Kapitel 4: Erforschung der Proteine
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13.05.2016 Biochemiezusammenfassung, Kapitel 4 Esther Büchel Kapitel 4: Erforschung der Proteine (Zusammenfassung von Kapitel 4.1, 4.2, 4.3 und 4.5 und dem Skript von F. Winkler) Unter dem Begriff Proteom (Begriff zusammengesetzt aus: Protein und Genom) versteht man die Information über alle exprimierten Proteine eines Lebewesens. Also Informationen über: Regulation der Proteinsynthese Proteinstruktur (primäre, sekundäre, tertiäre und quartäre) Umwandlungen nach der Translation (posttranslationale Modifikationen) Biologische Funktionen der Proteine Wechselwirkungen der Proteine mit anderen Molekülen Das Proteom ist viel grösser als das Genom (benötigt zum Verständnis mehr Informationen) und ist sehr variabel, da es von vielen Faktoren abhängt, wie der Art der Zelle, deren Entwicklungszustand, Umweltbedingungen etc. Um das Proteom zu erforschen, werden die einzelnen Proteine untersucht, charakterisiert und aufgelistet. Proteinreinigung Der erste Schritt der Proteinforschung liegt in der Trennung des gewünschten Proteins von den anderen Zellbestandteilen. Dazu sind mehrere Schritte erforderlich. Je nach dem, für welches Ziel man das Protein isolieren will, benötigt man unterschiedliche Mengen und unterschiedliche Reinheitsgrade des isolierten Proteins. Man wählt dementsprechend die passende Strategie aus für die Aufreinigung. Wahl des Ausgangsmaterials Um zu entscheiden, welche Zellen man als Ausgangsmaterial verwenden will, untersucht man sie nach dem Gehalt an dem gewünschten Protein. Dazu benötigt man einen Test auf eine möglichst spezifische Funktion des Proteins (=spezifisches Assay). So bestimmt man z.B. bei Enzymen deren katalytische Aktivität. (Das Verhältnis der so genannten „postulierten Enzymaktivität“ zur Konzentration aller enthaltenen Proteine bezeichnet man als spezifische Aktivität, welche man bei der Aufreinigung maximieren möchte.) Seit 1970 werden die gewünschten Proteine immer mehr in genetisch veränderten Zellen hergestellt (Rekombinante Expression) und danach isoliert. Dabei können viel grössere Mengen Protein gewonnen werden. Solubilisierung (Aufschluss der Zellen) Wenn sich das Protein in der Zelle oder auf der Zellmembran befindet, muss die Zelle zu Beginn aufgeschlossen werden. (Bei sekretorischen Proteinen ist der Zellaufschluss nicht nötig.) Beispiele der Methoden: Verschieden starke Reibkräfte („Mörser“) und Scherkräfte (Durch schmale Öffnung pressen), milde Detergentien (wie Lysozym, ein Enzym, welches die Zellwand auflöst) oder Ultraschall (harschere Methode). -1- 13.05.2016 Biochemiezusammenfassung, Kapitel 4 Esther Büchel Oft wird bei der Solubilisierung ein Puffer verwendet. Wegen der erhöhten Salzkonzentration kann so das Protein durch Osmose aus der Zelle gewonnen werden. Bei der Solubilisierung sollten möglichst viele Zellorganellen intakt bleiben, man erhält ein Homogenisat. Achtung: Das Protein kommt bei der Isolierung meist in ein anderes Milieu. Es kann dabei irreversibel verändert werden. Faktoren wie die Temperatur, der pHWert, die Ionenstärke des Puffers, gelöster Sauerstoff (Gefahr der Oxidation), Proteasen (Proteinabbauende Enzme) etc. sollten deshalb berücksichtigt werden. Von Vorteil ist es, möglichst schnell und bei tiefen Temperaturen zu arbeiten. Differentielle Zentrifugation Das Homogenisat wird nun schrittweise bei immer höheren Geschwindigkeiten zentrifugiert. Dabei verwendet man jeweils nur den Überstand für die weiteren Zentrifugationsschritte. Man erhält durch diese Differentielle Zentrifugation eine Reihe von Fraktionen mit Zellbestandteilen abnehmender Dichte. Diese werden auf die gesuchte Aktivität hin getestet (Assay). Die Fraktion mit der deutlich höheren Aktivität wird für die weiteren Aufreinigungsschritte verwendet. Methoden zur Proteinreinigung, dem Proteinnachweis und der Proteinanalyse Die Proteinreinigung erfolgt in einer Reihe von Auftrennungsverfahren, welche auf verschiedenen Eigenschaften der Proteine beruhen: Ladung Polarität Grösse Bindungsaffinität Löslichkeit (Proteine sind Polyelektrolyte: sie tragen viele ionisierbare Gruppen an der Oberfläche. Ihre Löslichkeit ist daher abhängig von der Salzkonzentration der Umgebung (Puffer) [Ionenstärke I=1/2∑ciZi^2], der Art der gelösten Ionen, dem pH-Wert, der Temperatur und der Polarität des Lösungsmittels) Nach jedem Reinigungsschritt wird der Proteingehalt mit einem geeigneten Assay untersucht. Aussalzen Methode: Durch eine hohe Salzkonzentration wird die Löslichkeit der Proteine herabgesetzt, so dass sie ausfallen. Ziele: Konzentrieren verdünnter Proteinlösungen Trennung von Proteinen, die bei verschiedenen Salzkonzentrationen ausfallen Dialyse Methode: Ein Dialyseschlauch (z.B. Celluloseschlauch mit Poren), der die Fraktion enthält, wird in einen Puffer gestellt. Kleine Moleküle, welche durch die Poren passen, diffundieren in den Puffer. Ziel: Entfernung von Salzen und anderen kleinen Molekülen -2- 13.05.2016 Biochemiezusammenfassung, Kapitel 4 Esther Büchel Chromatographische Methoden: Substanzgemisch in mobiler Phase läuft durch stationäre Phase. Unterschiedliche Wechselwirkungen der Moleküle, die in der mobilen Phase gelöst sind, mit der Stationären Phase bewirkt unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten und damit die Auftrennung der Moleküle. Durch Wiederholung des Vorgangs kann die Trennleistung verbessert werden. Wichtig sind die Auswahl der Methode und deren Spezielle Bedingungen. Früher wurden die Papier- und die Dünnschichtchromatographie angewendet. Da man damit nur sehr kleine Proteinmengen trennen kann, sind diese Methoden nur für analytische Anwendungen geeignet. Die Chromatographiemethoden, die heute häufig angewendet werden sind im Folgenden erklärt: Gelfiltrationschromatographie Methode: Stationäre Phase: Säule aus porösen Kügelchen, die aus einem unlöslichen, aber stark hydratisieren Material bestehen. (Poren gefüllt mit wässriger Lösung) Meist Dextran oder Agarose: Kohlenhydrate mit bestimmter Porenweite. Mobile Phase: (Läuft durch stationäre Phase) Grosse Moleküle passieren die Säule schneller als kleine Moleküle, da ihnen ein kleineres Volumen zugänglich ist. Kleine Moleküle treten öfters in die Poren der Kügelchen ein, es dauert daher länger, bis sie aus der Säule austreten. Ziel: Auftrennung nach der Grösse des Proteins, sehr häufig angewandt. Ionenaustauschchromatographie Methode: Stationäre Phase: Typische positiv oder negativ geladene Endgruppen sind an ein Material (meist Cellulose) gebunden: Positiv geladen: DEAE (Diethylaminoethyl)- Gruppe: Anionenaustauscher Negativ geladen: CM (Carboxymethyl)- Gruppe: Kationenaustauscher Mobile Phase: Je nach Ladungsdichte der Proteine (abhängig von pH und Ionenstärke), haften diese unterschiedlich stark an den geladenen Endgruppen. Bei einer Anionenaustauscherchromatographie binden die Moleküle mit der grössten negativen Ladungsdichte am besten an die positiv geladenen Endgruppen. Sie verlassen die Säule zuletzt. Bei der Kationenaustauscherchromatographie sind es die Moleküle mit der grössten positiven Ladungsdichte, welche die Säule zuletzt verlassen. Die an die Endgruppen gebundenen Proteine werden nach und nach ausgewaschen (eluiert), in dem man die Salzkonzentration (Ionenstärke) des durchfliessenden Puffers erhöht, so dass andere Ionen die Proteine von den Endgruppen verdrängen. Resultat: Trennung von Proteinen aufgrund ihrer Ladungsdichte (Nettoladung) Affinitätschromatographie Methode: Stationäre Phase: An das Trägermaterial der Säule sind Gruppen angehängt, für welche das gewünschte Protein eine spezifische Affinität besitzt. Mobile Phase: Das gewünschte Protein heftet sich an die Gruppen, die restlichen Proteine werden mit Puffer ausgespült. Anschliessend werden die in der Säule gebundenen Proteine entfernt. Dies geschieht durch Zugabe von löslichen Formen der spezifischen Gruppe, welche die Proteine von den Gruppen der Säule verdrängen, oder durch Änderung der chemischen Bedingungen, so dass -3- 13.05.2016 Biochemiezusammenfassung, Kapitel 4 Esther Büchel die Bindungsaffinität der Proteine zu den Gruppen der Säule herabgesetzt wird und diese die Säule verlassen können. Resultat: Isolierung eines Proteins aufgrund seiner spezifischen Affinität zu einer Gruppe. Vorteile dieser Methode: - Hohe Reinigungsleistung - schnell: weniger weitere Reinigungsschritte nötig Nachteile: - Stationäre Phase oft aufwendig herzustellen (Heute werden den Proteinen oft Tags (Gruppen für die Reinigung) angehängt) Hydrophobe Interaktionschromatographie Methode: Stationäre Phase: An das Trägermaterial der Säule sind apolare Gruppen angehängt. Mobile Phase: Durch unterschiedlich starke hydrophobe Wechselwirkungen mit den apolaren Gruppen werden die Protein aufgetrennt. Diese Wechselwirkungen sind umso stärker, je höher die Ionenstärke des Puffers ist. Zur Auswaschung der Proteine wird die Ionenkonzentration des Puffers kontinuierlich erniedrigt. Die Auftennung erfolgt also hier nach der Polarität der Proteine. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie liquid chromatography) (HPLC: high performance Methode: Die stationäre Phase besteht aus einem sehr fein strukturierten Material, es muss deshalb Druck angewendet werden, damit angemessene Durchflussraten der mobilen Phase möglich sind. HPLC ist eine verfeinerte Methode, die für alle Säulenchromatographietechniken angewandt werden kann. Vorteile: Verbesserte Auflösung, genau kontrollierte Flussraten Hohe Reproduzierbarkeit aufgrund on-line-Detektion Optimal für analytische Trennungen Elektrophoretische Methoden: Elektrophorese: Wanderung von Ionen (oder Molekülen mit einer Nettoladung) in einem elektrischen Feld. Polyacrylamidgelelelektrophorese (PAGE) Methode: Auf eine dünne Schicht aus Polyacrylamid (polymerisiertes Acrylamid mit Quervernetzer) werden verschiedene Proteinproben parallel aufgetragen. Darunter auch Proben mit Eichproteinen zum Vergleich. Dann wird eine elektrische Spannung angelegt. Die aufgrund des umgebenden Puffers (pH > 9) negativ geladenen Proteine wandern in Richtung der positiv geladenen Kathode durch das Gel. Die Proteinproben werden nun nach ihrer Molekülgrösse und ihrer elektrophoretischen Beweglichkeit aufgetrennt: Je nach Grösse der Moleküle passen sie unterschiedlich gut durch die Poren des Gels. Das Gel wirkt als Molekularsieb: Kleine Moleküle wandern rasch vorwärts, grosse Moleküle sind nahezu unbeweglich, Moleküle mittlerer Grössen bewegen sich mit den entsprechenden Wanderungsgeschwindigkeiten. Die elektrophoretische Beweglichkeit (Wanderungsgeschwindigkeit v) ist abhängig von der elektrischen Feldstärke (E), von der Nettoladung des Proteins (z) und von dem Reibungskoeffizienten (f): -4- 13.05.2016 Biochemiezusammenfassung, Kapitel 4 Esther Büchel v = Ez/f Der Reibungskoeffizient seinerseits ist abhängig von der Masse und der Gestalt des Proteins und von der Viskosität (η) des Mediums. Für eine Kugel mit Radius r gilt: f = 6πηr Nach der Auftrennung werden die Proteine durch Zugabe von Essigsäure fixiert und danach mit unterschiedlichen Methoden sichtbar gemacht. (Färbemethoden: Coomassie Brilliant Blue oder Silberfärbung, radioaktiv markierte Proteine durch Autoradiographie (Röntgenfilm auf das Gel legen), Immuno- oder Westernblotting (später erklärt)….) Anwendung: Primär analytisch: Man kann die Effizienz des Aufreinigungsprotokolls kontrollieren, indem man immer einen Teil der Fraktionen mittels Gelelektrophorese auftrennt und sichtbar macht. Die Anzahl Proteine (Banden) sollte während der Aufreinigung abnehmen, während die Intensität der Bande des gewünschten Proteins immer mehr zunehmen sollte. (Wird neben der wiederholten Kontrollen der spezifischen Aktivität (Assays) angewendet.) SDS PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) Methode: Die Polyacrylgelelektrophorese wird hier unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt. SDS (Natriumdodecylsulfat) ist ein Denaturierungsmittel. Es lagert sich an die Aminosäuren an (je ein SDS-Molekül pro zwei Aminosäuren) und zerstört damit fast alle nicht kovalenten Wechselwirkungen innerhalb des Proteins. Die Disulfidbrücken werden durch Zugabe von Mercaptoethanol oder Dithiothreitol aufgebrochen. Es entstehen denaturierte (aufgefaltete) Proteine, welche je nach Anzahl der Aminosäuren von unterschiedlich vielen negativ geladenen SDS- Molekülen umgeben sind. Die stärke der negativen Ladung ist also proportional zum Molekulargewicht des Proteins. (Ladung des Proteins vernachlässigbar) Bei der Elektrophorese ist die relative Beweglichkeit der SDS- Proteinkomplexe etwa proportional zum Logarithmus der Masse des Proteins. (Ausnahmen: manche Kohlenhydratreiche Proteine und Membranproteine) Vorteile: Mit der SDS PAGE kann das Molekulargewicht von Proteinen sehr genau bestimmt werden. Dazu vergleicht man die erhaltenen Banden mit den Banden von Eichproteinen bekannter Grösse. Hohe Auflösung Bei komplexen Proteinen, die aus mehreren Polypeptidketten bestehen werden die Ketten voneinander getrennt. Indem man die SDS PAGE mit oder ohne Mercaptoethanol/ Dithiothreitol durchführt kann man Informationen über Disulfidbrücken gewinnen. Agarosegelelektrophorese Bei der Agarosegelelektrophorese wird Agarose als Gelmaterial benutzt. Agarose ist mechanisch stabiler als Polyacrylamid und hat grössere Poren. Sie wird daher zur Auftrennung grösserer Proteine verwendet. Elektrophorese: Isoelektrische Fokussierung Methode: Zuerst ein Gemisch von Polyampholyten elektrophoretisch aufgetrennt. Polyampholyte sind kleine Polymere mit einer bestimmten Anzahl von sauren und basischen Gruppen. Durch deren elektrophoretische Auftrennung wird im Gel ein -5- 13.05.2016 Biochemiezusammenfassung, Kapitel 4 Esther Büchel stabiler pH-Gradient geschaffen. Danach werden die Proteinproben aufgetragen und es wird eine Spannung angelegt. Die sauren und basischen Gruppen der Proteine liegen je nach pH-Wert geladen oder ungeladen vor. Bei der Wanderung durch den pH-Gradienten verändert sich also deren Nettoladung. Der pI- Wert (=isoelektrischer Punkt) ist der pH-Wert, bei welchem die Nettoladung des Proteins null beträgt. Die elektrophoretische Beweglichkeit eines ungeladenen Proteins ist gleich null. Die Proteine wandern also bei der isoelektrischen Fokussierung genau bis zu ihrem isoelektrischen Punkt. Resultate: Auftrennung der Proteine anhand ihres relativen Gehalts an sauren und basischen Resten Hohe Auflösung: Proteine mit der Differenz von einer Ladung sind noch trennbar! Zweidimensionale Gelelektrophorese Erste Dimension: Die Proteinprobe wird durch isoelektrische Fokussierung aufgetrennt. Zweite Dimension: Senkrecht zur ersten Richtung wird eine SDS PAGE durchgeführt. Die Proteine mit demselben pI-Wert werden dabei nach ihrer Grösse aufgetrennt. Man erhält also ein zweidimensionales Bild von getrennten Proteinen Vorteile: In einem Experiment können sehr viele Proteine getrennt werden Zellproteine können unter verschiedenen Physiologischen Bedingungen aufgetrennt werden → Hinweise auf Genregulation Die Identifizierung erfolgt rasch mit Massenspektrometrie und Edman-Abbau (später beschrieben) Aufreinigungsprotokoll Um den Erfolg der Proteinreinigung zu verfolgen, führt man nach jedem Reinigungsschritt eine SDS-PAGE durch und testet die Fraktion nach ihrer spezifischen Aktivität. Die erhaltenen Werte werden in einer Tabelle aufgelistet. Man Beobachtet vor allem die Veränderung von Reinheitsgrad und Ausbeute. (Erklärung Siehe Buch, S. 95) Ultrazentrifugation Der Sedimentationskoeffizient s ist ein Mass dafür, wie stark sich ein Teilchen unter der Zentrifugalkraft bewegt. Er hängt ab von der Masse m des Teilchens, vom Reibungskoeffizient f (Mass für die Form des Teilchens) und vom Auftrieb des Mediums (1-vς) (Korrekte Zeichen: Buch, S.96), wobei v der Kehrwert der Dichte des Teilchens (partielles spezifisches Volumen) und ς die Dichte der Lösung darstellt: S = m(1- vς)/f [Einheit: 1 Svedberg (S) = 10^(-13) Sekunden] (Zonen-, Banden-,)Dichtezentrifugation: Zuerst wird im Zentrifugenröhrchen ein Dichtegradient zur Verhinderung von Konvektionsströmen hergestellt. (z.B. Saccharoselösung, deren Konzentration nach unten zunimmt) Dann wird die Proteinprobe dazugegeben und bei einer empirisch bestimmten Dauer und Geschwindigkeit zentrifugiert. Die Proteine trennen sich nach ihren unterschiedlichen Sedimentationskoeffizienten auf. Die Fraktionen können durch ein Loch im Röhrchen gesammelt werden. -6- 13.05.2016 Biochemiezusammenfassung, Kapitel 4 Esther Büchel Sedimentationsgleichgewichtszentrifugation: Eine Probe wird bei relativ geringer Geschwindigkeit zentrifugiert, so dass die Sedimentation durch die Diffusion ausgeglichen wird und sich das Sedimentationsgleichgewicht eingestellt hat. Die Proteine werden so relativ genau nach ihren Molekulargewichten aufgetrennt (unter nativen Bedingungen, im Gegensatz zur SDS PAGE: Proteine aus mehreren Polypeptidketten bleiben zusammen. Durch Vergleich mit der Masse, die durch SDS PAGE gewonnen wurde, lässt sich bestimmen, aus wie vielen Polypeptidketten das Protein besteht) MALDI-TOF-Massenspektrometrie Bei der Massenspektrometrie werden gasförmige, positiv geladene Moleküle durch ein elektrisches Feld beschleunigt. Die Flugzeit (TOF, time of flight) hängt ab vom Masse- Ladungs-Verhältnis des Teilchens. Um die Proteine in einen gasförmigen geladenen Zustand zu überführen, werden verschiedene Methoden angewandt. Bei der MALDI (matrix-assisted laser desorption-ionisation, matrixunterstützte Laserdesorption/ Ionisation) wird die in eine geeignete Matrix eingebettete Proteinprobe durch einen Laserstrahl ionisiert. Der Laserimpuls startet jeweils eine Uhr, welche die Flugzeit (TOF) der Ionen bis zum Auftreffen auf einen Detektor misst. Dieser zeichnet das MALDI-TOF-Massenspektrum auf, aus welchem die Masse des Proteins höchst exakt bestimmt werden kann. Peptidmassen-Fingerprinting: Eine Proteinprobe, welche mit der zweidimensionalen Gelelektrophorese aufgetrennt worden ist, kann mit enzymatischen Mitteln spezifisch gespalten und mittels MALDI-TOF untersucht werden. Die so ermittelten Peptidmassen stellen einen Fingerabdruck für das ursprüngliche Protein dar. Dieser kann mit elektronisch gewonnenen und in Datenbankten gesammelten Fingerprints verglichen und identifiziert werden. Diese Methode zur Identifizierung von Proteinen ersetzt heute weitgehend den Edman-Abbau. (später erklärt) Ermittlung der Primärstruktur von Proteinen Die erste Proteinsequenzierung gelang 1953 Frederick Sanger. Die Entwicklung der Sequenzierungstechnik war sehr wichtig für die Biochemie und Molekularbiologie. Die Kenntnis der Aminosäuresequenz… …ist bedeutend bei der Identifikation von Proteinen …ist Voraussetzung für 3-D-Strukturbestimmungen …erlaubt Sequenzvergleiche (z.B. um das evolutionäre Schicksal zu erforschen→ siehe Abschnitt Proteinevolution) …ist wichtig für die Analyse von Erbkrankheiten …ist Grundlage für die Herstellung monoklonaler Antikörper (später erklärt) …erlaubt die Erkennung von Signalsequenzen (Epitopen), welche Information über den Bestimmungsort und die Funktion des Proteins liefern Da heute aber die DNA-Sequenzierung schneller geht, wird die Proteinsequenz über deren DNA-Sequenz bestimmt, falls diese bekannt ist. (Sonst stellt man DNASonden her, welche einen kleinen Teil der Aminosäuresequenz repräsentieren. -7- 13.05.2016 Biochemiezusammenfassung, Kapitel 4 Esther Büchel Diese werden verwendet, um das Gen für das Protein zu isolieren, aus dem sich dann die Gesamtsequenz für das Protein ermitteln lässt) Aus der DNA-Sequenz lässt sich ausserdem ermitteln, wie oft und wann das Gen exprimiert wird. Heute werden meist nur noch Teilsequenzen bestimmt, um… …(unbekannte) Proteine zu identifizieren …die Identität eines gereinigten Proteins zu verifizieren …posttranslational veränderte Proteinreste in der Sequenz zuzuordnen …herauszufinden, wo im nativen Protein Disulfidbrücken ausgebildet werden …Proteinsequenzen zu bestimmen, wenn die DNA fehlerhaft ist Proteinsequenzierung: Bestimmung der Anzahl Polypeptidketten Dabsylchlorid reagiert mit einer ungeladenen α-Aminogruppe zu einem Sulfonamidderivat. Bei der Hydrolyse der Peptidkette wird dieses nicht aufgespaltet. Aufgrund der chromatographischen Eigenschaften der Dabsylmarkierten Aminosäure kann herausgefunden wie viele und welche Aminosäuren sich an einem N-Terminus befanden. Die Anzahl N-Termini entspricht der Anzahl Polypeptidketten des Proteins. Dansylchlorid wird ebenfalls zur Bestimmung der N-Termini angewendet. Auch durch eine SDS-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen kann die Anzahl Polypeptidketten bestimmt werden. Trennung der Polypeptidketten Mit denaturierenden Reagenzien wie Harnstoff oder Guanidiniumchlorid werden die Ketten voneinander dissoziiert. Die Disulfidbrücken werden durch β-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol reduziert und anschliessend durch Zugabe von Iodacetat alkyliert, damit die SH-Gruppen nicht erneut reagieren. Die dissoziierten Ketten werden durch chromatographische Methoden voneinander getrennt. Fragmentierung der Polypeptidkette Da die Sequenzierung von Proteinen mit mehr als 50 Resten meist nicht mehr exakt möglich ist, wird die Polypetidkette zuerst spezifisch gespalten. Dies kann mit chemischen oder enzymatischen Methoden erfolgen. Die Chemikalie Bromcyan (CNBr) zum Beispiel, spaltet Polypeptidketten auf der Carboxylseite eines Metioninrestes. Trypsin, ein proteolytisches Enzym aus dem Pankreassaft, spaltet Polypeptidketten auf der Carboxylseite von Arginin- und Lysinresten. Chymotrypsin, ein anderes Enzym, schneidet die auf der Carboxylseite von aromatischen und weiteren sperrigen unpolaren Resten. Ziel ist es, durch verschiedene spezifische Spaltungen, Sätze von überlappenden Fragmenten zu bekommen, welche nach der Sequenzierung die Bestimmung der Sequenz der ganzen Polypeptidkette ermöglichen. Trennung der Fragmente Die Peptide werden chromatographisch aufgetrennt. (mit HPLC) -8- 13.05.2016 Biochemiezusammenfassung, Kapitel 4 Esther Büchel Sequenzierung der Fragmente: Automatisierter Edman-Abbau Beim Edman-Abbau wird vom Aminoende des Peptids her eine Aminosäure nach der anderen entfernt: Phenylisothiocyanat reagiert unter mild alkalischen Bedingungen mit der ungeladenen endständigen Aminogruppe des Peptids. Eine milde Säure aktiviert die gebundene Chemikalie, so dass die spezifisch die Peptidbindung zwischen der aminoterminalen Aminosäure und dem Rest des Peptids spaltet. Man erhält also ein intaktes, um eine Aminosäure verkürztes Peptid und eine abgespaltete PTHAminosäure (Phenylthiohydantoin-Aminosäure). Diese lässt sich mit HPLC identifizieren. Das verkürzte Peptid wird nun erneut dem Edman-Abbau unterzogen und die nächste PTH-Aminosäure kann identifiziert werden. So fährt man weiter, bis alle Aminosäuren des Peptids identifiziert sind. Aufklärung der vollständigen Sequenz der Polypeptidkette Die vollständige Sequenz der Polypeptidkette kann aus den Sequenzen der überlappenden Fragmente rekonstruiert werden. Anordnung der Disulfidbrücken Um herauszufinden wo in einer Polypeptidkette Disulfidbrücken ausgebildet werden, fragmentiert man sie, ohne vorher die Disulfidbrücken zu brechen. Das Peptidgemisch wird entlang einer Papierkante elektrophoretisch aufgetrennt. Danach wird das Papier Perameisensäuredämpfen ausgesetzt. Dabei werden die Disulfidbrücken gebrochen. Bei anschliessender Elektrophorese in senkrechter Richtung zur ersten Elektrophorese haben die nun voneinander getrennten Peptide eine unterschiedliche Beweglichkeit als die über Disulfidbrücken verknüpften Peptide hatten. Peptide ausserhalb der Diagonalen waren also über Disulfidbrücken verknüpft. (daher wird diese Methode auch als Diagonale Elektrophorese bezeichnet) Durch die anschliessende Sequenzierung dieser Peptide und ihrer Lokalisation in der Polypeptidkette findet man die Lage der Disulfidbrücken im Protein heraus. Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung: Die Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung ist für die Sequenzierung nicht erforderlich. Sie kann aber der Charakterisierung eines Proteins dienen. Zum Beispiel, um zu kontrollieren, ob sie mit der bekannten Sequenz verträglich ist. Das Polypeptid wird dabei 24 Stunden in 6M HCl bei 110°C hydrolysiert. Die nun freien Aminosäuren werden durch Ionenaustauschchromatographie aufgetrennt und über ihr Elutionsvolumen (Puffervolumen, welches benötigt wird um die Aminosäure aus der Säule freizusetzen) identifiziert. Die Mengen der Aminosäuren bestimmt man durch Einfärbung mit Ninhydrin und anschliessender Messung der Extinktion. Für sehr genaue Mengenmessungen verwendet man Fluorescamin, welches mit der α-Aminogruppe zu einem fluoreszierenden Derivat reagiert. Die Menge wird hier durch Fluoreszenzmessung bestimmt. Proteinevolution Die Kenntnis der Aminosäuresquenz liefert nicht nur Informationen über die Struktur und die Funktion des Proteins, sondern auch über sein evolutionäres Schicksal: -9- 13.05.2016 Biochemiezusammenfassung, Kapitel 4 Esther Büchel Mit einem Computer lässt sich eine bekannte Aminosäurensequenz schnell mit anderen Sequenzen vergleichen. Proteine mit ähnlichen Sequenzen sind evolutiv nahe verwandt und zeigen ähnliche Funktionen. Sie werden daher in Proteinklassen zusammengefasst. Der Vergleich von homologen Proteinsequenzen verschiedener Arten liefert Informationen über die Evolutionswege. Die Evolutionären Entfernungen werden aufgrund der angenommenen Anzahl der Mutationen bestimmt. Wenn man die Proteine fossiler Proben untersucht, lassen sich Aussagen über den Zeitpunkt der Aufspaltung des Evolutionsweges machen. Sich wiederholende Sequenzen können Informationen über das evolutionäre Schicksal des Proteins liefern. Denn oft sind neue Proteine durch Verdoppelung und anschliessende Umänderung eines Urgens entstanden. Immunchemische Methoden: Immunologische Techniken basieren auf der Spezifität von Antikörpern für eine Struktur (Epitop) an der Oberfläche eines bestimmtes Antigens (Hier eine Protein). Herstellung Monoklonaler Antikörper Früher wurden Antikörper in Tieren hergestellt, indem man ihnen das Antigen injizierte, so dass das Tier Antikörper zur Abwehr dieses Antigens produzierte. Danach konnte man die Antikörper aus dem Blutserum gewinnen. Das Problem dabei war, dass die Antikörper polyklonal waren, das heisst es gab ein heterogenes Gemisch von Anitkörpern welche auf verschiedene Epitope des Antigens passten. Heute ist es möglich, fast zu jedem Protein spezifische monoklonale Antikörper herzustellen: Dazu injiziert man das Protein einer Maus, und entnimmt ihr danach die Milz. Dort hat die Maus spezifische Zellen produziert, welche das Antigen gegen das injizierte Protein produzieren. Ziel ist es nun, die gewünschte antikörperproduzierende Zelle zu klonen. Diese stirbt aber nach kurzer Zeit ab. Darum fusioniert man die Zellen aus der Milz der Maus mit unsterblichen Myelomzellen. (abstammend vom multiplen Myelom, einer Krankheit, bei welcher sich antikörperproduzierende Zellen unkontrolliert vermehren.) Die entstandenen Hybridomzellen produzieren nun unbegrenzt eine homogene Antikörperpopulation, deren Spezifität durch die elterliche Zelle bestimmt ist. (In der Milz waren noch andere antikörperproduzierende Zellen vorhanden) Die Zellen, bei welchen die gewünschte ProteinAntikörperreaktion stattfindet, werden dann isoliert und weiter vermehrt, bis reine Zellinien der gewünschten antikörperproduzierenden Zelle entstehen. Verwendung von monoklonalen Antikörpern in der Proteinforschung: Markierte Antikörper als Sonden, um die Lage bestimmter Proteine im Körper nachzuweisen Verwendung von Antikörpern in der festen Phase der Affinitätschromatographie Antikörper werden in vielen Assays (Tests auf spezifische Funktionen) verwendet Produktion von Antikörpern gegen ein unbekanntes Protein (Kapitel 4.4, kein Prüfungsstoff) - 10 - 13.05.2016 Biochemiezusammenfassung, Kapitel 4 Esther Büchel Die vier nachfolgenden Methoden sind ebenfalls Beispiele für die Verwendung von monoklonalen Antikörpern in der Proteinforschung. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Indirekter ELISA: In ein proteinbeschichtetes Reaktionsgefäss werden spezifische Antikörper gegeben, welche an das Protein binden. Danach werden andere Antikörper dazugegeben, die mit Enzymen gekoppelt sind. Diese enzymgekoppelten Antikörper binden nun an die proteinspezifischen Antikörper im Reaktionsgefäss. Ungebundene Antigen-Enzymkomplexe werden ausgewaschen. Die Enzyme katalysieren die Reaktion eines farblosen Substrates zu einem farbigen Produkt. Wenn Substrat ins Reaktionsgefäss gegeben wird, kann man aufgrund der Geschwindigkeit der Farbentwicklung auf die Menge des Enzyms und damit auf die Menge des Proteins im Reaktionsgefäss schliessen. Die Geschwindigkeit der Farbentwicklung ist dabei der Menge des proteinspezifischen Antikörpers proportional. Man kann mit dieser Methode also das Vorhandensein von Antikörpern nachweisen. (Bsp. Aidstest: Im Blut wird das Vorhandensein von Antikörpern gegen das Virusantigen untersucht) „Sandwich“-Elisa: Ein Reaktionsgefäss wird mit monoklonalen Antikörpern beschichtet, danach werden die Proteine dazugegeben, welche an die Antikörper binden. Eine zweite Sorte Antikörper, die mit Enzymen gekoppelt sind, bindet an die Proteine. Nichtgebundene Moleküle werden ausgewaschen. Bei der Zugabe von Substrat ist die Geschwindigkeit der Farbentwicklung diesmal proportional zur Menge Protein. Man kann mit dieser Methode ein spezifisches Protein nachweisen und die Menge bestimmen. (Proteinmengen unter einem Nanogramm (10-9g) können nachgewiesen werden.) Western-Blotting Zuerst wird eine Proteinprobe mit der SDS-PAGE aufgetrennt. Die einzelnen aufgetrennten Fraktionen werden dann auf eine Polymerschicht übertragen. (Diese Übertragung nennt man Blotting) Danach werden spezifische Antikörper dazugegeben die an das gesuchte Protein binden. Nichtgebundene Antikörper werden ausgewaschen. Durch Zugabe einer zweiten Sorte von Antikörpern, die radioaktiv markiert sind und an den ersten Antikörper binden, kann man nun die Antikörper-Antigenkomplexe nachweisen. Dort wo auf dem Röntgenfilm schwarze Banden erscheinen, befindet sich das gesuchte Protein. Wie beim ELISA kann man zum Nachweis den zweiten Antikörper auch an ein Enzym koppeln, welches ein gefärbtes Produkt erzeugt. Mit dem Western-Blotting können sehr geringe Mengen eines bestimmten Proteins bei gleichzeitiger Anwesenheit zahlreicher anderer Proteine nachgewiesen werden. (z.B. um ein Virusprotein im Blut ausfindig zu machen) Fluoreszenzmikroskopie Zellen werden mit spezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörpern oder Proteinen eingefärbt. Diese heften sich an die Proteine der Zelle, für welche sie eine Affinität besitzen. Bei der Betrachtung im Fluoreszenzmikroskop sieht man, wo das Protein lokalisiert ist. Bei dieser Methode können also Proteine in ihrem zellulären Umfeld - 11 - 13.05.2016 Biochemiezusammenfassung, Kapitel 4 Esther Büchel untersucht werden. Die Lokalisation der Proteine in der Zelle erlaubt Rückschlüsse auf ihre Funktion zu ziehen. Immunelektronenmikroskopie Hier setzt man Antikörper mit elektronendichten Markern ein und macht sie mit dem Elektronenmikroskop sichtbar. Im Gegensatz zur Fluoreszenzmikroskopie erlaubt diese Methode eine bessere räumliche Auflösung bei der Lokalisation von Proteinen in ihrem zellulären Umfeld. - 12 - 13.05.2016 Biochemiezusammenfassung, Kapitel 4 Esther Büchel Ermittlung der 3-D-Struktur von Proteinen: Das Proteinfaltungsproblem ist heute noch nicht gelöst. Das heisst, man kann bei einer bekannten Aminosäuresequenz noch nicht voraussagen, wie sich die Polypeptidkette falten wird. Dabei ist die dreidimensionale Struktur des nativen Proteins entscheidend für seine Funktion. Zwei der wichtigsten Techniken zur Aufklärung der dreidimensionalen Struktur sind im Folgenden erklärt. NMR-Spektroskopie (nuclear Kernresonanzspektroskopie) magnetic resonance spectroscopy, Eindimensionale NMR: Prinzip: Voraussetzung für die Untersuchung ist die Herstellung einer hochkonzentrierten Proteinlösung (ca. 1mM). An die Proteinlösung wird ein starkes homogenes Magnetfeld angelegt. Es gibt nun Atome, welche ein eigenes kleines Magnetfeld besitzen. Zum Beispiel das Wasserstoffatom (Proton,1H), das 13C- und das 15NAtom. Diese kleinen Magnetfelder (Elementarmagnete) entstehen aufgrund der Bewegung der Kerne dieser Atome, den Kernspins. Sie richten sich parallel (αSpinzustand) oder antiparallel (β-Spinzustand) zum angelegten äusseren Magnetfeld aus. Der Übergang vom α-Spinzustand zum angeregten β-Spinzustand kostet Energie. Durch einen elektromagnetischen Strahlungsimpuls bestimmter Frequenz kann diese Energiedifferenz überwunden werden. Den Übergang des Spins von α nach β nennt man Resonanz. Je nach Bindungspartner ist die Elektronendichte um den Elementarmagneten unterschiedlich gross. Eine Hohe Elektronendichte schirmt den Elementarmagneten vom äusseren Magnetfeld ab, so dass das angelegte Magnetfeld oder die Frequenz des Strahlungsimpulses erhöht werden muss, um Resonanz zu erzielen. Auch Magnetfelder direkt benachbarter Atome (Zum Beispiel Wasserstoffatome, welche an das benachbarte Kohlenstoffatom gebunden sind) beeinflussen die Stärke eines Elementarmagneten. Die angeregten Kerne emittieren elektromagnetische Strahlung einer bestimmten Frequenz, die sich messen lässt. Die Frequenz (=Energie der Strahlung) hängt von der Umgebung des Atoms ab. Diese Unterschiede der Frequenz aufgrund der chemischen Umgebung bezeichnet man als chemische Verschiebung. Indem man das magnetische Feld bei konstanter Frequenz der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung variiert oder das Feld konstant hält und die Frequenz der Strahlung ändert, kann man das Resonanzspektrum eines Moleküls ermitteln. Im Resonanzspektrum eines kleinen Proteins werden fast alle Protonen und ihre chemischen Verschiebungen dargestellt. Man kann daraus die Umgebung der Protonen (wie die Polarität der Bindungen und die Anzahl Protonen an benachbarten Kohlenstoffatomen) bestimmen. Zweidimensionale NMR: NOESY-Spektroskopie (nuclear Overhauser enhacement spectroscopy) Wenn man durch einen Hochfrequenzimpuls eine vorübergehende Magnetisierung erzeugt, so kann man den Spin eines Kerns verändern und die Auswirkung dieser Veränderung auf die Nachbaratome untersuchen. Je weiter die Kerne voneinander entfernt sind, desto geringer ist die gegenseitige Beeinflussung. (Kern-OverhauserEffekt, nuclear Overhauser effect, NOE) Bei Kernen, die nicht mehr als 0,5nm voneinander entfernt liegen, ergibt es ein abweichendes Signal aufgrund des NOE. - 13 - 13.05.2016 Biochemiezusammenfassung, Kapitel 4 Esther Büchel (Abweichende Signale von der Diagonale, welche das eindimensionale NMRSpektrum darstellt) Man kann mit dieser Methode die relativen Entfernungen (unter 0.5nm) der Wasserstoffatome zueinander im nativen Protein bestimmen. Durch diese Entfernungen lässt sich die dreidimensionale Struktur des Proteins nahezu eindeutig voraussagen. Röntgenkristallographie Diese Methode erfordert es, dass alle Moleküle in präziser Orientierung vorliegen. Darum werden die Proteine zuerst kristallisiert. Dies kann zum Beispiel durch Zugabe von Ammoniumsulfat geschehen, welches die Löslichkeit des Proteins verringert, so dass sich hochgeordnete Proteinkristalle bilden (Aussalzen). Solche Kristalle sind meist aus regelmässigen Strukturen (Einheitszellen) mit grossen Lösungszwischenräumen aufgebaut. Proteine, die in Lösung verschiedene Konformationen einnehmen können, können auch in unterschiedlichen Zuständen kristallisieren. Proteinkristalle sind häufig immer noch biologisch aktiv. Ein Proteinkristall wird nun mit Röntgenstrahlen bestrahlt. Diese werden durch Beschleunigung von Elektronen gegen eine Aufprallfläche aus Kupfer erzeugt. Die Wellenlänge von Röntgenstrahlen entspricht ungefähr der Länge einer kovalenten Bindung. Man erhält dadurch eine sehr hohe Auflösung. Ein Teil des Strahls geht ohne Richtungsänderung durch den Kristall hindurch, der Rest wird in verschiedene Richtungen gestreut oder gebeugt. Die gebeugten Strahlen können mit einem elektronischen Festkörperdetektor registriert oder mithilfe eines Röntgenfilms sichtbar gemacht werden, wobei der Schwärzungsgrad der Emulsion der Intensität des gebeugten Strahles proportional ist. Wenn man den Kristall rotieren lässt, bekommt man ein dreidimensionales Muster von Reflexen (Punkten) verschiedener Positionen und Intensitäten. Dieses Beugungsmuster liefert eine Vielzahl von Informationen über die Struktur des analysierten Proteins: Die Elektronendichte im Protein bestimmt den Beugungsgrad des Stahls. (bei hoher Elektronendichte wird der Strahl stärker gebeugt) Man kann ausserdem die Anordnung der Atome herausfinden, denn die gebeugten Wellen treten wieder zusammen und verstärken sich oder löschen sich am Detektor oder am Film aus. Die Elektronendichtekarte kann nun mit einer mathematischen Beziehung, der Fourier-Transformation, berechnet werden. Aus der Intensität wird für jeden Reflex eine Elektronendichtewelle berechnet. Die Phase (zeitliche Beziehung ihrer Berge und Täler) dieser Welle bestimmt, ob sie die Wellen anderer Reflexe auslöscht oder verstärkt. Aus diesen Elektonendichtewellen erhält man schlussendlich eine dreidimensionale Darstellung der Elektronendichteverteilung im Protein, welche einer geologischen Karte mit Höhenlinien gleicht. - 14 -
