5 - Universitätsklinikum des Saarlandes
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5. Ergebnisse 5.1. PCR-Optimierung Die erfolgreiche Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist von vielfältigen Faktoren abhängig. Nachdem grundlegende PCR-Voraussetzungen wie die Wahl der Primersequenzen (Bestimmung von Länge und Lage, Länge des amplifizierten Genabschnittes sowie G+C-Gehalt) gegeben waren, galt es für alle 18 Exone und des Versuchsbedingungen Promotors zu des finden. LDL-Rezeptorgens Dabei sind die die individuellen Reaktionstemperaturen, insbesondere die Annealingtemperatur, und die Wahl der Zusammensetzung des Reaktionsansatzes von entscheidender Bedeutung für die Spezifität und Effektivität jeder einzelnen Genamplifikation. 5.1.1. Auswahl der Primeroligonukleotide Zur theoretischen Aufstellung von Oligonukleotiden einschließlich ihrer Annealingtemperaturen lassen sich Computerprogramme wie das von uns in Anspruch genommene Programm „Primer 3 Output“ (im Internet verfügbar) einsetzen, wobei jedoch auf eine experimentelle Optimierung nicht verzichtet werden konnte. Ebenso verhielt es sich mit Primern, die wir der Literatur entnahmen (siehe Abschnitt ...). Die Oligonukleotidsequenzen sollten außerhalb der Splicing Sites der Exone liegen (im Schnitt ca. 20 bp entfernt, daher die zusätzliche Größenzunahme im Vgl. zu der eigentlichen Exongröße) und weitgehend mit der Originalsequenz des zu untersuchenden Genabschnittes übereinstimmen. Jede Sequenzabweichung in den Primeroligonukleotiden könnte zu einer verminderten Stabilität der Primerhybridisation und damit zu reduzierter Ausbeute der PCR führen. Erforderliche Fehlpaarungen aus Gründen der Primerkomplementarität, die in einigen Fällen in die Primersequenz eingeführt wurden, sind also möglichst viele Positionen vor dem 3' Ende des Primers lokalisiert (Siehe Tabelle ...). Für die Primerlänge wurden Kompromisse mit Längen von 18 bp bis 25 bp eingegangen. Kürzere Primer hybridisieren mit höherer Wahrscheinlichkeit unspezifisch an die Matrizen-DNA, und können daher zu unspezifischen Amplifikationsprodukten führen. Werden die Primer länger gewählt, kann durch die Ausbildung von intramolekularen Sekundärstrukturen 50 die Extension inhibiert werden. Des weiteren wurde ein vergleichbarer G+C-Gehalt (G+C-Gehalt = prozentualer Gehalt von Desoxycytosin und Desoxyguanin) in beiden Primern angestrebt, um möglichst vergleichbare Hybridisierungstemperaturen für beide Primermoleküle zu erreichen. Die Sensitivität der SSCP-Technik hängt stark von der untersuchten Fragmentlänge ab. Bei Fragmentlängen um 200 bp können über 90 % der Mutationen detektiert werden, bei größeren lässt die Sensitivität nach (Hayashi et al. 1992). Längere Stränge enthüllen relativ weniger Konformationsunterschiede durch Einzelbasensubstitutionen, kürzere eignen sich dagegen weniger Konformationen an (habe Literatur dazu bestellt). Die optimale Fragmentgröße für die Erkennung von Basenaustauschen wird mit 150 bp angegeben (Sheffield at al.1993). Daher sollte in unserer Untersuchung eine Länge von maximal 300 bp nicht überschritten werden. Die Fragmentgrößen der meisten Exone des LDL-Rezeptorgens (siehe Abbildung ...), wobei Exon 18 in der Regel nur im Anfangsbereich untersucht wird und nicht über dessen komplette Länge, sind noch im Rahmen der Voraussetzungen. Ausnahme ist jedoch Exon 4 mit einer Exongröße von 381 bp, bzw. als PCRFragment aufgrund der Primerlage auf 462 bp angewachsen. In dieser Gesamtfragmentlänge konnten in einem Versuch nur drei von fünf untersuchten Mutationen detektiert werden (siehe Abschnitt 5.1.4.). Daher wurde die Untersuchung in die zwei Analyseschritte Exon 4a und 4b mit Fragmentgrößen zu je 242 bp und 236 bp portioniert, mit der Folge dass zwei der für Exon 4 eingesetzten Primer nicht in den benachbarten Introns der Exone, sondern intern lokalisiert waren. Dieser Übergangsbereich im mittleren Abschnitt des Exons 4 birgt aber die Problematik, dass Mutationen die sich genau dort ausbilden unter Umständen schwerer oder gar nicht erfasst werden können. Daher wurden Proben mit Mutationen, die sich bekannter Weise dort aufhielten, und Proben bei denen nach der Durchuntersuchung des gesamten Gens bislang keine Auffälligkeit gefunden wurde, zusätzlich mit einer als Exon 4m gekennzeichneten speziellen SSCP-Analyse untersucht, um diesen blinden Bereich ebenfalls abzudecken (Siehe Tabelle...und Tabelle...). Schließlich musste noch die Wahl der jeweils optimalen Annealingtemperatur getroffen werden, welche gewährleisten sollte, dass sich möglichst viele Oligonukleotide spezifisch an die komplementäre Zielsequenz anhybridisierten. Die Verwendung niedriger Arbeitstemperaturen führt zu sinkender Spezifität, zu hohe Temperaturen zu geringer Anhybridisierung. 51 Mit Berücksichtigung von Temperaturvorschlägen aus der Literatur bzw. dem Computerprogramm wurden die Temperaturen in Testreihen mit Temperaturabständen von 2 °C aufwärts von 54 bis 60 °C bestimmt. Die ausgewählten Primersequenzen, deren Länge, die resultierenden Fragmentgrößen und die Annealingtemperaturen sind in Tabelle ... aufgeführt. Tabelle: Primersequenzen für die SSCP-Analyse des LDL-Rezeptorgens* Amplif. Frag- Primersequenz (5’ nach 3’) Primer- Primersequenz (5’ nach 3’) Anneal. Fragment ment- Upstream Primer Temp. länge größe US/DS [bp] [bp] Downstream Primer* [°C] Promotor 277 CAGCTCTTCACCGGAGACC 19/20 ACCTGCTGTGTCCTAGCTGG 58 Exon 1 223 TGAAATGCTGTAAATGACGTGG 22/22 GCTCCCTCTCAACCTATTCTGG 56 Exon 2 198 GTTTCTGATTCTGGCGTTGAG 21/19 CATATCATGCCCAAAGGGG 54 Exon 3 196 TTCCTTTGAGTGACAGTTCAATCC 24/24 GATAGGCTCAATAGCAAAGGCAGG 56 Exon 4a 242 GTGGTCTCGGCCATCCATCC 20/20 AGCCATCTTCGCAGTCGGGG 60 Exon 4b 236 CGACTGCGAAGATGGCTCGGA 21/25 GGGA_CCCAGGGACAGGTGATAGGA 58 Exon 4m 285 CAACAGCTCCACCTGCATC 19/25 GGGA_CCCAGGGACAGGTGATAGGA C 58 Exon 5 239 AAGGCCCTGCTTGTTTTTCT 20/18 TGCTTGGCAGAGAATGGG C 54 Exon 6 216 CTGACCTTCCTCCTTCCTCTCT 22/20 AACCTCCACCTTTCCTGGCT 58 Exon 7 211 GGCCCGAGAGTGACCAGT 18/19 CATGTCAGGAAGCGCAGAG 56 Exon 8 220 CATTGGGGAAGAGCCTCCCC 20/20 GCCTGCAAGGGGTGAGGCCG 60 Exon 9 225 CCCCTGACCTCGCTCCCCGG 20/20 GCTGCAGGCAGGGGCGACGC 60 Exon 10 278 ATGCCCTTCTCTCCTCCTGC 20/20 AGCCCTCAGCGTCGTGGATA 60 Exon 11 179 GCCTCACAGCTATTCTCTGTCCTC 25/25 TCCCTGTGACGGCTGTCCTGCGAAC 58 Exon 12 210 GCACGTGACCTCTCCTTATCCACT C 25/25 CACCTAAGTGCTTCGATCTCGTACG 58 Exon 13 216 GTCATCTTCCTTGCTGCCTG T 20/24 TTCCACAAGGAGGTTTCAAGGTTG 58 Exon 14 228 TGCCCTGACTCCGCTTCT 18/18 GGGGCAGTTGGAGGACAC 56 Exon 15 221 AGAAGACGTTTATTTATTCTTTC 23/23 GTGTGGTGGCGGGCCCAGTCTTT 50 Exon 16 202 CCTGCTCCATTTCTTGGTGG 20/20 ACGAGGTCACATAGCGGGAG 56 Exon 17 246 AGCTGGGTCTCTGGTCTCGGAGG 24/22 GGCTCTGGCTTTCTAGAGAGGG 58 Exon 18 190 TCCAGCCTGTTTCCTGAGTGCTGG C 24/24 CAGGCAATGCTTTGGTCTTCTCTG 56 *Die unterstrichenen Nukleotide der Primersequenzen sind Nukleotidsubstitutionen als Konsequenz der Primeroptimierung. Im Downstream Primer von Exon 4b und 4m wurde an der unterstrichenen Position ein G weggelassen. 52 Für ihren speziellen Einsatz in der Kapillarelektrophorese waren die Primer mit einem Fluoreszenzfarbstoff 5´ markiert, die Voraussetzung um die amplifizierten Einzelstränge zu detektieren bzw. zur Darstellung bringen zu können. Um den Upstream (US) und Downstream (DS) Primer unterscheiden zu können, wurden sie jeweils mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Der Upstream Primer wurde mit 6-FAM und der Downstream Primer mit HEX gekennzeichnet. Das unterschiedliche Markieren hat den Vorteil in der Evaluation der „Peakmuster“, um selbst im Falle von Überlappungen der zwei Einzelstränge im Elektropherogramm eine eindeutige Interpretation der „Peakmuster“ zu ermöglichen. Des weiteren war dieses Vorgehen auch erforderlich da, wie es sich in einigen Fällen später zeigte, abnormale Muster nur in einem Strang präsent sein konnten (Siehe Abb....). 5.1.2. PCR-Ansätze In den PCR-Ansätzen wurde nur die Verwendung der Zusätze MgCl2 und Glyzerin in Testreihen mit aufsteigender Konzentration optimiert, da einerseits die Praktikabilität gewahrt bleiben sollte, andererseits aber in gewissem Maße auf individuelle Bedürfnisse eingegangen werden musste. Bezeichnend für eine erfolgreich durchgeführte PCR ist sowohl die Intensität als auch eine möglichst scharfe Abgrenzung der Banden in der Agarosegel-Elektrophorese (Siehe auch Abschnitt...). Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, ist es notwendig sämtliche Versuchsbedingungen genau zu definieren, in Tabelle ... sind die PCR-Ansätze für jedes einzelne LDL-Rezeptorgen-Fragment aufgelistet. Um den Verbrauch von Reagenzien zu reduzieren, konnte nach Bestimmung der erfolgreichen Versuchsbedingungen auch mit halbierten Ansätzen zu 25 µl gearbeitet werden. 53 Wasser [µl] [µl] Taq: 1U/µl DNA [µl] HEX [µl] DS-Primer 6-FAM [µl] US-Primer Glyzerin [µl] Zusatz 2: MgCl2 [µl] Zusatz 1: [µl] dNTP-Mix [µl] Amp.-Puffer Fragment Amplif. Tabelle: PCR-Ansätze für die SSCP-Analyse des LDL-Rezeptorgens Prom. 5 5 3 1 1 1 2 1,5 30,5 Exon 1 5 5 3 - 1 1 2 1,5 31,5 Exon 2 5 5 4 - 1 1 2 1,5 30,5 Exon 3 5 5 4 - 1 1 2 1,5 30,5 Exon 4a 5 5 3 - 1 1 2 1,5 31,5 Exon 4b 5 5 4 1 1 1 2 1,5 29,5 Exon 4m 5 5 4 2 1 1 2 1,5 30,5 Exon 5 5 5 4 - 1 1 2 1,5 30,5 Exon 6 5 5 4 - 1 1 2 1,5 30,5 Exon 7 5 5 4 1 1 1 2 1,5 29,5 Exon 8 5 5 3 1 1 1 2 1,5 30,5 Exon 9 5 5 3 1 1 1 2 1,5 30,5 Exon 10 5 5 4 1 1 1 2 1,5 29,5 Exon 11 5 5 2 1 1 1 2 1,5 31,5 Exon 12 5 5 3 - 1 1 2 1,5 31,5 Exon 13 5 5 4 - 1 1 2 1,5 30,5 Exon 14 5 5 4 1 1 1 2 1,5 29,5 Exon 15 5 5 6 1 1 1 2 1,5 27,5 Exon 16 5 5 3 - 1 1 2 1,5 31,5 Exon17 5 5 3 1 1 1* 2 1,5 30,5 Exon 18 5 5 3 - 1 1 2 1,5 31,5 * Ausnahme Exon 17 DS-Primer 6-FAM markiert, siehe hierzu Abschnitt 5.4. 5.2. Einsatz der Kapillarelektrophorese für die SSCP-Technik Zur Erstellung eines Mutationsscreenings für das LDL-Rezeptorgen adaptierten wir in unserer Arbeit die SSCP-Analyse an die Kapillarelektrophorese mit Fluoreszenzdetektion. Hierzu wurde der ABI 310 Genetic Analyzer eingesetzt, welcher alle Elektrophoreseprozeduren einschließlich dem Ersetzen des Gels in der Kapillare durch ein Softwaresystem kontrollieren kann. Ein standardisiertes und praktikables Vorgehen war dabei von Beginn an erwünscht gewesen. Das LDL-Rezeptorgen besteht aus 18 Exonen und dem Promotor, die Zahl und Länge der Exone erforderten eine Aufteilung in 20 verschiedene Fragmente, um das gesamte Gen zu analysieren. Abb ... zeigt als Beispiel das Resultat der SSCPAnalyse von Exon 4b. Die komplementären Einzelstränge wurden komplett getrennt 54 und jeder Einzelstrang demonstriert im Idealfall einen einzelnen „Peak“. Der Upstream Einzelstrang markiert mit 6-FAM ist in der Farbe Blau dargestellt, der Gegenstrang markiert mit HEX in Grün. Die Einzelstränge eines jeweiligen Fragmentes hatten unterschiedliche Laufgeschwindigkeiten, daher variierte der Zeitpunkt des Auftretens und auch die Reihenfolge von US- und DS-Strang zwischen den verschiedenen Exonen. Bei 20 untersuchten Fragmenten führte in 15 Fällen der DS-Strang. Innerhalb des Elektropherogramms nahmen sie reproduzierbar einen spezifischen Bereich ein, wann sie in Erscheinung traten (siehe Tabelle ...). Dieser Bereich, auch „Size Range“ genannt, wurde jedoch nicht anhand einer normalen Zeitleiste bemessen, sondern anhand der Anzahl detektierter Datenpunkte in einer bestimmten Zeit. Dieses Auftreten der Einzelstränge innerhalb ihres charakteristischen Datenpunktbereiches wurde dann besonders wichtig, wenn es sich um homozygote Mutationsträger handelte, deren „Peakmuster“ meistens nur durch eine Verschiebung eines oder beider „Peaks“ im Vergleich zu den Positionen derer eines Wildtypen auffällig wurde (siehe Abb. ...). Um diese Vergleichsmöglichkeit zu gewährleisten, beinhaltete das Analysesystem einen internen Standard (Siehe Abschnitt 5.2.2.). Aber nicht in jedem Fall wurden die Einzelstränge des Wildtyp Allels als die erwarteten „Einzelpeaks“ detektiert. In einigen Fällen fanden wir ein komplexes „Peakmuster“, wie es am Beispiel von Exon 13 dargestellt ist (Siehe Abb. ...). Die SSCP entsteht nach einer milden Denaturierung, welche die Trennung der Einzelstränge bewirkt, dabei wird die energetisch günstigere Konformation favorisiert, abhängig von Sekundär- und Tertiärstruktur, Größe und Form, jedoch nicht von der Ladung (...). Manchmal existieren aber auch mehrere energetisch günstige Konformationen innerhalb eines Genotyps, dies führt dann zu einer Mehrgipfligkeit. Die beobachteten SSCP-Muster für bestimmte Genregionen mit Polymorphismen zeigten einen hohen Grad an Variation (Siehe Abschnitt 5.2.3.1. und 5.2.3.2.). Um vorliegende Mutationen in den untersuchten Fragmentbereichen zu erkennen, war es wichtig zu lernen, wie sich die Unterschiede in der Kurvendarstellung zwischen Wildtyp- und Mutanten-Proben äußerten. Hierzu wurden neun verschiedene WildtypProbanden konstant als Vergleichsmöglichkeit für die Analyse des gesamten LDLRezeptorgens herangezogen. Im Schnitt wurde jede dieser Proben wiederholt für 12 Exone eingesetzt, bzw. kamen sechs Proben auf jedes Exon. Daneben wurden noch über dreizehn weitere Wildtyp-Proben einzeln eingesetzt, vor allem um bei der 55 Untersuchung der Polymorphismen möglichst alle Genotypen einzuschließen. In der Mehrzahl der Fälle von heterozygot vorliegenden Mutationen wurde typischerweise das Auftreten von zusätzlichen "Peaks" beobachtet, wie es in den Abb. ...b und ...c zu sehen ist. Die abnormalen Muster traten jedoch nicht immer idealer Weise in beiden Strängen auf. Von 79 Darstellungen verschiedener genetischer Variationen (Bei Auftreten von zwei Variationen innerhalb eines Exons wurden diese als eine gemeinsame Darstellung gezählt) waren 23 nur durch einen Strang auffällig, wobei in 14 Fällen der führende Strang die Veränderung zeigte. Dies könnte darauf hinweisen, dass der führende Strang generell eher eine Konformationsveränderung eingeht (...). Insgesamt fiel aber bei dem Vergleich der Einzelstränge ein ausgewogenes Verhältnis der Mutationsdarstellung auf. In je 24 Fällen zeigte sowohl der führende Strang als auch der Folge-Strang die auffälligere Veränderung, in 31 Fällen waren beide gleich stark betroffen. Im Allgemeinen sollte bei der Betrachtung auch immer auf andere Formveränderungen der "Peaks" (Z.B. auf Abflachung, siehe Abb. ..) und auf Größenveränderungen der "Peaks" zueinander (Siehe Abb...) geachtet werden. Die „Peakhöhen“ sollten nicht zu niedrig, also unter 500 Units liegen, da durch unspezifische „Peaks“ aus Restfragmenten der PCR, welche dann stärker zur Geltung kommen, Artefakte entstehen können. Auf spezielle Sonderfälle in der Mutationsdetektion wird in Abschnitt 5.3. eingegangen. Tabelle: Erscheinungsbild der Wildtyp-SSCP-Analysen führender PeakA PeakanzahlB US DS Promotor DS 2 2 6330-6470 Exon1 US 1 1C 5715-5875 US 1 1-2C 5690-5970 Exon 3 DS/US 1C 2 5690-5800 Exon 4a DS 1 1 5600-5865 Exon 4b US 1 1 5755-6065 Exon 5 DS 1C 1 6015-6170 Exon 6 US 1-2 1 5670-5950 Exon 7 DS/US 1C 1 5760-5860 Exon 8 US/DS 1 1 5710-5900 Exon 9 DS 1 1 5745-5890 Exon 10 DS 1 1-2 6105-6360 Exon 11 DS/US 1 2-4 5545-5655 Fragment Exon 2 Size Range 56 Exon 12 DS 1-2 1-2 5790-5990 Exon 13 DS 2-4C 2-3 5890-6120 Exon 14 DS 1 2 5755-6110 Exon 15 DS 1-2 1 5640-5830 Exon 16 DS 1 2 5640-5870 Exon 17 DS 1C 1D 6040-6380 Exon 18 DS 1 1-2 5800-5890 ABei vier Exonen Überlagerung der „Peaks“. vom Genotyp bei vorhandenem Polymorphismus. CZusätzlich kleine Erhebung vorhanden, welche nicht als „Peak“ gewertet wird. DSehr flacher Peak. BAbhängig Abbildung: Klassische SSCP-Darstellung einer Mutation im Exon 9 des LDLRezeptorgens bei hetero-und homozygotem Vorliegen (Eigene Notiz) Mutation V408M Südafrikaner II GTG1285-ATG 68, 6.10.97. 12:03 sizing o.k. 7/1 normal Bodis 4/6 hetero Neumann 37/3 homo Berlin Abbildung: Wildtyp-SSCP-Analysen des LDL-Rezeptorgens Prom. bis Exon 18 ... 5.2.1. SSCP-Optimierung Für jedes in der SSCP-Analyse zu untersuchende Fragment können die Laufbedingungen individuell optimiert werden, wir wollten jedoch für alle Anwendungen eine Standard Kondition bestimmen. Dies würde in einer RoutineDiagnostik von Vorteil sein, wenn SSCP-Analysen von verschiedenen Fragmenten an einem Tag durchzuführen wären. Somit wurden einige der Parameter, die 57 konventionell zur Optimierung von Elektrophoresebedingungen verändert werden, in einer Standardkonstellation festgesetzt: Gel Konzentration 50g/l GS Polymer, Glyzerol Konzentration 100 ml/l, Länge der Kapillare 36 cm (bis zum Detektionsbereich), Spannung 13 KV. 5.2.1.1. Auswirkung der Temperatur auf das Laufverhalten In konventionellen SSCP-Analysen mit Polyacrylamidgelen war einer der Faktoren, welcher einen distinkten Einfluss auf die „Peakmuster“ und die Mutationsdetektion hatte, die Temperatur während der Elektrophorese. Sie beeinflusste dramatisch die Resultate der SSCP-Analyse. Die beste Separationstemperatur von zwei komplementären Strängen in der Polyacrylamidgelelektrophorese wurde bei Temperaturen zwischen 7 °C und 25 °C erreicht. Die erste Rationalisierungsmaßnahme hatte eine Temperatureinschränkung zur Folge. Daher wurde die SSCPAnalyse zunächst nur bei 30 °C durchgeführt. Da der ABI 310 Genetic Analyzer über keine Kühlvorrichtung verfügte, waren Temperaturen darunter schwierig zu halten (Nur durch kühlere Umgebungstemperatur, Kühlpackungen). Auch bei dieser im Vergleich mit der Originalmethode ungewöhnlichen Temperatur kamen die beiden Komplementärstränge sowohl ohne als auch mit genetischer Variation gut zur Darstellung. Um den Effekt der Temperatur in der Kapillarelektrophorese zu verifizieren, führten wir die SSCP-Analyse versuchsweise bei verschiedenen Temperaturen durch. Die Exone 3, 4a, 8, 9, 10, 12 und 13 wurden systematisch bei 30 °C, 35 °C, 40 °C und 45 °C getestet. Zusammenfassend wurden abweichende „Peakmuster“ dieser Exone deutlich bei den Temperaturen 30 °C, 35 °C und 40 °C detektiert. Nicht in allen Fällen war dies noch bei 45 °C möglich. Von den geeigneten Temperaturen 30 °C, 35 °C und 40 °C wurde ein Trend zur besten Trennung der komplementären Einzelstränge und Mutationsdetektion bei 30 °C gefunden. Bei den Temperaturen 40 °C und 45 °C waren teilweise die Abstände zwischen den komplementären Einzelsträngen enger, und es kam auch zu Abnahmen von „Peaks“, bzw. gingen einige ganz verloren. Dadurch wurde die Identifikation der Mutationen in einigen Fällen schwieriger (Siehe Abb. ...). Deshalb bevorzugten wir in unseren weiteren Untersuchungen zur Studie aller Fragmente eine Temperatur von 30 °C. Abbildung: Auswirkung verschiedener Temperaturen auf das Laufverhalten des Exon ... des LDL-Rezeptorgens 58 (Eigene Notiz) Muss noch ausgewählt werden Run 78 Aufgabe: Exon-Liste bei 30 °C Proben: Exon-Liste: vd. 38/1 BE 9 Exon 12 1:15 38/2 BE 10 Exon 12 1:15 Exon 12 1:15 39/10 96/048 Dillinger Exon 16 1:30 normal 30/2 S 96/36 Quast Exon 13 unvd. ++ 30/3 96/049 Dörr Exon 13 1:3 -- 30/5 97/016 Molter Exon 13 1 :3 +- 30/6 Nadiradse normal Run 80 Aufgabe: Exon-Liste 35 °C Proben: siehe Run 78 Ergebnis: 38/1 BE 9 Exon 12 Verschiebung der Mutation 38/2 BE 10 Exon 12 zusätzlicher US-Doppelpeak, normal? Ansonsten Peaks enger zsm. 30/2 S 96/36 Quast 30/3 96/049 Dörr 30/5 97/016 Molter Exon 13 US+DS enger zsm., Peaks gehen aber verloren. Run 87 Aufgabe: Exon-Liste bei 45 °C 5.2.1.2. Einfluss von PCR-Reagenzien verschiedener Herkunft auf die SSCPAnalyse Während unserer Untersuchungszeit fand ein Wechsel der PCR-Reagenzien statt. Wir bemerkten, dass dies abgesehen vom Einfluss auf die PCR-Produkte auch eine Auswirkung auf die Darstellung der SSCP-Analysen hatte. Bei dem Vergleich von 17 PCR-Läufen mit 183 Proben und 21 PCR-Läufen mit 175 Proben auf 16 Exone bezogen, ergab sich für uns ein ausgeglichenes Verhältnis zwischen den 59 Reagenzienherstellern USB und Boehringer, was die PCR-Ausbeute betrifft. Beide lieferten sowohl sehr gute bis schlechte, im Durchschnitt jedoch gleichwertige und gute Ausbeute. Bei der Betrachtung der SSCP-Bilder wurde ebenfalls ein ausgewogenes Verhältnis gefunden, ..... waren die Darstellungen von Fragmenten, die mit Boehringer-Reagenzien amplifiziert wurden, besser als .... USB-Produkte (Siehe bspw. Abb. ...). Wichtig ist jedoch zu wissen, dass es Unterschiede geben kann, so dass man vermeiden sollte, die PCR-Reagenzien während einer Untersuchungsserie zu wechseln, da kleinere Abweichungen von „Peakkurven“ auch durch den Reagenzienwechsel hervorgerufen werden können, statt durch eine Mutation. Daher sollte man möglichst Proben nur unter Verwendung der gleichen PCR-Reagenzien miteinander vergleichen. Abbildung: (eigene Notiz) USB vs. Boehr. Exon 16 Run 150 110/7 +8, 160 39/10 Dillinger 5.2.1.3. Primer als maßgebender Faktor für die Qualität Bei der Wahl der Primer stellte sich ein ähnlicher Sachverhalt wie bei den PCRReagenzien dar, jedoch nicht im selben Ausmaße, da es nur einmal der Fall war, dass ein Primerpaar von zwei verschiedenen Herstellern zum Einsatz kam. Daher sollte es mehr als Hinweis verstanden werden, dass Unterschiede die sich daraus ergeben könnten, evtl. darauf zurück zu führen sind. Die Primer für Exon 11 wurden mit derselben Sequenz je von der Firma Gibco und Perkin Elmer hergestellt, bei den Gibco-Primern war das PCR-Produkt schlechter und demzufolge war die SSCPAnalyse weniger zufriedenstellend als von derjenigen der Firma Perkin Elmer. Den weitaus größeren Einfluss nahmen die Primer aufgrund ihrer ausgewählten Sequenz ein, daher galt als erste Priorität geeignete Sequenzen zu finden. Den ersten Erfolg musste die PCR an sich möglichst in Form starker gut abgegrenzter Banden liefern, zusätzlich sollte auch die SSCP-Darstellung akzeptabel sein. In Abbildung ... ist z.B. eine Analyse des Exon 12 mit verschiedenen Primersequenzen dargestellt, wobei sich die erste Wahl als ungeeignet herausstellte, und daher eine weitere zum Einsatz kam, welche gute Ergebnisse lieferte. Eine Optimierung in 60 dieser Richtung ist damit sicherlich noch nicht ausgeschöpft, jedoch in Anbetracht der Wirtschaftlichkeit limitiert. (eigene Notiz) Abbildung: Darstellung des Exon 11 nach Amplifikation mit Primern verschiedener Hersteller Abbildung: Darstellung des Exon 12 nach Amplifikation mit unterschiedlichen Primersequenzen Exon 12 Primer alt/neu Unterschied Jensen /selbstbestimmt 5.2.1.4. Auswirkung überlang amplifizierter Fragmente auf die Mutationsdetektion Der Versuch Exon 4 als ganzes Fragment mit einer resultierenden Größe von 462 bp zu untersuchen, wurde aufgrund der deutlich reduzierten Fähigkeit der langen Einzelstränge, Konformationsunterschiede nach Einzelbasensubstitutionen aufzuweisen, nicht weiter verfolgt. Die Primer stimmten mit den Sequenzen des USPrimers von Exon 4a und des DS-Primers von Exon 4b überein (Siehe Tabelle ... und ...). Bei der Untersuchung von fünf Mutationen konnten jedoch nur drei erkannt werden (Siehe Abbildung). Daher wurde das Exon 4 wie im Abschnitt 5.1.1. beschrieben, in kleineren Teilstücken untersucht. Tabelle: Primersequenz und PCR-Ansatz für das gesamte Exon 4 des LDLRezeptorgens* Amplif. Frag- Primersequenz (5’ nach 3’) Primer- Primersequenz (5’ nach 3’) Anneal. Fragment ment- Upstream Primer Downstream Primer Temp. Exon 4 gesamt länge größe US/DS [bp] [bp] 462 GTGGTCTCGGCCATCCATC C 20/25 [°C] GGGA_CCCAGGGACAGGTG ATAGGAC 58 *Im Downstream Primer wurde als Konsequenz der Primeroptimierung an der unterstrichenen Position ein G weggelassen. 61 5 5 1 1 1 1 3 0,3 Wasser [µl] [µl] Taq: 1U/µl DNA [µl] HEX [µl] DS-Primer 6-FAM [µl] US-Primer Glyzerin [µl] Zusatz 2: MgCl2 [µl] Zusatz 1: [µl] dNTP-Mix [µl] Amp.-Puffer Fragment Amplif. Exon 4 gesamt 32,7 Abbildung: Vergleich von Mutationsdarstellungen bei Analyse eines Fragmentes, bzw. des gesamten Exon 4 des LDL-Rezeptorgens (Eigene Notiz) a) Wildtyp Dillinger Exon 4 gesamt 67/1, 107, 18.11.97, 16:55 Exon 4a 20/2, 49, 29.8.97, 14:20 Exon 4b 2/2, 3, 19.6.97, 11:57 b) Mutant Landsberg Exon 4a, nt 419 GAG-GGG, Glu119-Gly Exon 4 gesamt 67/2, 107 Exon 4a 13/5, 40, 5.8.97, 10:19 c) Mutant Kesternich Exon 4b, nt 519 TGG-TGG, Cys152-Trp Exon 4 gesamt 67/6, 107 Exon 4b 57/8, 96, 31.10.97, 13:06 d) Mutant Schlien Exon 4b 8 bp ins, nt 531, Asp 154 Gly 155 Erfolgreich Erfolgreich Erfolgreich (schon im Gel sichtbar) Exon 4 gesamt 67/7, 107 Exon 4b 51/3, 91, 21.10.97, 9:00 e) Mutant Mayer Exon 4a, nt 501 TGC-TGA, Cys146-Stop Exon 4 gesamt 67/2, 107 Exon 4a 13/5, 40 5.8.97, 10:19 62 kein Erfolg f) Mutant Dürrbaum Exon 4b, nt 682 GAG-TAG, Glu207-Stop Exon 4 gesamt 67/4, 107 Exon 4b 2/7, 3, 19.6.97, 11:57 kein Erfolg 5.2.2. Reproduzierbarkeit Neben der Ansicht der „Peakmuster“ ist die Reproduzierbarkeit von noch größerer Priorität. In Fällen mit einem komplexen Muster ist sie die Voraussetzung zur Detektion abnormaler „Peaks“, welche Mutationen anzeigen. Unter Einbeziehung des internen Standards GeneScan 500 markiert mit TAMRA, welcher zu jedem PCRProdukt hinzugefügt wurde, konnte eine komplette Überlappung der „Peakmuster“ bei Vergleich von tagtäglich aufeinanderfolgenden Elektrophoreseläufen gesehen werden, wie es z.B. in Abb... dargestellt wird. Somit war es möglich, dass auch in komplexen „Peakmustern“ Abnormalitäten klar als Mutationen erkannt werden konnten, ebenso wie homozygote Mutationsereignisse durch eine „Peakverschiebung“. Abbildung: SSCP-Darstellung einer mehrfach reproduzierten Probe des Exon ... 5.2.3.1. Polymorphismen und RFLP-Analyse Polymorphismen sind zwei oder mehrere voneinander unterscheidbare Varianten oder Genotypen innerhalb einer Population, wobei zumindest zwei dieser Varianten mit einer Häufigkeiten von mehr als einem Prozent vorkommen, so dass sie sich nicht mehr durch wiederholte Mutationen erklären lassen. Sie können durch einen Basenaustausch auch die Entstehung bzw. den Verlust von Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen nach sich ziehen, wie im Falle der Polymorphismen der Exone 8, 12, 13, 15 und 18, welche auch zu den häufig vorkommenden Polymorphismen des LDL-Rezeptorgens zählen. Zu Beginn erschwerten sie die SSCP-Analyse, daher wurden zur anfänglichen Kontrolle und Übersicht auch Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)-Analysen durchgeführt (Tabelle und , siehe auch Tabelle). Die entstandenen DNA-Fragmentmuster erleichterten die Rückschlüsse auf den jeweils vorliegenden Genotyp bei 63 Betrachtung der zugehörigen „Peakmuster“. Die Benennung des Genotyps erfolgte analog dem Schnittverhalten, später konnte auch teilweise auf die RFLP-Analyse verzichtet werden. Von den ... bekannten Polymorphismen des LDL-Rezeptorgens konnten 16 in unserer Studie beobachtet werden, zehn darunter zählen zu den häufig vorkommenden (Exon 2, 7, 8, 10, 11, 12 à zwei, 13, 15, 18), die restlichen sechs zu selten auftretenden Polymorphismen (Exon 4a, 6, 9 à zwei, 13, 14). Tabelle ...) Übersicht über die entstandenen Restriktionsfragmente nach RFLPAnalyse Exon Nukleotidaustausch Enzym Erfolgter Schnitt Entstandene des Enzyms Fragmente [bp] 2 TGC81TGT Sfa NI ++ C 101/58/34 +/- 101/92/58/34 -/- T 101/92 +/+ 136 + 39 +/- 175 + 136 + 39 -/- 175 +/+ 98 + 56 + 35 +/- 133 + 98 + 56 + 35 -/- 133 +56 +/+ 136 +56 +/- 192 + 136 +56 -/- 192 8 12 13 15 GCC1171 ACC AAT1773 AAC GTC1959 GTT CGG2232 CGA Stu I Hinc II Ava II Msp I +/+ +/-/- 18 GGC2635 AGC Msp I +/+ +/-/- (Fragmente müssen neu abgezählt werden, da andere Gesamtgröße) Tabelle: Übersicht über alle bekannten Einzelbasensubstitutions-Polymorphismen des LDL-Rezeptorgens 64 Ort Nukleotid-Austausch Enzym Häufigkeit Exon 2, nt 81* Exon 4a, nt 324 Exon 7, nt 1056 Intr. 7, nt 1060+10* Exon 8, nt 1170 Intron 9, nt 1359+29 Exon 10, nt 1413* Exon 11, nt 1617* Exon 12, nt 1725* Exon 12, nt 1773* Exon 13, nt 1959* Exon 14, nt 2029 Exon 15, nt 2231* Exon 18, nt 2635* TGCTGT GT C-T GC A-G C-T AGGAGA CCCCCT CTCCTT AATAAC TCC-TTC C-A CGGCGA GGCAGC Sfna I Mae III Artificial Cfo I Sma I Stu I Hha I G-A Artificial Stu I C-T Hinc II Ava II C-A Msp I Msp I 0,86 : 0,14 0,997 : 0,003 0,995 :0,005 0,581 : 0,419 0,931 : 0,069 0,560 : 0,440 0,500 : 0,500 0,921 : 0,079 0,99 : 0,01 0,561 : 0,439 0,596 : 0,404 ? 0,401 : 0,599 0,687 : 0,313 ? *In unserer Studie untersucht worden. 5.2.3.2. SSCP-Analyse von Exon 12-Fragmenten nach Restriktionsenzymverdau Im Exon 12 sind zwei häufig vorkommende Polymorphismen zu finden, daraus würden sich theoretisch neun verschiedene Varianten ergeben, wie sich eine SSCPAnalyse des Exon 12 darstellen könnte. Der Genstatus des „Silent“ Polymorphismus (nt 1725 CTC-CTT) war gut an der Darstellung des DS-Stranges durch klassische „Doppelpeakbildung“ zu erkennen. Der „Hinc II“ Polymorphismus (nt 1773 AAT-AAC) war bei 30 °C schwieriger zu unterscheiden, es ergaben sich nur leichte Unterschiede bei der Form der „Peakspitze“ des US-Stranges, außerdem war die Form zusätzlich von dem „Silent“-Genotyp beeinflusst. Die „Peaks“ der US- und DSStränge traten an fünf Positionen auf (Siehe Abbildung ...). Vereinfacht dargestellt stand bei normalem “Silent” Polymorphismus der DS-Strang links in 1. Position, im homozygoten Zustand rechts in 3. Position, im heterozygoten Zustand dann an beiden Positionen. Bei dem „Hinc II“ Polymorphismus waren weitere Details zu beachten. Im normalen Zustand zeigte sich der US-Strang in 2. Position mit einem spitzer ansteigendem „Peak“ und leichtem Knie, bei Homozygotie mit einem abgeflachten „Peak“, jedoch hing die Position an 4. oder 5. Stelle vom Genotyp des „Silent“ Polymorphismus ab, d.h. bei normalem „Silent“ an 4. Stelle, bei hetero- oder homozygotem an 5.Stelle. War der „Hinc II“ Polymorphismus heterozygot, zeigte der 65 US-Strang eine vorliegendem „Doppelpeakneigung“, „Silent“ Polymorphismus welche besser abhängig zur bei Trennung heterozygot kam. Diese unübersichtliche Darstellung in der SSCP-Analyse erschwerte die Erkennung vorliegender Mutationen. Eine Temperaturerhöhung erbrachte nur bei 35 °C einen geringen Vorteil um den Genotyp der Polymorphismen zuzuordnen, während die Restriktionsenzym-Analyse ihn eindeutig bestimmte (Siehe auch Abschnitt ...). Das Wissen über den Genotyp allein reichte aber noch nicht, es musste erst der Zusammenhang zum Kurvenverlauf erkannt werden um zu differenzieren, ob auch Mutationen vorliegen könnten. Wir suchten daher noch nach einer vereinfachteren Mutationsdetektion. Hierzu wurden die PCR-Fragmente des Exon 12 nach Restriktionsenzymverdau nicht in der Agarosegel-Elektrophorese, sondern als SSCP-Analyse untersucht. Es stellte sich ein übersichtlicheres „Peakmuster“ mit einer einfacheren Zuordnung zu den Genotypen heraus. Damit wurde auch die Erkennung abnormal vorliegender „Peaks“ verbessert. Der US-Strang bezeichnete durch typische „Doppelpeakbildung“ den „Silent“ Polymorphismus, der DS-Strang ebenso den „Hinc II“ Polymorphismus. Abweichungen davon hoben sich klar hervor (Siehe Abbildung ... und Tabelle ...). Diese zusätzliche Analyse wurde im weiteren Verlauf nach zunehmendem Erfahrungsgewinn nur noch bei Proben durchgeführt, bei denen eine Unsicherheit in der Beurteilung bestand. Abbildung: SSCP-Darstellung der verschiedenen Genotypen der Exon 12Polymorphismen (Eigene Notiz) Exon 12 SSCP 30 °C unvd. Run 177 13/13 n L1 143/13 98/98 n L6 133/2 98/98 e L7 133/3 13/98 n L4 143/16 13/98 e L2 143/14 98/98 o 151/3 Run176 66 mehrere überlagert 17.-19.3. 13/13 - - normal/normal Hettrich 97/018, 221, 28/16 (15), alle 30 °C bzw. 40, 228 13/98 +- hetero/normal Bu61, 221, 28/13 (12) 13/98 hetero Bu55, 221, 28/12 (11) 229 98/98 normal Bu34 225, 32/8 229 98/98 homo Bu65, 221, 28/15 (14) 229 98/98 hetero Bu12, 221, 28/4 (3) 229 228 Abbildung: SSCP-Darstellung von Exon 12-Fragmenten nach Restriktionsenzymverdau Exon 12-Verdau Run 186 Wildtypen: 13/13 n Lier H3 13/98 n Täffner H4 13/98 e L15 H15 98/98n Nebel H18 98/98e L7 H19 Run 220 8/ Exon 12-Verdau 1 13/98 n 5 98/98 n 6 13/98 e 10 13/13 n 11 98/98 n außer 8/5 Polymorphismen bestätigt Aladag auffällige Verschiebung Tabelle: Vereinfachte Übersicht zur Zuordnung der „Peaks“ der Exon 12-Fragmente in der SSCP-Analyse 67 Silent Hinc II US DS Abbildung +/+ +/+ rechts links +/+ +/- rechts rechts + links Nur theoretisch, da keine Probe dieses Genotyps vorhanden war S.o. +/+ -/- rechts rechts S.o. +/- +/+ links + rechts links 98/98 e Bu12 226, 28/4 +/- +/- links + rechts rechts + links 13/98 e Samardian 87/026, 220, 8/6 +/- -/- links + rechts rechts -/- +/+ links links -/- +/- links rechts + links -/- -/- links rechts 98/98 n Habbig 91/058, 220, 8/11 13/98 n Bednorz 87/133, 220, 8/1 13/13 n Schindhelm 91/045, 220, 8/10 5.2.4. Verschiedene Mutationen mit geringer Nukleotidpositions-Distanz Von den Mutationen, die uns für die Untersuchung zur Verfügung standen, waren einige in nur geringer Nukleotidpositions-Distanz voneinander lokalisiert. Es stellte sich die Frage, wie stark z.B. ein unterschiedlicher Basenaustausch innerhalb eines engen Bereiches sich auf die Darstellung in der SSCP-Analyse auswirken könnte. Sollte die Lokalisation dabei auch eine Rolle spielen, müsste sie einen erkennbaren Einfluss auf den Kurvenverlauf haben. Bei dem Vergleich von sechs hauptsächlich aus dem Exon 4 zugeordneten Paaren, deren Mutationen sich maximal nur um ein Basenpaar voneinander trennten, war es uns nicht möglich in den Kurvenverläufen einen Zusammenhang zu erkennen. Beispielsweise zeigt schon der unterschiedliche Basenaustausch an der gleichen Position nt 1329, wie stark sich die SSCP-Analysen voneinander unterscheiden (Siehe Abbildung ...). Somit ließ sich aus den Kurvenverläufen kein Lokalisationshinweis herleiten, die SSCP-Darstellungen gestalteten sich zu individuell. 68 Abbildung: Vergleich zweier unterschiedlicher Basenaustausche an der gleichen Nukleotidposition im Exon 9 des LDL-Rezeptorgens (Eigene Notiz) Exon 9 TGG1329-TGC Robertz, 4/7, 15 TGG1329-TGA Groß, 90/9, 137 (nicht in 61er Liste) Leider 26 und 30 min Laufzeit. 5.2.5. Detektion von Mutationen mit geringem Primer-Positionsabstand Die meisten Mutationen lagen in einem größeren Abstand von den Primern entfernt, nur drei waren bis auf wenige bp angenähert lokalisiert. Es handelte sich um eine Substitution T→C (nt 313) im Intron 3 mit 9 bp, eine 1 bp Insertion im Exon 4a mit 7 bp (nt 315 ins T) und eine Substitution G→A (nt 940+36) im Intron 6 mit der geringsten Anzahl von nur 2 bp zwischen sich und dem nächststehenden Primer. Die erfolgreiche Detektion dieser genetischen Varianten ließ darauf schließen, dass prinzipiell die gesamten kodierenden Bereiche des LDL-Rezeptorgens erfasst werden konnten, zumal die Primer sich außerhalb der Splicing Sites befanden. Ausnahme bildeten genetische Varianten, die genau im Bereich der internen Primer von Exon 4a und b lokalisiert waren (nt 517 TGC→GGC, nt 518 TGC→TAC, nt 519 TGC→TGG, nt 530 TCG→TTG, nt 531 8 bp ins), diese konnten mit einer solchen Primerkonstellation nicht detektiert werden. Daher wurden sie in einer zusätzlichen Analyse mit anderen Primern, welche speziell diesen Bereich umfassten, untersucht (Siehe Abschnitt 5.1.1.). 5.3. Detektierte Mutationen Aus den ersten Untersuchungen ging hervor, dass die Kapillarelektrophorese prinzipiell für die SSCP-Analyse geeignet war. Um uns nun einen Eindruck über die Sensitivität der Methode zu verschaffen, studierten wir 63 vorab charakterisierte (durch Sequenzierung, RFLP-Analyse oder DGGE) genetische Varianten im LDLRezeptorgen, die sich auf über 74 Probanden verteilten. Diese Anzahl kam zustande, da möglichst viele Individuen zur Darstellung der verschiedenen Genotypen der 69 Polymorphismen eingerechnet wurden. Zusätzlich zu diesen Indexprobanden wurden, wenn vorhanden, noch weitere Subjekte mit identischen Mutationen bzw. Polymorphismen analysiert. Acht der genetischen Varianten waren häufig vorkommende Polymorphismen (Siehe Abschnitt ...), zwei weitere waren seltene Varianten ohne pathologische Bedeutung (Exon 9 nt 1338 CTG-CTT, Exon 13 nt 1920 AAT-AAT), die restlichen 51 standen für Mutationen, welche bei 50 Individuen Hypercholesterinämie verursachten. In der Mehrzahl lagen die Mutationen heterozygot vor, nur vier waren homozygot (Exon 4b nt 518 TGC-TAC, Exon 6 nt 917 TCA-TTA, Exon 7 nt 1013 TGC-TAC, Exon 9 nt 1285 GTG-ATG, daneben wurden homozygote Zustände bei sechs Polymorphismen gesehen). Die Mutation V408MAfrikaner 2 (GTG1285-ATG) stand als einzige in heterozygoter und homozygoter Form zur Verfügung. Weiterhin befanden sich fünf Mutationen mit einer zusätzlichen Mutation, sogenannte Compound-Mutationen, im Kollektiv. Bei einem Probanden waren sie innerhalb desselben Exons lokalisiert, so dass sie in der SSCP-Analyse nicht einzeln, sondern als Verschmelzung dargestellt wurden (Exon 4a, ACG324ACT und TGC325-CGC). Daher sollte die Durchsicht einer Sequenzierung aufgrund auffälliger SSCP-Analyse nicht nach der ersten gefunden Mutation beendet werden. Das zur Verfügung gestandene DNA-Material zeigte einen breiten Ausschnitt aus verschiedenen genetischen Varianten, deren Zusammenstellung aus 50 einzelnen Nukleotidsubstitutionen, sechs kleinen Deletionen (3 x 1 bp, 3 bp, 4 bp, 37 bp), sechs kleinen Insertionen (2 x 1 bp, 2 bp, 4 bp, 8 bp, 11 bp) und einer kombinierten Insertions/Deletions Mutation (5 bp ins, 6 bp del) bestand (Siehe Tab.). Mit Ausnahme des Promotors, Exon 16 und 17, waren alle Exone mit genetischen Varianten vertreten. Die Verteilung von Mutationen über eine große Anzahl von Exonen war wichtig zur Erkenntnis, ob die SSCP-Analyse prinzipiell einsetzbar wäre, um unbekannte Mutationen in bestimmten Exonen zu detektieren. Von 63 verschiedenen Mutationen wurde in 61 Fällen ein distinktes abnormales „SSCPPeakmuster“ gefunden, welches die vorhandene genetische Variation indizierte. Die zwei Mutationen welche nur leichte Abweichungen im „SSCP-Peakmuster“ zeigten, wurden detaillierter untersucht. Es handelte sich um eine 1 bp Insertion und eine einzelne Nukleotidsubstitution. Für die 1 bp Insertion (Exon 10, 1 bp ins 1429) bestand die Abnormalität in einer größeren „Peak-Höhendifferenz“ zwischen den beiden „Einzelpeaks“ im Vergleich zu denen eines Wildtypen. Diese Abnormalität wurde in mehreren Läufen reproduziert. 70 Nach einer Erhöhung der Elektrophorese-Temperatur auf 45 °C konnte die Mutation jedoch klar durch die Bildung eines abnormalen „Peakmusters“ erkannt werden (Siehe Abb. ..). Die Insertion war ein Cytosin in einer Region von fünf Cytosinen. Das umgekehrte Komplement einer bestimmten Sequenz von vier Basen kommt durchschnittlich alle 4x4x4x4=256 Nukleotide wieder vor, so beinhaltet ein Einzelstrang mehrere mögliche Sequenzen, um Vierer-Basenpaardoppelstränge zu formen, so dass Ringstrukturen entstehen. Längere Stränge können manchmal „perfekt match“-Duplexe bilden. Das Verhalten dieser Stammringe ist abhängig von dem G+C-Gehalt, diese Verbindungen sind stabiler als A+T (Humphries). Der im Exon 10 vorhandene Sequenzabschnitt im Bereich von obig genannter Mutation (GG CCC , Codon 460) findet sich im Codon 500 komplementär wieder. Offenbar war diese kleine Region der intramolekularen Basenpaarungen verantwortlich für eine so stabile Einzelstrangkonformation, dass aus der 1 bp Insertion keine Konformitätsänderung resultierte. Hinzu kommt, dass größere Fragmente wie auch das Exon 10 mit einer Fragmentgröße von 278 bp weniger dazu neigen, Konformationsunterschiede ungewöhnlich hohe zu zeigen. Temperatur In diesem notwendig, speziellen entsprechend Fall einer war die erhöhten Schmelztemperatur, um die Destabilization des Einzelstranges zu provozieren, also den Verband der Basenpaarungen zu lockern, so dass die Sequenzänderung Einfluss auf die Konformation gewinnen konnte. In einem aus dem Internet verfügbaren Programm (mfold) konnte man diesen Sachverhalt als Simulation nachvollziehen, indem die Sequenz des Fragmentes eingegeben wurde und man sich die bei verschiedenen Temperaturen entstehenden Ringstrukturen mit entsprechenden Energiezuständen betrachten konnte. Auch hier wurde bei Temperaturerhöhung die komplexe Ringstruktur in eine einfachere Form gesprengt (Evtl. Abb.). Die andere schwer zu detektierende Mutation mit der 1 bp Substitution (Exon 4b, TCG530-TTG) wurde bei 30 °C nur durch einen abgeflachteren „Peakverlauf“ eines Einzelstranges auffällig. Diese Abnormalität war ebenfalls reproduzierbar. Durch Erhöhung der Temperatur wurde die Auffälligkeit prominenter, aber bis 45 °C gab es noch keine dramatischen Veränderungen. Das deutlich unterscheidende „SSCP-Peakmuster“ als Indikator einer Mutation wurde erst bei 48 °C gefunden (Siehe Abb. ..). Der genaue Grund für die Schwierigkeit, diese Mutation zu detektieren, bleibt noch unklar. Aufgrund dieser Erfahrungen setzten wir Kriterien für die Untersuchung von Fragmenten bei höherer Temperatur fest, und zwar bei 71 diskreten Auffälligkeiten wie „Peakhöhendifferenzen“ und leichten Formveränderungen, besonders wenn es sich um große Fragmente handelte. Ein großer Vorteil eines softwareunterstützen Analyse-Systems ist die Möglichkeit der Datenspeicherung. Die SSCP-Muster der verschiedenen Mutationen können gespeichert und auch nachbearbeitet werden, so konnte eine Art von Datenkatalog für verschiedene Mutationen kreiert werden. Neu diagnostizierte Proben mit Mutationen konnten mit den gespeicherten SSCP-Mustern verglichen werden. Wenn eine Übereinstimmung zwischen gespeichertem SSCP-Muster und einem neu dargestellten bestand, war mit hoher Wahrscheinlichkeit die Art der Mutation schon charakterisiert. Dies erleichterte auch die Bestätigung der Mutation im darauf folgenden Sequenzierungsschritt, welcher zur Absicherung immer erfolgte. Tabelle: Detektion von bekannten Mutationen und Polymorphismen durch SSCPAnalyse und Kapillarelektrophorese a) im Überblick Mutationen Anzahl detektiert im Gesamt Standardansatz* Punktmutationen 50 49 50 Insertionen (2 x 1 bp, 2 bp, 4 bp, 8 bp, 11 bp) 6 5 6 Deletionen (3 x 1 bp, 3 bp, 7 bp, 37 bp) 6 6 6 Insertion + Deletion (5 bp ins, 6 bp del) 1 1 1 Gesamt 63 59 63 *Standardansatz: Temperatur 30 °C; Gel Konzentration 50 g/l; Glyzerin 100 ml/l. b) im Detail Ort (Literatur/ DNA)a NukleotidAustausch Ort 72 (Literatur/ DNA)a NukleotidAustausch Exon 1, nt 1 Exon 2, nt 81 Exon 3, nt 196 Exon 3, nt 224 Exon 3, nt 253 Exon 3, nt 259 Exon 3, nt 301 Intron 3, 313+2 Exon 4a, nt 315 Exon 4a, nt 324 and nt 325 Exon 4a, nt 400 Exon 4a, nt 418 Exon 4a, nt 419 Exon 4a, nt 500 Exon 4a, nt 501 Exon 4b, nt 517 Exon 4b, nt 518 Exon 4b, nt 519 Exon 4b, nt 530 Exon 4b, nt 531 Exon 4b, nt 615 Exon 4b, nt 651 Exon 4b, nt 652 Exon 4b, nt 652 Exon 4b, nt 656 Exon 4b, nt 662 Exon 4b, nt 671 Exon 4b, nt 682 Exon 5, nt 757 Exon 5, nt 798 Exon 6, nt 858 ([15]/c) ([3]/d) (x/a) ([2,3]/a) ([2,3]/b) ([2,3]/a, c) ([2,3]/a) ([3]/c) (x/a) (x/a) [2,3] (x/a) (x/c) (x/a) ([2,3]/b) ([2,3]/a) ([2,3]/b) ([2,3]/a) ([2]/a,c) (x/b) ([2,3]/a) (x/c) ([2,3]/a) ([2,3]/a) ([2,3]/a) ([2]/a) ([2,3]/a) ([2,3]/a) ([2,3]/a, c) ([2]/c) ([2,3]/b) ([...]/d) ATGGTG Exon 6, nt 917 ([2,3]/b) TGTTGCb Exon 7, nt 970 ([2,3]/b) 2 bp ins AT Exon 7, nt 1013 (x/c) TGTTAT Exon 8, nt 1073 ([...]/d) CAGTAG Exon 8, nt 1171 ([3]/a, d) TGGGGG Exon 9, nt 1285 ([2,3]/a, b) GAGAAG Exon 9, nt 1307 ([2,3]/a) TC Exon 9, nt 1329 ([2,3]/a) 1 bp ins Exon 9, nt 1338 (x/a) ACGACT Exon 9, nt 1340 (x/a) TGCCGC Exon 10, nt 1413 ([3]/a, d) TGCCGC Exon 10, nt 1426 (x/a) GAGGAC Exon 10, nt 1429 (x/a) GAGGGG Exon 10, nt 1444 ([2,3]/a) TGCTAC Exon 10, nt 1567 ([2,3]/a) TGCTGA Exon 10, nt 1570 (x/a) TGCGGC Exon 11, nt 1646 ([2,3]/d) TGCTAC Exon 12, nt 1720 (x/c) TGCTGG Exon 12, nt 1725 ([3]/a, d) TCGTTG Exon 12, nt 1773 ([3]/a, d) 8 bp ins Exon 12, nt 1784 ([2,3]/b) 11 bp ins Exon 13, nt 1873 (x/c) 37 bp del Exon 13, nt 1920 (x/d) 1 bp del Exon 13, nt 1959 ([3]/d) 3 bp del Exon 14, nt 2042 ([2,3]/b) 6 bp ins+5 bp del Exon 14, nt 2054 ([2,3]/c) GACGGC Exon 14, nt 2096 ([2,3]/b) + ins GACGTC Exon 15, nt 2167 (x/d) GAGTAG Exon 15, nt 2177 ([2,3]/c) CGGTGG Exon 15, nt 2225 (x/c) GATGAA Exon 15, nt 2232 ([3]/a, d) AGCAGA Exon 18, nt 2635 ([3]/a, d) TCATTA 1 bp del TGCTAC TGTTAT GCCACCb GTGATG GTGGCG TGGTGC CTGCTT TCCTGC AGGAGAb 4 bp ins 1 bp ins GACAAC GTGATG GTGTTG CGCTGC CGCTGC CTCCTTb AATAACb 7 bp del AACACC AACAAT GTCGTTb TGCTAC CCGCTG CCGCTG 1 bp del G ACCATC ACCATC CGGCGAb GGCAGCb a In der Spalte (Literatur/DNA) bezieht sich die erste Position in Klammern auf die Datenbank, in welcher die Mutationen aufgelistet sind (siehe Kap. Literatur), x beschreibt eine noch nicht vorher publizierte Mutation. Die zweite Position bezieht sich auf das Zentrum woher die DNA erhalten wurde: a Köln Institut der Klinischen Chemie, Universität Köln b Berlin Franz-Volhard-Klinik, Max-Delbrück-Zenter für Molekularmedizin c Freiburg Klinisch-Chemisches Zentrallabor, Universität Freiburg d Homburg Klinisch-Chemisches Zentrallabor, Universität des Saarlandes b diese genetischen Varianten sind Polymorphismen, die schon in der Literatur beschrieben wurden. Tabelle: Verteilung der detektierten genetischen Varianten im LDL-Rezeptorgen Amplif. Gesamt Fragment Substitutionen Polymor- insgesamtA phismen Insertionen Deletionen Insertion + Deletion Prom 0 Exon 1 1 1 Exon 2 1 1 Exon 3 6 5B 1x2 Exon 4 20 13 1x1, 1x8, 1x11 1 1x1, 1x3, 1x37 1x 6 ins + 5 del Exon 5 2 2 73 Exon 6 2 2 Exon 7 2 1 Exon 8 2 2 Exon 9 5 5 Exon 10 6 4 Exon 11 1 1 Exon 12 4 3 2 Exon 13 3 3 1 Exon 14 3 3 Exon 15 4 3 Exon 16 0 0 Exon 17 0 0 Exon 18 1 1 1 Gesamt 63 50 8 1x1 1 1 1x1, 1x4 1x7 1 1x1 6 6 1 AEinschließlich BEine der Polymorphismen. Substitution befindet sich im Intron. Abbildung: SSCP-Darstellungen schwer detektierbarer Mutationsereignisse bei verschiedenen Temperaturen Bilder: (eigene Notiz) a) Dinani, Igbal, 91/016, 14/4/6 15/4homo A 8731 70, 8.10.97, 12:12 sizing o.k., 30, 35 ° 30 min 45 °C 57, 14/4, 45 °C 63, 15/4 b) BE3, 51/1 68/4 (Bodis 96/047) 30, 45, 48/50 °C, 204, 203, 5.4. Multiplex-Analyse Eine einzelne SSCP-Analyse miteingerechnet der Zeit für die Wiedereinfüllung des Gels benötigt 36 min. Da 20 Fragmente untersucht werden müssen, um das ganze LDL-Rezeptorgen zu erfassen, vergehen ca. zwölf Stunden, um eine Probe komplett durchzuanalysieren. Um die Analysezeit zu minimieren, wurden Multiplex-Analysen 74 eingeführt. Somit eignete sich dieses System auch für die genetische RoutineDiagnostik eines großen Gens. Für jedes Exon hatten beide DNA-Einzelstränge ihre charakteristische Retentionszeit in der Kapillarelektrophorese. In Abhängigkeit von der Retentionszeit wurden jeweils die Kombinationen der Exone ausgewählt, deren Einzelstränge die mit der gleichen Fluoreszenzfarbe markiert waren, sich nicht überlappten. Mit den vorhandenen zwei Fluoreszenzfarben (eine weitere wurde für den Standard benötigt, also wäre nur noch eine weitere von den derzeit für dieses Gerät erhältlichen vier Farben einzusetzen gewesen) war die kombinierte Analyse auf zwei Fragmente zur Zeit limitiert. Es ist denkbar, mit weiteren Farbmarkierungen eine größere Anzahl an Fragmenten gleichzeitig untersuchen zu können. In dieser Multiplex-Analyse konnten die Exone in einer Multiplex-PCR amplifiziert werden oder die fertigen PCR-Produkte wurden nach dem Amplifikationsschritt miteinander gemischt. In unserer Analyse bevorzugten wir das Zusammengeben der PCRProben nach der Amplifikation. Durch diese Prozedur ergab sich der Vorteil, dass jedes einzelne PCR-Produkt je nach Ausbeute vorher individuell mit Wasser verdünnt werden konnte, und so die später detektierten Fluoreszenzintensitäten aneinander angeglichen waren. Dies ermöglichte eine übersichtliche Darstellung beider Analysen auf einem Bild, bzw. im selben Detektionsbereich. Im Hinblick auf die Retentionszeit (mit „Datapoint-Abstand“ von mind. 100), die Fluoreszenzmarkierung der Einzelstränge (möglichst kein Aufeinanderfolgen von Einzelsträngen gleicher Markierung, deshalb wurde als Ausnahme der DS-Strang von dem mutationsarmen Exon 17 auch mit FAM markiert, da er dem DS-Strang von Exon 2 in der Multiplex-Analyse folgt) und dem Ausschluß von „Mutational Hot Spot“Exonen (wie Exon 4) wurden folgende Kombinationen als Multiplex-Analyse erstellt: Promotor + Exon 18, Exon 7 + 11, Exon 2 + 17, Exon 3 + 12, Exon 8 + 5, Exon 9 + 10 und Exon 13 + 16. Ein Beispiel einer Multiplex-Analyse ist in Abbildung ... präsentiert. Alle Mutationen konnten in der Multiplex-Analyse ohne Qualitätsverlust detektiert werden, für die Komplett-Analyse des ganzen Gens ergab sich eine Zeit von 7.8 h, also eine Zeitersparnis von 35 % der ursprünglichen Dauer. Eine weitere Zeitverkürzung durch ein „Pooling“ wäre theoretisch auch denkbar, jedoch praktisch schwierig durchzuführen, da zum einen für eine Analyse nur 1 µl an Probenmaterial eingesetzt wird. Bei einem Mix aus z.B. 10 verschiedenen DNAProben, welche vorher noch entsprechend der PCR-Ausbeute durch Verdünnung aneinander angeglichen werden müssen, ist es nicht zu gewährleisten, dass alle 75 letzendlich in gleicher Konzentration vorliegen. Zum anderen zeigte schon ein Mix aus zwei Proben, dass sich die Fluoreszenzen summieren und mutationsbedingte „Peaks“ dabei untergehen können. Fragmente die Polymorphismen beinhalten, wären auch nicht mehr zu beurteilen. Daher wurde dieses für uns zu unsichere Verfahren nicht eingesetzt. Abbildung: SSCP-Darstellung einer Multiplex-Analyse der Exon 9 und 10 des LDLRezeptorgens 5.5. DNA-Sequenzierung Zur DNA-Sequenzierung wurde das von SANGER 1977 et al. beschriebene und später von TABOR und RICHARDSON modifizierte Kettenabbruchverfahren eingesetzt (..). In der Cycle-Sequencing-Reaktion entstehen durch Einbau von fluoreszenzmarkierten Didesoxynuklotiden multiple DNA-Fragmente mit jeweils einem Nukleotid als Längenunterschied. Nach elektrophoretischer Sequenz-Analyse mit Fluoreszenzdetektion kann ein so amplifiziertes DNA-Fragment auf Sequenzabweichungen untersucht werden. 5.5.1.Vorlauf-PCR Die Vorlauf-PCR wurde als normale Amplifikationsreaktion zur Unterstützung der Cycle-Sequencing-Reaktion vorgeschaltet, um genügend Ausgangsmaterial für die anschließende Sequenzanalyse zu erhalten. Um die Fluoreszenzemissionen der markierten Didesoxynukleotide der Cycle-Sequencing-Reaktion nicht zu überlagern, wurden in der Vorlauf-PCR unmarkierte Primer eingesetzt. Da einige Primer noch aus früheren Projekten vorlagen, stimmten deren Sequenzen teilweise nicht mit denen der fluoreszenzmarkierten Primer aus der SSCP-Analyse überein (vgl. Tabelle..mit Tabelle...). Daher ergaben sich auch kleinere Abweichungen in den Ansätzen (vgl. Tabelle...mit Tabelle), die entsprechend den abweichenden Primern neu optimiert wurden. Die abweichenden Primersequenzen sollen jedoch bald nach Verbrauch abgesetzt werden, und die in der SSCP eingesetzten Primersequenzen übernommen werden. Zur Isolierung und Reinigung der gewonnenen DNAEinzelstränge von restlichen Reaktionskomponenten der Vorlauf-PCR, welche sich 76 störend auf die DNA-Sequenzierung auswirken können, wurde ein Aufarbeitungsverfahren angewendet (Siehe hierzu Abschnitt ...). Tabelle: Primersequenzen für die Sequenz-Analyse (Vorlauf-PCR) des LDLRezeptorgensa. Amplif. Frag- Fragmentb ment- Primersequenz (5’ nach 3’) Upstream Primer Primerlänge größe US/DS [bp] [bp] Primersequenz (5’ nach 3’) Downstream Primer* Anneal. Temp.c [°C] Promotor 277 CAGCTCTTCACCGGAGACC 19/20 ACCTGCTGTGTCCTAGCTGG Exon 1 223 TGAAATGCTGTAAATGACGTGGG 23/23 GCTCCCTCTCAACCTATTCTGGG 58 Exon 2 183 CCTTTCTCCTTTTCCTCTCTCTCAG 25/25 AAAATAAATGCATATCATGCCCAAA 54 Exon 3 196 TTCCTTTGAGTGACAGTTCAATCC 24/24 GATAGGCTCAATAGCAAAGGCAGG 56 Exon 4a 355 GTTGGGAGACTTCACACGGTGATGG 25/25 ACTTAGGCAGTGGAACTCGAAGGCC 60 Exon 4b 236 CGACTGCGAAGATGGCTCGGA 21/25 GGGA_CCCAGGGACAGGTGATAGGAC 58 Exon 5 239 AAGGCCCTGCTTGTTTTTCT 20/18 TGCTTGGCAGAGAATGGG 54 Exon 6 216 CTGACCTTCCTCCTTCCTCTCT 22/20 AACCTCCACCTTTCCTGGCT 54 Exon 7 211 GGCCCGAGAGTGACCAGT 18/19 CATGTCAGGAAGCGCAGAG 56 Exon 8 176 CCAAGCCTCTTTCTCTCTCTTCCA_ 24/25 CCACCCGCCGCCTTCCCGTGCTCAC 60 Exon 9 223 CCTGACCTCGCTCCCCGGACCCCC_ 24/25 GGCTGCAGGCAGGGGCGACGCTCAC 60 Exon 10 278 ATGCCCTTCTCTCCTCCTGCCTCAG 25/24 AGCCTCAGCGTCGTGGATACGCAC 60 Exon 11 179 GCCTCACAGCTATTCTCTGTCCTCC 25/25 TCCCTGTGACGGCTGTCCTGCGAAC 58 Exon 12 190 TCTCCTTATCCACTTGTGTGTCTAG 25/25 CTTCGATCTCGTACGTAAGCCACAC 60 Exon 13 218 GTCATCTTCCTTGCTGCCTGTTTAG 25/25 GTTTCCACAAGGAGGTTTCAAGGTT 58 Exon 14 228 TGCCCTGACTCCGCTTCT 18/18 GGGGCAGTTGGAGGACAC Exon 15 221 AGAAGACGTTTATTTATTCTTTC 23/23 GTGTGGTGGCGGGCCCAGTCTTT 52 Exon 16 128 CCTCACTCTTGCTTCTCTCCTGCAG 25/25 CGCTGGGGGACCGGCCCGCGCTTAC 56 Exon 17 246 AGCTGGGTCTCTGGTCTCGGAGGC 24/22 GGCTCTGGCTTTCTAGAGAGGG Exon 18 190 TCCAGCCTGTTTCCTGAGTGCTGG 24/24 CAGGCAATGCTTTGGTCTTCTCTG aDie 58/60 56/58 58/60 56 unterstrichenen Nukleotide der Primersequenzen sind Nukleotidsubstitutionen als Konsequenz der Primeroptimierung. Im Downstream Primer von Exon 4b wurde an der unterstrichenen Position ein G weggelassen. Am 3’ Ende der Upstream Primer von Exon 8 und 9 wurde im Vergleich mit der gewählten Primersequenz von ... ein A weggelassen. 77 bDie den unterstrichenen Exonen zugehörigen Primer stimmen in ihrer Sequenz nicht mit denen für die SSCP-Analyse überein (Vgl. Tabelle...). cBei Angabe von zwei Temperaturen konnte in diesen Fällen keine eindeutig geeignetere Temperatur bestimmt werden, je nach Situation wurden beide wechselhaft eingesetzt. Wasser [µl] [µl] Taq: 1U/µl DNA [µl] HEX [µl] DS-Primer 6-FAM [µl] US-Primer Glyzerin [µl] Zusatz 2: MgCl2 [µl] Zusatz 1: [µl] dNTP-Mix [µl] Amp.-Puffer Exon Tabelle: Vorlauf-PCR-Ansätze für die Sequenz-Analyse des LDL-Rezeptorgens Prom. 5 5 3 1 1 1 2 1,5 30,5 1 5 5 4 1 1 1 2 1,5 29,5 2 5 5 4 - 1 1 2 1,5 30,5 3 5 5 4 - 1 1 2 1,5 30,5 4a 5 5 3 - 1 1 2 1,5 31,5 4b 5 5 4 1 1 1 2 1,5 29,5 5 5 5 4 2 1 1 2 1,5 28,5 6 5 5 4 1 1 1 2 1,5 29,5 7 5 5 4 1 1 1 2 1,5 29,5 8 5 5 3 1 1 1 2 1,5 30,5 9 5 5 3 1 1 1 2 1,5 30,5 10 5 5 4 1 1 1 2 1,5 29,5 11 5 5 2 1 1 1 2 1,5 31,5 12 5 5 3 - 1 1 2 1,5 31,5 13 5 5 4 - 1 1 2 1,5 30,5 14 5 5 4 1 1 1 2 1,5 29,5 15 5 5 6 1 1 1 2 1,5 27,5 16 5 5 3 - 1 1 2 1,5 31,5 17 5 5 3 1 1 1 2 1,5 30,5 18 5 5 3 - 1 1 2 1,5 31,5 5.5.2. Cycle-Sequencing 78 In der Cycle-Sequencing-Reaktion wird ein DNA-Fragment von jeweils nur einem unmarkierten Primer (Upstream oder Downstream) linear amplifziert, gleichzeitig veranlassen fluoreszenzmarkierte Didesoxynukleotide eine Abbruchketten-Reaktion. Die einzelnen Ansätze für die zu untersuchenden Fragmente unterschieden sich diesmal nur durch die eingesetzten Primer, der DNA-Probe und der AnnealingTemperatur. Die Primer stimmten mit denen in der Vorlauf-PCR-Reaktion eingesetzten Primersequenzen überein. Für jede Probe wurden beide Einzelstrangsequenzen untersucht, da deren Komplementarität in der späteren Sequenz-Analyse eine Vergleichsmöglichkeit bietet und damit die Auswertung erleichert. 5.5.3. Sequenzanalyse Nach den Sequenzierungsläufen wurden die detektierten Rohdaten analysiert und in Elektropherogrammen ersichtlich. In diesen stellte jeder "Peak" ein Nukleotid dar, entsprechend seiner Fluoreszenzfarbe definiert (A=grün, T=rot, G=schwarz, C=blau, siehe auch Abschnitt ...). Über jedem "Peak " wurde das von der Software erkannte Nukleotid auch vermerkt, jedoch war eine genaue visuelle Überprüfung der "Peaks" unerlässlich, da die Software bei heterozygoten Überlagerungen von "Peaks" oft nur die Angabe des Nukleotids mit der stärkeren Fluoreszenzintensität erbrachte, also der heterozygote Zustand nur bei genauer Betrachtung der Ausschläge erkennbar war (siehe Abb. ). Außerdem standen die „Peaks“ unter dem Einfluß von der Art des vorausgehenden „Peaks“, besonders die „Peaks“ der Nukleotide G und A können unter Umständen zu einer Dämpfung bis sogar einem Wegfall des darauffolgenden „Nukleotidpeaks“ führen, was aber nicht mit einer Deletion zu verwechseln ist. Daher stellte es eine Erleichterung für die Auswertung dar, wenn die Sequenz mit der des komplementären Stranges verglichen werden konnte. Zudem erbrachte eine Übereinstimmung der gefundenen Sequenzabänderungen auch eine größere Sicherheit in der Bestimmung einer Mutation. In allen Fällen waren die Mutationen, die eindeutig durch die SSCP-Analyse auffielen, nachweisbar, und fehlten in den mituntersuchten Wildtyp-Kontrollen. 79 5.6. Mutationsscreening mit der SSCP-Technik Nach Abschluss der Untersuchungen zur grundlegenden Durchführung der hier angewendeten SSCP-Analyse und den dabei gesammelten Erfahrungen analysierten wir drei verschiedene Kollektive, welche von dem Institut für Klinische Chemie des Klinikums der Universität zu Köln, der Medizinischen Klinik und Poliklinik IV des Universitätsklinikums Leipzig und dem Klinisch-Chemischen Zentrallabor der Universitätskliniken des Saarlandes bereitgestellt wurden. Bei ihnen war das Vorliegen einer Mutation noch unbekannt. Sie rekrutierten sich aus Patienten, die sich einer Apherese-Therapie (Kollektive aus Leipzig und Köln) unterzogen, bzw. deren gemittelter Cholesterinwert um 294 mg/dl lag (Kollektiv aus Homburg). Bei allen wurde unter zunehmender Einbeziehung des Multiplex-Verfahrens das komplette LDL-Rezeptorgen analysiert. Proben, die eine Auffälligkeit zeigten, wurden anschließend zur Verifizierung sequenziert. Von insgesamt 47 Patienten konnten wir 25 als Mutationsträger identifizieren. Unter den Mutationen waren sechs dabei, die wir aus unseren Untersuchungen kannten und schon vor der Sequenzierung durch unsere Datenarchivierung determinieren konnten. Des weiteren fanden wir auch elf zu dieser Zeit noch nicht publizierte Mutationen (Aktuell sind nur noch sieben neu zu publizieren). Alle Mutationen lagen heterozygot vor, neun Mutationen waren Compound Mutationen, sechs Patientenpaare waren miteinander verwandt. Ein etwas seltenerer Polymorphismus im Intron 6 (+36 G-A) wurde auch nachgewiesen, einmal im homo- und sechs Mal im heterozygoten Genstatus. Ein häufiger vorkommender Polymorphismus im Intron 7 (nt 1060+10 C-G) wurde von uns erst durch den zunehmenden Erfahrungsgewinn nachträglich erkannt, da er sich im Kurvenverlauf etwas diskreter zeigte und anfänglich nicht alle Genotypen in unserem Kollektiv vertreten waren (Siehe Abb. ...). Die Proben wurden auch alle auf das familiär defekte Apolipoprotein B-100 (FDB) untersucht, denn bestimmte Mutationen des Apolipoprotein B-100 (Apo B-100) können ebenfalls den Phänotyp der FH auslösen. Ein positiver Fall konnte bestätigt werden, dieser wies jedoch auch keine zusätzliche Mutation im LDL-Rezeptorgen auf. In den Tabellen ... sind die detektierten Mutationen der jeweiligen Kollektive aufgeführt. Die in den Exonen 2, 8, 10, 12, 13, 15 und 18 untersuchten Polymorphismen (siehe Tabelle ...) ergaben im Sinne einer RFLP-Analyse in diesem hierfür auch zu kleinen Probenumfang keine 80 Hinweise auf eine Zuordnungsmöglichkeit zu den Mutationsträgern (Siehe Tabelle ...). Abbildung: Neu erfasste Polymorphismen im Intron 6 und Exon 7 des LDLRezeptorgens Tabelle: Detektion von vorher nicht bekannten Mutationen in verschiedenen Patientengruppen Gruppe Leipzig Köln Homburg Gesamt Patienten (n) 14 14 19 47 Mutationsträger (n) 11 5 9 25 Mutationsträger (%) 78,57 35,71 47,37 53,19 Verschiedene Mutationen (n) 13 9 8 29 Mutationen insgesamt (n) 18 12 11 33 Nicht pathogene Mutationen (n) 3 1 1 2 Uns bekannte Mutationen (n) 4 0 2 6 Nicht publizierte Mutationen zu dieser Zeit (n) 4 3 4 11 Homozygote Mutationen (n) 0 0 1 1 Compound Mutationen (n) 4 3 1 9 2x2 0 3x2 6x2 1 0 0 1 Verwandte Patienten (n) FDB (n) Tabelle: Detektierte Mutationen des LDL-Rezeptorgens im Leipzig-Kollektiv (Literaturspalte muß noch aktualisiert werden) Patient J.B.A P.W. K.E. Ort Exon 3, nt 259 Exon 3, nt 259 Intron 6, nt 940+36 Exon 3, nt 283 Literatur Nukleotidaustausch Cholesterin [md/dl] French-Canadian 2 TGGGGG French-Canadian 2 TGGGGG unbeschrieben GA 459 339 TGCAGC 498 81 S.S. P.H. D.T. S.R. R.S.B L.L. S.R. P.B. Exon 4a, nt 323 Intron 6, nt 940+36 Exon 4a, nt 324 Exon 4a, nt 325 Exon 4a, nt 337 Exon 4b, 676 Exon 4b, nt 681 Exon 9, nt 1239 Exon 4b, nt 681 Exon 9, nt 1239 Exon 5, nt 798 Exon 10, nt 1444 Intron 6, nt 940+36 W.H. R.H. FDB positiv ? Bverwandt Münster 1 Paris 5 Miami 1 Cincinatti 1 Exon 13, nt 1920 R.S. Averwandt Rare variant unbeschrieben unbeschrieben ACGATG GA 498 ACGACT TGCCGC GAGTAG TCTCCT 12 bp ins in frame ACGACA 12 bp ins in frame ACGACA 351 GATGAA 579 GACAAC AACAAT 366 GA 378 467 382 494 424 270 463 mit P.W. mit L.L. Tabelle: Detektierte Mutationen des LDL-Rezeptorgens im Köln-Kollektiv Patient Ort R.A. S.B. A.S. B.F. A.H. D.P. Exon 3, nt 196 Intron 14, nt 2140+5 Exon 4, nt 652 Exon 5, nt 798 Exon 12, nt 1729 Exon 13, nt 1916 Exon 14, nt 2039 Intron 14, nt 2140+5 Intron 6, nt 940+36 Literatur FH-Lithuania FH-Cincinatti 1 Nukleotidaustausch Cholesterin [md/dl] 2 bp ins AT GA 440 3 bp del GATGAA TGGCGG GTCGAC CTGCCG G-A 440? GA O.R. Intron 6, nt 940+36 GA 353 R.C. Intron 6, nt 940+36 GA 417 T.B. Intron 6, nt 940+36 GA 255 82 B.W. H.H. S. M.H. Z.I. ? ? ? ? ? Tabelle: Detektierte Mutationen des LDL-Rezeptorgens im Homburg-Kollektiv Patient Ort S.D. A S.-S.P. N.E. Exon 3, nt 196 Exon 3, nt 196 Exon 3, nt 259 Intron 6, nt 940+36 Exon 9, nt 1285 Exon 9, nt 1329 S.L. G.W.B W.H. R.W. C.E. M.R. B. B.M. G.J. H.A. H.E. M.H. P.J. T.A.C T.N. V.P. Exon 9, nt 1329 Exon 10, nt 1456 Exon 15, nt 2177 Exon 17, nt 2479 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? Literatur Nukleotidaustausch Cholesterin [md/dl] French Canadian4 2 bp ins AT 2 bp ins AT TGGGGG GA 244 392 494 GTGATG TGGTGA TGGTGA 1 bp del AACATC GTCATC 290 Afrikaner 2 Paris 9 New York 5 480 270 356 353 295 350 303 170 Averwandt mit S.-S.P. mit W.H. Cverwandt mit T.N. Bverwandt Tabelle: Analyse der Polymorphismen im Leipzig-Kollektiv Exon 2 8 Sfa NI Stu I J.B. ++ ++ GA ++ P.W. ++ ++ GA K.E. ++ ++ S.S. ++ ++ Enzym 10 12 13 15 18 Ava II Msp I MspI CC -- +- ++ ++ CC -- +- ++ AA ++ CC -- -- ++ GA ++ CT -- +- ++ Hinc II 83 P.H. +- ++ GA ++ CT -- +- +- D.T. ++ ++ GA +- CC +- ++ +- S.R. +- ++ GG -- CC ++ ++ ++ R.S. ++ ++ GA +- CT +- +- ++ L.L. ++ ++ GA +- CT +- +- ++ S.R. +- ++ GA +- CC +- ++ +- P.B. ++ ++ GA +- CC +- +- ++ R.S. ++ ++ GG +- CC +- ++ ++ W.H. +- ++ GA +- CT +- +- ++ R.H. ++ ++ GA +- CC +- ++ +- 13 15 18 Ava II Msp I MspI Dunkel unterlegte Felder kennzeichnen detektierte Mutationsträger + Schnitt, -kein Schnitt Tabelle: Analyse der Polymorphismen im Köln-Kollektiv Exon 2 8 Enzym Sfa NI Stu I A.Rosen +- ++ AA ++ CT -- +- +- S.B. +- ++ GG -- CC ++ ++ ++ A.S. ++ ++ AA ++ CC -- ++ -- B.F. ++ ++ GA +- CC +- ++ +- A.H. ++ ++ GA +- CT +- +- ++ D.P. ++ ++ GG +- CC +- ++ -- O.R. ++ ++ GG +- CC +- ++ ++ ++ AA +- CC +- R.C. 10 12 Hinc II ++ T.B. +- ++ GG +- CC +- ++ ++ B.W. +- ++ GA +- CC +- ++ +- H.H. ++ ++ AA ++ CC -- ++ -- S. ++ ++ GA +- CT +- +- ++ M.H. +- ++ GG +- CC +- ++ +- Z.I. ++ ++ GG -- CC ++ ++ ++ 13 15 18 Ava II Msp I MspI Dunkel unterlegte Felder kennzeichnen detektierte Mutationsträger + Schnitt, -kein Schnitt Tabelle: Analyse der Polymorphismen im Homburg-Kollektiv Exon Enzym 2 8 Sfa NI Stu I 10 12 Hinc II 84 S.D. +- ++ GA ++ CC -- ++ -- S.-S.P. +- ++ GA +- CC +- ++ +- N.E. ++ ++ GG +- CC -- ++ ++ ++ GG +- CC +- ++ ++ S.L. G.W. +- ++ GG -- CC ++ ++ ++ W.H. ++ ++ GG -- CC ++ ++ ++ R.W. +- ++ GG +- CC +- ++ +- C.E. ++ GG +- CC +- ++ ++ M.R. ++ AA ++ CC -- ++ -- ++ AA ++ CT -- -- +- B.M. ++ GA +- CC +- ++ +- G.J. ++ GG +- CC +- +- +- B. ++ H.A. +- ++ GA +- CC +- ++ +- H.E. ++ ++ GG -- CC ++ ++ +- M.H. ++ GA +- CT +- +- +- P.J. ++ GA +- CC +- +- +- T.A. ++ ++ GA +- CC +- ++ +- T.N. ++ ++ GA +- CC +- ++ +- V.P. ++ ++ GA +- CC +- ++ +- Dunkel unterlegte Felder kennzeichnen detektierte Mutationsträger + Schnitt, -kein Schnitt 85
