast des Herzens zusammen. Bei Erhöhung der Arbeitslast nimmt der
Energiebedarf des Herzens zu, bei Erniedrigung der Arbeitslast nimmt der Energiebedarf ab.
Diese Energie wird in Form von ATP durch die Mitochondrien des Herzens bereitgestellt. Das
Herz verbraucht das ATP zu ADP. Die ATP- Regenerierung aus ADP ist eng an den
Sauerstoffverbrauch gekoppelt.
In dieser Arbeit wurde untersucht, inwiefern der Sauerstoffverbrauch der Mitochondrien in vitro
durch Veränderungen der Nachlast in vivo beeinflusst wird. Dabei wird angenommen, dass eine
langfristige Zunahme der Nachlast zu einer Erhöhung der maximalen Leistungsfähigkeit des
Herzens führt. Um den dadurch erhöhten Energieanforderungen gerecht zu werden, sollten die
Herzmitochondrien mehr ATP regenerieren können. Es wird vermutet, dass eine erhöhte ATPRegenerierung mit einer erhöhten maximalen respiratorischen Aktivität der Mitochondrien
einhergeht. Dabei ist bisher unklar, ob die beiden mitochondrialen Subgruppen SSM und IFM
durch Veränderungen der Arbeitslast in unterschiedlichem Ausmaß beeinflusst werden.
Zum Verständnis der in dieser Arbeit gesetzten Ziele, der verwendeten Methoden sowie der
beobachteten Ergebnisse ist eine kurze Darstellung über den Aufbau und die Funktion von
Mitochondrien und der in den Mitochondrien lokalisierten Atmungskette erforderlich.
-3-
Mitochondrien und ATP- Synthese
Der größte Teil der für den Stoffwechsel von Herzmuskelzellen benötigten Energie wird von
den Mitochondrien in Form von ATP zur Verfügung gestellt. Mitochondrien sind
Zellorganellen, in denen aus der Oxidation von Substraten Energie gewonnen wird. Sie sind ca.
2-4 µm lang und ca. 1 µm dick. Der Volumenanteil von Mitochondrien im Herzmuskel von
Säugetieren verhält sich umgekehrt proportional zum Körpergewicht und kann bis zu 40-50%
betragen (Hoppeler et al., 1984; Schwartz, 1971).
Für die Generierung von ATP ist eine intakte Mitochondrienstruktur nötig. Die Mitochondrien
besitzen eine äußere und eine innere Mitochondrienmembran. Zwischen diesen beiden
Membranen befindet sich der Intermembranraum. Die äußere Membran ist für kleine Moleküle
und für Ionen durchlässig, während die innere Membran für die meisten Moleküle, Ionen und
Protonen undurchlässig ist. Die innere Mitochondrienmembran, die die mitochondriale Matrix
umschließt, enthält die Proteinkomplexe der Atmungskette einschließlich der ATP- Synthase.
Sie ist sehr stark gefaltet. Herzmitochondrien haben eine große Oberfläche an innerer Membran
mit
vielen
Einbuchtungen
(Cristae)
und
einer
entsprechend
großen
Zahl
an
Atmungskettenproteinen. Die Mitochondrienmatrix enthält eine Reihe von Enzymkomplexen.
Hierzu gehören die Enzyme zur ß-Oxidation der Fettsäuren, die Pyruvatdehydrogenase für die
Oxidation von Pyruvat zu Acetyl- Coenzym A im Rahmen der Glucose- Oxidation sowie die
Enzyme des Citratzyklus. Bei der Oxidation der verschiedenen Substrate entsteht AcetylCoenzym A. Dieses geht in den Citratzyklus ein. Im Citratzyklus entsteht durch die Aktivität
der Citratsynthase (CS) aus Acetyl- Coenzym A und Oxalacetat Citrat. Im Rahmen des
Citratzyklus erfolgt eine progrediente Oxidation der anfallenden Metaboliten. Dabei werden
Elektronen frei. Diese Elektronen werden von den Reduktionsäquivalenten NAD+ und FAD+
aufgenommen und anschließend in die Atmungskette eingeschleust (s. Abb. 1).
-4-
Abb. 1: Schematische Darstellung des Elektronentransports durch die Atmungskette und der
Produktion von ATP durch die ATP-Synthase. I-IV: Enzymkomplexe der Atmungskette; Q10:
Coenzym Q10; Cyt c: Cytochrom c; F0 bzw. F1: Untereinheiten der ATP-Synthase
Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des Elektronentransports durch die
Atmungskette.
Die
Atmungskette
besteht
aus
mehreren
hintereinander
geschalteten
Enzymkomplexen. Die Elektronen, die durch die Reduktionsäquivalente auf die Atmungskette
übertragen werden, durchlaufen diese Komplexe in einer festgelegten Reihenfolge. Durch die
Aktivität von Komplex I (= NADH-Dehydrogenase) werden die Elektronen von NADH + H+
auf Coenzym Q10 der mitochondrialen Atmungskette übertragen. Ein geringerer Anteil an
Elektronen, der auf Coenzym Q10 übertragen wird, stammt aus der Reduktion von Succinat zu
Fumarat, die durch Komplex II (= Succinat-Dehydrogenase) katalysiert wird. Von Coenzym Q10
werden die Elektronen durch die Aktivität des Komplex III auf Cytochrom c übertragen.
Komplex IV beschleunigt die Übertragung von Elektronen von Cytochrom c auf ein
Sauerstoffatom,
das
unter
der
Bildung
von
Wasser
reduziert
wird.
Bei
der
Elektronenübertragung in der Atmungskette wird Energie frei. Diese Energie wird zur
Generierung und Aufrechterhaltung eines elektrochemischen Protonengradienten über die
innere Mitochondrienmembran genutzt. Dabei fungieren die Komplexe I, III und IV der
Atmungskette jeweils als Protonenpumpen.
Dieses derzeitige Verständnis der ATP- Synthese in Mitochondrien beruht auf der
chemiosmotischen Theorie, die Peter Mitchell 1966 formulierte. Danach ist es der Rückstrom
von Protonen aus dem Intermembranraum in die mitochondriale Matrix, der die Energie für die
ATP- Synthese bereitstellt. Dieser Einstrom erfolgt Mitchell zufolge durch einen Protonenkanal
im sog. FO- Teil der für die ATP- Synthese verantwortlichen FOF1-ATPase. Somit findet an
dieser Stelle eine Kopplung von Substratoxidation mit nachfolgender Generierung eines
-5-
Protonengradienten und der Phosphorylierung von ADP zu ATP statt. Es muss jedoch
angemerkt werden, dass die stöchiometrischen Zusammenhänge, die von Mitchell postuliert
wurden, in Frage gestellt werden, da andere Faktoren (z.B. uncoupling proteins, mitochondrial
transition pores) den Rückfluss von Protonen in die mitochondriale Matrix beeinflussen können,
ohne dass dabei ATP produziert wird.
Viele Erkenntnisse, die in der Zeit nach der Formulierung von Mitchells Hypothese erlangt
wurden, stützen sich auf Untersuchungen von zuvor aus unterschiedlichen Geweben isolierten
Mitochondrien.
Nach
Isolation
der
Mitochondrien
können
zwei
mitochondriale
Subpopulationen getrennt beurteilt werden. Im Folgenden werden die Charakteristika der beiden
Subpopulationen sowie das Isolationsverfahren beschrieben.
Präparationstechniken zur Mitochondrienisolation
Im Herzmuskel gibt es zwei Gruppen von Mitochondrien, die sich anhand ihrer intrazellulären
Lokalisation unterscheiden lassen (Page und McCallister, 1973; Palmer et al., 1977; Weinstein
et al., 1985). Mitochondrien, die sich direkt unter der Zellmembran (dem Sarkolemm) befinden,
werden als subsarkolemmale Mitochondrien (SSM) bezeichnet, und Mitochondrien, die in den
Muskelfasern eingebettet sind, werden interfibrilläre Mitochondrien (IFM) genannt. Weinstein
et al. (1985) zeigten im elektronenmikroskopischen Bild, dass subsarkolemmale Mitochondrien
kleiner sind als interfibrilläre, die Matrixdichte aber nicht unterschiedlich ist. Es wird davon
ausgegangen, dass ATP aus interfibrillären Mitochondrien vor allem für die Muskelkontraktion
und ATP aus subsarkolemmalen Mitochondrien vor allem für Ionentransportprozesse genutzt
wird (McMillin-Wood et al., 1980; Weinstein et al., 1986).
Das Standardverfahren zur Isolierung von Mitochondrien ist die differentielle Zentrifugation,
bei der durch mehrere Zentrifugationsschritte die Mitochondrien von den anderen
Zellbestandteilen getrennt werden (Sordahl et al. 1971, Matlib et al. 1984). Durch die
zusätzliche Behandlung von Herzmuskelhomogenat mit dem stark proteolytischen Enzym
Nagarse (Protease XXIV) kann die Mitochondrienausbeute des Verfahrens erhöht werden
(Chance und Hagihara 1963, Tyler und Gonze 1967). Es wird angenommen, dass Nagarse die
Muskelfasern andaut und dadurch zusätzliche Mitochondrien freisetzt, die zwischen den
Myofibrillen gelegen sind (Palmer et al., 1977). Die interfibrillären Mitochondrien (IFM)
werden durch zusätzliche Nagarsebehandlung des ersten Pellets gewonnen. Diese Methode
-6-
erlaubt die separate Untersuchung der mitochondrialen Subpopulationen und wurde in
modifizierter Form in der folgenden Arbeit als Isolationsverfahren verwendet.
In dieser Arbeit folgten nach der Isolierung von SSM und IFM Messungen der strukturellen
Integrität
der
Mitochondrien.
Dadurch
sind
Aussagen
über
die
Qualität
der
Mitochondrienpräparation möglich. Diese Messungen können darüber hinaus Auskunft darüber
geben, ob die Mitochondrien durch Veränderungen der Arbeitslast in Ihrer Struktur beeinflusst
werden. Eine erhöhte oder erniedrigte Anzahl an strukturell intakten Mitochondrien hat direkt
Einfluss auf die respiratorische Aktivität einer Mitochondrienpopulation.
Mitochondriale Marker und Beurteilung der strukturellen Integrität isolierter
Mitochondrien
In bisherigen Studien wurde zur Quantifizierung von Mitochondrien sowie als Bezugsgröße des
O2-Verbrauchs meist der Proteingehalt der Mitochondrienpräparation gewählt, der als rein
mitochondrial angenommen wird. Jedoch haben einige Autoren bereits diskutiert, dass es bei
der Isolation von subsarkolemmalen Mitochondrien zu einer Kontamination mit sarkolemmalen
Proteinen kommen kann, oder dass nach Nagarsebehandlung noch myofibrilläre Proteine den
interfibrillären Mitochondrien anhaften (Chemnitius et al. 1988). So können Unterschiede
zwischen den Subpopulationen maskiert oder produziert werden. Andere Parameter, die
verwendet wurden, sind Cytochrom c oder Cytochrom aa3. Diese Parameter sind allerdings im
Falle von O2-Messungen nicht unabhängig von der Atmungskette, und während einer Ischämie
gehen sowohl Cytochrom c als auch Cytochrom aa3 in größerem Ausmaß verloren (Piper et al.,
1985).
In dieser Arbeit wurde die Citratsynthase (EC 4.1.3.7; Citrat-Oxalacetat-Lyase, CoAacetylating) als mitochondrialer Marker bestimmt. Die Citratsynthase kommt ausschließlich in
den Mitochondrien vor und gilt als mitochondriales Leitenzym (Srere 1969). Das Enzym hat ein
Molekulargewicht von ca. 86 kDa und ist in der mitochondrialen Matrix lokalisiert. Die
Citratsynthase katalysiert die Synthese von Citrat aus Acetyl-CoA und Oxalacetat (Abb. 2). Die
Citratsynthase eignet sich als Parameter für die Beurteilung der strukturellen Integrität einer
Mitochondrienpräparation.
-7-
Abb. 2: Reaktion der Citratsynthase
Zur Bestimmung der gesamten Citratsynthase-Aktivität eines Mitochondrienisolates muß die
Doppelmembran der Organellen zerstört werden, weil die Substrate des Enzyms (Oxalacetat
und Acetyl-CoA) die innere Mitochondrienmembran nicht passieren können. Die Desintegration
kann z.B. durch Scherkräfte (Robinson und Srere, 1985), Ultraschallbehandlung (Matlib et al.,
1983) oder Detergenseinwirkung (Matlib und Srere, 1976) erreicht werden.
Wird die Citratsynthase-Aktivität in einer Mitochondrienpräparation ohne vorherige
Desintegration der Mitochondrien gemessen, so wird der Anteil der Citratsynthase-Aktivität
bestimmt, der frei für die Substrate zugänglich ist (freie Citratsynthase-Aktivität). Dies ist z.B.
bei präparationsbedingter Schädigung der Mitochondrienmembran möglich. Das Enzym kann
dann entweder im Zytosol bzw. im Isolationsmedium gelöst vorliegen oder in den
Mitochondrien für die Substrate frei zugänglich sein (Häfner 1989). Aus der Differenz von
gesamter und freier Citratsynthase-Aktivität errechnet sich die latente Citratsynthase-Aktivität,
d.h. die Citratsynthase-Aktivität, die in den Mitochondrien enthalten ist und erst nach Auflösung
der Mitochondrienmembranen freigesetzt wird. Sie ist ein Maß für die strukturelle Integrität
einer Mitochondrienpopulation (Chemnitius et al. 1988). Der Citratsynthase-Quotient (CSR) als
Quotient aus latenter und freier Citratsynthase-Aktivität gilt als Marker für die strukturelle
Integrität einer Mitochondrienpräparation (Chemnitius et al. 1988). Die gesamte oder latente
CS- Aktivität eignen sich gut als Bezugswert zur Quantifizierung und Vergleichbarkeit der
Atmungsaktivitäten von Mitochondrienpopulationen.
-8-
Kenngrößen der Mitochondrienatmung
Warburg et al. (1923) führten in den 20er Jahren erste Bestimmungen der zellulären Atmung
mit manometrischen Methoden durch. Bartels beschrieb 1951 eine Quecksilbertropfelektrode
zur Bestimmung des Sauerstoffgehaltes im Blut (Bartels, 1951). Seit 1953 ist mit der von Clark
entwickelten
Platinelektrode
eine
kontinuierliche
polarographische
Bestimmung
des
Sauerstoffgehaltes einer Lösung möglich.
Chance und Williams (1955a-d) verwendeten die Clark-Elektrode erstmals zur Bestimmung des
Sauerstoffverbrauchs isolierter Mitochondrien. Sie unterschieden bei der respiratorischen
Aktivität von Mitochondrien vier Zustände: Im Stadium 1 (State 1) der mitochondrialen
Atmung befinden sich die Mitochondrien in einem phosphathaltigen Respirationsmedium. Der
Sauerstoffgehalt nimmt sehr langsam ab, da nur endogene Substrate von den Mitochondrien
verbraucht werden. Gibt man Substrat (z.B. Glutamat, Succinat, Malat) zu, steigt der O2Verbrauch (State 2). Ist die Atmung der Mitochondrien noch an die Phosphorylierung von ADP
zu ATP gekoppelt, so lässt sich der Sauerstoffverbrauch der Mitochondrien durch Zugabe von
ADP steigern. Die dann registrierte Aktivität wird auch als maximale ADP-stimulierte
Atmungsaktivität der Mitochondrien bezeichnet (State 3) und ist eine wichtige Kenngröße der
mitochondrialen Atmung. Nach vollständiger Phosphorylierung des zugegebenen ADP geht der
Sauerstoffverbrauch in State 4 über.
Chance und Williams definierten den so genannten Respiratorischen Kontrollindex (RCI) als
den Quotienten aus State 3- und State 4-Atmung (Chance und Williams, 1956). Der Quotient
charakterisiert die Kontrolle über die mitochondriale Atmungsaktivität in Abhängigkeit der
ADP- Konzentration.
Die Kopplung der ATP-Synthese an den Sauerstoffverbrauch der Mitochondrien-Atmung kann
indirekt anhand des ADP/O-Quotienten bewertet werden (Estabrook 1967). Der ADP/OQuotient lässt sich aus der polarographischen Aufzeichnung des Sauerstoffgehalts in der
Messkammer bestimmen. Es wird die Menge an zugegebenem ADP ins Verhältnis gesetzt zu
der Menge an Sauerstoff, die während der maximalen ADP-stimulierten Atmung (state 3)
verbraucht wurde. Abschließend werden im Folgenden die Auswirkungen einer chronischen
Arbeitslasterhöhung auf das Herz beschrieben.
-9-
Charakteristika chronisch überlasteter Herzen:
In dieser Arbeit wurde durch Zügelung des Aortenbogens eine chronische Nachlasterhöhung
induziert. Dies hat die Entwicklung einer myokardialen Hypertrophie zur Folge. Es ist bekannt,
dass die langfristige Überlastung des Herzens über das Stadium der Hypertrophie hinaus zum
Auftreten einer Herzinsuffizienz mit Symptomen wie Atemnot und beschleunigter
Ermüdbarkeit führen kann. Die Auswirkungen einer chronischen Nachlasterhöhung auf die
respiratorische Funktion von isolierten Herzmuskelmitochondrien sind jedoch bisher nicht
eindeutig geklärt. Die Beobachtung von potentiellen Veränderungen der mitochondrialen
Atmungsaktivität in chronisch belasteten, aber noch nicht insuffizienten Herzen könnte zur
Aufklärung dieser Frage beitragen. Bei dem in dieser Arbeit verwendeten Modell nach Zaha et
al. (2003) tritt die Herzinsuffizienz im Durchschnitt elf Wochen nach Aortenzügelung an jungen
Ratten ein. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit Beobachtungszeiträume von 2, 6 und 10
Wochen nach Zügelung gewählt.
Es ist bis heute unklar, ob sich die mitochondrialen Subpopulationen tatsächlich in ihren
biochemischen Eigenschaften unterscheiden. Es ist nur eine Studie bekannt, die unterscheidet
zwischen dem Einfluss einer manifesten Herzinsuffizienz auf interfibrilläre (IFM) und
subsarkolemmale Mitochondrien (SSM). Hoppel et al. (1982) haben an insuffizienten Herzen
gezeigt, dass die oxidative Phosphorylierung nur in IFM, nicht aber in SSM beeinträchtigt ist. In
der vorliegenden Arbeit wurde die chronische Entwicklung einer kardialen Hypertrophie
beobachtet und deren Einfluss auf die beiden mitochondrialen Subpopulationen SSM und IFM
getrennt untersucht. Durch getrennte Messungen von SSM und IFM soll untersucht werden, ob
sich eine chronische Druckbelastung unterschiedlich auf die beiden mitochondrialen
Subpopulationen auswirkt.
Zielsetzung:
Die Hypothese dieser Arbeit lautet, dass die maximale respiratorische Aktivität isolierter
Rattenherzmitochondrien mit Nachlasterhöhung zunimmt. Es soll untersucht werden, ob sich
eine chronische Nachlasterhöhung unterschiedlich auf die beiden mitochondrialen Subgruppen
auswirkt. Die respiratorische Aktivität von interfibrillären (IFM) und subsarkolemmalen (SSM)
Mitochondrien wurde zwei, sechs und zehn Wochen nach Aortenzügelung getrennt untersucht.
- 10 -
2. MATERIAL UND METHODEN
2.1 Material
2.1.1
Geräte
Für die Herstellung der Organhomogenate wurden verwendet:
Ultra-Turrax T25 (600 W, 8750 U/min) mit einem S25N-18G Dispergierwerkzeug, IKA-Werke
GmbH & Co KG, Staufen
Glas-Homogenisator nach Potter-Elvejhem mit einem locker passenden Teflon-Pistill,
angetrieben von einem RE 16 Rührgerät (25 W, 2000 U/min), IKA-Werke GmbH & Co KG,
Staufen
Für die Isolation der Mitochondrien wurden verwendet:
Sorvall Polyallomer-Zentrifugenröhrchen, 10ml, Sorvall Products (Newtown, CT, USA)
Sorvall Zentrifugen RC 5C plus, Rotor SS 34, Sorvall Products (Newtown, CT, USA)
Für die photometrischen Messungen wurden verwendet:
UV-Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro, Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala,
Schweden)
UV-Spectrophotometer Ultrospec 1000, Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden)
Für die Messung des Sauerstoffverbrauchs wurden verwendet:
Sauerstoffelektrode, Strathkelvin Instruments (Glasgow, Schottland)
Oxygen Partial Pressure Module OPPM Typ 697, Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten
1-Kanal-Flachschreiber L200 E, 200mm, Firma Linseis, Selb
Wasserbad, Julabo Labortechnik, Seelbach
Magnetrührer MR 3000, Firma Heidolph, Schwabach
- 11 -
Folgende Geräte kamen außerdem zur Anwendung:
Minishaker MS1, IKA-Werke Gmbh & Co KG, Staufen
Präzisionswaagen Sartorius BP 110 S, Firma Sartorius AG, Göttingen
Pipetten ( Eppendorf bzw. Gilson)
pH 526 pH-mV-Meter „SenTix 97 T“ der Wissenschaftlich-Technischen Werkstätten GmbH,
Weilheim
2.1.2
Tiere, Tierhaltung
Für die Experimente wurden männliche Albino-Ratten des Stammes Sprague Dawley (Rattus
ssp. Rattus) von der Firma Charles River, Sulzfeld, verwendet. Die Tiere wurden in Käfigen mit
zwei Tieren gehalten und hatten freien Zugang zu Fertigfutter und Wasser. Der Lichtzyklus
umfaßte 12h Tag und 12h Nacht bei einer Raumtemperatur von 20°C. Alle Experimente wurden
von der Tierversuchskomission der Universität Freiburg genehmigt (G-02/83).
2.1.3
Reagenzien
Die Regenzien wurden von den Firmen Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA), Delta-Pharma
(Neumarkt), Merck (Darmstadt), Serva (Heidelberg), Riedel-de Haën (Seelze) und CP- Pharma
(Burgdorf) bezogen.
Reagenz:
Hersteller:
Acetyl-Coenzym A Lithiumsalz 95%
Sigma
Adenosin-5`-diphosphat (ADP) Kaliumsalz 98-100%
Sigma
Albumin aus Rinderserum Fraktion V
Sigma
5,5`-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure)(DTNB)
Sigma
D-Mannitol 98%
Sigma
EDTA Dinatriumsalz
Serva
0,9%ige Natriumchlorid-Lösung
Delta-Pharma
- 12 -
Kaliumchlorid (KCl)
Merck
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)
Riedel-de Haën
L-Glutamat, Natriumsalz 99%
Sigma
Nikotinamidadenindinukleotid red. (NADH) Dinatriumsalz 98%
Sigma
Oxalacetat 98%
Sigma
Pentobarbital
CP- Pharma
Protease: Bacterial Type XXIV (Nagarse)
Sigma
Saccharose 99,5%
Sigma
Salzsäure (HCl) rauchend 37%
Merck
Succinsäure
Sigma
Tris-Puffer 99,9%
Sigma
Triton X-100
Sigma
2.2 Methoden
2.2.1
Chirurgische Eingriffe
In dieser Arbeit wurde durch Zügelung des Aortenbogens eine mechanische Nachlasterhöhung
induziert. Diese operativen Eingriffe wurden bei Tieren mit Körpergewichten von 50-80g
durchgeführt. Die Tiere wurden mit einer Mischung aus Ketamin (10%), Xylazin („Rompun“,
2%) und Aqua dest. im Verhältnis 1:1:2 narkotisiert. Zur Narkose wurden 0,3ml/100g
Körpergewicht dieser Mischung intraperitoneal injiziert.
Es wurde ein Längsschnitt durch die Haut über dem Sternum bis zur Trachea durchgeführt. Mit
Hilfe einer stumpfen Pinzette wurde die Trachea frei präpariert. Die Intubation der Tiere
erfolgte unter visueller Kontrolle. Daraufhin wurde der Tubus an ein Beatmungsgerät
angeschlossen. Eine partielle Sternotomie wurde durchgeführt und der Thymus entfernt. Der
Aortenbogen wurde mit einer stumpfen Pipette dargestellt und ein Metallclip mit Hilfe einer
Zange zwischen dem Abgang des Truncus brachiocephalicus und der linken Arteria carotis
communis platziert. Der maximale Abstand zwischen den beiden Clipbranchen betrug 0,4 mm.
- 13 -
Der Aortendurchmesser wurde somit um ca. 80% vermindert und eine Druckbelastung des
Herzens hervorgerufen. In Abb. 3 ist links ein Photo der anatomischen Verhältnisse nach
Freilegung des Aortenbogens einer Ratte zu sehen. Rechts ist die Aortenzügelung schematisch
dargestellt. Nach dem Zügeln des Aortenbogens und anschließender Naht des Operationsfeldes
wurden die Tiere nach Sicherstellung suffizienter Spontanatmung extubiert.
Metallclip
Linke A. Carotis
Truncus
brachiocephalicus
Aortenbogen
Abb. 3: Foto des freigelegten Aortenbogens und schematische Skizze der Aortenzügelung
2.2.2
Herstellung von Herzmuskelhomogenat
Zur Herstellung der Herzmuskelhomogenate wurde eine Modifikation des Standardverfahrens
nach Chemnitius et al. (1993) verwendet. In einer 4°C kalten kardioplegischen Lösung (Tab. 1)
wurde das Blut für 30 sec. aus dem entnommenen Rattenherz gewaschen. Anschließend wurde
das Herz mit einem Papiertuch von der kardioplegischen Lösung getrocknet. Die Vorhöfe
wurden mit Hilfe einer Preparationsschere abgeschnitten und das Herz gewogen. Die Ventrikel
wurden klein geschnitten und in einen Glasbehälter gegeben. Vier Volumeneinheiten
Isolationsmedium (Tab. 2) wurden in den Glasbehälter gegeben. Die Suspension wurde mit dem
Ultra Turrax für 20 sec. bei 8750 U/min homogenisiert. Das Dispergierwerkzeug wurde
daraufhin mit drei Volumeneinheiten Isolationsmedium gespült und das Homogenat damit
weiter verdünnt. Das Endvolumen entsprach somit dem 8-fachen in ml des eingesetzten
Ventrikelvolumens in g. Die Homogenisierung wurde in einem Potter Elvejhem
Glashomogenisator mit einem Stoß eines locker sitzenden, motorgetriebenen Teflon-Pistills
- 14 -
(2000 U/min) fortgesetzt und mit der pH-Einstellung auf 7,4 mittels Tris/HCl-Lösung (0,1
mol/l) abgeschlossen. Sämtliche Schritte wurden bei 4ºC durchgeführt. Das Homogenat wurde
anschließend bis zur weiteren Verwendung auf Eis gelagert.
Tab. 1: Zusammensetzung der kardioplegischen Lösung
KCl
180 mmol/l
EDTA
10 mmol/l
Der pH-Wert wurde mit 1 mol/l Tris-Base auf 7,4 eingestellt.
Tab. 2: Zusammensetzung des Isolationsmediums
KCl
180 mmol/l
EDTA
10 mmol/l
Albumin
0,5 %
Der pH-Wert wurde mit 1 mol/l Tris-Base auf 7,4 eingestellt.
2.2.3
Isolation von Mitochondrien
Die differentielle Zentrifugation als Verfahren zur Mitochondrienisolation wurde nach dem
Prinzip der Zwei-Populationen-Methode von Palmer et al. (1977) durchgeführt. Die
subsarkolemmalen Mitochondrien wurden durch mehrere Zentrifugationsschritte isoliert, die
Isolation interfibrillärer Mitochondrien erfolgte durch den zusätzlichen Einsatz des
proteolytischen Enzyms Nagarse (Protease XXIV). Abb. 4 zeigt das Schema zur Isolation der
beiden Subpopulationen.
- 15 -
Abb. 4: Schema zur Isolierung subsarkolemmaler (SSM) und interfibrillärer (IFM) Mitochondrien
Für die Isolation subsarkolemmaler Mitochondrien wurden drei ml vom Homogenat in ein
Zentrifugenröhrchen gegeben und bei 4ºC in einer Sorvall RC 5C plus Zentrifuge für 10 min bei
750 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde durch vorsichtiges Pipettieren in ein weiteres
Röhrchen gegeben, das Pellet wurde für die Isolation der interfibrillären Mitochondrien auf Eis
aufbewahrt. Nach erneuter Zentrifugation des Überstandes für 10 min bei 7000 U/min wurde ein
mitochondriales Pellet erhalten. Dieses Pellet wurde mit 1,5 ml Isolationsmedium vorsichtig
resuspendiert und für 10 min bei 7000 U/min zentrifugiert. Dieser Schritt wurde noch einmal
wiederholt. Das Pellet wurde schließlich in 500 µl Isolationsmedium resuspendiert. Sämtliche
Schritte wurden bei 4°C durchgeführt.
Die Isolation der interfibrillären Mitochondrien wurde in einem veränderten Verfahren nach
Tomec und Hoppel (1975) durchgeführt. Das aufbewahrte Pellet aus der Zentrifugation des
Homogenates wurde gewogen. Zwei Volumeneinheiten Isolationsmedium wurden zum Pellet
gegeben (bei einem Pelletgewicht von z.B. 500mg entsprach das 1ml). Nagarse (0,1 g/ml)
- 16 -
wurde mit einer Endkonzentration von 5 mg/g Feuchtgewicht zum verdünnten Pellet gegeben.
Nach Mischen der Suspension wurde nach 30 s eine Zentrifugation mit 7000 U/min für 5 min
bei 4ºC gestartet. Nach Verwerfen des Überstandes wurde das Pellet mit 3ml Isolationsmedium
resuspendiert und bei 750 U/min für 10 min zentrifugiert. Der mitochondrienhaltige Überstand
wurde 10 min bei 7000 U/min zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde mit 1,5 ml
Isolationsmedium resuspendiert und erneut für 10 min bei 7000 U/min zentrifugiert. Nach
Wiederholung dieses Schrittes wurde das Pellet in 500 µl Isolationsmedium aufgenommen und
vorsichtig resuspendiert. Sämtliche Schritte wurden bei 4°C durchgeführt.
2.2.4
Bestimmung der Citratsynthase- Aktivität
Die Citratsynthase (CS) ist ein Enzym der mitochondrialen Matrix. Sie kann aufgrund dieser
Lokalisation als mitochondrialer Marker benutzt werden. Chemnitius et al. (1988) unterscheiden
in vitro eine latente von einer freien Enzym-Aktivität. Die Summe dieser beiden Aktivitäten
ergibt die Gesamtaktivität der CS.
Wird die Citratsynthase in einer Mitochondrien- Präparation ohne vorherige Desintegration der
strukturell intakten Mitochondrienmembran gemessen, so wird der Anteil der CS- Aktivität
bestimmt, der frei für die Substrate zugänglich ist (CS-frei). Dies ist z.B. bei
präparationsbedingter Schädigung der Mitochondrienmembran möglich. Das Enzym kann dann
entweder im Zytosol oder im Isolationsmedium gelöst vorliegen oder in den Mitochondrien für
die Substrate frei zugänglich sein (Häfner 1989).
Für die Bestimmung der gesamten CS- Aktivität (CS-gesamt) muss die Doppelmembran der
Organellen zerstört werden, weil die Substrate des Enzyms die innere Mitochondrienmembran
nicht passieren können. Aus der Differenz von gesamter und freier CS- Aktivität errechnet sich
der latente Aktivitätsanteil (CS-latent), d.h. die CS- Aktivität, die erst nach Desintegration der
Mitochondrienmembran freigesetzt wird. Sie ist ein Maß für die strukturelle Intaktheit einer
Mitochondrienpräparation (Chemnitius et al. 1988). Der Citratsynthase- Quotient (CSR) als
Quotient aus latenter und freier CS- Aktivität gilt als Marker für die strukturelle Integrität einer
Mitochondrienpopulation (Chemnitius et al. 1988).
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Die Citratsynthase-Aktivität wurde nach der Methode von Srere (1969) bestimmt. Es lassen sich
zwei Aktivitätsanteile an den Steigungen der Extinktionsaufzeichnungen bestimmen. Der erste
Anteil entspricht einer unspezifischen Hydrolyse des Acetyl-CoA durch sonstige Enzyme mit
Hydrolyse-Aktivität. Der zweite Anteil entspricht der unspezifischen Aktivität plus der
Citratsynthase-Aktivität, die nach Zugabe von Oxalacetat (10 mmol/l) gestartet wird. Nach
Subtraktion der beiden Aktivitätsanteile erhält man die Citratsynthase-Aktivität.
Tab. 3: Pipettierschema für Bestimmung der freien und gesamten Citratsynthase-Aktivität
Freie
Gesamte
Aktivität
Aktivität
H2O
775 µl
775 µl
1 mmol/l DTNB in 1mol/l Tris/HCl pH 8,5
100 µl
100 µl
25 µl
25 µl
5 mmol/l Acetyl-CoA
Inkubation:
50µl Probe mit 50µl 0,9% NaCl
50 µl
50µl Probe mit 50µl 5% Triton X-100
--
-50 µl
Aufzeichnung der Extinktion (λ = 412 nm; 25°C; 2:20min)
Oxalacetat (10 mmol/l in 0,1 mol/l Tris/HCl pH 8,5)
50 µl
50 µl
Aufzeichnung der Extinktion (λ = 412 nm; 25°C; 2:20min)
Für die Bestimmung der gesamten CS- Aktivität wurden 50 µl Probe mit 50 µl des nichtionischen Tensids Triton X-100 (5%ige Lösung) für 5 Minuten vorinkubiert. Dadurch kommt
es zur Zerstörung der mitochondrialen Struktur. Nach Zugabe von Oxalacetat konnte somit die
Gesamtaktivität der Citratsynthase gemessen werden. Die freie Aktivität der Citratsynthase
wurde nach Vorinkubation in isotonischer NaCl-Lösung (0,9%) gemessen. Tab. 3 zeigt das
verwendete Pipettierschema.
2.2.5
Polarographische Atmungsmessung
Die Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs der isolierten Mitochondrien erfolgte mit Hilfe einer
Clark-Sauerstoffelektrode in einer Reaktionskammer mit einem Gesamtvolumen von 1 ml. Die
- 18 -
Temperatur in der Reaktionskammer wurde durch einen Wassermantel kontinuierlich auf 25°C
gehalten.
Abb. 5 zeigt die in dieser Arbeit verwendete Reaktionskammer. Sie hat an ihrem oberen Ende
eine Öffnung, die durch einen hierfür eigens vorgesehen Verschlußstift verschlossen werden
kann. Der Verschlußstift seinerseits enthält eine Kapillare mit einem Durchmesser von ca. 1-2
mm. Durch diese können im weiteren Versuchsablauf 20µl ADP mittels einer Spritze in die
Reaktionskammer gegeben werden. Atmosphärischer Sauerstoff hat aufgrund dieser
Versuchsanordnung keinen Einfluss auf die Messung des Sauerstoffverbrauchs in der
Reaktionskammer.
Abb. 5: Foto der verwendeten Atmungskammer
Sauerstoffelektrode:
Die Messung des Sauerstoffgehaltes in der Reaktionskammer wurde mit einer Elektrode nach
Clark durchgeführt (Clark et al., 1953). Das Prinzip der Elektrode besteht in der Messung des
elektrischen Stroms, der bei der Reduktion des Sauerstoffs an der Kathode entsteht. Dieser
Strom ist bei einer angelegten Spannung von 0,4-0,8 V ausschließlich von der Zahl der O2Moleküle abhängig, die pro Zeiteinheit die Elektrode erreichen und reduziert werden.
- 19 -
Abb. 6: Schematischer Aufbau der Clark-Elektrode
Somit kann eine Veränderung des Sauerstoffgehaltes in der Reaktionskammer über den
veränderten Strom aufgezeichnet werden. Konstante Diffusionsbedingungen werden erreicht,
indem die Elektrode mit einer für Sauerstoff permeablen Membran überzogen und die Lösung
ständig gerührt wird. Abb. 6 zeigt den schematischen Aufbau einer solchen Clark- Elektrode.
Die Anode (D) besteht aus einem dünnen Silberdraht. Sie ist über einen Elektrolyten (gesättigte
KCl-Lösung) mit der Kathode verbunden. Die Kathode (A) besteht aus mehreren ultradünnen,
in Glas eingeschmolzenen Platindrähten, die lediglich mit ihren angeschliffenen Stirnseiten im
Niveau der Glasoberfläche Kontakt zur Elektrolytlösung haben. Der Sauerstoff hat über eine 25
µm dicke semipermeable Teflonmembran Zugang zur Kathode, an der die Sauerstoffmoleküle
reduziert werden. Das führt zu einem Stromfluss. Dieser Strom wird mit einem
Nanoamperemeter gemessen und ist der Sauerstoffkonzentration der an die Teflonmembran
angrenzenden Lösung direkt proportional. Der zeitliche Verlauf der Stromstärke wird mit einem
Schreiber aufgezeichnet. Aufgrund dieses Prinzips verbraucht die Elektrode selbst Sauerstoff.
Dieser Verbrauch wird als Eigenverbrauch bezeichnet. Der Wert war bei der verwendeten
Elektrode jedoch so klein, dass er praktisch nicht messbar war und somit die Ergebnisse nicht
beeinflusste.
- 20 -
Eichung der Sauerstoffelektrode:
Die Eichung wurde täglich nach einer Methode von Lehninger (1951) unter Verwendung von
unkontrolliert atmenden Mitochondrien und NADH2 durchgeführt. Um die Enzyme der
Atmungskette für das Substrat NADH2 frei zugänglich zu machen, wurden die Mitochondrien
zur Desintegration ihrer Doppelmembranen tief gefroren und wieder aufgetaut. Die Übertragung
der Elektronen auf den Sauerstoff findet in diesen Präparationen unabhängig von ADP
stöchiometrisch statt. Für jedes O2-Molekül werden 2 NADH2-Moleküle zur Übertragung des
Wasserstoffs benötigt. Die Reaktionskammer wurde mit 925 µl Respirationsmedium und 50 µl
der Mitochondrienpräparation gefüllt und bei 25°C mit Luftsauerstoff äquilibriert. Durch
schrittweise Zugabe von NADH2 (25 µl, 1 mmol/l) wurde eine wie in Abb. 7 exemplarisch
dargestellte Eichkurve aufgezeichnet. Aus der Kästchenanzahl pro zugegebenen 25 µl NADH2
und der täglich gemessenen Extinktion des NADH2 läßt sich der Eichfaktor (nAtomeO/mm)
berechnen.
Abb. 7: Schreiber- Aufzeichnung der täglich durchgeführten NADH2- Eichkurve
Versuchsdurchführung:
Nach Isolierung der mitochondrialen Subpopulationen wurden jeweils für das Homogenat und
für die IFM und SSM Atmungsmessungen mit Glutamat und Succinat als Substrat durchgeführt.
Bis zum Zeitpunkt der jeweiligen Messung wurden die Mitochondrien bei 4°C gelagert.
- 21 -
Die Reaktionskammer wurde für die Atmungsmessungen mit Respirationsmedium (Tab. 4) und
Isolationsmedium (Tab. 2) sowie dem jeweiligen Substrat gefüllt. Tabelle 5 zeigt eine
Auflistung der jeweiligen Volumina zur Atmungsmessung.
Tab. 4: Zusammensetzung des Respirationsmediums
Mannitol
210 mmol/l
Saccharose
70 mmol/l
Tris-Base
10 mmol/l
KH2PO4
5 mmol/l
Der pH-Wert wurde mit HCl auf 7,4 eingestellt.
Tab. 5: Zusammensetzung der Reaktionskammer zur Atmungsmessung
Lösung
Volumen
Respirationsmedium
450 µl
Isolationsmedium + Mitochondrien *
480 µl
Substrat **
50 µl
ADP (10 mmol/l)
20 µl
* Es wurde 1 U CS aus der Mitochondrienpräparation eingesetzt.
** Es wurden Glutamat (10mmol/l) oder Succinat (10mmol/l) eingesetzt.
Die so gefüllte Reaktionskammer wurde unter ständigem Rühren unter Luftabschluss bis zur
Äquilibrierung belassen. Anschließend wurden die jeweils zu messenden Mitochondrien in die
Kammer gegeben und damit die Messung der respiratorischen Aktivität gestartet. Es wurde stets
eine Einheit latenter Citratsynthase- Aktivität der jeweiligen Mitochondrienpräparation in die
Reaktionskammer pipettiert. Es wurde nun die state 2-Atmung der Mitochondrien mittels eines
Schreibers aufgezeichnet. Sie ist charakterisiert duch einen Überschuss von Substraten wie
Glutamat oder Succinat für die mitochondriale Atmung. Durch Zugabe von 20µl ADP (10
mmol/l) in die Atmungskammer wurden die Mitochondrien zu maximaler ADP- stimulierter
- 22 -
Atmung (state 3-Atmung) aktiviert. Nach vollständiger Phosphorylierung des ADP zu ATP geht
die state 3-Atmung in die state 4-Atmung über.
Nach Abschluss eines Versuchs wurde die Reaktionskammer mit Aqua dest. gespült. Die
Teflonmembran wurde ein Mal wöchentlich erneuert. Nach Erneuerung der Membran wurde
jeweils eine Äquilibrierung der Sauerstoffelektrode durchgeführt. Dazu wurde die
Reaktionskammer zu jeweils 500µl mit Isolationsmedium und Respirationsmedium gefüllt.
Mittels eines Magnetrührers wurde die Lösung über einen Zeitraum von ca. 3h kontinuierlich
vermischt. Die Äquilibrierung war abgeschlossen, sobald der Schreiber über einen Zeitraum von
mindestens 10 min einen konstanten Messwert anzeigte.
Berechnung des Sauerstoffverbrauchs und des ADP/O-Quotienten:
Die Bestimmung der State 2-, State 3- und State 4-Atmung wurde durch Anlegen von
Tangenten an die jeweiligen Abschnitte der Kurve auf dem Schreiberpapier durchgeführt
(Abb. 8). Die Steigung der Tangenten wurde mit dem Eichfaktor der Sauerstoffelektrode
multipliziert. Hieraus ergab sich der Sauerstoffverbrauch (nAtomeO/min) von 1 Einheit
eingesetzter Citratsynthase-Aktivität.
Der
ADP/O-Quotient
wurde
nach
der
Methode
von
Estabrook
(1967)
aus
den
polarographischen Aufzeichnungen des Sauerstoffverbrauchs berechnet. Der vertikale Abstand
der Schnittpunkte der Tangenten der State 2- und State 3-Atmung bzw. der State 3- und State 4Atmung auf dem Schreiberpapier entsprach dem Sauerstoffverbrauch, der allein durch die
Zugabe von ADP entstand. Aus der Menge des zugegebenen ADP (20 µl, 10 mmol/l) und dem
ermittelten Sauerstoffverbrauch lässt sich somit der ADP/O-Quotient berechnen, indem man die
zugegebenen ADP-Äquivalente ins Verhältnis zu den verbrauchten Sauerstoffäquivalenten
setzt.
- 23 -
State 2
O2-Spannung
O2/ADP
State 3
State 4
Schreibervorschub
Abb. 8: Darstellung der Bestimmung von State 2, State 3 und State 4 sowie der Berechnung des
ADP/O-Quotienten an einer Originalaufzeichnung
2.2.6
Statistik
Die Ergebnisse sind als Mittelwerte mit der Standardabweichung des Mittelwertes (SD, standard
deviation) angegeben (Mittelwert ± SD). Die Daten wurden mittels einer Multivarianzanalyse
(analysis of variance, one- way ANOVA) auf signifikante Unterschiede hin überprüft. Post- hoc
Vergleiche mittels Tukey-Test dienten der Lokalisierung der signifkanten Unterschiede. Eine
Irrtumswahrscheinlichkeit von p < 0,05 wurde als signifikant angenommen.
- 24 -
3. ERGEBNISSE
In dieser Arbeit wurde der Einfluss einer chronischen Nachlasterhöhung auf die respiratorische
Aktivität isolierter Rattenherzmitochondrien bestimmt. Hierzu wurde an jungen Ratten eine
Aortenzügelung vorgenommen und die Mitochondrien der Herzen nach zwei, sechs und zehn
Wochen isoliert. Der Hypertrophiegrad der Herzen wurde morphologisch und durch das Herzzu Körpergewicht bestimmt. Die isolierten Mitochondrien wurden mit Hilfe der Citratsynthase
(CS) charakterisiert und die respiratorischen Eigenschaften mit einer Clark- Elektrode
gemessen.
3.1 Untersuchung eines Einflusses chronischer Nachlasterhöhung auf das
Verhältnis von Ventrikel- zu Körpergewicht
Tabelle 6 zeigt das Körpergewicht, das Ventrikelgewicht und das Verhältnis von Ventrikel- zu
Körpergewicht der untersuchten Tiere zu den verschiedenen Beobachtungszeitpunkten. Nach
zehn Wochen sind die Tiere mehr als doppelt so schwer wie nach zwei Wochen (p < 0,01). Das
Herzgewicht nimmt ebenfalls mit zunehmendem Alter zu, ist aber schon zwei Wochen nach
Zügelung größer als in einer Population ausgewachsener Kontrolltiere. Das Verhältnis von
Ventrikel- zu Körpergewicht ist entsprechend bereits nach zwei Wochen signifikant erhöht
(p < 0,01). Sechs Wochen nach Zügelung ist der Quotient weiterhin signifikant größer als in der
Kontrollgruppe (p < 0,05), zehn Wochen nach Zügelung aber nicht unterschiedlich zu nicht
gezügelten Tieren.
Tab. 6: Körpergewicht, Ventrikelgewicht und Ventrikel- zu Körpergewicht von
normotrophen Tieren (Kontrollgruppe) sowie 2, 6 und 10 Wochen nach Aortenzügelung
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
341 ± 37,6
167 ± 14,3 **
301 ± 29,8
394 ± 66,9
Ventrikelgewicht [g] 0,78 ± 0,06
0,94 ± 0,04
1,50 ± 0,03 *
1,63 ± 0,51 *
Ventrikelgewicht [g]
2,28 ± 0,08
Körpergewicht [kg]
5,63 ± 0,36 **
5,02 ± 0,46 *
4,22 ± 1,50
Körpergewicht [g]
Mittelwert ± SD, n= 12. * p < 0,05 vs. Kontrollgruppe. ** p < 0,01 vs. Kontrollgruppe.
- 25 -
3.2 Untersuchung eines Einflusses chronischer Nachlasterhöhung auf das
Isolationsverfahren
Die Citratsynthase (CS) wurde als mitochondrialer Marker gemessen. Durch die Bestimmung
der CS-latent und der CS-frei sowie des Quotienten aus CS-latent und CS-frei (CSR) kann die
strukturelle Integrität einer Mitochondrienpopulation bestimmt werden. Die CS kann ebenfalls
zur Messung der Ausbeute an Mitochondrien aus einem Herzhomogenat herangezogen werden.
Die Ausbeute ist definiert als der Prozentsatz der Citratsynthase- Aktivität der isolierten
Mitochondrien an der zur Mitochondrienisolation ursprünglich eingesetzten CitratsynthaseAktivität des Homogenats. Entsprechend kann man eine Ausbeute an subsarkolemmalen von
einer Ausbeute an interfibrillären Mitochondrien unterscheiden.
Abbildung 9 zeigt die Ausbeute an SSM (A) und IFM (B) nach Isolation aus den
Herzhomogenaten. Sowohl die jeweilige Ausbeute der mitochondrialen Subgruppen als auch
die Gesamtausbeute aller isolierten Mitochondrien veränderte sich durch Zügelung nicht. Die
Gesamtausbeute der CS in isolierten Mitochondrien aus den Homogenaten betrug 38,31 ± 0,9%.
A
30
40
B
25
Ausbeute [ % ]
Ausbeute [ % ]
30
20
20
15
10
10
5
0
0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Kontrollgruppe
Zeitpunkt nach Zügelung
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
Abb. 9: Ausbeute der Citratsynthase- Aktivität von SSM (A) und IFM (B) nach Isolation aus
Homogenaten von normotrophen sowie aus Homogenaten von 2, 6 bzw. 10 Wochen nach
Aortenzügelung entnommenen Herzen (Mittelwert ± SD, n= 12).
- 26 -
Abbildung 10 zeigt die Gesamt- CS- Aktivität der jeweiligen Mitochondrienpräparation. Die
Gesamtaktivität der Citratsynthase blieb durch Aortenzügelung unbeeinflusst.
160
A
CS gesamt (U/g Feuchtgewicht)
140
120
100
80
60
40
20
0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
140
B
CS gesamt (U/g Feuchtgewicht)
120
100
80
60
40
20
0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
140
C
CS gesamt (U/g Feuchtgewicht)
120
100
80
60
40
20
0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
Abb. 10: Gesamt- Citratsynthase (CS)- Aktivität von Homogenaten (A), SSM (B) und IFM (C)
aus normotrophen sowie aus 2, 6 bzw. 10 Wochen nach Aortenzügelung entnommenen Herzen
(Mittelwert ± SD, n= 12).
- 27 -
Abbildung 11 zeigt die latente und die freie CS- Aktivität. Die latente CS-Aktivität war bei allen
Mitochondrienpräparationen nach Zügelung nicht unterschiedlich zur Kontrollgruppe. Die freie
CS- Aktivität hingegen unterschied sich bei Messungen mit Homogenaten (A) zehn Wochen
nach Zügelung signifikant von der Kontrollgruppe (p < 0,05). Messungen der freien CSAktivität aus SSM (B) und IFM (C) ergaben keinerlei Unterschiede nach Zügelung.
140
latente / freie CS (U/g Feuchtgewicht)
A
120
100
80
60
40
*
20
0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
140
latente / freie CS (U/g Feuchtgewicht)
B
120
100
80
60
40
20
0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
140
latente / freie CS (U/g Feuchtgewicht)
C
120
100
80
60
40
20
0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
Abb. 11: Latente (schwarz) und freie (weiß bzw. schraffiert) Citratsynthase (CS)- Aktivität von
Homogenaten (A), SSM (B) und IFM (C) aus normotrophen sowie aus 2, 6 bzw. 10 Wochen
nach Aortenzügelung entnommenen Herzen (Mittelwert ± SD, n= 12). * p < 0,05 vs.
Normotrophie.
- 28 -
Abbildung
12
zeigt
den
Citratsynthasequotienten
(CSR)
der
jeweiligen
Mitochondrienpräparation. Es zeigten sich in allen Präparationen keine signifikanten
Unterschiede im CSR zwischen der Kontrollgruppe und Beobachtungen nach Aortenzügelung.
Die gemessenen Werte waren in den SSM- und IFM- Präparationen zu allen
Beobachtungszeitpunkten wesentlich höher als in Messungen von Homogenaten.
12
A
Citratsynthasequotient (CSR)
10
8
6
4
2
0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
35
B
Citratsynthasequotient (CSR)
30
25
20
15
10
5
0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
50
Citratsynthasequotient (CSR)
C
40
30
20
10
0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
Abb. 12: Citratsynthaseratio (CSR) von Homogenaten (A), SSM (B) und IFM (C) aus
normotrophen sowie aus 2, 6 bzw. 10 Wochen nach Aortenzügelung entnommenen Herzen
(Mittelwert ± SD, n= 12).
- 29 -
3.3 Untersuchung eines Einflusses chronischer Nachlasterhöhung auf die
Atmungsaktivität isolierter Mitochondrien
Maximale Atmungsaktivität isolierter Mitochondrien
Die Atmungsaktivität von Homogenaten, SSM und IFM wurde zu vier Zeitpunkten nach
Aortenzügelung gemessen. Die Mitochondrien wurden in vitro durch Zugabe von ADP zu
maximaler ADP- stimulierter (state 3-) Atmung aktiviert. Die Abbildungen 13 bis 15 zeigen die
Ergebnisse bezogen auf das mitochondriale Markerenzym Citratsynthase (CS).
Abbildung 13 stellt die state 3- Atmung von Homogenaten aus normotrophen sowie aus zwei,
sechs und zehn Wochen nach Zügelung entnommenen Herzen dar. Abbildung 13A zeigt die
state 3- Atmung von Homogenaten mit Glutamat als Substrat, Abbildung 13B mit Succinat als
Substrat. Es zeigte sich sechs Wochen nach Zügelung ein Trend zu einer Abnahme der state 3Atmung, zehn Wochen nach Zügelung war die maximale ADP- stimulierte Atmung signifikant
reduziert (p < 0,05).
300
B
State 3- Atmung (nAtomeO/CS latent)
State 3- Atmung (nAtomeO/CS latent.)
A
250
200
150
*
100
50
300
250
200
150
*
100
50
0
0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
Kontrollgruppe
10 Wochen
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
Zeitpunkt nach Zügelung
Abb. 13: State 3- Atmung von Homogenaten aus normotrophen sowie aus 2, 6 bzw. 10 Wochen
nach Aortenzügelung entnommenen Herzen bei Zugabe von Glutamat (A) oder Succinat (B) als
Substrat (Mittelwert ± SD, n= 12). * p < 0,05 vs. Normotrophie.
- 30 -
Abbildung 14 zeigt die state 3- Atmung von SSM im zeitlichen Verlauf nach Aortenzügelung.
Es ergab sich auch hier ein Trend zu einer Abnahme der state 3-Atmung im Vergleich 10
Wochen zu 2 Wochen nach Zügelung. Der Unterschied in der state 3-Atmung war jedoch nicht
signifikant.
400
400
B
State 3- Atmung (nAtomeO/CS latent)
State 3- Atmung (nAtomeO/CS latent)
A
300
200
100
300
200
100
0
0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Kontrollgruppe
Zeitpunkt nach Zügelung
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
Abb. 14: State 3- Atmung von SSM aus normotrophen sowie aus 2, 6 bzw. 10 Wochen nach
Aortenzügelung entnommenen Herzen bei Zugabe von Glutamat (A) oder Succinat (B) als
Substrat (Mittelwert ± SD, n= 12).
Abbildung 15 zeigt die state 3-Atmung der IFM nach Zügelung. Hierbei zeigte sich eine im
Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant reduzierte Atmung zehn Wochen nach Zügelung.
350
300
B
300
State 3- Atmung (nAtomeO/CS latent)
State 3- Atmung (nAtomeO/CS latent)
A
250
200
150
100
*
50
250
200
150
100
*
50
0
0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
Kontrollgruppe
10 Wochen
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
Zeitpunkt nach Zügelung
Abb. 15: State 3- Atmung von IFM aus normotrophen sowie aus 2, 6 bzw. 10 Wochen nach
Aortenzügelung entnommenen Herzen bei Zugabe von Glutamat (A) oder Succinat (B) als
Substrat (Mittelwert ± SD, n= 12). * p < 0,05 vs. Normotrophie.
- 31 -
Abb. 14 zeigt die state 3- Atmung der SSM, Abb. 15 diejenige der IFM. In den normotrophen
Herzen war die state 3- Atmung der IFM höher als die der SSM. Zehn Wochen nach Zügelung
ist die state 3- Atmung der IFM am stärksten eingeschränkt. Der IFM- Wert liegt zehn Wochen
nach Zügelung unter dem der SSM.
Respiratorischer Kontrollindex (RCI) und ADP/O- Quotient isolierter Mitochondrien
Die Abbildungen 16 bis 18 zeigen die State 3- und State 4- Werte von Homogenaten, SSM und
IFM bezogen auf die latente Citratsynthase- Aktivität bei Messungen mit Glutamat oder
Succinat als Substrat. Die state 3-Atmung von Homogenaten und IFM war zehn Wochen nach
Aortenzügelung signifikant reduziert (p < 0,05). Messungen mit SSM ergaben einen Trend zur
Abnahme, aber keine signifikanten Unterschiede nach Zügelung (p = 0,052) (vgl. auch Abb. 13
bis 15). Die Aufzeichnung der state 4-Atmung hingegen ergab nur bei Messungen von
Homogenaten mit Succinat als Substrat eine signifikante Abnahme nach zehn Wochen vs. nach
zwei Wochen (p < 0,05). Alle anderen state 4-Werte zeigten keinerlei Unterschiede nach
Zügelung.
300
300
B
Sauerstoffverbrauch (nAtomeO/CS latent)
Sauerstoffverbrauch (nAtomeO/CS latent.)
A
250
200
150
*
100
50
250
200
150
*
100
*
50
0
0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
Kontrollgruppe
10 Wochen
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
Zeitpunkt nach Zügelung
Abb. 16: State 3 (schwarz)- und State 4 (weiß)- Atmung bezogen auf die latente Citratsynthase
(CS)- Aktivität von Homogenaten aus normotrophen sowie aus 2, 6 bzw. 10 Wochen nach
Aortenzügelung entnommenen Herzen bei Zugabe von Glutamat (A) oder Succinat (B) als
Substrat (Mittelwert ± SD, n= 12). * p < 0,05 vs. Normotrophie.
- 32 -
400
400
A
Sauerstoffverbrauch (nAtomeO/CS latent)
Sauerstoffverbrauch (nAtomeO/CS latent)
B
300
200
100
300
200
100
0
0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
Kontrollgruppe
10 Wochen
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
Zeitpunkt nach Zügelung
Abb. 17: State 3 (schwarz)- und State 4 (schraffiert)- Atmung bezogen auf die latente
Citratsynthase (CS)- Aktivität von SSM aus normotrophen sowie aus 2, 6 bzw. 10 Wochen nach
Aortenzügelung entnommenen Herzen bei Zugabe von Glutamat (A) oder Succinat (B) als
Substrat (Mittelwert ± SD, n= 12).
350
A
300
Sauerstoffverbrauch (nAtomeO/CS latent)
Sauerstoffverbrauch (nAtomeO/CS latent)
B
300
250
200
150
100
*
50
0
250
200
150
100
*
50
0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Kontrollgruppe
Zeitpunkt nach Zügelung
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
Abb. 18: State 3 (schwarz)- und State 4 (schraffiert)- Atmung bezogen auf die latente
Citratsynthase (CS)- Aktivität von IFM aus normotrophen sowie aus 2, 6 bzw. 10 Wochen nach
Aortenzügelung entnommenen Herzen bei Zugabe von Glutamat (A) oder Succinat (B) als
Substrat (Mittelwert ± SD, n= 12). * p < 0,05 vs. Normotrophie.
- 33 -
Chance und Williams definierten den sog. Respiratorischen Kontrollindex (RCI) als den
Quotienten aus State 3- und State 4-Atmung. Der Quotient beschreibt die Kontrolle der
respiratorischen Aktivität von Mitochondrien in Gegenwart und Abwesenheit von ADP.
Die state 3-Atmung war bei Succinat- und Glutamat- Messungen etwa gleich hoch, während
State 4- Werte bei Succinat- Messungen generell höher lagen. Der RCI (state 3/state 4) war
daher bei Messungen mit Succinat prinzipiell niedriger als bei Messungen mit Glutamat (s. Tab.
7 am Beispiel der IFM).
Tab. 7: Respiratorische Kontrollindices von IFM aus normotrophen (Kontrollgruppe) und
2 Wochen nach Zügelung entnommenen Herzen mit Glutamat bzw. Succinat als Substrat
Glutamat
Succinat
Kontrollgruppe
IFM
8,23 ± 1,38
2,82 ± 0,65
2 Wochen n.Z.
IFM
10,42 ± 3,56
3,34 ± 0,86
Mittelwert ± SD, n= 5.
Die Abbildung 19 zeigt die Respiratorischen Kontrollindices (RCI) von Homogenaten (A), SSM
(B) und IFM (C) im zeitlichen Verlauf nach Aortenzügelung. Bei Messungen von Homogenaten
zeigte sich ein Trend zur Abnahme des RCI. Der Unterschied nach Zügelung war aber nicht
signifikant.
Wie die Abbildung 19B zeigt, waren die RCIs aus SSM hingegen zehn Wochen nach Zügelung
bei Messungen mit Succinat als Substrat signifikant reduziert (p < 0,05). Abbildung 19C stellt
die RCIs aus IFM nach Zügelung dar. Bei Messungen mit Glutamat als Substrat zeigte sich zehn
Wochen nach Zügelung eine signifikante Abnahme (p < 0,05).
- 34 -
10
Respiratorischer Kontrollindex (RCI)
A
8
6
4
2
0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
14
Respiratorischer Kontrollindex (RCI)
B
12
10
8
6
*
4
2
0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
16
Respiratorischer Kontrollindex (RCI)
C
14
12
10
8
*
6
4
2
0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
Abb. 19: Respiratorische Kontrollindices (RCI) aus Homogenaten (A), SSM (B) und IFM (C)
von normotrophen sowie von 2, 6 bzw. 10 Wochen nach Aortenzügelung entnommenen Herzen
vergleichend bei Atmungsmessungen mit Glutamat (schwarz) bzw. Succinat (weiß) als Substrat
(Mittelwert ± SD, n= 12). * p < 0,05 vs. Normotrophie.
- 35 -
Der ADP/O- Quotient gibt an, wie viel ADP pro verbrauchtem Sauerstoff zu ATP
phosphoryliert wird. Der Quotient charakterisiert die Kopplung von Sauerstoffverbrauch und
ATP-Generierung in der Atmungskette.
Abbildung 20 zeigt die ADP/O- Quotienten von Homogenaten, SSM und IFM. Es zeigte sich
zwei Wochen nach Aortenzügelung eine bei allen untersuchten Mitochondrienpräparationen
signifikante Reduzierung des ADP/O- Quotienten (p < 0,05). Bei Messungen der Homogenate
mit Glutamat zeigte sich eine Abnahme um ca. 50% (s. Abb. 20A; Kontrollgruppe 1,74 ± 0,44
vs. 2 Wochen nach Zügelung 0,87 ± 0,05; p < 0,01). Sechs und zehn Wochen nach Zügelung
waren die Quotienten bei allen eingesetzten Mitochondrienpräparationen nicht unterschiedlich
zur Kontrollgruppe. Die ADP/O- Quotienten bei Verwendung von Succinat als mitochondriales
Substrat waren durchgängig niedriger als die ADP/O- Quotienten mit Glutamat als
mitochondriales Substrat.
- 36 -
2,5
A
ADP/O- Quotient
2,0
1,5
**
1,0
*
0,5
0,0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
2,0
B
1,8
1,6
ADP/O- Quotient
1,4
1,2
1,0
*
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
2,0
C
1,8
1,6
ADP/O- Quotient
1,4
1,2
*
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Kontrollgruppe
2 Wochen
6 Wochen
10 Wochen
Zeitpunkt nach Zügelung
Abb. 20: ADP/O- Quotient von Homogenaten (A), SSM (B) und IFM (C) aus normotrophen
sowie aus 2, 6 bzw. 10 Wochen nach Aortenzügelung entnommenen Herzen vergleichend bei
Atmungsmessungen mit Glutamat (schwarz) bzw. Succinat (weiß/schraffiert) als Substrat
(Mittelwert ± SD, n= 12). * p < 0,05. ** p < 0,01 vs. Normotrophie.
- 37 -
4. DISKUSSION
In dieser Arbeit wurde der Einfluss einer durch Aortenzügelung induzierten chronischen
Nachlasterhöhung
auf
die
respiratorische
Aktivität
und
Kontrolle
isolierter
Rattenherzmitochondrien untersucht. Es konnte gezeigt werden, (1) dass die maximale ADPstimulierte Atmungsaktivität (state 3- Atmung) aller Mitochondrienpräparationen und vor allem
der interfibrillären Mitochondrien (IFM) mit zunehmender Zeit nach Nachlasterhöhung abnahm.
(2) Der Respiratorische Kontrollindex (RCI), der die respiratorische Kontrolle in Abhängigkeit
der ADP- Konzentration charakterisiert, war im Verlauf nach Zügelung z.T. signifikant
reduziert. (3) Der ADP/O- Quotient war zwei Wochen nach Zügelung vermindert, im späteren
Verlauf nach Nachlasterhöhung aber nicht unterschiedlich zur Kontrollgruppe. Die Gesamtheit
dieser Beobachtungen deutet demnach auf eine Einschränkung und nicht wie erwartet auf eine
Zunahme der respiratorischen Aktivität und Kontrolle nach chronischer Nachlasterhöhung hin.
Eine kontinuierliche Abnahme der mitochondrialen Atmungsaktivität bei chronischer
Nachlasterhöhung könnte das spätere Auftreten einer Herzinsuffizienz erklären.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die respiratorische Aktivität isolierter
Rattenherzmitochondrien mit zunehmender Zeit nach Nachlasterhöhung abnahm. Dieses
Ergebnis ist überraschend. Mitochondrien sind die Zellorganellen, die für die Bereitstellung von
Energie in Form von ATP verantwortlich sind. Die Energie, die das Herz benötigt, um den
Körper mit ausreichend Blut zu versorgen, hängt direkt mit der Arbeitslast des Herzens
zusammen. Bei Erhöhung der Arbeitslast nimmt der Energiebedarf des Herzens zu, bei
Erniedrigung der Arbeitslast nimmt der Energiebedarf ab. Bei Erhöhung der Nachlast würde
man daher eine Erhöhung der mitochondrialen ATP- Synthese erwarten. Es ist davon
auszugehen, dass eine erhöhte ATP- Syntheserate mit einer erhöhten Atmungsketten- Aktivität
einher geht. Daher hätte man erwartet, dass die von uns induzierte Nachlasterhöhung eine
Zunahme und nicht eine Abnahme der maximalen respiratorischen Aktivität der Mitochondrien
zur Folge hat. Die hier gezeigten Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass eine chronische
Nachlasterhöhung eine Beeinträchtigung der mitochondrialen Funktion verursacht, die eine
Anpassung der mitochondrialen Atmung an eine erhöhte myokardiale Arbeitslast nicht oder nur
bedingt zulässt. Die Folge wäre ein relativer Energie- Mangel des chronisch belasteten Herzens.
Bereits 1939 formulierten Herrmann und Decherd die so genannte „energy starvation
hypothesis“. Dieser Hypothese zufolge hat das Herz, das einer chronisch erhöhten Arbeitslast
- 38 -
ausgesetzt ist und in der Folge insuffizient wird, zu wenig Energie, um den veränderten
Arbeitsanforderungen gerecht zu werden. Diese Hypothese wird durch die heutzutage
angewandte Therapie der Herzinsuffizienz (ACE- Inhibitoren, AT- II Blocker, ß- Blocker), die
allesamt die Energieanforderungen an das insuffiziente Herz reduzieren, unterstützt (Ingwall
und Weiss, 2004). Neubauer (2007) unterscheidet im Wesentlichen drei Prozesse im kardialen
Energiestoffwechsel, deren Beeinträchtigung jeweils zum Energiemangel chronisch belasteter
Herzen beitragen könnte: (a) die Substratoxidation, vornehmlich die Oxidation von Fettsäuren
und Glucose, und anschließende Einschleusung der Metaboliten in die Mitochondrien, (b) die
mitochondriale Atmungsaktivität einschließlich der ATP- Synthese und schließlich (c) der ATPTransport aus den Mitochondrien. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Aktivität und
Kontrolle der mitochondrialen Atmung.
Coleman et al. (1969) konnten vor Jahrzehnten zeigen, dass der O2-Verbrauch hypertropher
Herzen erhöht sein kann. Neuere Studien ergaben, dass der O2-Verbrauch hypertropher Herzen
auch unverändert oder erniedrigt sein kann (De Boer et al., 2003; Laine et al., 1999). Studien an
isolierten Mitochondrien ergaben ebenfalls, dass die State 3-Atmung von isolierten
Mitochondrien hypertropher Herzen erhöht (Schwartz, 1971; Sordahl et al., 1973), erniedrigt
(Arcos et al., 1968; Cooper et al., 1973; Takeo et al., 1993) oder auch unverändert sein kann
(Dart und Holloszy, 1969; Leichtweis et al., 1996). Die Heterogenität dieser Ergebnisse könnte
durch methodische Unterschiede zwischen den einzelnen Studien bedingt sein. So können
unterschiedliche
Zusammensetzungen
der
jeweiligen
Mitochondrienpräparationen
die
Studienergebnisse entscheidend beeinflussen.
Im Herzmuskel gibt es zwei Gruppen von Mitochondrien, die sich anhand ihrer intrazellulären
Lokalisation unterscheiden lassen. Mitochondrien, die sich direkt unter der Zellmembran (dem
Sarkolemm) befinden, werden als subsarkolemmale Mitochondrien (SSM) bezeichnet.
Mitochondrien, die in den Muskelfasern eingebettet sind, werden interfibrilläre Mitochondrien
(IFM) genannt. In der Vergangenheit wurden zahlreiche Untersuchungen durchgeführt, die
unterschiedliche biochemische Eigenschaften von IFM und SSM aufzeigten. Die Unterschiede
konnten aber bis dato nicht eindeutig unterschiedlichen Funktionen von IFM und SSM in der
Zelle zugeordnet werden. Es wird davon ausgegangen, dass ATP aus IFM vor allem für die
Muskelkontraktion und ATP aus SSM vor allem für Ionentransportprozesse genutzt wird
(McMillin-Wood et al., 1980; Suh et al., 2003; Weinstein et al., 1986).
- 39 -
In dieser Arbeit haben wir zeigen können, dass in normotrophen Kontrollherzen die
Atmungsaktivität von IFM höher war als diejenige von SSM. Dies steht im Einklang mit
Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen. Palmer et al. (1977) haben zeigen können, dass IFM
gleiche Substrate 1,5 Mal schneller oxidieren als SSM. Matlib et al. (1978) vermuteten, dass die
gezeigten Unterschiede auf methodische Gründe zurück zu führen seien. Palmer et al. (1985)
und Hoppel et al. (1982) konnten jedoch aufzeigen, dass die unterschiedlichen
Atmungsaktivitäten auch erzielt wurden, wenn IFM mit der Methode zur Isolierung der SSM
isoliert wurden und vice versa. Sie vermuteten bereits damals verschiedene metabolische
Funktionen von IFM und SSM (Palmer et al., 1977). Neuere Untersuchungen konnten die
höhere Atmungsaktivität und oxidative Phosphorylierungsrate von IFM vs. SSM bestätigen
(Fannin et al., 1999; Judge et al., 2005). Suh et al. (2003) konnten in diesem Zusammenhang
zeigen, dass IFM einen höheren Gehalt an Cytochromen der Atmungskette und eine höhere
Aktivität der Atmungskettenkomplexe besitzen.
Wir konnten zeigen, dass sich eine chronische Erhöhung der Nachlast in unterschiedlichem
Ausmaß auf die beiden Subgruppen von Mitochondrien auswirkt. Die IFM, die in normotrophen
Herzen noch eine höhere respiratorische Aktivität als die SSM besaßen, waren zehn Wochen
nach Aortenzügelung am stärksten eingeschränkt. Laut aktuellem Review von Stanley et al.
(2005) wurde bis dato lediglich in einer älteren Arbeit von Hoppel et al. (1982) zwischen den
Auswirkungen einer Kardiomyopathie auf IFM und SSM unterschieden. Am Modell von
kongenital- dystrophischen Hamstern konnte damals gezeigt werden, dass die oxidative
Phosphorylierung in kardiomyopathischen Hamstern nur in den IFM, nicht aber in den SSM um
40-50% reduziert war. Bei dem von uns verwendeten Modell der chronischen Nachlasterhöhung
konnte in der Vergangenheit das Auftreten einer Herzinsuffizienz nach elf Wochen gezeigt
werden (Zaha et al., 2003). Die in der vorliegenden Arbeit gezeigte selektive Abnahme der
respiratorischen Aktivität der IFM könnte demnach den Übergang von einer kompensierten in
eine dekompensierte mitochondriale Atmungsaktivität darstellen. Unsere Ergebnisse stehen also
mit denen von Hoppel et al. (1982) im Einklang. Interpretationsversuche für diesen selektiven
Prozess werden durch weitere Unterschiede, die in den vergangenen Jahren zwischen IFM und
SSM festgestellt werden konnten, beeinflusst. Daher werden im Folgenden zuerst weitere
Charakteristika von IFM und SSM vorgestellt, bevor abschließend mögliche Mechanismen für
die selektiv reduzierte respiratorische Aktivität dargestellt werden.
- 40 -
Es konnten in der Vergangenheit Unterschiede in der Ultrastruktur zwischen IFM und SSM
gezeigt werden. Ob die verschiedenen Ultrastrukturen mit den Unterschieden in der
Atmungsaktivität der Mitochondrien in direktem Zusammenhang stehen, ist bis dato unklar.
Riva et al. (2005) konnten an Sprague Dawley- Ratten zeigen, dass IFM und SSM in situ
verschiedenartige „cristae“ besitzen. Cristae sind Einstülpungen der die Atmungskette
beinhaltenden inneren Mitochondrienmembran. Darüber hinaus konnten Riva et al. zeigen, dass
die Struktur von SSM durch das Isolationsverfahren nicht beeinflusst wurde, während IFM
strukturell plastischer waren und sich zwischen in situ- und in vitro- Beobachtungen strukturell
deutlich unterschieden. Durch das Isolationsverfahren induzierte Veränderungen der Struktur
von IFM würden demnach Schlussfolgerungen von in vitro- Beobachtungen auf das in vivoVerhalten von IFM erschweren. Ferner erfordert es weitere Untersuchungen, um festzustellen,
ob
unterschiedliche
Ultrastrukturen
im
Zusammenhang
mit
unterschiedlichen
Atmungsaktivitäten von IFM und SSM, wie sie in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden
konnten, stehen.
Es wurde vermutet, dass die unterschiedliche Lokalisation von IFM und SSM in
Kardiomyocyten nicht nur mit verschiedenen Funktionen assoziiert ist- wahrscheinlich wird
ATP aus IFM vor allem für die Muskelkontraktion und ATP aus SSM vor allem für
Ionentransportprozesse genutzt (Suh et al., 2003)- sondern auch unterschiedliche metabolische
Anforderungen mit sich bringen könnte (Judge et al., 2005). So könnte es sein, dass IFM und
SSM die für die ATP- Synthese nötigen Elektronen grundsätzlich aus der Oxidation
unterschiedlicher Substrate beziehen. Das könnte zu den in dieser Arbeit gezeigten
Unterschieden in der Atmungsaktivität von IFM und SSM hypertropher Herzen beitragen.
Zum besseren Verständnis dieser Theorie werden im Folgenden kurz die charakteristischen
Veränderungen der Substratoxidation im chronisch belasteten Herzen dargestellt. Das
normotrophe Herz gewinnt seine Energie zu 60-90% aus der Fettsäure (FS)- Oxidation und zu
10-40% aus der Glucose- Oxidation (Neubauer, 2007). Im chronisch belasteten Herzen
hingegen liegen andere metabolische Verhältnisse vor. Es konnte mehrfach gezeigt werden,
dass es in chronisch belasteten Herzen zu einer Verschiebung von hauptsächlicher FSOxidation zu vorwiegender Glucose- Oxidation kommt. Dieses Phänomen wird als sog.
„substrate- switch“ bezeichnet. Ferner konnte Mjøs (1971) zeigen, dass die mechanische
- 41 -
Effizienz des Herzens, i.e. die Umwandlung von chemischer Energie aus Substraten zu
mechanischer Arbeit, bei der Glucose- Oxidation größer ist als bei der FS- Oxidation. Dies
konnte mittlerweile von unzähligen Arbeitsgruppen bestätigt werden. So haben beispielsweise
auch Ingwall und Weiss (2004) zeigen können, dass die Glucose- Oxidation effizienter ist
(gemessen in generiertem ATP pro verbrauchtem O2). Letzterer konnte auch zeigen, dass eine
Erhöhung der Glucose- Aufnahme- Rate in die Zelle durch vermehrte Expression des GLUT 1Transporters zu einer verzögerten Progression der Herzinsuffizienz führte. Eine verminderte
GLUT 4- Dichte hingegen führte zu einer Abnahme der systolischen Funktion und zu einer
Entwicklung einer dilatativen Kardiomyopathie. Es sind noch sehr viele offene Fragen zu
diesem Wechsel von überwiegender FS- zu überwiegender Glucose- Oxidation im chronisch
belasteten Herzen zu beantworten. So ist vor allem bis dato nicht geklärt, ob dieser „substrateswitch“ eine negative Konsequenz und damit einen maladaptiven Prozess oder aber eine
Gegenregulation und damit einen adaptiven Prozess des hypertrophen Herzens darstellt. Diese
Frage geht aber über die potentielle Bedeutung des „substrate- switch“ auf Veränderungen der
respiratorischen Rate von IFM und SSM hinaus und ist daher für die vorliegende Arbeit nicht
von Bedeutung. Wichtig für das Verständnis der vorliegenden Arbeit ist jedoch die Erkenntnis,
dass die Glykolse von Kardiomyozyten nur in speziellen Kompartimenten des Zytosols abläuft.
Die
Glykoylse
von
Kardiomyozyten
erfolgt
wahrscheinlich
in
subsarkolemmalen
Kompartimenten, also in unmittelbarer Nähe der SSM. Das konnte durch in silicoUntersuchungen von Zhou et al. (2005) gezeigt werden. Diese Kompartimente nehmen lediglich
ca. 10% des Gesamtzellvolumens ein. Mehrere Arbeitsgruppen (Entman et al., 1977; Pierce und
Philipson, 1985; Xu et al., 1995; Weiss und Hiltbrand, 1985) konnten zeigen, dass die
glykolytischen Enzyme in der Zelle in unmittelbarer Nähe des sarkoplasmatischen Retikulums
und des Sarkolemms lokalisiert und nicht etwa über das gesamte Zytosol verteilt sind. Weiss
und Lamp (1987 & 1989) vermuteten, dass glykolytisch generiertes ATP vornehmlich zur IonHomeostasis benutzt wird. Sie konnten diese Vermutung durch ihre Studien stützen. Die
Ansicht wiederum, dass das für die Ion- Homeostasis nötige ATP überwiegend aus den SSM
stammt, ist weit verbreitet. Glykolytische Enzyme und SSM scheinen also nicht nur in
unmittelbarer Nachbarschaft zueinander zu liegen, sondern auch in die gleichen energetischen
Prozesse eingebunden zu sein. Diese Beobachtungen lassen es möglich erscheinen, dass SSM
die für die ATP- Synthese nötigen Elektronen ausschließlich oder zumindest überwiegend aus
der Oxidation von Glucose gewinnen.
- 42 -
Ein Modell, nach dem die SSM ihre Energie hauptsächlich aus der Glucose- Oxidation
gewinnen, hätte weitreichende Folgen für die Interpretation dieser und anderer Arbeiten. Dies
ließe vermuten, dass IFM ihre Energie sowohl aus der Glucose- als auch der Fettsäure (FS)Oxidation bzw. hauptsächlich aus der FS- Oxidation gewinnen. SSM und IFM bezögen also die
für die ATP- Synthese notwendigen Elektronen nicht im gleichen Verhältnis aus der Fettsäureund Glucose- Oxidation. Dieser Unterschied könnte vor dem Hintergrund des oben
beschriebenen „substrate- switch“ chronisch belasteter Herzen eine Erklärung für die in unserer
Arbeit gezeigten Unterschiede in der Atmungsaktivität von SSM und IFM sein.
Zusammenfassend gilt, dass (a) die respiratorische Aktivität von IFM in der vorliegenden Arbeit
am stärksten eingeschränkt war. (b) Im chronisch belasteten Herzen nimmt die FS- Oxidation
mit zunehmender Zeit ab, während die Glucose- Oxidation gegensätzlich zunimmt („substrateswitch“). (c) ATP aus IFM ist höchstwahrscheinlich für die kontraktilen Prozesse im Herzen
nötig. (d) Sowohl SSM als auch die glykolytischen Enzyme sind subsarkolemmal gelegen und
sind höchstwahrscheinlich beide in energetische Prozesse zur Aufrechterhaltung der IonHomeostase eingebunden.
Die Summe dieser Beobachtungen liefert einen möglichen Mechanismus für die selektive
Abnahme der respiratorischen Aktivität von interfibrillären Mitochondrien (IFM): SSM könnten
ihre Energie hauptsächlich aus der Oxidation von Glucose gewinnen, IFM hingegen aus der
Fettsäure- und Glucose- Oxidation. Kommt es mit zunehmender Zeit nach Arbeitslasterhöhung
in hypertrophen Herzen zum oben beschriebenen „substrate- switch“, sind vor allem die IFM
durch die Abnahme der FS- Oxidation beeinträchtigt. SSM hingegen wären davon nicht oder
nicht in gleichem Ausmaß negativ beeinflusst. Mit zunehmendem Grad der Herzhypertrophie
und letzten Endes der Dekompensation reduziert sich die Rate an Elektronen, die die IFM aus
der Oxidation der FS gewinnen. Der reduzierte Elektronenfluss durch die Atmungskette der
IFM könnte neben anderen Faktoren zu einer eingeschränkten respiratorischen Aktivität der
IFM beitragen. Das Resultat wäre eine verminderte ATP- Synthese durch die IFM und die
Konsequenz eine beeinträchtigte Funktion der Myofibrillen. In der Summe wäre dies ein
möglicher Mechanismus, nach dem die Abnahme der respiratorischen Rate vor allem der IFM
in direktem Zusammenhang steht mit der eingeschränkten Kontraktilität chronisch belasteter
Herzen. Es wäre daher für die Zukunft von großem Interesse, ob weitere Untersuchungen den
hier vermuteten Einfluss der Glykolyse auf die respiratorische Aktivität von SSM zeigen
- 43 -
können. Studien, die in insuffizienten Herzen den Einfluss einer Hemmung der Glykolyse auf
SSM und IFM getrennt untersuchen, könnten in dieser Frage hilfreich sein.
Hoppel et al. hatten bereits 1982 die unterschiedlichen Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen an
isolierten Mitochondrien auf eine Heterogenität in der Zusammensetzung der Isolate (Verhältnis
IFM: SSM) zurückgeführt. Unsere Ergebnisse unterstreichen, dass es für zukünftige Arbeiten an
isolierten Mitochondrien und für die Vergleichbarkeit der Arbeiten untereinander essentiell ist,
IFM und SSM voneinander getrennt zu untersuchen und den Einfluss chronischer
Arbeitslasterhöhung auf IFM und SSM getrennt zu bewerten.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Respiratorische Kontrollindex (RCI) von SSM
und IFM nach Aortenzügelung teilweise signifikant reduziert war. Der RCI berechnet sich aus
dem Verhältnis von state 3- zu state 4- Atmung (state 3/ state 4). Die state 3- Atmung der
Mitochondrienpräparationen und vor allem der IFM war nach Zügelung reduziert, state 4Atmung hingegen war durch Zügelung weitestgehend unbeeinflusst. Dadurch erklärt sich rein
rechnerisch die Abnahme der RCIs mit zunehmender Zeit nach Nachlasterhöhung. Eine
Abnahme
des
RCI
bedeutet
eine
Abnahme
der
respiratorischen
Kontrolle.
Als
Atmungskontrolle bezeichnet man die Regulation der Geschwindigkeit der oxidativen
Phosphorylierung durch den ADP- Spiegel (Stryer et al., 2003). Eine reduzierte
Atmungskontrolle bedeutet demnach, dass die oxidative Phosphorylierungsrate nur noch
eingeschränkt durch den ADP- Spiegel kontrolliert wird. Im gesunden Herzen führt eine
Zunahme der ADP- Konzentration infolge ATP- Verbrauch zu einer Stimulierung der
Atmungsaktivität (Stryer et al., 2003). Eine Abnahme der ADP- Konzentration führt zu einer
Abnahme der respiratorischen Aktivität. Eine Reduzierung des RCI durch chronische
Nachlasterhöhung bedeutet somit, dass die Kopplung von Elektronenfluss und ATP- Synthese
in der Atmungskette nur noch eingeschränkt durch Unterschiede in der ADP- Konzentration
kontrolliert wird.
Unsere Ergebnisse zeigten keine unterschiedlichen RCIs von SSM vs. IFM, weder in
normotrophen noch in hypertrophen Herzen. Judge et al. (2005) hingegen zeigten an
normotrophen Rattenherzen, dass der RCI in IFM größer war als in SSM. Fannin et al. (1999)
und Suh et al. (2003) hingegen fanden unseren Ergebnissen entsprechend ebenfalls keine
Unterschiede im RCI zwischen SSM und IFM. Ob sich die respiratorische Kontrolle von SSM
- 44 -
und IFM in normotrophen Herzen unterscheidet und/oder sich in hypertrophen Herzen auf
unterschiedliche Art und Weise verändert, kann aus diesen wenigen Daten nicht endgültig
geschlossen werden. Dies erfordert weitere Untersuchungen.
In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass die ADP/O- Quotienten von Homogenaten, SSM und
IFM zwei Wochen nach Aortenzügelung signifikant reduziert, sechs und zehn Wochen nach
Zügelung hingegen nicht unterschiedlich zu normotrophen Herzen waren. Das bedeutet, dass
unsere Messungen eine verminderte Kopplung von Sauerstoffverbrauch und ADPPhosphorylierung kurze Zeit nach Nachlasterhöhung ergaben. Mit zunehmender Zeit nach
Aortenzügelung entspricht die Kopplung wieder den bei normotrophen Herzen gemessenen
Verhältnissen.
Die Kopplung von Substratoxidation, Elektronenfluss und Sauerstoffverbrauch auf der einen
Seite mit der Phosphorylierung von ADP zu ATP auf der anderen Seite kann durch
verschiedene Faktoren beeinflusst werden. So kann z.B. die Aufhebung der strukturellen
Integrität der inneren Mitochondrienmembran oder Schäden an Atmungskettenkomplexen eine
reduzierte Kopplung zur Folge haben (Lesnefsky et al., 2001). Außerdem können so genannte
„uncoupling proteins“ (UCP) die Kopplung beeinflussen (Boss et al., 2000). Diese Proteine
erniedrigen den über die innere Mitochondrienmembran aufgebauten Protonengradienten,
indem sie Protonen aus dem Intermembranraum in die mitochondriale Matrix entlang des
elektrochemischen Gradienten einströmen lassen. Bei diesem Vorgang wird allerdings entgegen
dem Einströmen von Protonen durch die ATP- Synthase kein ATP, sondern Hitze erzeugt.
Daher führen UCP zu einer Beeinträchtigung der Kopplung von Sauerstoffverbrauch und ATPSynthese.
Murray et al. (2004) konnten zeigen, dass es eine positive Korrelation zwischen der
Plasmakonzentration von freien Fettsäuren (FFS) und der Dichte der beiden kardialen UCPIsoformen UCP 2 und 3 im Herzen gibt. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass es eine
negative Korrelation zwischen der FFS- Plasmakonzentration und der Dichte des GlucoseTransporters GLUT 4 gab. Eine hohe FFS- Konzentration war also mit einer hohen UCP 2/3und einer niedrigen GLUT 4- Dichte, i.e. niedrigen Glucose- uptake- Rate, assoziiert. Laut
Murray könnte die bei HI- Patienten festgestellte adaptive Sympathikusaktivierung zu einer
Stimulierung
der
Lipolyse
führen
mit
- 45 -
der
Konsequenz
einer
erhöhten
FFS-
Plasmakonzentration. Diese wiederum könnte wie oben beschrieben zu einer Erhöhung der UCP
2/3- Dichte und zu einer Erniedrigung der Glucose- Aufnahme- Rate durch die Kardiomyocyten
führen. Die Kombination aus erstens einer beeinträchtigten Kopplung von Elektronenfluss und
ATP- Synthese sowie zweitens einer verminderten Substrataufnahme könnte dann laut Murray
et al. zur Insuffizienz des Herzens führen.
Dieser vorgeschlagene Mechanismus ist mit unseren Ergebnissen nicht vereinbar. Wir konnten
eine Verminderung des ADP/O- Quotienten zwei Wochen nach Zügelung feststellen. Falls der
von Murray vorgeschlagene Mechanismus auch unseren Beobachtungen zu Grunde läge,
müsste die FFS- Plasmakonzentration bereits nach zwei Wochen erhöht sein. Die Folge wäre
eine erhöhte UCP- und eine erniedrigte GLUT 4- Dichte. Die von Murray et al. (2004)
vorgeschlagene adaptive Sympathikusaktivierung jedoch basiert auf einem verminderten
kardialen Output und einer Sauerstoffmangelversorgung des peripheren Gewebes. Diese
Phänomene treten vermutlich erst im späteren Verlauf nach chronischer Erhöhung der Arbeitlast
auf und manifestieren sich bei dem hier angewandten Tiermodell (Zaha et al., 2003)
wahrscheinlich nicht schon nach zwei Wochen. Eine erhöhte Sympathikusaktivierung mit der
Folge einer erhöhten Lipolyse und damit einer erhöhten FFS- Plasmakonzentration wäre
demnach erst später als zwei Wochen nach Zügelung zu erwarten.
Außerdem
könnte
zu
einem
solch
frühen
Zeitpunkt
nach
Nachlasterhöhung
die
Fettsäureoxidation noch aktiver sein als die Glucose- Oxidation. Das wiederum würde bedeuten,
dass eine hohe FFS- Konzentration zu einer hohen Rate an Fettsäureoxidation und eben nicht
zur FFS- Akkumulation führen würde. Selbst bei erhöhter Sympathikusaktivierung würde die
FFS- Konzentration in einem solchen Fall nicht oder nur unwesentlich steigen. Der von Murray
et al. vorgeschlagene Mechanismus kann also nicht zu einer Erniedrigung des ADP/OQuotienten kurze Zeit nach Nachlasterhöhung führen. Vielmehr spricht der vorgeschlagene
Mechanismus für eine kontinuierliche Erniedrigung des ADP/O- Quotienten mit zunehmender
Zeit nach Zügelung.
Hoppel et al. (1982) konnten keinerlei Veränderungen des ADP/O- Quotienten in
Herzinsuffizienz- Hamstern nachweisen, weder in IFM noch in SSM. Die Veränderungen der
Kopplung von Sauerstoffoxidation und ATP- Synthese in hypertrophen und insuffizienten
Herzen bleibt weiterhin unklar.
- 46 -
Unsere Ergebnisse zeigten keine Unterschiede in den ADP/O- Quotienten von SSM und IFM.
Dies deckt sich mit den Ergebnissen anderer Arbeiten (Palmer et al., 1985; Shin et al., 1989;
Suh et al., 2003).
Die
wesentlichen
Ergebnisse
unserer
Arbeit
waren
unabhängig
vom
eingesetzten
mitochondrialen Substrat Glutamat oder Succinat. Dies steht im Einklang mit einer älteren,
konzeptionell ähnlichen Arbeit von Hoppel et al. an kardyomyopathischen Hamstern (Hoppel et
al., 1982). Diese Beobachtung könnte bei der Lokalisierung von Schäden in Mitochondrien aus
hypertrophen Herzen hilfreich sein.
Die bei der Oxidation von Glutamat gewonnen Elektronen werden über den Komplex I in die
Atmungskette (AK) eingeschleust, die Elektronen aus der Succinat- Oxidation hingegen über
den Komplex II. Da sich die respiratorische Aktivität substrat- unabhängig veränderte, könnte
man vermuten, dass die Veränderungen in Mitochondrien aus hypertrophen Herzen nicht oder
nicht hauptsächlich den Komplex I der AK betrafen. Wäre das dennoch der Fall, hätte man
Unterschiede erwarten müssen zwischen Messungen mit diesen beiden Substraten, da bei
Succinat- Messungen der Komplex I als Ursache für die verminderte Atmungsaktivität praktisch
nicht in Frage kommt. Darüber hinaus wurde der Komplex I neben dem Komplex V als Ort der
größten Kontrolle über die oxydative Phosphorylierung beschrieben (Borutaite et al., 1995;
Gellerich et al., 1983; Groen et al., 1982). Laut Lesnefsky et al. (2001) hat eine minimale
Beeinträchtigung der Komplex I- Funktion unmittelbar eine Abnahme der oxidativen
Phosphorylierung zur Folge. Sollte bei unseren Messungen tatsächlich der AK- Komplex I
beeinträchtigt sein, würde man einen Unterschied zwischen Messungen mit Succinat vs.
Glutamat erwarten. Dieser Unterschied zeigte sich aber nicht.
Die Heterogenität bisheriger Untersuchungen von Schäden an AK- Komplexen in insuffizienten
Herzen erschwert die Einordnung unserer Ergebnisse. Jarreta et al. (2000) konnten in
insuffizienten menschlichen Herzen eine Abnahme der Komplex III- Aktivität um 35% ohne
Veränderungen der anderen AK- Komplexe zeigen. Andere Autoren konnten Defekte der
Komplexe III und IV (Buchwald et al., 1990) bzw. der Komplexe III und V (Marin-Garcia et
al., 2001) zeigen. Ide et al. (1999) hingegen konnten an dem gleichen Modell wie Marin- Garcia
et al. eine 50%ige Abnahme der Komplex I- Aktivität in insuffizienten Herzen feststellen.
Scheubel et al. (2002) konnten ebenfalls eine Abnahme der Komplex I- Aktivität (-28%) an
- 47 -
menschlichen Herzen zeigen. Schließlich konnten wiederum Ide et al. eine Beeinträchtigung
aller AK- Komplexe außer des vollständig nukleär kodierten Komplex II feststellen (Ide et al.,
2001).
Zusammenfassend lässt sich daraus schließen, dass Beeinträchtigungen der Komplexe I, III, IV
und V beschrieben worden sind. Veränderungen am einzigen vollständig vom Zellkern
kodierten Komplex II sind bis dato jedoch nicht gesehen worden (Casademont und Miro, 2002).
Die Frage nach der Lokalisation von AK- Komplex- Defekten in chronisch belasteten Herzen
geht weit über die Fragestellungen der vorliegenden Arbeit hinaus. Inwiefern die in der
vorliegenden Arbeit gezeigten substrat- unabhängigen Veränderungen gegen Defekte am
Komplex I der AK sprechen, bleibt offen.
Schließlich sollte bei der Interpretation sämtlicher Ergebnisse die in dieser Arbeit angewandte
Methode kritisch betrachtet werden. Im Folgenden wird der Einfluss (a) unterschiedlicher
Hypertrophiegrade, (b) altersbedingter, Arbeitslast- unabhängiger Veränderungen und
(c) sonstiger methodischer Aspekte auf die Atmungsaktivität isolierter Mitochondrien diskutiert.
Die unterschiedlichen Ergebnisse verschiedener Arbeitsgruppen bezüglich der Atmungsaktivität
isolierter
Mitochondrien
könnten
unter
anderem
durch
unterschiedlich
gewählte
Hypertrophiemodelle bedingt sein. Das in dieser Arbeit verwendete Modell der durch
Aortenzügelung induzierten chronischen Nachlasterhöhung ist in unserem Labor etabliert. Es
konnte bereits in der Vergangenheit gezeigt werden, dass sich mit zunehmender Zeit eine
myokardiale Hypertrophie mit Auftreten von Symptomen einer Herzinsuffizienz nach etwa drei
Monaten entwickelt (Zaha et al., 2003). Diese Beobachtungen sind allerdings unmittelbar mit
dem verbleibenden Innendurchmesser des Aortenbogens nach Aortenzügelung assoziiert. Ein
verringerter
Durchmesser
des
Aortenbogenlumens
könnte
zu
einer
vermehrten
Nachlasterhöhung führen. Ein vergrößerter Durchmesser des Gefäßlumens könnte zu einer
verminderten Nachlasterhöhung führen. Unterschiedliche Grade der Nachlasterhöhung wegen
Unterschieden im von Hand durchgeführten Zügelungsprozess könnten somit direkte
Auswirkungen auf den Ausprägungsgrad der Hypertrophie innerhalb dieses Modells haben. Das
Ausmaß der Hypertrophie wiederum spielt eine wichtige Rolle bei der Bewertung der
mitochondrialen Funktionseinschränkung nach chronischer Nachlasterhöhung.
- 48 -
In der vorliegenden Arbeit wurden Veränderungen der mitochondrialen Aktivität zu
unterschiedlichen Zeitpunkten nach Zügelung verglichen mit einer Kontrollgruppe (KG). Die
KG setzte sich aus 11 Wochen alten, nicht operierten Ratten zusammen. Die Herzen aus den
operierten Ratten wurden im Alter von 5, 9 und 13 Wochen entnommen und verarbeitet. Das
bedeutet, dass zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt Unterschiede im Lebensalter von
operierten vs. nicht- operierten (KG) Tieren vorlagen.
Unterschiede im Lebensalter können die mitochondriale Funktion trotz gleich bleibender
Arbeitslast beeinflussen. Mehrere Autoren konnten zeigen, dass Alterungsprozesse („aging“)
selektiv IFM, nicht aber SSM beeinträchtigen (Judge et al., 2005; Riva et al., 2006; Suh et al.,
2003). Fannin et al. (1999) konnten eine Abnahme der oxydativen Phosphorylierungsrate in
IFM von 24 Monate alten vs. 6 Monate alten Ratten zeigen. SSM blieben davon unberührt. In
einer Studie von Judge et al. (2005) nahm die state 3- Atmung der SSM sogar im Alter zu. Die
Autoren vermuteten, dass dies ein Kompensationsmechanismus für die reduzierte state 3Atmung der IFM sein könnte. Es konnte darüber hinaus festgestellt werden, dass in IFM aus
älteren Tieren eine vermehrte Bildung von Sauerstoffradikalen vorliegt (Judge et al., 2005; Suh
et al., 2003). Diese Radikale sollen zu einer Schädigung der mitochondrialen DNA (mtDNA)
und der Atmungskette (AK) selbst führen. Das wiederum würde zu einer verstärkten Bildung
von Radikalen durch die AK führen mit den beschriebenen Konsequenzen. Dieser Mechanismus
könnte nach Suh et al. (2003) zu fibrotischen Umbauprozessen und reduzierter Kontraktilität
älterer, nicht zusätzlich chronisch- belasteter Herzen beitragen.
Mehrere Autoren konnten zeigen, dass der beschriebene Mechanismus auch ursächlich an der
Entstehung und/oder Progression der Herzinsuffizienz beteiligt sein könnte (Ide et al., 2001;
Sheeran und Pepe, 2006; Tsutsui, 2006). Diese Beobachtungen sind für die Planung von
zukünftigen Studien von isolierten Mitochondrien aus hypertrophen Herzen wichtig. Es wäre
hilfreich, mehrere Kontrollgruppen zu bilden, die jeweils im Alter mit den operierten Tieren
übereinstimmen. Man könnte dann die Werte der operierten mit den Werten der gleichaltrigen
nicht operierten Tiere vergleichen. Damit könnten dann Unterschiede zwischen gezügelten und
nicht gezügelten Tieren noch deutlicher auf die Zügelung zurück zu führen sein. Aging- Effekte
wären in einem solchen Studienkonzept nicht mehr relevant.
- 49 -
In unserer Arbeit lagen nur geringfügige Unterschiede im Lebensalter zwischen operierten und
nicht- operierten Tieren vor. Der maximale Unterschied betrug 6 Lebenswochen. Darüber
hinaus zeigten sich „aging“- Effekte bei allen oben erwähnten Arbeiten erst im fortgeschrittenen
Lebensalter des jeweiligen Tiermodells. Stanley et al. (2005) warnen davor, „aging“- Effekte in
Hypertrophie- Modellen wie dem von uns verwendeten über zu bewerten. Die meisten
Hypertrophie- und HI- Modelle würden an juvenilen oder jungen Tieren durchgeführt werden,
in denen „aging“- Effekte keine Relevanz hätten (Stanley et al., 2005). Daher sind die in dieser
Arbeit gezeigten Veränderungen der mitochondrialen Atmungsaktivität höchstwahrscheinlich
auf die Nachlasterhöhung zurück zu führen. „Aging“- Effekte spielen also in der vorliegenden
Arbeit keine oder nur eine geringfügige Rolle.
Der unterschiedliche Einfluss von Alterungsprozessen auf SSM vs. IFM unterstreicht, wie
wichtig es ist, in Studien an kardialen Mitochondrien SSM und IFM getrennt voneinander zu
bewerten.
Schließlich können noch andere methodische Aspekte Auswirkungen auf die Atmungsaktivität
von Mitochondrien haben. Es konnte gezeigt werden, dass NO c-GMP vermittelt die GlucoseAufnahme in Kardiomyocyten hemmen (Depre et al., 1998) und die Aufnahme und Oxidation
von Fettsäuren erhöhen kann (Recchia et al., 1999; Recchia et al., 2002). NO könnte eine
wichtige Funktion im oben beschriebenen „substrate“- switch einnehmen. Dadurch wären in
vitro- Modelle, die die Verhältnisse der NO- Konzentrationen in vivo nicht vollständig
respektieren, nur bedingt aussagefähig. Ferner konnte ein Einfluss des verwendeten
Anästhetikums (Stowe und Kevin, 2004) auf die respiratorische Funktion gezeigt werden.
- 50 -
Schlussfolgerung:
Eine durch chronische Erhöhung der Nachlast induzierte myokardiale Hypertrophie geht mit
einer kontinuierlichen Abnahme der maximalen respiratorischen Aktivität (state 3- Atmung)
und Kontrolle (RCI) isolierter Rattenherzmitochondrien und dabei vor allem der IFM einher.
Die Kopplung von Substratoxidation und ATP- Synthese (ADP/O) ist nach Nachlasterhöhung
zwischenzeitlich reduziert. Diese Befunde könnten ursächlich mit dem Auftreten einer
Herzinsuffizienz nach chronischer Arbeitsbelastung des Herzens zusammen hängen.
- 51 -
5. ZUSAMMENFASSUNG
Hintergrund: Eine chronische Erhöhung der myokardialen Nachlast führt zu einer
Hypertrophie und geht mit einem vermehrten Bedarf an ATP, welches in der Atmungskette
generiert wird, einher. Wir stellten die Hypothese auf, dass im Zuge der Hypertrophie die
maximale respiratorische Kapazität isolierter Mitochondrien aus Rattenherzen zunimmt.
Material und Methoden: In männlichen Sprague Dawley Ratten von 50-80g Körpergewicht
wurde durch Zügelung des Aortenbogens eine chronische Nachlasterhöhung induziert.
Subsarkolemmale (SSM) und interfibrilläre (IFM) Mitochondrien wurden zwei, sechs und zehn
Wochen nach Zügelung mittels differentieller Zentrifugation isoliert. Mit Glutamat bzw.
Succinat als Substrat wurde der maximale ADP-stimulierte O2-Verbrauch (State 3-Atmung)
gemessen und die Atmung nach ADP- Verbrauch (state 4) sowie der ADP/O- Quotient und der
Respiratorische Kontrollindex (RCI) (state3/state4) mittels Clark-Elektrode ermittelt. Die
Citratsynthase (CS) wurde als mitochondriales Markerenzym verwendet und der Quotient aus
latenter und freier CS-Aktivität (CSR) als Marker für mitochondriale Integrität bestimmt.
Ergebnisse: Chronische Erhöhung der Nachlast führte zu einer signifikanten Hypertrophie
(Ventrikel- zu Körpergewicht 2,28 ± 0,08 in Kontrollgruppe vs. nach 2 Wochen 5,63 ± 0,36 und
nach 6 Wochen 5,02 ± 0,46 g/kg; p < 0,01). Die Gesamtausbeute an SSM und IFM aus den
Homogenaten blieb gleich in den hypertrophen Herzen (38,31 ± 0,9%). Die
Gesamt-
Citratsynthase- Aktivität war nach Zügelung nicht unterschiedlich zur Kontrollgruppe. Der CSR
blieb nach Zügelung unverändert.
Die state 3-Atmung betrug in der Kontrollgruppe
212,8 nAtomeO/CS-latent bei IFM und 172,5 nAtomeO/CS-latent bei SSM. Die state 3-Atmung
beider Subpopulationen nahm mit zunehmender Zeit nach Zügelung ab. 10 Wochen nach
Zügelung waren die IFM in ihrer state 3-Atmung am stärksten eingeschränkt (61,8 ± 7,3
nAtomeO/CS-latent; p < 0,05). Die state 4- Atmung lag bei Succinat- Messungen generell höher
als bei vergleichbaren Glutamat- Messungen. Die state 4-Atmung blieb durch Zügelung
unbeeinflusst. Der RCI war nach 10 Wochen z.T. signifikant reduziert (IFM: 8,23 ± 1,38 vs.
4,99 ± 0,96; p < 0,05). Der ADP/O- Quotient war nach 2 Wochen reduziert (1,74 ± 0,44 vs. 0,87
± 0,05; p < 0,01), sonst aber unverändert. Schlussfolgerungen: Eine durch chronische
Nachlasterhöhung hervorgerufene Hypertrophie geht wider Erwarten mit einer kontinuierlichen
Abnahme der maximalen respiratorischen Aktivität (state 3- Atmung) und Kontrolle isolierter
Herzmitochondrien und dabei vor allem der IFM einher. Darüber hinaus kommt es zu einer
zwischenzeitlichen Reduzierung der Kopplung von Elektronenfluss und ATP- Synthese
(ADP/O- Quotient) in der Atmungskette. Die Reduzierung der respiratorischen Aktivität stellt
möglicherweise eine Ursache für das Auftreten einer späteren Herzinsuffizienz dar.
- 52 -
6. LITERATURVERZEICHNIS
Arcos, J. C., Sohal, R. S., Sun, S. C., Argus, M. F., und Burch, G. E. (1968). Changes in
ultrastructure and respiratory control in mitochondria of rat heart hypertrophied by exercise.
Exp Mol Pathol 8, 49-65.
Bartels, H. (1951). [Potentiometric determination of the oxygen pressure in whole blood with
the mercury drip electrode; theory and practice.]. Pflugers Arch 254, 107-125.
Borutaite, V., Mildaziene, V., Brown, G. C., und Brand, M. D. (1995). Control and kinetic
analysis of ischemia-damaged heart mitochondria: which parts of the oxidative phosphorylation
system are affected by ischemia? Biochim Biophys Acta 1272, 154-158.
Boss, O., Hagen, T., und Lowell, B. B. (2000). Uncoupling proteins 2 and 3: potential regulators
of mitochondrial energy metabolism. Diabetes 49, 143-156.
Buchwald, A., Till, H., Unterberg, C., Oberschmidt, R., Figulla, H. R., und Wiegand, V. (1990).
Alterations of the mitochondrial respiratory chain in human dilated cardiomyopathy. Eur Heart J
11, 509-516.
Casademont, J., und Miro, O. (2002). Electron transport chain defects in heart failure. Heart Fail
Rev 7, 131-139.
Chance, B. und Hagihara, B. (1963). Direct spectroscopic measurements of interaction of
components of the respiratory chain with ADP, phosphate and uncoupling agents. In:
Proceedings of the 5th International Congress of Biochemstry. Pergamon Press, London, p. 3
Chance, B., und Williams, G. R. (1955a). A method for the localization of sites for oxidative
phosphorylation. Nature 176, 250-254.
Chance, B., und Williams, G. R. (1955b). Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I.
Kinetics of oxygen utilization. J Biol Chem 217, 383-393.
Chance, B., und Williams, G. R. (1955c). Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation.
III. The steady state. J Biol Chem 217, 409-427.
Chance, B., und Williams, G. R. (1955d). A simple and rapid assay of oxidative
phosphorylation. Nature 175, 1120-1121.
Chance, B., und Williams, G. R. (1956). The respiratory chain and oxidative phosphorylation.
Adv Enzymol Relat Subj Biochem 17, 65-134.
- 53 -
Chandler, M. P., Kerner, J., Huang, H., Vazquez, E., Reszko, A., Martini, W. Z., Hoppel, C. L.,
Imai, M., Rastogi, S., Sabbah, H. N., und Stanley, W. C. (2004). Moderate severity heart failure
does not involve a downregulation of myocardial fatty acid oxidation. Am J Physiol Heart Circ
Physiol 287, H1538-1543.
Chemnitius, J.M., Häfner, P., Kreuzer, H. und Zech, R. (1988). Latent and free citrate synthase
activity as enzymatic indicators for respiratory potential of isolated porcine heart mitochondria.
J Appl Cardiol 3: 301-310
Chemnitius, J. M., Manglitz, T., Kloeppel, M., Doenst, T., Schwartz, P., Kreuzer, H., und Zech,
R. (1993). Rapid preparation of subsarcolemmal and interfibrillar mitochondrial subpopulations
from cardiac muscle. Int J Biochem 25, 589-596.
Clark, L. C., Jr., Wolf, R., Granger, D., und Taylor, Z. (1953). Continuous recording of blood
oxygen tensions by polarography. J Appl Physiol 6, 189-193.
Coleman, H. N., Sonnenblick, E. H., und Braunwald, E. (1969). Myocardial oxygen
consumption associated with external work: the Fenn effect. Am J Physiol 217, 291-296.
Cooper, G. t., Puga, F. J., Zujko, K. J., Harrison, C. E., und Coleman, H. N., 3rd (1973). Normal
myocardial function and energetics in volume-overload hypertrophy in the cat. Circ Res 32,
140-148.
Dart, C. H., Jr., und Holloszy, J. O. (1969). Hypertrophied non-failing rat heart; partial
biochemical characterization. Circ Res 25, 245-253.
Das, A. M., und Harris, D. A. (1992). Mitochondrial ATP synthase regulation in heart: defects
in hypertension are restored after treatment with captopril. Cardioscience 3, 227-232.
De Boer, R. A., Pinto, Y. M., und Van Veldhuisen, D. J. (2003). The imbalance between oxygen
demand and supply as a potential mechanism in the pathophysiology of heart failure: the role of
microvascular growth and abnormalities. Microcirculation 10, 113-126.
Dent, M. R., Dhalla, N. S., und Tappia, P. S. (2004). Phospholipase C gene expression, protein
content, and activities in cardiac hypertrophy and heart failure due to volume overload. Am J
Physiol Heart Circ Physiol 287, H719-727.
Depre, C., Gaussin, V., Ponchaut, S., Fischer, Y., Vanoverschelde, J. L., und Hue, L. (1998).
Inhibition of myocardial glucose uptake by cGMP. Am J Physiol 274, H1443-1449.
- 54 -
Entman, M. L., Bornet, E. P., Van Winkle, W. B., Goldstein, M. A., und Schwartz, A. (1977).
Association of glycogenolysis with cardiac sarcoplasmic reticulum: II. Effect of glycogen
depletion, deoxycholate solubilization and cardiac ischemia: evidence for a phorphorylase
kinase membrane complex. J Mol Cell Cardiol 9, 515-528.
Estabrook, R. (1967). Mitochondrial respiratory control and the polarographic measurement of
ADP:O ratios. In: Methods in Enzymology. Academic Press, San Diego, pp. 41-47
Fannin, S. W., Lesnefsky, E. J., Slabe, T. J., Hassan, M. O., und Hoppel, C. L. (1999). Aging
selectively decreases oxidative capacity in rat heart interfibrillar mitochondria. Arch Biochem
Biophys 372, 399-407.
Gellerich, F. N., Bohnensack, R., und Kunz, W. (1983). Control of mitochondrial respiration.
The contribution of the adenine nucleotide translocator depends on the ATP- and ADPconsuming enzymes. Biochim Biophys Acta 722, 381-391.
Groen, A. K., Wanders, R. J., Westerhoff, H. V., van der Meer, R., und Tager, J. M. (1982).
Quantification of the contribution of various steps to the control of mitochondrial respiration. J
Biol Chem 257, 2754-2757.
Häfner, P. (1989). Latente und freie Citratsynthase-Aktivitäten als enzymologischer Parameter
zur Charakterisierung von Herzmuskelmitochondrien. Medizinische Dissertation, GeorgAugust-Universität Göttingen: S. 1-86
Hafstad, A. D., Solevag, G. H., Severson, D. L., Larsen, T. S., und Aasum, E. (2006). Perfused
hearts from Type 2 diabetic (db/db) mice show metabolic responsiveness to insulin. Am J
Physiol Heart Circ Physiol 290, H1763-1769.
Herrman, G. und Decherd, G.M. (1939). The chemical nature of heart failure. Ann Intern Med
12: 1233-1244
Hoppel, C. L., Tandler, B., Parland, W., Turkaly, J. S., und Albers, L. D. (1982). Hamster
cardiomyopathy. A defect in oxidative phosphorylation in the cardiac interfibrillar
mitochondria. J Biol Chem 257, 1540-1548.
Hoppeler, H., Lindstedt, S. L., Claassen, H., Taylor, C. R., Mathieu, O., und Weibel, E. R.
(1984). Scaling mitochondrial volume in heart to body mass. Respir Physiol 55, 131-137.
Ide, T., Tsutsui, H., Hayashidani, S., Kang, D., Suematsu, N., Nakamura, K., Utsumi, H.,
Hamasaki, N., und Takeshita, A. (2001). Mitochondrial DNA damage and dysfunction
associated with oxidative stress in failing hearts after myocardial infarction. Circ Res 88, 529535.
- 55 -
Ide, T., Tsutsui, H., Kinugawa, S., Utsumi, H., Kang, D., Hattori, N., Uchida, K., Arimura, K.,
Egashira, K., und Takeshita, A. (1999). Mitochondrial electron transport complex I is a potential
source of oxygen free radicals in the failing myocardium. Circ Res 85, 357-363.
Ingwall, J. S., und Weiss, R. G. (2004). Is the failing heart energy starved? On using chemical
energy to support cardiac function. Circ Res 95, 135-145.
Jarreta, D., Orus, J., Barrientos, A., Miro, O., Roig, E., Heras, M., Moraes, C. T., Cardellach, F.,
und Casademont, J. (2000). Mitochondrial function in heart muscle from patients with
idiopathic dilated cardiomyopathy. Cardiovasc Res 45, 860-865.
Judge, S., Jang, Y. M., Smith, A., Hagen, T., und Leeuwenburgh, C. (2005). Age-associated
increases in oxidative stress and antioxidant enzyme activities in cardiac interfibrillar
mitochondria: implications for the mitochondrial theory of aging. Faseb J 19, 419-421.
Kajiyama, K., Pauly, D. F., Hughes, H., Yoon, S. B., Entman, M. L., und McMillin-Wood, J. B.
(1987). Protection by verapamil of mitochondrial glutathione equilibrium and phospholipid
changes during reperfusion of ischemic canine myocardium. Circ Res 61, 301-310.
Katz, A.M. (2000). Heart Failure: Pathophysiology, Molecular Biology and Clinical
Management. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins.
Laine, H., Katoh, C., Luotolahti, M., Yki-Jarvinen, H., Kantola, I., Jula, A., Takala, T. O.,
Ruotsalainen, U., Iida, H., Haaparanta, M., et al. (1999). Myocardial oxygen consumption is
unchanged but efficiency is reduced in patients with essential hypertension and left ventricular
hypertrophy. Circulation 100, 2425-2430.
Lehninger, A. L. (1951). Phosphorylation coupled to oxidation of dihydrodiphosphopyridine
nucleotide. J Biol Chem 190, 345-359.
Leichtweis, S. B., Leeuwenburgh, C., Chandwaney, R., Parmelee, D. J., und Ji, L. L. (1996).
Ischaemia-reperfusion induced alterations of mitochondrial function in hypertrophied rat heart.
Acta Physiol Scand 156, 51-60.
Lesnefsky, E. J., Moghaddas, S., Tandler, B., Kerner, J., und Hoppel, C. L. (2001).
Mitochondrial dysfunction in cardiac disease: ischemia--reperfusion, aging, and heart failure. J
Mol Cell Cardiol 33, 1065-1089.
Marin-Garcia, J., Goldenthal, M. J., und Moe, G. W. (2001). Abnormal cardiac and skeletal
muscle mitochondrial function in pacing-induced cardiac failure. Cardiovasc Res 52, 103-110.
- 56 -
Matlib, M. A., Rembert, J. C., Millard, R. W., Ashraf, M., Rouslin, W., Asano, G., Greenfield,
J. C., Jr., und Schwartz, A. (1983). Mitochondrial function in canine experimental cardiac
hypertrophy. J Mol Cell Cardiol 15, 221-232.
Matlib, M. A., Rouslin, W., Kraft, G., Berner, P., und Schwartz, A. (1978). On the existence of
two populations of mitochondria in a single organ. Respiration, calcium transport and enzyme
activities. Biochem Biophys Res Commun 84, 482-488.
Matlib, M.A., Rouslin, W., Vaghy, P. und Schwartz, A. (1984). Isolation of cardiac muscle
mitochondria: An update. In: Methods of Pharmacology. Plenum Press, New York, pp. 25-37
Matlib, M. A., und Srere, P. A. (1976). Oxidative properties of swollen rat liver mitochondria.
Arch Biochem Biophys 174, 705-712.
McMillin-Wood, J., Wolkowicz, P. E., Chu, A., Tate, C. A., Goldstein, M. A., und Entman, M.
L. (1980). Calcium uptake by two preparations of mitochondria from heart. Biochim Biophys
Acta 591, 251-265.
Mjos, O. D. (1971). Effect of free fatty acids on myocardial function and oxygen consumption
in intact dogs. J Clin Invest 50, 1386-1389.
Murray, A. J., Anderson, R. E., Watson, G. C., Radda, G. K., und Clarke, K. (2004).
Uncoupling proteins in human heart. Lancet 364, 1786-1788.
Neubauer, S. (2007). The failing heart--an engine out of fuel. N Engl J Med 356, 1140-1151.
Page, E., und McCallister, L. P. (1973). Quantitative electron microscopic description of heart
muscle cells. Application to normal, hypertrophied and thyroxin-stimulated hearts. Am J
Cardiol 31, 172-181.
Palmer, J. W., Tandler, B., und Hoppel, C. L. (1977). Biochemical properties of
subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria isolated from rat cardiac muscle. J Biol Chem
252, 8731-8739.
Palmer, J. W., Tandler, B., und Hoppel, C. L. (1985). Biochemical differences between
subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria from rat cardiac muscle: effects of procedural
manipulations. Arch Biochem Biophys 236, 691-702.
Pierce, G. N., und Philipson, K. D. (1985). Binding of glycolytic enzymes to cardiac
sarcolemmal and sarcoplasmic reticular membranes. J Biol Chem 260, 6862-6870.
- 57 -
Piper, H. M., Sezer, O., Schleyer, M., Schwartz, P., Hutter, J. F., und Spieckermann, P. G.
(1985). Development of ischemia-induced damage in defined mitochondrial subpopulations. J
Mol Cell Cardiol 17, 885-896.
Recchia, F. A., McConnell, P. I., Bernstein, R. D., Vogel, T. R., Xu, X., und Hintze, T. H.
(1998). Reduced nitric oxide production and altered myocardial metabolism during the
decompensation of pacing-induced heart failure in the conscious dog. Circ Res 83, 969-979.
Recchia, F. A., McConnell, P. I., Loke, K. E., Xu, X., Ochoa, M., und Hintze, T. H. (1999).
Nitric oxide controls cardiac substrate utilization in the conscious dog. Cardiovasc Res 44, 325332.
Recchia, F. A., Osorio, J. C., Chandler, M. P., Xu, X., Panchal, A. R., Lopaschuk, G. D., Hintze,
T. H., und Stanley, W. C. (2002). Reduced synthesis of NO causes marked alterations in
myocardial substrate metabolism in conscious dogs. Am J Physiol Endocrinol Metab 282, E197206.
Riva, A., Tandler, B., Lesnefsky, E. J., Conti, G., Loffredo, F., Vazquez, E., und Hoppel, C. L.
(2006). Structure of cristae in cardiac mitochondria of aged rat. Mech Ageing Dev 127, 917921.
Riva, A., Tandler, B., Loffredo, F., Vazquez, E., und Hoppel, C. (2005). Structural differences
in two biochemically defined populations of cardiac mitochondria. Am J Physiol Heart Circ
Physiol 289, H868-872.
Robinson, J. B., Jr., und Srere, P. A. (1985). Organization of Krebs tricarboxylic acid cycle
enzymes in mitochondria. J Biol Chem 260, 10800-10805.
Scheubel, R. J., Tostlebe, M., Simm, A., Rohrbach, S., Prondzinsky, R., Gellerich, F. N., Silber,
R. E., und Holtz, J. (2002). Dysfunction of mitochondrial respiratory chain complex I in human
failing myocardium is not due to disturbed mitochondrial gene expression. J Am Coll Cardiol
40, 2174-2181.
Schwartz, A. (1971). Electron transport and mitochondria. Cardiology 56, 35-42.
Sheeran, F. L., und Pepe, S. (2006). Energy deficiency in the failing heart: linking increased
reactive oxygen species and disruption of oxidative phosphorylation rate. Biochim Biophys
Acta 1757, 543-552.
Shin, G., Sugiyama, M., Shoji, T., Kagiyama, A., Sato, H., und Ogura, R. (1989). Detection of
mitochondrial membrane damages in myocardial ischemia with ESR spin labeling technique. J
Mol Cell Cardiol 21, 1029-1036.
- 58 -
Sordahl, L., Johnson, C., Blailock, Z. und Schwartz, A. (1971). The mitochondrion. In: Methods
of Pharmacology. Plenum Press, New York, pp. 247-286
Sordahl, L. A., McCollum, W. B., Wood, W. G., und Schwartz, A. (1973). Mitochondria and
sarcoplasmic reticulum function in cardiac hypertrophy and failure. Am J Physiol 224, 497-502.
Srere, P. (1969). Citrate synthase. In: Methods in Enzymology. Academic Press, San Diego, pp.
3-11
Stanley, W. C., Lopaschuk, G. D., und McCormack, J. G. (1997). Regulation of energy
substrate metabolism in the diabetic heart. Cardiovasc Res 34, 25-33.
Stanley, W. C., Recchia, F. A., und Lopaschuk, G. D. (2005). Myocardial substrate metabolism
in the normal and failing heart. Physiol Rev 85, 1093-1129.
Stowe, D. F., und Kevin, L. G. (2004). Cardiac preconditioning by volatile anesthetic agents: a
defining role for altered mitochondrial bioenergetics. Antioxid Redox Signal 6, 439-448.
Stryer, L., Berg, J. M., und Tymoczko, J. L. (2003). Biochemistry, 5. edition.
Suh, J. H., Heath, S. H., und Hagen, T. M. (2003). Two subpopulations of mitochondria in the
aging rat heart display heterogenous levels of oxidative stress. Free Radic Biol Med 35, 10641072.
Taegtmeyer, H., McNulty, P., und Young, M. E. (2002). Adaptation and maladaptation of the
heart in diabetes: Part I: general concepts. Circulation 105, 1727-1733.
Takeo, S., Tanonaka, K., Aoki, M., Nakai, Y., Sanbe, A., Shizume, Y., Tanaka, C., Miyake, K.,
Hirai, K., Ueda, N., und et al. (1993). In vivo profile of myocardial energy metabolism of
pressure-overloaded rat. Jpn Heart J 34, 313-331.
Tomec, R. J., und Hoppel, C. L. (1975). Carnitine palmitoyltransferase in bovine fetal heart
mitochondria. Arch Biochem Biophys 170, 716-723.
Tsutsui, H. (2006). Mitochondrial oxidative stress and heart failure. Intern Med 45, 809-813.
Tyler, D.D. und Gonze, J. (1967). The preparation of heart mitochondria from laboratory
animals. In: Methods in Enzymology. Academic Press, San Diego, p. 75
Warburg, O. (1923). Über die Grundlagen der Wielandschen Atmungstheorie. Biochem Z Berl
142: 518-523
- 59 -
Weinstein, E. S., Benson, D. W., und Fry, D. E. (1986). Subpopulations of human heart
mitochondria. J Surg Res 40, 495-498.
Weinstein, E. S., Benson, D. W., Ratcliffe, D. J., Maksem, J., und Fry, D. E. (1985).
Experimental myocardial ischemia. Differential injury of mitochondrial subpopulations. Arch
Surg 120, 332-338.
Weiss, J., und Hiltbrand, B. (1985). Functional compartmentation of glycolytic versus oxidative
metabolism in isolated rabbit heart. J Clin Invest 75, 436-447.
Weiss, J. N., und Lamp, S. T. (1987). Glycolysis preferentially inhibits ATP-sensitive K+
channels in isolated guinea pig cardiac myocytes. Science 238, 67-69.
Weiss, J. N., und Lamp, S. T. (1989). Cardiac ATP-sensitive K+ channels. Evidence for
preferential regulation by glycolysis. J Gen Physiol 94, 911-935.
Xu, K. Y., Zweier, J. L., und Becker, L. C. (1995). Functional coupling between glycolysis and
sarcoplasmic reticulum Ca2+ transport. Circ Res 77, 88-97.
Young, M. E., McNulty, P., und Taegtmeyer, H. (2002). Adaptation and maladaptation of the
heart in diabetes: Part II: potential mechanisms. Circulation 105, 1861-1870.
Zaha, V., Grohmann, J., Gobel, H., Geibel, A., Beyersdorf, F., und Doenst, T. (2003).
Experimental model for heart failure in rats--induction and diagnosis. Thorac Cardiovasc Surg
51, 211-215.
Zhou, L., Salem, J. E., Saidel, G. M., Stanley, W. C., und Cabrera, M. E. (2005). Mechanistic
model of cardiac energy metabolism predicts localization of glycolysis to cytosolic subdomain
during ischemia. Am J Physiol Heart Circ Physiol 288, H2400-2411.
- 60 -
7. Curriculum Vitae
Persönliche Daten
Name, Vornamen
FAZELI, Ahmad WALID
Geburtsdatum, -ort
08.03.1981, Bonn (Deutschland)
Nationalität
Deutsch
Geschlecht
Männlich
Ausbildung
Studium:
Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg: Studium der Humanmedizin
2007
3. Staatsexamen
Praktisches Jahr
Pädiatrie, Universitätskinderklinik Freiburg
Chirurgie, Universitetssykehuset Nord-Norge, Tromsö / Norwegen
Kardiologie / Angiologie, Medizinische Universitätsklinik Freiburg
Department of Nephrology, Royal Melbourne Hospital / Australien
Promotion
Universität Freiburg / Abteilung für Herz- und Gefäßchirurgie
(Prof. Dr. T. Doenst)
2006
2. Staatsexamen
2003 - 2004
Université “Paris-Sud”, Frankreich: 4. Studienjahr
2003
1. Staatsexamen
2002
Physikum
Schule:
1999
Bilinguales Friedrich-Ebert-Gymnasium, Bonn: deutsches Abitur
und französisches baccalauréat
1997
Vorversetzung aus Stufe 10 in Stufe 12
Arbeitserfahrungen
2005
Wissenschaftliche Hilfskraft „POL“
2003
Wissenschaftliche Hilfskraft „Praktikum der Physiologie“
2000
Summcercamp, WI (USA): ehrenamtliche Arbeit mit minder
privilegierten Kindern
1997
Mitglied der deutschen Delegation des Europäischen
Jugendparlaments (M.E.P.)
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Sprachen
Muttersprachen
Deutsch
Farsi
Sonstige
Französisch: ausgezeichnet (2. Platz Bundeswettbewerb
Fremdsprachen, Landesebene, 1997)
Englisch: sehr gut in Sprache und Schrift
Norwegisch: gut in Sprache und Schrift
Latein: Grundkenntnisse
Stipendien
Universität Freiburg
PJ- Stipendium, University of South Florida (03 / 2006)
Freiburger Ärzte
Consulting
PJ- Reisestipendium Melbourne, Australien ( 10 / 2006)
Musikschule der Stadt
Bonn
“Stipendium zur Musikstudium vorbereitenden Ausbildung” (MVA)
( 1995 -1997)
Publikationen
Abstracts
Doenst T, Fazeli W, Bugger H, Beyersdorf F (2006). Impairment of
respiratory capacity and control of isolated mitochondria during the
development of hypertrophy in rat heart. Thorac cardiovasc Surg
2006; 54.
Schwarzer M, Fazeli W, Bugger H, Doenst T (2006). Biphasic
impairment of respiratory capacity in isolated mitochondria during
the development of hypertrophy in rat heart. Cardiovascular Drugs
and Therapy, Volume 20, Number 6, December 2006 , pp. 395424(30).
Buchbeitrag
Aktürk D. Pharma kompakt- Spezielle Pharmakologie für Mediziner
und Zahnmediziner (2006), Lehmanns Media; Kapitel „Akutes
Koronarsyndrom“, „Herzrhythmusstörungen“, „Herzinsuffizienz“.
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8. DANKSAGUNG
Ich möchte mich bei all denjenigen, die mich während meiner Arbeit an der vorliegenden
Promotion unterstützt haben, herzlich bedanken.
Allen voran gilt mein großer Dank meinem Doktorvater PD Dr. Torsten Doenst, der mir in
seiner Arbeitsgruppe die Erstellung dieser Arbeit ermöglicht hat und mich darüber hinaus mit
seinen konstruktiven Anregungen animiert hat, mir stets einen kritischen Umgang und ein
Hinterfragen von auf den ersten Blick Offensichtlichem zu bewahren. Die Freiheiten, die er mir
während meiner Promotion dankenswerterweise ließ, haben mich ungemein Vieles lernen
lassen, von dem ich während meiner gesamten Laufbahn profitieren werde.
Prof. Dr. Sven Dittrich bin ich neben seiner Tätigkeit als Zweitgutachter vor allem für seine
wertvollen Ratschläge in Bezug auf die professionelle Gestaltung meiner Laufbahn zutiefst
dankbar. Er hat mir auf menschliche Art und Weise den Blick für das Wesentliche geschärft.
Ich wurde im Labor der AG Doenst sowohl fachlich als auch menschlich mit offenen Armen
empfangen und durfte mich schon sehr bald als Teil eines Teams fühlen. Dafür möchte ich mich
bedanken bei Peter Kahle, Gracjan Pytel, Heiko Bugger, Vitalij Maks, Gloria Färber,
Daniel Blum und Michael Schwarzer. Die gemeinsame Zeit wird mir in bester Erinnerung
bleiben.
Vielen lieben Dank an Maja Tofteng, deren inhaltliche und insbesondere unendliche
moralische Unterstützung einen großen Beitrag zum erfolgreichen Abschluss dieser Arbeit
geleistet hat.
Schließlich möchte ich diese Gelegenheit nutzen, meinen Eltern, Dr. Alishah und Nazifa Fazeli
sowie meinem Bruder, Soleiman Fazeli für Ihre bedingungslose Liebe und Loyalität bei dieser
und anderen beruflichen sowie privaten Herausforderungen zu danken. Die Arbeit an dieser
Promotion war wie so vieles in meinem Leben ein außerordentliches Privileg. Ich danke meinen
Eltern für diese Chance und möchte ihnen meine Promotionsarbeit widmen.
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