I UNTERSUCHUNGSMATERIALMATERIALENTNAHME

HISTOLOGISCHE TECHNIKEN
I VORBEHANDLUNG
1. BEHANDLUNG VON ZU FIXIERENDEM MATERIAL (ROUTINE)
Nach der Entnahme des Materials, muss dieses sofort fixiert werden. Das bedeutet, dass die Probe gleich
in ein geeignetes, mit den Patientendaten beschriftetes, Gefäß mit Fixierflüssigkeit (Formalin)
gegeben wird. Auf ausreichende Größe des Gefäßes und Menge des Fixiermittels achten! Der Vorgang der
Fixierung beginnt sofort. Veränderungen durch Zelltod werden gestoppt und das Gewebe bleibt in gutem
Zustand erhalten.
II HISTOLOGISCHE VERARBEITUNG
FIXIERUNG:
stoppt biologische Vorgänge
EINBETTUNG: gibt dem Gewebe die notwendige Schneidekonsistenz
SCHNEIDEN:
Herstellung von Gewebsschnitten mit dem Mikrotom
FÄRBUNG:
Kontrastgebung
EINDECKEN:
Haltbarmachung
MIKROSKOP. BEGUTACHTUNG: Befunderstellung durch den Arzt
FIXIERUNG
Nach Entnahme einer Gewebsprobe und der damit verbundenen Unterbrechung der Sauerstoffversorgung,
kommt es zu Veränderungen die zum Zelltod führen, wenn nicht eine entsprechende Fixierung diese
Vorgänge stoppt.
WAS PASSIERT OHNE FIXIERUNG ?
o
AUTOLYSE: Selbstverdauung durch zelleigene Enzyme. Erfolgt umso rascher je enzymreicher das
Gewebe ist. Ist abhängig von der Temperatur und der Zeit. Kühlung bremst die Autolyse. Je mehr
Zeit zwischen Entnahme und Fixierung vergeht, desto größer sind die Schäden an den Zellen.
o
FÄULNIS: Zerstörung des Gewebes unter Mitwirkung körpereigener Bakterien von z.B. Darm oder
Haut. Beginn nach 2-3 Tagen; abgeschlossen nach 3-4 Monaten.
o
VERWESUNG: Oxidationsprozess. Eiweißkörper und Fette werden zu einfachen anorganischen
Verbindungen zerlegt.
Bei allen drei Vorgängen werden im Wesentlichen die Proteine der Zellen zerstört. Durch Fixierung wird
dieser Prozess gestoppt, um den augenblicklichen Zustand festzuhalten.
1
ARTEN DER FIXIERUNG
Physikalische Fixierung = Gefrierfixation
o
o
o
o
o
o
schlagartiges Abkühlen des Gewebes auf sehr tiefe Temperaturen
biochemische Vorgänge werden nur für die Zeit des Tieffrierens gestoppt, nach dem Auftauen setzt
die Autolyse wieder ein.
Lagerung des Untersuchungsmaterials bei sehr tiefen Temperaturen erforderlich.
Vorteil: keine chemische Behandlung des Gewebes
Fehlerquellen: durch zu langsames Abkühlen bilden sich Eiskristalle im Gewebswasser, wodurch Zellund Kernmembranen zerstört werden und Proteine dehydrieren → Bildung von künstlichen
Vakuolen im Plasma (=Artefakte).
Anwendung: Schnelldiagnostik, Enzym- und Fettdarstellung, Immunhistochemie; Schockgefrieren:
bei Proben für molekularbiologische Untersuchungen
Chemische Fixierung
Fixierung läuft je nach Fixiermittel über verschiedene Mechanismen ab:
o
o
o
o
Vernetzung: FM lagert sich zwischen die EW-Moleküle → Vernetzung der EW-Moleküle → FM wird
dabei verbraucht.
Wasserentzug: Entzug des Gewebswassers und des Hydratationsmantels durch stärker
wasseranziehende Mittel (z.B. Alkohol, Aceton)
Salzbildung: EW-Moleküle gehen Verbindungen mit chemischen Substanzen ein (z.B. Sublimat,
Pikrinsäure)→Bildung von Komplexsalzen
Änderung des Quellungszustandes: durch Zugabe von Säuren (z.B. Essigsäuren) wird EW in einen
Bereich minimaler Quellung gebracht → Ausfällung
Andere Arten der Fixierung
o
o
o
Lufttrocknen:
v.a. bei Abstrich, Abklatsch und Ausstrichpräparaten
Gefriertrocknung:
für Elektronenmikroskopie
Gefriersubstitution: für Elektronenmikroskopie
REGELN ZUR SACHGERECHTEN DURCHFÜHRUNG DER FIXIERUNG
1. Sofortige Fixierung: - nach Gewebeentnahme - je schneller Gewebe fixiert wird, umso bessere
Beurteilbarkeit des Schnittes.
2. Wahl des FM: FM soll dem Untersuchungsziel entsprechen (Alkohol löst Fette, Wasser löst Glykogen).
3. Größe des Gewebsstückes: je kleiner, umso schneller die Fixierung.
4. Menge des FM: ca. 20faches Volumen des Objektes verwenden. FM wird verbraucht → FM
zwischendurch wechseln und nur 1x verwenden.
5. Zutritt des FM: von allen Seiten gewährleisten.
6. Fixierdauer: möglichst kurz halten → sonst Gefahr der Schrumpfung bzw. übermäßigen Härtung
(Vorsicht: vollständige Durchfixierung des Gewebestückes beachten!)  ev. entkalken
7. Nachbehandlung: wenn nötig.
2
FIXIERMITTEL DIE MIT VERNETZUNG ARBEITEN
FORMALIN
o
o
o
o
o
ist die wässrige Lösung von Formaldehyd (=stechend riechendes Gas)
Formaldehyd ist maximal zu 37-40% in Wasser löslich.
bei Lichteinwirkung kommt es zur Bildung von Ameisensäure → Formalin in dunklen
Flaschen aufbewahren.
um den pH-Wert im neutralen Bereich zu halten → Zugabe von Puffer-Neutralformalin
als Konservierungsmittel geeignet
Wirkweise: Formalin ist ein proteinvernetzendes Fixativ, wenig denaturierend, keine Schrumpfung
Eigenschaften: Eindringgeschwindigkeit: 1mm/Stunde, abhängig von Konzentration, Temperatur und
Gewebskonsistenz. Geschwindigkeit nimmt mit der zurückgelegten Strecke ab. Formalin dringt relativ
schnell ein, aber die Vernetzungsreaktion läuft langsam ab (Fixierzeit ≠ Eindringzeit!). Erst nach 24
Stunden ist eine adäquate Fixierung erreicht. Vollständige Fixierung wäre erst nach 1-2 Wochen gegeben,
dies ist aber nicht wünschenswert, weil dadurch funktionelle Gruppen, die für best. Färbungen bzw.
immunhistochemische Reaktionen wichtig sind, blockiert werden.
Fixierdauer: kleine Gewebsproben: einige Stunden; größere Präparate: 24 Stunden.
Durch die anschließende Einbettung im Einbettungsautomat, der mit Druck, Vakuum und erhöhter
Temperatur arbeitet → Verkürzung der Fixierdauer.
Anwendung: 4-10%ige Formaldehylösung (10%iges Formalin enthält 4% Formaldehyd)
Praktische Hinweise
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
fixiert wird durch Einlegen des Gewebes in die Fixierlösung = Inversionsfixierung
Mengenverhältnis Probe: Fixiermedium=1:10-1:20 entsprechend große Gefäße verwenden
Fixativ soll von allen Seiten an das Gewebe herankommen
Gewebegröße 3-5 mm dick
entsprechende Vorbereitung der Organe (siehe Übernahme).
makroskopisch erkennt man formalinfixiertes Gewebe durch Veränderung der Farbe
(rot→graubraun) und der Konsistenz (weich→druckelastisch)
nicht gepuffertes Formalin: Formalinpigment durch Hämoglobinabbau entsteht - kann durch
alk.Pikrinsäure entfernt werden.
Vorsicht: kann Allergien und Ekzeme verursachen im Tierversuch cancerogen!
→MAK-Werte beachten(Abzug! Handschuhe!) Beschäftigungseinschränkung bei Schwangerschaft
Formalinersatzstoffe: HOPE, Prefer-Fixativ
Entsorgung: sammeln - nicht in den Ausguss
Vorteile:
Gutes Diffusionsvermögen
Geringe Schrumpfung
Fette bleiben erhalten
Zahlreiche Enzyme bleiben aktiv
Auch für ELMI geeignet
Gutes Gelingen vieler Färbungen
FM + Konservierungsmittel
billig
Nachteile:
Rindenbildung bei zu hoher Konzentration
Härtung bei zu langer Fixierzeit
Glycogenverlust bei NBH
Formalinniederschläge
Allergien, Ekzeme, im Tierversuch canzerogen
3
SPEZIELLE VERARBEITUNGSMETHODEN
1. VERARBEITUNG VON HARTEM GEWEBE
ENTKALKUNG=DEKALZIFIKATION: Notwendiger Vorgang um Knochengewebe oder Kalkablagerungen
im Gewebe für die Routine (Paraffineinbettung) schneidbar zu machen, wenn nicht die Hartschnittmethode
(Methylmetacrylateinbettung) angewandt wird.
PRINZIP
Die im Gewebe vorkommenden Mineralsalze in fester Form (z.B.: Ca-Carbonat), werden durch das
Entkalkungsmittel in lösliche Salze übergeführt.
WAS IST ZU BEACHTEN
o ausreichende Fixierung (12-48 Std.) bevor das Gewebe in die Entkalkungsflüssigkeit eingebracht wird.
o größere Stücke mit Säge entsprechend verkleinern (ca.5 mm dicke Scheiben)
o Entkalkungsflüssigkeit regelmäßig wechseln
o Prüfen des Entkalkungszustandes durch Einschneiden od. Ammoniumoxalat - Test (Nachweis ob noch
Ca-Ionen in der letzten Portion Entkalkerflüssigkeit zu finden sind), ev. Röntgenkontrolle
MÖGLICHES UNTERSUCHUNGSMATERIAL
o Beckenkammstanzen
o Operationspräparate von Knochen (Hüftkopf, Kieferknochen)
o verkalkte Operationspräparate (Herzklappenanteile, Schilddrüse)
o Zahnmaterial: Entkalkung mit konzentrierter Ameisensäure und 70%igem Alkohol (1:1)Zuweisungsdiagnosen: Osteomyelitis, Arthritis, traumatische Fraktur, nekrotische Veränderungen,
Osteomalazie, Osteoporose
ENTKALKUNGSMITTEL
ENTKALKUNG DURCH SÄUREN
schwache Säuren: Essigsäure, Pikrinsäure, Zitonensäure entkalken in 9-10 Tagen
starke Säuren:
Ameisensäure (ca.8%ig), Milchsäure, Trichloressigsäure, Salpetersäure (5-10%ig),
Salzsäure (5-10%ig) entkalken in 24-48 Std.
Säuren führen auch zur Hydrolyse der Nucleinsäuren → Kerne färben sich schlecht an, quant. DNAMessung nicht möglich. Auch Enzyme werden durch Säuren gehemmt.
ENTKALKUNG DURCH CHELATBILDUNG
Chelatbildner haben die Fähigkeit Metallionen in sich einzuschließen (Komplexbildung)
z.B.: Ethylendiamintetraacid=EDTA
EDTA entkalkt viel langsamer als Säuren, aber dafür auch viel schonender.
Entkalkung von Knochenbiopsien ca. 3-4 Tage; kortikale Knochenproben 6-8 Wochen
EDTA Lösungen alle 3-5 Tage wechseln
Wässerung der Präparate nach Entkalkung → um ein Quellen der kollagenen Fasern zu verhindern, muss
der Knochen vorher in 5%ige Natrium- oder Lithiumsulfatlösung gebracht werden.
Beschleunigung der Entkalkung durch Mikrowelle, Ultraschall oder Elekrolyse
Nach der Entkalkung kann nun die routinemäßige Einbettung erfolgen. Bei größeren Knochenstücken ist es
ratsam die Einbettungsschritte dementsprechend zu verlängern (unvollständige Einbettung würde zu
kreidig-matschigem und bröckligem Verhalten beim Schneiden führen).
4
SCHNEIDEN VON ENTKALKTEM GEWEBE
o
o
o
o
o
o
hartes Gewebe beim Ausgießen: Längsseite des Gewebes immer parallel zur Schneiderichtung
auslegen.
Einmalklingen für hartes Gewebe verwenden
Blöcke gut kühlen
entkalktes Gewebe schwimmt leicht vom OT ab → beschichtete OT verwenden
ev. auch längere Antrocknungszeit im Brutschrank
Oberflächenentkalkung mit konz. Ameisensäure (15’) bei bereits in Paraffin eingeblockten
Gewebe (wenn Entkalkung zu kurz od. versteckte Kalkeinschlüsse auftreten)
FÄRBEN VON ENTKALKTEM GEWEBE
o
o
o
wird routinemäßig durchgeführt
durch die Säureeinwirkung sinkt die Kernanfärbbarkeit → durch Behandlung mit 4-5%igem
Natriumbicarbonatlösung für 10’-2Std. kann man diese wieder restaurieren.
Will man hartes Gewebe nicht entkalken, muss man es nach der Fixierung in Kunststoffen
(Methacrylate) einbetten und entsprechend schneiden.
Geräte zur Präparatherstellung von hartem Gewebe:
Sägemikrotom (diamantbeschichtetes, horizontal rotierendes Lochsägeblatt)
Diamantbandsäge (diamantbeschichtetes Sägeblatt)- dient meist als Vorbereitung für:
Hartschnittmikrotom, Hochleistungsmikrotom:
o Schlittenmikrotom
o Stahlmesser
o für spongiösen Knochen
o Schnittdicke 20-30μm
Dünnschliffgerät:
o arbeitet mit rotierendem Schleifteller mit Schleifpapieren unterschiedlicher Körnung.
o für kompakte Knochen und Implantate
o Schnittdicke 50μm
ANWENDUNGSGEBIETE:
o Einfluss von Implantaten auf angrenzendes Knochengewebe
o Zähne
2. VERARBEITUNG VON NATIVEM MATERIAL ALS SCHNELLSCHNITT
Dabei wird, während der Patient noch in Narkose liegt, die exzidierte Probe auf schnellsten Weg ins Labor
gebracht. Ein Gefrierschnittpräparat wird hergestellt. An diesem wird ein vorläufiger Befund erstellt,
der die weitere Vorgehensweise des Chirurgen bestimmt. Man kann feststellen, um welche Art Tumor es
sich handelt, und ob er im Gesunden entfernt wurde. Die Dauer vom Einlangen des Gewebes bis zur
Befundübermittlung sollte im Idealfall bei 20 Minuten liegen. Der vorläufige Befund muss im
Paraffinschnitt bestätigt werden.
BEISPIELE:
Brust-OP, Hautstücke,….
PRINZIP:
Umwandlung von Gewebewasser in Eis → erforderliche Schneidekonsistenz.
MERKE: je fettreicher das Gewebe, umso tiefere Temperaturen wählen
5
FEHLERQUELLEN UND NACHTEILE:
zu langsames Einfrieren – Bildung von Eiskristallen im Gewebe → Entstehung von Artefakten.
zu tiefe Temperaturen → Splittern des Schnittes
zu hohe Temperaturen → Stauchen und Zerbröseln des Schnittes
schlechtere morphologische Darstellung des Gewebes
SCHNEIDEN: im Kryostat: siehe Mikrotome und Schneidetechnik
FÄRBUNG: HE-Schnellfärbung
KRYOSTAT: Rotationsmikrotom in einem Kälteraum  Objekt- und Messerkühlung, Abschluss des
Kälteraumes nach außen durch waagrechtes Schiebefenster, Bedienungselemente sind außen angebracht,
Streckplättchen am Messer erleichtert das Entrollen des Schnittes  Schnittabnahme mit Objektträger
Technik: Kühlmedium auf Objekttisch kurz anfrieren, Gewebe tieffrieren, anschneiden 
Schnittgewinnung, Objektträger anhauchen, Schnitt abnehmen  färben, eindecken
EINBETTUNG
Prozess nach der Fixierung, bei dem das Gewebe aus der Fixierlösung über verschied.
Zwischenschritte in das Einbettmedium übergeführt wird. Es dringt ins Gewebe ein und verfestigt sich
→ so erreicht man einen Zustand, der es erlaubt, am Mikrotom mikrometerdünne Schnitte anzufertigen.
NICHT WASSERLÖSLICHE EINBETTMITTEL
I. PARAFFINWACHSEINBETTUNG
o
o
o
o
o
o
o
=Standardverfahren, Verwendung von Einbettautomaten
Einbettprozess nur an gut fixiertem Gewebe durchführen
Gewebsblockdicke sollte 3-5 mm nicht überschreiten (sonst andere Zeiten verwenden)
starke Konzentrationsunterschiede zw. den Lösungen vermeiden → zu starke Schrumpfung
wäre sonst die Folge.
Dauer: 12-14 Std. über Nacht
Schnellverfahren für kleine Biopsien möglich
heutzutage verwendet man Paraffine mit spez. Zusätzen z.B. DMSO = Di-Methylsulfoxyd mit
Schleppwirkung → Eindringgeschw. wird erhöht, Homogenität verbessert.
PRINZIP
o
o
Paraffin ist nicht mit wässrigen Fixantien mischbar. Folglich muss zuerst das Wasser mit
Alkohol und anschließend der Alkohol von einem Intermedium verdrängt werden.
Dies ist die Voraussetzung, dass Paraffin ins Gewebe eindringen kann.
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ARBEITSSCHRITTE:
1. FIXIERUNG:
o
o
2×60΄ Formalin (37-45°) - vervollständigt Fixierung
2 Bäder sind vorteilhaft, weil das erste meist durch Verschleppung verunreinigt ist.
2. ENTWÄSSERUNG:
o
o
o
o
o
o
o
Wasser wird aus dem Gewebe verdrängt und entfernt.
Dazu verwendet man Alkohol in aufsteigender Konzentration.
Fixiertes Gewebe wird durch längere Einwirkzeit von niederprozentigem Alkohol nicht nachteilig
beeinflusst.
2-4 Std./Alkoholbad
je 60΄ bei 37-45° in den niedrigprozentigen Alkoholen
2×60΄ bei 37-45° in den hochprozentigen Alkoholen
je 2 Alkoholbäder wegen Verschleppung
3. CLEARING:
o
o
o
o
o
o
= aufhellen, klären
vermittelt zwischen 100%igem Ethanol und Paraffin = Intermedium
2×60΄ bei 37-45°
am häufigsten verwendet: XYLOL
~ gehört zu den Kohlenwasserstoffen
~ rasche Aufhellung des Gewebes
~ wirkt härtend (nicht zu lange drinnen lassen)
~ Vorsicht: krebserregend!!! Kopfschmerzen, Schäden im ZNS, Niere → Xylolersatzstoffe
verwenden
Zusatz von Phenol zum Intermedium toleriert Wasserrückstände im abs. Alkohol → erlaubt
Clearing aus 70-95%igem Alkohol
Verwendung bei Gewebe, das nicht der Härtung von abs. Alkohol ausgesetzt werden soll.
4. INFILTRATION:
o
o
o
o
o
Eindringen des Einbettmediums
Paraffin wird verflüssigt (Schmelzpunkt 52-60°) und liegt in seiner monomeren Form vor
Paraffine mit niedrigem Schmelzpunkt sind schonender für das Gewebe
Paraffin dringt ins Gewebe ein → beim Abkühlen verfestigt es sich und kristallisiert aus.
Je schneller die Abkühlung vor sich geht, umso feinkristalliner und homogener ist das
Ergebnis; überhitztes Paraffin wird gelb und seifig
Beim Ausgießen verwendet man Paraffin mit einem höheren Schmelzpunkt!!!
KUNSTSTOFFEINBETTUNG
o
o
o
o
o
ermöglicht detailreichere Darstellung der Zellen und Zellkerne
um hohe Auflösung zu erreichen müssen die Schnitte eine Dicke unter 1μm haben=
SEMIDÜNNSCHNITTE → härteres Einbettmaterial verwenden
unumgänglich ist die Verwendung von Kunststoffen zur Einbettung in der Elektronenmikroskopie
zur Herstellung von ULTRADÜNNSCHNITTEN
v.a. bei Gewebsproben von Niere, Knochenmark, Lymphsystem
für die Verarbeitung von unentkalktem Knochen → Herstellung von Hartschnitten und Schliffen.
7
SCHNEIDEN
MIKROTOMTYPEN
SCHLITTENMIKROTOM
Der Messerschlitten wird auf einer Gleitbahn horizontal vor und zurück bewegt. Das Präparat ist auf
der Präparathalterung fixiert. Beim Schneidevorgang wird das Messer durch den Block gezogen und so
eine dünne Schicht an der Oberseite des Blocks abgetragen.
Über einen Vorschubmechanismus wird das Präparat um die eingestellte Mikrometerzahl vertikal nach
oben bewegt. Die Gleitbahnen und das ganze Gerät sind aus Metall. Für ein leichteres Gleiten werden die
Bahnen geölt. Man muss darauf achten, dass sich kein Rost darauf bildet oder die Bahnen
ungleichmäßig abgenutzt werden.
Schlittenmikrotome dienen zum Schneiden von hartem, großen Materialien. Der Vorteil der Geräte
liegt in der Stabilität und dem verstellbaren Messerwinkeln. Sie werden hauptsächlich in der
Routinehistologie eingesetzt.
ROTATIONSMIKROTOM
Das Messer ist starr fixiert und steht quer mit der Schneide nach oben. Der Gewebeblock wird senkrecht
darauf bewegt. Die vertikale Bewegung des Präparates wird durch ein Handrad ausgelöst. Bei jeder
Umdrehung erfolgt der Vorschub des Präparates in Richtung Messer. Die Geräte können mit einem
Motor ausgestattet sein.
Einsatzgebiet
o Herstellung von Paraffinschnitten in der Routinehistologie
o Herstellung von Semidünnschnitten von kunststoffgebetteten Gewebe für die Lichtmikroskopie
o Schnittbänder für Serienschnitte
KRYOSTAT
Beim Kryostat ist das Rotationsmikrotom in eine Kühlkammer eingebaut. Die Temperatur kann
entsprechend dem Gerätetyp bis zu -60°C abgesenkt werden. Präparat, Messer und Zubehör haben
dieselbe Temperatur, was die Schnittgewinnung sehr erleichtert.
Einsetzgebiet
o Herstellung von Gefrierschnitten von
~ unfixiertem Gewebe (Schnellschnitt, Enzymhistochemie)
~ fixiertem Gewebe zur Umgehung des Einbettungsprozess
o Schneiden von Industrieprodukten
Die Schnittdicke bei Gewebe zur Schnellschnittuntersuchung liegt bei 5-10µm.
Es gibt auch tragbare Tischkryostate, die z.B. direkt im OP eingesetzt erden können.
Andererseits werden auch sehr große Kryostate für Großflächenschnitte im Handel angeboten.
8
ULTRAMIKROTOM
Werden in der Elektronenmikroskopie zur Herstellung von Ultradünnschnitten (0,91-0,5 µm) benötigt. Das
Gewebe ist in Kunststoff eingebettet, um diese Dicke zu erreichen zu können. Zur
lichtmikroskopischen Vorbeurteilung des Blocks werden auch Semidünn- oder Vorschnitte hergestellt.
Die Größe der Präparate liegt im Millimeterbereich. Der Präparatvorschub erfolgt über einen thermischen
Mechanismus, bei dem sich ein Bifurkationsmetall kontrolliert ausdehnt. Das Schneiden läuft, um
möglichst gleichmäßige Schnitte zu erhalten, motorisiert unter mikroskopischer Beobachtung ab.
Zur Anfertigung von Gefrierschnitten wird das Ultramikrotom mit einer Kühlkammer ausgerüstet.
SCHNEIDETECHNIK
Faktoren zum Gelingen
o
o
o
o
Stabiles, gut eingestelltes Mikrotom
Scharfes Messer
Gut gekühlter Block
Richtig eingestellte Schneidewinkel
Schneidewinkel
Die wichtigen Winkel für die Schneidetechnik sind die so genannte Inklination und die Deklination.
Inklination
Die Inklination entspricht der Neigung des Messers zur Präparateebene. Härtere Konsistenz  steilere
Inklination, weichere Konsistenz  flachere Inklination.
Bei einer Inklination über 18° wird das Messer zu steil, es rumpelt über den Block und führt zu Rippeln.
Bei einer Inklination unter 13,5° liegt die Facette auf dem Gewebe auf, der Freiwinkel ist null bzw. negativ.
Die Schneide erfasst das Gewebe nicht, keine Schnittgewinnung bzw. es wird abwechselnd zu dick und
zu dünn geschnitten.
Freiwinkel
Anstellwinkel zur unteren Facettenfläche, zu klein  Inklination zu flach  Kante zwischen Messerkörper
und Facette drückt auf das Objekt  ungleichmäßige Schnittdicke, Objekt wird gepresst
Weicheres Einbettungsmedium kann man mit möglichst kleinem Freiwinkel schneiden, um dünne Schnitte
zu erhalten. Optimales Schneiden gelingt bei einem Freiwinkel zwischen 0-5°.
Schubwinkel
Anstellwinkel zur oberen Facettenfläche, bestimmt den grad zur Abhebung des Schnites gegenüber dem
Schneidegut, zu groß  Inklination zu steil  Facettenschneide holpert über den Block  Querrillen,
Stauchung des Schnittes
Deklination
Unter Deklination versteht man den Schneidewinkel in Bezug zur Schneidrichtung. Bei einem
Rotationsmikrotom zur Serienschnittherstellung steht das Messer quer. Beim Schlittenmikrotom kann man
die Deklination verstellen. Die übliche Einstellung liegt zwischen 120-160°.
Je härter das Gewebe ist, umso schräger stellt man das Messer.
9
VOR DER FÄRBUNG
Entfernen des Einbettmediums und Anpassung des Schnittes an das Milieu des Farbstoffes.
BEI PARAFFIN
o ENTPARAFFINIEREN: Entfernung von Paraffin durch Xylolersatz
o REHYDRIEREN: Entfernung des Xylolersatzstoffes durch 100%igen Alkohol - Anpassung des
Schnittes ans Farbstoffmilieu durch absteigende Alkoholreihe bis A.d.
o Achtung: unvollständige Paraffinherauslösung bewirkt fleckige Färbung!
BEI KUNSTHARZ
o Entfernung mit Benzol
HISTOLOGISCHE FÄRBUNGEN
Farbstoffe sind Substanzen, die die Fähigkeit haben, sich an ein Substrat zu binden. Färbungen schaffen
die für die Beurteilung notwendigen Kontraste im Gewebe.
Es gibt natürliche (tierisch, pflanzlich z.B. Hämatoxylin) und künstliche (z.B. Eosin, Methylenblau)
Farbstoffe.
WIRKWEISE VON FARBSTOFFLÖSUNGEN
DIREKT-SUBSTANTIV
Anfärbung ohne Zusatzstoffe
INDIREKT-ADJEKTIV
Anfärbung nur mit Hilfsmittel= BEIZE möglich
Beize ist ein Metallion, das Komplexe mit bestimmten Farbstoffen bildet. Es werden für die
Farbstoffbindung notwendige reaktionsfähige Gruppen freigesetzt. Es entsteht ein FARBLACK.
Lacke wirken stets als basische Farbstoffe und werden hauptsächlich als Kernfarbstoffe eingesetzt.
2 Möglichkeiten
o
einzeitig adjektive Färbung: gemeinsames Anbieten von Farbstoff und Beize → Farblack
(Hämatoxylin nach Weigert)
o
zweizeitig adjektive Färbung: getrenntes Anbieten von Farbstoff und Beize (meist zuerst Beize)
BEIZMITTEL
o
o
o
Metallsäuren, Metallsalze (Sublimat..)
Alaunsalze (Chromalaun…)
Oxidationsfördernde Substanzen (Anilin..)
BEISPIELE
o
o
Hämalaun
Eisenhämatoxylin
10
WAS BEEINFLUSST DIE FÄRBUNG
FIXIERUNG
saure denaturierende Fixantien bewirken das Aufbrechen des Chromatins → Bindungsstellen
für Kernfarbstoff werden frei.
zu lange Fixierung durch Vernetzung → Bindungsstellen können blockiert werden.
Beispiele:
~ Formalin und Osmiumtetroxid verursachen stärkere Basophilie
~ saure Dichromatlösung verursacht stärkere Eosinophilie
~ Glutaraldehyd verursacht ohne Aldehydblockierung falsch positive PAS Reaktionen
o
o
o
EINBETTUNG
Gefrierschnitte: nehmen Farbstoffe schneller auf → Überfärbung möglich (v.a. bei Trichrom Färbungen)
nicht entfernte Kunststoffe haben Einfluss: z.B.: zu schwache Färbung od. Hintergrundfärbung
o
o
GEWEBEFAKTOREN
Dichte der Struktur
dünne Gewebsschnitte färben sich schneller als dicke
Proben mit unregelmäßiger Oberfläche färben sich schneller als glatte (Gefrierschnitt)
verteilte Zellen (z.B.:Ausstriche) färben sich schneller als Schnitte
o
o
o
o
FARBSTOFFFAKTOREN
Löslichkeit eines Farbstoffes im Substrat (Sudan III)
Diffusibilität eines Farbstoffes: grob- feindispers (z.B.:Trichrom-Färbung)
pH-Wert
Bei pH 4,5-6
sind die Kerne negativ geladen
=> Kerne sind basophil
ist das Zytoplasma positiv geladen => Zytoplasma ist acidophil
ACHTUNG: basophil und acidophil sind somit relative Bezeichnungen, die vom pH-Wert abhängig sind.
FARBSTOFFLÖSUNGEN
STAMMLÖSUNG
o
Gesättigte Form - lange Haltbarkeit
GEBRAUCHSLÖSUNG
o
zur einmaligen Verwendung hergestellte Farbstofflösung
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GEPUFFERTE LÖSUNGEN
o
o
Bestimmter pH-Wert - optimale Anfärbung der Struktur.
Puffer: enthält eine schwache Säure (z.B.:Essigsäure) und ihre konjugierte Base
(z.B.:Natriumacetat)-Lösung ist gegenüber
Zugabe von Säuren und Basen ziemlich unempfindlich.
LÖSUNGSMITTELN
o
Farbstoffe werden dem Substrat meist in wässriger oder alkoholischer Lösung angeboten. Angabe
über Farbintensität bzw. Farbcharakter erfolgt durch Buchstaben hinter dem Namen des
Farbstoffes.
VERHALTEN VON FARBSTOFFEN GEGENÜBER LÖSUNGSMITTELN
o
o
o
o
o
o
o
Färbeprodukte wie „Berliner-Blau“ oder metallisches Silber sind praktisch unlöslich in den üblichen
Lösungsmitteln.
Azofarbstoffe in organischen Lösungsmitteln löslich → wässrige Eindeckmedien verwenden.
Metallkomplexfarbstoffe (Hämalaune) werden durch Lösungsmittel kaum beeinflusst.
andere basische Farbstoffe (Kristallviolett, Methylenblau) können in verdünnten Alkoholen
differenziert werden.
saure Farbstoffe (Eosin Y, Orange G) und wasserlösliche basische Farbstoffe (Alcianblau) sind
wenig löslich in Alkohol.
Fettfärbungen dürfen nur wässrig eingedeckt werden.
mit basischen Farbstoffen abgefärbte Schnitte schnell dehydrieren - saure Farbstoffe sind hier
weniger empfindlich.
BEGRIFFE IN DER FÄRBETECHNIK
ÜBERSICHTSFÄRBUNG
Kombination aus Kern- und Plasmafarbstoff, HE-Färbung
MEHRFACHFÄRBUNG
Plasmafärbung mit mehreren Plasmafarbstoffen, unterschiedliche Aufnahme im Gewebe abhängig von der
Dispersionsgröße der Farbstoffteilchen.
Simultanfärbung:
Verwendung eines Farbstoffgemisches (z.B.:Pikrofuchsin bei van Gieson:kollagene Fasern rot, Plasma gelb)
Succedanfärbung:
Farbstoffe werden nacheinander angeboten (z.B.:Trichromfärbung nach Goldner)
PROGRESSIVE FÄRBUNG
Ein weniger konzentrierter Farbstoff wird bis zur optimalen Anfärbung angeboten.
REGRESSIVE FÄRBUNG
Schnittüberfärbung mit konzentriertem Farbstoff → gradweises Entfärben bis zur optimalen
Anfärbung der Strukturen.
ENDPUNKTFÄRBUNG
Zeitunabhängige Färbung von Teilstrukturen.
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IMPRÄGNATION
Keine Färbung, sondern Niederschlagsbildung von Metallsalzen an Zellstrukturen(z.B.:Gomori)
METACHROMASIE
Farbstoff färbt Struktur nicht in der Eigenfarbe an, sondern in einer anderen
Nuance(z.B.:Thionin:Kerne-blau, Schleime-violett)
DIFFERENZIERUNG
Ist gradweises Entfernen von überschüssigem Farbstoff → Entfärbung mit selektivem Ergebnis.
Durch die Veränderung der Reaktionsbedingungen (z.B.:pH-Wert) wird die Bindungskraft des
Farbstoffes beeinflusst.
Differenzierungsmittel:
Wasser, verdünnte Alkohole, verdünnte Säuren, (z.B.:HCl-Alkohol) verdünnte Basen
ANFÄRBUNG DER ZELLBESTANDTEILE
KERNFARBSTOFFE
o
Kernchromatin ist aufgebaut aus den Nukleinsäuren und anhängenden Proteinen – zählt zu den
basophilen Gewebsanteilen d.h. ist negativ geladen (Phosphatgruppe) und zieht basische
Farbstoffe an.
o
Elektive Kernfärbung kann durch Einstellen des pH-Wertes der Farblösung zw. dem IEP der
Kerne (ca.3,8) und dem des Plasmas (ca.6,5) erreicht werden. In diesem Bereich liegt der
Kernfarbstoff als Base vor und bindet an die sauren Chromatinbestandteile, jedoch nicht an
die basischen Plasmabestandteile.
o
Basophil erscheinen auch jene Strukturen im Cytoplasma, die bei diesem pH-Wert ebenfalls
saure Gruppen aufweisen (z.B. Ribosome).
o
Kernfarbstoffe:
~ Mayers Hämalaun
~ Weigerts Eisenhämatoxylin
~ Kernechtrot-Aluminiumsulfat
~ Methylenblau
PLASMAFARBSTOFFE
o
o
o
sind meistens sauer und binden an positiv geladene Gewebselemente.
pH-Wert muss zw. 4–6 liegen → Plasmaproteine positiv geladen.
Plasmafarbstoffe:
~ Eosin Y
~ Chromotropin
~ Orange G
~ Säurefuchsin
~ Lichtgrün
~ Anilinblau
13
KERNFÄRBUNG mit BASISCHEN ADJEKTIVEN KERNFARBSTOFFEN
1. HÄMATOXYLINE
o
wird aus Blauholz gewonnen (färberisch noch unwirksam)→ Reifung durch Oxidation notwendig:
~ natürlich: durch Sauerstoff
~ künstlich: durch Oxidantien: Kaliumjodat; Quecksilberoxid
o
→ in diesem Zustand kann der Farbstoff nur schlecht an Gewebekomponenten binden → man
setzt Beizmittel zu → stark positiv geladene Komplexbindung von Hämatein und Metallion →
Hämatoxylinlacke (Hämateinlacke) entstehen.
o
je nach verwendetem Beizmittel gibt es:
~ HÄMALAUNE
~ EISEN-HÄMATOXYLINE
HÄMALAUNE:
o
Hämatoxylinlacke des Aluminiums, die mit Alaunen (Kalialaun) gebildet werden.
o
Beispiele: Mayer’s, Harris’, Gill’s Ehrlich’s, Delafield’s (diese reifen natürlich)
o
Prinzip: Kernfärbung erfolgt im stark saurem Milieu → positiv geladenes Hämalaun verbindet
sich mit Phosphorgruppe der Nucleinsäure. Durch anschließendes Spülen in LW od.
schwacher Base, führt man den Hämatoxylinlack in seine blaue Form übe r= BLÄUEN.
Mit diesem Vorgang wird die Färbung stabilisiert.
o
Die Färbung kann sowohl progressiv als auch regressiv erfolgen. Bei letzterer wird in saurer
Lösung (2%ige Essigsäure od. 0,1-0,25iger Salzsäure) differenziert.
o
Färbeergebnis: kontrastreiche Darstellung der Zellkerne in blauen Farbtönen
o
ACHTUNG:
~ bei alten Farblösungen (=überoxidiert)→ zarter graublauer Hintergrund kann entstehen
~ Farbstoff empfindlich auf Säuren → unbrauchbar für manche Spezialfärbungen mit stark
sauren Farblösungen
EISEN-HÄMATOXYLINE:
o
hier werden Eisensalze als Beizmittel und gleichzeitig als Oxidationsmittel eingesetzt.
o
Beispiele: Weigert’s, Heidenhain’s
o
Prinzip: bei dieser Färbung mischt man Farblösung und Beizmittel erst kurz vor Gebrauch (sonst
Gefahr der Überoxidation)
o
Färbeergebnis: schwarze Kerne
o
wird v.a. bei Spezialfärbungen eingesetzt, wo eine Behandlung mit sauren Farblösungen erfolgt
– Eisen - Hämatoxylin ist unempfindlich gegenüber Säuren.
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2. KERNECHTROT KERNFÄRBUNG mit BASISCHEN SUBSTANTIVEN FARBSTOFFEN
o
o
o
o
o
Teerfarbstoffe - ergeben kontrastreiche, leuchtende Anfärbung
besonders schöne Ergebnisse nach Fixierung mit abs. Alkohol oder Bouin
Beispiele: Toluidinblau, Kresylviolett, Methylenblau
Färbeergebnis: Kerne, Nucleoli: blau(violett) Schleimsubstanzen: rotviolett
lichtgeschützte Aufbewahrung: weniger gut haltbar
KERNFÄRBUNG mit SAUREN KERNFARBSTOFFEN
o
o
Farbstoffbindung an Histone = basisches Eiweißgerüst des Zellkernes
Beispiele: Säurefuchsin (Mallory), Azocarmin (BGW-Färbung)
PLASMAFÄRBUNG
o
o
o
o
wird immer in Kombination mit Kernfärbung durchgeführt → Kontrasterhöhung
alle Bestandteile des Zytoplasmas werden gefärbt - Anfärbung graduell unterschiedlich.
Verwendung von sauren Farbstoffen
Beispiele: Eosin, Lichtgrün, Anilinblau, Orange G, Azophloxin
ÜBERSICHTSFÄRBUNG KERNFÄRBUNG+PLASMAFÄRBUNG
HÄMATOXYLIN-EOSIN FÄRBUNG
o
o
o
Routinefärbung
Kernfärbung mit Hämatoxylin (siehe Kapitel Kernfärbung)
Plasmafärbung mit EOSIN
~ saurer Farbstoff in Wasser und Alkohol löslich
~ pH 4-6 (wird mittels Eisessig eingestellt)
~ Färbeergebnis: Zytoplasma, BGW, Kollagenfasern kräftig rot
~ auch Kernstrukturen nehmen Farbstoff an → rötlich-violettes Mischbild nach Kernfärbung
entsteht.
~ Färbung erfolgt regressiv: Überfärben anschließend differenzieren in Wasser und Alkohol.
~ Gebrauchslösung: 0,5-2%ig
~ bessere Kontraste erzielt man durch Mischen von Eosin mit Phloxin B → Kollagen und
Muskelfasern unterscheidbar. Jede eingelangte Gewebeprobe wird mit HE-Färbung angefärbt
und mikroskopisch beurteilt. In den meisten Fällen wird bereits eine Diagnose erstellt. Durch
die großen Probenmengen wird die Färbung im Routinelabor von Färbeautomaten erledigt.
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SPEZIALFÄRBUNGEN
BINDEGEWEBE-UND STÜTZGEWEBE-DARSTELLUNG
BINDEGEWEBE
o
o
o
o
mesenchymalen Ursprungs
hat Anteil am Aufbau aller Organe, indem es Stroma, Kapseln und weitere Strukturen bildet.
BGW besteht einerseits aus Zellen, andererseits aus zwischenzelligen Substanzen.
man unterscheidet:
~ fixe Bindegewebszellen (Fibroblasten,-zyten)
~ freie Bindegewebszellen (Abwehrzellen , Blutzellen)
KOLLAGENFASERN
o Bestandteil von Sehnen und Muskelfaszien
o liegen in der Lederhaut, im gefäßführenden BGW, in Knorpel und Knochen.
o haben eine kreuzweise und spiralige Anordnung
o sind aus Kollagenfibrillen zusammengesetzt.
ELASTISCHE FASERN
o kommen in Form von Netzen vor
o Begleitstruktur der kollagagenen Fasern im interstitiellen BGW, und in Organkapseln und in
großen Mengen in der Lunge.
o bilden gefensterte Membranen in der Wand herznaher Arterien.
RETIKULINFASERN
o bilden gitterartige Strukturen
o retikuläres BGW bildet das Grundgerüst der lymphatischen Organe (Milz, Lymphknoten)
o kommen auch sonst im lockeren BGW und im Eingeweideorganen vor.
Kurzinformationen über Basalmembran, Grundsubstanz, Knorpel, Knochen, Fettzellen, Muskelgewebe und
Fibrin finden sie Buch S.196, 197
1. VAN-GIESON-FÄRBUNG:
o selektive Darstellung von kollagenen Fasern, Muskel und Cytoplasma.
o simultane Färbung mit Pikrinsäure und Säurefuchsin = Pikrofuchsin
o Kernfärbung mit Eisenhämatoxylin n. Weigert.
2. CHROMOTROP-ANILINBLAU-FÄRBUNG n. Gomori (CAB):
o selektive Darstellung von kollagenen Fasern und allgemein von Bindegewebe.
o simultane Trichromfärbung mit sauren Farbstoffen.
o Kernfärbung mit Eisenhämatoxylin n. Weigert.
3. WEIGERT`S RESORCIN-FUCHSIN-FÄRBUNG:
o Darstellung von elastischen Fasern und Bindegewebskomponenten.
o Kernfärbung mit säurefesten Eisen - Hämatoxylin.
o übliche Gegenfärbung mit Pikrofuchsin (=Van-Gieson).
4. SILBERIMPRÄGNATION n. Gomeri:
o Darstellung der retikulären Fasern.
o keine Färbung im eigentlichen Sinne→ Versilberung → genaue Beschreibung s. Kapitel spez.
Färbeverfahren
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5. ROMANOVSKY GIEMSA-FÄRBUNG:
o Mischungen von basischen Teerfarbstoffen und ihren Salzen mit Eosin färben das Cytoplasma
und die Zellkerne der Blutzellen je nach dem pH-Milieu → eigentümlich rötlich-violette
Anfärbung des Kernchromatins entsteht → dieses Phänomen nennt man RomanovskyGiemsa-Effekt oder Polychromasie.
o Die Giemsa-Färbung ist eine Übersichtsfärbung und zeigt mehr cytoplasmatische Details als die HEFärbung.
~ Darstellung von Blut- und KM-Zellen.
~ Darstellung von Helicobacter pylori, Parasiten.
LIPID-DARSTELLUNG
Fettstoffe lassen sich nur am Gefrierschnitt des unfixierten oder kurzfixierten Gewebes darstellen. Im
Routinelabor wird der Großteil der Lipide durch Einwirkung von organischen Lösungsmitteln beim
Paraffin- Einbettungsprozess herausgelöst und entzieht sich dadurch der Darstellung. Lipidfixierung im
Sinne einer Vernetzung gelingt nur mit Osmiumtetroxid und Chromsäure.
Im Histolabor färbt man:
o Neutralfett mit Sudanfarbstoffen
o Lipofuszin bei der Pigmentidentifizierung
o Myelinscheiden als neurologische Strukturen
1.SUDAN-III-FÄRBUNG:
o Darstellung von Neutralfett
o Fett erscheint pathologischer Weise z.B. nach Knochenfrakturen oder Verletzungen von fettreichen
Körperarealen als Fettembolie in Gefäßen.
o Fettbestandteile von zerfallenen Zellen können als Fetttröpfchen dargestellt werden.
o Liposarkome können von anderen Tumortypen differenziert werden.
o Prinzip: Färbungen mit öllöslichen Farbstoffen basieren auf der größeren Löslichkeit der
Farbstoffe in lipoiden Substanzen als im Reagens selbst.
o Lösungsmittel (Aceton, Alkohol) darf die Lipoide nicht aus dem Gewebe extrahieren.
KOHLENHYDRAT-DARSTELLUNG
1.PERJOD-ACID-SCHIFF`sche Reaktion n. McMannus (PAS):
o Darstellung von neutralen Mucosubstanzen, Glykogen, Basalmembranen, Pilzen.
o Glykogen ist die Speicherform der KH (in Leber, Herz und Skelettmuskulatur), es ist relativ
unlöslich in Wasser und kann bei rascher Fixierung dargestellt werden (wird in Proteinnetz
gefangen). Glykogen wird durch Diastase gelöst (=indirekter Nachweis von Glykogen).
o Glutaraldehydfixierte Proben → Aldehydblockierung vor Färbung notwendig, sonst falsch
positive Ergebnisse.
o Überoxidation am Färbebeginn → falsch negative Ergebnisse.
o ACHTUNG: Schiff´sches Reagens ist farblos - färbt aber Hände und Kleidung rot.
PRINZIP:
Die PAS-Färbung ist eine histochemische Reaktion zum Nachweis von best. KH, deren Glykolgruppen
durch die Perjodsäure zu Aldehydgruppen oxidiert werden. Diese reagieren mit dem Schiff´schen
Reagens und bewirken eine rot-violette Farbe. Spülen in Metabisulfit entfernt überschüssiges
Schiff´sches Reagens und verhindert falsch positive Ergebnisse durch angelagerten Farbstoff an andere
Gewebeelemente. Zur Kontrastierung wird eine Kernfärbung mit Hämalaun angeschlossen.
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2.ALCIANBLAU-FÄRBUNG:
o Darstellung saurer Mucosubstanzen
o Gegenfärbung mit Kernechtrot oder PAS anschließen.
AMYLOID-DARSTELLUNG:
o
o
Amyloid ist eine hauptsächlich extrazelluläre, amorphe, eosinophile Ablagerung in einem oder
vielen Organen. Aufgrund von der Bedeutung von amyloiden Fasern bei Krankheiten wie
Alzheimer, Kreuzfeld-Jakob oder Rheuma, wird die Forschung weiter vorangetrieben.
Amyloid gibt nach Anfärbung mit Kongorot eine apfelgrüne Doppelbrechung mit polarisiertem Licht.
KONGOROT n. Highman:- Darstellung von Amyloid
PIGMENT-DARSTELLUNG
Pigment ist einer in Körperzellen vorkommender Stoff in Körnchenform oder gelöster Form, der eine
(meist braun bis schwarze) Eigenfärbung aufweist.
Man unterscheidet:
o
endogene Pigmente
hämatogene:
~ Abbauprodukte der Blut-, Muskel- und Gallenfarbstoffe
~ (Hämoglobin, Myoglobin, Hämosiderin, Bilirubin)
nicht hämatogen:
~ lipogene Pigmente (Lipo-und Hämofuszine)
~ Melanin
o
exogene Pigmente
~ in der Haut: Kohle, Tusche, Teer, Metalle
~ in Verdauungs- und Atmungswegen: Pflanzenfarbstoffe, Pikrinsäure, Kohle-, Stein-,
Metallstäube
o
artificielle Pigmente z.B.: fixierungsbedingt
1.BERLINER-BLAU Reaktion:
o
Darstellung von dreiwertigen Eisenionen: Hämoglobin von zerstörten Erythrozyten wird im
Gewebe rasch zu Hämosiderin abgebaut und somit mit der Berlinerblaureaktion nachgewiesen.
o
kleine Mengen von Eisen findet man normalerweise in der Milz und im Knochenmark
o
bei Hämochromatose: Ablagerungen in Leber und Pankreas
o
bei Hämosiderose: Ablagerungen in Leber, Milz und Lymphknoten
o
auch zur Asbestfaserdarstellung in der Lunge geeignet.
PRINZIP:
o
o
o
o
histochemische Reaktion
durch Salzsäure wird das Eisen von Ferritin und Hämosiderin freigegeben die dreiwertigen
Eisenionen reagieren sofort mit gelbem Blutlaugensalz (=Kaliumferrocyanid) zu blauem
Berlinerblau. Diese Reaktion erfasst nur ionisiertes Eisen, nicht aber das in organischen
Verbindungen eingelagerte.
Achtung:
~ schnelle Fixierung, weil sonst Eisenionen durch Autolyse frühzeitig freigesetzt werden →
falsch positiv
~ Einwirkung von Säuren z.B. bei der Entkalkung kann Eisenionen aus dem Gewebe lösen
→ falsch positiv
Gegenfärbung mit Kernechtrot
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NACH DER FÄRBUNG
Schnitt soll luftdicht abgeschlossen werden. Dies erreicht man durch
EINSCHLUSSMITTEL=EINDECKMITTEL
Diese verändern weder die Farbe noch die Struktur des Präparates.
o
WASSERLÖSLICHE EINSCHLUSSMITTEL: z.B. Glyceringelatine
~ Schnitte werden direkt aus dem A.d. eingedeckt
~ für Präparate, die nicht entwässert werden dürfen
~ Nachteil: geringe Haltbarkeit → Austrocknung möglich
o
WASSERUNLÖSLICHE EINSCHLUSSMITTEL: z.B. Eukitt, Entellan
~ künstliche Harze
~ diese funktionieren nur mit entsprechendem Lösungsmittel nach der Färbung muss das
Wasser durch eine aufsteigende Alkoholreihe dem Schnitt entzogen werden, und dann
mit dem Lösungsmittel (meist EBE = n-Butylacetat) durchtränkt werden. Schnitte aus
der Lösung → 1Tropfen Einschlussmedium darauf → Deckglas darüber → trocknen
lassen. In der Routine wird dieser Eindeckvorgang meist von Eindeckautomaten
übernommen.
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