Versuch 1: Aktivität und Kinetik von Methan

Annick Frising, Shilpi Singh, Meret Aeppli
Praktikum Biogeochemie: Bericht zum Teil Umweltmikrobiologie
Versuch 1: Aktivität und Kinetik von Methan-Oxidierenden Bakterien in einem DeponieAbdeckboden
Zielsetzung
Deponien beeinträchtigen die Umwelt unter anderem durch die Produktion von Methan in den
anaeroben Zonen. Um das Entweichen des Gases in die Atmosphäre zu verhindern, werden
stillgelegte Deponien mit einem Abdeckboden überdeckt, in welchem in tieferen Schichten
produziertes Methan oxidiert und damit abgebaut wird.
In diesem Versuch soll die Aktivität und Kinetik des Enzyms MMO in Abhängigkeit des Bodens und
der verfügbaren Methankonzentration untersucht werden. Das Enzym MMO ist deshalb von
Bedeutung, weil es den ersten Schritt der Methanoxidation (Umwandlung von Methan zu Methanol)
katalysiert und folglich essentiell ist für den Abbau von Methan. Um die Kinetik des Enzyms adäquat
beschreiben zu können, sollen die Parameter vmax und Km aus der Michaelis-Menten-Theorie,
welche die Kinetik enzymkatalysierter Reaktionen behandelt, mit Hilfe der experimentell bestimmten
Reaktionsgeschwindigkeit berechnet werden.
Methoden
Die Aktivität der methanoxidierenden Organismen in high activity (HA) Bodenproben, in welchen die
Methankonzentration zwischen 500-600ppm liegt, und low activity Bodenproben (LA), in welchen
die Methankonzentration zwischen 2-20ppm liegt, wurden im Labor untersucht.
Methan-Gasstandards
Eine Standard-Reihe von insgesamt 8 Standards von 1-18'000 ppmv wurde angefertigt. Damit wurde
sichergestellt, dass ein grosszügiger Konzentrationsbereich der erwarteten Resultate abgedeckt ist.
Zunächst wurden die Glasfläschchen mit N2 gespült um allfällig vorhandenes Methan zu entfernen.
Danach wurde das zu injizierende Volumen des Standardgases (Methan) berechnet und in die
Glasfläschchen gespritzt. Anschliessend wurde mittels der Druckdifferenz die effektive
Endkonzentration des Methans mit der Formel im Skript berechnet.
Inkubation
In insgesamt 48 Glasfläschchen wurden in die eine Hälfte der Fläschchen je 3g HA Boden und die
andere Hälfte je 3g LA Boden gegeben. Danach wurden die zuvor berechneten
Methankonzentrationen in die mit Boden gefüllten Fläschchen gegeben. Pro Methankonzentration
gab es 3 Repetitionen, d.h. bei 8 verschiedenen Methankonzentrationen etgibt dies insgesamt 24
Fläschchen pro Boden. Anschliessend wurde der Druck in den Fläschchen gemessen und entweder
Luft über ein Ventil abgelassen oder Luft mit einer Spritze hinzugefügt um jeweils einen Druck von
ungefähr 1300 mbar zu erreichen.
Gravimetrischer Wassergehalt und Trockengewicht
Zur Bestimmung des Trockengewichtes sowie des gravimetrischen Wassergehaltes wurden jeweils 10
g des HA und des LA Bodens in einer Schale abgewogen und eine Woche lang bei 60 °C im Ofen
trocknen gelassen. Nach einer Woche wurden die beiden Bodenproben erneut gewogen.
Anschliessend wurde, mittels der Formel im Skript, der gravimetrische Wassergehalt bestimmt.
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Gaschromatographie
Im Gaschromatographen wurden die Änderungen der Methankonzentration über die Zeit gemessen
und aufgezeichnet. Anschliessend wurden die aufgezeichneten Daten in Excel kopiert und die
Abnahme der Methankonzentration in einem Graphen dargestellt.
Resultate
Gravimetrischer Bodenwassergehalt im HA MOB Boden:
Mfeucht = 10.02g, MMatrix = 8.25g
𝜃𝑤𝑚 =
𝑀𝑓𝑒𝑢𝑐ℎ𝑡 −𝑀𝑀𝑎𝑡𝑟𝑖𝑥
𝑀𝑀𝑎𝑡𝑟𝑖𝑥
= 0.21
Errechnete maximale Umsatzgeschwindigkeit vmax und Km aus den gaschromatische Messungen:
High Activity MOB: vmax = 7331.72nmol/h*g und Km = 860.55nmol = 0.86 mol
Low Activity MOB: vmax = 26.62nmol/h*g und Km = 601.17nmol = 0.60mol
Diskussion
Je nach zugefügter Methankonzentration verläuft die Oxidation anhand einer Kinetik nullter oder
erster Ordnung. Für Methankonzentrationen unter 22000 ppm kann die Reaktion durch eine Kinetik
erster Ordung beschrieben werden das Enzym, welches die Oxidation katalysiert, ist im Überschuss
vorhanden, wohingegen das Substrat (also Methan) limitierend ist. Für Methankonzentrationen über
22000 ppm ist dies nicht mehr der Fall - hier ist das Substrat im Überschuss vorhanden und das
Enzym ist limitierend. Die Reaktion gehorcht einer Kinetik nullter Ordnung.
In den Proben mit den drei niedrigsten Konzentationen konnte die Reaktion weder mit einer Kinetik
nullter noch mit einer Kinetik erster Ordnung adäquat beschrieben werden, da die Konzentation des
Methans über die Zeit nicht kontinuerlich abnahm, sondern zwischendurch wieder stieg. Dies liegt
vermutlich daran, dass wegen der tiefen Methankonzentration nur wenig Oxidation stattfinden kann
und deshalb die Methanproduktion in den vorhandenen anaeroben Gebieten, obwohl sie selbst auch
nur sehr gering ist, einen überproportional grossen Einfluss hat.
Die Umsatzrate in High Activity Böden und Low Activity Böden unterscheidet sich um einen Faktor
275. Die HA Böden haben wie erwartet eine viel höhere Umsatzrate als die LA Böden.
In beide Böden (Low Activity und High Activity) findet Low Affinity Methanoxidation (Km 0.2-10 mol)
statt, was aus den errechneten Km zu schliessen ist. Low Affinity Methanoxidation findet im
Allgemeinen da statt, wo hohe Methankonzentrationen auftreten- zum Beispiel auf Deponien.
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Die spezifische Umsatzraten pro Zelle für die HA und LA Böden lassen sich aus den Umsatzraten und
der Anzahl Zellen pro Gramm Boden (siehe PCR-Versuch) berechenen: Beim High Activity Boden
beträgt die spezifische Umsatzrate pro Zelle 0.014 nmol/h, beim Low Activity Boden 0.0004 nmol/h.
Die Raten sind im High Activity Boden also etwa 35 mal höher wie im Low Affinity Boden.
Versuch 2: Feld-Block
Zielsetzung
Ziel des Feld-Blockes sind quantitative Aussagen zu Massenflüssen von Methan und zur
Methanoxidation in Böden. Um solche Aussagen zu ermöglichen, werden Methanprofile in Böden
gemessen. Aus den gewonnenen Daten und mit Hilfe des 1. und 2. Fickschen Gesetzes lässt sich der
Methan-Einheitsflux über das ganze Profil berechnen, wobei von einem eindimensionalen, diffusen
Stofftransport mit örtlich konstanten Diffusionskoeffizienten sowie einer Steady-State-Situation
ausgegangen wird.
Methoden
Im Vorfeld wurde von Philipp Nauer eine Standard-Reihe für den Gaschromatographen hergestellt,
um den erwarteten Konzentrationsbereich des Methans im Boden abzudecken.
Mit einem dünnen Metallstab, welcher am unteren Teil, der in den Boden eingeführt wird, spitz und
mit sehr feinen Löchern versehrt ist und am oberen Teil Ventile und einer Spritze befestigt hat,
wurden zunächst an der Bodenoberfläche und anschliessend in 10 cm Schritten bis auf 70 cm Tiefe
die jeweiligen Methanproben entnommen. Diese wurde dann in den Gaschromatographen
eingespritzt um die Methankonzentrationen in den verschiedenen Tiefen zu ermitteln. Mit der
Konzentrationsreihe konnte man anschliessend feststellen ob die Methankonzentration im Boden
abnimmt oder etwa fluktuiert oder sogar zunimmt.
Des Weiteren wurden auch der Wassergehalt sowie die Bodentemperatur mit speziellen Geräten
gemessen. Die Porosität des Bodens haben wir aus einer Studie von Philipp Nauer übernommen.
Resultate
Gemessene Temperatur im Boden:
Tiefe [cm] 0
2.5
5
°C
12.9
12.6
11.15
10
10.45
15
10.25
20
10.20
25
10.15
Gemessener Wassergehalt im Boden:
Standort 1
Standort 2
Standort 3
0.138
0.141
0.129
0.14
0.14
0.13
30
10.05
40
9.8
50
9.4
60
9.05
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Methanfluss im Bodenprofil:
Fluxberechnung:
f (0cm)
= 0.106 g m-2 yr-1
f (0-10cm) = 0.194 g m-2 yr-1
T1/2
k1
Deff
= 12.341 h
= 0.056 h-1
= 3.56 cm2/min
Diskussion
Die Methanabnahme im Boden ist nicht wie erwartet exponentiell, was vermutlich an der
Inhomogenität des Bodens liegt. Es ist zu sehen, dass die Methankonzentration in der Tiefe wieder
zunimmt. Dies kann durch Methanproduktion in den tieferen, anaeroben Bodenschichten begründet
werden. Auch der eher plötzliche Wetterumschlag kann zu dieser ungleichen Methankonzentration
führen, da die MOB bei schlechtem Wetter weniger aktiv sind.
Versuch 3: Bestimmung der Menge methanoxidierender Bakterien im Bodenmaterial einer
Deponieabdeckung
Zielsetzung
In diesem Versuch soll die Menge an Methan-oxidierenden Bakterien, welche im Bodenmaterial von
Deponieabdeckungen vorkommen, quantifiziert werden. Verwendet wird die Methode der
qualitativen PCR, welche durch Amplifizierung der für methanotrophe Bakterien charakteristischen
Gene pmoA Rückschlüsse auf die Anzahl im Boden vorhandener Bakterien erlaubt.
Zusätzlich zur PCR soll die aus Bodenproben extrahierte DNA einerseits mit einem Spektophotometer
quantifiziert und andererseits mittels Gel-Elektrophorese visualisiert werden.
Methoden
Quantitative PCR
Die quantitative PCR-Methode wurde angewendet um die Menge an pmoA Genen in der DNA von
zwei verschiedenen Bodenproben aus der Lindenstock Deponie zu quantifizieren. Für die
Bestimmung einer Standardkurve wurde zunächst eine Verdünnungsreihe der Standard-DNA
angesetzt. Die Standardkurve wurde erstellt indem man die Anzahl an Amplifikationszyklen (Ct)
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gegen die festgelegte DNA-Konzentration aufgetragen hat. Für jede Konzentration hat die Anzahl
ändert die Anzahl an Amplifikationszyklen wobei höhere Konzentrationen weniger Zyklen benötigen.
Da die DNA der Bodenproben möglicherweise PCR Inhibitoren enthalten könnte, wurden die
Bodenproben mit Wasser 2-fach verdünnt und erst anschliessend als Template/Vorlage für die qPCR
benutzt. Die Standard- sowie die verdünnten Bodenproben und die beiden aus Wasser bestehenden
negativ Kontrollen wurden zu dem qPCR Mastermix, welcher 2 verschiedene Primer, den
fluoreszierenden Farbstoff, das DNA Template und Wasser enthält, gegeben. Die Platte mit den
Proben wurde mit Parafilm zugeklebt und geschüttelt (nicht von Hand!).
Danach wurde die Platte im Thermocycler erhitzt so dass, die DNA bei ungefähr 95°C zuerst
denaturiert, sich anschliessend zwischen 45 und 60°C die Primer an die DNA binden, dann bei 72°C
die Amplifikation durch die TAC einsetzt und schliesslich bei 85 °C die Detektion der pmoA Gene
einsetzt.
DNA Extraktion
Für die Extraktion einer genügend grossen Menge an reiner qualitativ hochwertiger DNA aus der
Bodenprobe wurde ein Extraktionskit verwendet, welches Glasperlen und SDS-Detergens enthält,
wodurch die intakten Zellen mechanisch zerstört werden und die DNA freigesetzt wird.
Anschliessend werden die in der Bodenprobe vorhandenen Bestandteile wie Bodenpartikel und
Zellreste zuerst durch Zentrifugation und nachher durch Ausfällung der Proteine gefolgt von
Zentrifugation entfernt. Die extrahierte DNA wird gereinigt und mittels Binden an eine
Silicamembran sowie mehrfaches Waschen mit Puffern konzentriert.
Ueberprüfung der DNA Extraktion und der qPCR mittels Gel-Elektrophorese
Für die Gel-Elektrophorese wurde ein Agarosegel hergestellt. Während dieses Gel aushärtete wurden
das PCR Produkt, die extrahierte DNA und die negative PCR Kontrolle jeweils mit einem blauen
Farbstoff vermischt. Anschliessend wurden diese Mischungen sowie zwei Standard-DNA Proben in
die Taschen des Gels pipettiert und die Gelelektrophoreseapparatur unter Strom gesetzt. Das Gel
wurde ungefähr eine halbe Stunde laufen gelassen. Danach wurde das Gel unter UV-Licht betrachtet
um die Reinheit der extrahierten DNA zu untersuchen. Die extrahierte DNA war nicht sehr rein!
Wie schon im ersten Anschnitt erwähnt wurde die Anzahl an pmoA Genen in den Bodenproben
mittels der aus unseren Daten erstellten Standardkurve berechnet.
Annick Frising, Shilpi Singh, Meret Aeppli
Resultate
Standardkurve
Anzahl Kopien der pmoA-Gene
Samples
HA 1:100
LA 1:100
CT
26.8
30.1
N0 undiluted
128300
17700
# per l
6415
884
# per g
523673
66792
Effizienz
E=0.83
Diskussion
Die erstellten LA-Proben konnten durch die PCR nicht quantifiziert werden, da die Konzentration der
Gene vermutlich zu tief war. Diese Tatsache wird dadurch unterstützt, dass auch bei der
Elektrophorese die pmoA-Gene nicht detektiert werden konnten. Für die Berechnung der Anzahl
Kopien im Low Affinity Boden wurden die CT der zweiten Praktikumsgruppe verwendet.
Wie zu erwarten ist die Anzahl pmoA-Gene im High Affinity Boden mit 523658 Kopien pro Gramm
Boden höher als im Low Affinity Boden mit 66753 Kopien pro Gramm Boden (Faktor 7.8).
Die Effizienz der PCR liegt bei 0.83. Ein Faktor 2 würde bedeuten, dass die Anzah Genkopien sich bei
jedem Durchlauf verdoppelt. Dieser Wert ist in der Praxis nicht erreichbar. In unserem Fall wurden
bei jedem Durchlauf ca. 40% der Gene verdoppelt.
Synthese
Aus dem Laborteil wurde ersichtlich, dass sich die Oxidationsraten von Methan in den beiden Böden,
also High und Low Activity, unterscheiden. Die Experimente fanden unter kontrollierten Bedinungen
statt und die Resultate sind gemäss den Erwartungen ausgefallen.
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Beim Feldversuch war dies nicht der Fall. Die vermutete Abnahme der Methankonzentration mit der
Tiefe konnte nicht bestätigt werden, da im Messungen im Feld von einer Vielzahl von Faktoren
(Temperatur, Wetter, Bodenbeschaffenheit etc.) abhängen. Es ist deshalb schwierig, von den
Laborexperimenten auf die Vorgänge im Feld zu schliessen- so lassen sich die Ergebnisse aus den
Messungen der Oxidationsrate und aus dem qPCR keine Rückschlüsse auf die Vorgänge im Feld zu.
Um im Feld repräsentativere Messungen zu erhalten, müsten mehr Orte über eine gewisse Zeit
beprobt werden müssen.
Die Ergebnisse der qPCR-Analyse lassen sich gut mit den Ergebnissen der Oxidationsraten aus dem
ersten Laborversuch in Verbindung bringen- wie erwartet sind im High Activity Boden mehr
Organismen vorhanden als im Low Activity Boden und auch die Umsatzrate pro Zelle unterscheidet
sich.