Rho-glukosylierende Toxine von Clostridium difficile

360_377_BIOsp_0406.qxd
370
02.06.2006
7:56 Uhr
Seite 370
WISSENSCHAFT · S P E C I A L : Z E L L B I O L O G I E
Süßer Zelltod durch Zytotoxine
Rho-glukosylierende Toxine
von Clostridium difficile
THOMAS JANK UND KL AUS AKTORIES
INSTITUT FÜR EXPERIMENTELLE UND KLINISCHE PHARMAKOLOGIE UND
TOXIKOLOGIE, ALBERT-LUDWIGS-UNIVERSITÄT FREIBURG I. BR.
Clostridium difficile ist der häufigste Verursacher einer Diarrhö, die nach
Therapie mit Antibiotika auftritt[1]. Nahezu sämtliche Antibiotika kommen
als Auslöser in Betracht, am häufigsten werden jedoch BreitspektrumAntibiotika für diese Therapiekomplikation verantwortlich gemacht.
ó Die Zerstörung der normalen Mikroflora
des Darms durch Antibiotika führt zu einer
Selektion und zu einem Überwuchern von
C. difficile. Der Keim proliferiert und produziert Toxine, die nicht nur eine Diarrhö son-
dern im schweren Fall eine pseudomembranöse Kolitis mit fatalen Folgen für den Patienten auslösen können[2]. Erst kürzlich warnten mehrere Arbeitsgruppen in Kanada und
den USA vor der Ausbreitung eines sehr viru-
Abb. 1: Aufnahme und Wirkung von der C. difficile Toxine A und B. Die C. difficile Toxine A und B binden
an noch unbekannte Zellmembranrezeptoren. Nach Endozytose folgt die Translokation der Toxine ins
Zytosol. Dabei kommt es zu einer Porenbildung, die Cholesterol-abhängig ist. Es wird nur die katalytische Domäne (Dreieck) transloziert. Bislang ist nicht bekannt, wann genau die Spaltung der Toxine
erfolgt. Im Zytosol glukosyliert die katalytische Domäne der Toxine Rho-GTPasen unter Verwendung
von UDP-Glucose als Zuckerdonor. Die Glucosylierung hemmt die Funktion von Rho-GTPasen. Dadurch
wird die Expression von RhoB hoch reguliert. Ein Teil von RhoB bleibt aktiv und mag an der Induktion
von Entzündungsprozessen beteiligt sein.
lenten C. difficile-Stammes (BI/NAP1), der zu
einem besonders schweren Verlauf der Infektion mit hoher Mortalität führt[3]. Zwei Exotoxine, Toxin A und B, sind die entscheidenden Pathogenitätsfaktoren von C. difficile[4].
Daneben tritt ein binäres Aktin-ADP-ribosylierendes Toxin auf, das allerdings nur bei
bestimmten Stämmen gefunden wird[5].
Toxin A und B sind die Prototypen der Familie der clostridialen glukosylierenden Zytotoxine, zu der auch das letale Toxin und das αToxin, die von den Gasbrand-Erregern Clostridium sordellii und Clostridium novyi gebildet werden[4], gehören. Dabei handelt es sich
um typische Exotoxine, die an spezifische
Membranrezeptoren von Zielzellen binden.
Der Toxinrezeptorkomplex wird anschließend
endozytiert. Aus einem sauren endosomalen
Kompartiment wird das Toxin, bzw. nur dessen katalytische Domäne ins Zytosol[6] transloziert, wo es seine Zielproteine findet. Bisher
ist unklar in welchem Kompartiment die Prozessierung erfolgt. Auch ist die Art und Weise
der Translokation noch weitgehend ungeklärt.
Die Toxine sind zur Porenbildung fähig und
dieser Prozess ist, wie kürzlich gezeigt wurde, von Cholesterol abhängig[7] (Abb. 1).
Sämtliche clostridialen glukosylierenden
Zytotoxine modifizieren Rho-Proteine an identischer Stelle, nämlich an Threonin-37 (entspricht Thr-35 in Rac und Cdc42)[8]. Diese
Aminosäure spielt eine essenzielle Rolle für
die biologische Aktivität der GTPasen und ist
an der Bindung des Nukleotids der GTPasen
beteiligt. Die Glukosylierung der Rho-Proteine durch die clostridialen Zytotoxine hat
bedeutsame funktionelle Konsequenzen. Die
glukosylierten Rho-Proteine können nicht
mehr ihre aktive Konformation einnehmen[9],
also nicht mehr durch Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (GEFs) in die aktive GTPgebundene Form überführt werden. Ebenso
gravierend ist die Blockade ihrer Interaktion
mit Effektoren wie verschiedene Protein- und
Lipidkinasen, Phospholipasen sowie zahlreiche Adaptorproteine. Damit sind sie nicht
mehr in der Lage ihre Schalterfunktion auszuüben[4]. Ohne funktionell aktive Rho-GTPaBIOspektrum | 04.06 | 12. Jahrgang
360_377_BIOsp_0406.qxd
02.06.2006
7:56 Uhr
Seite 371
371
sen kommt es schließlich zum Zelltod (– was
hier zum fast lyrischen Titel führte –).
Welche Rolle hat die Glukosylierung
von Rho-GTPasen für die Toxininduzierte Diarrhö und Kolitis?
Leicht abzuleiten von den dargestellten RhoFunktionen führt die Glukosylierung und
Inaktivierung der GTPasen zur Umverteilung
des Aktinzytoskeletts, zur Desintegration der
Tight-Junctions von Epithelzellen und damit
zum Verlust ihrer Schrankenfunktion im
Darmepithel[10]. Diese Prozesse erklären die
Toxin-induzierte Diarrhö. Die Toxine führen
darüber hinaus zu schweren Entzündungssymptomen unter anderem durch Rekrutierung von Entzündungszellen. Bis vor kurzem
war dieser Sachverhalt nur schwer verständlich, denn die clostridialen Toxine hemmen
Rho-Proteine und sollten somit Entzündungssignale blockieren. Kürzlich wurde
jedoch gezeigt, dass durch die glukosylierenden Toxine die Isoform RhoB vermehrt
exprimiert wird[11]. RhoB entgeht offenbar
auch einer Inaktivierung und könnte für die
Auslösung und Aktivierung von Entzündungsreaktionen (z. B. Freisetzung von Entzündungsmediatoren und Rekrutierung von
Entzündungszellen) verantwortlich sein. Eine
Rolle von RhoB ist in Apoptose und Vesikeltransport beschrieben.
3D-Struktur der katalytischen
Domäne
Seit langem ist bekannt, dass die clostridialen
glukosylierenden Zytotoxine mindestens aus
drei funktionellen Domänen aufgebaut sind[12]
BIOspektrum | 04.06 | 12. Jahrgang
(Abb. 2A). Der N-Terminus trägt die katalytische Aktivität, der C-Terminus ist für die Bindung des Toxins an Zielzellen verantwortlich
und in der Mitte des Proteins befindet sich
eine hydrophobe Region, von der angenommen wird, dass sie für die Translokation des
Toxins ins Zytosol wichtig ist. Kürzlich wurde die katalytischen Domäne, die genau dem
ins Zytosol translozierten Toxinfragmentes
von Toxin B entspricht, kristallisiert und die
3D-Struktur aufgeklärt[13] (Abb. 2B). Diese
Untersuchungen zeigten, dass die katalytische Domäne des Toxins eine gemischte α/βFaltung aufweist, wobei das aktive Zentrum
durch ein 6-strängiges β-Faltblatt, mit überwiegend paralleler Ausrichtung charakterisiert ist (Abb. 2B). Die β-Faltblattstruktur ist
durch verschiedene Helices flankiert. Insgesamt entspricht das katalytische Zentrum von
Toxin B der Faltung einer Typ A Glukosyltransferase wie sie z. B. für Glykogenin oder
die bovine α-1,3Galaktosyl-transferase bekannt ist[14].
Es muss erwähnt werden, dass das katalytische Zentrum aus 234 Aminosäuren besteht,
die katalytische Domäne insgesamt 543 Aminosäuren, also 309 zusätzliche Aminosäurereste besitzt, die im Wesentlichen in drei Subdomänen das katalytische Zentrum flankieren. Die Bedeutung dieser zusätzlichen Aminosäuren ist noch weitgehend unklar. Vermutet wird eine Rolle bei der Substratinteraktion und/oder bei der intrazellulären Lokalisierung des Toxins. Da die Kristallstruktur
im Komplex mit dem Cosubstrat UDP-Glucose sowie mit dem essenziellen Mangan-Kation
erfolgte, konnten aus der Analyse neue
Erkenntnisse über die Ligandeninteraktion
und über den molekularen Mechanismus der
Reaktion gewonnen werden. Vor einigen Jahren war ein DXD-Motiv in Toxin B identifiziert worden, das wie sich herausstellte, nicht
nur für die Aktivität von Toxin B sondern auch
für zahlreiche andere Glukosyltransferasen
essenziell ist. Die Kristallstrukturanalyse
erklärte nun die essenzielle Rolle dieses
Motivs in der Koordinierung der Manganionen sowie der Bindung des Cosubstrates. Bei
der Glukosylierung von Zielproteinen durch
Toxin B kommt es zu einer Retention der αKonfiguration des anomeren C-Atoms der
UDP-Glukose. Die Kristallstrukturanalyse
lässt vermuten, dass bei der retinierenden
Glukosylierung durch Toxin B keine zweistufige Reaktion (SN2, „Double Displacement“)
vorliegt, wie sie typischerweise bei Glukosylhydrolasen gefunden werden, da im Enzym
keine nukleophilen Gruppen für den SN2Angriff in geeigneter Position zur Verfügung
stehen[13, 15]. Es wird deshalb angenommen,
dass im Fall der Glukosylierung durch Toxin
B und wohl bei allen clostridialen glukosylierenden Toxinen ein SNi-Mechanismus vorliegt, bei dem der Angriff des Nukleophils
von derselben Seite erfolgt wie der Austritt
der Abgangsgruppe. Die Kristallstrukturanalyse erlaubte interessante Einblicke in die
Cosubstratspezifität der Toxine. Bislang war
es ein Rätsel, warum das verwandte α-Toxin
von C. novyi UDP-N-Acetylglucosamin als
Zuckerdonor akzeptiert, während alle anderen clostridialen glukosylierenden Toxine
UDP-Glukose als Cosubstrate verwenden. Es
zeigte sich, dass in der katalytischen Tasche
360_377_BIOsp_0406.qxd
372
02.06.2006
7:56 Uhr
Seite 372
WISSENSCHAFT · S P E C I A L : Z E L L B I O L O G I E
aktionsregion von Proteinen. Kürzlich gelang
die Kristallisierung eines C-terminalen 255
Aminosäuren langen Fragmentes von Toxin A
im Komplex mit einer halbsynthetischen Kohlenhydratstruktur, die als Modell eines ToxinRezeptors gelten könnte[20] (Abb. 2C). Diese
Befunde unterstützen die Hypothese, dass die
Solenoid-Struktur von Toxin A und B für eine
multivalente Bindung an Membranrezeptoren von Zielzellen wichtig ist.
Schlussfolgerung
Abb. 2: Modell der clostridialen glukosylierenden Toxine. A, C. difficile Toxin A (308 kDa) und Toxin B
(270 kDa) sind mindestens aus drei funktionellen Domänen aufgebaut. N-terminal befindet sich die
Enzymdomäne, am C-Terminus die Bindungsdomäne und in der Mitte des Moleküls die putative Translokationsdomäne. B, Die Enzymdomäne besteht aus 543 Aminosäuren und hat ein katalytisches Zentrum, das Glukosyltransferasen vom Typ GTA entspricht. Das hydrolysierte Cosubstrat UDP-Glucose
(gelb) ist gebunden. Weitere Subdomänen, deren Funktion noch ungeklärt ist, flankieren das katalytische Zentrum. C, Der C-Terminus besteht aus repetitiven Einheiten mit Solenoid-Faltung, die für die
Rezeptorbindung wichtig sind. Das sind 32 kurze (KR, 15–21 AS) und 7 lange Repeats (LR, 30 AS).
Interaktionsstellen mit Kohlenhydraten (αGal-(1,3)-βGal-(1,4)-βGlcNAc-R), die mögliche Rezeptorstrukturen darstellen, sind durch Pfeile gekennzeichnet. D, Eine gleiche Solenoid-Struktur wie bei Toxin A
findet man beim Pneumokokken Autolysin LytA.
von Toxin B zwei Aminosäuren, nämlich Isoleucin 383 und Glutamin 385 gegenüber dem
α-Toxin unterschiedlich waren. Wurden diese gegen die entsprechenden Aminosäuren
des α-Toxins (Serin und Alanin) ausgetauscht,
so war auch Toxin B in der Lage, UDP-N-Acetylglucosamin als Zuckerdonor zu akzeptieren[16]. Erfolgte der Austausch umgekehrt so
wurde aus dem α-Toxin, das üblicherweise
eine N-Acetylglukosaminylierung katalysiert,
ein glukosylierendes Enzym, das UDP-Glukose als Zuckerdonor akzeptierte.
Der C-Terminus von Clostridium
difficile Toxin A
Wie bereits erwähnt, ist der C-Terminus wahrscheinlich an der Bindung des Toxins an den
Zellmembranrezeptor beteiligt. Der C-Terminus von Toxin A und B ist durch repetitive
Strukturen gekennzeichnet. Schon früh wurden diese Repeats mit der Bindung an Kohlenhydraten in Beziehung gebracht[17]. Ähnliche Strukturen findet man u. a. in den Kohlenhydrat-Bindungsdomänen von Glykosyltransferasen[17]. Kürzlich wurde ein C-termi-
nales Fragment von 127 Aminosäuren von
Toxin A (Toxintyp VI), das den AminosäureResten 2582–2709 entspricht, kristallisiert
(Abb. 2C). Dieses Fragment erlaubte ein
Strukturmodell abzuleiten nach dem der CTerminus von Toxin A aus 31 kurzen und sieben langen Repeats aufgebaut ist[18]. Jeder
dieser Repeats hat eine Haarnadel-Struktur,
die von einer Schleife gefolgt wird und dem
Strukturprinzip β-Strang-Haarnadel-β-StrangLoop entspricht. Die einzelnen Repeats sind
ca. 120o gegeneinander schraubenförmig
(linksdrehend) versetzt. Die Struktur der gesamten C-terminalen repetitiven Domäne
(CRD) entspricht einer Solenoid-Faltung. Eine
ähnliche Solenoid-Struktur wie bei Toxin A
wurde für die Cholin-bindende Domäne des
Autolysins LytA, einem Virulenzfaktor von
Pneumokokken, gefunden[19] (Abb. 2D). Stapelähnliche Solenoid-Strukturen findet man
bei zahlreichen bakteriellen Oberflächenproteinen (z. B. die Leucin-reichen Repeats
von Internalin B bei Listerien). Die SolenoidFaltung gilt wegen ihrer ausgedehnten Tertiärstruktur als häufige Bindungs- und Inter-
C. difficile-Toxine sind wichtige Pathogenitätsfaktoren, die eine große medizinische
Bedeutung als Auslöser der Antibiotika-induzierten Diarrhö und Pseudomembranösen
Kolitis haben. Der molekulare Pathogenitätsmechanismus ist die Glukosylierung von
Rho-Proteinen, der zu Inaktivierung (aber
auch vermehrte Expression von RhoB) der
GTPasen führt. Durch Kristallstrukturanalyse der katalytischen Domäne sowie durch Aufklärung der Struktur der C-terminalen repetitiven Toxinsegmente konnten neue Einblicke
in die molekularen Mechanismen der Toxinwirkung sowie in mögliche MembranrezeptorInteraktionen gewonnen werden. Diese
Kenntnisse werden für die Entwicklung von
Inhibitoren für neue pharmakologische Ansätze zur Therapie der Antibiotika-assoziierten
Diarrhö und pseudomembranösen Kolitis, die
durch clostridiale glukosylierende Zytotoxine ausgelöst werden, von größter Bedeutung
sein.
ó
Literatur
[1] Bartlett, J. G. (2002): Clinical Practice: Antibiotic-associated Diarrhea. N. Engl. J. Med. 346: 334–339.
[2] Kelly, C. P., and LaMont, J. T. (1998): Clostridium difficile
infection. Annu. Rev. Med. 49: 375–390.
[3] McDonald, L. C., Killgore, G. E., Thompson, A., Owens,
R. C., Jr., Kazakova, S. V., Sambol, S. P., Johnson, S., and
Gerding, D. N. (2005): An epidemic, toxin gene-variant strain
of Clostridium difficile. N. Engl. J. Med. 353: 2433–2441.
[4] Just, I., and Gerhard, R. (2004): Large clostridial cytotoxins. Rev. Physiol Biochem. Pharmacol. 152: 23–47.
[5] Perelle, S., Gibert, M., Bourlioux, P., Corthier, G., and
Popoff, M. R. (1997): Production of a complete binary toxin
(actin-specific ADP-ribosyltransferase) by Clostridium difficile
CD196. Infect. Immun. 65: 1402–1407.
[6] Pfeifer, G., Schirmer, J., Leemhuis, J., Busch, C., Meyer,
D. K., Aktories, K., and Barth, H. (2003): Cellular uptake of
Clostridium difficile toxin B: translocation of the N-terminal
catalytic domain into the cytosol of eukaryotic cells. J. Biol.
Chem. 278: 44535–44541.
[7] Giesemann, T., Jank, T., Gerhard, R., Maier, E., Just, I.,
Benz, R., and Aktories, K. (2006): Cholesterol-dependent pore
formation of clostridium difficile toxin A. J. Biol. Chem. 281:
10808–10815.
[8] Just, I., Selzer, J., Wilm, M., Von Eichel-Streiber, C., Mann,
M., and Aktories, K. (1995): Glucosylation of Rho proteins by
Clostridium difficile toxin B. Nature 375: 500–503.
[9] Geyer, M., Wilde, C., Selzer, J., Aktories, K., and Kalbitzer,
H. R. (2003): Glucosylation of Ras by Clostridium sordellii
lethal toxin: Consequences for the effector loop conformations
observed by NMR spectroscopy. Biochemistry 42: 11951–
11959.
BIOspektrum | 04.06 | 12. Jahrgang
360_377_BIOsp_0406.qxd
02.06.2006
7:56 Uhr
Seite 373
373
[10] Aktories, K., and Barbieri, J. T. (2005): Bacterial cytotoxins: targeting eukaryotic switches. Nat. Rev. Microbiol. 3:
397–410.
[11] Gerhard, R., Tatge, H., Genth, H., Thum, T., Borlak, J.,
Fritz, G., and Just, I. (2005): Clostridium difficile toxin A induces expression of the stress-induced early gene product RhoB.
J. Biol. Chem. 280: 1499–1505.
[12] Von Eichel-Streiber, C., Boquet, P., Sauerborn, M., and
Thelestam, M. (1996): Large clostridial cytotoxins – a family
of glycosyltransferases modifying small GTP-binding proteins.
Trends Microbiol. 4: 375–382.
[13] Reinert, D. J., Jank, T., Aktories, K., and Schulz, G. E.
(2005): Structural Basis for the Function of Clostridium difficile Toxin B. J. Mol. Biol. 351: 973–981.
[14] Unligil, U. M., and Rini, J. M. (2000): Glycosyltransferase
structure and mechanism. Curr. Opin. Struct. Biol. 10: 510–517.
[15] Davies, G. J. (2001): Sweet secrets of synthesis. Nat.
Struct. Biol. 8: 98–100.
[16] Jank, T., Reinert, D. J., Giesemann, T., Schulz, G. E., and
Aktories, K. (2005): Change of the donor substrate specificity
BIOspektrum | 04.06 | 12. Jahrgang
of Clostridium difficile toxin B by site-directed mutagenesis.
J. Biol. Chem. 280: 37833–37838.
[17] Von Eichel-Streiber, C., Sauerborn, M., and Kuramitsu,
H. K. (1992): Evidence for a modular structure of the homologous repetitive C-terminal carbohydrate-binding sites of clostridium difficile toxins and streptcoccus mutans glucosyltransferases. J. Bacteriol. 174: 6707–6710.
[18] Ho, J. G., Greco, A., Rupnik, M., and Ng, K. K. (2005):
Crystal structure of receptor-binding C-terminal repeats from
Clostridium difficile toxin A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 102:
18373–18378.
[19] Fernandez-Tornero, C., Lopez, R., Garcia, E., GimenezGallego, G., and Romero, A. (2001): A novel solenoid fold in
the cell wall anchoring domain of the pneumococcal virulence
factor LytA. Nat. Struct. Biol. 8: 1020–1024.
[20] Greco, A., Ho, J. G., Lin, S. J., Palcic, M. M., Rupnik, M.,
and Ng, K. K. (2006): Carbohydrate recognition by Clostridium
difficile toxin A. Nat. Struct. Mol. Biol.; [Epub ahead of print].
Korrespondenzadresse:
Thomas Jank und
Klaus Aktories
Institut für
Experimentelle und Klinische
Pharmakologie und Toxikologie
Albertstr. 25
Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
D-79104 Freiburg i. Br.
Tel.: 0761-2035301
Fax: 0761-2035311
Klaus.Aktories@pharmakol.
uni-freiburg.de
www.pharmakologie.unifreiburg.de/i/welcome.htm