Regulatorische Strategien: Enzyme und Hämoglobin
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Pharmazeutische Wissenschaften SS 03 Juli 03 B.Thalmann Regulatorische Strategien: Enzyme und Hämoglobin Chapter 10 Aspartat- Transcarbamoylase wird durch das Endprodukt des regulierten Reaktionsweg gehemmt. Bei der Biosynthese der Pyrimidine katalysiert die ATCase den ersten Schritt, die Kondensation von Aspartat und Carbamoylphosphat zu NCarbamoylaspartat und Orthophosphat. Am Ende der ganzen Biosynthese stehen die Pyrimidinnukleotide (= Cytidintriphosphat; CTP). Man stellt fest, dass dieses Endprodukt verantwortlich ist für die Hemmung des 1. Schrittes, ausgeführt durch die ATCase. Wenn [C] von CTP ansteigt, nimmt die Geschwindigkeit der ATCase- Reaktion ab und umgekehrt. Zwischen Enzym und CTP ist ein typisches Beispiel für Rückkoppelungs- und Endprodukthemmung (feedback inhibition). Da CTP sich deutlich von den Substraten der Reaktion unterscheidet, muss CTP sich an eine andere aktive Stelle des Enzyms koppeln als das die Substrate tun. Solche Stellen nennt man allosterische Zentren und CTP ist folglich ein "allosterischer" Inhibitor. Bei der ATCase befinden sich die katalytischen und regulatorischen Untereinheiten auf separaten Polypeptidketten. Allosterische Enzyme zeigen eine Eigenschaft, die wir Kooperativität nennen, d.h. die Aktivität an einem funktionellen Zentrum ( Bindung eines Moleküls ans Zentrum) führt zu einer Konformationsänderung, was wiederum die Aktivität am anderen Zentrum beeinflusst! (Details: 10.1.2; Erklärung zu den Untereinheiten und zur Veränderung der Quartärstruktur.) Eigentlich besitzt die ATCase 2 unterschiedliche quartäre Formen, die eine dominiert wenn kein Substrat vorhanden ist, die andere im Falle einer Interaktion. Die zwei Formen ( T = tensed) und ( R = relaxed) können bei einem bestimmten Konzentrationsverhältnis zwischen Aspartat und Carbamoylphosphat auch im Gleichgewicht liegen. Wo aber jeweils die Lage des Gleichgewichts ist, hängt von der Zahl, der mit Substrat besetzten, aktiven Zentren ab. Zur Wirkung von CTP: Wenn der Inhibitor CTP bindet, verschiebt sich das Gleichgewicht auf die Seite der T-Form und erniedrigt so die Aktivität der ATCase, was eine Verringerung von N- Carbamoylaspartat zur folge hat. Diese allosterische Regulation heisst konzertierter Mechanismus und funktioniert nach dem "Alles oder nichts" Prinzip( sequentieller Mechanismus; 10.1.6). Das heisst, das gesamte Enzym wird von R- in T-Form gebracht; alle katalytischen Zentren sind gleich betroffen von der Konformationsänderung. 1 Pharmazeutische Wissenschaften SS 03 Juli 03 B.Thalmann Kinetik allosterischer Enzyme Allosterische Enzyme werden nicht nur von bestimmten Molekülen reguliert, sondern auch die [C] der Substrate spielen bei der Reaktion eine Rolle. Ohne Substrat liegt das Enzym in T- Form vor. Bei Bindung mit Substrat verschiebt sich die Konformation von T nach R, wobei sich die Aktivität an allen Zentren erhöht und so die gesamte Enzymaktivität verstärkt wird. Wenn sich die Konformation einer Untereinheit ändert, ist das bei den Anderen auch der Fall, weil alle zusammenspielen (Kooperativität)! Die Kurve einer solchen Reaktion sieht daher nicht wie die, einer MichaelisMenten- Kinetik aus, sondern gleicht einem "S" und wird Sigmoid genannt.(Figure 10.11) Die Effekte von Substrat auf allosterische Enzyme = homotropischer Effekt und der Effekt von nicht- Substrat- Moleküle aufs Enzym = heterotropischer Effekt ( z.B. CTP auf ATCase). Hämoglobin, ein Beispiel für ein allosterisches Protein Allosterie kommt nicht nur bei Enzymen vor, sondern auch bei Proteinen. Betrachten wir das Protein Hämoglobin, welches den Sauerstoff kooperativ an sich bindet. Das die Untereinheiten kooperieren, können wir am sigmoiden Graphen sehen! Sauerstoff muss im Blut aus den Lungen, wo der Sauerstoffpartialdruck relativ hoch ist, in die Gewebe mit niedrigerem Sauerstoffpartialdruck transportiert werden. In den Lungen wir Hämoglobin fast ganz mit Sauerstoff gesättigt, das heisst, 98% der Sauerstoffbindungsstellen sind besetzt. In den Geweben angelangt, beträgt der Sättigungsgrad noch 32%. Also, 66% der Bindungsstellen tragen dem Transport bei. Ein hypothetisches, nicht kooperatives Protein schafft gerade einmal 38% zu transportieren. Daraus schliesst man, dass die kooperative Bindung des Hämoglobins mit Sauerstoff eine 1,7- fach höhere Übertragungsrate von Sauerstoff hat, als nicht-kooperative Bindungsstellen anderer Proteine. Die homotropische Regulation von Hämoglobin durch seine Sauerstoffliganden (Substrat) erhöht demnach die physiologische Sauerstofftransportkapazität. Die Hämgruppe ist verantwortlich für die Bindungskapazität von Sauerstoff an Hämoglobin. Der Hämkomplex besteht aus einer organischen Komponente (= Protoporphyrin) und einem zentralen Eisenatom. Das im Zentrum des Porphyrinring sitzende Eisen ist an die Stickstoffatome dessen 4 Pyrrolringe gebunden, und liegt normalerweise in der 2+ Oxidationsstufe vor. Es kann an jeder Seite der Hämebene 2 zusätzliche Bindungen ausbilden ( 5. Und 6. Koordinationsstelle). 2 Pharmazeutische Wissenschaften SS 03 Juli 03 B.Thalmann Beim Hämoglobin ist die 5. Koordinationsstelle besetzt, beim Desoxyhämoglobin jedoch liegt sie frei. Dort wird das Eisen oxygeniert. Die Desoxyform entspricht der T-Form und durch die Bindung mit Sauerstoff kommt es zur grundlegenden Konformationsänderung der Quartätstruktur, T wechselt zu R, weil sich die Strukturveränderung des Eisenions direkt auf die Untereinheiten auswirkt. Der Bohr- Effekt Ein kontrahierender Muskel hat einen grossen Bedarf an Sauerstoff und erzeugt seinerseits viel H+ und CO2 ( = Schnelle Stoffwechselrate) Beides sind heterotropische Effektoren von Hämoglobin; sie verstärken die Abgabe von O2. Bei niedrigerem pH als 7,4 ( z.B in den Lungen) erniedrigt sich die Affinität des Hämoglobins, d.h. wenn Hämoglobin in einen saureren Bereich gelangt, gibt es sein O2 schneller ab. Beim Transport aus den Lungen (pH 7,4) in die aktiven Muskeln (pH 7,2) kommt es zu einer hohen Rate (77%) an O2 Freisetzung. Ohne Änderung des pH's würden wie gesagt nur 66% abgegeben. Zu dem erleichtert eine hohe [CO2] die Freisetzung des Sauerstoffes. Merke: Die heterotropische Regulation von Hämolglobin durch H+ und CO2 erhöht die Effizienz des O2 Transportes bei diesem allosterischen Protein noch mehr. Wenn das Hämoglobin im Blut zurück in die Lungen fliesst, sind H+ und CO2, in Form von Hydrogencarbonat (HCO3-) daran gebunden. In den Lungen wird dann erneut Sauerstoff "geladen"... Isozyme (= Isoenzyme) Es sind Enzyme, die sich in der As- Sequenz unterscheiden, aber dieselbe Reaktion Katalysieren. Sie besitzen meist unterschiedliche regulatorische Eigenschaften. Isozyme lassen sich häufig auf Grund ihrer biochemichen Eigenschaften (z.B. Elektrophoretische Mobilität...) unterscheiden. Sie ermöglichen eine Feineinstellung des Metabolismus, da sie spezifischen Anforderungen bestimmter Gewebe (aerob/ anerob...) und/oder momentaner Zustände gewachsen sind (Bsp. LDH; 10.3.). Kovalente Modifikationen als Mittel für die Regulation der Enzymaktivität Wenn einem Enzym kovalent eine funktionelle Gruppe angehängt wird, verändern sich die Eigenschaften des Enzyms. Meist sind die Modifikationen irreversibel. Phosphorylierung und Dephosphorylierung kommen am häufigsten vor. Histone zum Beispiel, werden in vivo acetyliert und deacetyliert; ihre kovalente Modifikation kann durch die kovalente 3 Pharmazeutische Wissenschaften SS 03 Juli 03 B.Thalmann Veränderung der modifizierenden Enzyme reguliert werden. Wie schon gesagt ist die Phosphorylierung von Enzymen, Membrankanälen und anderen Zielproteine häufig und dies sicher auch ihrer Effizienz wegen. Diesen Mechanismus finden wir fast bei allen Stoffwechselvorgängen in eukaryontischen Zellen. Die Phosphorylierungsreaktion wird durch Proteinkinasen katalysiert. Das Donormolekül ist ATP. Die γPhosphorylgruppe wird auf einen spezifischen Serin-, Threonin-, oder evtl. Tyrosinrest übertragen. Proteinphosphatasen sind die Antagonisten der Kinasen und entfernen die Phosphorylgruppe hydrolytisch. Orthophosphat wird freigesetzt. ACHTUNG: Dephosphorylierung ist nicht einfach nur die "Umkehr" von Phosphorylierung! Letztere erfolgt nur durch die Aktivität der spezifischen Proteinkinase und unter Spaltung von ATP... Diese Reaktionen sind unter physiologischen Umständen irreversibel und fänden ohne Enzyme praktisch nicht statt. Zu beachten ist jedoch, dass das Endergebins beider Reaktionen die Spaltung von ATP zu ADP + P ist; ΔG = -50kJ/mol. Dieser energetische Gewinn ist äusserst günstig. Phosphorylierung steuert die Aktivität von Proteinen strukturell, thermodynamisch, kinetisch und regulatorisch: 1. Eine Phosphorylgruppe fügt 2 negative Ladungen ans modifizierte Protein, (elektrostatische WW möglich) 2. 3 oder mehrere Möglichkeiten eine H- Brücke zu bilden 3. Freie Enthalpie sichert Irreversibilität und das Protein wird stabilisiert. 4. Kinetik ist den Bedingungen der Physiologischen Prozessen gerecht ( je nach Notwendigkeit langsam oder schnell) 5. Eine einzige Kinase kann in kurzer Zeit mehrere hundert Zielproteine phosphorylieren. 6. Koppelung des Stoffwechsels an den Energiestatus der Zelle, da ATP (zelluläre Energiewährung) als Donormolekül. Einige Kinasen sind nur spezifisch gerichtet und interagieren ausschliesslich mit einem Protein, während Andere multifunktionell sind und verschiedene Zielproteine modifizieren können. Vergleicht man die AS- Sequenzen vieler Phosphorylierungsstellen miteinander, zeigt sich, dass multifunktionelle Kinasen (wie die Protein- Kinase A eine ist) verwandte Sequenzen erkennen. z. B. die Consensussequenz: Arg - Arg - X - Ser* - Z Oder: Arg - Arg - X - Thr*- Z Wobei: X= kleiner AS- Rest Z= grosse, hydrophobe AS *) Phosphorylierungsstelle 4 Pharmazeutische Wissenschaften SS 03 Juli 03 B.Thalmann Kurze synthetische Peptide, die diese Consensusmotiv enthalten, werden fast immer von Serin bzw. Threonin spezifischen Proteinkinasen phospohryliert. Zyklisches AMP aktiviert die Proteinkinase A durch Veränderung ihrer Quartärstruktur Oft sind es Hormone die die Bildung von cAMP auslösen. CAMP entsteht durch ringförmiges schliessen von ATP und ist ein Intrazellulärer Botenstoff. Die PKA ist ein Enzym das Ser- /Thr- Reste phosphoryliert und so die Aktivität des Zielproteins anschaltet. PKA selbst muss aber auch aktiviert werden und dies geschieht eben durch cAMP. Der Aktivierungsmechanismus entspricht dem, der besprochenen ATCase. PKA besteht aus 2 Arten von Untereinheiten. Aus regulatorischen ( R) und katalytischen ( C). Ohne die Bindung von cAMP bilden die Unereinheiten einen enzymatisch inaktiven Komplex. Durch die Bindung von 4 Molekülen cAMP aktiviert die PKA durch die Dissoziation (=Konformationsänderung) des inaktiven Komplex in eine regulatorische Untereinheit und in 2 katalytisch aktive Untereinheiten. Somit ist PKA ein Modell für allosterische Regulation und Phosphorylierung. Aktivierung von Enzymen durch spezifische Proteolytische Spaltung Viele Enzyme erhalten ihre charakteristische 3-D-Struktur durch spontane Faltung. Andere Proteine werden erst als inaktive Vorstufen synthetisiert und werden erst durch die Spaltung einer spezifischen Peptidbindung zu einem aktiven Enzym (Spaltung mit ATP verbrauch). Wenn sie noch in ihrer inaktiven Vorstufen vorliegen nennt man sie Zymogen oder Proenzym. Auf diese Weise können Proteine auch ausserhalb der Zelle aktiviert werden. Allerdings findet die proteolytische Spaltung nur einmal im Leben eines Enzyms statt und ist definitiv irreversibel, nicht etwa wie allosterische Kontrolle oder kovalente Modifikationen! Proteolyse in biologischen Systemen: 1. Verdauungsenzyme (Chymotrypsinogen- Chymotrypsin) 2. Blutgerinnungskaskade 3. Proinsulin-Insulin 4. Prokollagen-Kollagen u.v.m. 5 Pharmazeutische Wissenschaften SS 03 Juli 03 B.Thalmann Chymotrypsin ist ein Verdauungsenzym, es hydrolysiert Proteine im Dünndarm. Seine inaktive Vorstufe, Chymotrypsinogen wird in den Acinuszellen des Pankreas synthetisiert und ist eine Polypeptidkette von 245 AS. Bei der Spaltung der Peptidbindung zwischen Arg15 und Ile16 entsteht die entscheidende Konformationsänderung um ein funktionelles Enzym zu bilden. π-Chymotrypsin entsteht und wirkt seinerseits auf weitere π-Chymotrypsine ein, jeweils 3 bleiben miteinander durch Disulfidbrücken verbunden. Elektrostatische WW bewirkt eine Umorientierung und die Ausbildung des Substratspezifitätszentrum. Das Anschalten der Enzymaktivität in einem Protein kann also durch diskrete, streng ortsgebundene Konformationsänderungen zustande kommen, ausgelöst durch die Spaltung einer einzigen Peptidbindung. Trypsinogen wird durch Enteropepsidase aktiviert. Die einzige Lysin-Isoleucin Peptidbindung im Trypsinogen wird dabei hydrolysiert, sobald Trypsinogen aus dem Pankreas in den Zwölffingerdarm tritt. Trypsin ist neu enstanden. Dort wirken viele Enzyme gemeinsam bei der Verdauung von Proteinen. Trypsin ist der gemeinsame Aktivator aller Zymogene im Pankreas. Inhibitoren Da die Aktivierung eines Zymogens zur Protease irreversibel ist, gibt es spezifische Proteaseinhibitoren zur Beendigung der Proteolysen. Am Beispiel des Pankreastrypsininhibitors kann man sehen, dass das Trypsin gehemmt wird in dem sich der Inhibitor fest ans aktive Zentrum bindet. Da dieser ein sehr effektives Substratanaloga ist, verleiht er dem Komplex eine aussergewöhnliche Stabilität. Der Inhibitor verändert sich strukturell nicht durch die Bindung, er ist bereits so konzipiert, dass er perfekt komplementär ins aktive Zentrum passt; er ist stabil und wird deshalb nur langsam umgesetzt. Enzymatische Kaskaden In biochemischen Systemen kommen oft enzymatische Kaskaden vor, das heisst ein ausschlaggebendes Signal löst eine Kettenreaktion aus, dessen Schritte jeweils von spezifischen Enzymen katalisiert werden. Zum Beispiel die Blutgerinnung. Die Gerinnsel bilden sich auf Grund einer zymogenaktivierten Kaskade, wobei ein katalisierter Gerinnungsfaktor den ersten Schritt aktiviert. Die Aktivierungsgeschwindigkeit verläuft dabei exponentiel. Zwei Systeme werden dabei aktiviert: das so genannte intravaskuläre System (durch Verletzung eines Endothels der Blutgefäse) und das extravaskuläre System ( Verletzung von Geweben), die exakt kooperieren müssen um erfolgreich die Blutung zu stoppen. Dabei entsteht ein Gerinnsel aus dem Protein Fibrin. Dieses entsteht im letzten Schritt der Kaskade mittels Umwandlung von Fibrinogen 6 Pharmazeutische Wissenschaften SS 03 Juli 03 B.Thalmann durch die proteolytische Einwirkung des Enzyms Thrombin. Dem Fibrinogen werden dabei Fibrinopeptide abgetrennt und die Zentraldomäne des Proteins bleibt erhalten. Diese ist fähig mit ihresgleichen zu polymerisieren (Verkettung zwischen Aminotermini und carboxylterminalen Enden) und so ein Gerinnsel zu bilden. Vitamin K beeinflusst die Blutgerinnung Trombin wird ebenfalls als Zymogen synthetisiert und heisst Protrombin. Dieses wird erst durch die Aktivierung durch Faktor X und Faktor V zu aktivem Trombin. Vitamin K spielt bei der Synthese von Protrombin und andern Gerinnungsfaktoren eine elementare Rolle. "Normales" Protrombin enthält γ-Carboxyglutamat. Bei Abwesenheit von Vitamin K fehlt diese modifizierte Aminosäure! Tatsächlich werden in der aminoterminalen Region des Protrombins die ersten Glutamatreste von einem Vitamin K abhängigen Enzymsystem zu γ-Carboxyglutamat carboxyliert. Carboxyglutamat ist ein guter Calcium 2+ Chelator, was nötig ist damit sich Protrombin besser auf Phopholipidmembranen anheften kann. Diese Bindung ist wichtig, da das Protrombin so in die Nähe zweier Gerinnungsproteine gelangt, welches es zu Trombin katalysieren. Die Blutgerinnung ist überlebensnotwendig und schon ein kleiner Defekt kann letale Folgen haben. Der bekannteste Defekt ist die als geschlechtsgebundenes, rezessives Merkmal vererbte Bluterkrankheit ( klassische Hämophilie) bei ihr fehlt Faktor VIII oder er hat nur eine schwache Funktionalität. Auf der andern Seite besteht für den Organismus aber auch die Gefahr der Blutgerinsel, die die Gefäse verstopfen können (Thrombosen). In der enzymatischen Kaskade der Blutgerinnung ist also ein feingesteuertes Equilibrium essentiell. Interessanterweise besitzt Trombin eine doppelte Funktion. Es katalysiert einerseits die Entstehung von Fibrin und setzt andererseits die Inaktivierung der Gerinnungskaskade in Gang. Zusätzlich gibt es Inhibitoren (z.B Antithrombin III) diese hemmen die Serinproteasen (Faktor XII, XI, IX und X). Antitrombin gehört zur Familie der Serin-Protease-Inhibitoren ( Serpine ). Antithrombin begrenzt das Ausmass der Gerinnung, aber was passiert mit den Gerinnseln, wenn die Verletzung verheilt ist? Die Gerinnsel, aus Fibrin bestehend werden durch Plasmin gespalten. Plasmin selbst entsteht wenn Plasminogen durch einen gewebespezifischen Plasminogenaktivator (TPA) umgewandelt wird. 7 Pharmazeutische Wissenschaften SS 03 Juli 03 B.Thalmann 8
