1. Einleitung - repOSitorium

Struktur, Funktion und Regulation der
Plasmamembran V-ATPase von Manduca sexta
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
des Fachbereiches Biologie/Chemie
an der Universität Osnabrück
Vorgelegt von
Markus Huß
aus Augsburg
Osnabrück, 2001
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1
1.1.
Ionentransport-ATPasen und ihre Funktion in der Membran
1
1.2.
Die V-ATPase im Mitteldarm von M. sexta
5
1.3.
Regulation von V-ATPasen
7
1.4.
Die Charakterisierung von ATPasen mit Hilfe von Inhibitoren
10
1.5.
Aufgabenstellung
12
2. Material
13
2.1.
Chemikalien, Enzyme und sekundäre Antikörper
13
2.2.
Puffer und Medien
14
2.3.
Versuchstiere
15
3. Methoden
16
3.1.
16
3.1.1.
3.1.2.
3.1.3.
3.1.4.
3.1.5.
3.1.6.
3.1.7.
3.1.8.
3.1.9.
3.1.10.
3.1.11.
3.1.12.
3.1.13.
3.1.14.
3.1.15.
3.1.16.
3.1.17.
3.1.18.
3.1.19.
3.1.20.
3.1.21.
3.1.22.
Biochemische Methoden
Präparation von angereicherten und hochreinen GobletzellApikalmembranen
Reinigung des V1Vo Holoenzyms aus angereicherter GCAM oder aus
Mitteldarmrohhomogenat
Reinigung des Vo Komplexes aus angereicherter GCAM oder aus
Mitteldarmrohhomogenat
Reinigung des V1 Komplexes aus Mitteldarm
SDS-PAGE
Proteinbestimmung
Western Blot
Reinigung von Antikörpern
Immunfärbung
Coomassie-Färbung
Silber-Färbung
Markierung mit 14C-DCCD
Markierung mit 125J-Concanamycin A
Isoelektrische Fokussierung mit anschließender 2-D Elektrophorese
Röntgenkleinwinkelstreuung
Matrix unterstützte Laserdesorptions-Ionisations-Massenspektroskopie
(MALDI-MS)
N-terminale Sequenzierung
ATPase-Aktivitätstest und Phosphatbestimmung
Bestimmung und Entfernung endogener Nukleotide
Behandlung des V1 Komplexes mit chaotropen Ionen (KI-Stripping)
Messung des ATP-getriebenen Protonentransports
Rekonstitution des V1Vo Holoenzyms in Liposomen
16
17
18
18
19
20
21
21
22
23
23
23
24
24
25
25
26
26
27
28
28
29
Inhaltsverzeichnis
3.1.23.
3.1.24.
3.2.
3.2.1.
3.2.2.
3.2.3.
3.2.4.
3.2.5.
3.2.6.
3.2.7.
3.2.8.
3.2.9.
3.2.10.
Messung kapazitiver Ströme am blacklipid Bilayer
Auftrennung von Subkomplexen des V1Vo Holoenzyms
Molekularbiologische Methoden
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Phenolextraktion und Ethanolfällung
Plasmid DNA Präparation
Spaltung von DNA durch Restriktionsenzyme
Agarosegelelektrophorese von DNA
Ligation und Transformation
Herstellung kompetenter Zellen
Sequenzierung von DNA
Klonierung, Expression und Reinigung von rekombinanten Teilen der B
Untereinheit im pMal-c2-System
Herstellung der rekombinanten Untereinheit C im pET System
29
30
30
30
31
31
31
32
32
32
33
33
35
4. Ergebnisse
36
4.1.
36
4.1.1.
4.1.2.
4.1.3.
4.1.4.
4.1.5.
4.2.
4.2.1.
4.2.2.
4.2.3.
4.2.4.
4.3.
4.3.1.
4.3.2.
4.3.3.
4.3.4.
4.4.
4.4.1.
4.4.2.
4.4.3.
4.4.4.
Die Struktur der V-ATPase aus M. sexta
Optimierung der V1Vo Holoenzym Präparation
Entdeckung der Untereinheit a bei M. sexta
Die Untereinheit B und die Identifizierung ihrer putativen Isoform B´ als
Hsp60
Identifizierung der Untereinheit D
Analyse aller Untereinheiten der V-ATPase durch MALDI-MS
Der V1 Komplex
Modifikation der Präparation des V1 Komplexes
Die Untereinheitenzusammensetztung des V1 Komplexes in der 2-D
Gelelektrophorese
Untersuchung der Untereinheit C im V1 Komplex
Behandlung des V1 Komplexes mit chaotropen Ionen
Der Vo Komplex
Reinigung des Vo Komplexes
Identifizierung der 26 kDa Bande des Vo Komplexes
Markierung der plecomakrolidbindenden Untereinheit der V-ATPase
Die Wirkung neuer Makrolide
Funktion und Regulation des V1Vo Holoenzyms und
des V1 Komplexes
Einfluß von Alkoholen und Detergenzien auf die Mg-ATPase
Aktivität des V1 Komplexes
Einfluß von Methanol auf das V1Vo Holoenzym
Abhängigkeit der Ca-abhängigen Hydrolyse-Aktivität des
V1 Komplexes vom verwendeten Nukleosidtriphosphat
Einfluß von Ca-ADP, Mg-ADP und Pi auf die Hydrolyse
von ATP durch das V1Vo Holoenzym und den V1 Komplex
36
40
42
45
45
49
49
52
53
59
61
61
65
66
73
76
76
78
79
80
Inhaltsverzeichnis
4.4.5.
4.4.6.
4.4.7.
4.4.8.
4.4.9.
Bestimmung der endogen gebundenen Nukleotide des
V1Vo Holoenzyms und des V1 Komplexes
Dissoziation des V1Vo Holoenzyms in vitro
Einfluß von DCCD und Concanamycin auf die Mg2+- und Ca2+ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms
Messung des Protonentransports an GCAM-Vesikeln mit Mg2+und Ca2+-ATP als Substrat
Messungen kapazitiver Ströme des rekonstituierten V1Vo Holoenzyms
85
87
91
93
94
5. Diskussion
95
5.1.
95
5.1.1.
5.1.2.
5.1.3.
5.1.4.
5.1.5.
5.1.6.
5.1.7.
5.2.
5.2.1.
5.2.2.
5.2.3.
5.2.4.
5.3.
5.3.1.
5.3.2.
5.3.3.
Die Struktur der V-ATPase aus M. sexta
Das V1Vo Holoenzym
Der Vo Komplex
Der V1 Komplex
Die putative Isoform der Untereinheit B gehört zu den Hsp60-Proteinen
Gehört die Untereinheit C zum V1 Komplex?
Ist die Untereinheit E bei V-ATPasen das funktionelle Homolog zur
Untereinheit  der F-ATPasen?
Die räumliche Struktur des V1 Komplexes
Die Aktivität der V-ATPase
Ca2+ ist kein vollwertiger Ersatz für Mg2+
Warum ist der isolierte V1 Komplex inaktiv?
Die V-ATPase-Aktivität wird durch ADP gehemmt
Mg-ATP spielt eine wichtige Rolle bei der Dissoziation der
V-ATPase in den V1 und den Vo Komplex
Makrolid Antibiotika als Inhibitoren der V-ATPase
Die Identifizierung der plecomakrolidbindenden Untereinheit
der V-ATPase
Gibt es eine gemeinsame Bindestelle für Makrolide in V-ATPasen?
Die V-ATPase von M. sexta: Ein Modellsystem für die
Osteoporoseforschung
95
96
99
100
101
102
104
106
106
107
109
110
112
112
118
120
6. Zusammenfassung
122
7. Literaturverzeichnis
124
8. Publikationen
133
9. Abkürzungsverzeichnis
134
10. Lebenslauf
135
11. Danksagung
136
Einleitung
1. Einleitung
1.1. Ionentransport-ATPasen und ihre Funktion in der Membran
Für die Funktion einer Minimalzelle ist, neben einem grundlegenden Stoffwechselzyklus und
einer replikationsfähigen Matrize, eine Membran erforderlich, welche die ganze Zelle
umschließt und sie gegen ihre Umgebung abgrenzt (T. Ganti, 1971). Diese Membran muß die
Fähigkeit zu einem kontrollierten Austausch von Ionen und Molekülen zwischen dem Cytosol
und dem extrazellulär Medium besitzen. Da der Austausch häufig entgegen einem
elektrochemischen Gradienten erfolgen muß, sind spezielle Proteine in die Membran
integriert, die diese Transportprozesse energetisieren. Ist der Transport direkt an die
Hydrolyse von ATP gekoppelt, nennt man ihn primären Transport, wird er dagegen durch
eine primär erzeugte ionenmotorische Kraft über der Membran angetrieben spricht man von
sekundärem Transport (Harold, 1986). Bei den für den primären Transport zuständigen
Membranproteinen handelt es sich um Ionentransport-ATPasen, die nach Pedersen & Carafoli
(1987) in die drei Klassen der P-, F- und V-ATPasen eingeteilt werden können, wobei die
letzteren beiden sich von einem gemeinsamen Vorfahren ableiten lassen (Nelson & Taiz,
1989).
Bei den P-ATPasen handelt es sich um die am einfachsten gebauten Vertreter der
Ionentransport-ATPasen (Pedersen & Carafoli, 1987). In der Regel bestehen sie aus einer,
manchmal auch aus zwei oder mehr Untereinheiten (Geering, 2000). Sie heißen P-ATPasen,
da sie während der Hydrolyse von ATP ein Aspartyl-Phosphat-Intermediat bilden, also
kurzzeitig phosphoryliert werden; aus diesem Grunde ist eine Hemmung ihrer Enzymaktivität
durch das Phosphatanalogon ortho-Vanadat möglich. Das wohl bekannteste Mitglied dieser
Klasse ist die Na+/K+-ATPase, die in der basolateralen Membran fast jeder tierischen Zelle
vorkommt. Sie energetisiert über den von ihr erzeugten Na+-Gradienten die sekundär-aktive
Aufnahme von Glukose und Aminosäuren, ist an der Regulation des Zellvolumens und an der
elektrischen Erregbarkeit von Nervenzellen beteiligt. Einige weitere Vertreter der P-ATPasen
sind die Ca2+-ATPasen in der Membran des sarcoplasmatischen Retikulums, die H+/K+ATPase in der Magenschleimhaut von Wirbeltieren, die H+-ATPasen in der Plasmamembran
von Pflanzen und Pilzen und die Kdp-ATPasen in der Cytoplasmamembran von Eubakterien
(Pedersen & Carafoli, 1987).
1
Einleitung
Die zweite Klasse der Ionentransport-ATPasen sind die F-ATPasen, welche in der inneren
Mitochondrienmembran, in der Thylakoidmembran von Chloroplasten und in der
Plasmamembran von Bakterien vorkommen. Dort fungieren sie als ATP-Synthasen und
nutzen eine durch Elektronentransportketten aufgebaute protonenmotorische Kraft (proton
motive force, pmf) zur Synthese von ATP aus ADP und Phosphat (Mitchell, 1966). Die
bakterielle F-ATPase kann unter anaeroben Bedingungen auch in die entgegengesetzte
Richtung arbeiten und durch ATP-Hydrolyse einen Protonengradienten über der Membran
aufbauen, der zu sekundären Transportprozessen genutzt werden kann. Der Aufbau der FATPasen ist wesentlich komplexer als bei den P-ATPasen. Mit einer Molekularmasse von bis
zu 800 kDa setzen sie sich aus einem peripheren F1 Komplex und einem membranständigen
Fo Komplex zusammen. Vom F1 Komplex leitet sich auch der Name der ganzen Klasse ab, da
er unter der Bezeichnung Faktor 1 erstmals als Bestandteil der ATP-Synthase erkannt und
isoliert wurde (siehe Pedersen & Carafoli, 1987). Der Fo Komplex wiederum erhielt seinen
Namen auf Grund der Sensitivität der mitochondrialen F-ATPase gegenüber dem
Antibiotikum Oligomycin (siehe Pedersen & Carafoli, 1987). Weitere wirksame Inhibitoren
sind unter anderem NaN3 und N´,N´-Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD). Die F-ATPase
besteht, bei einem ihrer am einfachsten gebauten Vertreter aus dem Bakterium E. coli, aus den
F1 Untereinheiten und und den Fo Untereinheiten a, b und c in der Stöchiometrie
 a, b2 und c12 (Deckers-Hebestreit & Altendorf, 1996, Fillingame et al., 1998).
Der Fo Komplex der F-ATPasen von Mitochondrien und Chloroplasten ist ungleich
komplexer aufgebaut und besteht aus bis zu 8 verschiedenen Untereinheiten (McCarty, 1992).
Die Stöchiometrie der Untereinheit c scheint bei den F-ATPasen zwischen verschiedenen
Spezies zu variieren. So wurde für den Fo Komplex aus Chloroplasten 14 Kopien der
Untereinheit c identifiziert (Seelert et al., 2000), für den Fo Komplex aus Hefe jedoch nur 10
(Stock et al., 1999). Weiterhin gibt es Beobachtungen, dass die Stöchiometrie der
Untereinheit c bei E. coli in Abhängigkeit von der angebotenen Kohlenstoffquelle variieren
kann (Schemidt et al., 1998). Die Struktur des F1 Komplexes und von Teilen des Fo
Komplexes ist inzwischen durch Röntgenkristallographie bestimmt worden (Abrahams et al.,
1994, Stock et al., 1999, Gibbons et al., 2000). Die drei - und die drei -Untereinheiten sind
alternierend um die zentrale -Untereinheit angeordnet, die mit dem Ring der c Untereinheiten
des Fo Komplexes in Verbindung steht. Eine durch die pmf angetriebene Rotation dieses
Rings wird über die asymmetrisch geformte -Untereinheit in den F1 Komplex übertragen und
führt dort zu einer zyklischen Konformationsänderung der katalytischen -Untereinheiten,
2
Einleitung
wie sie zur ATP-Synthese nach dem binding-change Mechanismus erforderlich ist (Boyer,
1989; Junge et al., 1997). Mittlerweile konnte diese Rotation der -Untereinheit und des Rings
aus c Untereinheiten experimentell bestätigt werden (Duncan et al., 1995; Sabbert et al.,
1996; Noji et al., 1997, 1999; Pänke et al., 2000; Tsunoda et al., 2000).
Die dritte Klasse der Ionentransport-ATPasen bilden die V-ATPasen. Sie erhielten ihren
Namen aufgrund ihrer erstmaligen Beschreibung in der Vakuolenmembran der Hefe (siehe
Pedersen & Carafoli, 1987) und zeichnen sich durch ihre hohe Empfindlichkeit gegenüber den
Plecomakroliden Bafilomycin und Concanamycin aus, durch die sie bereits im nanomolaren
Bereich gehemmt werden (Überblick in Dröse & Altendorf, 1997). V-ATPasen sind
elektrogene Protonenpumpen, die in bestimmten Endomembranen aller Eukaryonten und in
den Plasmamembranen einer ganzen Reihe tierischer Zellen vorkommen (Gogarten et al.,
1992; Gluck, 1992; Anraku et al., 1992). Auch in der Zellmembran von Prokaryonten wurden
ATPasen vom V-Typ nachgewiesen, allerdings translozieren sie dort Na+-Ionen statt H+Ionen (Takase et al., 1993). Im Gegensatz zu den mit ihnen verwandten F-ATPasen arbeiten
V-ATPasen ausschließlich als ATP-abhängige Ionenpumpen. Bei Eukaryonten erfolgt der
Protonentransport immer vom Cytosol in das entsprechende Zellorganell oder den
Extrazellulärraum. Sie generieren dabei eine pmf, welche für die unterschiedlichsten sekundär
aktiven Transportprozesse genutzt wird. In Abhängigkeit von den entsprechenden Antiportern
oder Symportern und dem entsprechenden Gegenion kann sich der pH-Wert des transKompartiments ins Saure oder Alkalische verschieben oder er bleibt neutral (Harvey, 1992).
Wird kein Gegenion transportiert, entsteht eine Spannung über der Membran. In Endosomen,
Vakuolen und Lysosomen ist eine Ansäuerung jeweils entscheidend für deren Funktion.
Durch die Senkung des pH-Wertes werden in Lysosomen Proteasen aktiviert oder in
Endosomen die Liganden von ihren Rezeptoren dissoziiert (Mellman, 1992). In
Plasmamembranen übernehmen die V-ATPasen ebenfalls die Aufgabe der Protonensekretion,
wie zum Beispiel bei der Regulation des Säure/Base-Haushalts im proximalen und distalen
Tubulus der Säugerniere (Gluck et al., 1992) oder bei der Auflösung der Knochenmatrix
durch Osteoklasten (Blair, 1998). Darüber hinaus nehmen sie in vielen tierischen Epithelien
die bisher weniger bekannte Aufgabe wahr, sekundär aktive Transportprozesse zu
energetisieren. In tierischen Zellen erfolgt dies normalerweise durch das von der Na+/K+ATPase generierte Na+-Potential. Sind die Zellen aber einer Na+-armen Umgebung
ausgesetzt, wie z. B. im Mitteldarm von pflanzenfressenden Insekten oder im Epithel der
Froschhaut und den Kiemen von Süßwasserfischen, wird das benötigte Ionen-Potential nicht
3
Einleitung
mit einem Na+-Gradienten erzeugt (Wieczorek et al., 1991; Harvey B. J., 1992; Wieczorek et
al., 1999). In diesen Fällen erzeugt eine V-ATPase ein Protonenpotential.
Wie bereits erwähnt, sind die F- und V-ATPasen miteinander verwandt und haben mehrere
strukturelle Merkmale gemeinsam. So lassen sich auch die V-ATPasen in einen peripheren,
katalytischen und einen membranständigen, protonentranslozierenden Komplex unterteilen,
welche in Analogie zu den F-ATPasen als V1 und Vo Komplex bezeichnet werden. Der V1
Komplex setzt sich aus den Untereinheiten A3, B3, C, D, E1-3, F, G1-3 und H zusammen, wobei
die Stöchiometrie der Untereinheiten E und G (wie durch die Indices angedeutet) noch nicht
geklärt ist (Arai et al., 1988; Supekova et al., 1995; Xie, 1996; siehe auch Abb. 3). Die
Untereinheiten A und B des V1 Komplexes weisen eine mehr als 25%ige Sequenzhomologie
zu den Untereinheiten  und  der F-ATPasen auf (Nelson & Taiz, 1989). Bei der
Untereinheit A handelt es sich um die katalytisch aktive Untereinheit, die ebenso wie die
Untereinheit

der
F-ATPasen
die
Glycin-reiche
Nukleotid-bindende
Sequenz
GXXXXGKT/S, das sogenannte Walker-Motiv enthält (Walker et al., 1982). Außerdem
enthält sie zwei hochkonservierte Cysteine, wodurch die V-ATPasen sensitiv für SH-Gruppen
modifizierende Substanzen wie zum Beispiel N-Ethylmaleimid (NEM) sind (Moriyama &
Nelson, 1987). Die Untereinheit B wird in Analogie zu ihrem Pendant der -Untereinheit der
F-ATPasen als regulatorische Untereinheit bezeichnet. Sie besitzt zwar kein Walker-Motiv,
kann aber das ATP-Analogon 3-O-(4-Benzoyl)Benzoyladenosin-5´-triphosphat (BzATP)
binden (Manolson et al., 1985; Vasilyeva & Forgac, 1996). Die restlichen V1-Untereinheiten
C bis H, welche den Stiel der V-ATPase bilden, haben keinerlei Sequenzhomologien zu FATPase Untereinheiten. Auf jeden Fall ist jede der Untereinheiten wichtig für die korrekte
Funktion der V-ATPase, da in Hefe gezeigt wurde, dass sie entweder essentiell für die
Assemblierung und/oder die Aktivität sind (Stevens & Forgac, 1997). Da für die Kopplung
von ATP-Hydrolyse und Protonentranslokation in Analogie zu F-ATPasen auch für VATPasen ein Rotationsmechanismus angenommen wird, interessiert besonders, welche der
Stieluntereinheiten den Part der -Untereinheit übernimmt; sowohl für die Untereinheit E als
auch für die Untereinheit D gibt es entsprechende Hinweise (Bowman et al., 1995; Nelson et
al., 1995).
Der Vo Komplex besteht in seiner minimalen Ausstattung aus den Untereinheiten a, d und c,
wobei von der Untereinheit c, welche auch als Proteolipid bezeichnet wird, die Isoformen c´
und c´´ vorkommen können (Arai et al., 1988; Hirata et al., 1997). Die Untereinheit c ist
homolog zur Untereinheit c der F-ATPasen und offensichtlich durch eine Genduplikation aus
einem gemeinsamen Vorfahren entstanden (Mandel et al., 1988). Im Vergleich zu ihrem
4
Einleitung
Pendant bei den F-ATPasen hat sie deshalb eine doppelt so große Molekularmasse, vier statt
zwei Membrandurchgänge und liegt auch nur in sechs Kopien pro Vo Komplex vor (Noumi et
al., 1991; Nelson, 1992). Das Proteolipid ist vermutlich die entscheidende Untereinheit für die
Protonentranslokation über die Membran, da die Bindung von DCCD an ein Glutamat in der
vierten Transmembranhelix diesen komplett unterbindet, wobei nur eine der Untereinheiten c
ein DCCD-Molekül gebunden haben muß (Arai et al., 1988; Forgac, 1998). Außerdem nimmt
man an, dass es sich beim Ring aus den c Untereinheiten, wiederum in Analogie zu den FATPasen, um den membranständigen Teil des Rotors handelt (Forgac, 1998). Die
Untereinheit a wird als mögliche Bindestelle des V-ATPase-Inhibitors Bafilomycin und als
Hauptbestandteil des Stators diskutiert (Zhang et al., 1994; Forgac, 1998). Für die
Untereinheit d gibt es noch keine konkreten Hinweise auf eine spezielle Funktion, es konnte
nur gezeigt werden, dass sie ebenfalls wichtig für die Assemblierung der V-ATPase ist
(Bauerle et al., 1993).
1.2. Die V-ATPase im Mitteldarm von M. sexta
Eine der am besten untersuchten V-ATPasen befindet sich im Mitteldarmepithel der Raupe
des Tabakschwärmers M. sexta, wo das von ihr erzeugte Transmembranpotential für die
Energetisierung aller Transportprozesse verantwortlich ist. Das einschichtige Epithel des
Mitteldarms besteht aus nur zwei differenzierten Zelltypen, den Columnar- oder Säulenzellen
und den Goblet- oder Becherzellen (Abb. 1). Es enthält keine Na+/K+-ATPase (Jungreis &
Vaughan, 1977) und wird durch ein K+-Potential energetisiert (Harvey et al., 1983,
Wieczorek et al., 1986). Die in der Gobletzellapikalmembran (GCAM) lokalisierte "K+Pumpe" wurde als ein Zweikomponentensystem aus einer V-ATPase und einem K+/nH+Antiporter identifiziert (Schweikl et al., 1989; Wieczorek et al.; 1989). Das Mitteldarmepithel
von M. sexta war damit das erste tierische Epithel, dessen Energetisierung durch eine VATPase nachgewiesen werden konnte (Wieczorek et al., 1991). Die in das Darmlumen
transportierten K+-Ionen erzeugen somit zum einen das K+-Potential, das zur Energetisierung
von Aminosäure/K+-Symporten in die Columnarzellen benötigt wird (Giordana et al., 1989).
Andererseits entzieht der Antiporter wegen seiner Stöchiometrie von 2H+ pro K+ dem
Darmlumen Protonen, was letztlich zu einem extrem hohen alkalischer pH-Wert von bis zu 12
im Lumen des Mitteldarms führt (Azuma et al., 1995). Die Alkalinität des Mitteldarmlumens
verhindert vermutlich eine Vernetzung der durch die pflanzliche Nahrung aufgenommenen
Tannine, welche ansonsten zu einer Inaktivierung von Enzymen führt (Goldstein & Swain,
1965; Berenbaum, 1980).
5
Einleitung
Abb. 1: Energetisierung des Mitteldarmepithels von M. sexta durch die V-ATPase. Der aktive elektrogene
K+-Transport erfolgt über die Gobletzellapikalmembran (GCAM) durch den von der V-ATPase (V)
energetisierten K+/2H+-Antiporter. Durch das Zusammenspiel von V-ATPase und Antiporter entsteht zum einen
der alkalische pH-Wert im Mitteldarmlumen und zum anderen eine Spannung von  150 mV über dem Epithel.
Durch einen Aminosäure/K+-Symporter (S) in der Columnarzellapikalmembran (CCAM) werden Aminosäuren
(AS) aufgenommen (modifiziert nach Wieczorek et al., 2000).
Ein besonderer experimenteller Vorteil der V-ATPase von M. sexta liegt in der extrem hohen
Dichte in der das Enzym in der GCAM vorliegt (Abb. 2). Schon in ersten elektronenmikroskopischen Aufnahmen von Schnitten des Mitteldarms fielen ca. 10 nm große Partikel
auf, welche die Apikalmembran der Gobletzellen bedeckten und als Portasomen bezeichnet
und mit dem Ionentransport in Verbindung gebracht wurden (Harvey et al., 1981). Die
Isolierung dieser Membran ermöglichte die ersten grundlegenden Charakterisierungen des
Ionentransports und die erste Solubilisierung und Reinigung der V-ATPase (Cioffi &
Wolfersberger, 1983; Wieczorek et al., 1986; Schweikl et al., 1989). Bis zu Beginn der
vorliegenden Arbeit gelang es durch die Kombination von molekularbiologischen und
biochemischen Methoden, die Untereinheiten A, B, E, F und G des V1 Komplexes, sowie die
Untereinheiten c und d des Vo Komplexes von M. sexta zu identifizieren (Dow et al., 1992;
Gräf et al., 1992; Novak et al., 1992; Gräf et al., 1994a; Gräf et al., 1994b; Lepier et al.,
1996; Merzendorfer et al., 1997b). Die Untereinheit F konnte dabei erstmals als konstitutive
V-ATPase Untereinheit beschrieben werden und ebenso wie die Untereinheit G erstmals dem
V1 Komplex zugeordnet werden. Für alle anderen dem V1 Komplex zugehörigen
Untereinheiten (C, D und H) gab es, wie aus der SDS-PAGE der gereinigten V-ATPase zu
erkennen war, potentielle Kandidaten in Form von Proteinbanden mit der entsprechenden
Molekularmasse. Bei den dem Vo Komplex zugehörigen Untereinheiten war dies nicht der
6
Einleitung
Fall; so konnte trotz der Verwendung eines ganzen Cocktails von Proteaseinhibitoren die als
proteolytisch sehr anfällig bekannte Untereinheit a nicht nachgewiesen werden, was als
Besonderheit von Insekten-V-ATPasen interpretiert wurde (Wieczorek, 1992; Wieczorek et
al., 2000). Die war insofern interessant, da die gereinigte V-ATPase aus M. sexta sich durch
Bafilomycin hemmen läßt und die Untereinheit a eigentlich als Bafilomycin-bindende
Untereinheit betrachtet wurde (Wieczorek et al., 1991; Zhang et al., 1994).
Abb. 2: Aufnahmen von Vesikeln der Gobletzellapikalmembran von M. sexta. Die Vesikel der gereinigten
GCAM aus dem posterioren Mitteldarm wurden von Dr. Michael Radermacher und Dr. Teresa Ruiz (MPI für
Biophysik, Frankfurt) wie in Radermacher et al. (1999) beschrieben negativ-kontrastiert und elektronenmikroskopisch abgebildet. In der Aufsicht ist deutlich die dichte Packung der V-ATPase (ca. 10000/µm2) und
die hexagonale Struktur des V1 Komplexes mit ca. 10 nm Durchmesser zu sehen (a, b). In der Seitenansicht ist
die Unterteilung Kopf und Stiel zusehen, wobei Einheit aus Stiel und Kopf ca. 15 nm aus der Membran
herausragt (a). (Radermacher, Ruiz, Huss und Wieczorek unpubliziert).
1.3. Regulation von V-ATPasen
Für ein komplexes Enzym wie die V-ATPase, das in verschiedensten Organellen, Organen
und Organismen ganz unterschiedliche Aufgaben erfüllt und dabei große Mengen von
Stoffwechselenergie in Form von ATP verbraucht, erscheinen Kontroll- und Regulationsmechanismen unbedingt erforderlich. So konsumiert die V-ATPase des Mitteldarmepithels
der Raupe von M. sexta 10% des gesamten ATPs des Tieres (Dow, 1984). Deshalb dürfte es
von großer Bedeutung sein, dass die V-ATPase-Aktivität den jeweiligen Erfordernissen und
Bedingungen angepasst wird, um nicht "unnötig" Energie zu verbrauchen.
Für V-ATPasen sind, unter anderem aus Untersuchungen an M. sexta, bereits einige
Regulationsmöglichkeiten bekannt. Schon die Biosynthese von V-ATPase Untereinheiten
wird auf der Ebene der Transkription reguliert. Ursprünglich wurden V-ATPasen in vielen
7
Einleitung
Organismen aufgrund von G+C-reichen Regionen in den Promotoren der Gene für einzelne
Untereinheiten als konstitutiv exprimierte house-keeping Proteine betrachtet (Wechser &
Bowman, 1995). Allerdings enthalten die Promotoren der Untereinheiten B, G und d von M.
sexta verschiedene Elemente, wie TATA-Boxen, CCAAT-Boxen oder Ecdyson-responsiveElemente die auf eine transkriptionelle Regulation hindeuten (Merzendorfer et al., 1997a). In
diesem Zusammenhang konnte mit Northern Blots gezeigt werden, dass die Menge der
mRNA für fast alle V-ATPase-Untereinheiten während der Häutung und bei Hunger abnimmt
und dies mit dem Anstieg des 20-Hydroxyecdyson-Titers (20-HE) in der Hämolymphe
korreliert (Reineke et al., 2001). Weiterhin konnte durch Injektion von 20-HE in die
Hämolymphe der Raupen und durch Reportergenstudien mit den Promotoren der Gene der
Untereinheiten B, G und d ein 20-HE-abhängiges Absinken der Transkriptionsrate für diese
Untereinheiten bestätigt werden (Reineke et al., 2001).
Auch auf posttranskriptioneller Ebene können die Untereinheiten der V-ATPase reguliert
werden. Bei M. sexta wurden erste Hinweise für eine Regulation durch die Transkription von
Antisense-RNA für die Untereinheiten d und H gefunden (Merzendorfer et al., 1997a;
Merzendorfer et al., 1997b; Merzendorfer, Düvel und Wieczorek unpubliziert). AntisenseRNA kann mit ihrer Sense-mRNA einen Doppelstrang ausbilden, der durch spezifische
Doppelstrang-RNAsen (dsRNAsen) abgebaut wird, wodurch die Translationsrate der
entsprechenden Untereinheit erniedrigt wird (Nellen & Lichtenstein, 1993).
Änderungen des Redoxpotentials in der Zelle könnten ebenfalls eine Möglichkeit darstellen
die Aktivität der V-ATPase zu modulieren. Ein Beispiel hierfür ist die redox-abhängige
Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen zwei konservierten Cysteinresten in der
Untereinheit A der V-ATPase aus Clathrinvesikeln mit der daraus resultierenden Inhibierung
(Taiz et al., 1994; Merzendorfer et al., 1997a; Stevens & Forgac, 1997). Auch die Aktivität
der V-ATPase aus N. crassa wird durch reduzierende bzw. oxidierende Agenzien modifiziert
(Dschida & Bowman, 1995).
Die Aktivität der V-ATPase lässt sich aber auch über die Menge der zur Verfügung stehenden
funktionsfähigen Enzyme in der Membran regulieren. Hierfür wurden bisher zwei
verschiedene Mechanismen entdeckt: Zum einen kann die Anzahl der V-ATPasen durch
Exozytose bzw. Endozytose von V-ATPase-haltigen Vesikeln gesteuert werden. Im distalen
und proximalen Tubulus der Säugerniere oder im Epithel der Krötenharnblase verschmelzen
dicht mit V-ATPase bepackte Vesikel nach Bedarf mit der Plasmamembran oder werden
wieder endozytiert (Gluck et al., 1982; Schwartz & Al-Awqati, 1985; Brown et al., 1987).
Zum anderen kann die Anzahl der aktiven V-ATPasen durch reversible Dissoziation des
8
Einleitung
cytosolischen V1 Komplexes vom membranständigen Vo Komplex gesteuert werden (Abb. 3).
Dieser
Mechanismus
wurde
erstmals
für
die
V-ATPase
im
Mitteldarm
der
Tabakschwärmerraupe von M. sexta entdeckt (Sumner et al., 1995). Nimmt die Raupe keine
Nahrung zu sich, z. B. während der Häutung oder bei Futtermangel, dissoziieren die V1
Komplexe von der Membran ab (Sumner et al., 1995; Gräf et al., 1996). Durch diese
Trennung in V1 und Vo Komplex wird die V-ATPase sehr effektiv ausgeschaltet, da der
cytosolische V1 Komplex in vivo keine Mg-ATPase-Aktivität und der Vo Komplex keine
Protonenleitfähigkeit besitzt (Gräf et al., 1996; Beltran & Nelson, 1992).
Abb. 3: Die V-ATPase und ihre reversible Dissoziation in die beiden Subkomplexe V 1 und Vo. In diesem
Modell wurden alle bekannten Untereinheiten der V-ATPase von M. sexta und die aktuellen Kenntnisse über
deren Topologie und Stöchiometrie berücksichtigt.
Durch die Dissoziation erhöht sich der Anteil von freien V1 Komplexen an cytosolischem
Protein von 1% auf 2% (Gräf et al., 1996). Aus diesem Pool von V1 Komplexen gelang es
erstmals einen nativen V1 Komplex aus den Untereinheiten A, B, E, F und G zu reinigen.
Dieser Komplex hat im Gegensatz zum V1Vo Holoenzym keine Mg-ATPase-Aktivität, kann
aber ebenso wie dieses die Hydrolyse von ATP in Gegenwart von Ca2+ katalysieren (Gräf et
al., 1996). Allerdings kann mit Zugabe von Methanol eine Mg-ATP-Hydrolyse-Aktivität des
V1 Komplexes induziert werden (Gräf et al., 1996). Wenn die Raupen wieder Nahrung zu sich
nehmen, reassoziiert der V1 Komplex wieder an die Membran. Die zur Reassoziation
benötigten V1 Komplexe werden offensichtlich aus dem cytosolischen Pool rekrutiert, da
hierfür keine Proteinneusynthese erforderlich ist (Jäger & Klein, 1996). Deshalb kann man
davon ausgehen, dass die Untereinheiten des Vo Komplexes in der Plasmamembran
9
Einleitung
verbleiben und ebenfalls wiederverwendet werden. Ob der Vo Komplex dabei allerdings als
ganzer intakter Komplex oder in seine Untereinheiten dissoziiert vorliegt, ist noch nicht
geklärt. Auch bei der Hefe S. cerevisiae wurde eine ähnliche reversible Dissoziation der VATPase nachgewiesen (Kane, 1995). Wird den Hefezellen durch einen Wechsel des
Nährmediums Glukose als Kohlenstoffquelle entzogen oder erreichen die Zellen die
stationäre Wachstumsphase, dissoziiert die V-ATPase, wird den Zellen wieder Glukose im
Medium angeboten, reassoziiert die V-ATPase (Kane, 1995; Parra & Kane, 1998). Da die
reversible Dissoziation der V-ATPase bei zwei phylogenetisch weit voneinander entfernten
Organismen entdeckt wurde, kann man auf einen allgemein gültigen Regulationsmechanismus für V-ATPasen schließen. Die genaue Steuerung der Dissoziation ist
weitgehend unbekannt. Möglicherweise spielt die Untereinheit C eine Rolle, da sie beim
abdissoziierten V1 Komplex aus Hefe nicht und aus M. sexta nur in substöchiometrischen
Mengen vorhanden ist, im reassoziiertem Holoenzym aber wieder auftaucht (Kane, 1995;
Gräf et al., 1996). Glukose spielt bei der Hefe offensichtlich eine entscheidende Rolle, da ihre
Entfernung aus dem Medium bereits nach fünf Minuten die Dissoziation der V-ATPase
bewirkt (Kane, 1995). Auch bei M. sexta sinkt innerhalb von nur 30 min nach Futterentzug
die Glukosekonzentration in der Hämolymphe um mehr als 60% ab und beträgt nach 10 h nur
noch 5% der Ursprungskonzentration (Gies et al., 1988). Bis jetzt konnte aber kein direkter
Zusammenhang
zwischen
Glukose
und
der
Dissoziation
gezeigt
werden.
Alle
Glukosestoffwechsel- und auch Signaltransduktionsmutanten der Hefe, die bisher untersucht
wurden, zeigten ein vergleichbares Dissoziationsverhalten wie der Wildtyp (Parra & Kane,
1998). Es ist allerdings bekannt, dass die V-ATPase unter dem Einfluß von chaotropen Ionen
und/oder Nukleotiden auch in vitro zu einer Dissoziation in ihren V1 und Vo Komplex neigt
(Moriyama & Nelson, 1989), wodurch die Untersuchung von grundlegenden zur Dissoziation
der V-ATPase führenden Mechanismen am gereinigten V1Vo Holoenzym möglich sein sollte.
1.4. Die Charakterisierung von ATPasen mit Hilfe von Inhibitoren
Wie bei nahezu jeder Proteinfamilie gibt es auch für die V-ATPasen spezifische Inhibitoren.
Diese können zum einen zur Klassifizierung herangezogen werden, zum anderen ermöglichen
sie es, die Funktion und die Struktur des jeweiligen Proteins zu untersuchen. So konnten
beispielsweise mit Hilfe des Phosphatanalogons ortho-Vanadat Teile des Reaktionszyklus der
P-ATPasen aufgeklärt werden (Cantley et al., 1978; Pedersen & Carafoli, 1987). Mit dem
Inhibitor NEM wurde die Untereinheit A als die katalytisch aktive Untereinheit der V-ATPase
bestätigt (Feng & Forgac, 1992). N´,N´-Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD), das sowohl F- als
10
Einleitung
auch V-ATPasen hemmt, bindet bei beiden ATPasen an einen sauren Aminosäurerest in der
membranständigen Untereinheit c des Fo- bzw. Vo-Komplexes, die zueinander homolog sind
(Sebald et al., 1980; Arai et al., 1987).
Auch Plecomakrolide wie die Bafilomycine und die Concanamycine sind gegen mehrere
Klassen von Ionentransport-ATPasen wirksam. Sie hemmen die V-ATPasen in nanomolaren
Konzentrationen, sind aber überraschenderweise gegen die verwandten F-ATPasen
vollkommen wirkungslos, obwohl Bafilomycin mit dem membranständigen Komplex
wechselwirkt, der bei beiden ATPasen zu einem großen Teil aus den zueinander homologen
Untereinheiten c besteht (Hanada et al., 1990; Dröse et al., 1993). Dagegen werden PATPasen, wie die Kdp-ATPase aus E. coli und die Na+/K+-ATPase aus Rind, die ganz
offensichtlich keinerlei Gemeinsamkeiten mit den V-ATPasen haben, in mikromolaren
Konzentrationen gehemmt (Bowman et al., 1988). Auch einige Vertreter der ABCTransporter (ATP-Binding-Cassette) erwiesen sich als sensitiv gegenüber Bafilomycin
(Higgins, 1992; Sharom et al., 1995; Hunke et al., 1995). Für keine der drei ATPase-Klassen,
die durch Plecomakrolide gehemmt werden, ist bisher die Bindestelle bekannt. Deshalb war
es von großem Interesse, zunächst für eine der ATPasen, im speziellem der V-ATPase,
welche am sensitivsten auf die Plecomakrolide reagiert, die Bindestelle am Enzym zu
bestimmen.
Weiterhin interessant sind auch Inhibitoren, die innerhalb einer Klasse von ATPasen eine
unterschiedlich starke Wirkung entfalten, da sie zum einen weiteren Aufschluß über den
Wirkungsmechanismus bzw. die Interaktion zwischen Inhibitor und Enzym geben und zum
anderen wichtige Erkenntnisse für die gezielte Veränderung der Inhibitorstruktur für
therapeutische Zwecke liefern können. So sind für Bafilomycin und Concanamycin für VATPasen aus verschiedenen Spezies sehr unterschiedliche IC50-Werte gemessen worden
(Dröse et al., 2001). Auch wurde kürzlich für eine neue Gruppe von Makroliden, die
Benzolactone-Enamide, entdeckt, dass sie unterschiedlich effizient gegenüber V-ATPasen
unterschiedlicher Herkunft sind (Erickson et al.,1997; Reichenbach, 1997; Kunze et al., 1998;
Boyd et al., 2001). Besonders auffällig war dabei die hohe Selektivität, mit der die
Benzolacton-Enamide V-ATPasen aus Säugetieren hemmten, nicht aber V-ATPasen aus
Pilzen (Boyd et al., 2001).
11
Einleitung
1.5. Aufgabenstellung
Durch die hohe Dichte der V-ATPase in der Gobletzellapikalmembran bietet der Mitteldarm
des Tabakschwärmers M. sexta ideale Vorraussetzungen für biochemische und strukturelle
Untersuchungen. Zunächst sollten die Präparationsmethoden für das V1Vo Holoenzym und
den V1 Komplex verbessert werden, um eine deutlich größere Ausbeute, Reinheit und
Stabilität des Holoenzyms und der V1-ATPase zu erhalten. Weiterhin sollte überprüft werden,
ob der Vo Komplex nach Abdissoziation des V1 Komplexes als ganzes in der Membran
erhalten bleibt. Gegebenenfalls sollte dieser native Vo Komplex dann gereinigt werden. Diese
drei gereinigten Komplexe sollten dann als Grundlage für alle weiteren geplanten
Untersuchungen dienen.

Ein primäres Ziel war die Aufklärung der Untereinheitenzusammensetzung der V-ATPase
und die Identifizierung der Untereinheiten auf Proteinebene, eine Vorraussetzung für
spätere
hochauflösende
Strukturanalysen.
Dazu
sollten
neben
etablierten
gelelektrophoretischen und immunochemischen Methoden auch die N-terminale
Sequenzierung und die MALDI-Massenspektrometrie herangezogen werden. Ein
besonderes Augenmerk sollte dabei der weitgehend unbekannten Struktur des V o
Komplexes gelten, für den bisher nur die Untereinheiten c und d identifiziert waren.

Mit einem semisynthetischen Concanamycin A Derivat sollte die im Vo Komplex
lokalisierte Plecomakrolid-bindende Untereinheit der V-ATPase detektiert und wenn
möglich die genaue Bindestelle eingegrenzt werden. Auch sollte die Wirkung einiger
neuer Makrolide auf die Aktivität der V-ATPase charakterisiert werden.

Der abdissoziierte V1 Komplex hat im Gegensatz zum V1Vo Holoenzym keine MgATPase-Aktivität, kann aber ebenso wie dieses die Hydrolyse von ATP in Gegenwart von
Ca2+ katalysieren. Durch die Zugabe von Methanol erhält der V1 Komplex die Fähigkeit,
Mg-ATP zu hydrolysieren zurück. Die Ursache dieses Phänomens sollte unter anderem
durch einen Vergleich der Enzymaktivitäten des V1 Komplexes und des V1Vo
Holoenzyms untersucht werden.

Da der Vorgang der Dissoziation der V-ATPase noch weitgehend unverstanden ist, sollte
er im Rahmen der vorliegenden Arbeit vor allem in Hinblick auf eine mögliche Rolle von
Nukleotiden näher betrachtet werden.
12
Material
2. Material
2.1. Chemikalien, Enzyme und sekundäre Antikörper
Amersham Pharmacia Biotech: 14C-DCCD
Amresco: Acrylamide (40%), Sequenziergelfertigmischung
Biomol: Pefabloc SC
Fluka:
Ammoniummolybdat,
Bafilomycin
B1,
Chloroform-Isoamylalkohol
(24:1),
Concanamycin A, Dinatrium-Hydrogen-Phosphat, Saccharose, -Aminocapronsäure, NaEGTA, Essigsäure, Ethanol, Glutaraldehyd, Glycin, Kaliumjodid, Salzsäure (37%),
Isopropanol,
Methanol,
n-Butanol,
MgCl2,
MOPS,
NaCl,
Natriumhydroxid,
Natriumthiosulfat, SDS, Silbernitrat, TCA, TEMED
FMC: Sea Plaque (low melting point) Agarose
Gibco: Agar, Agarose (ultrapure), Hefeextrakt, LB-Broth, NZY-Broth, TB-Broth, Pepton 140
Grüssing: Formaldehyd (37%), Glycerin (87%)
Loewe: IPTG, Tris
Merck: Amidoschwarz, Natriummolybdat, Schwefelsäure (95-98%), Tween 20, Coomassie
Brilliant-blau R-250
New England Biolabs: Restriktionsenzyme, T4-DNA-Ligase
Perkin Elmer: Taq Polymerase
Riedel-de Haen: Aceton, CaCl2 x 2 H2O, KCl, Natriumazid,
Serva:
APS,
BCIP,
Bromphenolblau,
BSA,
Na2-EDTA,
Fischgelatine
(flüssig),
Natriumacetat, Natriumcarbonat, NBT, SDS
Sigma: ADP (K-Salz), AMP-PNP (Li-Salz), ATP (Na-Salz), ATP (Tris-Salz), alkalische
Phosphatase, Alkalische Phosphatase-konjungierte Anti-Maus-IgG, Alkalische Phosphatasekonjungierte
Anti-Kaninchen
IgG,
Alkalische
Phosphatase-konjungierte
Anti-
Meerschweinchen IgG, Ampicillin, Bisacrylamid, -Mercaptoethanol, C12E10, DCCD, DTT,
EDTA (freie Säure), GTP (K-Salz), Jodacetamid, Malachitgrün, Mannit, Orthovanadat, PEP,
Luciferin/Luciferase, Ponceau S
Stratagene: Restriktionsenzyme, T4-DNA-Polymerase, alkalische Phosphatase
Alle verwendeten Chemikalien hatten, sofern nicht anders erwähnt, p. a. Qualität. Die nicht
aufgeführten Standardchemikalien wurden in der Regel von den Firmen Fluka, Sigma, Merck
13
Material
und Riedel de Haen bezogen. Die für die PCR eingesetzten Oligonukleotide wurden von
Amersham Pharmacia Biotech synthetisiert. Wurden für die Experimente käufliche Kits
eingesetzt ist dies im Text vermerkt.
2.2. Puffer und Medien
b-Medium: Einwaage pro Liter Medium: 5 g Hefeextrakt, 20 g Pepton 140, 5 g MgSO4, pH
mit KOH auf 7,6 eingestellt
a-Medium: entspricht b-Medium plus 14 g Agar
APP-Puffer: 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 9,5
APP-Puffer mit NBT/BCIP: 45 µl NBT und 35 µl BCIP pro 10 ml APP-Puffer
BCIP: 50 mg/ml 5-Bromo-4-Chloroindoxylphosphat in reinem Dimethylformamid
Blockpuffer: 3% Gelatine in TTBSN
Blotpuffer 1: 300 mM Tris (nach dem Ansetzen 1/4 Volumenteil Methanol zugeben)
Blotpuffer 2: 30 mM Tris (nach dem Ansetzen 1/4 Volumenteil Methanol zugeben)
Blotpuffer 3: 30 mM Tris 40 mM -Aminocapronsäure (nach dem Ansetzen 1/4 Volumenteil
Methanol zugeben)
ET: 5 mM Na2-EDTA, 5 mM Tris-HCl pH 8,1
HI: 1 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8,1
HIM: 9,6 mM -Mercaptoethanol in HI
HIMC: 0,01% C12E10 in HIM
Luciferin/Luciferase-Puffer: 60 mM Tris-Acetat pH 7,75, 10 mM MgCl2, 1 mM KCl, 1,5
mM EDTA, 2,5 mM -Mercaptoethanol, 0,4 mg/ml Luciferin/Luciferase (Sigma)
LO: 50 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8,1
LOM: 9,6 mM -Mercaptoethanol in LO
LOMC: 0,01% C12E10 in LOM
MENT: 300 mM Mannit, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 17 mM Tris-HCl pH 8,1
MENTP: 5 mM Pefabloc SC in MENT
NBT: 75 mg/ml Nitroblau Tetrazolium in 70% Dimethylformamid
Pyruvatkinase-Lösung: 70 mM Tris-Acetat pH 7,75, 9 mM MgCl2, 5 mM KCl, 2 mM
Phosphoenolpyruvat, 2 mM EDTA, 500 U/ml Pyruvatkinase
SET: 250 mM Saccharose in ET
14
Material
SETP: 5 mM Pefabloc SC in SET
TBS: 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,5
TBSN: 0,02% NaN3 in TBS
TE: 0,32 mM EDTA, 16 mM Tris-HCl pH 8,1
TEK: 200 mM KCl in TE
TEM: 9,6 mM -Mercaptoethanol in TE
TEN: 50 mM NaCl in TE
Tfb-1: 30 mM K-Acetat, 100 mM RbCl, 10 mM CaCl2, 15% Glycerin, 50 mM MnCl2, pH 5,8
Tfb-2: 10 mM MOPS, 10 mM RbCl, 75 mM CaCl2, 15% Glycerin, pH 6,5
TTBSN: 0,05% Tween 20 in TBSN
Verdünnungspuffer: 1% Gelatine in TTBSN
2.3. Versuchstiere
Bei den für die Präparationen verwendeten Tieren handelt es sich um Raupen des
Tabakschwärmers Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae, Abb. 4), die wenn nicht anders
erwähnt im 5. Larvalstadium waren und ein Gewicht von ca. 6 g hatten. Die Raupen wurden
in einem Laborbrutschrank bei 27°C und 16 h Langtag-Bedingungen gehalten und mit
synthetischem Futter ernährt (Bell & Joachim, 1974). Die Falter wurden in Käfigen mit einem
Volumen von mindestens 1 m3 gehalten (27°C, 16 h Tageslicht), wobei eine 30%ige
Zuckerlösung als Nahrung diente.
Abb. 4: Der Tabakschwärmer (Manduca sexta). Raupe im 5. Larvenstadium
15
Methoden
3. Methoden
3.1. Biochemische Methoden
3.1.1. Präparation von angereicherten und hochreinen Gobletzell-Apikalmembranen
Zur Anreicherung von Apikalmembranen der Gobletzellen wurde die Methode von Cioffi und
Wolfersberger (1983), modifiziert durch Wieczorek et al. (1990), verwendet. Als Ausgangsmaterial dienten posteriore Mitteldärme aus M. sexta Raupen (5. Larvenstadium, 5-7 g). Diese
wurden nach Entfernen der Längsmuskulatur entfaltet, in ca. 2 mm große Stücke geschnitten
und in eiskaltem SET-Puffer gesammelt. Durch Ultraschall (Branson-Sonifier 250, Mikrospitze, Ausgangsleistung 2, Arbeitspuls 35%/s, 15-25 Pulse) wurde zunächst der Mikrovillisaum der Columnarzellen abgeschert und der Zellinhalt durch dreimaliges Waschen mit SETPuffer entfernt. Die Apikalmembran der Gobletzellen wurde durch Triturieren mit einer
Pasteurpipette vom Rest des Zellverbandes gelöst und durch Filtrieren (4 Lagen Gaze)
abgetrennt. Die so gewonnenen Membranen wurden abzentrifugiert, in SET resuspendiert und
in einem gestuften Saccharosedichtegradienten (3 ml 45%, 3 ml 41% und 3 ml 37%
Saccharose in ET w/w) 4 h bzw. über Nacht bei 107.000 x g und 4°C isopyknisch
zentrifugiert (SW 41 Ti Rotor, Beckman). Die an der Grenze von 37% und 41% Saccharose
angereicherten
Gobletzell-Apikalmembranen
wurden
vom
Saccharosegradienten
abgenommen, in 4 Schritten (0,5, 1, 1 und 1,5 Volumenteile) langsam mit ET-Puffer 1:5
verdünnt und bei 10.000 x g (30 min, 4°C, Avanti Kühlzentrifuge, JA25.50, Beckman)
zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 ml SET-Puffer resuspendiert, bei 48.000 x g (15 min, 4°C,
Avanti Kühlzentrifuge, JA25.50, Beckman) erneut zentrifugiert und entweder direkt weiter
verwendet oder in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bei –20°C gelagert.
Die Präparation von reiner GCAM (Wieczorek et al., 1990) erfolgte bis zur Verdünnung der
vom Saccharosedichtegradienten abgenommenen Bande wie oben beschrieben, allerdings
enthielt der Gradient kein EDTA. Die verdünnte Suspension wurde dann auf
Corexzentrifugengläser verteilt (5-6 ml pro Röhrchen), mit 4 Pulsen ultrabeschallt (BransonSonifier 250, Mikrospitze, Ausgangsleistung 2, Arbeitspuls 35%/s) und für 30 min bei 10.000
x g zentrifugiert (4°C, Avanti Kühlzentrifuge, JA25.50, Beckman). Dabei lösen sich vor allem
noch an der GCAM anhaftende Mitochondrien. Die Überstände, die reine GCAM enthielten,
wurden in einem Erlenmeyerkolben auf Eis gesammelt, die Pellets in jeweils 3 ml SET
16
Methoden
resuspendiert und erneut, wie vorher beschrieben, beschallt und zentrifugiert. Nach
zweimaliger Wiederholung dieser Prozedur wurden die gesammelten Überstände aus den 4
Zentrifugationsschritten auf Polycarbonatröhrchen verteilt und für 1 h bei 30.000 x g
zentrifugiert. Das durchsichtige Pellet, welches die gereinigte GCAM enthielt, wurde in dem
für die Versuche relevanten Puffer resuspendiert und auf Eis bzw. im Kühlschrank gelagert.
3.1.2. Reinigung des V1Vo Holoenzyms aus angereicherter GCAM oder aus Mitteldarmrohhomogenat
Zur Reinigung von V1Vo Holoenzyms wurden zunächst tiefgefrorene angereicherte
Gobletzell-Apikalmembranen benutzt und direkt wie weiter unten beschrieben solubilisiert
und aufgereinigt (Schweikl et al., 1989). Um eine höhere Ausbeute an V1Vo Holoenzym mit
weniger Aufwand zu erhalten, wurde eine modifizierte Präparation aus Rohhomogenat von
ganzen Mitteldärmen entwickelt. Dazu wurden isolierte Mitteldärme von bis zu 24, für 15 min
auf Eis gekühlten Raupen (5. Larvalstadium) in kaltem Puffer SETP (250 mM Saccharose, 5
mM EDTA, 5 mM Tris-HCl, 5 mM Pefabloc SC, pH 8,1) mit einem Ultraturrax (IKA,
Deutschland) 30 s bei 20500 rpm homogenisiert. Nach einer Zentrifugation von 5 min bei
10.000 x g und 4°C in einem Festwinkelrotor (Avanti Kühlzentrifuge, JA25.50, Beckman)
wurde das Pellet in SETP resuspendiert und erneut unter den gleichen Bedingungen
zentrifugiert. Dieses Pellet wurde wieder in SETP aufgenommen und, um das noch
vorhandene Fett effektiv abzutrennen, nun für 30 min bei 200.000 x g und 4°C in einem
Festwinkelrotor (90 Ti, Beckman) zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet in TEM mit
0,1% C12E10 bei 4°C solubilisiert, wobei im Falle der tiefgefrorenen angereicherten
Gobletzell-Apikalmembran das Detergens zu Protein Verhältnis dabei 2:1 betrug. Für das
Membranpellet aus dem Rohhomogenat von 24 Raupen wurden standardmäßig 400 ml TEM
mit 0,1% C12E10 verwendet. Nach einer 1-stündigen Zentrifugation (200.000 x g, 4°C, 90 Ti,
Beckman) wurde der Überstand mit den gelösten Proteinen durch eine Membran mit einer
Porengröße von 0,22 µm filtriert und entweder durch Ultrafiltration in einer Rührzelle unter
Druck oder per Zentrifugation in Mikrokonzentratoren ankonzentriert (beide Amicon, 10 kDa
Ausschlußgröße). Das Konzentrat von höchstens 4 Raupen wurde auf je einen
diskontinuierlichen Saccharosegradienten geschichtet (3 ml 40%, 2 ml 30%, 2 ml 20% und
1,6 ml 10% Saccharose gelöst in TEM mit 0,01% C12E10 und 200 mM KCl) und für 90 min
bei 310.000 x g und 4°C zentrifugiert (Vertikalrotor VTi 65.1, Beckman). Mit der 30%
Fraktion wurde nach einer 4-fachen Verdünnung mit LOMC-Puffer (20 mM Tris-HCl, 9,6
17
Methoden
mM 2-Mercaptoethanol, 0,01% C12E10, pH 8,1, mit 50 mM NaCl) eine Anionenaustauscher
Chromatographie mittels FPLC auf einer Mono Q bzw. Resource Q (beide Säulen und FPLC,
Amersham-Pharmacia Biotechnology Inc.) oder mittels HPLC auf einer Hyper D Q Säule
(HPLC Biosys 2000, Beckman; Säule, Biosepra) durchgeführt. Das V1Vo Holoenzym eluierte
in einem linearen Salzgradienten (50 – 400 mM NaCl in LOMC) zwischen 230 und 280 mM
NaCl. Mit Hilfe eines Zentrifugalkonzentrators (Ausschlußgröße 100 kDa) wurde das Eluat
auf 100 µl ankonzentriert. Der letzte Reinigungsschritt erfolgte mittels FPLC über eine
Gelpermeationssäule (Superdex 200 Amersham-Pharmacia Biotechnology Inc.) mit dem
Puffer LOMC, der 150 mM NaCl enthielt.
3.1.3. Reinigung des Vo Komplexes aus angereicherter GCAM oder aus Mitteldarmrohhomogenat
Bei den ersten Versuchen, den Vo Komplex der V-ATPase aus dem Mitteldarm von M. sexta
zu reinigen, wurde zunächst die Gobletzell-Apikalmembran aus Raupen im 5. Larvenstadium,
die für 16-20 h gehungert hatten, genau wie für das V1Vo Holoenzym (3.1.1-2) beschrieben
angereichert, solubilisiert und gereinigt. Der Vo Komplex befand sich in der 20% Saccharose
Fraktion des diskontinuierlichen Gradienten, welche dann auch weiter verarbeitet wurde.
Auch hier wurde, um eine höhere Ausbeute zu erzielen, auf das Rohhomogenat von ganzen
Därmen hungernder Tiere als Startmaterial zurückgegriffen. Als weitere Modifikation des
Protokolls wurde das zweite Pellet der Zentrifugation bei 12.000 x g in ETPKI (5 mM EDTA,
5 mM Tris-HCl, 5 mM Pefabloc SC, 0,8 M KI, pH 8,1) resuspendiert und für 30 min auf Eis
inkubiert. Anschließend wurde die Probe mit TEM auf eine KI Konzentration von 40 mM
verdünnt und bei 200.000 x g für 30 min bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde in TEM
resuspendiert und nochmals zentrifugiert. Das letzte Pellet wurde dann genau wie das V1Vo
Holoenzym (3.1.2.) solubilisiert und gereinigt, nur dass, wie schon erwähnt, hierbei die 20%
Saccharose Fraktion nach der zonalen Zentrifugation für die Anionenaustauscher- und die
Gelpermeationschromatographie weiter verwendet wurde.
3.1.4. Reinigung des V1 Komplexes aus Mitteldarm
Der V1 Komplex aus dem Mitteldarm wurde nach der Methode von Gräf et al. (1996) mit
einigen wichtigen Modifikationen durchgeführt. Die Mitteldärme von bis zu 30 eisgekühlten
18
Methoden
Raupen (Ernährungs-, bzw. Entwicklungsstatus versuchsabhängig) wurden in eiskaltem
MENT-Puffer gesammelt, dreimal mit diesem gewaschen und in 5 ml MENTP mit einem
Ultraturrax bei 20500 rpm für 50 s homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 10.000 x g und
4°C in einem Festwinkelrotor (JA-25.50, Beckman) für 5 min, und der daraus resultierende
Überstand 30 min bei 200.000 x g und 4°C in einem Festwinkelrotor (90 Ti, Beckman)
zentrifugiert. Dieser Überstand wurde nach einer Filtration (0,22 µm) langsam mit einem
gleich großen Volumen kalter gesättigter Ammoniumsulfatlösung gemischt und unter Rühren
für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Das Präzipitat wurde durch eine 5-minütige Zentrifugation
bei 10.000 x g und 4°C in einem Festwinkelrotor (JA-25.50, Beckman) pelletiert, in TENPuffer mit 9,6 mM -Mercaptoethanol resuspendiert, auf einen diskontinuierlichen
Saccharosegradienten (3 ml 40%, 2 ml 30%, 2 ml 20% und 1,6 ml 10% Saccharose in TENPuffer mit 9,6 mM -Mercaptoethanol, ein Gradient pro 4 Raupenausgangsmaterial)
geschichtet und für 90 min bei 310.000 x g-Max und 4°C zentrifugiert. Die gesamte 30%Saccharosefraktion (2 ml) und die untere Hälfte (1 ml) der 20%-Saccharosefraktion wurden
gepoolt, filtriert (0,22 µm) und mittels eines FPLC- oder HPLC-Systems (Pharmacia oder
Beckman) über eine Anionenaustauschersäule (Mono Q, Pharmacia oder Hyper D Q,
Biosepra) weiter aufgereinigt. Der V1-Komplex eluiert in einem linearen Salzgradienten (50 –
400 mM NaCl in LOM) bei ca. 220 mM als einzelner Peak. Dieser wurde durch Ultrafiltration
(100
kDa
Ausschlußgröße)
auf
100
µl
ankonzentriert
und
über
Gelpermeationschromatographie (FPLC, Superdex 200, Pharmacia) endgültig gereinigt.
3.1.5. SDS-PAGE
Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde modifiziert nach Lämmli et al.
(1970) in vertikalen Gelkammern unterschiedlicher Fabrikate durchgeführt (BIORAD,
Hoefer,
Biometra).
Die
Proteinproben
wurden
mit
einer
5-fach
Stammlösung
Probenauftragspuffer auf eine Endkonzentration von 125 mM Tris-HCl pH 6,8, 5%
Saccharose, 2% SDS, 0,005% Bromphenolblau und 2% -Mercaptoethanol gebracht, für 45 s
bzw. 3 min bei 95°C erhitzt und auf Eis abgekühlt. Die Proben wurden entweder direkt auf
ein
Gel
geladen
oder
bei
-20°C
bis
zur
Verwendung
gelagert.
Waren
die
Proteinkonzentrationen sehr niedrig, wurden die Proben mit Trichloressigsäure (10%
Endkonzentration) für 30 min auf Eis gefällt. Zweimal mit eiskaltem Aceton gewaschen und
für je 10 min zentrifugiert (20.000 x g 10, 4°C, Festwinkelrotor). Anschließend wurden die
19
Methoden
Proben in einem angemessenen Volumen einfach konzentriertem Probenauftragspuffer
resuspendiert und wie oben weiter behandelt.
Falls nicht anderweitig beschrieben, bestanden die Sammelgele aus 5,4% T/ 2,3% C Acrylamid in 125 mM Tris-HCl pH 6,8 und 0,2% SDS. Für die Trenngele wurde entweder 17% T/
0,4% C oder 12% T/ 0,4% C in 330 mM Tris-HCl pH 8,7, 01% SDS verwendet. Der
Laufpuffer enthielt 100 mM Tris, 100 mM Glycin, 0,1% SDS und pH 8,8. Die Elektophorese
wurde in der Regel mit einer konstanten Stromstärke von 15 mA/Gel gestartet. Nachdem die
Probe vollständig ins Sammelgel eingelaufen war wurde die Stromstärke auf 30 mA/Gel
erhöht.
Alternativ wurde außerdem die Tricine-SDS-PAGE nach Schägger & Jagow (1987) in einer
Hoefer SE 600 Kammer (Pharmacia) verwendet. Die Gele setzten sich aus einem Trenngel
(16,5% T, 3% C), Spacergel (10% T, 3% C) und einem Sammelgel (4% T, 3% C) zusammen.
Die Proben wurden mit 3-fach Probenauftragspuffer (Endkonzentration: 4% SDS, 12%
Glycerin, 2% -Mercaptoethanol, 0,01% Serva blue G 50 mM Tris-HCl pH 6,8) versetzt und
entweder für 45 s bei 95°C erhitzt oder für 30 min bei 40°C inkubiert. Die Elektrophorese
wurde mit 35 V gestartet, und, nachdem die gesamte Probe ins Gel eingewandert war (ca. 1h),
bei 90 V für 16 h durchgeführt (Anodenpuffer, 200 mM Tris-HCl pH 8,9; Kathodenpuffer,
100 mM Tris, 100 mM Tricine, 0,1% SDS pH 8,25).
Für die mit J-Concanolid A markierten Proben wurden teilweise auch Gradientengele mit 1015% T und 3,3% C verwendet (Ratajczak, 1994).
3.1.6. Proteinbestimmung
Die photometrische Bestimmung der Proteinkonzentration mit Amidoschwarz erfolgte nach
Wieczorek et al. (1990) modifiziert nach Popov et al. (1975). Der Test beruht auf der
Bindung des Farbstoffes Amidoschwarz an basische Aminosäuren und hat den Vorteil, dass
er bei hoher Sensitivität relativ unempfindlich gegen Detergenzien, Reduktionsmittel und
viele bei anderen Proteinnachweisen störende Substanzen ist. Die Proteinproben wurden mit
jeweils 300 µl der Amidoschwarzlösung versetzt und 5 min bei RT inkubiert. Anschließend
wurde bei 14000 rpm (Eppendorf-Tischzentrifuge) 4 min zentrifugiert, der Überstand
abgesaugt, das Pellet zweimal mit 500 µl Essigsäure/Methanol (1:10) gewaschen und für je 3
min zentrifugiert. Dann wurde das Pellet in 350 µl 0,1 N NaOH gelöst, die Extinktion bei 615
20
Methoden
nm gemessen und die Proteinmenge mit einer parallel erstellten Eichreihe aus BSAStandardlösungen (2, 4 und 6 µg BSA) bestimmt.
3.1.7. Western Blot
Um die aufgetrennten Proteine nach einer Gelelektrophorese auf eine PVDF- oder
Nitrocellulosemembran zu übertragen, wurden Western-Blots nach Towbin et al. (1979) im
Semidry-Verfahren (Trans-Blot SD, BIO-RAD) durchgeführt. Das benutzte dreiteilige
Puffersystem nach Khyse-Anderson (1984) wurde durch Zugabe von 20% Methanol zu den
Blotpuffern modifiziert. Der Transfer war in der Regel nach 60 min bei 1 mA/cm2 Gelfläche
quantitativ abgeschlossen, was durch reversibles Färben der Blotmembran mit 0,02% Ponceau
S und Anfärben des Gels mit Coomassie Blau R-250 überprüft wurde.
3.1.8. Reinigung von Antikörpern
Die verwendeten Antikörper aus Blutseren bzw. Hybridomazellkulturüberständen wurden per
Affinitätschromatographie über Protein A- bzw. Protein G-gekoppelten Sepharosesäulen
(Pharmacia und Sigma) gereinigt. Entsprechend dem für die Produktion von Antikörpern
verwendeten Wirtsorganismus wurde das Säulenmaterial mit der jeweils höheren Affinität
ausgewählt. Zunächst wurden die Proben mit TBS (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,6)
5-fach verdünnt, sterilfiltriert (0,22 µm) und auf die Säule aufgetragen. Anschließend wurde
mit TBS gewaschen und die gebundenen Antikörper mit Elutionspuffer (0,1 M Glycin-HCl
pH 2,7) eluiert. Die gesammelten Fraktionen wurden durch vorgelegten Neutralisationspuffer
(1 M Tris-HCl pH 8,0) neutralisiert. Mit Hilfe von Dotblots wurden die Fraktionen, welche
Antikörper enthielten, bestimmt, gepoolt und gefriergetrocknet.
Bei den Antiseren gegen Fusionsproteine mit maltosebindendem Protein (MBP) wurden die
spezifischen Antikörper gegen MBP mittels Affinitätschromatographie im Batch-Verfahren
entfernt. Hierzu wurde 1 mg MBP (New England Biolabs) an 60 mg Cyanbromid-aktivierte
Sepharose 4B (Sigma) gekoppelt, mit 100 mM Glycin-HCl (pH 2,7) gewaschen und mit 2 ml
TBS-Puffer äquilibriert. Dann wurden zu 500 µl Aliquots der Immunseren 125 ml 5x TBSPuffer gegeben, filtriert (0,45 µm) und mit der MBP-Sepharose vermischt. Nach 1,5 h
Inkubation bei Raumtemperatur wurde die MBP-Sepharose bei 2000 x g (5 min, RT)
pelletiert und der Serumüberstand abgenommen. Anschließend wurden die MBP-Antikörper
21
Methoden
mit 100 mM Glycin-HCl (pH 2,7) von der MBP-Sepharose eluiert und mit (1 M Tris-HCl pH
8,0)
neutralisiert.
Die
MBP-Sepharose
wurde
mit
TBS-Puffer
regeneriert
und
wiederverwendet. Die Abreicherung der MBP-Antikörper aus dem Serum wurde mit Dotblots
kontrolliert und mit dem Serumüberstand wiederholt, bis das Eluat der MBP-Sepharose keine
Antikörper gegen MBP mehr enthielt.
3.1.9. Immunfärbung
Um unspezifische Markierungen zu verhindern, wurde die Blotmembran zunächst für bis zu
60 min in Blockpuffer und anschließend mit einer Verdünnung des primären Antikörpers in
Verdünnungspuffer für eine weitere Stunde inkubiert (siehe Tab. 1). Nachdem die Blotmembran durch 3 x 5 min waschen mit TTBSN von überschüssigen primären Antikörpern
befreit war, erfolgte eine einstündige Inkubation mit den entsprechenden sekundären
Antikörpern, die mit alkalischer Phosphatase gekoppelt waren (Verdünnungen siehe Tab.1).
Nicht gebundene Antikörper wurden durch 3-maliges Waschen mit TTBSN (je 5 min)
entfernt, die Membran mit destilliertem Wasser gespült und die spezifisch immunmarkierten
Proteinbanden durch Zugabe des APP-Puffers mit NBT/BCIP sichtbar gemacht.
Tab.1: Übersicht der verwendeten Antikörper.
Die monoklonalen Antikörper in Mäusen und die polyklonalen Antikörper in Kaninchen wurden in unserem
Labor hergestellt. Die polyklonalen Antikörper aus Meerschweinchen wurden durch die Firma Charles River
(Deutschland) hergestellt.
Antikörper
Antigen:
Hergestellt in:
Verdünnung
90-7
E Untereinheit
Maus, monoklonal
1:100
47-5
E und G Untereinheit
Maus, monoklonal
1:100
221-9
A Untereinheit
Maus, monoklonal
1:10-100
224-3
B und e Untereinheit
Maus, monoklonal
1:10-100
488-1,2
C Untereinheit
Meerschweinchen, polyklonal
1:1000
C23
B Untereinheit (AS 243-428)
Meerschweinchen, polyklonal
1:1000
C34
B Untereinheit (AS 475-494)
Meerschweinchen, polyklonal
1:100
M40
d Untereinheit
Meerschweinchen, polyklonal
1:1000
353-1,2,4
V1 Komplex
Meerschweinchen, polyklonal
1:10000
373-3
a Untereinheit aus Rind M115
Kaninchen, polyklonal
1:100
K2
Holoenzym
Kaninchen, polyklonal
1:10000
22
Methoden
3.1.10. Coomassie-Färbung
Die Gele wurden im Anschluß an die Elektrophorese für mindestens 30 min mit CoomassieLösung (0,25% Coomassie Brilliant-Blue R-250 w/v, 50% Methanol und 10% Essigsäure)
fixiert und gefärbt (Bollag & Edelstein, 1991). Zur Entfärbung wurden die Gele entweder für
15 min in 200 ml H2O/Gel in einer Haushaltsmikrowelle (600 W) gekocht oder mit einem
zweiteiligen Puffersystem für 30 min in Entfärber I (25% Isopropanol, 10% Essigsäure) und
danach für 60 min Entfärber II (7,5% Methanol, 10% Essigsäure) entfärbt.
3.1.11. Silber-Färbung
Wenn es nötig war geringe Proteinmengen, besonders membranständiger Untereinheiten auf
den Gelen zu visualisieren, wurde die Methode der Silberfärbung nach Heukeshoven &
Dernick (1988) benutzt. Dafür wurden die Gele zuerst für 30 min fixiert (40% Ethanol, 10%
Essigsäure) und anschließend für 30 min sensitiviert (30% Ethanol, 0,125% Glutaraldehyd
(w/v), 0,2% Thiosulfat (w/v) und 6,8% Natriumacetat (w/v)). Nach 3-maligem Waschen mit
H2O (5 min) wurde für 20 min die eigentliche Silberreaktion durchgeführt (0,25% Silbernitrat
(w/v) und 0,015% Formaldehyd(w/v)). Die Entwicklung, sprich die Reduktion der
Silberionen erfolgte in einer Lösung aus 2,5% Natriumcarbonat (w/v) und 0,0075%
Formaldehyd (w/v). Durch Waschen mit 1,5% Na-EDTA (w/v) wurde die Entwicklung
gestoppt. Um ein Zerspringen der Gele bei der Trocknung zu vermeiden, wurden sie für
mindestens 30 min in 30% Ethanol mit 4% Glycerin inkubiert.
3.1.12. Markierung mit 14C-DCCD
Die Markierung und Identifizierung des Proteolipids, der Untereinheit c der V-ATPase durch
14
C-N´,N´-Dicyclohexylcarbodiimid (14C-DCCD) erfolgte in Anlehnung an Lepier et al.
(1996). Dazu wurde zunächst 6 µg Protein in 500 µl DCCD-Labellingpuffer (50 mm TrisMOPS pH 8,1, 1 mM MgCl2, 1 mM -Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA, 10 µM 14C-DCCD
(0,3 µCi)) für 30 min bei 30°C inkubiert. Die Probe wurde, wie unter (3.1.7.) beschrieben, mit
TCA gefällt und für die SDS-PAGE vorbereitet, wobei sie allerdings nicht auf 95°C erhitzt,
sondern 1 h bei 37°C inkubiert wurde, um ein Aggregieren des Proteolipids zu verhindern.
Nach der Gelelektrophorese, dem Färben mit Coomassie Brilliant-Blue 250-R und dem
23
Methoden
Entfärben wurde das Gel, vor dem Trocknen auf Whatmanpapier für je 30 min in
ENHANCE-Lösung (DuPont) und in kaltem H2O inkubiert. Für die Autoradiographie der mit
14
C-DCCD markierten Banden wurde das getrocknete Gel entweder auf einen Kodak XAR 5
Röntgenfilm ohne Verstärkerscreen oder auf einen Phosphoscreen für mehrere Tage aufgelegt
und anschließend entwickelt bzw. mit einem Phosphoimager ausgewertet.
3.1.13. Markierung mit 125J-Concanamycin A
20-30 µg der Proben wurden in einem Volumen von 30-40 µl mit 0,01-100 µM 9-O-[p(Trifluoroethyldiazirinyl)-benzoyl]-21,23-dideoxy-23-epi-[125I]Iodo-concanolid
A
(J-Con-
canolid A) für 1 h auf Eis oder 3 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend auf Eis
für 3-5 min UV bestrahlt (366 nm, 2 x 6 W). Die Proben für die Schutzversuche wurden
zusätzlich mit 1 µM, 10 µM, 100 µM und 300 µM Concanamycin A bzw. mit 10 µM und 100
µM der anderen Substanzen für 1 h auf Eis vor Zugabe des J-Concanolid A vorinkubiert. Alle
Makrolide wurden in DMSO gelöst, die Konzentration anhand ihres Extinktionskoeffizienten
in Methanol photometrisch bestimmt, aliquotiert, bei -70°C gelagert und nur einmal direkt vor
dem entsprechenden Versuch aufgetaut. Nach der Bestrahlung wurden 7,5 –10 µl 5-fach SDSProbenpuffer hinzugefügt, die Proben für 45 s auf 95°C erhitzt oder für 30 min bei 40°C
inkubiert, auf Eis abgekühlt und auf ein SDS-Gel aufgetragen. Die Gele wurden entweder mit
Coomassie gefärbt und nach dem Entfärben auf Whatmanpapier getrocknet oder mit Zn2+gefärbt und in Folie eingeschweißt. Anschließend wurden sie für bis zu 72 h auf einem
Phosphoscreen exponiert. Die Auswertung erfolgte mit einem Phosphoimager (Molecular
Probes). Nach der Exposition wurden die Zn2+-gefärbten Gele mit Coomassie nachgefärbt und
gegebenenfalls die Untereinheit c für MALDI-MS-Analysen bzw. die Messung der
gebundenen Radioaktivität in einem Gamma-Counter (Philips, PW 4800) ausgeschnitten.
3.1.14. Isoelektrische Fokussierung mit anschließender 2-D Elektrophorese
Für die isoelekrische Fokussierung der Proteinkomplexe wurde das DryStrip-System von
Pharmacia benutzt. Dazu wurden die Drystrips in 240 µl Rehydrierungslösung (8 M
Harnstoff, 2% Chaps, 2% IPG-Puffer, 0,3% DTT und 0,01% Bromphenolblau) über Nacht
rehydriert und dann auf einer Multiphor II in der "Drystripwanne" positioniert. Die Proben
wurden mit Probenauftragspuffer versetzt (9,8 M Harnstoff, 2% -Mercaptoethanol, 2% IPGPuffer, 0,5% Triton X-100) und mittels Probenauftragsbechern kathodisch aufgetragen. Die
Elektrophorese erfolgte zunächst für 4,5 h bei 300 V und dann für 11,5 h bei 2000 V.
24
Methoden
Anschließend wurden die Drystrips entweder sofort weiter verwendet oder bei -70°C gelagert.
Für die zweite Dimension wurden die Drystrips zuerst 10 min in Äquilibrierungslösung I (100
mM Tris-HCl pH 6,8, 6 M Harnstoff, 30% Glycerin, 1% SDS, 1% DTT) und dann 10 min in
Äquilibrierungslösung II (100 mM Tris-HCl pH 6,8, 6 M Harnstoff, 30% Glycerin, 1% SDS,
200 mM Jodacetamid und 0,01% Bromphenolblau) inkubiert und auf ein vertikales SDS-Gel
(Sammelgel ohne Taschen) in einer Biometra-Kammer aufgelegt. Die Elektrophorese erfolgte
wie unter (3.1.7.) beschrieben.
3.1.15. Röntgenkleinwinkelstreuung
Die Röntgenkleinwinkelstreuungsexperimente wurden zusammen mit Dr. Gerhard Grüber
(Osnabrück) und Dr. Michel Koch (EMBL, Hamburg) in der Hamburg Outstation des EMBL
wie in Svergun et al. (1998) für den V1 Komplex beschrieben durchgeführt.
3.1.16. Matrix-unterstützte Laserdesorptions Ionisations Massenspektroskopie (MALDI-MS)
Die massenspektrometrischen Untersuchungen der Untereinheiten der V-ATPase wurden von
Dr. Simone König im Proteomik-Labor der Zentralen Projektgruppe "Integrierte Funktionelle
Genomik" des Interdisziplinären Klinischen Forschungszentrum der Medizinischen Fakultät
der Universität Münster durchgeführt. Nach der SDS-PAGE wurden die mit Coomassie
gefärbten Proteinbanden mit einer modifizierten Methode nach Shevchenko et al. (1996) und
Zhang et al. (1998) für die Massenspektrometrie vorbereitet. Die Banden wurden
ausgeschnitten und mit 25 mM NH4HCO3 in 50% Methanol entfärbt. Das Gelstück wurde
zunächst mit Eisessig/Methanol/Wasser (10/45/45, v/v/v) 30 min und anschließend mit
Wasser 30 min gewaschen. Danach wurde es mit Acetonitril geschrumpft, getrocknet und in
20 µl 50 mM NH4HCO3 mit 400 ng Trypsin oder Chymotrypsin rehydriert. Überschüssige
Proteaselösung wurde entfernt und das Gelstück mit Puffer überschichtet. Der Verdau (37°C,
über Nacht) wurde durch Zugabe von 5-10 ml Eisessig gestoppt und der Überstand in ein
neues Eppendorfreaktionsgefäß transferiert. Das Gelstück wurde zweimal mit 70 µl
Acetonitril extrahiert und die Überstände vereinigt und lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde in
7 µl 0,1% wässriger TFA gelöst, mit ZipTips (Millipore, Bedford, MA, USA) gereinigt und
die Peptide mit 7 µl 70% Acetonitril eluiert. Für die Matrix wurden 10 mg α-cyano-4hydroxycinnamic Säure mit Aceton gewaschen und in 1 ml Acetonitril/Ethanol (50/50, v/v)
mit 1% 0,1% wässriger TFA aufgenommen. Davon wurden 0,7 µl und 0,7 µl Probe auf den
Probenträger aufgebracht und sofort gemischt. Für die MALDI wurde ein TofSpec-2E Gerät
25
Methoden
(Micromass Ltd., Manchester, UK) benutzt. Die Proben wurden im positive ion reflectron
mode mit einer Matrix-Unterdrückung von 500 gemessen. Die Massen-Kalibrierung erfolgte
extern und wurde entweder mit der lock mass Option oder den Trypsin Autolyse Peaks intern
korrigiert.
3.1.17. N-terminale Sequenzierung
Für die N-terminalen Sequenzierungen wurde das V1Vo Holoenzym, der V1 Komplex oder der
Vo Komplex wie beschrieben gereinigt, mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf PVDFMembran geblottet. Anschließend wurden die Proteine mit Amidoschwarz- oder CoomassieFärbung sichtbar gemacht und die entsprechenden Banden ausgeschnitten. Die Sequenzierung
der Proben erfolgte durch Dr. Roland Schmid (Universität Osnabrück) bzw. durch Dr.
Barbara Schedding (Universität Münster) entweder in einem Applied Biosystems Sequencer
Modell 473A oder Modell 492-01.
3.1.18. ATPase-Aktivitätstest und Phosphatbestimmung
Um die spezifische ATPase-Aktivität der verschieden Proben zu ermitteln, wurde das bei der
Hydrolyse von ATP entstehende anorganische Phosphat photometrisch bestimmt (Wieczorek
et al., 1990). Der Vorteil dieser verwendeten Methode gegenüber anderen Pi-Bestimmungen
liegt in ihrer hohen Sensitivität (Extinktion 0,3 ≙ 4 ng Pi) und in ihrer Linearität bis zu einer
Extinktion von über 2. Der Standardansatz mit einem Endvolumen von 160 µl enthielt 50 mM
Tris-MOPS (pH 8,1), 20 mM KCl, 1 mM Tris-ATP, 3 mM -Mercaptoethanol und 1 mM
MgCl2 bzw. 3 mM CaCl2. Nach einer 5-10 minütigen Vorinkubation ohne Substrat im
Wasserbad bei 30°C wurde die Enzymreaktion durch Zugabe von ATP gestartet, nach Ablauf
der gewählten Reaktionszeit durch Tiefgefrieren in flüssigem Stickstoff gestoppt und die
Probe danach bei -20°C gelagert.
Die Quantifizierung des freigesetzten anorganischen Phosphats erfolgte photometrisch als
Malachitgrün-Phosphomolybdat-Komplex. Zu den 160 µl der tiefgefrorenen Probe des
Aktivitätstests wurden 50 µl 20% Trichloressigsäure pipettiert und das Ganze im Wasserbad
bei 70°C aufgetaut. Das ausgefallene Protein wurde durch Zentrifugation pelletiert (1 min,
13200 rpm, Eppendorf-Tischzentrifuge 5415D). Exakt 3,5 min nach der TCA-Zugabe wurden
60 µl des Überstandes mit 100 µl saurem Molybdat (2,4% H2SO4, 60 mM Na-Molybdat)
vermischt. Nach weiteren 15 s wurden 30 µl Malachitgrünlösung (7,4% in gesättigtem,
filtriertem Polyvinylalkohol) zupipettiert. Nach insgesamt 5 min 45 s wurde nicht
26
Methoden
komplexiertes Malachitgrün mit 200 µl 7,8% H2SO4 zerstört. Die Extinktion der
resultierenden Lösung bei 625 nm wurde nach 70-100 min photometrisch bestimmt
(SpektraMax Plus, Molecular Devices) und der Phosphatgehalt an Hand von mitgeführten
Phosphatstandardwerten (0, 10 und 25 nmol) errechnet.
3.1.19. Bestimmung und Entfernung endogener Nukleotide
Der Nachweis und die Quantifizierung der im Enzym fest gebundenen Nukleotide erfolgte
mit der leicht modifizierten Luciferin/Luciferase-Methode nach Senior et al. (1992). Die
Proben wurden in einem Volumen von 100-200 µl (Proteinkonzentration zwischen 0,5 und 2
µg/µl; Puffer für den V1 Komplex 150 mM NaCl, 9,6 mM -Mercaptoethanol, 20 mM TrisHCl pH 8,1 und für das V1Vo Holoenzym zusätzlich 0,01% C12E10) für 5 min bei 100°C
denaturiert, auf Eis abgekühlt und das denaturierte Protein 5 min bei 4°C abzentrifugiert
(20.000 x g, Beckman-Tischzentrifuge). Der Überstand wurde abgenommen, bei -20°C
eingefroren und dort bis zur Bestimmung des Nukleotidgehalts gelagert.
Um das freigesetzte ATP zu messen, wurden zu 10 oder 20 µl des Überstandes zu 500 µl
Luciferin/Luciferase-Puffer (60 mM Tris-Acetat pH 7,75, 10 mM MgCl2, 1 mM KCl, 1,5 mM
EDTA, 2,5 mM -Mercaptoethanol und 0,4 mg/ml Luciferin/Luciferase (Sigma)) gegeben.
Nach 30 s Vorinkubation wurde in einem Luminometer (Lumat LB 9507, EG &G Berthold)
die Lichtemission für 60 s gemessen. Zur Quantifizierung des ATP-Gehaltes wurde jeweils
parallel zu den Proben eine Eichreihe (0,1 pmol-1 nmol ATP) und eine nur Puffer enthaltende
Kontrolle mitgeführt. Die Eichung ergab jeweils eine lineare Beziehung zwischen der Menge
an eingesetztem Nukleotid und der gemessenen Lichtemission.
Zur Bestimmung des freigesetzten ADPs wurden zu 10 oder 20 µl des Überstandes 90 µl
Luciferin/Luciferase-Puffer (ohne Luciferin/Luciferase) und 10 µl Pyruvatkinase-Lösung (70
mM Tris-Acetat pH 7,75, 9 mM MgCl2, 5 mM KCl, 2 mM Phosphoenolpyruvat, 2 mM
EDTA und 500 U/ml Pyruvatkinase) gegeben und das Ganze für 40 min bei 30°C inkubiert.
Anschließend wurde die Probe mit 400 µl Luciferin/Luciferase-Puffer vermischt und die
Lichtemission nach Ablauf von 30 s für 1 min gemessen. Auch hier wurde jeweils parallel
eine ADP-Eichreihe (0,1 pmol-1 nmol ADP), welche ebenfalls eine gerade Eichkurve ergab,
und eine Pufferkontrolle mitgeführt.
Zur Entfernung von Nukleotiden aus dem V1 Komplex wurde im Anschluß an die
Standardreinigung (3.1.4.) eine zusätzliche Gelpermeationschromatographie auf einer
Superdex 200 Säule (Pharmacia) durchgeführt, wobei dem Laufpuffer (150 mM NaCl, 20 mm
27
Methoden
Tris-HCl pH 8,1, 9,6 mM -Mercaptoethanol) entweder a) nichts (Kontrolle), b) 25%
Methanol, c) 5 mM EDTA oder d) 0,01% C12E10 zugesetzt wurden.
Außerdem wurde noch ein nach Senior et al., (1992) adaptiertes Verfahren mit einer
Sephadex G-50 Säule (1,6 cm x 100 cm, Flußrate 0,03 ml/min, RT) und einem Säulenpuffer
aus 100 mM Tris-SO4 pH=8,0, 4 mM EDTA, 50% Glycerin verwendet. Zur Kontrolle wurde
ein entsprechendes Aliquot parallel bei RT inkubiert.
Letztlich wurde auch versucht, Nukleotide durch Behandlung des V1 Komplexes mit
alkalischer Phophatase (APP) zu entfernen (Digel et al., 1996). Hierzu wurden 460 µg V1
Komplex in 110 µl Puffer (150 mM NaCl, 20 mm Tris-HCl pH 8,1, 9,6 mM Mercaptoethanol) mit 57 U APP (Stratagene, Nr. 6000015) für 18 h bei 25°C in einem
Eppendorfschüttler (300 rpm) inkubiert. Zur Kontrolle wurde parallel je ein Aliquot mit V1
Komplex ohne APP und ein Aliquot ohne V1 Komplex mit APP inkubiert. Anschließend
wurde die APP mittels FPLC auf einer Superdex 200 Säule (Pharmacia) quantitativ vom V1
Komplex abgetrennt, was mit Hilfe der NBT/BCIP-Reaktion in einem Titerplattentest der
Fraktionen überprüft wurde.
3.1.20. Behandlung des V1 Komplexes mit chaotropen Ionen (KI-Stripping)
Der V1 Komplex wurde in 0,8 M KI, 150 mm NaCl, 20 mm Tris-HCl und 9,6 mM 2Mercaptoethanol bei pH 8,1 für 45 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde mit der Probe
eine Gelpermeationschromatographie auf einer Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia) mittels
FPLC bei einer Flußrate von 0,5 ml/min im gleichen Puffer ohne KI durchgeführt.
3.1.21. Messung des ATP-getriebenen Protonentransports
Der ATP-getriebene Protonentransport wurde an GCAM-Vesikeln nach Wieczorek et al.
(1991) gemessen. Dazu wurden die Membranpellets in THTCl resuspendiert und ein
Standardansatz von 790 µl (pH=8,1) vorbereitet, der sich folgendermaßen zusammensetzte:
20 µl 40 mM Tris-ATP in 200 mM Tris, 10 µl 75 µM Acridinorange, 10 µl THTCl-Vesikel, 8
µl 50 mM NaN3 in THTCl, 8 µl 10 mM Na3VO4 in THTCl und 734 µl THTCl; wenn mehr
als 10 µl THTCl-Vesikel verwendet wurden, verringerte sich das THTCl-Volumen
entsprechend. Die Reaktion wurde mit 10 µl 80 mM MgCl2 gestartet, so dass sich bei einem
Endvolumen von 800 µl die Konzentrationen von 1 mM ATP, 0,9 µM Acridinorange, 0,5
mM NaN3, 0,1 mM Na3VO4 und 1 mM MgCl2 in THTCl ergaben. Die Ansäuerung des
Vesikelinneren durch die V-ATPase wurde fluorometrisch gemessen (Fluorometer: LS 50 B,
28
Methoden
Perkin Elmer) und aufgezeichnet. Die Rückstellung der Fluoreszenz erfolgte durch Zerstörung
des Protonengradienten mit 10 µl 1,6 M KCl bzw. 10 µl 1,6 M NH4Cl (Endkonzentration
jeweils 20 mM).
3.1.22. Rekonstitution des V1Vo Holoenzyms in Liposomen
Für die Messungen von kapazitiven Strömen am blacklipid Bilayer wurde das V1Vo
Holoenzym nach der Methode von Fendler et al. (1996) in Liposomen rekonstituiert. Dazu
wurden zunächst 2,5 mg in Chloroform gelöste Phospholipide im Rotationsverdampfer unter
Stickstoffbegasung für ca. 90 min getrocknet und anschließend in 250 µl LOM mit 1% C 12E10
resuspendiert. Nach 1 h Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Suspension bis zur
Opaleszenz im Eisbad beschallt. Für die Rekonstitution des V1Vo Holoenzyms wurde ein
Protein-Lipid-Verhältnis von 1:20 (w/w) gewählt und 250 µl der vorgeformten Liposomen
mit 0,25 mg Protein (in 275 µl 1% C12E10, 9,6 mM -Mercaptoethanol, 150 mM NaCl und 20
mM Tris-HCl pH 8,1) gemischt und für 15 min auf Eis inkubiert. Das Detergenz wurde durch
Zugabe von Biobeads (Biorad) entfernt, zunächst wurde ca. 1/3 Volumen Beads zugegeben
und die Suspension unter sanftem Schütteln über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Beads wurden
mittels Filtration durch Glaswolle entfernt und durch ca. 1/4 Volumen frische Beads ersetzt,
welche nach 45 min sanftem Schütteln bei Raumtemperatur ebenfalls abfiltriert wurden. Nach
5 min Zentrifugation bei 13000 x g, um evtl. unlösliche Bestandteile zu entfernen, wurden die
Proteoliposomen direkt für die Messungen eingesetzt.
3.1.23. Messung kapazitiver Ströme am blacklipid Bilayer
Die Messungen an sogenannten "schwarzen" Lipid-Doppelschichten (Blacklipid Bilayer)
erfolgten bei Dr. Klaus Fendler (MPI für Biophysik, Frankfurt). Dazu wurden 0,01-0,02 cm2
große optisch schwarze Lipid-Doppelschichten in einer temperierten Teflonzelle (24°C)
hergestellt (Fendler et al., 1985; Borlinghaus et al., 1987). Die Lipid-Doppelschicht wurde
aus einer Lösung mit 1,5% (w/v) Diphytanoylphosphatidylcholin und 0,025% (w/v)
Octadecylamin gelöst in n-Decan gebildet. Die beiden Kammern der Zelle waren mit je 1,3
ml Puffer (20 mM Tris-HCl pH 7,0, 3 mM DTT, 150 mM NaCl) gefüllt und über
Polyacrylamid Salzbrücken und Ag/AgCl Elektroden mit einem externen Meßkreis
verbunden, wobei das Meßsignal verstärkt, gefiltert (Cutoff, 500 Hz) und mit einem digitalen
Oszilloscop aufgezeichnet wurde. Für eine Meßreihe wurden zwischen 10 und 50 µl
Proteoliposomen in eine der Kammern pipettiert und für 30 min gerührt. Die Konzentrationen
29
Methoden
von caged ATP (P3-[1-(2-nitrophenyl)ethyl]adenosin 5´-triphosphat, Fendler et al. 1985)),
MgCl2, CaCl2 und Concanamycin A konnte durch Zugabe aus diversen Stammlösungen
variiert werden.
Die Photolyse des caged ATP wurde durch einen 10 ns langen Laserpuls (308 nm, 12 mm dm
Blende, Energie zwischen 10,7 und 11,7 mJ) der auf die Lipid-Doppelschicht fokusiert war
bewirkt. Dabei wurden zwischen 15% und 30% des caged ATP im Laserfokus freigesetzt.
Zwischen den einzelnen Laserblitzen wurde für 10 min gerührt um das freigesetzte ATP zu
verdünnen bzw. die Hydrolyse durch die V-ATPase der nicht an die Lipid-Doppelschicht
adsorbierten Proteoliposomen zu ermöglichen.
3.1.24. Auftrennung von Subkomplexen des V1Vo Holoenzyms
Das V1Vo Holoenzym wurde in 70 µl Aliquots (100 µg Protein, 150 mM NaCl, 9,6 mM Mercaptoethanol, 20 mM Tris-HCl pH 8,1) für 10 min bei 30°C im Wasserbad vorinkubiert
und dann mit 10 µl des Test-Nukleotids versetzt und entsprechend der gewählten Zeit bis zu 1
h weiter inkubiert. Im Anschluß an diese Behandlung wurde der V1 und Vo Komplex durch
Zentrifugation in einem Saccharosestufengradienten getrennt. Hierfür wurden 920 µl Puffer
(5% Saccharose in TEK, 0,01% C12E10, 9,6 mM -Mercaptoethanol, RT) zur fertig
inkubierten Probe gemischt und auf den Dichtegradienten geschichtet (2 ml 40%, 1 ml 35%, 1
ml 30%, 1 ml 25%, 1 ml 20%,1 ml 15%,1 ml 10% Saccharose in TEK, 0,01% C12E10, 9,6 mM
-Mercaptoethanol). Die Zentrifugation erfolgte für 90 min bei 310.000 x g und 25°C in
einem Vertikalrotor (VTi 65.1, Beckman). Die Gradienten wurden anschließend mit einer
Peristaltikpumpe und Glaskapillare beginnend mit der 40% Saccharosestufe von unten in 500
µl große Aliquots fraktioniert (Benennung der Fraktionen: 40/1, 40/2, 40/3, 40/4, 35/1, 35/2,
30/1, 30/2, 25/1 usw.).
3.2. Molekularbiologische Methoden
3.2.1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Für die Polymerase-Kettenreaktionen wurde ein GeneATAQ-Controller (Amersham
Pharmacia Biotech) verwendet. Ein Standardansatz (25 µl) enthielt 50 mM KCl, 10 mM TrisHCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 0,01% Gelatine, je 200µM dATP, dGTP, dCTP und dTTP, je
0,75 µM der beiden Primer, bis zu 250 ng Template-DNA und 0,625 U Taq Polymerase. Als
Verdunstungsschutz wurden die Ansätze mit 2 Tropfen Mineralöl überschichtet. Die Reaktion
30
Methoden
wurde wie folgt durchgeführt: 1 x 2 min 93°C, 35 x ( 30 s 93°C, 40 s Annealing-Temperatur,
60 s/1 kb 73°C), wobei die Annealing-Temperatur nach der Formel 4°C x (G + C) + 2° C x
(A + T) - 3°C (Lion & Haas, 1990) berechnet und die niedrigere Temperatur des Primerpaars
verwendet wurde.
3.2.2. Phenolextraktion und Ethanolfällung
Die Aufreinigung von DNA aus den PCR-Ansätzen erfolgte mittels einer Phenolextraktion.
Hierzu wurde zu der jeweiligen DNA-Lösung ein Volumenanteil Phenol:Chloroform:
Isoamylalkohol (25:24:1) gegeben, durch Vortexen gemischt und 1 min zentrifugiert (13.000
x g). Aus dem wässrigen Überstand wurde das restliche Phenol mit 1 Volumen
Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) und erneutem Zentrifugieren entfernt. Anschließend wurde
die wässrige Phase mit 1/10 Volumenteil 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumenteilen -20°C
kaltem Ethanol versetzt und für 30 min bei 14000 x g und 4°C zentrifugiert. Nachdem das
Pellet noch einmal mit 70% -20°C kaltem Ethanol gewaschen und für 5 min bei 14000 x g
zentrifugiert worden war, wurde es in einer Speedvac getrocknet und bei -20°C gelagert.
3.2.3. Plasmid DNA Präparation
Für die Plasmidpräparationen wurde entweder die "klassische" Methode der alkalischen Lyse
nach Sambrook et al. (1989) oder ein QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen benutzt.
Erstere wurde vor allem für die Sequenzierungsreaktionen benutzt, da sie in der Regel wegen
höherer Reinheit bessere Ergebnisse liefert.
3.2.4. Spaltung von DNA durch Restriktionsenzyme
Die enzymatische Spaltung der DNA wurde normalerweise in einem Volumen von 20 µl und
mit bis zu 3 µg DNA und 3-5 U Restriktionsenzym durchgeführt. Sowohl die
Pufferzusammensetzung als auch die Inkubationstemperatur richtete sich nach den Angaben
der Hersteller der einzelnen Restriktionsenzyme. Nach einer Inkubation von 2 h wurde der
Verdau durch Einfrieren gestoppt und das Ergebnis durch die Elektrophorese in einem 1%
Agarosegel überprüft.
31
Methoden
3.2.5. Agarosegelelektrophorese von DNA
Für die gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten wurden FlachbettMinigelkammern, 1%ige Agarosegele und das TAE-Puffersystem (40 mm Tris-Acetat pH
8,3, 1 mM Na-EDTA) verwendet. Die Elektrophorese wurde bei 7-10 V/cm durchgeführt. Zur
Visualisierung der Fragmente wurden die Gele nach dem Lauf für bis zu 60 min mit
Ethidiumbromid (1µg/ml in TAE) inkubiert und anschließend nicht gebundenes
Ethidiumbromid durch Waschen der Gele in H2O (30 min) entfernt. Mit einem Eagle-EyeVideosystem (Stratagene) wurden die Ergebnisse dokumentiert. Die gewünschten DNAFragmente wurden mit Hilfe des JetSorb-Systems (Genomed) aus dem Gel isoliert.
3.2.6. Ligation und Transformation
Die Ligation von DNA erfolgte über mindestens 24 h bei 16°C und wurde durch 10 min
Erhitzen auf 68°C gestoppt. Die 25 µl großen Ligationsansätze enthielten 100 ng Vektor, die
10-fache molare Menge an Insert, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 7 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5
mM ATP und 2 Weiss-Units T4-DNA-Ligase (New England Biolabs).
Für die Transformation wurde ein 200 µl Aliquot tiefgefrorener kompetenter Zellen in einem
Eppendorfgefäß in der Hand aufgetaut und für 10 min auf Eis temperiert. Anschließend
wurden Sie mit 25 µl des Ligationsansatzes vermischt und für weitere 30 min auf Eis
inkubiert. Nach einem 90 s "Hitzeschock" von 42°C, gefolgt von 2 min Abkühlen auf Eis
wurden 800 µl Medium zugegeben und für 1 h bei 37°C unter sanftem Schütteln inkubiert.
Um positiv transformierte Zellen mittels der Blau-Weiß-Selektion erkennen zu können,
wurden die transformierten Zellen auf LBamp XGal/IPTG Platten ausplattiert.
3.2.7. Herstellung kompetenter Zellen
Zur Herstellung von kompetenten Zellen wurde ein Protokoll der Firma New England Biolabs
angewandt, bei dem die Tranformationseffizienz durch Verwendung von RbCl neben CaCl 2
erhöht wird. Zunächst wurde der Empfängerstamm auf a-Platten ausplattiert und über Nacht
bei 37°C angezüchtet. Davon wurde eine einzelne Kolonie zum Animpfen von 5 ml bMedium verwendet und bis zu einer OD550 von 0,3 bei 37°C geschüttelt. Mit dieser Vorkultur
wurden wiederum 100 ml auf 37°C vorgewärmtes b-Medium angeimpft und für ca. 2 h bei
37°C unter Schütteln bis zu einer OD550 von 0,5 kultiviert. Nachdem die Zellsuspension für 5
32
Methoden
min auf Eis abgekühlt war, wurden die Zellen durch Zentrifugation (5 min, 5000 x g, 4°C)
geerntet, in 40 ml eiskaltem Tfb-1 resuspendiert und für 5 min auf Eis inkubiert.
Anschließend wurde nochmals zentrifugiert (5 min, 5000 x g, 4°C) und diesmal in 4 ml
eiskaltem Tfb-2 resuspendiert. Nach 15 min auf Eis wurden die jetzt kompetenten Zellen in
200 µl großen Aliquots in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bei -80°C gelagert.
3.2.8. Sequenzierung von DNA
Bei der Sequenzierung von DNA wurde nach der Dideoxynukleotid-Kettenabruchmethode
von Sanger et al. (1977) vorgegangen, wobei der Sequenase 2.0-Kit mit modifizierter T7DNA-Polymerase (Tabor & Richardson, 1987) und 35S-dATP verwendet wurde. Als Primer
dienten die Standardprimer T3 und T7, sowie insertspezifische in Auftragssynthese
hergestellte Primer. Die Auftrennung der Abruchprodukte erfolgte durch eine Elektrophorese
in einem denaturierenden Polyacrylamidgel (Sambrock et al., 1989) mit einem BRL
Sequencing System S2. Anschließend wurden die Gele fixiert und auf Whatmann 3MM
Filterpapier getrocknet. Nach einer 24 h Exposition auf einen Kodak XAR 5 Röntgenfilm
konnte das Ergebnis der Autoradiographie ausgewertet werden.
3.2.9. Klonierung, Expression und Reinigung von rekombinanten Teilen der B Untereinheit
im pMal-c2-System
Als Antigene zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen 2 Abschnitte der
Untereinheit B, (Aminosäure 243-428 und Aminosäure 475-494) wurden überexprimierte
Fusionsproteine verwendet (Novak et al., 1992). Dazu wurden die entsprechenden
Teilsequenzen mittels PCR auf einem cDNA Klon der B-Untereinheit von M. sexta in einem
Sputnik-Expressionsvektor (Stratagene, Klon von Dr. Ralph Gräph zur Verfügung gestellt) als
Template amplifiziert und in den Expressionsvektor pMal c2 (New England Biolabs) kloniert.
Als Primerpaar für den bei V-ATPasen stark konservierten Mittelteil der B-Untereinheit (C2;
Aminosäuren 243-428) dienten 56KVORW2 (CTC TTC TTG AAC TTG GCC AA) als
Vorwärts-Primer und 56KREV2 (TAC TCA GAA TTC TTA GAG CGC CTC CTC ACC
CAC TA) als Rückwärts-Primer. Für den C-Terminus (C3; AS 475-494) wurde 56KVOR3
(ATG TTG AAG CGT ATC CCG GC) als Vorwärts-Primer und 56KREV3 (TAC TCA GAA
TTC TTA GTG ACG GGA GTC TCT GGG GT) als Rückwärts-Primer eingesetzt. Die
beiden Vorwärts-Primer generierten Blunt-Enden, wohingegen die beiden Rückwärts-Primer
eine Schnittstelle für EcoRI (unterstrichene Basen) einfügten. Die PCR-Produkte wurden wie
33
Methoden
beschrieben (3.2.1-5) über ein Agarosegel gereinigt, eluiert und nach 2 h Inkubation mit
EcoR1 bei 37° C eingefroren. Parallel dazu wurde das Plasmid pMAL-c2 gereinigt und
ebenfalls für 2 h mit EcoR1 und XMN1 inkubiert und anschließend eingefroren. Die Ligation
erfolgte über 72 h bei 16 ° C (3.2.6.). Anschließend wurden die Plasmide in kompetente E.
coli XL1 Blue-Zellen transformiert (3.2.6-7) und auf LBamp-Platten ausgestrichen. Je 5
positive Kolonien aus der Blau-Weiß-Selektion wurden abgenommen (C2 1-5 und C3 1-5)
und als Glycerindauerkulturen bei -70°C gelagert. Der korrekte Einbau des Inserts in das
Plasmid der Klone wurde später mittels DNA-Sequenzierung überprüft (3.2.8.).
Für die Expression der beiden Teilstücke C2 und C3 wurden jeweils zweimal 0,5 l TB-Amp
Medium mit je 5 ml einer Übernachtkultur der Klone C23 und C34 angeimpft. Nachdem die
Bakterien bis zu einer OD600 von 0,5 herangewachsen waren wurden sie mit 0,3 M IPTG
induziert, um das entsprechende rekombinante Protein herzustellen. 2 h später wurden die
Zellen durch eine Zentrifugation (20 min, 4000 x g, 4°C) pelletiert, in 50 ml Säulenpuffer
(200 mM NaCl, 1 mM Na-EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4) resuspendiert und bei -20°C
eingefroren. Am nächsten Tag wurden die Zellen in kaltem Wasser langsam aufgetaut und in
5 ml großen Aliquots auf Eis für 2 min ultrabeschallt (Branson Sonifier, Mikrotip, Stufe 6,
50% Impulsdauer), um die Zellen zu lysieren. Anschließend wurde die Suspension für 30 min
bei 9000 x g und 4°C zentrifugiert und der Überstand mit Säulenpuffer auf eine Proteinmenge
von ca. 3 mg/ml eingestellt.
Die Reinigung des Fusionsproteins aus dem Überstand erfolgte über Affinitätschromatographie, wobei das maltosebindende Protein an die kovalent mit der Agarosematrix
der Säule (Volumen ca. 10 ml) verbundene Amylose bindet. Der gefilterte Überstand
(Spritzenvorsatzfilter, 0,45 µm) wurde auf die Säule aufgetragen und diese danach mit dem 8fachen Säulenvolumen an Säulenpuffer durchgespült. Das gebundene Protein wurde mit 10
mM Maltose im Säulenpuffer eluiert, gesammelt und auf einem SDS-Gel mit reinem
maltosebindendem Protein verglichen. Die Proben wurden ankonzentriert und zur
Immunisierung von Meerschweinchen zu Charles River, Deutschland geschickt (8,5 mg C23
bzw. 1 mg C34).
34
Methoden
3.2.10. Herstellung der rekombinanten Untereinheit C im pET System
Die rekombinante C Untereinheit, wurde für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern
und für Reassoziationsversuche mit dem pET Expressionssystem (Novagen) hergestellt.
Hierzu wurde der komplette kodierende Abschnitt der cDNA mittels PCR amplifiziert, in den
Vektor pET-16b eingefügt und in E. coli BL21 Zellen transformiert (Merzendorfer et al.,
2000). Die Zellen wurden mit 0,4 mM IPTG induziert und das rekombinante Protein mit Hilfe
eine N-terminal angefügten His-Tags über NTA-Säulen gereinigt. Dies erfolgte nach dem
vom Hersteller (Novagen) vorgegeben Protokoll, wobei der Elution des rekombinanten
Proteins mit 300 mM Imidazol, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,9) ein Waschschritt mit
100 mM Imidazol, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,9) vorraus ging. Um eine
Aggregation des eluierten Proteins durch von der Säule abgelöstes Ni2+ zu unterbinden, wurde
beim Fraktionieren eine 200 mM Na-EDTA-Lösung vorgelegt (Endkonzentration 10 mM in
den Fraktionen). Das so gewonnene Protein war frei von Verunreinigungen und konnte direkt
für die Immunisierung bzw. die Reassoziationsversuche eingesetzt werden.
35
Ergebnisse
4. Ergebnisse
4.1. Die V-ATPase aus M. Sexta
4.1.1. Optimierung der V1Vo Holoenzym Präparation
Ein Manko aller bisher beschriebenen Reinigungsprozeduren für V-ATPasen ist die im
Verhältnis zu F- und P-Typ-ATPasen relativ geringe Ausbeute pro Präparationsansatz, die
aufwendigere biochemische und strukturelle Untersuchungen verhindert. Dies gilt auch für
die Reinigung der V-ATPase aus dem Mitteldarm von M. sexta, bei der zudem bisher nur der
posteriore Abschnitt des Mitteldarms benutzt wurde, der nur etwa ein Drittel der gesamten
Länge ausmacht (Abb. 5).
Abb. 5: Unterschiede in der Morphologie des anterioren, medianen und posterioren Mitteldarmepithels
von Manduca sexta. (A) longitudinal geöffneter Mitteldarm. Faltungsmuster des (B) anterioren Teils, (C)
medianen Teils, und (D) posterioren Teils. (E) Querschnitt durch das anteriore und mediane Mitteldarmepithel.
(F) Querschnitt durch das posteriore Mitteldarmepithel. (G) Schnitt durch die Apikalmembran einer Gobletzelle
des anterioren und medianen Mitteldarmepithels. (H) Schnitt durch die Apikalmembran einer Gobletzelle des
posterioren Mitteldarms. CC, Columnarzelle; GC, Kavität der Gobletzelle; NC, Kern der Columnarzelle; NG,
Kern der Gobletzelle; M, Mitochondrium. Die Abbildung wurde übernommen aus Cioffi & Harvey (1981).
36
Ergebnisse
Allerdings befinden sich auch in seinem anterioren und medianen Abschnitt Goblet-Zellen,
deren Apikalmembranen mit sogenannten Portasomen (V-ATPase) besetzt sind (Cioffi &
Harvey, 1981) und in denen die V-ATPase auch durch immuncytochemische Untersuchungen
nachgewiesen wurde (Russell et al., 1992). Weiterhin hatten Cioffi & Harvey (1981) gezeigt,
dass es zwischen den drei Darmabschnitten keinen Unterschied im aktiven K+-Transport gibt.
Um die Präparationsausbeute an V-ATPase zu erhöhen, wurde deshalb versucht, diese auch
aus der Gobletzellapikalmembran des anterioren Mitteldarms zu reinigen. Bei der
angereicherten GCAM (Bande 2, 3.1.1.) und bei der aus ihr solubilisierten und gereinigten VATPase (3.1.2.) aus dem anterioren Mitteldarm zeigte sich, dass sie in vergleichbarer Menge
gewonnen werden konnte und dass die Reinheit und Aktivität der gereinigten V-ATPase mit
der aus dem posterioren Abschnitt vergleichbar war (Tab. 2, Abb. 6).
Tab. 2: Ausbeute und Aktivität der V-ATPase aus Präparationen des anterioren und posterioren
Mitteldarms. Angegeben ist die Ausbeute in µg Protein pro eingesetzter Raupe und die spezifische Aktivität in
U/mg aus einem typischen Versuch.
Mitteldarmabschnitt
Ausbeute an angereicherter GCAM (Bande 2)
Ausbeute an gereinigter V-ATPase aus Bande 2
ATPase-Aktivität der gereinigten V-ATPase
ATPase-Aktivität der gereinigten V-ATPase mit 0,5 mM
NaN3
ATPase-Aktivität der gereinigten V-ATPase mit 0,5 mM
NaN3 und 0,1 mM Na3VO4
96 kD
67 kD
Posterior
60 µg/Raupe
10 µg/Raupe
1,8 U/mg
1,9 U/mg
Anterior
120 µg/Raupe
14 µg/Raupe
1,9 U/mg
1,8 U/mg
1,7 U/mg
1,9 U/mg
A
B
43 kD
C
30 kD
D
E
20 kD
c
G
F
14 kD
1
2
3
Abb. 6: Gereinigte V-ATPase aus angereicherter GCAM. Coomassie gefärbtes SDS-Gel, Bahn 1, 5 µg
Standardprotein, Bahn 2, 10 µg V-ATPase aus anteriorem Mitteldarm, Bahn 3, 10 µg V-ATPase aus posteriorem
Mitteldarm.
37
Ergebnisse
Ein viel wichtigerer Befund war allerdings, dass das verwendete Detergenz C12E10 die VATPase sehr selektiv solubilisiert, so dass keine Verunreinigungen mit anderen ATPasen vom
F-Typ (Hemmung durch Azid) oder P-Typ (Hemmung durch Vanadat) vorhanden waren,
welche sich in der gereinigten GCAM aus anteriorem Mitteldarm noch mit bis zu 50%
Fremd-ATPase-Aktivität bemerkbar machten (Tab. 3).
Tab. 3: Ausbeute und ATPase-Aktivität der reinen GCAM aus anteriorem und posteriorem Mitteldarm.
Die Ausbeute ist in µg Protein pro verwendeter Raupe, die ATPase-Aktivität in U pro mg Protein und in Prozent
der gesamten ATPase-Aktivität angegeben (n=3,  S. D.).
Ausbeute
ATPase-Aktivität
ATPase-Aktivität mit 0,5 mM NaN3
ATPase-Aktivität mit 0,5 mM NaN3
und 0,1 mM Na3VO4
Posteriorer Mitteldarm
6 µg/Raupe
0,65  0,24 U/mg 100%
0,52  0,29 U/mg 80%
0,48  0,11 U/mg 74%
Anteriorer Mitteldarm
12 µg/Raupe
0,72  0,28 U/mg 100%
0,41  0,13 U/mg 56%
0,3  0,11 U/mg 50%
Diese Selektivität war eine wichtige Voraussetzung für die Entwicklung eines neuen
Reinigungsprotokolls für das V1Vo Holoenzym und den Vo Komplex aus dem
Mitteldarmrohhomogenat (3.1.2., 3.1.3.), das zu stark erhöhten Ausbeuten führte. Bei diesem
neuen Reinigungsprotokoll konnte zum einen auf die Anreicherung der GCAM, welche die
zeitaufwendige Entfernung der Längsmuskulaturstreifen vom Darmepithel beinhaltet,
verzichtet werden (3.1.1.). Zum anderem wurde nicht nur der posteriore Mitteldarmabschnitt,
sondern der ganze Mitteldarm als Ausgangsmaterial verwendet. Der komplette Darm wurde
homogenisiert und das daraus gewonnene Membranpellet mit C12E10 solubilisiert. Um
Verunreinigungen durch unspezifische elektrostatische Wechselwirkungen zwischen der VATPase und anderen Proteinen zu minimieren, wurde dem Saccharosedichtegradienten, in
welchem der konzentrierte Solubilisierungsüberstand aufgetrennt wurde, 200 mM KCl
zugesetzt. Dies führte nicht nur zu einer höheren Reinheit, sondern auch zur Entdeckung der
bis dato nicht darstellbaren Untereinheit a (siehe 4.1.2.). Um die V-ATPase in einer noch
höheren Reinheit zu erhalten, wurden im Anschluß an die Dichtegradientenzentrifugation
noch 2 Chromatographieschritte eingeführt. Zunächst wurde eine Anionenaustauscherchromatographie auf einer Mono Q-, Resource Q- (beide Pharmacia) oder Hyper D Q-Säule
(Biosepra) durchgeführt, bei der das V1Vo Holoenzym in einem linearen Salzgradienten bei
einer NaCl-Konzentration zwischen 230 mM und 280 mM als relativ homogener Peak
eluierte (Abb. 7a). Bei einer anschließenden Gelpermeationschromatographie auf einer
Superdex 200-Säule (Pharmacia) eluierte das V1Vo Holoenzym dann in einem einzigen Peak
mit einer Schulter (Abb. 7b), auf die später noch näher eingegangen wird. Bei einer SDS38
Ergebnisse
PAGE des Elutionspeaks der Gelfiltration zeigte sich nach Silberfärbung (Abb. 7c), dass alle
Untereinheiten des V1Vo Holoenzyms vorhanden und keine nennenswerten Verunreinigungen
enthalten waren. Die Ausbeuten der neu entwickelten Präparation beliefen sich auf im
Durchschnitt 100 µg reines V1Vo Holoenzym/Raupe, was gemessen an der bisherigen
Ausbeute von ca. 10 µg V1Vo Holoenzym/Raupe mit geringerer Reinheit (Schweikl et al.,
1989) eine deutliche Steigerung darstellt. Außerdem ist noch zu erwähnen, dass bei der
herkömmlichen Art der Reinigung durch den hohen Zeitaufwand für die längsmuskelfreie
Präparation im Schnitt nur ca. 16 Raupen verwendet werden konnten. Da bei der Reinigung
aus dem Rohhomogenat von ganzen Mitteldärmen bis zu 32 Raupen verwendet werden
können, steigt somit die Gesamtausbeute noch zusätzlich.
Abb. 7: Reinigung des V1Vo Holoenzyms. a) Elutionsprofile des V1Vo Holoenzyms der Anionenaustauscherchromatographie (Hyper D Q, Biosepra); b) Elutionsprofile des V 1Vo Holoenzyms Gelpermeationschromatographie (Superdex 200, Pharmacia); c) Silbergefärbtes SDS-Gel des Elutionspeaks der Gelpermeationschromatographie (1 µg Protein).
39
Ergebnisse
4.1.2. Entdeckung der Untereinheit a bei M. sexta
Bei den Versuchen, das V1Vo Holoenzym durch direktes Solubilisieren des Membranpellets
eines Mitteldarmrohhomogenats zu reinigen, wurde den Saccharoselösungen für die zonale
Dichtegradientenzentrifugation 200 mM KCl zugesetzt, um Verunreinigungen mit Proteinen,
die durch unspezifische elektrostatische Wechselwirkungen am V1Vo Holoenzym haften zu
verhindern (siehe Abb. 6). Bei einer anschließenden Auftrennung der Probe auf einem SDSGel zeigte sich dabei erstmals eine deutliche Bande mit einer apparenten Molekularmasse von
ca. 100 kDa (Abb. 8). Im weiteren wurde dann überprüft, ob es sich bei dieser Bande um die
Untereinheit a handelt, die bei den meisten anderen V-ATPasen beschrieben wurde, bei M.
sexta bis jetzt allerdings nachgewiesen werden konnte (Wieczorek et al., 2000).
Abb. 8: Entdeckung der Untereinheit a bei M. sexta. Ein mit Coomassie gefärbtes SDS-Gel (Bahn 1-3) und
ein immungefärbter Westernblot (Bahn 4) des aus der GCAM des posterioren Mitteldarms gereinigten
Holoenzyms, mit und ohne KCl im Dichtegradienten. Bahn 1, 5 µg Standardproteine (Molekularmassen in kDa),
Bahn 2, 5 µg V1Vo Holoenzym aus GCAM, Bahn 3 und 4, 5 µg V1Vo Holoenzym aus GCAM mit 200 mM KCl
im Saccharosedichtegradienten, Bahn 4, gefärbt mit Serum gegen die 116 kDa Untereinheit a von chromaffinen
Granula aus Rind (Gillespie et al., 1991).
Mit Hilfe von Antikörpern gegen die 116 kDa Untereinheit a von chromaffinen Granula aus
Rind (Gillespie et al., 1991) konnte die Vermutung, dass es sich bei dem 100 kDa Protein um
die Untereinheit a handelt bestätigt werden (Abb. 8). Inzwischen wurde cDNA für die
Untereinheit a aus dem Mitteldarm von M. sexta in unserer Arbeitsgruppe kloniert und
sequenziert (Merzendorfer et al., 2000; GenBank Acc.-Nr. AJ249390). Deshalb konnte auch
durch MALDI-MS-Analysen von tryptischen Peptiden der aus einem SDS-PAGE
ausgeschnittenen 100 kDa Bande eine eindeutige Identifizierung dieser Bande als
Untereinheit a mit einer Sequenzabdeckung von 36% erreicht werden (Abb. 9).
40
Ergebnisse
a)
m/z gemessene Peptide
705.411
732.384
763.380
891.470
938.380
954.382
1009.492
1017.501
1025.444
1044.621
1122.564
1126.592
1166.568
1173.552
1260.588
1271.643
1278.637
1288.596
1419.673
1490.661
1465.637
1481.659
1542.697
1558.685
1575.715
1646.750
1670.791
1686.863
1738.841
1821.852
1837.879
2048.957
2064.900
2119.987
2079.948
2121.960
2126.023
2264.173
2370.229
2550.350
2573.259
erwartet m/z
705.405
732.404
763.410
891.505
938.382
954.377
1009.420
1017.548
1025.458
1044.657
1122.605
1126.622
1166.596
1173.606
1260.659
1271.671
1278.706
1288.629
1419.658
1490.695
1465.663
1481.658
1542.690
1558.685
1575.759
1646.796
1670.785
1686.780
1738.872
1821.844
1837.839
2048.978
2064.973
2120.016
2080.027
2121.983
2126.071
2264.153
2370.256
2550.402
2573.267
erste AS
195
182
51
50
57
letzte AS
200
187
56
56
63
180
258
170
122
346
473
804
827
111
121
39
244
187
266
179
130
356
482
812
838
121
130
49
256
357
368
136
148
244
257
135
148
267
357
281
371
75
93
94
201
372
611
320
740
346
110
219
389
630
340
761
368
Sequenz
(R)GNVFLR(Q)
(R)IPAFER(M)
(K)FVNEVR(R)
(R)KFVNEVR(R)
(R)RCDEMER(K)
methionine oxidized
cysteine acrylamide
(R)ERIPAFER(M)
(R)EMAMGVMTR(I)
(K)LGFVAGVILR(E)
(R)NYLELTELK(H)
(R)SGSSVPPILNR(M)
(K)SLNIFGSSWR(Q)
(R)LHWVEFQSK(F)
(R)FEVILDSAGPGR(G)
(R)EVNQNAEALKR(N)
(K)RNYLELTELK(H)
(R)DLNPDVNAFQR(K)
(R)ATLYPCPESPADR(R)
C acrylamide
(R)METLEDPPTYNR(N)
M ox.
(K)TQVFFDEMADPSR(E)
M ox.
(R)ATLYPCPESPADRR(E)
C acrylamide
(R)KTQVFFDEMADPSR(E)
M ox.
(R)IEDLNTVLGQTQDHR(H)
(R)METLEDPPTYNRNNK(F)
M ox.
(R)DGIPMLEIPGECPEAPQPR(E)
M ox.
C acrylamide
(R)EMIDLEATFEKLENELR(E)
(R)QAEIDTPLEDPSSSDQVYK(S)
(K)FTQAFQNLIYAYGVATYR(E)
(K)TSAYCAPSILITFINMMLFK(T)
(K)CLIAECWVPALDLETIQLALR(R)
M ox. (R)LWALSLAHAQLAEVAWNMLLRK(G)
(R)SGSSVPPILNRMETLEDPPTYNR(N)
b)
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
MGSLFRSEEMTLCQLFLQSEAAYACVSELGELGLVQFRDLNPDVNAFQRKFVNEVRRCDE
MERKLRYLEKEIRRDGIPMLEIPGECPEAPQPREMIDLEATFEKLENELREVNQNAEALK
RNYLELTELKHILRKTQVFFDEMADPSREEEQVTLLGEEGLMAGGQALKLGFVAGVILRE
RIPAFERMLWRACRGNVFLRQAEIDTPLEDPSSSDQVYKSVFIIFFQGDQLKTRVKKICE
GFRATLYPCPESPADRREMAMGVMTRIEDLNTVLGQTQDHRHRVLVAAAKNIKNWFVKVR
KIKAIYHTLNLFNLDVTQKCLIAECWVPALDLETIQLALRRGTERSGSSVPPILNRMETL
EDPPTYNRNNKFTQAFQNLIYAYGVATYREVNPAPYTIITFPFLFAVMFGDLGHGALMAA
FGFWMCYKEKPLQAKKIDSEIWNIFFGGRYIILLMGLFSMYTGLIYNDIFSKSLNIFGSS
WRQNYNASTLTENKLLQLNPDSPDYLQYPYPFGIDPVWQLAEANKIIFMNAYKMKISIII
GVFHMLFGVCLSLWNHLYFKRRISVYVEFIPQILFLTLLFFYMVLLMFIKWTSYGPTPGA
FGSQDPAIVKTSAYCAPSILITFINMMLFKTDANTRPQCDDTMYAGQLQLQKFFVIVALL
CVPVMLFGKPYFIMKEQKQRARQGHQPVEGAAENGTAGGAPVPSSGHHDDDITEVFIHQG
IHTIEYVLGSVSHTASYLRLWALSLAHAQLAEVAWNMLLRKGLMSTDFQGGIFLYIVFAG
WAAISVSILVLMEGLSAFLHTLRLHWVEFQSKFYAGEGLSLPTGSRFEVILDSAGPGRGV
N
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
Abb. 9: MALDI-MS Karte der Untereinheit a. Die durch MALDI-MS identifizierten tryptischen Peptide der
100 kDa Bande (a) und ihre Sequenzabdeckung (b) mit der Untereinheit a der V-ATPase aus M. sexta (GenBank
Acc.-Nr. AJ249390). Die gefundenen Fragmente der MALDI-MS sind in der Aminosäuresequenz unterstrichen
und fett gedruckt.
41
Ergebnisse
4.1.3. Die Untereinheit B und die Identifizierung ihrer putativen Isoform B´ als Hsp60
Da die bisher zu Immunfärbungen verwendeten Antiseren gegen das V1Vo Holoenzym so gut
wie keine Antikörper gegen die Untereinheit B enthielten und gegen diese auch keine
monoklonalen Antikörper zur Verfügung standen, sollten polyklonale Antikörper gegen eine
rekombinant hergestellte Untereinheit B produziert werden. Um die Möglichkeiten der
Anwendung zu erhöhen, wurde nicht die ganze Untereinheit, sondern zwei Teilsequenzen
ausgewählt: zum einen der Bereich von Aminosäure 243-428, welcher bei allen V-ATPasen
hoch konserviert ist, so dass die Antikörper auch gegen V-ATPasen aus anderen Organismen
zu verwenden sind, zum anderen der Bereich von Aminosäure 475-494 aus dem C-Terminus
der für M. sexta spezifisch ist und den die Antikörper deshalb nur in der Insekten V-ATPase
erkennen sollten (Novak et al., 1992). Beide Teilsequenzen der B Untereinheit wurden mit
spezifischen Primern in einer PCR vervielfältigt, die Produkte gereinigt, in den
Expressionsvektor pMalc2 (New England Biolabs) kloniert und dieser in E. coli Zellen (XL1
blue) transformiert. Die Expression des rekombinanten Fusionsproteins wurde induziert und
das Protein per Affinitätschromatographie auf einer Amylosesäule soweit als möglich
gereinigt. Bei einer Kontrolle in der SDS-PAGE waren dann auch Banden mit der für die
Fusionsproteine erwarteten Größe zu sehen (Abb. 10).
Abb. 10: Fusionsprotein aus Teilsequenzen der B Untereinheit und MBP. Coomassie-gefärbte SDS-PAGE
der gereinigten Fusionsproteine. Bahn 1, Standardproteine (5 µg), Bahn 2, MBP (1µg), Bahn 3, MBP-C34 (1µg)
und Bahn 4, MBP-C23 (1µg).
Die Fusionsproteine wurden direkt zur Immunisierung von zwei Meerschweinchen verwendet
und die erhaltenen Antiseren auf gereinigtem V1Vo Holoenzym getestet. Dabei kam es zu
einem überraschenden Ergebnis. Das Antiserum C23 detektierte die Untereinheit B und ein
weiteres Protein mit ca. 60 kDa im folgenden B´ genannt (Abb. 11b). Das Antiserum C34
erkannte die Untereinheit B überhaupt nicht, dafür aber ebenfalls das 60 kDa Protein B´. Das
42
Ergebnisse
Protein B´ wurde bisher häufig als schwache Bande bei der Reinigung der V-ATPase
beobachtet und ist auch in der neuen Präparationsmethode als Bande in der bereits erwähnten
mal mehr mal weniger ausgeprägten Schulter des Elutionspeaks der Gelfiltration zu sehen
(Abb. 11a).
Abb. 11: Entdeckung des Proteins B´. a) Elutionsprofil des V1Vo Holoenzyms von einer Superdex 200
Gelfiltrationssäule (Pharmacia). b) SDS-PAGE der Peaks I und II der Gelfiltration. Bahn 1-3 Coomassie gefärbt,
Bahn 4-7, Westernblot. Bahn 1, Proteinstandard, Bahn 2, 4 und 6, Peak I; Bahn 3, 5 und 7, Peak II. Bahn 4 und
5, Immunfärbung mit Antiserum C23 und Bahn 6 und 7, Immunfärbung mit Antiserum C34.
Abb. 12: Vorkommen von B` in unterschiedlichen Präparationen. Silbergefärbtes SDS-PAGE-Gel. Bahn 1,
Standardproteine, Bahn 2, V1Vo Holoenzym aus angereicherter GCAM aus anteriorem Mitteldarm,. Bahn 3,
V1Vo Holoenzym aus angereicherter GCAM aus posteriorem Mitteldarm. Bahn 4, V1Vo Holoenzym aus
gereinigter GCAM aus anteriorem Mitteldarm. Bahn 5, V1Vo Holoenzym aus gereinigter GCAM aus
posteriorem Mitteldarm. Bahn 6, V1 Komplex.
43
Ergebnisse
Es stellte sich nun die Frage, ob es sich bei diesem Protein um eine Isoform der Untereinheit
B handelt, und wenn ja, wo diese Isoform vorkommt. Zunächst wurde untersucht, in welchen
Präparationen die B´-Bande auftaucht. Das V1Vo Holoenzym wurde aus der angereicherten
GCAM (3.1.1.) und der gereinigten GCAM des anterioren und posterioren Mitteldarms
solubilisiert und isoliert und mit dem V1 Komplex verglichen (Abb. 12). Es zeigte sich, dass
beim V1Vo Holoenzym aus der angereicherten GCAM beider Darmabschnitte deutlich die
Bande B´ zu sehen ist. Hingegen ist B´ weder im V1Vo Holoenzym aus gereinigter GCAM
noch im V1 Komplex enthalten. MALDI-MS-Analysen der beiden Proteinbanden
ermöglichten eine eindeutige Identifizierung der Bande B als Untereinheit B entsprechend der
von der cDNA abgeleiteten Proteinsequenz (Abb. 15). Die Bande B´ konnte auf diese Weise
nicht identifiziert werden, da keine der gemessenen Fragmentmassen ein Pendant in der von
der cDNA abgeleiteten Proteinsequenz hatte (nicht gezeigt). Eine eindeutige Identifizierung
von B` erfolgte erst durch eine N-terminale Sequenzierung der entsprechenden Proteinbande
durch Dr. Barbara Schedding (Universität Münster). Die ersten 30 Aminosäuren konnten
eindeutig gelesen werden und ergaben bei der Suche in der Datenbank eine hohe
Übereinstimmung mit dem Hitzeschockprotein 60 (Hsp63) von Heliothis vireszens, dem
Tobacco Budworm (Abb. 13). Außerdem stimmten die 30 Aminosäuren mit der Sequenz
eines, bei einem sogenannten "Shotgun-Screening" für V-ATPase Untereinheiten von Ralph
Gräf in unserem Labor gefundenen Klons (Klon10) vollständig überein. Sowohl das Hsp63
aus H. vireszens als auch der Klon 10 beinhalteten eine vorgeschaltete Signalsequenz für den
mitochondrialen Import. Für Klon 10 wurde die mitochondriale Lokalisation mit einer
Wahrscheinlichkeit größer 90% vorhergesagt (PSORT II server).
Hsp60 M. sexta
Klon 10 M. sexta
Hsp60 H. vireszens
1
10
20
30
40
50
60
+--------+---------+---------+---------+---------+---------+AKDVRFGADVRALMLQGVDILADAVAVTMG
SIRTKMLRLPRVVRQSISLHKSQQLT--RFYAKDVRFGADVRALMLQGVDILADAVAVTMG
MFKMYRSPHITRNSFKYLKATNINSCRFYAKEVRFGPDVRSLMLQGVDILADADDVTMG
70
80
90
100
110
--------+---------+---------+---------+---------+Hsp60 M. sexta
Klon 10 M. sexta
Hsp60 H. vireszens
PKGRNVILEQSWGSPKITKDGVTVAKGVELKDKFQNIGAKLVQNVANNT
PKGVNVILAKNLGPPKITKDGVTVAKGIDLKDKFQNIGARLVQNVANKTN
Abb. 13: Sequenzvergleich Hsp60. Vergleich zwischen der durch N-terminale Sequenzierung des Protein B´
erhaltenen Sequenz (Hsp60 M. sexta), des durch ein shotgun screening erhaltenen Klons aus M. sexta (Klon 10
M. sexta) und des Hsp60 aus H. vireszens. Bei allen drei Sequenzen identische Aminosäuren (rot), bei zwei
Sequenzen identische Aminosäuren (blau), andere (schwarz).
44
Ergebnisse
4.1.4. Identifizierung der Untereinheit D
Zu Beginn der Arbeit lag keinerlei Sequenzinformation zur bis dahin als D Untereinheit
bezeichneten SDS-Bande des V1Vo Holoenzyms und des V1 Komplexes vor. Die Bande
wurde nur auf Grund ihrer apparenten Molekularmasse von 32 kDa und wegen des
Vorkommens einer D Untereinheit bei anderen V-ATPasen als solche benannt. Um die
Identität dieser Bande aufzuklären, wurde sie aus einem SDS-PAGE Gel ausgeschnitten. Bei
der N-terminalen Sequenzierung eines Cyanbromid-Fragments durch Dr. Roland Schmid
(Abt. Mikrobiologie, Universität Osnabrück) konnte die Sequenz GRLAGAQKGHGLL
detektiert werden. Bei einer Datenbanksuche ergaben sich eindeutige Übereinstimmungen mit
D Untereinheiten anderer V-ATPasen (Beispiele in Abb. 14). Mittlerweile wurde diese
Sequenzinformation zur Synthese von degenerierten Primern benutzt, die zu einer
erfolgreichen Klonierung und Sequenzierung der cDNA der Untereinheit D von M. sexta
führte (Merzendorfer et al., 2000).
B. taurus
C. albicans
S. cerevisiae
M. sexta
1
10
20
30
40
+--------+---------+---------+---------+-MSGKDRIEIFPSRMAQTIMKARLKGAQTGRNLLKKKSDALT
MSGAGNREQVFPTRMTLGVMKSKLKGAQQGHSLLKRKSEALT
MSGNREQVFPTRMTLGLMKTKLKGANQGYSLLKRKSEALT
GRLAGAQKGHGLL
Abb. 14: Teilsequenz der D Untereinheit. Vergleich der Teilsequenz der D Untereinheit von M. sexta mit den
entsprechenden Teilen der D Untereinheiten aus B. taurus, C. albicans und S. cerevisiae. Identische
Aminosäuren (rot), andere (schwarz).
4.1.5. Analyse der Untereinheiten der V-ATPase durch MALDI-MS
Für weitergehende funktionelle und strukturelle Untersuchungen der V-ATPase war es nicht
nur notwendig, das Enzym in ausreichender Quantität und Qualität zu reinigen, sondern auch
alle seine Untereinheiten zu identifizieren. Zwar sind inzwischen alle Untereinheiten der VATPase von M. sexta auf der Basis von cDNA-Sequenzen nachgewiesen (Dow et al., 1992;
Gräf et al., 1992; Novak et al., 1992; Gräf et al., 1994a; Gräf et al., 1994b; Lepier et al.,
1996; Merzendorfer et al., 1997b; Merzendorfer et al., 1999; Merzendorfer et al., 2000), doch
stand die eindeutige Identifizierung der Untereinheiten auf Proteinebene noch aus, zumal für
eine Reihe von Untereinheiten Isogene bzw. Isoformen existieren. Deshalb wurden alle
Banden eines SDS-PAGE Geles des V1Vo Holoenzyms bzw. des V1 Komplexes
ausgeschnitten und im Gel tryptisch verdaut (3.1.16.). Die extrahierten Peptide wurden mittels
45
Ergebnisse
MALDI-MS analysiert und den entsprechenden Abschnitten der sich aus ihrer cDNA
ergebenden Aminosäuresequenz zugeordnet (Abb. 15). Trypsin erwies sich für die
Untereinheit c und e als ungeeignet, da die meisten der entstehenden Fragmente nicht im
Meßbereich lagen. Bei der Untereinheit c, welche im Zusammenhang mit der Untersuchung
zur Makrolidbindestelle wichtig war (4.3.3.), wurde deshalb Chymotrypsin eingesetzt. Mit
Ausnahme der Untereinheit e konnten alle Untereinheiten durch eine deutliche Übereinstimmung zwischen den analysierten Fragmenten und den cDNA-Sequenzen identifiziert
werden (Sequenzabdeckungen: A = 85%, B = 62 %, H = 58 %, C = 71%, D = 56%, E = 55%,
G = 79%, F = 66%, a = 36%, d = 47% und c = 76%). Bei der Untereinheit c konnten zwei
auffällige Massenfragmente von 1523,9 und 1739,9 m/z nachgewiesen werden, die nicht
durch die cDNA-Sequenz zu erklären sind (siehe auch 5.1.2.). Möglicherweise handelt es sich
hierbei um das Fragment einer Isoform der Untereinheit. Weiterhin ergaben sich aus der
MALDI-MS keine Hinweise auf Isoformen für andere Untereinheiten. Diese können
allerdings nicht vollständig ausgeschlossen werden, da sich Sequenzänderungen auch in nicht
repräsentierten oder nachweisbaren Fragmenten befinden können.
Abb. 15: MALDI-MS-Analyse aller Untereinheiten des V1Vo Holoenzyms. Für jede Untereinheit wurden die
in der MALDI-MS gefundenen Massen ihren potentiellen Peptidfragmenten zugeordnet und in der
Aminosäuresequenz fettgedruckt und unterstrichen hervorgehoben.
Untereinheit A:
1
51
101
151
201
251
301
351
401
451
501
551
601
MASKGGLKTIANEENEERFGYVFAVSGPVVTAEKMSGSAMYELVRVGYNE
LVGEIIRLEGDMATIQVYEETSGVTVGDPVLRTGKPLSVELGPGILGSIF
DGIQRPLKDINELTQSIYIPKGVNVPSLAREVDWEFNPLNVKVGSHITGG
DLYGIVHENTLVKHKMLMPPRAKGTVTYIAPAGNYKVTDVVLETEFDGEK
AQYTMLQVWPVRQPRPVTEKLPANHPLLTGQRVLDSLFPCVQGGTTAIPG
AFGCGKTVISQALSKYSNSDVIIYVGCGERGNEMSEVLRDFPELTVEIEG
VTESIMKRTALVANTSNMPVAAREASIYTGITLSEYFRDMGYNVSMMADS
TSRWAEALREISGRLAEMPADSGYPAYLGARLASFYERAGRVKCLGNPDR
EGSVSIVGAVSPPGGDFSDPVTAATLGIVQVFWGLDKKLAQRKHFPSINW
LISYSKYMRALDDFYEKNYPEFVPLRTKVKEILQEEEDLSEIVQLVGKAS
LAETDKITLEVAKLLKDDFLQQNSYSSYDRFCPFYKTVGMLKNIISFYDM
SRHAVESTAQSDNKVTWNVIRDAMGNVLYQLSSMKFKDPVKDGEAKIKAD
FDQLLEDMSAAFRNLED
50
10
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
Untereinheit B:
1
51
101
151
201
251
301
351
401
451
46
MAKTLSAAQANKEHVLAVSRDFISQPRLTYKTVSGVNGPLVILDEVKFPK
FSEIVQLKLADGTHRSGQVLEVSGSKAVVQVFEGTSGIDAKNTLCEFTGD
ILRTPVSEDMLGRVFNGSGKPIDKGPPILAEDFLDIQGQPINPWSRIYPE
EMIQTGISAIDVMNSIARGQKIPIFSAAGLPHNEIAAQICRQAGLVKIPG
KSVLDDHEDNFAIVFAAMGVNMETARFFKQDFEENGSMENVCLFLNLAND
PTIERIITPRLALTAAEFLAYQCEKHVLVILTDMSSYAEALREVSAAREE
VPGRRGFPGYMYTDLATIYERAGRVEGRNGSITQIPILTMPNDDITHPIP
DLTGYITEGQIYVDRQLHNRQIYPPVNVLPSLSRLMKSAIGEGMTRKDHS
DVSNQLYACYAIGKDVQAMKAVVGEEALTPDDLLYLEFLTKFEKNFITQG
NYENRTVFESLDIGWQLLRIFPKEMLKRIPASILAEFYPRDSRH
50
10
150
200
250
300
350
400
450
500
Ergebnisse
Untereinheit H:
1
51
101
151
201
251
301
351
401
451
MANIGDEKVSQLIPTLGDDKIDMIAATSVLQIRASEIRQTQINWQSYLQG
QMITQRDHDFIVNLDQRGQKDLPDKNPDACADVFLNLLTHISKDHTIQYI
LVLIDDILSEDKSRVKIFRETKYSGNIWQPFLNLLNRQDEFVQHMTARII
AKLACWHPQLMDKSDLHFYLSWLKDQLKMNNNDYIQSVARCLQMMLRVDE
YRFAFLSVDGISTLLSILASRVNFQVQYQLVFCLWVLTFNPLLAEKMNKF
NAIPILADILSDSVKEKVTRIVLAVFRNLIEKPQDQQVAKEHCIAMVQCK
VLKQLSILEQKRSDDEDIMNDVEFLNERLQASVQDLSSFDQYATEVKSGR
LEWSPVHKSAKFWRENAARLNERGQELLRTLVHLLEKSHDPVVLAVACYD
VGEYVRHYPRGKHIIEQLGGKQRVMYLLSHDDPNVRYEALLAVQKLMVHN
WEYLGKQLEKEQIDKQAGTVVGAKA
50
10
150
200
250
300
350
400
450
500
Untereinheit C:
1
51
101
151
201
251
301
351
MSEYWLISAPGDKTCQQTWEALNQATKANNLSLNYKFPIPDLKVGTLDQL
VGLSDDLGKLDTFVEGVTRKVAQYLGEVLEDQRDKLHENLTANNDDLPHY
LTRFQWDMAKYPIKQSLRNIADIISKQVGQIDADLKVKSSAYNALKGNLQ
NLEKKQTGSLLTRNLADLVKKEHFILDSEYLTTLLVIVPKSMFNDWNANY
EKITDMIVPRSTQLIHQDGDYGLFTVTLFKKVVDEFKLHARERKFVVREF
AYNEADLVAGKNEITKLLTDKKKQFGPLVRWLKVNFSECFCAWIHVKALR
VFVESVLRYGLPVNFQAALLVPSRRSARRLRDTLHALYAHLDHSAHHHAN
AQQDSVELAGLGFGQSEYYPYVFYKINIDMIEKAA
50
10
150
200
250
300
350
Untereinheit D:
1
51
101
151
201
MSGKDRLAIFPSRGAQMLMKGRLAGAQKGHGLLKKKADALQVRFRLILSK
IIETKTLMGEVMKEAAFSLAEAKFTTGDFNQVVLQNVTKAQIKIRSKKDN
VAGVTLPIFESYQDGSDTYELAGLARGGQQLAKLKKNFQSAVKLLVELAS
LQTSFVTLDEVIKITNRRVNAIEHVIIPRLERTLAYIISELDELEREEFY
RLKKIQDKKKIIKDKAEAKKAALRAAGQDLRDSANLLDEGDEDLLF
50
10
150
200
250
Untereinheit E:
1
51
101
151
201
MALSDADVQKQIKHMMAFIEQEANEKAEEIDAKAEEEFNIEKGRLVQQQR
LKIMEYYEKKEKQVELQKKIQSSNMLNQARLKVLKVREDHVRNVLDEARK
RLAEVPKDIKLYSDLLVTLIVQALFQLVEPTVTLRVRQADKALVESLLGR
AQQDYKAKIKKDVVLKIDNENFLPPDTCGGIELIAAKGRIKISNTLESRL
ELIAQQLLPEIRNALFGRNPNRKFTD
50
10
150
200
Untereinheit G:
1
51
101
MASQTHGIQQLLAAEKRAAEKVSEARKRKAKRLKQAKEEAQDEVEKYRQE
RERQFKEFEAKHMGTREGVAAKIDAETRIKIDEMNKMVQTQKEAVIKDVL
NLVYDIKPELHINYRVV
50
10
Untereinheit F:
1
51
101
MALHAAVKGKLISVIGDEDTCVGFLLGGIGEINKNRHPNFMVVDKNTPVS
EIEECFKRFVKRDDIDIILINQNVAELVRHVIDAHTAPVPSVLEIPSKDH
PYDASKDSILRRAKGMFNPEDLVR
50
10
Untereinheit a: (siehe Abb. 9)
47
Ergebnisse
Untereinheit d:
1
51
101
151
201
251
301
MKGCIFNIDAGYLEGLCRGFKCGILKQSDYLNLVQCETLEDLKLHLQGTD
YGTFLANEPSPLSVSTIDDKLREKLVIEFQHLRNHSVEPLSTFLDFITYS
YMIDNIILLITGTLHQRPISELIPKCHPLGSFEQMEAIHVAATPAELYNA
VLVDTPLAPFFVDCISEQDLDEMNIEIIRNTLYKAYLEAFYDFCKQIGGT
TADVMCEILAFEADRRAIIITINSFGTELSKDDRAKLYPRCGKLNPDGLA
ALARADDYEQVKAVAEYYAEYSALFEGAGNNVGDKTLEDKFFEHEVNLNV
HAFLQQFHFGVFYSYLKLKEQECRNIVWISECVAQKHRAKIDNYIPIF
50
100
150
200
250
300
350
Untereinheit c; Trypsin und Chymotrypsin:
1
51
101
151
MAENPIYGPFFGVMGAASAIIFSALGAAYGTAKSGTGIAAMSVMRPELIM
KSIIPVVMAGIIAIYGLVVAVLIAGSLDSPSNNYTLYRGFIHLGAGLAVG
FSGLAAGFAIGIVGDAGVRGTAQQPRLFVGMILILIFAEVLGLYGLIVAI
YLYTKQ
50
100
150
Untereinheit e:
1
51
48
MGASFVPITVFTILWGVVGIVCPIFAPKGPNRGIIQVVLMLTAATCWLFW
LCAYMAQMNPLIGPRLNNETLIWISRTWGNPISNHTGA
50
Ergebnisse
4.2. Der V1 Komplex
4.2.1. Modifikation der Präparation des V1 Komplexes
Um die Struktur und die biochemischen Eigenschaften des V1 Komplexes intensiver
untersuchen zu können, war es erforderlich, die Stabilität und Aktivität des Komplexes über
längere Zeit zu erhalten. Bei Gräf et al. (1996) wurden alle Experimente direkt im Anschluß
an die Präparation durchgeführt, da schon bei einer Lagerung über Nacht die Aktivität des V1
Komplexes sich im Vergleich zur frischen Präparation stark verringerte. Bei Vortests einiger
Lagerungsbedingungen zeigte sich, dass sowohl die Zugabe von -Mercaptoethanol als auch
ein Aufbewahren bei 4°C im Kühlschrank sich positiv auf die Aktivität des V1 Komplexes
auswirken (Tab. 4).
Tab. 4: Lagerungsbedingungen für den V1 Komplex und deren Auswirkung auf die Aktivität. Bei der
gemessenen Aktivität handelt es sich um die Mg-ATPase-Aktivität in Gegenwart von 25% Methanol.
Lagerungsbedingungen
Kontrolle: 150 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl pH 8,1
Relative Aktivität
100% (2,4 U)
Nach 96 h in 150 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl pH 8,1, 4°C
43%
Nach 96 h in 150 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl, 25% Methanol pH 8,1, 4°C
42%
Nach 96 h in 150 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl, 3 mM -Mercaptoethanol pH 8,1, 4°C
62,5%
Einfrieren und/oder Lagern im flüssigem Stickstoff bewirkten einen kompletten Verlust der
Aktivität. Wurde der Komplex bei Raumtemperatur gelagert, zeigte sich bei einer
anschließenden Anionenaustauscherchromatographie, warum die Aktivität des V1 Komplexes
im Vergleich zur Lagerung bei 4°C schlechter wurde. Der V1 Komplex (II) mit hoher
Aktivität (Gräf et al., 1996), welcher im zweiten Peak eluiert, wandelt sich im Laufe der Zeit
komplett in die inaktivere Form des ersten Elutionspeaks (I) um (siehe Abb. 16).
49
Ergebnisse
Abb. 16: Denaturierung des V1 Komplexes bei Raumtemperatur. Zu sehen sind Elutionsprofile von einer
Anionenaustauscherchromatographie (Mono Q, Pharmacia). Der 2. Peak (II) einer V 1 Komplex Präparation
wurde in 20 mM Tris-HCl pH 8,1, 150 mM NaCl bei RT gelagert und am folgenden Tag erneut auf der
Anionenaustauschersäule aufgetrennt a). Dies wurde mit jeweils dem 2. Elutionspeak (II) wiederholt b) und c).
Da die einzelnen Untereinheiten des V1 Komplexes viele Cysteine enthalten und diese sowohl
membrangebunden im V1Vo Holoenzym als auch im freien V1 Komplex vom reduzierenden
Milieu des Cytosols umgeben sind, lag es nahe, schon bei der Präparation des V1 Komplexes
ein Reduktionsmittel zur Stabilisierung zu verwenden. Da -Mercaptoethanol bereits seinen
positiven Effekt bei der Lagerung des V1 Komplexes gezeigt hatte, wurde es mit einer
Endkonzentration von 9,6 mM den Laufpuffern für die Chromatographie zugegeben
(Merzendorfer et al., 1997a). Dadurch verschwand der Anteil des V1 Komplexes mit
geringerer Aktivität bei der Anionenaustauscherchromatographie, also der 1. Elutionspeak
fast vollständig und der aktivere 2. Peak nahm entsprechend zu (Abb. 17). Deshalb wurde
auch in der anschließenden Gelpermeationschromatographie -Mercaptoethanol als
Reduktionsmittel verwendet.
50
Ergebnisse
Abb. 17: Der Einfluß von -Mercaptoethanol auf die Reinigung des V1 Komplexes. Vergleich zweier V1
Komplex Präparationen ohne a) und mit b) 9,6 mM -Mercaptoethanol im Laufpuffer der
Anionenaustauscherchromatographie (Mono Q, Pharmacia).
Somit
waren
durch
die
Zugabe
von
9,6
mM
-Mercaptoethanol
in
alle
Chromatographiepuffer und die anschließende Lagerung bei 4°C im Kühlschrank die
Vorraussetzungen geschaffen, größere Mengen des V1 Komplexes zu sammeln und
zeitaufwendigere Experimente, für die ein stabiles Enzym notwendig ist, durchzuführen. Bei
Proben, die unter diesen Bedingungen gereinigt und gelagert wurden, konnte nach 4 Wochen
noch eine Aktivität von bis zu 95% im Vergleich zur frischen Probe gemessen werden (nicht
gezeigt).
51
Ergebnisse
4.2.2. Die Untereinheitenzusammensetztung des V1 Komplexes in der 2-D Gelelektrophorese
Da es unklar war, ob zwei verschiedene Proteine wegen gleicher Eigenschaften in der SDSPAGE als eine einzige Proteinbande zu sehen sind, wurde der V1 Komplex mit der Methode
der 2-dimensionalen Gelelektrophorese analysiert. Dabei wurde in der ersten Dimension nach
dem Isoelektrischen Punkt getrennt, in der zweiten Dimension in einem SDS-PAGE-Gel nach
der apparenten Molekularmasse (Abb. 18).
Abb. 18: 2-D Gelelektrophorese des V1 Komplexes. Gezeigt ist die 2. Dimension, des Coomassie-gefärbten
SDS-PAGE-Gels. Auf dem Gel wurde als Referenz links 5 µg V1 Komplex und rechts 5 µg Proteinstandard
aufgegeben. In der ersten Dimension wurden 20 µg V1 Komplex auf einem IEF-Dry Strip (Pharmacia, pH 3-10)
aufgetrennt und anschließend auf das SDS-Gel aufgelegt. Die in der 2. Dimension wiedergefundenen
Untereinheiten sind im Gel markiert. Ein unbekannter Spot wurde mit einem Pfeil markiert.
Bei dieser Auftrennung konnten alle Untereinheiten des V1 Komplexes wiedergefunden
werden und soweit spezifische Antikörper (A, B, E G Untereinheit) vorhanden waren, durch
Immunfärbung eines Westernblots der 2. Dimension identifiziert werden (nicht gezeigt). Die
Position der Untereinheiten im Gel entsprach zum einen ihrer apparenten Molekularmasse,
zum anderen aber auch dem von ihrer abgeleiteten Aminosäuresequenz berechneten
Isoelektrischen Punkt (Tab. 5).
52
Ergebnisse
Tab. 5: Isoelektrische Punkte der Untereinheiten des V1 Komplexes. Der Isoelektrische Punkt wurde aus den
abgeleiteten Aminosäuresequenzen ermittelt.
Untereinheit
A
B
C
D
E
F
G
H
Isoelektrischer Punkt
4,99
5,2
8,2
9,6
9,4
5,9
9,4
6,3
Einzig eine kleine Bande (Abb. 18, Pfeil), die etwas links und leicht höher als die
Untereinheit F lief, könnte auf eine mögliche Isoform der Untereinheit G hindeuten, von der
es mehr als ein Gen gibt (Lepier et al., 1996; Merzendorfer et al., 2000). Ein Westernblot mit
anschließender Immunfärbung mit dem monoklonalen Antikörper 47-5, welcher gegen ein
gemeinsames Epitop der E und G Untereinheit gerichtet ist, erkennt diese Bande allerdings
nicht. Inzwischen wird die Problematik der Isoformen von Untereinheiten von Stephan
Reineke in unserem Labor genauer untersucht, so dass mit neuen Erkenntnissen zu rechnen
ist. Außer diesem einen Punkt gab es keine weiteren auffälligen neuen Banden, die auf eine
Isoform oder eine bis dato unbekannte neue Untereinheit hindeuten würden.
4.2. 3. Untersuchung der Untereinheit C des V1 Komplexes
Obwohl die Untereinheit C dem katalytischen V1 Komplex des Holoenzyms zu zuordnen ist,
kommt sie im gereinigten V1 Komplex im Vergleich zum V1Vo Holoenzym allenfalls in
substöchiometrischen Mengen vor (Gräf et al., 1996; Svergun et al., 1998). Bei den
Untersuchungen zur Stimulierung der Mg-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes durch
Alkohole (4.4.1.) zeigte sich, dass die Untereinheit C bei einer Gelpermeationschromatographie in Gegenwart von 25% Methanol, 15% Ethanol, 10% Isopropanol oder 5% 1Propanol vom eigentlichen V1 Komplex abgetrennt werden kann (Abb. 19, nur für Methanol
gezeigt). Wird der V1 Komplex vor dem Auftragen auf die Gelfiltrationssäule mit dem
Alkohol gemischt, findet man die Untereinheit C in einem V1-Aggregat wieder, welches
deutlich größer als der ursprüngliche V1 Komplex ist und nahe dem Ausschlußvolumen
eluiert. Derselbe Effekt einer Aggregatbildung mit höherer Molekularmasse war auch bei
einer Saccharosedichtegradientenzentrifugation des V1 Komplexes in Gegenwart von
53
Ergebnisse
Methanol beobachten, wenn die Probe vorher auf 25% Methanol gebracht wurde. Das
Aggregat war dann bei einer wesentlich höheren Dichte wieder zu finden (Abb. 20).
Abb. 19: Einfluß von Methanol auf den V1 Komplex (Gelchromatographie). Auftrennung des V1 Komplexes
durch Gelchromatographie mit Methanol im Laufpuffer. 2,5 mg (25 µg/µl) V 1 Komplex wurde mit Methanol
versetzt [25%] und in einer Superdex 200 Säule (Pharmacia) 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8,1, 9,6 mM Mercaptoethanol, 25% Methanol) aufgetrennt (Fraktion I und II). Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE Gel von
unbehandeltem V1 Komplex (1); Fraktion I (2) und Fraktion II (3).
Abb. 20: Einfluß von Methanol auf den V1 Komplex (Dichtegradientenzentrifugation). Auftrennung des V1
Komplexes in einem methanolhaltigen linearen Saccharosedichtegradienten. 2,5 mg (25 µg/µl) V 1 Komplex
wurde mit Methanol versetzt [25%] und auf einem linearem Saccharosedichtegradienten (10%-50% Saccharose
in 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8,1, 9,6 mM -Mercaptoethanol, 25% Methanol) für 90 min bei 310.000
x g und 4°C (VTi 65.1, Beckman) zentrifugiert. Der Proteingehalt der 500 µl Fraktionen (1, hohe Dichte; 20,
niedrige Dichte) ist in µg angegeben. Inset, Silbergefärbte SDS-PAGE-Gele gleich großer Aliquots der
gepoolten Fraktionen 4-7 (a) und der gepoolten Fraktionen 12-15 (b).
54
Ergebnisse
Beim Auftragen des V1 Komplexes ohne vorherige Zugabe von Alkohol auf eine mit Alkohol
äquilibrierte Superdexsäule wurde die Untereinheit C ebenfalls vom V1 Komplex abgetrennt,
allerdings entstand dabei kein Aggregat (Abb. 21). Die Untereinheit C konnte in diesem Fall
wegen der starken Verdünnung in der Säule nicht als Peak detektiert werden. Offensichtlich
ist die Bildung von Aggregaten bei hohen verwendeten Proteinkonzentrationen (25 µg/µl)
eine Folge der Zugabe von Alkohol. Wird die Probe hingegen langsam auf den
entsprechenden Alkoholanteil bei gleichzeitiger Erniedrigung der Proteinkonzentration
gebracht, wie dies im letzten Experiment der Fall war, kommt es zu keiner Aggregatbildung,
die Untereinheit C wird allerdings auch hier abgelöst.
Die Aggregation des V1 Komplexes bei hohen Proteinkonzentrationen in Gegenwart von
Alkohol wurde auch durch die Streukurven aus der Röntgenkleinwinkelstreuung bestätigt
(Abb. 22). Die Streukurve des V1 Komplexes in methanolhaltigem Puffer (Abb. 22b) zeigte
im Gegensatz zur Kontrolle ohne Alkohol (Abb. 22a) im oberen Bereich einen geraden
Verlauf, was auf eine Aggregation des Proteins schließen lässt.
Abb. 21: Abtrennung der Untereinheit C vom V1 Komplex (Gelchromatographie). Die Auftrennung des V1
Komplexes (2,5 mg, 25 µg/µl) durch Gelchromatographie erfolgte in einer Superdex 200 Säule (Pharmacia;
Laufpuffer: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8,1, 9,6 mM -Mercaptoethanol, 25% Methanol). a)
Elutionsprofil. b) SDS-PAGE-Gel gefärbt mit Coomassie Blau (je 10 µg Protein). Bahn 1, Kontrolle, Bahn 2,
Peak aus a).
55
Ergebnisse
Abb. 22: Streukurve des V1 Komplexes im Röntgenkleinwinkelstreuungsexperiment. a) ohne und b) mit
25% Methanol im Puffer (Protein,10 mg/ml).
Um das Phänomen der Ablösung der C Untereinheit vom V1 Komplex genauer untersuchen
zu können, wurde diese, nachdem die sie codierende cDNA von Xiao-Fan Zhao in unserem
Labor erfolgreich kloniert und sequenziert worden war (Merzendorfer et al., 2000) mit Hilfe
des PET-Systems in E. coli überexprimiert (siehe 3.2.9.). Bei Reassoziationsexperimenten
wurde zunächst der V1 Komplex durch Mischen mit Methanol [25%] und anschließender
Gelchromatographie vollständig von der Untereinheit C befreit (Abb. 23a). Dieser C-freie
Komplex wurde nach Überführung in einen methanolfreien Puffer mit 10-fachem Überschuß
an rekombinanter Untereinheit C inkubiert. Bei der anschließenden Gelchromatographie
zeigte sich, dass das rekombinante Protein an den V1 Komplex assoziiert und nicht
gebundenes Protein später eluiert (Abb. 23c). In einer Kontrolle ließ sich die rekombinante
Untereinheit genau wie die native Untereinheit durch Zugabe von Methanol wieder entfernen
(Abb. 23d). Wurde der durch Alkohol von der C Untereinheit befreite Komplex für einen
Aktivitätstest eingesetzt, gab es keinen meßbaren Unterschied zu seinem C-haltigem
Ursprungskomplex, weder bezüglich der Mg-ATPase-Aktivität in 25% Methanol noch
bezüglich der Ca-ATPase-Aktivität in wässrigem Milieu (nicht gezeigt). Auch eine Zugabe
von einem Überschuß von rekombinanter Untereinheit C hatte praktisch keinen Einfluß auf
56
Ergebnisse
die Eigenschaften des V1 Komplexes. Daraus läßt sich schließen, dass die C Untereinheit
offensichtlich keinen Einfluß auf die Aktivität des V1 Komplexes hat.
Abb. 23: Reassoziation der rekombinanten Untereinheit C an den V 1 Komplex. Zu sehen sind jeweils die
Elutionsprofile der Gelfiltration auf der Superdex 200 Säule (Pharmacia) und die mit Coomassie gefärbten SDSPAGE Gele der entsprechenden Peakfraktionen. a) Entfernung der nativen Untereinheit C vom V 1 Komplex
durch 25% Methanol im Laufpuffer (150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8,1, 9,6 mM -Mercaptoethanol). b)
Der C-freie V1 Komplex (110 µl, 1 µg/µl) wurde im Eppendorfschüttler bei 4°C über Nacht im Laufpuffer
inkubiert. c) Der C-freie V1 Komplex (110 µl, 1 µg/µl) wurde mit 100 µg rekombinanter Untereinheit C im
Eppendorfschüttler bei 4°C über Nacht im Laufpuffer inkubiert. d) Der C-freie V1 Komplex (110 µl, 1 µg/µl)
wurde mit 100 µg rekombinanter Untereinheit C im Eppendorfschüttler bei 4°C über Nacht im Laufpuffer
inkubiert und vor der Gelfiltration mit 25% Methanol versetzt. Der Laufpuffer enthielt hier ebenfalls 25%
Methanol.
Es stellte sich nun die Frage, ob sich die Untereinheit C auch beim V1Vo Holoenzym mit
Hilfe von Methanol ablösen läßt. Aus diesem Grunde wurde in einem Experiment eine
Gelchromatographie des V1Vo Holoenzyms in Gegenwart von 25% Methanol durchgeführt,
die erhaltenen Fraktionen in einem SDS-PAGE Gel aufgetrennt und nach Western Blotting
mit Antiserum gegen die rekombinante Untereinheit C analysiert (Abb. 24). Dabei zeigte sich,
dass sich beim Holoenzym im Gegensatz zum V1 Komplex die Untereinheit C durch den
Alkohol nicht ablösen ließ. Überraschenderweise löste sich im Kontrollexperiment in
Gegenwart von 0,01% des von uns standardmäßig zur Reinigung des V1Vo Holoenzyms
verwendeten Detergenz C12E10 die Untereinheit C vom V1 Komplex ab. Diese schon durch
57
Ergebnisse
das milde Detergenz hervorgerufene Dissoziation deutet darauf hin, dass die Untereinheit C
im Holoenzym stärker geschützt ist als im V1 Komplex. Der Schutz könnte eine Folge der
Lage der Untereinheit C und/oder stärkerer Wechselwirkungen mit dem Holoenzym sein.
Abb. 24: Entfernung der Untereinheit C vom V1 Komplex und vom V1Vo Holoenzym.
a) Coomassiegefärbtes SDS-PAGE Gel. b) Westernblot eines SDS-PAGE Gels, immungefärbt mit polyklonalen
Antikörpern gegen die rekombinante Untereinheit C. St, Standardproteine. 1, 10 µg V 1 Komplex. 2, 10 µg V1
Komplex nach Gelfiltration mit 0,01% C12E10 im Laufpuffer. 3, 10 µg V1 Komplex nach Gelfiltration mit 0,01%
C12E10 und 25% Methanol im Laufpuffer. 4, 10 µg V 1Vo Holoenzym nach Gelfiltration mit 0,01% C12E10 im
Laufpuffer. 5, 10 µg V1Vo Holoenzym nach Gelfiltration mit 0,01% C12E10 und 25% Methanol im Laufpuffer.
58
Ergebnisse
4.2.4. Behandlung des V1 Komplexes mit chaotropen Ionen
Chaotrope Ionen, wie das hier verwendete Iodid, stören die Ordnung von Wasser und machen
es lipophiler (Hatefi & Hanstein, 1969). Dies führt unter anderem dazu, dass hydrophobe
Wechselwirkungen zwischen Proteinen abgeschwächt oder aufgehoben werden. Wird der V 1
Komplex mit 0,8 M KI 30 min auf Eis inkubiert, zerfällt er in zwei Subkomplexe, die bei
einer anschließenden Gelfiltration voneinander getrennt werden können (Subkomplexe I und
II, Abb. 25a). Der Subkomplex I besteht aus den Untereinheiten A, B, H, C, E und G und der
Subkomplex II aus A, B, E und G (Abb. 25b). Beide Subkomplexe wiesen keinerlei ATPaseAktivität auf (nicht gezeigt). Mit Hilfe von Eichproteinen (Thyroglobulin 669 kDa, Ferritin
440 kDa, Catalase 232 kDa und Aldolase 158 kDa) wurden die apparenten Molekularmassen
des V1 Komplexes und der Subkomplexe mittels Gelfiltration bestimmt (Abb. 26, Tab. 6). Für
den V1 Komplex ergab sich dabei eine Masse von 484 kDa, für Subkomplex I 275 kDa und
für Subkomplex II 190 kDa. Geht man von der mit Hilfe der Röntgenkleinwinkelstreuung
ermittelten Molekularmasse des V1 Komplexes von 550 kDa aus (Svergun et al., 1998), ergibt
sich ein Korrekturfaktor von 1,14, welcher bei Subkomplex I zu einer Molekularmasse von
314 kDa und bei Subkomplex II zu einer Masse von 217 kDa führt. Diese beiden Massen
entsprechen in etwa den aus der cDNA abgeleiteten Massen der Subkomplexe (Tab. 6), wenn
man auch die unterschiedliche Stöchiometrie von A und B in den beiden Subkomplexen
berücksichtigt.
Weiterhin ist bemerkenswert, dass die Untereinheiten D und F in keinem der beiden
Komplexe enthalten sind und auch nicht separat gefunden werden. Ersteres deutet auf eine
eher periphere Lokalisation dieser beiden Untereinheiten im V1 Komplex hin, letzteres dass
diese beiden Untereinheiten als einzelne und kleine Proteine bei der verwendeten Gelfiltration
bis unter die Nachweisgrenze verdünnt werden.
59
Ergebnisse
Abb. 25: Behandlung des V1 Komplexes mit chaotropen Ionen. Der V1 Komplex zerfällt bei Behandlung mit
0,8 M KI in zwei Subkomplexe. a) Elutionsprofil der beiden Subkomplexe I und II bei einer Gelfiltration
(Superdex 200, Pharmacia). b) Silbergefärbtes SDS-PAGE-Gel des unbehandelten V1 Komplexes V und der
beiden Subkomplexe I und II.
Molekularmassenbestimmung mittels Gelfiltration
0,45
0,4
0,35
Kav
0,3
0,25
y = -0,2622Ln(x) + 3,5342
0,2
0,15
0,1
0,05
0
100000
1000000
Molkularmassen (Da)
Abb. 26: Eichung der Superdex 200 Säule. Eichgerade der Proteine, Thyroglobulin 669 kDa, Ferritin 440 kDa,
Catalase 232 kDa und Aldolase 158 kDa für die Molekularmassenbestimmung mittels Gelfiltration.
Tab. 6: Die Molekularmassen des V1 Komplexes und seiner durch KI-Behandlung entstehenden
Subkomplexe. Die Massen wurden entweder mit Hilfe von Eichproteinen in der Gelfiltration oder als Summe
der aus den cDNAs abgeleiteten Molekularmassen berechnet, wobei die Stöchiometrie von A und B
berücksichtigt wurde.
0,102
Molekularmasse nach
Gelfiltration
484 kDa
Molekularmasse nach SDS-PAGE
(Summe der Untereinheiten)
A3B3HCDEFG = 550 kDa
Subkomplex I
0,25
275 kDa
AB2HCEG = 317 kDa
Subkomplex II
0,346
190 kDa
A2BEG = 231 kDa
60
Molekül
Kav
V1 Komplex
Ergebnisse
4.3. Der Vo Komplex
4.3.1. Reinigung des Vo Komplexes
Nachdem es gelungen war, die während der Häutung bzw. während der Hungerphasen von
der GCAM abdissoziierten V1 Untereinheiten als intakten V1 Komplex aus dem Cytosol zu
isolieren, stellte sich die Frage, ob die Vo Untereinheiten als ganzer Komplex in der Membran
erhalten bleiben. Würde dies der Fall sein, dann sollten sie sich bei der Solubilisierung mit
C12E10 ähnlich wie das V1Vo Holoenzym verhalten und genauso wie dieses isoliert werden
können. Dazu wurde zuerst die GCAM von hungernden Raupen, genau wie für das V1Vo
Holoenzym beschrieben, als Bande 2 angereichert, anschließend mit C12E10 solubilisiert und
der Überstand nach Zentrifugation bei 100000 x g über einen Saccharosedichtegradienten
aufgetrennt.
Dabei
zeigte
sich
schon
bei
der
Proteinverteilung
innerhalb
der
Gradientenfraktionen ein anderes Bild als bei fressenden Raupen (Abb. 27).
Proteinverteilung im Saccharosedichtegradienten
35
Prozentuale Proteinverteilung
30
25
20
15
10
5
0
1
2
3
4
5
6
Fraktionen
Abb. 27: Proteinverteilung im Saccharosedichtegradienten bei fressenden und hungernden Raupen.
Verglichen wird der prozentuale Proteingehalt der einzelnen Fraktionen (Fraktion 1 hohe, Fraktion 6 niedrige
Saccharosedichte) bezogen auf die gesamte Proteinmenge. Weiße Balken, fressende Raupen (n=3, Mittelwert 
S. D.) Schwarze Balken, hungernde Raupen (n=3, Mittelwert  S. D.).
61
Ergebnisse
Es kam zu einer Umverteilung des Proteins von Fraktionen mit hoher Saccharosedichte,
welche normalerweise das V1Vo-Holoenzym enthalten (Fraktion 1 und 2) zu Fraktionen mit
geringerer Dichte (Fraktion 3 und 4). Im folgenden wurde dann, mittels gelelektrophoretischer
Analyse der Fraktionen und Westernblot mit spezifischen Antikörpern für die Untereinheit d
und die Untereinheit e gezeigt, dass es sich bei dieser Verschiebung tatsächlich um die
Untereinheiten des Vo Komplexes handelt (Abb. 28). Damit lässt sich feststellen, dass bei
hungernden Raupen der Vo Komplex als solcher in der Membran erhalten bleibt und sich als
Ganzes solubilisieren und anreichern lässt, da einzelne Untereinheiten nicht soweit in den
Saccharosegradienten einwandern würden.
Abb. 28: Verteilung der Untereinheiten d und e im Saccharosedichtegradienten. Gezeigt sind immungefärbte Westernblots der Saccharosedichtegradientenfraktionen von fressenden (oben) und hungernden Raupen
(unten). Jede Fraktion wurde einmal mit einem Antiserum gegen das V 1Vo Holoenzym (jeweils linker
Blotstreifen), einmal mit dem Antiserum M40 gegen die Untereinheit d (jeweils mittlerer Blotstreifen) und
einmal mit dem monoklonalen Antikörper 224-3 gegen die Untereinheit e (jeweils rechter Blotstreifen)
immungefärbt.
Als nächster Reinigungsschritt wurde eine Anionenaustauscherchromatographie (Mono Q,
Pharmacia oder Hyper D Q, Biosepra) mit der Vo Komplex-haltigen Fraktion des
62
Ergebnisse
Saccharosedichtegradienten durchgeführt, wobei der Vo Komplex relativ breit zwischen 230
und 350 mM NaCl eluiert (Abb. 29).
Abb. 29: Reinigung des Vo Komplexes durch Anionenaustauscherchromatographie. a) Der Vo Komplex
eluiert bei der Anionenaustauscherchromatographie (Mono Q, Pharmacia) zwischen 230 mM und 350 mM NaCl
(Pfeile). b) Silbergefärbtes SDS-PAGE-Gel der Fraktionen der Anionenaustauscherchromatographie. Bahn 1 und
11, 5 µg Standardproteine. Bahn 2-10 und 12-19, je 10 µl der Fraktionen der Anionenaustauscherchromatographie. Die Pfeile markieren den Bereich von 230 mM bis 350 mm NaCl.
Die
entsprechenden
Fraktionen
wurden
gepoolt,
ankonzentriert
und
einer
Gelpermeationschromatographie (Superdex 200, Pharmacia) unterzogen. Der Vo Komplex
eluierte als ein einzelner Peak und enthielt alle bekannten, ihm zugeordneten Untereinheiten
a, d, e und c, welche entweder mit Antikörpern oder radioaktivem
14
C-DCCD identifiziert
wurden, sowie eine zusätzliche Bande mit einer apparenten Molekularmasse von 26 kDa
(Abb. 30). Später wurde von der doch sehr aufwendigen Präparation der angereicherten
GCAM, genau wie bei der Reinigung des V1Vo Holoenzyms, zur Solubilisierung eines
Rohhomogenats aus Mitteldärmen von hungernden Tieren übergegangen, wobei als
zusätzlicher Schritt zur Erhöhung des Anteils an Vo Komplexen in der Membran die nicht
abdissoziierten V1-Untereinheiten mit Hilfe von Kaliumiodid als chaotropem Ion abgelöst
wurden. Ausserdem wurde ebenfalls, wie bei der Reinigung des Holoenzyms, der
63
Ergebnisse
Saccharosedichtegradient mit 200 mM KCl versetzt, um lose assoziierte Proteine zu entfernen
und die Untereinheit a zu stabilisieren.
Abb. 30: Reinigung des Vo Komplexes mittels Gelpermeationschromatographie. a) Elutionsprofil des Vo
Komplexes aus angereicherter GCAM mit 200 mM KCl im Saccharosegradienten von einer Superdex 200-Säule
(Pharmacia). Der grau unterlegte Bereich entspricht dem V o Komplex. b) SDS-PAGE-Gel dieses Vo Komplexes.
Bahn 1, 1 µg Standardproteine, Silberfärbung. Bahn 2, 1 µg Vo Komplex; Silberfärbung. Bahn 3, 5 µg Vo
Komplex, Autoradiographie mit radioaktiven 14C-DCCD, das spezifisch an die c Untereinheit bindet. Bahn 4, 1
µg Vo Komplex, Immunfärbung mit dem monoklonalen Antikörper 224-3 gegen die e Untereinheit. Bahn 5, 5 µg
Vo Komplex, Immunfärbung mit Antiserum M40 gegen die d Untereinheit. Bahn 6, 5 µg Vo Komplex,
Immunfärbung mit Serum gegen die 116 kDa Untereinheit a von chromaffinen Granula aus Rind (Gillespie et
al., 1991).
64
Ergebnisse
4.3.2. Identifizierung der 26 kDa Bande des Vo Komplexes
Zur Identifizierung der unbekannten 26 kDa Bande im gereinigten Vo Komplex wurde diese
nach SDS-PAGE mit einem Westernblots auf eine PVDF-Membran transferiert. Diese
Blotmembran wurde mit Coomassie Blau angefärbt, wobei als Besonderheit anzumerken ist,
dass sich die 26 kDa-Bande wie auch die Untereinheit c nicht anfärben ließen, sondern im
Gegenteil die Blotmembran an dieser Stelle weiß blieb (Abb. 31). Die 26 kDa-Bande wurde
ausgeschnitten und von Frau Dr. Schedding (Universität Münster) N-terminal ansequenziert.
Abb. 31: Blot der 26 kDa Bande aus dem V o Komplex. Der Vo Komplex wurde nach SDS-PAGE auf PVDFMembran geblottet und mit Coomassie Blau angefärbt.
Dabei wurde die Aminosäuresequenz [A R S] E N [P F] [I V] Y G P ermittelt, wobei die
Aminosäuren in Klammern eine gleich hohe Wahrscheinlichkeit haben. Bei einer BLASTSuche fand sich diese Teilsequenz ausschließlich als N-terminale Sequenz für c
Untereinheiten von V-ATPasen wieder. Die Variante M A E N P I Y G P um das N-terminale
Methionin erweitert entspricht genau dem N-Terminus der Untereinheit c von M. sexta (Abb.
32). Alle bisher gefundenen Isoformen c´´ unterscheiden sich von ihren c und c´ Varianten
durch die Verlängerung der N-Termini (Abb. 32), deshalb kann man mit hoher Sicherheit
ausschließen, dass es sich bei der 26 kDa Bande um die c´´ Isoform von M. sexta handelt. Da
die Untereinheit c typischerweise zur Bildung von Aggregaten neigt (Lepier et al., 1996),
handelt es sich bei der 26 kDa Bande sehr wahrscheinlich um ein Dimer von c.
65
Ergebnisse
Abb. 32: Sequenzvergleich Untereinheit c bzw. die n-terminale Sequenz der 26 kDa Bande mit anderen c
Untereinheiten. Die Variante A E N P I Y G P der Teilsequenz die bei der n-terminalen Sequenzierung der 26
kDa Bande erhalten wurde, deckt sich mit dem n-Terminus der Untereinheit c aus M. sexta. Hier wurde diese
Sequenz mit den N-Termini von V-ATPase Untereinheiten c aus anderen Organismen verglichen, für die neben
der Isoform c auch eine Isoform c´ oder c´´ bekannt ist (S. cerevisiae, C. elegans und H. sapiens).
4.3.3. Markierung der plecomakrolidbindenden Untereinheit der V-ATPase
Plecomakrolide sind seit längerem als sehr spezifische Inhibitoren von V-ATPasen bekannt
(Bowman et al., 1988; Dröse et al., 1993), insbesondere die Concanamycine und
Bafilomycine (Abb. 41). Die Zusammenarbeit der Arbeitsgruppen von Prof. Altendorf in
Osnabrück und von Prof. Zeeck in Göttingen führte zu einer Analyse der für die Hemmung
entscheidenden Komponenten der Plecomakrolide (Bindseil & Zeeck, 1994; Boddien, 1995;
Dröse et al., 1997; Dröse et al., 2001). Im Rahmen dieser Zusammenarbeit gelang es Dr.
Gudrun Ingenhorst (Göttingen), ein semisynthetisches Derivat des Concanamycin A
herzustellen (Ingenhorst, 2000). Dieses Derivat, das im folgenden als J-Concanolid A
bezeichnete
9-O-[p-(Trifluoroethyldiazirinyl)-benzoyl]-21,23-dideoxy-23-epi-[125I]Iodo-
concanolid A, besitzt gegenüber der Ausgangssubstanz zwei wichtige Modifikationen. Zum
einen hat es eine UV-aktivierbare Diazirinyl-Gruppe an der Position C9, zum anderen ein
125
Jod an Position C23 des Hemiketalrings (Abb. 33). Mit Hilfe der Diazirinyl-Gruppe, die
nach UV-Belichtung ein hochreaktives Carben bildet, welches sofort eine kovalente Bindung
mit dem in unmittelbarer Nähe zur Verfügung stehenden Partner eingeht. Das
125
I als
radioaktiver Marker sollte dann die mit dem Makrolid interagierende Untereinheit der VATPase in der Autoradiographie nach SDS-PAGE sichtbar machen.
66
Ergebnisse
Abb. 33: Struktur des 9-O-[p-(Trifluoroethyldiazirinyl)-benzoyl]-21,23-dideoxy-23-epi-[125I]Iodoconcanolid A. Die gegenüber dem Ausgangsstoff Concanamycin A veränderten Positionen sind durch Nummern
gekennzeichnet und die Reaktion bei UV-Belichtung dargestellt.
Zunächst wurde die Wirkung des J-Concanolids A auf die Aktivität der gereinigten V-ATPase
genauer untersucht und mit der Ausgangssubstanz Concanamycin A verglichen (Abb. 34),
wobei eine Probe mit nicht radioaktivem Jod verwendet wurde. Bei diesen Versuchen zeigte
es sich, wie entscheidend der richtige Umgang mit den Plecomakroliden für die Messung
reproduzierbarer Werte ist. Die Plecomakrolide erwiesen sich als äußerst empfindlich
gegenüber "Gefrier-Auftau-Zyklen" bzw. Lagerung in gelöster Form im Kühlschrank bei 4°C.
Die besten Ergebnisse wurden mit frisch in DMSO gelösten Substanzen erzielt, deren echte
Konzentration mit Hilfe ihres Extinktionskoeffizienten spektralphotometrisch bestimmt
wurde. Die Proben wurden anschließend entweder direkt verwendet oder aliquotiert, bei
-70°C gelagert und nur einmal direkt vor dem jeweiligen Versuch aufgetaut. Für das JConcanolid A ergab sich ein IC50 von 10-20 µM, welcher deutlich schlechter war als für das
parallel getestete Concanamycin A (IC50 10 nM), jedoch durchaus als noch ausreichend
spezifisch zu betrachten ist.
67
Ergebnisse
Abb. 34: Hemmung des V1Vo Holoenzyms durch Plecomakrolide. Jede der Kurven ist das Ergebnis eines
Aktivitätstests mit einer unabhängigen V1Vo Holoenzym Präparation, wobei jeder Meßwert dem Mittelwert von
3 Versuchsansätzen entspricht. Die spezifische Aktivität des V1Vo Holoenzyms war im Standardansatz ohne
Inhibitor 2,9 0,5 U/mg (S. D.). Concanamycin (▲), J-Concanolid A (■).
Abb. 35: Konzentrationsabhängige Photoaffinitätsmarkierung des gereinigten V 1Vo Holoenzyms mit JConcanolid A. Tricine SDS-PAGE ( Sammelgel 4% T, 3% C; Distanzgel 10% T, 3% C; Trenngel 16,5% T, 3%
C, Schägger & Jagow 1987). Bahn 1 mit Coomassie gefärbt, Bahn 2-9 Autoradiogramm des Gels nach 48 h
Exposition auf einem Phosphoscreen. Es wurden je 20 µg V 1Vo Holoenzym mit 100 µM (Bahn 2,3), 30 µM
(Bahn 4), 10 µM (Bahn 5), 3 µM (Bahn 6), 1 µM (Bahn 7), 0,3 µM (Bahn 8) und 0,1 µM (Bahn 9) J-Concanolid
A für 1 h auf Eis inkubiert und anschließend für 5 min bei 366 nm bestrahlt (ausser Bahn 2, Dunkelkontrolle).
Die Markierung der gereinigten V-ATPase wurde wie unter 3.1.13. beschrieben durchgeführt.
In der Autoradiographie ist deutlich zu erkennen, dass nur die Untereinheit c und selbst bei
der hohen Konzentration von 100 µM J-Concanolid A keine der anderen Untereinheiten
68
Ergebnisse
markiert wurde (Abb. 35). Auch bei der unbelichteten Probe wurde keine der Untereinheiten
markiert; die Radioaktivität wanderte unspezifisch ins Gel ein und verteilte sich über die
ganze Bahn 2. Bei der belichteten Probe mit 100 µM J-Concanolid A ohne Protein verblieb
die gesamte Sonde direkt in der Auftragstasche des Geles, das gleiche geschah auch mit dem
nicht an Protein gebundenen Anteil des J-Concanolid A in den Ansätzen mit Protein (nicht
gezeigt).
Die mit Coomassie Blau gefärbten Banden der Untereinheit c wurden im Anschluß an die
Autoradiographie aus dem Gel ausgeschnitten und die gebundene Radioaktivität in einem
Gamma-Counter gemessen (Abb. 36). Dabei ergab sich eine eindeutige Korrelation der an die
Untereinheit c gebundenen Radioaktivität mit der bei gleichen eingesetzten Konzentrationen
an J-Concanolid A gemessenen Hemmung der V-ATPase Aktivität.
Abb. 36: Die relative Hemmung des V1Vo Holoenzyms im Vergleich mit der gemessenen Radioaktivität.
Die Banden der Untereinheit c aus dem SDS-Gel (Abb. 35) wurden ausgeschnitten und ihre Radioaktivität in
einem Gamma-Counter bestimmt (68,3 cpm (100 µM-Bande), 69,9 cpm (30 µM-Bande), 63,6 cpm ( 10 µMBande), 59,1 cpm (3 µM-Bande), 57,4 cpm (1 µM-Bande), 55,2 cpm (0.3 µM-Bande), 56,6 cpm (0.1 µM-Bande)
und 51,5 cpm (0 µM-Bande). Die prozentuale Hemmung der V-ATPase durch das J-Concanolid A wurde aus
dem parallel durchgeführten Test mit nicht radioaktivem J-Concanolid A entnommen.
Um die Identität der als Untereinheit c bezeichneten Bande zweifelsfrei zu sichern, wurden in
Zusammenarbeit mit Simone König (Münster) MALDI-MS-Analysen der ausgeschnittenen
SDS-Gel Banden durchgeführt. Die nach einem chymotryptischen Verdau erhaltenen
Fragmente zeigen zum einen eindeutig, dass es sich bei der ausgeschnittenen Bande
tatsächlich um die Untereinheit c handelt und zum andern, dass durch die kovalente Bindung
des J-Concanolid A an die Untereinheit neue zusätzliche Fragmente entstehen (Abb. 37, Abb.
69
Ergebnisse
38). Sechs dieser Fragmente konnten ihren möglichen Peptiden zugeordnet werden. Es
handelt sich um die Fragmente der Aminosäuren 8-22, 12-29 und 85-87 deren Masse um 842
kDa erhöht wurde und Fragmente der Aminosäuren 1-7, 85-87 und 138-151 deren Masse um
972 kDa erhöht wurde. In Abb. 38 ist ein Ausschnitt aus dem Massenspektrum der mit JConcanolid A modifizierten Untereinheit c zusehen, der drei dieser Fragmente enthält.
Abb. 37: MALDI-MS-Karte der Untereinheit c nach einem Chymotrypsinverdau. Die mit J-Concanolid A
markierte Proteinbande (oben) und die entsprechende Bande ohne J-Concanolid A Behandlung (unten) wurden
aus einem SDS-GEL ausgeschnitten, mit Chymotrypsin verdaut und eine MALDI-MS durchgeführt. Den
identifizierten Massen wurden jeweils die entsprechenden chymotryptischen Fragmente mit Angabe der ersten
und letzten Aminosäure zugeordnet. Die angegebenen Fragmente sind in beiden Spektren zu finden. Bei der mit
J-Concanolid A behandelten Probe wurden einige zusätzliche neue Massen gefunden, die wahrscheinlich auf
eine Modifizierung durch J-Concanolid A zurückzuführen sind. Bei diesen Massen handelt es sich um die
Fragmente der Aminosäuren 8-22, 12-29 und 85-87 deren Masse um 842 kDa erhöht wurde und Fragmente der
Aminosäuren 1-7, 85-87 und 138-151 deren Masse um 972 kDa erhöht wurde.
70
Ergebnisse
Abb. 38: Bei Behandlung der Untereinheit c mit J-Concanolid A entstehen Fragmente mit erhöhter
Masse. Ein Ausschnitt eines Massenspektrums der Untereinheit c, welche mit 10 µM J-Concanolid A behandelt
wurde. Die Pfeile weisen auf drei Fragmente hin die möglicherweise durch J-Concanolid A modifiziert wurden.
a) Mögliches Fragment Aminosäuren 8-22 plus 842 kDa (Sonde, die HJ verloren hat). b) Mögliches Fragment
Aminosäuren 12-29 plus 842 kDa. c) Mögliches Fragment Aminosäuren 138-151 plus 972 kDa.
Um die Spezifität der Bindung von J-Concanolid A an die Untereinheit c zu überprüfen,
wurde versucht, die Markierung durch Vorinkubation Concanamycin A zu unterbinden (Abb.
39). 1 µM Concanamycin A führte schon zu einer deutlich schwächeren Markierung der
Untereinheit c, und bei Konzentrationen von 10 µm, 100 µm und 300 µM war überhaupt
keine Markierung mehr zu sehen. Concanamycin A konkurriert also mit seinem Derivat um
die gleiche Bindungsstelle in der Untereinheit c der V-ATPase.
Über die bisher geschilderten Markierungsversuche hinaus wurden auch solche mit GCAMVesikeln und mit gereinigtem Vo Komplex durchgeführt (Abb. 40). Auch bei der
membrangebundenen V-ATPase, bei der sich alle Untereinheiten in ihrer natürlichen
Lipidumgebung befinden, wurde ebenfalls nur die Untereinheit c markiert. Genauso wurde
beim gereinigten Vo Komplex ebenfalls nur die Untereinheit c markiert, wobei die für den Vo
Komplex typische breite Bande der Untereinheit c im SDS-Gel auffällt.
71
Ergebnisse
Abb. 39: Die J-Concanolid A-Markierung der Untereinheit c kann durch Concanamycin A verhindert
werden. Autoradiogramm eines Tricine SDS-PAGE Gels ( Sammelgel 4% T, 3% C; Distanzgel 10% T, 3% C;
Trenngel 16,5% T, 3% C, Schägger & Jagow 1987) nach 48 h Exposition auf einem Phosphoscreen. Es wurden
jeweils 20 µg gereinigtes V1Vo Holoenzym mit 10 µM J-Concanolid A inkubiert (Bahn 1-5). Vorinkubation der
Proben mit 1 µM (Bahn 2), 10 µM(Bahn 3), 100 µM (Bahn 4) und 300 µM (Bahn 5) Concanamycin A.
Abb. 40: J-Concanolid markiert die Untereinheit c im membrangebundenem V 1Vo Holoenzym und im
gereinigtem Vo Komplex. SDS-PAGE Gel (10-15% T, 3,3% C) mit Coomassie gefärbt (Bahn 1, 3 und 5).
Autoradiogramme des Gels nach 72 h Exposition auf einem Phosphoscreen (Bahn 2, 4 und 6). Bahn 1,2, 20 µg
V1Vo Holoenzym, Bahn 3,4 20 µg gereinigter Vo Komplex, Bahn 5,6, 20 µg gereinigte GCAM. Alle Proben
wurden mit 0,1 µM J-Concanolid A inkubiert und für 3 min mit UV-Licht (366 nm) behandelt.
72
Ergebnisse
4.3.4. Die Wirkung neuer Makrolide
Nun blieb noch die Frage zu beantworten, ob es sich bei der Bindestelle in der Untereinheit c
nur um die Concanamycin A Bindestelle, um die universelle Plecomakrolidbindestelle oder
sogar um die Bindestelle für eine noch größere Gruppe von Makrolidantibiotika handelt.
Hierzu wurden zunächst die bekannten Plecomakrolide Bafilomycin A1 und Bafilomycin B1
sowie eine Reihe neuerer Makrolide (Apicularen, Archazolid, Salicylihalamid und
Cruentaren) auf ihre hemmende Wirkung auf das gereinigte V1Vo Holoenzym getestet (Abb.
41, Abb. 42). Dabei zeigte sich, dass Bafilomycin A1 und B1 (IC50 10-20 nM) in ihrer
Hemmwirkung auf die V-ATPase im Gegensatz zu vielen Literaturdaten keine Unterschiede
im Vergleich zu Concanamycin A (IC50 10 nM) aufweisen.
Abb. 41: Die Strukturen der verwendeten Makrolide. Die Struktur von Cruentaren C33H51NO8 ist bis jetzt
noch nicht gelöst.
73
Ergebnisse
Abb. 42: Die Hemmung des gereinigten V1Vo Holoenzyms durch Makrolide. Alle Substanzen wurden
parallel in einem Versuchsansatz und mit einer V1Vo Holoenzym Präparation getestet. Jeder Wert entspricht dem
Mittel aus 3 Versuchsansätzen.
Auch für Apikularen, Archazolid und Salicylihalamid ergaben sich gleich niedrige IC 50 Werte
von 10-20 nM, lediglich Cruentaren und J-Concanolid A (Abb. 42) wichen mit ihren relativ
hohen IC50 Werten von 60 µM bzw. 10-20 µM etwas davon ab. Im Anschluß an die
Charakterisierung der Hemmeigenschaften wurden die Substanzen in einem Kompetitionsversuch auf ihre Fähigkeit, mit J-Concanolid A um die Bindestelle in der Untereinheit c zu
konkurrieren, getestet (Abb. 43). Als weiterer Inhibitor der V-ATPase, von dem die Bindung
an die Untereinheit c bekannt ist, wurde in diesem Versuch auch noch DCCD eingesetzt. Die
beiden Bafilomycine und das Archazolid konnten die Markierung der Untereinheit c in
gleicher Weise verhindern wie Concanamycin A. Die anderen Makrolide, Apikularen,
Salicylihalamid und Cruentaren, waren nicht in der Lage, mit dem J-Concanolid A um die
Bindestelle zu konkurrieren, was eventuell auf eine andere Bindungsstelle bzw.
Wirkungsweise der Substanzen schließen läßt. Auch die Vorinkubation des V1Vo
Holoenzyms mit DCCD, welches kovalent an das Glutamat 139 bindet, bewirkte keine
Verdrängung der Markierung.
74
Ergebnisse
Abb. 43: Kompetitionsversuche mit anderen Makroliden und DCCD. Tricine SDS-PAGE Gel (Sammelgel
4% T, 3% C; Distanzgel 10% T, 3% C; Trenngel 16,5% T, 3% C, Schägger & Jagow 1987). Bahn 1, Coomassie
Blau gefärbt. Bahn 2-16, Autoradiogramm des Gels nach 48 h Exposition auf einem Phosphoscreen. Es wurden
jeweils 20 µg gereinigtes V1Vo Holoenzym mit der entsprechenden Substanz vorinkubiert und anschließend mit
10 µM J-Concanolid A versetzt. Bahn 1, 20 µg V1Vo Holoenzym ; Bahn 2/3, 100/10 µM Bafilomycin A1; Bahn
4/11, Kontrolle ohne zusätzliche Substanz; Bahn 5/6, 100/10 µM Bafilomycin B1; Bahn 7/8, 100/10 µM
Apicularen; Bahn 9/10, 100/10 µM Archazolid; Bahn 12/13, 100/10 µM Salicylihalamid; Bahn 14, 100 µM
Cruentaren; Bahn 15/16, 100/10 µM DCCD.
75
Ergebnisse
4.4. Funktion und Regulation des V1Vo Holoenzyms und der V1 ATPase
4.4.1. Einfluß von Alkoholen und Detergenzien auf die Mg-ATPase-Aktivität des V1
Komplexes
Aus der Arbeit von Gräf et al. (1996) war einiges über die enzymatischen Eigenschaften des
V1 Komplexes bekannt wie z. B., die Stimulierung seiner Mg-ATPase-Aktivität durch
Methanol, ähnlich wie bei den F1 Komplexen aus Bakterien, Chloroplasten und
Mitochondrien (Hicks et al., 1986; Sakurai et al., 1981; Schuster, 1979; Ortiz Flores et al.,
1982). Die Wirkungsweise des Methanols wird zum einen auf eine Konformationsänderung
der Komplexe in der durch die Lösungsmittel bedingten hydrophoberen und somit
membranähnlicheren Umgebung und zum anderen durch die mögliche Freisetzung von
festgebundenem ADP erklärt (Anthon & Jagendorf, 1983). Eine hydrophobere Umgebung
sollten auch Detergenzien herstellen, aber weder C12E10 (0,03% und 0,003%) und
Octylglycosid (1,5% und 0,15%) konnten eine Mg-abhängige ATPase-Aktivität des V1
Komplexes induzieren (nicht gezeigt). In der Anwesenheit von Alkoholen zeigte sich jedoch
für jeden der verwendeten Alkohole ein Optimum für die Aktivierung der Mg-ATPase, das
bei 1-Propanol bei 5%, bei Isopropanol bei 10-15%, bei Ethanol bei 15% und bei Methanol
bei 25% lag (Abb. 44). Bei einer Gelchromatographie (Superdex 200, Pharmacia) zeigte sich
für alle bei ihrer Optimumskonzentration verwendeten Alkohole, das bereits beschriebene
Phänomen der Aggregation und des Ablösens der C Untereinheit.
Relative Aktivität
Methanol (n=5)
140
Ethanol (n=3)
120
Isopropanol (n=2)
100
1-Propanol (n=3)
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Alkoholanteil in % (v/v)
Abb. 44: Einfluß von Alkoholen auf die Mg-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes. Die Aktivitäten wurden
auf den Wert bei 25% Methanol normiert, welcher bei jedem Versuch als Kontrolle mitgeführt wurde
(Mittelwert  S.D.).
76
Ergebnisse
In einem weiteren Versuch wurde überprüft, ob die durch Methanol induzierte Mg-ATPaseAktivität über die Zeit linear verläuft. Dazu wurde die Aktivität des V1 Komplexes in
Gegenwart von 15%, 20% und 25% Methanol nach 1, 2 und 3 min bestimmt. Wie Abb. 45
zeigt, war die Hydrolyserate von ATP zeitunabhängig für die einzelnen Alkoholkonzentrationen gleich groß.
Da sich eine Methanolkonzentration von 25% als optimal erwies und es für diese Bedingung
bereits einige Daten gab, wurde diese standardmäßig verwendet, um die Mg-ATPase
Eigenschaften des V1 Komplexes zu untersuchen. Weiterhin wurde, um eine einheitliche
Population von V1 Komplexen ohne verschieden große Mengen an assoziierter C Untereinheit
als
Ausgangsmaterial
zur
Verfügung
zu
haben,
der
V1
Komplex
durch
eine
Gelchromatographie mit 25% Methanol im Laufpuffer von Resten der C Untereinheit befreit
U/mg
und anschließend wieder in lösungsmittelfreien Puffer gebracht.
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1 min
2 min
3min
15
20
25
Methanolanteil (%)
Abb. 45: Die methanolabhängige Mg-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes hat einen linearen zeitlichen
Verlauf. Gezeigt ist die ATPase-Aktivität in Gegenwart von 15%, 20% und 25% Methanol nach 1, 2 und 3 min
eines typischen Experimentes.
77
Ergebnisse
4.4.2. Einfluß von Methanol auf das V1Vo Holoenzym
Die Wirkung von Methanol auf die Mg-ATPase-Aktivität wurde auch für das V1Vo
Holoenzym untersucht, wobei sich zeigte, dass es bei einer Konzentration von 20% zu einer
20-40%igen Stimulierung durch den Alkohol kommt (Abb. 46). Als naheliegende Ursache für
diese Erhöhung der Aktivität wurde ein Ablösen von V1 Komplexen vom V1Vo Holoenzyms
durch Methanol vermutet, welche dann einen Beitrag zur Gesamtaktivität leisten. Diese
Hypothese wurde durch eine Gelchromatographie (Superdex 200, Pharmacia) des V1Vo
Holoenzyms in Gegenwart von 20% Methanol überprüft und widerlegt (siehe Abb. 24).
Wahrscheinlich ist die Erhöhung der Aktivität auf die durch Mg-ATP-Hydrolyse bedingte
Dissoziation des Holoenzyms in V1 und Vo Komplex zurückzuführen. Betrachtet man den
Verlauf der Phosphatproduktion durch das Holoenzym ohne Methanol, so verringert sie sich
mit zunehmender Inkubationszeit, denn die abdissoziierten V1 Komplexe haben keinerlei MgATPase-Aktivität. Dagegen nimmt die Phosphatproduktion in Gegenwart von Methanol
deutlich weniger ab, da sich hier die freien V1 Komplexe mit ihrer durch Methanol
induzierten Mg-ATPase-Aktivität an der Gesamtaktivität beteiligen.
a)
b)
18
16
14
3
2,5
12
10
8
6
nmol Pi
Aktivität (U/mg)
3,5
2
1,5
1
0 % Methanol
4
2
0
0,5
0
0
5
10
15
Methanolanteil (%)
20
25
20 % Methanol
0
1
2
3
Zeit (min)
4
5
Abb. 46: Stimulierung der Mg-ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms durch Methanol. (a) Die Aktivität
des V1Vo Holoenzyms wurde in Gegenwart von 0% - 25% Methanol bestimmt (2 µg Protein, 2 min
Inkubationszeit, n=3, Mittelwerte  S. D.). (b) Vergleich der Hydrolyse Aktivität ohne und mit 20% Methanol
über die Zeit (2 µg Protein).
78
Ergebnisse
4.4.3. Abhängigkeit der Ca-abhängigen Hydrolyse-Aktivität des V1 Komplexes vom
verwendeten Nukleosidtriphosphat
Für den V1 Komplex ist eine Ca-ATPase-Aktivität beschrieben, die mit zunehmender
Reaktionszeit abnimmt, wobei eine Produkthemmung durch ADP vermutet wurde (Gräf et al.,
1996 und Abb. 47). Wird hingegen Ca-GTP als Substrat angeboten, sinkt zwar die
Hydrolyserate um ca. 1/3 ab, ändert sich aber mit zunehmender Reaktionszeit nicht. Eine
direkte Überprüfung, ob ADP als Endprodukt den V1 Komplex hemmt, konnte in diesem Fall
nicht mit Hilfe eines regenerierenden Systems aus Pyruvatkinase und Phosphoenolpyruvat
durchgeführt werden, da die Pyruvatkinase ein Mg2+-abhängiges Enzym ist und schon Mg2+Konzentrationen von 0,1 mM die Ca2+-Aktivität des V1 Komplexes inhibieren. Alternativ
wurde Kreatinkinase und Phosphokreatin als Mg2+-unabhängiges regenerierendes System
getestet, dabei zeigte sich jedoch, dass auch dies nicht geeignet war, da Phosphokreatin sehr
säureinstabil ist und bei der Quantifizierung des freigesetzten Pi mit saurem Molybdat zerfällt.
Deshalb wurde der Einfluß von ADP auf die Aktivität des V1 Komplexes durch
Vorinkubation mit verschiedenen ADP Konzentrationen untersucht.
25
Ca-ATP 4 µg Protein
Ca-ATP 8 µg Protein
Ca-GTP 4 µg Protein
Ca-GTP 8 µg Protein
nmol Pi
20
15
10
5
0
0
5
10
15
Zeit (min)
Abb. 47: Die Hydrolyse von Ca-ATP und Ca-GTP durch den V1 Komplex. Die Hydrolyse-Aktivität von 4
µg und 8 µg V1 Komplex für Ca-ATP und Ca-GTP nach 0,25, 0,5, 1, 3, 5, 10 und 15 min wurde gemessen. Da
mehr als 25 nmol produziertes Pi den Meßbereich des verwendeten Tests überschreiten konnten die 10 min
Werte für 8 mg Protein und die 15 min Werte für 4 und 8 µg Protein mit Ca-GTP nicht ausgewertet werden.
79
Ergebnisse
4.4.4. Einfluß von Ca-ADP, Mg-ADP und Pi auf die Hydrolyse von ATP durch das V1Vo
Holoenzym und den V1 Komplex
Die bisherigen Versuche zur Hydrolyse-Aktivität des V1 Komplexes legen eine
Endprodukthemmung der Ca-ATPase-Aktivität nahe, welche unter Einbeziehung des nach der
neuen Methode präparierten V1Vo Holoenzyms systematisch untersucht werden sollte. Von
diesem war schon durch die Versuche von Schweikl et al. (1989) bekannt, dass die MgAktivitäten des solubilisierten V1Vo Holoenzyms eine starke Endprodukthemmung aufweisen,
die durch ein ADP-regenerierendes System aus Pyruvatkinase und Phosphoenolpyruvat
teilweise aufgehoben werden kann. Aus diesem Grund wurde zunächst die Aktivität des
gereinigten V1Vo Holoenzyms mit und ohne Regeneration von ADP getestet. Es zeigte sich
im wesentlichen das gleiche Ergebnis wie bei Schweikl (1988), wobei die Inaktivierung des
Holoenzyms bei kleinen Proteinmengen und kurzen Inkubationszeiten nicht ganz so schnell
verlief. Ab einer Konzentration von ca. 50 µM produziertem ADP war allerdings ebenfalls
eine deutliche Hemmung zu beobachten (Abb. 48).
a)
b)
14
30
12
25
8
0 U/ml PK
3 U/ml PK
10 U/ml PK
30 U/ml PK
6
4
2
0
nmol Pi
nmol Pi
10
20
15
0 U/ml PK
3 U/ml PK
10 U/ml PK
30 U/ml PK
10
5
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Zeit (min)
0
5
10
15
Zeit (min)
Abb. 48: Einfluß eines ADP-regenerierenden Systems. Es wurde die Mg-ATPase-Aktivität von 4 µg/160 µl
(a) und 1 µg/160 µl (b) gereinigtem V1Vo Holoenzym in Gegenwart von 0, 3, 10 und 30 U/ml Pyruvatkinase und
10 mM Phosphoenolpyruvat (PEP) bestimmt.
Um unterscheiden zu können, ob schon die Anwesenheit der Hydrolyseendprodukte ADP
oder Pi einen Einfluß auf die Aktivität haben oder ob der Vorgang der Hydrolyse selbst zu
einer Inaktivierung notwendig ist, wurden einige Experimente durchgeführt, bei denen der V1
Komplex und das V1Vo Holoenzym
mit ADP oder Pi und jeweils Ca2+ oder Mg2+
vorinkubiert wurde.
Beim V1 Komplex war die Mg-abhängige Aktivität in Gegenwart von 25% Methanol
vollkommen unabhängig von der vorgelegten ADP- oder Pi Konzentration, die in mehreren
Versuchen zwischen 0 und 30 µM bzw. 0 und 50 µM variiert wurde (Abb. 49, Abb. 52). Bei
80
Ergebnisse
den Vorversuchen für die Ca-ATPase-Aktivität zeigte sich dagegen schon eine deutliche
Hemmung bei der Verwendung von 30 µM ADP. In einem weiteren Test wurde dann die
ADP Konzentration auf bis zu 1 mM erhöht, was eine Hemmung der Anfangs-Hydrolyserate
der Ca-Aktivität um mehr als 70% zur Folge hatte (Abb. 49). Eine Vorinkubation mit Pi hatte
keine Auswirkung auf die Aktivität (Abb. 52).
10
0 µM ADP
1 µM ADP
3 µM ADP
10 µM ADP
30 µM ADP
nmol Pi
8
6
4
2
0
0
2
3
Zeit (min)
4
5
0 µM ADP
30 µM ADP
100 µM ADP
300 µM ADP
1000 µM ADP
10
8
nmol Pi
1
6
4
2
0
0
1
2
3
Zeit (min)
4
5
Abb. 49: Einfluß von ADP auf die Aktivität des V1 Komplexes. Methanol induzierte Mg-ATPase-Aktivität
des V1 Komplexes (1,5 µg Protein/160 µl) nach 5 min Vorinkubation mit den angegebenen Mg-ADPKonzentrationen (oben). Ca-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes (4 µg Protein/160 µl) nach 5 min
Vorinkubation mit den angegebenen Ca-ADP-Konzentrationen (unten). Die Messung erfolgte in je zwei
parallelen Ansätzen, wobei nach den entsprechenden Zeiten je 160 µl Aliquots zur Phosphatbestimmung
entnommen wurden.
Die Mg- und Ca-ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms wurde ebenfalls nicht durch
Vorinkubation mit Pi beeinflußt (Abb. 53). Auch die Ca-ATP-Hydrolyserate blieb weitgehend
unbeeinflußt von der vorgelegten Menge an Ca-ATP (Abb. 50) Dagegen zeigte hier eine
Vorinkubation mit Mg-ADP eine deutliche Hemmung (Abb. 50), die sich vor allem bei
kurzen Inkubationszeiten andeutete. Deshalb wurde der Einfluß von Mg-ADP auf die
Hydrolyse bei einer Inkubationszeit von 15 s untersucht (Abb. 51). Die Hemmung war
konzentrationsabhängig, wobei 100 µM vorgelegtes Mg-ADP zu 85% inhibierte.
81
Ergebnisse
Als weitere Parameter wurden noch eine Erhöhung der im Test verwendeten MgKonzentration von 1 mM auf 3 mM bzw. eine Verdopplung der Proteinmenge bei Mg- und
Ca- Aktivität untersucht, was jeweils zu gleichen Ergebnissen führte (nicht gezeigt).
18
0 µM ADP
0,1 µM ADP
0,3 µM ADP
1 µM ADP
3 µM ADP
10 µM ADP
30 µM ADP
16
14
nmol Pi
12
10
8
6
4
2
0
0
1
2
3
4
5
Zeit (min)
18
16
0 µM ADP
0,1 µM ADP
0,3 µM ADP
1 µM ADP
3 µM ADP
10 µM ADP
30 µM ADP
14
nmol Pi
12
10
8
6
4
2
0
0
1
2
3
4
5
Zeit (min)
Abb. 50: Einfluß von ADP auf die Aktivität des V1Vo Holoenzyms. Mg-ATPase-Aktivität des V1Vo
Holoenzyms (1,3 µg/160 µl) nach 5 min Vorinkubation mit den angegebenen Mg-ADP-Konzentrationen (oben).
Ca-ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms (2,6 µg/160 µl) nach 5 min Vorinkubation mit den angegebenen CaADP-Konzentrationen (unten). Die Messung erfolgte in je zwei parallelen Ansätzen, wobei nach den
entsprechenden Zeiten je 160 µl Aliquots zur Phosphatbestimmung entnommen wurden.
82
Ergebnisse
3
noml Pi nach 15 s
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0 µM 0,1 µM 0,3 µM 1 µM
3 µM
10 µM 30 µM 100 µM
Vorinkubation mit µM [ADP]
Abb. 51: Hemmung der Mg-ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms durch Mg-ADP bei einer
Inkubationszeit von 15 s. Je 4 µg V1Vo Holoenzym wurden für 5 min mit den entsprechenden Mengen MgADP vorinkubiert (je 6 Proben).
20
0 µM Pi
5 µM Pi
20µM Pi
50 µM Pi
nmol Pi
15
10
5
0
0
1
2
3
Zeit (min)
4
5
20
0 µM Pi
5 µM Pi
20µM Pi
50 µM Pi
nmol pi
15
10
5
0
0
1
2
3
Zeit (min)
4
5
Abb. 52: Einfluß von anorganischem Phosphat auf die Aktivität des V 1 Komplexes. Methanol induzierte
Mg-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes (1 µg/160 µl) nach 5 min Vorinkubation mit den angegebenen PiKonzentrationen (oben). Ca-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes (4 µg/160 µl) nach 5 min Vorinkubation mit
den angegebenen Pi-Konzentrationen (unten). Die Messung erfolgte in je zwei parallelen Ansätzen, wobei nach
den entsprechenden Zeiten je 160 µl Aliquots zur Phosphatbestimmung entnommen wurden. Das vorgelegte Pi
wurde über die Meßwerte für 0 min korrigiert.
83
Ergebnisse
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
nmol Pi
0 µM Pi
5 µM Pi
20 µM Pi
50 µM Pi
0
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
1
2
3
Zeit (min)
4
5
nmol Pi
0 µM Pi
5 µM Pi
20 µM Pi
50 µM Pi
0
1
2
3
Zeit (min)
4
5
Abb. 53: Einfluß von anorganischem Phosphat auf die Aktivität des V 1Vo Holoenzyms. Mg-ATPaseAktivität des V1Vo Holoenzyms (1,8 µg/ 160 µl) nach 5 min Vorinkubation mit den angegebenen PiKonzentrationen (oben). Ca-ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms (3,6 µg/160 µl) nach 5 min Vorinkubation
mit den angegebenen Pi-Konzentrationen (unten). Die Messung erfolgte in je zwei parallelen Ansätzen, wobei
nach den entsprechenden Zeiten je 160 µl Aliquots zur Phosphatbestimmung entnommen wurden. Das
vorgelegte Pi wurde über die Meßwerte für 0 min korrigiert.
84
Ergebnisse
4.4.5. Bestimmung der endogen gebundenen Nukleotide des V1Vo Holoenzyms und des V1
Komplexes
Um die Ergebnisse der Experimente zum Einfluss von Nukleotiden auf die V-ATPase besser
interpretieren zu können, wurde zunächst der bis dato noch nicht untersuchte Gehalt von
endogen gebundenen Nukleotiden im V1Vo Holoenzym und im V1 Komplex aus hungernden
Raupen mit Hilfe der Luciferin/Luciferase-Methode bestimmt (3.1.19.). Für die Berechnung
des Verhältnisses von Nukleotide zu Protein wurde für das V1Vo Holoenzym eine
Molekularmasse von 800 kDa und für den V1 Komplex von 550 kDa angenommen. Dabei
ergab sich für das V1Vo Holoenzym ein ATP-Gehalt von 0,005 mol/mol Enzym und für den
V1 Komplex ein ATP-Gehalt von 0,0015 mol/mol Enzym (Tab. 7). Höhere Werte ergaben
sich für ADP mit einem Gehalt von 0,28 mol/mol Holoenzym und 1,7 mol/mol V1 Komplex
(Tab. 7). Der ADP-Gehalt des V1 Komplexes war unabhängig vom physiologischen Zustand
der Raupen: fressende, hungernde und sich häutende Tiere unterschieden sich nicht.
Tab. 7: Der Nukleotidgehalt des V1Vo Holoenzyms und des V1 Komplexes. Die Messung des
Nukleotidgehaltes von mehreren unabhängigen Präparationen (n=3-14) erfolgte mit der Luciferin/LuciferaseMethode (Mittelwerte  S. D., n. b., nicht bestimmt).
V1Vo Holoenzym
ATP-Gehalt
ADP-Gehalt
0,005  0,002
mol/mol (n=3)
0,28  0,05
mol/mol (n=6)
V1 Komplex
V1 Komplex
V1 Komplex
(hungernde Raupen)
(fressende Raupen)
(häutende Raupen)
0,0015  0,001
mol/mol (n=3)
1,7  0,57
mol/mol (n=14)
n. b.
n. b.
1,63  0,42
mol/mol (n=8)
1,75  0,42
mol/mol (n=4)
Im weiteren wurde versucht, das im V1 Komplex gebundene ADP zu entfernen (Abb. 54).
Neben mehreren Variationen des für die Standardgelchromatographie (Superdex 200,
Pharmacia) verwendeten Puffers (150 mM NaCl, 20 mm Tris-HCl pH 8,1, 9,6 mM Mercaptoethanol) durch Zugabe von 25% Methanol, 0,01% C12E10 oder 5 mM EDTA, wurde
auch eine Säulenchromatographie nach Senior et al. (1992) und eine Inkubation mit
alkalischer Phosphatase (Digel et al., 1996) versucht (Details, siehe 3.1.19.). Alle Proben
wurden nach der entsprechenden Behandlung zusammen mit der entsprechenden
Ausgangsprobe auf einem SDS-PAGE Gel analysiert, wobei keine Veränderung festgestellt
werden konnte (nicht gezeigt).
Obwohl Methanol die Mg-ATPase-Aktivität des V1-Komplexes stimuliert und linearisiert,
löst es kein ADP aus dem Komplex. Auch 5 mM EDTA, welches durch die Komplexierung
85
Ergebnisse
von divalenten Kationen das ADP aus seiner Bindestelle, die möglicherweise von Mg-ADP
besetzt ist herauslösen könnte, hatte ebenso wie das für die Reinigung des Holoenzyms
verwendete C12E10, welches sehr wenig ADP enthält, keine Wirkung. Die für F-ATPasen
erfolgreich zur Entfernung von Nukleotiden eingesetzte Chromatographie mittels einer langen
Sephadex G-50 Säule war ebenfalls uneffektiv. Lediglich die Inkubation mit alkalischer
Phosphatase bewirkte eine deutliche Reduktion des ADP-Gehaltes auf 1/3 des
Ausgangswertes. Ein Aktivitätstest dieses V1 Komplexes unter Standardbedingungen zeigte
allerdings keinen Unterschied zur Kontrolle im Hinblick auf die Ca- und die Mg-abhängige
Aktivität; dies könnte möglicherweise auf ein sofortiges wiederbesetzten der Bindestelle mit
ADP zurückzuführen sein. Für weitere Untersuchungen über den Einfluß von Nukleotiden
bzw. die Bindestelle des endogenen ADPs sollte deshalb darüber nachgedacht werden, diese
Methode in die Vorbereitung des V1 Komplexes mit einzubinden.
100
relativer ADP-Gehalt (%)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Kontrolle
Methanol
EDTA
C12E10
Senior
APP
Abb. 54: ADP-Gehalt unterschiedlich behandelter V1 Komplexe. Gelchromatographie in Superdex 200 mit
25% Methanol, mit 5 mM EDTA, mit 0,01% C12E10 im Laufpuffer; Gelchromatographie in Sephadex G-50 nach
Senior et al. (1992); Inkubation mit alkalischer Phosphatase (APP) nach Digel et al. (1996). Vergleich mit
jeweils parallel durchgeführten Kontrollen (100%).
86
Ergebnisse
4.4.6. Dissoziation des V1Vo Holoenzyms in vitro
Da gezeigt werden konnte, dass ADP einen starken Einfluß auf die Aktivität der V-ATPase
hat, sollte überprüft werden, ob diese Hemmung durch eine Dissoziation des V1Vo
Holoenzyms in seine beiden Subkomplexe bewirkt wird. Aus diesem Grunde wurde das V1Vo
Holoenzym mit den entsprechenden Nukleotiden vorinkubiert, gefolgt von einer
Zentrifugation im Saccharosedichtegradienten (siehe 3.1.24.). Die deutlichste Zunahme an
Vo-Untereinheiten in Fraktionen niedriger Dichte, verbunden mit deren Abnahme in
Fraktionen hoher Dichte, zeigte sich bei Inkubation des Holoenzyms mit 2 mM Mg-ATP
(Abb. 55). Dies bedeutet, dass es unter diesen Inkubationsbedingungen zu einer Dissoziation
von V1 Komplex und Vo Komplex kam. Ein schwächerer Effekt wurde durch Inkubation mit
2 mM Mg-ADP sowie mit 2 mM Mg-ADP und 2 mM Pi erzielt, wobei sich zwischen diesen
beiden Inkubationsvarianten kein signifikanter Unterschied zeigte. Hingegen ergab sich bei
Inkubation des Holoenzyms mit 2 mM Ca-ATP, mit 2 mM Ca-ADP, mit 0,2 mM Mg-ADP,
sowie mit 0,2 mM Mg-ADP und 0,2 mM Pi kein deutlich sichtbarer Effekt, der auf eine
größere Dissoziationsrate des Holoenzyms schließen lassen könnte.
Abb. 55: Einfluß von Mg- und Ca-ADP, Mg- und Ca-ATP und von Pi mit Mg-ADP auf die Dissoziation
des V1Vo Holoenzyms. a) und b) Silbergefärbte SDS-PAGE Gele der Saccharosedichtegradientenfraktionen (a)
hohe Dichte (b) niedrige Dichte. 1, Kontrolle. 2, 2 mM Mg-ADP. 3, 2 mM Mg-ATP. 4, 2 mM Ca-ADP. 5, 2 mM
Ca-ATP. c) und d) Silbergefärbte SDS-PAGE Gele der Saccharosedichtegradientenfraktionen (c) hohe Dichte
(d) niedrige Dichte. 1, Kontrolle. 2, 0,2 mM Mg-ADP. 3, 2 mM Mg-ADP. 4, 0,2 mM Mg-ADP, 0,2 mM Pi. 5, 2
mM Mg-ADP, 2 mM Pi.
87
Ergebnisse
Bei den vorausgegangenen Experimenten war die Konzentration der Nukleotide so groß, dass
jedes Holoenzymmolekül mehr als 1000 ATP hydrolysierte. Daher war es von Interesse, wie
sich die V-ATPase bei Inkubation mit äquimolaren Nukleotidkonzentrationen verhält. Bei
einer ATP Konzentration von 1 µM steht jedem eingesetzten V1Vo Holoenzym (100 µg/80µl)
theoretisch ca. 1 ATP zur Verfügung. Wie Abb. 56 zeigt, reichte dies tatsächlich aus, um den
ungefähr gleichen Dissoziationseffekt zu erzeugen. Ein Gemisch von 1 µM ATP und 0,2 mM
ADP führte allerdings zu keiner spürbaren Dissoziation von V1 und Vo Komplex. Mit Hilfe
des nicht hydrolysierbaren ATP Analogons AMP-PNP sollte getestet werden, ob die
Besetzung der ATP-Bindestelle alleine schon eine Dissoziation bewirken kann. Dies ist nicht
der Fall, da die Probe mit AMP-PNP keinerlei Unterschied zur Kontrolle aufwies (Abb. 56).
Möglicherweise bietet AMP-PNP aber einen Schutz vor der durch ATP bewirkten
Dissoziation, da diese in Kombination mit dem Analogon bei einer ATP Konzentration von 2
mM geringer ausfällt als ohne. AMP-PNP konkurriert möglicherweise sowohl mit ATP als
auch mit dem entstehenden ADP um die Bindestelle im Enzym. Zur Verdeutlichung dieser
Ergebnisse wurde zusätzlich zu den SDS-PAGE Gelen auch noch die Proteinverteilung in den
Saccharosegradienten analysiert, wodurch sich der Dissoziationsgrad ebenfalls sehr schön
darstellen läßt (Abb. 57).
Zusätzlich wurde auch der Nukleotidgehalt der Fraktionen dieses Versuches bestimmt, wozu
jeweils die Fraktionen 2-4 und 7-9 zusammengefasst wurden (Abb. 58). In keinem der beiden
Pools konnte ATP in nennenswerter Menge nachgewiesen werden. Der ATP-Gehalt der
Fraktion 2-4, welche jeweils das komplette V1Vo Holoenzym enthalten, entsprach mit 0,001
mol/mol V-ATPase in etwa dem bereits bestimmten Wert (siehe auch 4.4.5.). In der Fraktion
7-9 in der sich neben dem Vo Komplex auch V1-ATPase befindet konnte, kein ATP
nachgewiesen werden. Anders sah es hingegen mit dem ADP-Gehalt der Proben aus. Bei der
Inkubation mit 2 mM Mg-ATP erhöhte sich der ADP-Gehalt der Fraktion 2-4 im Vergleich
zur Kontrolle um das Dreifache. Auch bei der Mischung aus 2 mM AMP-PNP und 2 mM
ATP erhöhte sich der ADP-Gehalt leicht. Bei der Verwendung von 2 mM AMP-PNP alleine
konnte eine deutliche Verringerung des ADP-Wertes registriert werden. In der Fraktion 7-9
war der ADP-Gehalt bei allen Versuchsbedingungen ca. gleich groß und pendelte um 0,2 mol
ADP/mol Enzym (da V1 und Vo Untereinheiten in der Fraktion 7-9 enthalten sind wurde auch
hier mit einer Molekularmasse von 800 kDa gerechnet). Es konnte also keine Erhöhung des
ADP-Gehaltes in den abdissoziierten V1 Komplexen festgestellt werden. Hieraus lässt sich
zunächst schließen, dass vermutlich nicht die feste Bindung eines ADP-Moleküls an das
Enzym zu dessen Dissoziation führt.
88
Ergebnisse
Abb. 56: Einfluß von geringen ATP-Konzentrationen und von AMP-PNP auf die Dissoziation des V1Vo
Holoenzyms. a)- h) Silbergefärbte SDS-PAGE Gele der Saccharosedichtegradienten (1) Standardproteine, (210) entspricht Fraktion 40/2-25/2 (siehe 3.1.24.). (a) Kontrolle, (b) 2 mM Mg-ATP, (c) 1 µM Mg-ATP, (d) 1 µM
Mg-ATP, 0,2 mM Mg-ADP, (e) 0,2 mM Mg-ADP, (f) 2 mM Mg-AMP-PNP, (g) 2 mM Mg-AMP-PNP, 0,2 mM
Mg-ATP, (h) 2 mM Mg-AMP-PNP, 2 mM Mg-ATP.
89
Ergebnisse
60
Kontrolle
2 mM ATP
1 µM ATP
1 µM ATP 0,2 mM ADP
0,2 mM ADP
2 mM AMP-PNP
0,2 mM ATP 2 mM AMP-PNP
2 mM ATP 2 mM AMP-PNP
Proteinverteilung (%)
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Fraktion
Abb. 57: Proteinverteilung in den Saccharosedichtegradienten. Gezeigt ist die Proteinverteilung in den
Gradienten der Dissoziationversuche mit geringer ATP-Konzentration und AMP-PNP (1-9 entspricht Fraktion
40/2-25/2, siehe auch Abb. 56).
2
1,8
Fraktion 2-4
mol ADP/mol Enzym
1,6
Fraktion 7-9
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
M
M
m
m
+
DP
A
M
A
M
TP
A
TP
A
TP
P
AT
M
m
2
TP
+
A
P
M
PN
m
P2
M
0,
A
+
M
NP
m
2
-P
P
M
A
P
PN
P2
2
m
µM
µM
A
lle
tro
M
m
2
0,
1
1
2
on
K
2
0,
M
m
D
A
P
Abb. 58: ADP-Gehalt der Saccharosedichtegradientenfraktionen. Die Fraktionen 2-4 und 7-9 des
Dissoziationversuche mit geringer ATP-Konzentration und AMP-PNP (1-9 entspricht Fraktion 40/2-25/2, siehe
auch Abb. 56 und 57) wurden gepoolt, ankonzentriert und ihr Gehalt an gebundenem ADP mit wie unter 3.1.22
beschrieben bestimmt. Bei der Berechnung des Verhältnisses wurde jeweils ein Molekulargewicht des V1Vo
Holoenzyms von 800 kDa benutzt. Zur Kontrolle wurde auch der ATP-Gehalt bestimmt, welcher für die
Fraktionen 2-4 bei 0,001 mol/mol Enzym lag und sich für die Fraktionen 7-9 unter der Nachweisgrenze befand.
90
Ergebnisse
4.4.7. Einfluß von DCCD und Concanamycin A auf die Mg2+ und Ca2+-ATPase-Aktivität des
V1Vo Holoenzyms
Das Carbodiimid DCCD und das Plecomakrolid Concanamycin A sind Inhibitoren, die ihre
Bindestelle und somit ihren Wirkungsort im Vo Komplex des Enzyms haben, obwohl die
Hydrolyse von ATP im V1 Komplex erfolgt. Die Mg-abhängige Hydrolyse von ATP wurde in
diesem Versuchsansatz durch 0,01 µM Concanamycin A stark und durch 0,1 µM komplett
gehemmt (Abb. 59 , siehe auch 4.3.3.). DCCD hatte nur in höheren Konzentration von 100
µM einen hemmenden Einfluss auf das Enzym. Ganz anders sah das Ergebnis für die CaATPase-Aktivität aus, welche weder durch Concanamycin noch durch DCCD wesentlich
beeinflußt wurde (Abb. 60). Hieraus lässt sich schließen, dass die Ca-ATPase-Aktivität des
V1Vo Holoenzyms keine Protonentranslokation durch den Vo Komplex induziert. Die
Entkopplung von ATP-Hydrolyse und Protonentransport könnte auf eine Uni-site Katalyse in
der Gegenwart von Ca2+ zurückzuführen sein. Ob es sich hierbei um ein Phänomen des
detergenssolubilisierten und gereinigten V1Vo Holoenzyms handelt oder dies auch in der
nativen Membranumgebung erfolgt, wurde in der Folge an gereinigten GCAM-Vesikeln
getestet.
91
Ergebnisse
Kontrolle
1,5 µM DCCD
100 µM DCCD
0,01 µM Con A
0,1 µM Con A
35
30
nmol Pi
25
20
15
10
5
0
0
1
2
Zeit (min)
3
4
Abb. 59: Einfluß von DCCD und Concanamycin A Mg-ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms. Die
Proben (840 µl, 25 µg/ml, n=2) wurden mit den entsprechenden Hemmstoffen für 10 min vorinkubiert, die
Hydrolyse mit 120 µl ATP (Endkonzentration 1 mM) gestartet und zu den angegebenen Zeiten 160 µl Aliquots
zur Phosphatbestimmung entnommen und in N2 eingefroren.
35
Kontrolle
1,5 µM DCCD
100 µM DCCD
0,01 µM Con A
0,1 µM Con A
30
nmol Pi
25
20
15
10
5
0
0
1
2
Zeit (min)
3
4
Abb. 60: Einfluß von DCCD und Concanamycin A Ca-ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms. Vorgehen
wie Abb. 59.
92
Ergebnisse
4.4.8. Messung des Protonentranports an GCAM-Vesikeln mit Mg2+- und Ca2+-ATP als
Substrat
Die vorhergehenden Versuche zur Inhibierung der Mg- und Ca-ATPase-Aktivität des V1Vo
Holoenzyms durch die Vo Komplex-spezifischen Inhibitoren DCCD und Concanamycin A
legten nahe, dass es einen Unterschied zwischen der ATP-Hydrolyse mit Mg2+ oder Ca2+ als
divalentem Kation gibt, der sich auf die Protonentranslokation auswirkt. Diese Vermutung
wurde durch fluorometrische Messungen des Protonentransports in gereinigten GCAMVesikeln verifiziert. Die Anwesenheit von 1 mM Mg2+ induzierte einen ATP-getriebenen
Protonentransport der durch Quenchen der Acridinorange-Fluoreszenz gemessen wurde (Abb.
61a). Durch die Aktivierung des K+/H+-Antiporters in der GCAM mit KCl konnte diese
Ansäuerung wieder aufgehoben werden (Wieczorek et al., 1991). Dagegen konnte die
Protonentranslokation durch Ca2+-Konzentrationen von 1-15 mM nicht induziert werden
(Abb. 61c-d). Ca2+-Konzentrationen bis zu 15 mM beeinflussten die MgATP-induzierte
Ansäuerung der Vesikel nicht. Auch der Zusatz von Ca2+, nachdem mit Mg2+ eine
Ansäuerung erreicht wurde, hatte keine Wirkung (Abb. 61c).
Abb. 61: Fluorometrische Messung des Protonentransports in GCAM-Vesikeln. In den Versuchen (a-d)
wurden jeweils 10 µl GCAM-Vesikel (ca. 10 µg Protein) eingesetzt und die Änderung der Acridinorangefluoreszenz nach Zugabe von 1 mM MgCl2 (1), 20 mM KCl (2), 1 mM CaCl2 (3), 3 mM CaCl2 (4) und 15 mM
CaCl2 (5) gemessen (es sind jeweils die Endkonzentrationen in der Küvette angegeben). Bei Versuch (c) war
bereits 4 mM CaCl2 vorgelegt.
93
Ergebnisse
4.4.9. Messungen kapazitiver Ströme des rekonstituierten V1Vo Holoenzyms
Um den elektrogenen Schritt bei der Protonentranslokation über die Membran elektrisch
erfassen zu können wurde das V1Vo Holoenzym zunächst in Liposomen rekonstituiert. Diese
Proteoliposomen wurden dann an einen Blacklipid Bilayer adsorbiert und die kapazitiven
Ströme bei der Hydrolyse von ATP durch das V1Vo Holoenzym gemessen. Der Strom war
abhängig von der eingesetzten Konzentration an ATP und die Werte reproduzierbar zu
messen (Abb. 62a-c). Da der Strom durch Concanamycin A inhibierbar war, kann er als
spezifisch für das rekonstituierte V1Vo Holoenzym betrachtet werden (Abb. 62d.). Auch
zeigte sich wie bereits bei der GCAM auch im rekonstituierten System, dass die Hydrolyse
von Ca-ATP keinen Protonentransport antreibt (Abb. 62e) und dass Ca2+ die Mg-ATPabhängige Protonentranslokation nicht beeinflusst (Abb. 62f-h).
Abb. 62: Blacklipidbilayer: Messungen der Stromstärke von Bilayeradsorbaten. Für die hier gezeigten
Versuche wurden jeweils 43 µl Proteoliposomen eingesetzt. Zum Zeitpunkt 0 s wurde mit einem Laserblitz das
caged ATP freigesetzt. a) 300 µM caged ATP, 1 mM MgCl2. b) und c) 1 mM caged ATP, 1 mM MgCl2. d) 1
mM caged ATP, 1 mM MgCl2, 10 µM Concanamycin A (10 min Vorinkubation). e) 1 mM caged ATP, 3 mM
CaCl2. f) und g) 1 mM caged ATP, 3 mM CaCl2, 1 mM MgCl2. h) 1 mM caged ATP, 3 mM CaCl2, 3 mM
MgCl2.
94
Diskussion
5. Diskussion
5.1. Die Struktur der V-ATPase aus M. sexta
5.1.1. Das V1Vo Holoenzym
Die Isolierung der V-ATPase aus dem Mitteldarmepithel von Tabakschwärmern (Schweikl et
al., 1989) war mit dem Manko behaftet, dass die Präparation im Verhältnis zur Ausbeute sehr
aufwendig war und dass deswegen nur eine vergleichsweise geringe Anzahl von
Experimenten mit einer Präparation durchgeführt werden konnte. Ausserdem enthielten die
Präparationen nicht alle konstitutiven V-ATPase-Untereinheiten (Wieczorek et al., 2000). In
dieser
Arbeit
wurden
bestehende
Reinigungsprotokolle
optimiert
und
neue
Reinigungsprotokolle etabliert. Erst dadurch war es möglich, für das V1Vo Holoenzym sowie
seine beiden Teilkomplexe V1 und Vo die genaue Untereinheitenzusammensetzung zu
bestimmen und darüber hinaus Strukturdaten, besonders über den katalytischen V1 Komplex,
zu gewinnen.
Für die Erhöhung der Ausbeute und die wesentlich einfachere und schnellere Präparation des
V1Vo Holoenzyms sind vor allem zwei Ergebnisse ausschlaggebend. Zum einen hat die VATPase aus dem anterioren Mitteldarmabschnitt die gleichen enzymatischen Eigenschaften
und die gleiche Untereinheitenzusammensetzung wie die V-ATPase aus dem posterioren
Mitteldarm, so dass der ganze Mitteldarm als Ausgangsmaterial für die Reinigung der VATPase verwendet werden kann. Zum anderen solubilisiert das Detergenz C 12E10 die VATPase so selektiv aus dem Mitteldarmepithel, dass sich die aufwendige längsmuskelfreie
Präparation des Mitteldarmepithels und die Anreicherung der GCAM auf einem
Saccharosestufengradienten erübrigt; vielmehr kann ein Rohhomogenat des Mitteldarmepithels als Ausgangsmaterial für die Reinigung der V-ATPase verwendet werden. Die
zusätzlichen Chromatographieschritte mit einem Anionenaustauscher und einer Gelfiltration
ermöglichten die Reinigung eines V1Vo Holoenzyms aus M. sexta, dass mit den
Untereinheiten A, B, C, D, E, F, G und H alle bekannten Untereinheiten des V1 Komplexes
und mit den Untereinheiten a, c, d und e auch die des Vo Komplexes enthält. Die Ausbeute an
V1Vo Holoenzym liegt mit 100 µg pro Raupe mehr als 10 mal höher als bei der bisherigen
Präparationsmethode. Die Identifikation aller Untereinheiten erfolgte über MALDI-MSAnalyse von tryptischen bzw. chymotryptischen Fragmenten ihrer aus einem SDS-PAGE Gel
95
Diskussion
ausgeschnittenen Proteinbanden und deren Abgleich mit den Fragmenten eines theoretischen
Verdaus ihrer, aus der cDNA abgeleiteten, Aminosäuresequenzen (Dow et al., 1992; Gräf et
al., 1992; Novak et al., 1992; Gräf et al., 1994a; Gräf et al., 1994b; Lepier et al., 1996;
Merzendorfer et al., 1997; Merzendorfer et al., 1999; Merzendorfer et al., 2000). Bis auf die
Untereinheit e, deren tryptische Fragmente außerhalb des Meßbereichs lagen, konnten alle
Proteinbanden eindeutig den jeweiligen Untereinheiten zugeordnet werden. Letztere war
allerdings bereits durch monoklonale Antikörper und N-terminale Sequenzierung eindeutig
identifiziert worden (Merzendorfer et al., 1999).
5.1.2. Der Vo Komplex
Bei der neuen Präparationsmethode des V1Vo Holoenzyms ist besonders die Entdeckung der
Untereinheit a hervorzuheben, die für lange Zeit bei Insekten nicht dargestellt werden konnte
(Wieczorek et al., 2000). Die Abwesenheit dieser Untereinheit stellte ein Problem dar, weil
bei Mutageneseexperimenten an der V-ATPase der Hefe gezeigt wurde, dass sie essentiell für
die Assemblierung und/oder die Protonentranslokation der V-ATPase ist (Manolson et al.,
1994; Leng et al., 1996; Leng et al., 1998). Weiterhin gilt die Untereinheit a als Kandidat für
einen wichtigen Bestandteil des sogenannten Stators in Modellen, welche die Arbeitsweise
der V-ATPase in Analogie zur F-ATPase erklären (Kagawa & Hamamoto, 1996; Junge et al.,
1997).
Tatsächlich
wurde
dieser
second
stalk
erstmalig
bei
V-ATPasen
elektronenmikroskopisch dokumentiert (Boekema et al., 1997), was bald danach zu seiner
Entdeckung bei F-ATPasen führte (Wilkens & Capaldi, 1998). Des weiteren wurde die
Untereinheit a bisher als Favorit für die Bindung von Plecomakroliden gehandelt (Zhang et
al., 1994), wobei dies in dieser Arbeit allerdings widerlegt werden konnte. Die besondere
Proteolyse-Empfindlichkeit der Untereinheit a war zwar bekannt (Adachi et al., 1990a), so
dass ein Abbau des Proteins während der Reinigung nach Schweikl et al. (1989) durchaus
möglich gewesen wäre, allerdings konnte selbst die Verwendung eines ganzen Cocktails von
Proteaseinhibitoren (Wieczorek et al., 2000) die scheinbare "Degradation" nicht verhindern.
Mit der Erhöhung der Ionenstärke im Saccharosedichtegradienten durch 200 mM KCl gelang
es nun erstmals, das V1Vo Holoenzym mit seiner Untereinheit a zu reinigen. Offensichtlich
bewirkt die höhere Ionenstärke der Lösung durch verstärkte hydrophobe Wechselwirkungen
eine festere Bindung der Untereinheit a an den Rest des V1Vo Holoenzyms. An welche der
Untereinheiten der V-ATPase die Untereinheit a fester bindet bzw. mit welcher der
Untereinheiten sie überhaupt interaggiert, ist für M. sexta bisher noch nicht untersucht. Auch
96
Diskussion
bei anderen V-ATPasen sind die Wechselwirkungen mit den anderen Untereinheiten nicht
vollständig geklärt. Bei Hefe sind allerdings Interaktionen der Untereinheit a mit der
Untereinheit d, c, A und H beschrieben (Tomashek et al., 1996; Landolt-Marticorena et al.,
2000). Mittlerweile ist die Untereinheit a aus dem Mitteldarm kloniert und sequenziert
(Merzendorfer et al., 2000), eine weitere Isoform wurde in der cDNA von Malpighischen
Gefäßen gefunden und teilweise kloniert und sequenziert (Reineke, Merzendorfer, Vor der
Brüggen und Wieczorek, nicht publiziert).
Bei Hafer konnte die Untereinheit a bisher ebenfalls nicht als Bestandteil des gereinigten
V1Vo Holoenzyms nachgewiesen werden, obwohl sie im Vo Komplex, welcher nativ in der
Membran vorkommt, enthalten ist (Li & Sze, 1999). Da das Reinigungsprotokoll für die VATPase aus Hafer keine Salze enthält wäre es interessant zu überprüfen, ob sich bei Erhöhung
der Ionenstärke auch bei dieser V-ATPase der gleiche Effekt einstellt.
Neben der modifizierten Reinigung des ganzen V1Vo Holoenzyms wurde auch ein Protokoll
zur Reinigung des nativen Vo Komplexes etabliert. Dabei wurde die Anreicherung des freien
Vo Komplexes in der GCAM durch die Abdissoziation des V1 Komplexes bei hungernden
Raupen ausgenutzt (Gräf et al. 1996) und gezeigt, dass neben dem cytosolischen V1 Komplex
auch der membranständige Vo Komplex als ganzes erhalten bleibt und mit einer hohen
Ausbeute 50 µg/Raupe isoliert werden kann. Durch die hohe Reinheit der Präparation war es
möglich, die genaue Untereinheitenzusammensetzung des Vo Komplexes, aus den
Untereinheiten a, c, d und e zu bestimmen. Wie bereits für das V1Vo Holoenzym ausgeführt,
gelang es auch hier erstmalig die Untereinheit a als konstitutiven Bestandteil des Vo
Komplexes einer Insekten V-ATPase darzustellen.
Die Untereinheit d, die bereits als Bestandteil des Vo Komplexes aus Clathrinvesikeln von
Rindern etabliert war (Zhang et al., 1992; Zhang et al., 1994) konnte auch für die Insekten VATPase nachgewiesen werden (Merzendorfer et al., 1997b). Diese Untereinheit besitzt im
Gegensatz zu den anderen Vo Untereinheiten keinen Membrandurchgang (Merzendorfer et
al., 1997b) und wird nur durch ihre Wechselwirkungen mit den anderen Untereinheiten an
den Vo Komplex gebunden, wo sie jedoch eine wichtige Rolle bei der Assemblierung des
V1Vo Holoenzyms spielt (Bauerle et al., 1993).
Als neuer konstitutiver Bestandteil des nativen Vo Komplexes konnte die Untereinheit e
erstmalig bei M. sexta nachgewiesen werden (Merzendorfer et al., 1999); ihre Entdeckung
sicherte ab, dass ein kurz zuvor durch Co-Reinigung mit der Rinder V-ATPase gefundenes
Protein auch dort als V-ATPase-Untereinheit angesehen werden kann (Ludwig et al., 1998).
Die homologe Untereinheit in Hefe (VMA21) gehört nicht zur reifen V-ATPase, sondern ist
97
Diskussion
nur während der Assemblierung im Endoplasmatischen Retikulum mit dem Vo Komplex
assoziiert. Im Gegensatz zur Untereinheit e von M. sexta wird sie dort durch ein
Retentionssignal zurückgehalten und weist auch keinerlei Glycosylierungen auf, die bei M.
sexta immerhin 10 kDa zur apparenten Molekularmasse von 20 kDa beitragen.
Die Untereinheit c konnte durch die Autoradiographie nach Inkubation mit
14
C-DCCD und
durch die MALDI-MS-Analysen ebenfalls eindeutig dem Vo Komplex zugeordnet werden.
Bei vielen anderen Spezies, z. B. S. cerevisiae, C. elegans und H. sapiens konnten inzwischen
neben c auch dessen Isoformen c´ und c´´ gefunden werden, wobei die Isoform c´ gleich groß
wie c ist, die Isoform c´´ größer ist (19-23 kDa) und wahrscheinlich einen
Membrandurchgang mehr besitzt (Hirata et al., 1997; Oka et al., 1997; Nishigori et al., 1998).
Für S. cerevisiae konnte gezeigt werden, dass zum einen jede der 3 Isoformen für die richtige
Funktion eines V-ATPase-Moleküls exprimiert werden muß (Hirata et al., 1997) und dass
zum anderen in jedem Vo Komplex jeweils eine Untereinheit c´ und c´´, sowie mehrere
Untereinheiten c vorhanden sind (Powell et al., 2000). Bei M. sexta wurden diese Isoformen
bisher vergeblich gesucht, obwohl es zumindest nach Ergebnissen von Northern-BlotHybridisierungen zwei Transskripte unterschiedlicher Größe für das Proteolipid gibt (Dow et
al., 1992). Die Bande mit der apparenten Molekularmasse von 26 kDa, die als einziges
unbekanntes Protein im gereinigten Vo Komplex zu erkennen ist erschien aus naheliegenden
Gründen als guter Kandidat für die Isoform c´´. Dies erschien insbesondere plausibel, da bei
früheren Versuchen, die Untereinheit c in der GCAM mit
14
C-DCCD zu markieren, auch ein
Signal bei 26 kDa zu finden war (Sumner et al., 1995). Bei der N-terminalen Sequenzierung
dieser Bande stellte es sich dann aber heraus, dass die erhaltene Sequenzinformation genau
dem N-Terminus der Untereinheit c entspricht. Bei einem Vergleich mit mehreren Isoformen
aus anderen Organismen zeigte sich, dass alle Isoformen der Kategorie c´´ ihren
Größenunterschied zu c und c´ hauptsächlich durch eine Verlängerung des n-Terminus
erhalten. Deshalb ist es sehr unwahrscheinlich, dass es sich bei der 26 kDa Bande um c´´
handelt. Für die Untereinheit c ist andererseits bekannt, dass sie beim Erhitzen der Proben für
die SDS-PAGE sehr leicht Aggregate bildet, die sehr groß werden und dadurch eine
Einwanderung ins Gel verhindern können (Finbow & Pitts, 1993; Lepier et al., 1996). Um
eine Aggregation zu vermeiden, werden die Proben des V1Vo Holoenzyms und des Vo
Komplexes in unserem Labor standardmäßig entweder nur 45 s auf 95°C erhitzt oder für 30
min bei 37°C erwärmt. Da das Vermeiden der Aggregation trotzdem nicht vollständig zu
gelingen scheint, dürfte es sich bei der 26 kDa Bande mit ziemlicher Sicherheit um eine
Dimer der Untereinheit c handeln. Nichtsdestotrotz gibt es, neben den bereits erwähnten zwei
98
Diskussion
Produkten aus der Northern-Blot-Hybridisierung, einen weiteren Hinweis auf die Existenz
einer Isoform c´ der Untereinheit c. Bei allen MALDI-MS-Analysen der Untereinheit
tauchten reproduzierbar zwei markante chymotryptische Massenfragmente auf (1523,9 und
1739,9 m/z), die nicht in der Sequenz von c wiederzufinden sind. Dabei könnte es sich um
Fragmente der Isoform c´ handeln, welche normalerweise ca. die gleiche Molekularmasse wie
c hat und deshalb in der normalen SDS-PAGE nicht von dieser zu unterscheiden ist. 2-D
Gelelektrophoresen, wie für den löslichen V1 Komplex, waren sowohl mit dem V1Vo
Holoenzym, als auch mit dem Vo Komplex bisher nicht erfolgreich. Einen neuen Ansatz bietet
die trägerfreie isoelektrische Fokussierung mit dem Octopussystem der Firma Dr. Weber,
welches gerade für Membranproteine besonders geeignet ist.
5.1.3. Der V1 Komplex
Auch die Reinigung des cytosolischen V1 Komplexes wurde im Vergleich zu Gräf et al.
(1996) modifiziert, so dass zum einen die Stabilität und Aktivität des Komplexes über
mehrere Wochen konserviert werden kann, und zum anderen eine größere Menge an Raupen
bei einer Präparation verarbeitet werden konnte, was die Menge an gereinigtem V1 Komplex
pro Präparationstag erhöht. Als entscheidend für die Erhaltung der Aktivität erwies sich die
Zugabe eines Reduktionsmittels schon früh während der Präparation, um bei der großen
Anzahl an Cysteinen im V1 Komplex die Bildung von Disulfidbrücken zu verhindern, die zu
einem deutlichen Aktivitätsverlust der V1-ATPase führen (diese Arbeit; Gräf et al., 1996).
Auch konnte inzwischen gezeigt werden, dass die Oxidation des V1 Komplexes zu
Änderungen seiner 3D-Struktur führt (Grüber et al., 2000b). Einen weiteren wichtigen
Einfluß hatte die Lagerungstemperatur von 4°C, bei der sich die V1-ATPase am stabilsten
erwies. Mit Hilfe der 2-D Gelelektrophorese konnte die genaue Zusammensetzung des V1
Komplexes aus den Untereinheiten A, B, C, D, E, F, G und H ermittelt werden, welche auch
durch die Ergebnisse von Immunfärbungen mit spezifischen Antikörpern und durch MALDIMS-Analysen bestätigt wurde. Die 2-D Gellektrophorese zeigte weiterhin, dass keine
Isoformen von Untereinheiten, die sich in ihren isoelektrischen Punkten unterscheiden, im V1
Komplex enthalten sind.
99
Diskussion
5.1.4. Die putative Isoform der Untereinheit B gehört zu den Hsp60-Proteinen
Für B Untereinheiten von V-ATPasen sind in mehreren Organismen Isoformen, die in
unterschiedlichen Organen bzw. Zellkompartimenten exprimiert werden, beschrieben (Wang
& Gluck, 1990; Van Hille et al., 1994; Bartkiewicz et al., 1995). Bei der Verwendung der
zwei monospezifischen Antiseren C23 und C34, welche gegen die Aminosäuren 243-428
bzw. gegen die Aminosäuren 475-494 der Untereinheit B gerichtet waren, wurde
überraschenderweise eine Bande B´ zwischen der A und der B Untereinheit mit einer
Molekularmasse von 60 kDa erkannt. C23 markierte dabei die Banden B und B´, C34
hingegen nur die Bande B´. Die B´ Bande ist sowohl in der gereinigten V-ATPase aus
Mitteldarmrohhomogenat als auch in der gereinigten V-ATPase aus angereicherter GCAM
von anteriorem und posteriorem Mitteldarm enthalten, nicht aber in der V-ATPase aus
gereinigter GCAM des anterioren und posterioren Mitteldarms und im V1 Komplex. Da die
letzteren Präparationen entweder aus reinen Membranen erfolgten oder direkt aus dem
Cytosol, lag die Vermutung nahe, dass es sich möglicherweise um eine endosomale Isoform
der Untereinheit B handeln könnte, die nicht in der Plasmamembran V-ATPase vorkommt.
Eine andere Möglichkeit wäre, dass es sich bei der Untereinheit B in der Plasmamembran VATPase um ein posttranslational C-terminal verkürztes Protein handeln könnte, da es nicht
durch das Antiserum C34 gegen diesen Bereich erkannt wird. Bei einer MALDSI-MS
Analyse zeigte sich allerdings, dass es sich bei der Bande B um das vollständige Protein
einschließlich des C-Terminus handelt. Eine N-terminale Sequenzierung von B´ klärte
schließlich dessen Identität als Mitglied der Hsp60 Familie, für welches bereits zusätzliche
Sequenzinformation durch ein "shotgun screening" vorhanden war. Dieser Klon 10 aus M.
sexta enthält eine mitochondriale Lokalisationsequenz, die im Fall von B´ nicht mehr
vorhanden ist; dies spricht dafür, dass es sich tatsächlich in Mitochondrien befindet. Durch
die Zerstörung der Mitochondrien bei der Homogenisation des Gewebes wird es freigesetzt
und bindet eventuell als Chaperon an beschädigte Teile der V-ATPase und wird deshalb
mitgereinigt. Aus der späteren Elution in der Gelchromatographie im Vergleich zum reinen
Holoenzym lässt sich schließen, dass es nicht an die intakte bzw. vollständige V-ATPase
bindet, sondern an Teilkomplexe die möglicherweise "beschädigt" sind. Es stellt sich nun die
Frage, warum Antikörper gegen zwei verschiedene Teilbereiche der B-Untereinheit dieses
Hsp60 erkennen. Hierfür gibt es zwei mögliche Erklärungen. 1. Bei der Reinigung der
Fusionsproteine für die Herstellung der Antiseren wurde aus den zur Expression verwendeten
100
Diskussion
E. coli Zellen GroEL, ebenfalls ein Mitglied der Hsp60 Familie, mitgereinigt. Deshalb
produzierten die zur Immunisierung verwendeten Meerschweinchen Antikörper gegen
GroEL, welche das Hsp60 aus M. sexta erkennen. 2. Es ist bekannt, dass es zwischen der 
Untereinheit der F-ATPasen und Chaperonen konservierte Regionen gibt, welche auch in der
B-Untereinheit von V-ATPasen vorhanden sind und dass Antikörper gegen zwei synthetische
Peptide dieser Regionen der  Untereinheit von F-ATPasen sehr stark mit GroEL
kreuzreagieren (Luis et al., 1990, Alconada et al., 1994). Einige dieser konservierten Motive
kommen sowohl bei der B-Untereinheit von M. sexta als auch bei Hsp60 Proteinen der
Insekten vor (nicht gezeigt, hier wurde mit Hsp63 von H. vireszens verglichen da nur ein Teil
der M. sexta Sequenz bekannt ist), so dass auch hier eine Kreuzreaktion auftreten könnte.
5.1.5. Gehört die Untereinheit C zum V1 Komplex?
Bei Gräf et al. (1996) enthielten die gereinigten cytosolischen V1 Komplexe ebensowenig
eine Untereinheit C, wie die V1 Komplexe aus S. cerevisiae (Kane, 1995) und die gestrippten
V1 Komplexe aus chromaffinen Granula von Rind (Moriyama & Nelson, 1989). Allerdings ist
die Untereinheit C in den nach der modifizierten Methode gereinigten V1 Komplexen, wenn
auch in substöchiometrischen Mengen, enthalten. Sie läßt sich aber durch die Zugabe von
Alkoholen sehr leicht vom V1 Komplex abtrennen, weshalb zunächst vermutet wurde, dass
dadurch die Mg-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes hervorgerufen wird. Der C-freie
Komplex zeigt aber in wässriger Lösung ebenfalls nur Ca-ATPase- und keine Mg-ATPaseAktivität. Die rekombinante Untereinheit C reassoziiert problemlos mit dem C-freien
Komplex und dieser hat die gleichen enzymatischen Eigenschaften wie der C-freie oder der
native C-haltige V1 Komplex. Dies scheint dem Ergebnis von Peng et al. (1993) zu
widersprechen,
welche
bei
Clathrinvesikeln
feststellten,
dass
durch
Zugabe
der
rekombinanten Untereinheit C zu einem Subkomplex aus A, B und D dessen Ca-ATPaseAktivität um ein 15-faches auf ein Drittel der Aktivität des intakten V1 Komplexes anstieg.
Dieser Subkomplex wurde allerdings unter sehr harschen Bedingungen hergestellt, so dass die
Aktivitätssteigerung möglicherweise durch die Wirkung der Untereinheit C als Stabilisator
oder auch Chaperon für diesen Subkomplex zurückzuführen ist und er dadurch erst in eine
aktivere Konformation gebracht wird. Der V1 Komplex aus M. sexta scheint hingegen mit und
ohne die Untereinheit C bereits in seiner richtigen Konformation zu sein.
Eine mögliche Antwort auf die Frage der Rolle der Untereinheit C ergab sich aus dem
Befund, dass sie sich mit Alkoholen nicht vom V1Vo Holoenzym entfernen läßt. Dagegen
101
Diskussion
reichen bereits 0,01% des Detergens C12E10, welches standardmäßig zur Solubilisierung und
Reinigung des V1Vo Holoenzyms benutzt wird, aus, um sie vom V1 Komplex abzulösen. Dies
zeigt, dass es einen großen Unterschied in der Wechselwirkung von Untereinheit C mit dem
V1Vo Holoenzym und dem V1 Komplex gibt. Es wurde bereits gezeigt, dass die Untereinheit
C zwar nicht für die Assemblierung der Komplexe V1 und Vo notwendig ist, wohl aber für die
Assemblierung der Beiden zum intakten Holoenzym (Beltran & Nelson, 1992; Ho et al.,
1993; Doherty & Kane, 1993). Auch bei der glukoseabhängigen Dissoziation der V-ATPase
in Hefe ist die Untereinheit C weder im V1- noch im Vo-Komplex zu finden, bei einer
Reassoziation ist sie allerdings wieder im V1Vo Holoenzym zu finden. Deshalb ist es sehr
wahrscheinlich, dass bedingt durch die einzige bisher nachgewiesene Aufgabe der
Untereinheit C, nämlich bei der Assemblierung des V1Vo Holoenzyms mitzuwirken, ihre
Lokalisation am Interface zwischen den beiden Komplexen zu finden ist, wo sie
möglicherweise durch die Untereinheit a "eingeklemmt" wird (siehe Modell Abb. 3). Die
Anwesenheit im gereinigten V1-Komplex von M. sexta ist vielleicht nur auf eine
präparationsbedingte hohe Affinität der Untereinheit C zum V1 Komplex zurückzuführen, was
auch die leichte Reassoziation der rekombinanten Untereinheit belegt.
5.1.6. Ist die Untereinheit E bei V-ATPasen das funktionelle Homolog zur Untereinheit  der
F-ATPasen?
Bei der Behandlung des V1 Komplexes mit chaotropen Ionen zerfiel dieser in zwei
Subkomplexe bestehend aus den Untereinheiten AB2HCEG und A2BEG mit einem
Molekulargewicht von ca. 310 bzw. 230 kDa. Keiner der beiden Komplexe zeigte eine Caoder Mg-ATPase-Aktivität und in keinem der beiden Komplexe waren die Untereinheiten D
und F enthalten. Es sieht so aus, als ob der V1 Komplex durch KI in zwei asymmetrische
Hälften gespalten würde, die zusammengesetzt fast wieder einen ganzen Komplex von ca.
540 kDa ergeben. Für die F Untereinheit ist bekannt, dass sie leicht vom V1 Komplex
abzulösen und auch wieder zu reassozieren ist (Gräf et al., 1994b; Gräf et al., 1996).
Ausserdem gibt es Hinweise darauf, dass die beiden Untereinheiten D und F miteinander
interagieren (Thomashek et al., 1997). Interessant war jedoch das Verschwinden der D
Untereinheit bei gleichzeitigen Verbleiben der E Untereinheit an den Komplexen, da bei den
V-ATPasen immer noch sehr kontrovers diskutiert wird, welche dieser beiden Untereinheiten
das Homologe für die Untereinheit  der F-ATPasen darstellt (Bowman et al., 1995; Nelson et
al., 1995; Xu & Forgac, 2000; Grüber et al., 2000a). Im aktuellen Struktur-Funktions-Modell
für die F-ATPasen (Review in Stock et al., 2000), das zum einen durch hochauflösenden
102
Diskussion
Strukturdaten (Abrahams et al., 1994; Bianchet et al. 1998; Stock et al., 1999; Hausrath et al.,
1999; Gibbons et al., 2000) und zum anderen durch Experimente, bei denen die Rotation der 
Untereinheit relativ zur  und  Untereinheit gezeigt wurde (Duncan et al., 1995; Sabbert et
al., 1996; Noji et al., 1999), gestützt wird, übernimmt die langgestreckte  Untereinheit der FATPase die wichtige Aufgabe, die bei der Katalyse von ATP entstehende Bewegung im
hexagonalen Kopfteil der F1-ATPase zum für die Protonentranslokation verantwortlichen FoTeil zu vermitteln. Beide Untereinheiten der V-ATPase haben keinerlei auffällige
Sequenzhomologie zur  Untereinheit der F-ATPasen, aber für beide wird eine langgestreckte
Struktur aus -Helices vorhergesagt, wodurch zumindest diese Anforderung erfüllt wäre. Für
die Untereinheit E spricht weiterhin ihre Stabilität gegenüber der Trypsinisierung, des V1
Komplexes und des V1Vo Holoenzyms und der Behandlung durch chaotrope Ionen, bei denen
die D Untereinheit als eine der ersten verschwindet; dabei bleibt die durch Methanol
induzierte Mg-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes nichtsdestotrotz erhalten (Grüber et al.,
2000a; Reineke, Hunke, Huss und Wieczorek, unpublizierte Ergebnisse). Auch ein Komplex
aus den Untereinheiten A, B, C und E der Clathrinvesikel aus Rind zeigt ohne die
Untereinheit D eine Ca-ATPase-Aktivität (Peng et al., 1993). Der schnelle Abbau der D
Untereinheit deutet, genau wie deren herauslösen aus dem V1 Komplex durch chaotrope
Ionen, auf eine eher exponierte Position hin, die sich eigentlich nicht mit einer für ein Homolog a priori zu erwartenden geschützten Lage im Inneren des Enzyms vereinbaren läßt.
Weiterhin konnten für die E Untereinheit in Abhängigkeit von zugesetzten Nukleotiden
verschiedene Nulllängen-Vernetzungsprodukte entdeckt werden, was auf eine Bewegung der
E Untereinheit bei der Hydrolyse, evtl. eine Rotation, hindeutet (Grüber et al., 2000a). Auch
ist bei einer Pflanzen-V-ATPase die Entstehung einer Disulfidbrücke innerhalb der E
Untereinheit, durch Zugabe eines ATP-Analogons und einer dadurch verursachten
Konformationsänderung beobachtet worden (Kawamura et al. 2001). Eine Studie allerdings,
bei der die Untereinheit D entweder zufällig oder gerichtet mutiert wurde, zeigte bei
vollständig assemblierten V-ATPasen einen eindeutigen Zusammenhang zwischen der
Untereinheit D, der ATPase-Aktivität und dem Protonentransport, was wiederum diese als Homolog favorisiert (Xu & Forgac, 2000). Unter diesem Gesichtspunkt können die
Ergebnisse der KI-Behandlung auch folgendermaßen interpretiert werden: Die Untereinheit D
muß als rotierendes Element leicht drehbar sein und sollte deshalb keine allzu starken
Wechselwirkungen, z. B. hydrophober Natur zu anderen Untereinheiten eingehen können. Da
der V1 Komplex durch KI "in der Mitte" gespalten wird, was aus den entstehenden
103
Diskussion
Fragmenten AB2HCEG und A2BEG ersichtlich ist, könnte in diesem Fall die Untereinheit D
einfach aus dem Komplex "herausfallen" (Abb. 63). Ausserdem ist die Untereinheit E in
beiden Subkomplexen der KI-Spaltung enthalten und somit möglicherweise mehr als einmal
pro Enzym vorhanden. Dies spricht ebenfalls gegen ihre Funktion als Pendant zur Untereinheit, welche in der F-ATPase als einzelne Kopie vorliegt. Auch die ATPase-Aktivität
des V1 Komplexes ohne D darf nicht überbewertet werden, da die Ca-ATPase-Aktivität im
V1Vo Holoenzym als wahrscheinliche uni-site Katalyse sowieso keinen Protonentransport
bewirkt und deshalb auch kein -Homolog erforderlich ist. Möglicherweise handelt es sich
auch bei der Methanol stimulierten Mg-ATPase-Aktivität um eine solche uni-site Katalyse.
Eine vollständige Klärung, welche der V-ATPase Untereinheiten nun wirklich das Homolog
zur  Untereinheit der F-ATPasen ist, wird erst durch eine Struktur der V-ATPase in atomarer
Auflösung möglich sein.
Abb. 63: Modell der Spaltung des V1 Komplexes durch KI.
5.1.7. Die räumliche Struktur des V1 Komplexes
Bislang kamen vor allem zwei bildgebende Verfahren, die Röntgenkleinwinkelstreuung und
die Elektronenmikroskopie, für die Analyse der räumlichen Struktur des V1 Komplexes zum
Einsatz (Svergun et al., 1998; Radermacher et al., 1999; Grüber et al., 2000a; Radermacher et
al., 2001). Die erste Methode hat, trotz der relativ geringen Auflösung, den entscheidenden
Vorteil, dass sie mit einem unfixierten Objekt arbeitet und damit die erhaltenen Bilder die
Struktur unter physiologischen Bedingungen widerspiegeln. In diesen Röntgenkleinwinkel104
Diskussion
streuungsexperimenten wurde die Struktur des V1 Komplexes mit einer Auflösung von 3,6
nm bestimmt. Der V1 Komplex hat die Form eines Pilzes, wobei der Durchmesser des Kopfes
ca. 14,5 nm beträgt und der Stiel eine Länge von 11 nm hat. Der Kopfteil zeichnet sich
ausserdem durch eine dreifache Symmetrie aus, die sich mit der alternierenden Anordnung
der jeweils drei Kopien der A und der B Untereinheit erklären läßt, wie sie auch für die und -Untereinheiten der F1-ATPase beobachtet wurde (Abrahams et al., 1994). Die Messung
von Konformationsänderungen im V1 Komplex mit der Röntgenkleinwinkelstreuung ist
möglich, wie bereits durch eine Veränderung der Struktur in Abhängigkeit vom RedoxZustand gezeigt werden konnte (Grüber et al., 2000b). Um mehr Details über den löslichen V1
Komplex und im besonderen über die Feinstruktur des Stiels zu erhalten, wäre auf jeden Fall
eine Untersuchung des vollständig C-freien V1 Komplexes und eine Analyse der durch KIBehandlung entstehenden asymmetrischen Hälften des V1 Komplexes sehr interessant.
Die mit Hilfe der Röntgenkleinwinkelstreuung gewonnenen Daten decken sich sehr gut mit
den für die V1-ATPase (Radermacher et al., 1999; Grüber et al., 2000a; Radermacher et al.,
2001) und das Holoenzym (Abb. 2) aus M. sexta durch Elektronenmikroskopie erhaltenen.
Auch sie bestätigen die bereits aus anderen Organismen, wie N. Crassa und C. fervidus
bekannten Strukturmerkmale der V-ATPasen (Dschida & Bowman, 1992; Boekema et al.,
1997, 1998 und 1999). In der Aufsicht zeigen sie wiederum eine hexagonale Anordnung der
Untereinheiten A und B, und in der Seitenansicht die Unterteilung in Kopf und Stiel. Auch
die zusätzlichen Massen auf beiden Seiten des Stiels sind zu erkennen, welche in
elektronenmikroskopischen Bildern mit höherer Auflösung als zweiter bzw. dritter Stiel der
V-ATPase interpretiert wurden (Boekema et al., 1999). Zumindest einer dieser zusätzlichen
Stiele ist nach dem vorgeschlagenen Rotor- und Stator-Modell für die Funktionsweise der VATPase in Analogie zur F-ATPase notwendig (Junge et al., 1997; Junge, 1999).
Eine Besonderheit der V-ATPase von M. sexta gegenüber V-ATPasen aus anderen
Organismen ist die hohe Dichte in der sie in die GCAM integriert ist, wie
elektronenmikroskopische Bilder eindrucksvoll zeigen (Abb. 2). In der chromaffinen Granula
aus Rindern sind es nur ca. 20 V-ATPasen pro Organelle und in den Clathrinvesikeln
vermutlich nur 2 pro Vesikel und auch in der Vakuolenmembran von N. crassa sind es
deutlich weniger als in der GCAM von M. sexta (Schmidt et al., 1982; Forgac et al., 1984;
Bowman et al., 1989). Die hohe, quasi kristalline Dichte der V-ATPase in der GCAM soll in
einer Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Engel (Biozentrum Basel) dazu
genutzt werden, mit Hilfe der Kraftmikroskopie und der Elektronenkristallographie die
Struktur der V-ATPase in ihrer nativen Membran weiter zu untersuchen. Vor allem soll dabei
105
Diskussion
auch die Struktur des Vo Komplexes, von dem es bis jetzt so gut wie keine Daten gibt, mit
einbezogen werden. Zum einen können dafür sogenannte right-side-out Vesikel und zum
anderen mit Hilfe von KI vom V1 Komplex befreite Vesikel verwendet werden.
5.2. Die Aktivität der V-ATPase
5.2.1. Ca2+ ist kein vollwertiger Ersatz für Mg2+
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der V-ATPase von M.
sexta deutliche Unterschiede in Hinblick auf ihre Wechselwirkung mit Mg2+ bzw. Ca2+
aufweist. Messungen der Enzymaktivität sowie Protonentransport- und Spannungsmessungen
ergaben, dass die Hydrolyse von Ca-ATP im V1 Komplex, im Gegensatz zur Hydrolyse von
Mg-ATP, nicht zu einer Kommunikation mit dem Vo Komplex führt, die in eine
Protonentranslokation mündet. Auch für die V-ATPase aus Clathrinvesikeln war gezeigt
worden, dass Ca2+ nicht als Ersatz für Mg2+ verwendet werden kann, da die Hydrolyse von
Ca-ATP dort ebenfalls keinen Protonentransport antreibt (Xie & Stone, 1988). In dieser
Arbeit wurde, neben der Aufgabe des Mg2+ als Co-Faktor für die ATP-Hydrolyse, eine
weitere Funktion des Mg2+ als Koppler zwischen Hydrolyse und Protonentransport und eine
zweite Bindestelle für Mg2+ diskutiert. Begründet wurde dies durch den 500-fachen
Konzentrationsunterschied zwischen der geringen, zur Hemmung der Ca-ATPase-Aktivität
und der hohen, für eine optimale Mg-ATPase-Aktivität benötigten Mg2+-Konzentration. Auch
in zwei weiteren Untersuchungen wurde eine mögliche zusätzliche Mg2+-Bindestelle bei VATPasen postuliert. Zum einen bei Markierungsversuchen mit -[32P]ATP bei der V-ATPase
aus chromaffinen Granula deutlich mehr Mg2+ benötigt als für die Bildung von Mg-ATP als
Substrat erforderlich war (Moriyama & Nelson, 1987). Zum anderen erhielten David & Baron
(1994) sowohl für die Osteoklasten als auch für die Nieren V-ATPase einen jeweils 2-fach
höheren Km-Wert für Mg2+, als nach der Bestimmung des Km-Wertes für ATP zu erwarten
gewesen wäre. Auch bei F-ATPasen konnte ein ähnlich unterschiedlicher Einfluß der beiden
divalenten Kationen auf die Aktivität des Enzyms festgestellt werden. Bei mitochondrialen FATPasen bewirkt Ca2+ zwar ebenso wie Mg2+ eine ATP-Hydrolyse, nicht aber einen
Protonentransport (Pullman et al., 1960). Desweiteren konnte gezeigt werden, dass Mg2+
vermutlich bei der Dissoziation und Reassoziation von F1- und F0 Komplex bei E. coli eine
Rolle spielt (Vogel & Steinhart, 1976).
106
Diskussion
Obwohl es diesen entscheidenden Unterschied zwischen den beiden Kationen gibt, kann die
genauere Betrachtung der Ca-ATPase-Aktivität wichtige Erkenntnisse über Teilschritte der
ATP-Hydrolyse liefern. Dies gilt im besonderen für Untersuchungen am isolierten V1
Komplex, der in wässriger Lösung nur als Ca-ATPase aktiv ist. Hier konnten bereits mit Hilfe
von
CuCl2-Vernetzungsexperimenten
wechselnde
Interaktionen
zwischen
einzelnen
Untereinheiten, in Abhängigkeit von Ca-ATP und Ca-ADP, gefunden werden (Grüber et al.,
2000a).
5.2.2. Warum ist der isolierte V1 Komplex inaktiv?
Der gereinigte cytosolische V1 Komplex hat eine Ca-abhängige ATPase-Aktivität und
keinerlei Mg-ATPase Aktivität. Die Ca-ATPase-Aktivität wird sogar schon durch 0,1 mM
Mg2+ vollständig inhibiert (Gräf et al., 1996). Durch die Zugabe von Methanol läßt sich
allerdings eine Mg-abhängige Hydrolyse von ATP induzieren (Gräf et al., 1996). Diese
methanolabhängige Mg-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes ist vollkommen linear und
unabhängig vom produzierten oder vorgelegten ADP, ähnlich wie es z. B. für den
mitochondrialen F1-Komplex aus Rinderherz beschrieben ist (Ortiz Flores et al., 1982). Bei
der Überprüfung, ob dieser Effekt auch mit anderen Alkoholen erreicht werden kann, zeigte
sich, dass mit zunehmender Kettenlänge weniger Volumenanteil der Alkohole zugesetzt
werden muß, um eine optimale Aktivität zu erhalten. Diese Reihenfolge entspricht der
Aktivierung der Mg-ATPase-Aktivität der CF1-ATPase durch Alkohole (Kneusel et al., 1982;
Mochimaru & Sakurai, 1998), was auf einen vergleichbaren Aktivierungsmechanismus bei
den CF1- und den V1 Komplexen schließen läßt. Allerdings bewirkt Methanol bei der CF1ATPase die Freisetzung von festgebundenen Nukleotiden (Anthon & Jagendorf., 1984),
während beim V1 Komplex keine Veränderung des Gehaltes an festgebundenem ADP
gemessen werden konnte. Aus diesem Grunde kann die Stimulierung der Mg-abhängigen
ATPase-Aktivität durch die Freisetzung eines endogenen inhibitorischen ADPs aus dem
Komplex ausgeschlossen werden. Bis auf die Restablösung, der nur leicht assoziierten und
substöchiometrisch vorhandenen Untereinheit C, deren An- oder Abwesenheit keinerlei
Einfluß auf die Aktivität hat, wurde keine weitere Untereinheit durch die Inkubation mit
Alkoholen aus dem Komplex entfernt. Auch die Untereinheit H verbleibt im V1 Komplex,
was insofern von Bedeutung ist, da für den V1 Komplex einer Vma13p Mutante der Hefe
eine geringe, Methanol-unabhängige Mg-ATPase-Aktivität (0,265 U/mg) beschrieben wurde,
die sich durch Zugabe von Methanol verdoppeln läßt (Parra et al., 2000). Eine Aktivierung
107
Diskussion
des Komplexes durch die Entfernung einer inhibitorischen Untereinheit, analog zur
Entfernung der Untereinheit  der CF1-ATPasen (McCarty, 1992), ist deshalb auszuschließen.
Für die vollständige Inhibierung der Mg-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes in wässriger
Lösung, d. h. in Abwesenheit von Methanol, bieten sich zwei Alternativen an. Zum einen
könnte bei einer Inkubation mit Mg2+ und ATP genau ein Hydrolyseschritt stattfinden, wobei
das entstandene Mg-ADP das Enzym sofort blockiert. Dies bedeutet, dass nach der Inkubation
mit Mg2+ und ATP zusätzliche Nukleotide im V1 Komplex enthalten sind. Falls sich diese
durch Methanol wieder entfernen lassen, wäre die Wirkungsweise geklärt. Zum anderen
könnte sich bei Zugabe von Mg2+ ein inhibierender Komplex aus Mg2+ und bereits
gebundenem ADP bilden, der die Hydrolyse des beim Reaktionsstarts zugegebenen TrisATPs verhindert. Bei einem von endogenen Nukleotiden befreiten V1 Komplex sollte sich
dann Hydrolyse-Aktivität nachweisen lassen. Eine vergleichbare Wirkung von Mg2+ wurde
bei der F1-ATPase und bei der CF1-ATPase nachgewiesen (Drobinskaya et al., 1985; Carmeli
et al., 1981; Digel et al., 1996). Bei der CF1-ATPase wird die aus der Entfernung von
endogenem Nukleotid resultierende schnellere Startgeschwindigkeit der Hydrolyse durch
Wiederbeladen des Enzyms mit Mg-ADP rückgängig gemacht (Digel et al., 1998).
Im Gegensatz zur linearen Mg-ATP-Hydrolyse-Aktivität in Gegenwart von Methanol ist die
Ca-ATPase-Aktivität des V1 Komplexes einer Endprodukthemmung durch Ca-ADP
unterworfen, was durch die starke Hemmung der Hydrolyse nach Vorinkubation mit ADP
und die lineare Ca-GTPase-Aktivität bestätigt wird. Auch für den isolierten V1 Komplex aus
Hefe ist eine Hemmung der Ca-ATP-Hydrolyse durch ADP und eine lineare Ca-GTPaseAktivität beschrieben (Parra & Kane, 1998). Der verwendete V1 Komplex aus Hefe enthält,
im Gegensatz zum V1 Komplex aus M. sexta, keinerlei gebundene Nukleotide. Es handelt sich
aber nicht um einen nativ abdissoziierten, sondern einen durch Deletion von Vma3p
(Untereinheit c) gewonnenen V1 Komplex. Dieser besteht zwar aus allen Untereinheiten (A,
B, D, E, F, G und H), kann aber wegen des defekten Vo Komplexes nicht an die Membran
andocken. Somit hat er weder native ATPase-Aktivität, noch eine native Dissoziation hinter
sich und enthält möglicherweise deswegen kein Nukleotid. Die V1 Komplexe aus beiden
Organismen zeigen aber eine ähnliche Hemmung durch Ca-ADP, weshalb diese sehr
wahrscheinlich nicht durch das bei M. sexta bereits endogen vorhandene ADP vermittelt wird,
sondern durch ein neu gebundenes Ca-ADP. Dieses besetzt möglicherweise eine der
katalytischen Bindestellen und verhindert so weitere Hydrolyse-Aktivität. Für die V1-ATPase
aus Thermus thermophilus ist eine derartige Inaktivierung durch gebundenes ADP
beschrieben (Yokoyama et al., 1998). Dort liegt der ADP-Gehalt des Enzyms zunächst bei
108
Diskussion
weniger als 0,1 mol/mol und steigt während der Hydrolyse bis zur vollständigen Inaktivierung
auf 1,5 mol/mol an.
5.2.3. Die V-ATPase-Aktivität wird durch ADP gehemmt
Die Hydrolyse-Aktivität des V1Vo Holoenzyms aus M. sexta wird durch Mg-ADP deutlich
erniedrigt, wobei man zwischen zwei verschiedenen Arten der Hemmung unterscheiden muß;
die Hemmung durch das während der ATP-Hydrolyse gebildete ADP (siehe 5.2.4.) und die
Hemmung der Startgeschwindigkeit durch Vorinkubation mit Mg-ADP. Letztere scheinen
alle V-ATPasen gemeinsam zu haben, da sie bereits für Vertreter aus verschiedenen Spezies
publiziert wurde. So wird die ATP-Hydrolyse der V-ATPase aus chromaffinen Granula durch
100 µM ADP allosterisch gehemmt (Moriyama & Nelson, 1987). Auch für den ATPabhängigen Protonentransport durch die V-ATPasen in der Niere und in den Osteoklasten
konnte eine inhibierende Wirkung von ADP auf die Startgeschwindigkeit, mit Ki-Werten von
37 bzw. 17 µM, gezeigt werden (David & Baron, 1994). Weiterhin konnten Webster et al.
(1995) einen inhibitorischen Effekt von ADP bei Konzentrationen von 25 bis 200 µM auf die
Protonentransportaktivität der V-ATPase in chromaffinen Granula feststellen. In einer
späteren Arbeit dieser Autoren gelang es, mit Hilfe von [3H]ADP dessen Bindung an eine
hochaffine Bindestelle (Kd=70 nM) nachzuweisen (Webster & Apps, 1996). Für Clathrinvesikel wurde eine bereits bei ADP-Konzentrationen von 0,2 µM beginnende Hemmung des
Protonentransport entdeckt (Vasilyeva & Forgac, 1998). Nicht zuletzt hat die V-ATPase aus
M. sexta mit einer 50%igen Hemmung der Hydrolyse-Aktivität bei ca. 2 µM ADP eine
vergleichbar hohe Empfindlichkeit. Alle diese Ergebnisse sind weitgehend in Einklang mit
dem von Webster et al. (1995) aufgrund von kinetischen Daten vorgeschlagenen Modell für
die
Funktion
der
V-ATPase.
Demnach
gibt
es
für
die
V-ATPase
zwei
Konformationszustände, eine katalytisch aktive R-Konformation und einen inaktive TKonformation, mit jeweils drei katalytischen und einer regulatorischen Bindestelle für
Nukleotide. ADP bindet dabei bevorzugt an die T-Konformation der V-ATPase und reguliert
dadurch die Aktivität des Enzyms.
Eine vergleichbare Art der Verzögerung der katalytischen Aktivität gibt es auch bei den FATPasen. Als Ursache für deren Hemmung nach Vorinkubation mit Mg-ADP geht man von
der Besetzung der hochaffinen katalytischen Bindestelle durch ein Mg-ADP aus, die ähnlich
auch bei der normalen Hydrolyse gemäß dem binding change Mechanismus erfolgt
(Vasilyeva et al., 1982; Feldman & Boyer, 1985; Boyer, 1989; Milgrom & Cross, 1993).
109
Diskussion
5.2.4. Mg-ATP spielt eine wichtige Rolle bei der Dissoziation der V-ATPase in den V1 und
den Vo Komplex
Schon seit geraumer Zeit ist bekannt, dass in vitro bei der membrangebundenen bzw.
rekonstituierten V-ATPase der katalytische V1 Komplex, unter dem Einfluß von chaotropen
Ionen und/oder von Nukleotiden vom Vo Komplex abgetrennt werden kann, wobei eine
Inkubation auf Eis (cold inactivation) die Dissoziation zusätzlich unterstützt (Moriyama &
Nelson, 1989; Bowman et al., 1989; Arai et al., 1989; Kane et al., 1989; Adachi et al.,
1990b). Dabei wurden die stärksten Dissoziationsraten in Gegenwart von Mg-ATP erreicht.
Die Vorinkubation mit NEM, welches die Bindung und Hydrolyse von ATP an die
Untereinheit A verhindert, unterbindet auch eine Dissoziation des Holoenzyms (Bowman et
al., 1989; Moriyama & Nelson 1987 und 1989). Ausserdem wurde mit Hilfe von nicht
hydrolysierbaren ATP-Analoga gezeigt, dass die Bindung von ATP alleine nicht ausreicht,
um eine Dissoziation zu induzieren. Deshalb wird vermutet, dass die V-ATPase während der
ATP-Hydrolyse einen Konformationszustand durchläuft, der sie anfällig für eine Dissoziation
durch chaotrope Ionen macht.
Nachdem die Dissoziation der V-ATPase unter in vivo Bedingungen in der Hefe
nachgewiesen werden konnte, gibt es einige wichtige Hinweise darauf, dass auch in vivo die
ATP-Hydrolyse eine entscheidende Rolle für die Dissoziationsfähigkeit des Enzyms spielen
könnte. So sind inzwischen mehrere Hefe-Mutanten bekannt, die nicht mehr in der Lage sind,
ATP zu hydrolysieren und offensichtlich als Folge davon auch keine Dissoziation der VATPase nach Glukoseentzug aufweisen (Parra & Kane, 1998; MacLeod et al., 1999). Eine
dieser Mutanten ist zwar in der Lage, ATP zu binden, dissoziiert aber trotzdem nicht
(MacLeod et al., 1999). Andererseits reagierte ein Hefestamm mit einer Mutation in der
Untereinheit D (Vma8), was einen mehr als 90%igen Verlust der V-ATPase-Aktivität und des
Protonentransports zur Folge hat genauso wie der Wildtyp mit Dissoziation des Enzyms auf
die Entfernung von Glukose aus dem Nährmedium (Xu & Forgac, 2000). Es reicht also schon
eine relativ geringe Aktivität der V-ATPase aus, um in vivo die Möglichkeit der Regulation
der V-ATPase durch Dissoziation zu erhalten. Die indirekte Vermutung, dass nur wenige
Hydrolyseschritte für eine Dissoziation der V-ATPase erforderlich sind, konnte in der
vorliegenden Arbeit experimentell bestätigt werden. Allein die Hydrolyse von einem einzigen
Mg-ATP pro Holoenzymmolekül scheint vollkommen ausreichend zu sein, die V-ATPase
soweit zu destabilisieren, dass eine Dissoziation in V1 und Vo Komplex erfolgt. Auch die
110
Diskussion
Inkubation mit hohen Mg-ADP-Konzentrationen löst eine teilweise Dissoziation der VATPase aus (Moriyama & Nelson 1989; Bowman et al., 1989). Für die Dissoziation könnte
man sich folgendes Szenario vorstellen. Mg-ATP bindet an die V-ATPase, wird hydrolysiert
und das entstehende Mg-ADP wird sofort durch ein neues Mg-ATP ersetzt. Ist aufgrund eines
ungünstigen ADP/ATP-Verhältnisses nicht ausreichend ATP vorhanden, verbleibt das MgADP in der Bindetasche. Diese Konformation der V-ATPase ist offensichtlich relativ instabil;
das Enzym tendiert damit zur Dissoziation, die umso wahrscheinlicher ist, je länger die
instabile Konformation beibehalten wird. Möglicherweise erklärt dies auch den Effekt der
cold inactivation bei dem die V-ATPase bei Inkubation mit Mg-ATP auf Eis deutlich
schneller dissoziiert als unter gleichen Bedingungen bei Raumtemperatur (Moriyama &
Nelson, 1989). Da die ATP-Hydrolyse bei niedrigen Temperaturen langsamer erfolgt ist das
Enzym möglicherweise bei jedem Reaktionsschritt länger in einer instabilen Mg-ADPKonformation als bei Raumtemperatur und dissoziiert deshalb leichter.
Widersprüchlich sind in diesem Zusammenhang die Befunde in Hinblick auf den ADP-Gehalt
der abdissoziierten V1 Komplexe. In den in vitro erhaltenen Komplexen konnte kein ADP
nachgewiesen werden, dagegen haben alle nativ von der Membran abdissoziierten V1
Komplexe einen ADP-Gehalt von ca. 1,7 mol/mol. Der ADP-Gehalt im intakten Holoenzym
stieg bei den in vitro Versuchen allerdings auf einen ähnlichen Wert von 1,8 mol/mol an. Um
die Rolle des ADPs in diesem Zusammenhang zu verstehen, ist es notwendig zu klären, ob 1)
ADP in beiden Fällen an der gleichen Stelle gebunden ist, was auf eine gleiche Funktion
hinweisen würde oder ob 2) verschiedene Bindestellen vorhanden sind, die unterschiedliche
Funktionen implizieren. Beim Holoenzym könnte es sich um einen Sensor für die
Energieladung der Zelle handeln, welcher die Dissoziation des V1 Komplexes vom Vo
Komplex induziert. Dass die V-ATPase selbst auf wechselnde ATP/ADP-Verhältnisse in der
Zelle reagiert, zeigen die Ergebnisse von Dietz et al. (1998). Hier wurde die V-ATPase aus
Gerste mit unter verschiedenen Bedingungen in vivo gemessenen ATP/ADP-Verhältnissen
inkubiert und die Aktivität bestimmt. Diese korrelierte mit der in vivo gemessenen
Ansäuerung der Vakuole unter den selben Bedingungen.
Beim V1 Komplex könnte das endogene ADP die Mg-ATPase-Aktivität abschalten, wie es
bei T. thermophilus der Fall ist (Yokoyama et al., 1998). Für die Bindung des ADPs bieten
sich zunächst natürlich die 3 katalytischen Untereinheiten A an. Nach kinetischen
Untersuchungen hat die V-ATPase allerdings neben drei katalytischen Bindestellen auch noch
mindestens eine regulatorische Bindestelle (Webster et al., 1995). Es gibt bereits eine ganze
Reihe von Befunden, welche belegen dass auch andere Untereinheiten mit Nukleotiden
111
Diskussion
interagieren. Die Untereinheit B der V-ATPase aus Hefe kann sowohl mit 2-Azido-ATP als
auch mit BzATP markiert werden (Zhang et al., 1995; Vasilyeva & Forgac, 1996). Weiterhin
konnte in chromaffinen Granula die Untereinheit D mit radioaktivem ATP markiert werden
(Moriyama & Nelson, 1987). Auch konnte kürzlich die Untereinheit E mit 8-N3-3´-biotinylATP markiert werden, wobei diese Markierung allerdings als Folge der engen Nachbarschaft
der Untereinheit E, als putatives -Homolog, mit der katalytischen Untereinheit A interpretiert
wurde (Schäfer et al., 2001). Da es in einem Vorversuch bereits durch die Verwendung von
alkalischer Phophatase gelang, den nativen V1 Komplex deutlich von seinem endogen
gebundenen ADP zu befreien und das native Holoenzym quasi frei von Nukleotiden ist sollte
es mit den entsprechenden Nukleotid-Sonden möglich sein die Bindestelle des ADPs zu
identifizieren.
5.3. Makrolid Antibiotika als Inhibitoren der V-ATPase
5.3.1. Die Identifizierung der plecomakrolidbindenden Untereinheit der V-ATPase
Die Plecomakrolide Bafilomycin und Concanamycin, welche von Werner et al. (1983, 1984)
erstmals beschrieben wurden, sind seit mehreren Jahren für ihre sehr spezifische und
reversible Hemmung von V-Typ ATPasen in nanomolaren Konzentrationen, aber auch für die
Hemmung von P-Typ ATPasen in mikromolaren Konzentrationen bekannt (Bowman et al.,
1988; Dröse et al., 1993; Dröse & Altendorf, 1997). Über die Art der Inhibierung bzw. die
Bindungsstelle der Antibiotika in den Enzymen ist allerdings sehr wenig bekannt.
Hanada et al. (1990) berichteten, dass Bafilomycin A1 bei V-ATPasen aus chromaffinen
Granula des Rindes mit dem Vo Komplex interagiert, da durch Zugabe von Vo Komplexen zu
gereinigtem V1Vo Holoenzym, dessen Hemmung durch Bafilomycin A1 unterdrückt werden
konnte, zugesetzte V1 Komplexe dagegen waren wirkungslos. Der Vo Komplex als Zielort der
Plecomakrolidhemmung wurde durch zwei weitere Publikationen zur V-ATPase aus
Clathrinvesikeln von Rindern bestätigt (Crider et al., 1994; Zhang et al., 1994). Zum einen
konnte durch 1 nM Bafilomycin A1 der passive Protonenfluß durch das säureaktivierte
rekonstituierte V1Vo Holoenzym und durch den säureaktivierten rekonstituierten Vo Komplex
unterbunden
werden.
Zum
anderen
wurde
die
Hemmung
des
ATP-getriebenen
Protonentransports von rekonstituiertem V1Vo Holoenzym durch Bafilomycin A1 untersucht.
Durch Zugabe von rekonstituiertem Vo Komplex, rekonstituierter Untereinheit a oder
112
Diskussion
gemeinsam rekonstituierten Untereinheiten a und d konnte diese vermindert werden, nicht
jedoch durch Untereinheit d alleine oder der Kombination aus c und c´. Daraus schlossen die
Autoren auf eine Bindungsstelle für Bafilomycin A1 in der Untereinheit a. Ein Widerspruch
ergab sich allerdings aus der Beobachtung, dass Proteoliposomen mit den gemeinsam
rekonstituierten Vo-Untereinheiten c, c´ und a, bzw. c, c´, d und a keinerlei Wirkung hatten.
Dies läßt auf eine Veränderung der Eigenschaften der Untereinheiten während der Reinigung
bzw. der Rekonstitution schließen.
Die Ergebnisse aus drei weiteren Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Wirkung von
Bafilomycinen auf die V-ATPase unabhängig von der Untereinheit a stattfindet. So zeigten Li
& Sze (1999), dass bei der gereinigten V-ATPase aus Hafer, welche keine Untereinheit a
enthält, die ATP-Hydrolyse durch Bafilomycin inhibiert wird. Ähnliches konnte in Hinblick
auf die Enzymaktivität bereits für die gereinigte V-ATPase aus M. sexta gezeigt werden,
deren Präparation früher ebenfalls keine Untereinheit a enthielt, die aber trotzdem sensitiv für
Bafilomycin war (Wieczorek et al., 1991). Weiterhin beobachten Landolt-Marticorena et al.
(2000) eine Hemmung der ATP-Hydrolyse durch Bafilomycin auch nachdem der
Protonentransport durch die Trypsinisierung der Untereinheit a von der ATP-Hydrolyse
entkoppelt wurde.
Einen Hinweis auf die Untereinheit c des Vo Komplexes als möglicher Bindungspartner für
Plecomakrolide
lieferte
eine
Affinitätschromatographie
mit
kovalent
gebundenem
Bafilomycin C1, welche zur Reinigung der V-ATPase aus Hühnchenosteoklasten eingesetzt
wurde (Rautiala et al., 1993). Dabei zeigte die Untereinheit c eine sehr hohe Affinität zur
Bafilomycin C1 Säule und eine Vorinkubation mit dem Untereinheit c spezifischen Inhibitor
DCCD in einer Konzentration von 1 mM verhinderte die Bindung der V-ATPase an die
Säule, woraus auf eine Bindestelle des Bafilomycins in der Untereinheit c nahe der DCCDBindestelle geschlossen wurde. Allerdings bindet DCCD bei dieser hohen Konzentration
nicht nur an Carboxylgruppen wie die von Glutamat und Aspartat, sondern auch an
Sulfhydrylgruppen und Tyrosin-Seitenketten (Azzi et al., 1984). Deshalb konnte eine
Modifikation von Makrolidbindestellen in anderen Untereinheiten bzw. an einer anderen
Stelle der Untereinheit c nicht ausgeschlossen werden. Außerdem war zum Zeitpunkt der
Publikation die Anwesenheit bzw. Identität der Untereinheit a in der V-ATPase aus
Hühnchenosteoklasten noch nicht geklärt, so dass diese möglicherweise nur nicht detektiert
werden konnte. Durch ein mit 3H markiertes Derivat des Bafilomycins A1 konnte bei der VATPase aus Hühnchenosteoklasten eine nicht kovalente Bindung an den Vo Komplex
nachgewiesen werden (Mattsson & Keeling, 1996), wodurch die direkte Interaktion von
113
Diskussion
Plecomakroliden mit dem Vo Komplex endgültig bestätigt wurde. Weiterhin unklar war
jedoch, in welcher der Vo Untereinheiten die Plecomakrolidbindestelle sitzt. Diese Frage
konnte nun durch die Experimente der vorliegenden Arbeit eindeutig geklärt werden.
Wie bereits erwähnt, wurde in einer langjährigen Zusammenarbeit der Arbeitsgruppen von
Prof. Altendorf (Universität Osnabrück) und Prof. Zeeck (Universität Göttingen) versucht, die
für die Hemmung entscheidenden Strukturelemente der Plecomakrolide zu finden und
diejenigen Positionen zu identifizieren, die für eine Modifikation ohne großen Verlust an
Spezifität und Hemmung geeignet sind (Dröse et al., 1993; Dröse et al., 2001). Für die
biologische Wirksamkeit erwies sich der Makrolactonring als essentiell und der
Hemiketalring für eine maximale Hemmung als entscheidend. Die Position C23, an der bei
Concanamycin A ein Zuckerrest gebunden ist, der lediglich zu einer höheren chemischen
Stabilität der Verbindung beiträgt, konnte ohne Aktivitätsverlust entfernt und modifiziert
werden. Ähnliche Untersuchungen an Bafilomycin A1 von Gagliardi et al. (1998, 1999)
zeigten ebenfalls, dass diese Position, bei Bafilomycinen handelt es sich um C21, ohne
Einfluß auf die Aktivität modifiziert werden kann. Deshalb wurde diese Position mit einem
125
I besetzt, welches zu Detektion mittels Autoradiographie genutzt wurde. Als weitere Stelle,
bei der eine Modifikation keinen Einfluß auf die Hemmungseigenschaften hat, bot sich die
Position
C9
an,
deren
OH-Gruppe
gegen
eine
UV-aktivierbare
Gruppe,
ein
Trifluormethylaryldiazirin (Brunner et al., 1980) ausgetauscht wurde. Diese Gruppe bildet
nach UV-Bestrahlung bei 360 nm ein hochreaktives, aber sehr kurzlebiges Carben, welches
mit allen in Proteinen vorkommenden Resten kovalente Bindungen eingehen kann, wobei die
Reaktion mit Nucleophilen die bevorzugte ist. Außerdem wurde noch die Position C21
deoxyliert, was sich positiv auf die Stabilität der Verbindung auswirkte. Die daraus
resultierende Verbindung 9-O-[p-(Trifluoroethyldiazirinyl)-benzoyl]-21,23-dideoxy-23-epi[125I]Iodo-concanolid A, (J-Concanolid A, Abb. 33) wurde zunächst als nicht radioaktive
Verbindung für Hemmstudien des gereinigten V1Vo Holoenzyms eingesetzt und hatte mit
einem IC50 von 10-20 µM im Vergleich zu seiner Ausgangssubstanz Concanamycin A mit
einem IC50 10 nM zwar eine schlechtere Hemmung, die aber immer noch als ausreichend
erachtet wurde. Bei der konzentrationsabhängigen Markierung des V1Vo Holoenzyms mit der
Sonde konnte nur die Markierung der Untereinheit c beobachtet werden. Selbst mit einer
Konzentration von 100 µM, bei der die ATPase-Aktivität des V1Vo Holoenzyms bis zu 90%
gehemmt ist, wurde keine andere Untereinheit markiert. Die direkte Bindung der Sonde an die
Untereinheit
c
wird
durch
vier
weitere
Befunde
gestützt.
Erstens
konnte
bei
Radioaktivitätsmessungen der an Hand der Proteinfärbung identifizierten und aus dem SDS114
Diskussion
PAGE Gel ausgeschnittenen Bande eine Zunahme der daran gebundenen Radioaktivität in
Abhängigkeit von der eingesetzten Sondenkonzentration gemessen werden. Diese korreliert
auch mit dem Grad der Inhibierung des V1Vo Holoenzyms bei den gleichen Konzentrationen.
Zweitens wird auch im gereinigten Vo Komplex nur die Bande der Untereinheit c markiert
wobei diese Markierung ein, für den Vo Komplex typisches Bild der Untereinheit c, mit einer
relative breiten Bande aufweist, die auch in der Proteinfärbung wie in der Autoradiographie
mit
14
C-DCCD zu bemerken ist. Drittens wird in den Vesikeln der GCAM, in der sich das
V1Vo Holoenzym in seiner nativen Membran mit der originären Lipidzusammensetzung
befindet, ebenfalls nur die Untereinheit c markiert. Letztlich konnte die Untereinheit c per
MALDI-MS-Analyse der aus dem SDS-PAGE-Gel ausgeschnittenen Banden, die auch
Radioaktivität aufwiesen, eindeutig identifiziert werden. In Gegenwart der Sonde konnten
kovalente Modifikationen an bestimmten Fragmenten festgestellt werden, die ohne Sonde
nicht vorhanden waren. Die Massenzunahme der Fragmente von Aminosäure 8-22, 12-29 und
85-87 um 842 kDa entspricht der Masse des J-Concanolids A, welches seine HI-Gruppe
verloren hat. Dieser Verlust ist wahrscheinlich auf die Säureempfindlichkeit der Sonde und
die doch sehr niedrigen pH-Werte bei der Gelfixierung und der Vorbereitung für die MALDIMS zurückzuführen. Bei den drei anderen gefundenen Fragmenten, Aminosäure 1-7, 85-87
und 138-151 erhöhte sich die Masse um 972 kDa. Diese Erhöhung ist etwas kritischer zu
betrachten, da bei Bindung der ganzen Sonde nur eine Massenzunahme von 970 kDa zu
erwarten ist. Möglicherweise ereignet sich eine zusätzliche Modifikation der Sonde, z. B. das
Öffnen einer der C-C Doppelbindungen und Anlagerung zweier Protonen. Die Untersuchung
einer möglichen Modifikation der Sonde und die sehr zeitaufwendige, genauere Analyse und
Sequenzierung der erhaltenen modifizierten Fragmente dauert noch an. Allerdings sprechen
mehrere Hinweise dafür, dass es sich bei den Fragmenten tatsächlich um die Umgebung der
Bindestelle handelt. Erstens taucht das Fragment 85-87 mit beiden Modifikationen auf.
Zweitens überlappen sich die Fragmente 8-22 und 12-29, und das Fragment 1-7 liegt in ihrer
direkten Nachbarschaft. Drittens befinden sich die Fragmente 1-7 und 85-87 nach
Vorhersagen zur Topologie der Untereinheit c auf der luminalen Seite der Membran und auch
die anderen Fragmente sind in der luminalen Hälfte der Membran zu finden (Tab. 9; Findlay
et al., 1997). Dagegen war keines der gefundenen Fragmente cytosolisch orientiert. Deshalb
kann man vermuten, dass die Bindetasche für J-Concanolid A und somit auch für
Concanamycin A auf der luminalen Seite der Membran liegt oder von dort zugänglich ist.
115
Diskussion
Tab. 9: Topologie der Untereinheit c. Die Daten für die Untereinheit c von M. sexta wurden aus NiceProt view
of SWISS-PROT für Acc. Nr. P31403 übernommen.
Aminosäurenummer
1-7
8-30
31-52
53-73
74-92
93-114
115-126
127-152
153-156
Orientierung
Lumen
Membran
Cytosol
Membran
Lumen
Membran
Cytosol
Membran
Lumen
Auch die Spezifität der Sonde konnte untermauert werden, da sich die Markierung durch 10
µM J-Concanolid A mit 1 µM vorgelegtem Concanamycin A deutlich abschwächen und
durch höhere Konzentrationen (10 µM, 100 µM und 300 µM) ganz verhindern läßt, was eine
gemeinsame Bindestelle für Concanamycin A als Ausgangssubstanz und J-Concanolid A als
dessen Derivat nahelegt. Für die vollständige Verdrängung der Markierung muß demnach
mehr Concanamycin A eingesetzt werden als für die vollständige Hemmung der ATPHydrolyse. Die Ursache dafür ist möglicherweise, dass für eine vollständige Hemmung,
ähnlich wie für DCCD gezeigt (Forgac, 1998), nur ein einziges gebundenes Inhibitormolekül
pro V-ATPase benötigt wird; im optimalen Fall stünden dem J-Concanolid A noch die 5
weiteren Bindestellen der anderen Untereinheiten c zur Verfügung. Es müssen demgemäß alle
sechs Untereinheiten c mit Concanamycin A besetzt sein, bis keine Markierung mehr möglich
ist.
Neben den Concanamycinen gehören auch die bereits mehrfach erwähnten Bafilomycine zu
den Plecomakroliden (Bindseil & Zeeck, 1994). Zwei Vertreter dieser Gruppe, Bafilomycin
A1 und Bafilomycin B1, wurden ebenfalls auf ihre Fähigkeit getestet, die V-ATPase zu
hemmen bzw. mit J-Concanolid A um die Bindestelle in der Untereinheit c zu konkurrieren.
Mit einem IC50 zwischen 10-20 nM lagen sie exakt im Bereich des parallel getesteten
Concanamycin A. Dies war zunächst etwas überraschend, da Concanamycin A eigentlich als
der potentere Inhibitor für V-ATPasen gilt und der bisher bekannte IC50-Wert für Bafilomycin
A1 bei M. sexta auch etwas höher lag (Bowman et al., 1988; Dröse et al., 1993; Wieczorek et
al., 1991). Der niedrigere Wert für Bafilomycin A1 liegt wahrscheinlich zum einen an der
großen Reinheit der verwendeten Plecomakrolide, die wir direkt von der Arbeitsgruppe von
Prof. Zeeck (Göttingen) erhalten hatten und zum anderen an der schon beschriebenen
Lagerung der in DMSO gelösten Makrolide bei -70°C und der strikten Vermeidung von
116
Diskussion
Gefrier-Auftau-Zyklen,
besonders
bei
den
instabileren
Bafilomycinen.
Gleiche
Empfindlichkeit der V-ATPase gegenüber allen drei verwendeten Plecomakroliden kommt
nicht nur bei M. sexta vor sondern ist auch für Mesembryanthemum crystallinum beschrieben
worden (Dröse et al., 2001). Die Unterschiede zur V-ATPase von N. crassa könnten sich
durch unterschiedliche Affinitäten erklären lassen; die höhere Flexibilität des mit 18 CAtomen größeren Lactonrings der Concanamycine erlaubt gegenüber dem steiferen 16 CRing der Bafilomycine eine leichtere Anpassung an eine von Spezies zu Spezies
möglicherweise verschieden gestalteten Bindungstasche (Kinashi et al., 1984; Dröse &
Altendorf, 1997). Auf jeden Fall konnten beide verwendeten Bafilomycine die Markierung
der Untereinheit c durch J-Concanolid A unterbinden, was verallgemeinernd einen Schluss
auf eine gemeinsame Bindestelle in der Untereinheit c für Plecomakrolide zulassen dürfte.
Leider gibt es außer bei den drei erwähnten Organismen offensichtlich keine vergleichenden
Untersuchungen zur Hemmung von Bafilomycinen und Concanamycinen. Bei einem
Sequenzvergleich der Untereinheiten c dieser drei Spezies, zeigen sich jedoch gemeinsame
Unterschiede von M. sexta und M. crystallinum zu N. crassa, die evtl. zu einer veränderten
Bindetasche führen könnten (Abb. 64). Von den 10 gefundenen Aminosäureaustauschen sind
5 neutral, bei den anderen 5 handelt es sich um Wechsel von polaren zu hydrophoben Resten
oder umgekehrt (LN, TA, SA, SA), sowie einen Austausch von einem polaren
Glutamin (Q91) zu einem positiv geladenem Histidin (H92 bzw. H95). Diese zusätzliche
Ladung befindet sich in der unmittelbaren Nachbarschaft des Fragmentes 85-87, welches
vermutlich mit J-Concanolid A markiert wird. Durch gerichtete Mutationen an diesen
Positionen, unterstützt von vergleichenden Analysen anderer V-ATPasen, die den Austausch
QH haben wie z. B. die Pflanzen-V-ATPasen oder nicht haben wie z. B. die Säuger-VATPasen (siehe auch Abb. 65) könnte untersucht werden, ob dieser Zusammenhang wirklich
besteht.
Abb. 64: Vergleich der Untereinheiten c von N. crassa, M. sexta und M. crystallinum. Die Aminosäuren aus
der Sequenz von N. crassa, welche sich von den beiden anderen Sequenzen unterscheiden, diese aber
gemeinsam haben, sind hervorgehoben. (grau unterlegt, neutrale Austausche; schwarz unterlegt, nicht neutrale
Austausche)
117
Diskussion
5.3.2. Gibt es eine gemeinsame Bindestelle für Makrolide in V-ATPasen?
Die Plecomakrolide gehören zur Familie der Makrolide, in deren Reihen einige neue
Substanzen mit ganz unterschiedlichen Wirkungen auf V-ATPasen aus verschiedenen Spezies
beschrieben sind. Eine dieser neuen Gruppen bei den Makroliden sind die BenzolactonEnamide (Erickson et al., 1997). Zwei Vertreter dieser Gruppe wurden hier bezüglich ihres
Einflusses auf die V-ATPase aus M. sexta untersucht, das Salicylihalamid und das Apikularen
A. Salicylihalamid wurde erstmals aus dem marinen Schwamm Haliclona sp. isoliert und hat
eine stark cytotoxische Wirkung. Sehr wahrscheinlich wird Salicylihalamid allerdings nicht
von Haliclona sp. selbst, sondern von einem symbiontischen Mikroorganismus dieses
Schwammes produziert (Erickson et al., 1997). Bei Untersuchungen mit V-ATPasen aus
verschiedenen Spezies ergab sich für Salicylihalamid ein sehr differenziertes Bild; so wurde
die V-ATPase von S. cervisae und N. crassa nicht gehemmt, wohl aber Säuger-V-ATPasen
aus Leber, Niere und Osteoklasten (Boyd et al., 2001).
Für den zweiten Vertreter der Benzolacton-Enamide, das Apikularen A, isoliert aus dem
Myxobakterium Chondromyces robustus ist ähnliches bekannt; es hat keinerlei Effekt auf
Hefen und filamentöse Pilze, wirkt aber stark toxisch auf Säugetierzellen (Kunze et al., 1998;
Jansen et al., 2000; Boyd et al., 2001).
Archazolid und Cruentaren gehören ebenfalls zur Gruppe der Makrolide und werden auch aus
Myxobakterien isoliert (Prof. Reichenbach & Dr. Sasse, GBF Braunschweig, persönliche
Mitteilung). Archazolid führt bei Wachstumstests in Säugetierzelllinien zu den gleichen
cytotoxischen Wirkungen und den gleichen morphologischen Veränderungen wie
Salicylihalamid, Concanamycin und Bafilomycin z. B. die Erweiterung des Endoplasmatischen Retikulums oder die Bildung von Streßfaserbündeln (Reichenbach, 1997 und Dr.
Sasse, persönliche Mitteilungen). Für Cruentaren werden dagegen wesentlich höhere
Konzentrationen für eine Hemmung des Zellwachstums benötigt, und die morphologischen
Veränderungen der Zellen haben andere Ausprägungen, was auf eine andere Wirkungsart der
Cytotoxizität hinweist (Dr. Sasse, persönliche Mitteilung). Diese letzten drei Vertreter der
Makrolide wurden in dieser Arbeit erstmals auf ihre Wirkung auf V-ATPasen getestet,
Salicylihalamid zum ersten Mal bei einer Insekten V-ATPase. Für Salicylihalamid,
Apikularen und Archazolid wies die V-ATPase die gleiche Empfindlichkeit auf wie für die
Plecomakrolide mit einem IC50 von 10-20 nM. Mit der Insekten V-ATPase wurde somit
neben den Säuger-V-ATPasen eine zweite Gruppe von V-ATPasen mit hoher Sensitivität
118
Diskussion
gegenüber Benzolacton-Enamiden etabliert und Archazolid A als neue V-ATPase hemmende
Substanz in die Makrolidfamilie eingeführt.
Warum die V-ATPase von M. sexta und die V-ATPasen von Säugern im Gegensatz zu VATPasen aus S. cervisae und N. crassa auf die Benzolacton-Enamide reagieren, ist nicht klar.
Geht man allerdings von der Annahme aus, dass die Benzolacton-Enamide, ähnlich wie die
Plecomakrolide an die Untereinheit c binden, ergeben sich bei einem Vergleich der
Aminosäuresequenzen dieser Untereinheit, welche bei allen Spezies hoch konserviert ist, fünf
Positionen, die nur S. cervisae und N. crassa gemeinsam haben (Abb. 65). Ob einer dieser
Aminosäureaustausche allerdings die Unempfindlichkeit der V-ATPase aus diesen beiden
Organismen gegenüber Benzolacton-Enamiden bewirkt, müßte wiederum durch gezielte
Mutageneseexperimente überprüft werden. Auch wurden bisher noch keine Tests an
pflanzlichen V-ATPasen durchgeführt, welche im Vergleich (Abb. 65) ebenfalls
berücksichtigt sind.
Abb. 65: Sequenzvergleich der V-ATPase Untereinheiten c. Es sind die Sequenzen folgender Spezies
miteinander verglichen: S. cerevisiae, N. Crassa, R. norvegicus, H. sapiens, B. taurus, A. aegyptie, N.
norvegicus, N. tabacum, G. hirsutum, M. crystallinum und O. sativa. Die fünf Aminosäuren die nur S. cerevisiae
und N. crassa im Vergleich zu allen anderen Spezies gemeinsam haben, sind hervorgehoben.
Besonders interessant waren in diesem Zusammenhang auch die Versuche, die Markierung
durch J-Concanolid A durch die vier neuen Makrolide zu kompetitieren. Mit 10 µM
Archazolid A gelang es, ähnlich wie mit Concanamycin A, Bafilomycin A1 bzw. B1 die
Markierung vollständig zu unterdrücken, mit Salicylihalamid und Apikularen gelang dies,
obwohl sie die gleiche Effizienz in der Hemmung der V-ATPase zeigen, nicht.
119
Diskussion
Wie nach den Beobachtungen von Dr. Sasse zu erwarten war, hatte Cruentaren einen deutlich
höheren IC50 von 60 µM bezüglich der Hemmung der V-ATPase, und es konnte ebenfalls
keine Verdrängung der Markierung durch J-Concanolid A nachgewiesen werden.
Damit gibt es einen entscheidenden Unterschied in der Wirkungsweise von Plecomakroliden
und Archazolid A gegenüber den Benzolacton-Enamiden, da sie bei gleichen IC50 Werten
einen verschiedenen Einfluß auf die Markierung mit J-Concanolid A haben. Hierfür bieten
sich zwei Erklärungsmöglichkeiten an. Erstens, die beiden Gruppen haben verschiedene
Bindungsstellen an die V-ATPase und binden dort unabhängig voneinander an das Enzym,
möglicherweise sogar an unterschiedlichen Untereinheiten. Bisher gibt es keine Daten über
die Wirkungsweise der Benzolacton-Amide-Hemmung auf die V-ATPase. Es ist nur der
Effekt auf Zellkulturen bzw. die V-ATPase-Aktivität, nicht aber ein Einfluß auf die
Protonenleitfähigkeit des Vo Komplexes gezeigt, wie dies für Plecomakrolide geschehen ist
(Crider et al., 1994; Zhang et al., 1994), so dass durchaus eine andere inhibitorische Wirkung
auf die V-ATPase-Aktivität denkbar wäre. Die zweite Möglichkeit könnte in der Größe der
Bindetasche der V-ATPase für die Makrolide begründet liegen. Diese muß relativ groß sein,
da sowohl der Makrolidring als auch der Hemiketalring einen entscheidenden Einfluß auf die
Hemmung der V-ATPase haben (Dröse et al., 1993; Gagliardi et al., 1999; Dröse et al.,
2001). Vielleicht ist sie bei einer Vorinkubation mit Plecomakroliden und Archazolid A
blockiert, weshalb sich das J-Concanolid A nicht einlagern kann. Dagegen füllen die
kleineren Benzolacton-Amide diese Tasche nicht vollständig aus und das J-Concanolid A hat
zusätzlich Platz um zu binden oder es verdrängt durch seine Anlagerung das BenzolactonAmid.
5.3.3. Die V-ATPase von M. sexta: Ein Modellsystem für die Osteoporoseforschung
Die Untersuchung der V-ATPase und die Wirkungsweise ihrer spezifischen Inhibitoren, vor
allem aus der Gruppe der Makrolide, wird im Zusammenhang mit der Osteoporoseforschung
immer wichtiger. Die zum Knochen hin orientierten Membranen der Osteoklasten sind dicht
mit V-ATPasen bestückt (Blair et al., 1989), und es gibt einen direkten Zusammenhang
zwischen der V-ATPase und dem Abbau von Knochenmaterial durch die Osteoklasten
(Chatterjee et al., 1992; Blair, 1998). Eine spezifische Hemmung der V-ATPase in
Osteoklasten könnte also den Knochenabbau verhindern oder verlangsamen. Es konnte schon
gezeigt werden, dass Bafilomycin A1 in vitro und in vivo in der Lage ist, genau dies zu
bewirken (Sundquist et al., 1990; Farina et al., 1995). Allerdings wirkt Bafilomycin auch auf
120
Diskussion
alle anderen V-ATPasen im Organismus und seine Letaldosis liegt bei 1 mg/kg
Lebendgewicht. Bekannt sind aber auch osteoklastenspezifische Isoformen von V-ATPase
Untereinheiten (Van Hille et al., 1993, 1995; Bartkiewicz et al., 1995; Lee et al., 1996; Li et
al., 1996) und eine Regulation der mRNA für V-ATPase Untereinheiten während der
Osteoklastenreifung (Laitala-Leinonen et al., 1996). Deshalb wird versucht, ausgehend von
der bekannten Struktur von Bafilomycin, durch Modifikation einen Inhibitor zu finden, der
nur die V-ATPase in den Osteoklasten hemmt (Farina & Gagliardi, 1999; Gagliardi et al.,
1998; Keeling et al., 1998). Durch die Entdeckung der neuen Mitglieder der Makrolidfamilie,
die zwischen V-ATPasen aus verschiedenen Spezies unterscheiden können, bietet sich eine
neue Ansatzmöglichkeit, um gewebespezifische Inhibitoren der V-ATPasen zu finden (Boyd
et al., 2001; Farina & Gagliardi, 1999). Da die V-ATPase aus M. sexta ähnlich wie die VATPase aus Osteoklasten durch die Benzolacton-Amide gehemmt wird, eignet sie sich auch
aufgrund ihrer hohen Reinheit und Verfügbarkeit hervorragend für eine Struktur-FunktionsAnalyse von neuen Inhibitoren.
Eine weitere wichtige Gemeinsamkeit zwischen der V-ATPase aus M. sexta und der VATPase aus Osteoklasten spiegelt sich in einer für beide beobachteten Interaktion mit dem
Cytoskelett der Zelle wieder. So konnte gezeigt werden, dass die V-ATPase während der
Aktivierung der Osteoklasten mit dem Aktincytoskelett direkt interagiert und in vitro an FAktin bindet (Lee et al., 1999; Holliday et al., 2000). Auch die V-ATPase aus M. sexta kann
in vitro direkt an Aktin binden, und in der Zelle colokalisiert sie mit Aktinfilamenten
(Merzendorfer et al., 2001). Mit ihrer Empfindlichkeit gegenüber Plecomakroliden und der
neuen Gruppe der Benzolacton-Amide, sowie ihrer Interaktion mit dem Aktincytoskelett stellt
die V-ATPase von M. sexta damit möglicherweise ein ideales Modell dar, mit dem
grundlegende Fragen in der Osteoporose-Forschung geklärt werden können.
121
Zusammenfassung
6. Zusammenfassung
Die V-ATPase im larvalen Mitteldarm des Tabakschwärmers Manduca sexta energetisiert die
gesamten sekundär aktiven Transportprozesse in diesem Epithel. Sie ist einer der best
untersuchten Vertreter dieser Klasse von Ionentransport-ATPasen und hat sich als ideales
Objekt für die Untersuchung von Struktur, Funktion und Regulation dieser Proteinfamilie
erwiesen. In der vorliegenden Dissertation wurde die Struktur des V1Vo Holoenzyms, des V1
Komplexes und des Vo Komplexes, die Regulation der V-ATPase-Aktivität und die
Hemmung der V-ATPase durch Makrolide untersucht.
Mit der Modifikation von bestehenden und der Etablierung von neuen Protokollen gelang es
das V1Vo Holoenzym, den V1 Komplex und den Vo Komplex in Milligramm-Mengen zu
reinigen und damit die Vorraussetzung für neue Erkenntnisse über die Struktur der V-ATPase
zu schaffen.
Durch N-terminale Sequenzierung, Immunfärbung und/oder MALDI-MS konnten neben den
bereits bei M. sexta bekannten Untereinheiten A, B, E, F, G, c und d auch die restlichen
Untereinheiten C, D, H, a und e identifiziert werden. Das als Kontamination der V-ATPase
häufig auftauchende Protein B´ wurde als ein mitochondriales Hsp60 identifiziert. Bei dem
sowohl im Holoenzym als auch im Vo Komplex vorhandenen 26 kDa großen Protein handelt
es sich sehr wahrscheinlich um ein Dimer der Untereinheit c und nicht, wie bislang vermutet
um deren Isoform c´´. Für die im V1 Komplex nur substöchiometrisch vorhandene
Untereinheit C konnte gezeigt werden, dass sie im Gegensatz zur Situation beim V 1Vo
Holoenzym nur sehr schwach gebunden ist. Sie lässt sich schon unter relativ milden
Bedingungen (0,01% C12E10) vom V1 Komplex abtrennen, reassoziiert aber andererseits auch
sehr leicht wieder an den V1 Komplex, wie mit einer rekombinanten Untereinheit gezeigt
werden konnte. Durch die Behandlung des V1 Komplexes mit chaotropen Ionen ergaben sich
Hinweise, die eher auf die Untereinheit D als auf die Untereinheit E als Homolog der VATPasen zur -Untereinheit der F-ATPasen schließen lassen. Durch die Erhöhung der
Ionenstärke während eines Reinigungsschrittes gelang es erstmals, die Untereinheit a bei einer
Insekten V-ATPase darzustellen. Dies gelang sowohl für das V1Vo Holoenzym als auch für
den Vo Komplex und war besonders wichtig, da die Untereinheit als der Favorit für die
Bindung der V-ATPase spezifischen inhibitorischen Plecomakrolide angesehen wurde. Wie
sich allerdings herausstellte, ist die Untereinheit c des Vo Komplexes die einzige Untereinheit
die durch das semisynthetische Concanamycin-Derivat, 9-O-[p-(Trifluoroethyldiazirinyl)122
Zusammenfassung
benzoyl]-21,23-dideoxy-23-epi-[125I]Iodo-concanolid A (J-Concanolid A) spezifisch markiert
wird. Durch MALDI-MS konnten einige Bereiche der Untereinheit c bestimmt werden, die
potentiell mit der Sonde interagieren. Diese Abschnitte befinden sich alle auf der luminalen
Seite der Membran. Beim Testen einer Reihe neuer Makrolide zeigte sich erstaunlicherweise,
dass Salicylihalamid, Apikularen und Archazolid ähnlich wie Concanamycin A, Bafilomycin
A1 und B1, mit einem IC50 von ca. 20 nM die V-ATPase schon bei sehr niedrigen
Konzentrationen hemmen. Das ebenfalls getestete Cruentaren lag mit einem IC 50 von 60 µM
hingegen deutlich höher. Neben Concanamycin und den Bafilomycinen ist auch Archazolid in
der Lage, die Markierung durch J-Concanolid A zu unterbinden, was auf eine gemeinsame
Bindestelle dieser drei Makrolide hinweist.
Die Untersuchung der Enzymaktivität der V-ATPase zeigte zum einen eine deutliche
Endprodukthemmung durch das entstehende ADP und zum anderen dass Mg2+ nicht durch
Ca2+ zu ersetzten ist, da Ca2+-ATP im Gegensatz zu Mg2+-ATP keinen Protonentransport
unterstützt. Für den Mechanismus der Dissoziation des V1Vo Holoenzyms in seinen V1 und
Vo Komplex scheinen Nukleotide von entscheidender Bedeutung zu sein. Während das V1Vo
Holoenzym praktisch nukleotidfrei ist, sind im abdissoziierten V1 Komplex ein bis zwei
Moleküle ADP enthalten. Die Bindung von ADP oder AMP-PNP an das Holoenzym bewirkt
keine Dissoziation der V-ATPase. Allerdings genügt bereits die Hydrolyse von nur einem
Molekül Mg2+-ATP pro Enzym, um eine Dissoziation zu induzieren. Aus diesem Befund
kann geschlossen werden, dass die V-ATPase während der Hydrolyse einen Konformationszustand durchläuft, in dem sie instabil ist und zur Dissoziation neigt.
123
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132
Publikationen
8. Publikationen
Orginalpublikationen:
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Wieczorek, H., Grüber, G., Harvey, W. R., Huss, M., Merzendorfer, H. and Zeiske, W.
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Abstracts und Kurzvorträge:
Huss, M., Merzendorfer, H., Dietlein, T., Harvey, W. R. and Wieczorek, H. (1997).
Regulation of the insect V-ATPases. Verhandlungen der Deutschen Zoologischen
Gesellschaft, 107
Huss, M., Grüber, G., Harvey, W. R., Merzendorfer, H., Schmid, R. and Wieczorek, H.
(1999). Structural features of the insect V-ATPase: the catalytic V1 complex. Zoology
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Merzendorfer, H., Huss, M., Reineke, S., Harvey, W. R., Schmid, R. and Wieczorek, H.
(1999). Structural features of the insect V-ATPase: the membrane bound Vo complex.
Zoology 102, 69
Merzendorfer, H., Huss, M., Reinike, S., Harvey, W. R., Schmid, R. and Wieczorek, H.
(1999). Structural features of the insect V-ATPase: the Vo complex. Comparative
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Kurzvortrag 5th Inter. Congress of Comparative Physiology and Biochemistry, Calgary 1999:
Huss, M., Grüber, G., Harvey, W. R., Merzendorfer, H., Schmid, R. and Wieczorek, H.
(1999). Structural features of the insect V-ATPase: the V1 complex. Comparative
Biochemistry and Physiology 124A, S6
133
Abkürzungsverzeichnis
9. Abkürzungsverzeichnis
ADP:
Adenosin-Diphosphat
AMP-PNP:
Adenylyl-Imino-Diphosphat
APP:
Alkalische Phosphatase
APS:
Ammoniumpersulfat
ATP:
Adenosin-Triphosphat
BCIP:
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat
BSA:
Bovine serum albumin
BzATP:
3-O-(4-Benzoyl)Benzoyladenosin-5´-triphosphat
C12E10:
Polyoxyethylen-10-Laurylether
DCCD:
N´,N´-Dicyclohexylcarbodiimid
DMSO:
Dimethylsulfoxid
DTT:
Dithiothreitol
EDTA:
Ethylendiamintetraessigsäure
GCAM:
Goblet cell apical membrane
GTP:
Guanosin-Triphosphat
J-Concanolid A:
9-O-[p-(Trifluoroethyl-diazirinyl)-benzoyl]-21,23-dideoxy-23-epi[125I]Iodo-concanolid A
kDa:
Kilodalton
MALDI-MS:
Matrix unterstützte Laserdesorptions-Ionisations-Massenspektroskopie
MBP:
Maltose bindendes Protein
MOPS:
N-Morpholinopropansulfonsäure
NBT:
4-Nitroblautetrazoliumchlorid-Hydrat
NEM:
N-Ethylmaleimid
PAGE:
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
SDS:
Sodium dodecyl sulfate
TCA:
Trichloressigsäure
TEMED:
N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin
Tris:
2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol
Tween 20:
Polyoxyethylensorbitanmonolaureat
134
Lebenslauf
10. Lebenslauf
Markus Huß
Persönliche Angaben
Geburtstag:
Geburtsort:
Staatsangehörigkeit:
Familienstand:
Eltern:
13. März 1968
Augsburg
deutsch
seit 25. Juli 1997 verheiratet mit Tanja Huß, geb. Beutmüller
Huß Manfred und Renate, geb. Rößler
Schulbildung
1974-1978
Besuch der Hans Adlhoch Grundschule in Augsburg
1978-1987
Besuch des Holbein Gymnasiums in Augsburg (mathematischnaturwissenschaftlicher Zweig)
Juni 1987
Erlangung der allgemeinen Hochschulreife
Wehr/Ersatzdienst
Juli 1987-Feb. 1989
Zivildienst beim Malteser Hilfsdienst Augsburg
Hochschulbildung
Okt. 1989-Sept. 1995
Studium an der Ludwig-Maximillians-Universität München,
Diplomstudiengang Biologie
Mai 1992
Vordiplom
Hauptstudium mit der Fächerbelegung Zoologie (Hauptfach),
Biochemie, Pflanzenphysiologie und Anthropologie/Humangenetik
Diplomarbeit im Labor von Prof. Dr. Wieczorek, Zoologisches
Institut der Universität München
Sept. 1995
Abschluß als Diplom-Biologe univ.
1996
Wissenschaftlicher Mitarbeiter von Prof. W. R. Harvey (Temple
University, PA, USA)
1997
Promotionsstudium
Doktorarbeit im Labor von Prof. Dr. Wieczorek (zunächst
Zoologisches Institut der Universität München, seit 1998
Arbeitsgruppe Tierphysiologie Universität Osnabrück)
135
Eidesstattliche Erklärung
11. Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei allen recht herzlich bedanken, die mich während meiner
Studien und der vorliegenden Doktorarbeit unterstützt und zum erfolgreichen Abschluß
beigetragen haben:
Zunächst bedanke ich mich bei M. sexta ohne deren Mitteldarmepithel es die ganze VATPase Forschung wesentlich schwerer hätte.
Prof. Dr. Helmut Wieczorek danke ich für die Betreuung, die guten Forschungsbedingungen
in einem modernen Labor und die vielen intensiven, nicht nur forschungsrelevanten
Diskussionen.
Prof. Dr. Karlheinz Altendorf danke ich für die Übernahme des Koreferates und die
Zusammenarbeit im Rahmen der Untersuchungen der Makrolide.
Bei allen Mitgliedern unserer ehemaligen Arbeitsgruppe aus München und unserer jetzigen
Arbeitsgruppe hier in Osnabrück bedanke ich mich für die gute Zusammenarbeit und das
angenehme Arbeitsklima, besonders bei Bruni Förg-Brey, Gundula Key, Daniela KleineKohlbrecher, Thomas Krüppel, Harald Mikoleit, Hans Merzendorfer, Stephan Reineke,
Tobias Schafmeier und Wolfgang Zeiske.
Weiterhin vielen Dank an die Arbeitsgruppe Mikrobiologie für die stets freundliche Hilfe und
Unterstützung bei Problemen aller Art, hier vor allem an Michael Gaßel und Stefanie Konrad.
Bei Simone König, Klaus Fendler, Eva Grabsch, Barbara Schedding, Roland Schmid, Gudrun
Ingenhorst, Prof. Zeeck, Michel Koch und Gerhard Grüber bedanke ich mich für die
erfolgreiche Zusammenarbeit.
Weiterhin möchte ich mich bei Prof. Reichenbach und Dr. Sasse von der GBF
(Braunschweig) und Dr. Boyd vom NCI (Maryland) für die Bereitstellung von Makroliden
bedanken.
Nicht zuletzt möchte ich mich bei meiner Familie bedanken, vor allem bei meiner Mutter und
meiner Ehefrau Tanja, die mich immer unterstützt und mir den Rücken freigehalten haben.
136