Kryokonservierung
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Auftrag an die AG Transgene Technologie (TT) am ZEMM, Zinklesweg 10, 97078 Würzburg Kontakt: 0931/201-44078; E-Mail: [email protected] Klicken Sie hier, um ein Datum einzugeben. Art des Auftrags: ☐ Kryokonservierung von Embryonen (1) ☐ Kryokonservierung von Spermien (2) Hinweis: - Es gilt die Gebührenordnung des ZEMM (www.zemm.uni-wuerzburg.de). Die Abrechnungen erfolgen über die Verwaltungsleiterin Frau Hülya Noak. Auftraggeber (AG/Institut, Projektleiter, Adresse, Telefon, E-Mail): Klicken Sie hier, um Text einzugeben. Direkter Ansprechpartner (Name, Telefon, E-Mail): Klicken Sie hier, um Text einzugeben. Bezeichnung der Mauslinie (Offizielle Standardnomenklatur und Kurz-/Arbeits-/FBI-Bezeichnung): Klicken Sie hier, um Text einzugeben. Art der genetischen Modifikation: Klicken Sie hier, um Text einzugeben. Wählen Sie ein Element aus. Wählen Sie ein Element aus. Genetischer Hintergrund: Wählen Sie ein Element aus. Sonst.: Klicken Sie hier, um Text einzugeben. Ggf. Literaturzitat, das den Phänotyp der Linie beschreibt: Klicken Sie hier, um Text einzugeben. Kurze Begründung für die Kryokonservierung der Linie unter Berücksichtigung tierschutzrechtlicher und tierethischer Aspekte: Klicken Sie hier, um Text einzugeben. Erläuterungen und weitere Angaben: Zu (1) Kryokonservierung von Embryonen: - Die Kryokonservierung von Embryonen ist ein aufwendiges und teures Verfahren, das besonders wichtigen Linien vorbehalten werden sollte. 1 - Es werden 2-Zell, ggf. 8-Zellembryonen kryokonserviert in einem 2-Schrittverfahren mit kontrollierter Kühlungsrate nach einem modifizierten Protokoll von Renard JP und Babinet C 1984. - Ziel ist die Gewinnung von 400 (Vp -/- x wt) bis 600 (Vp +/- x wt) Embryonen, die in straws mit je 20 Embryonen geeignet für die Rederivation in eine scheinträchtige Amme in LN2 gelagert werden. Als reiner Backup bei Weiterzucht der Linie ist ein halber Ansatz mit 200 – 300 Embryonen möglich. Im Fall einer zu erwartenden häufigen externen Nachfrage der Linie wird eine Archivierung in einem Mausrepositorium empfohlen (https://www.infrafrontier.eu). - - Es werden 10 vitale, voll reproduktionsfähige Männchen im Alter von 2 bis 6 Monaten benötigt. - Falls bei der Linie die Reproduktionsrate beeinträchtigt sein sollte, wird die Kryokonservierung mit heterozygoten Männchen durchgeführt. Die Männchen werden mit superovulierten wt Weibchen verpaart, wenn möglich in dem oben genannten Hintergrundstamm, und aus diesen die Embryonen präpariert. Es werden 4 - 6 Verpaarungs- und Kryokonservierungsrunden durchgeführt mit je 10 Spenderweibchen im Abstand von einer Woche. Jedoch ist die maximale Anzahl an Spenderweibchen auf 60 begrenzt, selbst wenn die Sollgröße von 400 – 600 Embryonen nicht erreicht werden sollte. Ein straw wird einem Auftautest unterzogen (Lysisrate; Entwicklungsrate in vitro zum Blastozystenstadium, alternativ Embryotransfer mit Bestimmung der Geburtsrate). In besonders begründeten Fällen wird ein Intercross mit Spenderweibchen der transgenen Linie durchgeführt. Dies bedingt jedoch eine starke Zuchtexpansion und die regelmäßige und ausreichende Bereitstellung von Weibchen im Alter von 3 Wochen gemäß beschriebenem Verpaarungsschema durch den Auftraggeber. Unabhängig von der Ausbeute werden maximal 6 Verpaarungs- und Kryokonservierungsrunden durchgeführt. Für die Lagerung in LN2 entstehen Folgekosten. Die Lagerung erfolgt am ZEMM, auf Wunsch in eigenen oder weiteren Lagertanks des Auftraggebers. Eine zweite, unabhängige Lagerstätte zur Risikoreduktion von Schäden und Unfällen besteht nicht. Für Schäden kann keine Haftung übernommen werden. Eine erfolgreiche Rederivation der Embryonen kann nicht garantiert werden. - - - Für die Kryokonservierung verfügbare Männchen (Anzahl = 10, Geburtsdatum, Haltungsort, -raum, FBI-Nummer): Klicken Sie hier, um Text einzugeben. Der Auftraggeber überträgt die Tiere an die TT zur Durchführung der Kryokonservierung. Er bevollmächtigt die TT, für diese Linie Arbeitsaufträge an die Tierhaltung zu erteilen. Nach Abschluss der Kryokonservierung gehen die Tiere wieder an den Auftraggeber zurück oder werden getötet? Wählen Sie ein Element aus. Zu (2) Kryokonservierung von Spermien: - Als Backup zur Zucht und für weniger wichtige Linien empfiehlt sich die Kryokonservierung von Spermien. Diese ist einfacher und schneller als die Kryokonservierung von Embryonen, jedoch ist die Rederivation durch IVF aufwendiger und schwieriger. Die Durchführung erfolgt in Anlehnung an: Nakagata N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods Mol Biol;693:57-73. 2011. 2 - - Trotz Optimierungen und verbesserter Protokolle ist die Effizienz der Rederivation kryokonservierter Spermien stark abhängig vom genetischen Hintergrund der Spenderlinie. Während Hybridlinien oder der FVB/N Hintergrund sehr gut funktionieren, ist die Effizienz im häufig verwendeten C57BL/6 Hintergrund deutlich schlechter. Pro Linie werden ca. 20 straws kryokonserviert. Es wird eine Test-Rederivation durchgeführt und die Befruchtungsrate (Entwicklung zu 2-Zellembryonen) der kryokonservierten Spermien mit frisch präparierten Spermien in der IVF verglichen. Als Cut-Off wird eine Befruchtungsrate von 20% für die kryokonservierten Spermien festgelegt. Im Fall einer zu erwartenden häufigen externen Nachfrage der Linie wird eine Archivierung in einem Mausrepositorium empfohlen (https://www.infrafrontier.eu). - Es werden 3 vitale, voll reproduktionsfähige Männchen im Alter von 2 bis 6 Monaten benötigt. - Für die Lagerung in LN2 entstehen Folgekosten. Die Lagerung erfolgt am ZEMM, auf Wunsch in eigenen oder weiteren Lagertanks des Auftraggebers. Eine zweite, unabhängige Lagerstätte zur Risikoreduktion von Schäden und Unfällen besteht nicht. Für Schäden kann keine Haftung übernommen werden. Eine erfolgreiche Rederivation der Spermien kann nicht garantiert werden. Für die Kryokonservierung verfügbare Männchen (Anzahl = 3, Geburtsdatum, Haltungsort, -raum, FBINummer): Klicken Sie hier, um Text einzugeben. Der Auftraggeber überträgt die Tiere an die TT zur Durchführung der Kryokonservierung. Er bevollmächtigt die TT, für diese Linie Arbeitsaufträge an die Tierhaltung zu erteilen. 3
