1. Ziele

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Praktikum „Methoden in der Neurobiologie“ 2010
Neuroanatomie des Insektennervensystems: „Backfill“
Wolfgang Mader, Wolfgang Stein
Abb.1. Stabheuschrecke und allgemeine Darstellung des Nervensystems der Insekten.
1. Ziele
 Kennenlernen der Organisation des zentralen Nervensystems von Insekten am Beispiel
der Stabheuschrecke.
 Es wird die Technik des Ni2+-Backfills vermittelt. Diese Technik ermöglicht die Darstellung
der Verzweigungen von Neuronen - Motoneuronen oder Sinneszellen - im zentralen
Nervensystem (ZNS) oder in den peripheren Zielgebieten, z. B. den Muskeln.
 Darstellung der Verzweigung von Motoneuronen im thorakalen ZNS der
Stabheuschrecke am Beispiel der Motoneurone der Beinmuskulatur.
2. Allgemeine Voraussetzungen
2.1. Kenntnisse und Begriffe, die Sie sich vor dem Praktikum aneignen sollten
Machen Sie sich mit der generellen Struktur eines Insektennervensystems vertraut. Jedes
beliebige Zoologielehrbuch bietet die nötigen Informationen (genau wie die Vorlesung über
den Lauf des Praktikums).
Stichworte, die Ihnen etwas sagen müssen: Ganglion, Konnektiv, Kommissur, motorisches
Neuron, sensorisches Neuron, Soma, Axon, Dendrit, Efferenz, Afferenz.
2.2. Das thorakale Nervensystem
Das thorakale Nervensystem der Stabheuschrecke besteht aus 3 Ganglien (s. Abb.1). Die
motorische und sensorische neuronale Versorgung ist in aller Regel segmental organisiert.
Das heißt, dass die Somata (Zellkörper) und dendritischen Verzweigungen der Motoneurone
der Mittelbeinmuskeln im Mesothorakalganglion liegen und die entsprechenden Neurone der
Hinterbeinmuskulatur im Metathorakalganglion. Allerdings kommt es gelegentlich auch zu
segmentüberschreitenden neuronalen Projektionen, gerade bei der Sensorik.
Axone von Motoneuronen (Efferenzen) verlassen das ZNS durch Seitennerven der
Ganglien. Durch dieselben Seitennerven treten Axone von Sinnesorganen der Flügel und
Beine in das ZNS ein. Jedes thorakale Ganglion hat auf jeder Seite 6 Seitennerven, die sich
in der Peripherie stark verzweigen.
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2.3. Die Beinmuskulatur (Abb.2.)
Die Muskulatur der Laufbeine wird unterschieden in intrinsische Muskulatur – im Bein
gelegen – und extrinsiche Muskulatur – im Thorax gelegen und das Bein von dort aus
bewegend.
Abb.2. Bein der Stabheuschrecke, rechts mit anatomischen Details (Muskeln zur Bewegung
der Tibia braun, Drehachsen der Gelenke rot). Nach Bässler, 1983.
Bei der Stabheuschrecke sind praktisch alle Gelenke des Beins Scharniergelenke, die
Bewegung nur um eine Rotationsachse erlauben. Machen Sie sich diesen Sachverhalt am
lebenden Tier klar (Vorsicht, die Tiere werfen ihre Beine durch Autotomie ab, wenn diese
stark gereizt oder beschädigt werden). Bei den zwei eng hintereinander liegenden
Scharniergelenken an der Beinbasis erlaubt dies einen Bewegungsspielraum nahezu wie bei
einem Kugelgelenk. Da wir Axone von Nervenzellen markieren, die im Femur des Laufbeins
verlaufen (s.u.), können nur Motoneurone markiert werden, die intrinsische Muskeln
versorgen.
Ein Beinmuskel wird typischerweise von drei Motoneuronen innerviert, es können
aber auch bis zu 14 Motoneurone sein (bei Wirbeltieren sind es dagegen meist mehrere
tausend – weshalb?). Die Zellkörper (Somata) der Motoneurone und ihre dendritischen
Verzweigungen liegen im ZNS. Eine Erregung der Motoneurone führt zur Kontraktion des
entsprechenden Beinmuskels (bzw. der vom jeweiligen Motoneuron versorgten
Muskelfaserpopulation in dem Muskel, der „motorischen Einheit“) und damit zu einer
Bewegung des Beins im zugehörigen Gelenk.
3. Darstellung intrinsischer Motoneurone des Stabheuschreckenbeins mittels
„Backfill“ von Nickelionen/Nickelrubeanat
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Abb.3. Mesothorakalganglion der Stabheuschrecke mit ausgewählten Motoneuronen der
Beinmuskulatur (Retractor coxae). Nach Bässler, 1983.
3.1. Die darzustellenden Neurone (Abb.3)
Im Beinnerven verlaufen die Axone sämtlicher Motoneurone welche die intrinsische
Beinmuskulatur innervieren, insgesamt knapp 100 relativ dicke Axone. Zudem verlaufen hier
die Axone der Beinsensorik, von den verschiedensten Mechanorezeptoren bis hin zu
Chemorezeptoren auf den Fusspolstern, insgesamt mehrere tausend z.T. sehr dünne
Nervenfasern. Alle diese Axone laufen über den Beinnerven in das zum betreffenden
Segment gehörige Ganglion (bzw. haben als Motoneurone ihren Ursprung dort... ). Im Fall
der Beinmuskulatur liegen die Zellkörper der zugehörigen Motoneurone gleichseitig –
ispilateral – im Segmentalganglion, entweder anterior oder posterior der Nerveneinmündung.
Die Somata der sensorischen Nervenzellen liegen peripher in den Sinnesstrukturen. Ihre
Axone verzweigen nach Eintritt in das Segmentalganglion typischerweise ebenfalls
ipsilateral, und sie ziehen z.T. auch in benachbarte Ganglien, häufiger nach anterior als nach
posterior und mitunter bis in das Gehirn.
3.2. Prinzip der Färbung
Eine Nickelchlorid-Lösung wird an der durchtrennten Stelle eines Nerven von den dort
eröffneten Axonen aufgenommen und innerhalb dieser Neurone - ggf. aktiv - transportiert.
Die Färbung funktioniert daher nicht, wenn die Nerven mit der Pinzette gequetscht oder
überdehnt wurden oder eingetrocknet sind. Auch der Kontakt des Nervenendes mit Vaseline
kommt als Fehlerquelle in Frage. Mit verdünntem Dithiooxamid (Anhydrid der
Rubeanwasserstoffsäure; Vorsicht: sehr giftig! Frage: was könnte der Grund für die
Giftigkeit sein?) wird in diesen Neuronen Nickelrubeanat als blauer Niederschlag ausgefällt.
Das Färbeverhalten beruht auf der Füllung von Neuronen lebender oder frisch getöteter
Tiere mit Nickel- oder Kobaltsalzen. Verwendet werden hauptsächlich wässrige Lösungen
von CoCl2 und NiCl2.Nach einer bestimmten Zeit, in der die Nickel bzw. Kobaltionen in das
Neuron diffundieren können, werden diese mit Sulfidionen ausgefällt. Dadurch bildet sich im
Falle von Kobalt ein schwarzer, schwer löslicher Niederschlag von Kobaltsulfid.
Reaktion:
Co2+ + S2- 
CoS

Dieser schwarze Niederschlag kann durch die histologische Aufarbeitung nicht mehr gelöst
werden. Die mit CoS markierten Neurone erscheinen deshalb in den Präparaten als
schwarze bzw. bei schwächeren Füllungen als dunkelbraune Strukturen. Als
Fällungsreagenz ist Dithiooaxmid geeignet (Rubeanwasserstoffsäure).
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Möglichkeiten der Anwendung
1.
Intrazelluläre Injektion zur Darstellung einzelner Neurone
(z. B. Motoneurone: J. A. Wilson, J. of Neurobiol. 10, 153-167 (1979); Interneurone:
M.V.S. Siegler und M. Burrows, J. of Comp. Neurol. 183, 212-147 (1979); Pflüger, J.
Comp. Neurol. 222, 243-358 (1984)
Glasmikroelektroden werden mit Kobaltsalzlösungen gefüllt (5 - 10%ig), und es wird
dann von einzelnen Neuronen abgeleitet. Die Kobaltionen werden durch Applizierung
eines Stromes durch die Elektrodenöffnung in das Neuron geschickt. (Richtwerte:
Stromstärke 10 nA, Injektionsdauer: 15-30 min, Pulsdauer: 500 ms). Dabei wird die
Mikroelektrode zum positiven, die indifferente Elektrode zum negativen Pol.
2.
Extrazelluläre Injektion
Auch hierzu werden Glasmikroelektroden verwendet, die mit Kobaltsalzlösungen gefüllt
sind. Die Elektrodenspitze wird abgebrochen und die Elektrode an die gewünschte
Stelle im ZNS gebracht. Ohne Anwendung eines Stroms diffundieren Co2+-Ionen aus
der Pipettenspitze und bilden dort einen "Co2+-Vorrat". Durchziehenden verletzte
Nervenfasern nehmen Co2+ auf. Diese Technik eignet sich für das Studium der
Ganglien-Architektur, besonders für die Markierung von Axonbündeln und Trakten.
(Richtwert: Diffusionsdauer 1-2 h für eine Strecke von 1 mm
Variante dieser Methode: Stromapplikation [siehe unter 1.])
3.
Diffusionsmethode ("backfilling")
Co2+-Ionen wandern in abgeschnittenen Axonen durch Diffusionsvorgänge bis sie die
gesamte verbleibende Nervenzelle erfüllen. Voraussetzung ist, daß die Schnittstelle in
einen Co2+-Ionenpool hineintaucht, der vom übrigen Gewebe gut isoliert ist. Auf diese
Weise kann zur Peripherie und zur Zentrale hin gefärbt werden.
Beispiele:
a)
Blöckchenmethode:
Nervensystem wird herauspräpariert und gewünschtes Nervenende in einen
CoCl2-Pool gehängt.
Blöckchen wird dann für einige Zeit in eine feuchte Kammer gelegt (Diffusionsdauer: 5
- 24 h).
b)
Nervensystem wird im Tier belassen, gewünschter Nerv freipräpariert. Danach Bildung
eines Vaselinepools um den Nerv. Vaselinepool wird zunächst mit Aqua dest. gefüllt
damit evtl. gequetschte Nervenendigungen aufquellen. Das Aqua dest. wird dann
durch CoCl2-Lösung ersetzt und der Nerv durchgeschnitten. Durch Aufbewahren in
einer feuchten Kammer wird das Präparat vor dem Austrocknen geschützt
(Diffusionszeit wieder 5 - 48 h).
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Fehlerquellen
1.
Beim Präparieren Quetschen oder Dehnen des Axons (keine Co2+-Diffuison mehr
möglich).
Dies kann im weiteren Verlauf der Behandlung ebenfalls passieren, vor allem, wenn
das zu färbende Axonstück bei der Blöckchenmethode über den Paraffinkanal
gehoben werden soll.
2.
Nerv zu kurz herauspräpariert.
3.
Das Axonende wurde nicht abgeschnitten sondern nur gequetscht (stumpfe Schere).
4.
Versehentlich kommt das Axonende mit Vaseline oder Paraffinöl in Berührung. Auch
dies kann dazu führen, daß die Co2+-Diffusion blockiert ist. Außerdem sollte die
Vaseline nicht verfärbt sein (weiße Vaseline - vasel. album benutzen).
5.
Ein Lecken oder Auslaufen der verdünnten Nickel-/Kobaltchloridlösung muß unbedingt
vermieden werden, sonst wird das gesamte Präparat schwarz oder es kann keine
Färbung erkannt werden.
6.
Die Waschvorgänge, die im Skript beschrieben sind, sollten sehr sorgfältig ausgeführt
werden.
4. Literatur
Kükenthal, Leitfaden für das Zoologische Praktikum, Gustav-Fischer-Verlag
Kästner, Lehrbuch der speziellen Zoologie, Gustav-Fischer-Verlag
Seifert, Entomologisches Praktikum, Thieme-Verlag
Altmann J.S., Tryer N.M.; Filling selected neurons with cobalt through cut axons. In:
Strausfeld N.J., Miller T.A: Neuroanatomical Techniques, Chapter 19, Springer-Verlag
Bässler, Neural basis of elementary behavior in stick insects, Springer-Verlag 1983
5. Aufgaben
5.1. Äußere Morphologie
(da der Backfill möglichst früh angesetzt werden soll, um eine lange Transportzeit des
Färbemediums zu erlauben, kann diese Aufgabe ggf. gut zu einem späteren Zeitpunkt mit
einem frischen Tier erledigt werden)
 Legen Sie eine Skizze von der äußeren Gestalt der Stabheuschrecke an. Beschriften Sie
die Abbildung.
 Betrachten Sie das Tier unter dem Binokular: Kopf mit Sinnesorgan (Augen, Antennen),
Thorax mit Beinen (lösen Sie Reflexbewegungen aus, indem Sie mit einer Pinzette o.ä.
Haare auf den Beinen berühren), Abdomen (haben Sie ein Weibchen oder Männchen vor
sich?).
 Zeichnen Sie ein Detail, z. B. den Kopf, den Thorax, ein Bein. Beschriften Sie die
Zeichnung.
5.2. Ansetzen eines „Backfill“
 Sie können das Tier bei Bedarf durch Kühlung anästhesieren oder den Kopf abtrennen
(dann ist das Tier offiziell „tot“, durch die Autonomie der Körpersegmente wird aber
beispielsweise der Kopf ggf. noch tagelang mit den Fühlern spielen, Nahrung aufnehmen
etc.). Dann legen Sie es auf einer Korkplattform fest, indem Sie an mehreren Stellen
entlang der beiden Körperseiten Stecknadel schräg in den Kork stechen, so dass sich die
Nadeln über dem Tier überkreuzen und den Körper eng auf der Unterlage fixieren. In
gleicher Weise legen Sie die Beine fest. Nach Festlegen der Beine fixieren Sie die CoxaTrochanter-Gelenke aller zu untersuchenden Beine mit Zahnkleber (Protemp II). Achten
Sie darauf, den Protemp Wall nicht zu hoch zu bauen, da Sie später noch den Thorax
des Tieres aufpräparieren müssen.
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




Durchtrennen Sie den Femur des Beins, bei dem Sie einen Backfill durchführen möchten
(Sie können dies ggf. nacheinander bei ein bis drei Beinen desselben Tiers tun). Dichten
Sie den Untergrund (Kork) im Bereich der Schnittstelle durch Abdecken mit einer Folie ab
Dann umgeben Sie die Schnittstelle mit einem Vaselinetrog, in den anschließend
destilliertes Wasser gefüllt wird. Achten Sie bei dem Trog auf eine dichte Verbindung zum
Beinstumpf, auch auf dessen Unterseite! Das eingefüllte destillierte Wasser darf nicht
auslaufen. Es dient dem osmotisch verursachten Aufquellen des angeschnittenen
Beingewebes, insbesondere der angeschnittenen Axone, die durch den Schnitt
gequetscht sein könnten.
Am besten schneiden Sie die Schnittkante noch einmal mit einer scharfen Mikroschere
oder mit einer Rasierklinge im destillierten Wasser frisch an. So wird auch geronnene
Hämolymphe entfernt und das Lumen der Axone sollte frei zugänglich für das
Färbemedium sein. Nach etwa 10min wechseln Sie das destillierte Wasser gegen die
Färbelösung aus (Absaugen des Wassers mit einem aus Fliesspapier gedrehtem Docht,
einfüllen des NiCl2 mit einer ausgezogenen Spritze oder Spritzenkanüle).
Verschließen Sie die Wanne mit einem Vaselinedeckel. Bedecken Sie das gesamte
Präparat vorsichtig mit ringerfeuchtem saugfähigem Papier.
Überführen Sie das Präparat mit der Präparierwanne in eine Plastikschachtel, die mit
feuchtem Papier ausgelegt wurde (oder eine andere Form von „feuchter Kammer“).
Stellen Sie die Schachtel für 12–18 Stunden an einen kühlen Ort. Die „feuchte Kammer“
verhindert das Austrocknen des Präparats und das Absterben des Gewebes. Sollte das
Präparat über ein Wochenende „laufen“ gelassen werden, ist die Aufbewahrung im
Kühlschrank bei 4-8°C besser.
Normalerweise wäre es nötig, den zu füllenden Nerven frei zu präparieren und isoliert in die
Vaselinewanne zu legen. Die beschriebene Methode funktioniert nur, weil unter dem Einfluss
von Luftsauerstoff (und Schwermetallionen) die Hämolymphe im Beinstumpf so schnell
gerinnt und so gut abdichtet, dass die Schwermetallionen nicht im Hämolymphraum bis in die
Körperhöhle diffundieren können.
5.3. Fertigstellen und Auswerten des „Backfill“
 Entfernen Sie zunächst die Vaselinewanne mit dem Nickelchlorid, und zwar so vorsichtig,
dass keine Lösung das Tier oder die Unterlage kontaminiert (das Nickelchlorid ist nicht
nur giftig, sondern würde bei Benetzung des Tiers auch andere Strukturen anfärben).
Saugen Sie zunächst das Nickelchlorid mit einem Docht ab. Durchtrennen Sie dann das
Bein zwischen Vaselinewanne und Körper und entfernen Sie das Beinstück mit
Vaselinetrog und Unterlage (bitte auf etwaige Minutien achten, die z.B. die untergelegte
Plastikfolie befestigt haben; diese sind im Müll sehr unangenehm und sollten zuvor
entfernt, gesäubert und aufgehoben werden). Spülen Sie anschließend mit etwas Ringer
nach.
 Präparieren Sie nun das Nervensystem frei. Dies können Sie bei genügend Zeit und
verfügbaren Tieren zunächst an einem frischen Tier üben und sich gleichzeitig einen
Überblick über die innere Anatomie verschaffen (wie auch die äußere Morphologie, s.o.).
Dazu werden zunächst Kopf und Abdomenspitze abgetrennt. Dann können Sie mit einer
flach geführten Schere den Körper dorsal der Länge nach Aufschneiden (gekreuzte
Stecknadel hierbei ggf. rearrangieren). Anschließend spreizen Sie mit den Stecknadeln
die Körperseitenwand von innen leicht auf und stecken die Nadeln so fest, dass der
Körperinnenraum gut zugänglich ist. Mit etwas Ringer durchspülen und ggf. –
beispielsweise bei der Übungspräparation - das Präparat mit 1%iger Methylenblau–
Lösung überspülen, dadurch wird das Nervensystem (und v.a. auch Fettgewebe)
angefärbt und hebt sich von anderem Gewebe ab.
 Darm, Fettkörper und Tracheen ausräumen. Ventral ist dann bereits das
Strickleiternervensystem zu erkennen, stellenweise noch von einigen kleineren Muskeln
überdeckt. Durchtrennen Sie diese Muskeln vorsichtig (ggf. mit Glashaken oder
Präpariernadel erst etwas anheben und dann ohne Beschädigung des Nervensystems
durchtrennen), genau wie alle Seitennerven. Beschädigen Sie jedoch nicht die
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

Konnektive zwischen den thorakalen Ganglien. Kritisch ist das Durchtrennen oder
Abbrechen des zentralen Apodems, welches zwischen den Konnekitven von Meso- und
Metathorakalganglien liegt; bitten Sie hier ggf. einen Assistenten um Hilfe. Dann ist das
Nervensystem nur noch über die Tracheen in der Körperhöhle befestigt und kann leicht
angehoben werden. Die Tracheen reißen entweder beim langsamen Abheben von selbst
ab, oder sie können mit einer Schere beim Abheben durchschnitten werden.
Anschließend das Nervensystem sofort in ein Blockschälchen mit Ringer überführen um
jede Austrocknung zu verhindern. Evtl. können schon während der Präparation 2-3
Tropfen des Fällungsreagenz Dithiooxamid zugegeben werden. Da das Reagenz giftig
ist, müssen in diesem Fall anschließend Besteck und Korkplattform gründlich gereinigt
werden. Ansonsten entwickeln Sie die Färbungen nach dem angegebenen Rezept nun in
dem Blockschälchen.
Fertigen Sie eine Skizze des Präparats an; achten Sie dabei besonders auf Muskeln und
Nervensystem.
6. Zeitplan für das Entwickeln der Färbung und die weitere Verarbeitung
6.1. Verarbeitung von Nickel-Färbungen im Detail
1. Ganglienkette in Blockschälchen mit frischem Ringer überführen
2. 1-2 Tropfen Dithiooxamid (in 100% Ethanol) zutropfen und 30 min entwickeln
3. 3 x 5 min in Ringerlösung waschen
4. 30 min Fixierung in Gemisch aus Eisessig-Alkohol (1:4) oder in Paraformaldehyd (4%)
(oder über Nacht bzw. bis zu ein paar Tagen im Kühlschrank)
5. aufsteigende Alkoholreihe
1 x 5 min
30%
1 x 5 min
50%
2 x 5 min
70%
(auch hier kann das Präparat aufbewahrt werden, grundsätzlich beliebig lange)
2 x 5 min
90%
2 x 5 min
96%
3 x 5 min
100%
6. Aufklaren und Aufbewahren in Methylsalicylat
7. Bei guten Präparaten kann eine Überführung in Canada Balsam erfolgen (Dauerpräparat,
hier sind Hohlschliffobjektträger nötig). Dies sollte jedoch erst einige Stunden (am besten
einen Tag) nach dem Aufklaren in Methylsalicylat erfolgen, da sonst eine erneute
Eintrübung des Präparates die Folge ist.
7. Auswertung
Zeichnen Sie die Ganglien mit den gefärbten Neuronen und machen Sie sich mit der
Anatomie der Nervenzellen von Insekten vertraut.
Am Ende des Praktikums sollten Sie zumindest 4 Zeichnungen angefertigt haben, jeweils mit
Beschriftung und ggf. knappen Erläuterungen:
 das ganze Tier in einer Übersicht
 ein Detail, beispielsweise den Kopf
 ZNS und Muskulatur in einer Übersicht
 Ganglion mit gefärbten Neuronen (Mikroskop)
 eventuell einen Ganglienabschnitt oder ein typisches Neuron
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