GC gaschromatographie zusammenfassung

Protokoll: GC
Trennungsoptimizierung Mithilfe des Chromatogram Modeler
Sinn und Zweck des Versuchs:
es soll die Trennung der Substanzen mittels Gaschromatographie mithilfe der Pro EZGC
Chromatogramm-Modeler (online-Tool) optimiert werden.
Theorie:
Skizze eines Gaschromatographen1:
Trennprinzip in der Gaschromatographie:
Gaschromatographie ist nur für gasförmige Substanzen, oder Substanzen, die sich unzersetzt
verdampfen lassen, geeignet. Als mobile Phase könnte z.B. Helium verwendet werden, die
Kapillarsäule ist bei der stationären Phase ein Flüssigkeitsfilm. Bei der GC sind sowohl Adsorptionsals auch Verteilungschromatographie (Verteilung der Probe zwischen der mobilen und stationären
Phase) zu beobachten. Die Verteilungschromatographie ist bei den Kapillarsäulen vorhanden. Nach
der Injektion der Probe in den Einspritzblock wird sie im gasförmigen Zustand mit der mobilen Phase
in die Trennsäule transportiert. Die Substanzen weisen verschiedene Siedepunkte und haben
unterschiedliche Wechselwirkungen mit der stationären Phase. Daher beruht die GC auf die
verschiedenen Verweilzeiten der Substanzen in der stationären Phase. Man erhält ein
Chromatogramm mit getrennten Peaks, welche die einzelnen Substanzen darstellen. Mittels eines
Temperaturprogramms wird einen Temperaturgradienten für eine effizientere Trennung aufgebaut.
Flammenionisationsdetektor: (Skizze und kurze Erklärung, Wie funktioniert der
Flammenionisationsdetektor?)2
1
2
(HU-Berlin, o. J.)
(Springer Link, o. J.)
Die Analyten (v.a. Verbindungen mit oxidierbarem Kohlenstoff) werden mit einem Trägerstrom in die
Flamme transportiert, wo sie mit synthetischem Sauerstoff thermisch ionisiert werden. Die
freiwerdenden Elektronen bei der Ionisierung (→ messbare Strom am Ende der Säule) werden
aufgefangen und vom Datensystem als Peak angegeben. Der Detektorsignal ist linear proportional
zur Menge des Analyten.
Was versteht man unter Split-Injection?
Ein bestimmtes Volumen der injizierten Probemenge kann mittels des Split-Injektors abgetrennt
werden. Dieses abgetrennte Volumen wird nicht zur Säule geleitet, und somit wird die Menge an
Analytmolekülen in der Säule auf ein bestimmtes Maß reduziert, um Überladungseffekte zu
vermeiden3
Was versteht man unter On Column Injection?
Gaschromatographische Injektionstechnik, die dazu dient, eine Probe in ein chromatographisches
System einzuschleusen. Bei dieser Technik wird die flüssige Probe direkt in die Kapillarsäule
eingeführt. Der Durchmesser der Spritzenkanüle der zur Injektion verwendete Spritze muss kleiner
sein als der Durchmesser der Kapillarsäule. Die Temperatur der Säule wird bei der Probenaufgabe
niedrig gehalten, danach wird die sie erhöht (über Säulenofen oder eine zusätzliche Heizung)4.
3
4
(analytik.ethz, o. J.)
(Chemgapedia, o. J.)
Wenn die stationäre Phase eine Flüssigkeit ist handelt es sich um die Verteilungs- oder
Adsorptionschromatographie?
Bei einer flüssigen stationären Phase handelt es sich um eine Verteilungschromatographie
Diskussion:
a) Sie haben das Ziel eine ultraschnelle Methode (≤ 5min) zu entwickeln, bei der mindestens
eine Auflösung von 1,5 erreicht wird und alle Komponenten (bitte sieht die Excel-Tabelle auf
Moodle) innerhalb dieser Zeit eluieren. Geben sie dazu die Werte für alle Variablen (Säule,
Trägergas, Ofenprogramm, u.s.w.) und die bessere Auflösung an und trennen sie alle
Komponenten. Bitte hängen Sie die Chromatogramm von der Modeler mit Parametern
(Bildschirmfoto) an. Bitte erläutern Sie ihre Ergebnisse. Welche(r) Parameter(n) hat/haben
großen Einfluss auf gute Trennung/Auflösung.
für dieses Ziel werden die Maß der Säule geändert:
Die Analysenzeit beträgt dabei 4,77 min.
Das Ziel wurde erreicht, in dem die Säulenlänge, Säulendurchmesser und Dicke der Säule
kleiner geworden sind. Die Retentionszeit beschreibt die Zeit, die ein Analyt fürs Passieren
der Säule benötigt. Durch das Verkleinern der Säule wird die Zeit kürzer, die das Analyt
braucht, um die Säule zu passieren, und somit verkürzt sich die Analysenzeit.
Die Auflösung wird mit der folgenden Formel berechnet:
1
𝛼−1
𝑘
𝑅𝑠 = √𝑁 ∙ (
)∙(
)
4
𝛼
1+𝑘
1
√𝑁:
4
steht für die Effizienz
𝛼−1
):
𝛼
(
Selektivität
𝑘
(1+𝑘): Retention
Dabei hat die Selektivität den größten Einfluss auf die Auflösung. Sie hängt von den AnalytEigenschaften ab. Diese Eigenschaften könnten z.B. durch Änderung der Temperatur
verändert werden (T hat den größten Einfluss), oder durch Veränderung der Polarität der
stationären Phase oder Änderung der mobilen Phase (z.B. Carriergas). In unserem Fall hat
also die Temperatur und das Carriergas den größten Einfluss auf die Auflösung.
b) Geben Sie eine geeignete Formel zur Berechnung der Trennstufenzahl N an, mit der Sie
anhand der Daten aus dem EZGC Modeler rechnen können.
𝑁 = 16 ∙ (
𝑡𝑅 2
)
𝑊𝑏
c) Berechnen Sie N für folgende Flussrate (0,1; 0,5; 1; 2; 3; 5; 7; 10; 15; 20; 25 mL/min) für jeden
Analyten (welche ihr eluieren sollt) und stellen Sie in einem Diagramm N vs. Flussrate dar (für
jede). Bei welcher Flussrate hat N sein Maximum? Was wäre die optimale Flussrate für alle
Analyte, damit ihr eine optimale chromatographishe Methode entwickeln könnt.
Valproic acid
Flussrate
[ml/min]
0,1
tR
wb
N
9,07
0,335
11728,5667
= 11729
0,5
2,73
0,044
61594,2149
= 61595
1
1,72
0,02
118336
2
1,12
0,01
200704
3
0,88
0,007
252865,306
= 252866
5
0,66
0,005
278784
7
0,55
0,004
302500
10
0,46
0,004
211600
15
0,37
0,003
243377,778
= 243378
20
0,32
0,003
182044,444
= 182045
25
0,28
0,003
139377,778
= 139378
Auftragung N vs. Flussrate für valproic acid
350000
300000
250000
N
200000
150000
100000
50000
0
0
5
10
15
20
25
30
Flussrate in ml/min
Das Maximum der Trennstufenzahl ist bei der Flussrate 7 ml/min.
Ethosuximide:
Flussrate
[ml/min]
0,1
tR
wb
N
9,24
0,33
12544
0,5
2,87
0,043
1
1,83
0,021
2
1,2
0,011
3
0,95
0,008
71276,5819
= 71277
121502,041
= 121503
190413,223
= 190414
225625
5
0,71
0,006
7
0,59
0,005
224044,444
= 224045
222784
10
0,49
0,004
240100
15
0,4
0,004
160000
20
0,34
0,004
115600
25
0,3
0,004
90000
Auftragung N vs. Flussrate für Ethosuximide
300000
250000
N
200000
150000
100000
50000
0
0
5
10
15
20
25
30
Flussrate in ml/min
Das Maximum der Trennstufenzahl ist ungefähr bei der Flussrate 10 ml/min
Benzocaine
Flussrate
[ml/min]
0,1
tR
wb
N
9,95
0,314
0,5
3,47
0,042
1
2,38
0,022
2
1,66
0,014
3
1,35
0,012
16065,9662
= 16066
109214,512
= 109215
187252,893
= 187253
224946,939
= 224947
202500
5
1,03
0,011
7
0,85
0,01
140284,298
= 140285
115600
10
0,71
0,009
99575,3086
15
0,57
0,009
20
0,49
0,009
25
0,44
0,009
= 99576
64177,7778
= 64178
47427,1605
= 47428
38241,9753
= 38242
Auftragung N vs. Flussrate für Benzocaine
250000
200000
N
150000
100000
50000
0
0
5
10
15
20
25
30
Flussrate in ml/min
Das Maximum der Trennstufenzahl liegt bei ungefähr 2 ml/min
Hydromorphone:
Flussrate
[ml/min]
0,1
tR
wb
N
15,15
0,384
0,5
6,4
0,05
24904,7852
= 24905
262144
1
5,14
0,024
2
4,36
0,018
3
3,98
0,018
5
3,57
0,021
7
3,33
0,023
10
3,09
0,027
15
2,84
0,032
20
2,67
0,037
733877,778
= 733878
938745,679
= 938746
782241,975
= 782242
462400
335392,06
= 335393
209560,494
= 209561
126025
83318,0424
= 83319
25
2,54
0,04
64516
Auftragung N vs. Flussrate für Hydromorphone
1000000
900000
800000
700000
N
600000
500000
400000
300000
200000
100000
0
0
5
10
15
20
25
30
Flussrate in ml/min
Das Maximum der Trennstufenzahl ist ungefähr bei der Flussrate 2 ml/min.
Flunitrazepam:
Flussrate
[ml/min]
0,1
tR
wb
N
16,28
0,408
0,5
6,87
0,053
1
5,51
0,026
2
4,71
0,018
3
4,34
0,018
5
3,94
0,02
25474,6636
=25475
268832,467
= 268833
718582,249
= 718583
1095511,11
= 1095512
930153,086
= 930154
620944
7
3,71
0,023
10
3,47
0,027
15
3,22
0,032
20
3,05
0,036
25
2,93
0,041
416305,482
= 416306
264272,154
=264273
162006,25
= 162007
114845,679
= 114846
81712,3141
= 81713
Auftragung N vs. Flussrate für Flunitrazepam
1200000
1000000
N
800000
600000
400000
200000
0
0
5
10
15
20
25
30
Flussrate in ml/min
Das Maximum der Trennstufenzahl ist ungefähr bei 2 ml/min
Flurazepam:
Flussrate
[ml/min]
0,1
tR
wb
N
18,33
0,459
0,5
7,58
0,06
1
6,04
0,03
2
5,14
0,018
3
4,78
0,018
5
4,38
0,02
25516,4082
= 25517
255361,778
= 255362
648561,778
= 648562
1304671,6
= 1304672
1128316,05
= 1128317
767376
7
4,14
0,023
518400
10
3,91
0,027
15
3,66
0,032
20
3,5
0,037
25
3,37
0,04
335541,289
= 335542
209306,25
= 209307
143170,197
= 143171
113569
Auftragung N vs. Flussrate für Flurazepam
1400000
1200000
1000000
N
800000
600000
400000
200000
0
0
5
10
15
20
25
30
Flussrate in ml/min
Das Maximum der Trennstufenzahl ist bei 2 ml/min
Im Folgenden sind alle Kurven für alle Diagramme in einem Diagramm aufgetragen:
Auftragung N vs. Flussrate
1400000
1200000
1000000
N
800000
600000
400000
200000
0
0
5
10
15
20
25
30
Flussrate
Valproic acid
Ethosuximid
Benzocaine
Hydromorphone
Flunitrazepam
Flurazepam
Aus dem Diagramm resultiert, dass 4 Substanzen ihr Maximum bei der Flussrate 2 ml/min. haben,
daher resultiert, dass die optimale Flussrate ungefähr 2 ml/min. für alle Analyten beträgt!
d) Berechnen Sie die erforderliche Trennstufenzahl N, die Sie mindestens benötigen, um eine
Auflösung R von 1.5 zu erhalten (k = 3, α = 1.1). Wie lang muss die Säule bei einer gegebenen
Trennstufenhöhe H von 10,0 µm sein?
1
𝛼−1
𝑘
𝑅𝑠 = √𝑁 ∙ (
)∙(
)
4
𝛼
1+𝑘
1
1,1 − 1
3
1,5 = √𝑁 ∙ (
)∙(
)
4
1,1
1+3
𝑁 = 7744
Die erforderliche Trennstufenzahl beträgt 7744!
𝑁=
𝐿
𝐻
𝐿 = 𝑁 ∙ 𝐻 = 7744 ∙ 10,0 𝜇𝑚 = 77440 𝜇𝑚
Die Säule muss 77440 𝜇𝑚 lang sein.
e) Sie wollen die Konzentration eines unbekanntes Stoffes mittels Standardadditionsverfahren
herausfinden (sieht bitte die Excel-Datei auf Moodle um eure Substanz zu finden). Dazu
geben Sie einen bekannten Stoff zu ihrer Probe und erstellen ein Diagramm (z.B. mit Excel)
mithilfe dessen eine Regressionsgerade bezüglich Peakfläche und Konzentration für den
linearen Bereich ein. Geben Sie dabei das Bestimmtheitsmaß (R²) und die Geradengleichung
an. (Die in Excel erstellte Kalibriergerade (Konzentration (x) vs Peakfläche (y)) wird an das
Protokoll angehängt. R2 und die Geradengleichung angeben.)
Die Gerade ist für die Substanz B erstellt!
Spiked conentration
[𝜇𝑔/𝑚𝑙]
0
Area
434491,68
0,14375
17129285,92
0,2875
31773618,63
0,43125
44949979,87
1,00625
82819597,42
Area
Konzentration vs. Peakfläche
100000000
90000000
80000000
70000000
60000000
50000000
40000000
30000000
20000000
10000000
0
y = 7,976E+07x + 5,612E+06
R² = 9,818E-01
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Konzentration in 𝜇g/ml
Bestimmung der Konzentration:
−𝑎
|
𝑏
Wobei a ist der y-Achsenabschnitt und b ist die Steigung der Regressionsgerade:
𝑥=|
−5,612 ∙ 106
𝑥=|
| = 7,036 ∙ 10−2 𝜇𝑔/𝑚𝑙
7,976 ∙ 107
f)
Die Bewertung der Robustheit sollte während der Entwicklungsphase berücksichtigt werden
und hängt von der Art des untersuchten Verfahrens ab. Es sollte die Zuverlässigkeit einer
Analyse in Bezug auf absichtliche Variationen der Methodenparameter zeigen. Wenn
Messungen anfällig für Änderungen der Analysebedingungen sind, sollten die
Analysebedingungen angemessen kontrolliert oder eine Vorsichtsmaßnahme in das
Verfahren aufgenommen werden. Eine Konsequenz der Bewertung der Robustheit sollte
sein, dass eine Reihe von Systemeignungsparametern (z. B. Auflösungstest) festgelegt wird,
um sicherzustellen, dass die Gültigkeit des Analyseverfahrens bei jeder Verwendung erhalten
bleibt.
Laut der ICH Richtlinie (es wird auf Moodle zur Verfügung gestellt) (International Council for
Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use), was sind die
Beispiele für typische Variationen in der Gaschromatographie?
-
Unterschiedliche Säulen (z.B. auch von unterschiedlichen Packungen und Herstellern)
Temperatur
Flussrate