In-vitro-Genexpression von GFP Produktnachweis mittels SDS-PAGE
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Experimentelle Vorgehensweise In-vitroGenexpression von GFP und Produktnachweis mittels SDSPAGE 16.05.2016 1 Ziele des Experiments 1. In einem zellfreien System von E. coli soll das Grün Fluoreszierende Protein (GFP) exprimiert werden. 2. Das Expressionsprodukt GFP soll mittels SDS-PAGE nachgewiesen und dessen molare Masse über eine Eichkurve ermittelt werden. 16.05.2016 2 Dauer des Experiments 60 Minuten: Probenvorbereitung und Ansetzen der In-vitro-Genexpression 120 Minuten: Dauer der GFP-Expression oder länger (z.B. über Nacht) 70 Minuten: Durchführung der SDS-PAGE 30 Minuten: Gelauswertung und Bestimmung der molaren Masse von GFP 16.05.2016 3 Lagerung des Kits Das Kit wird auf Trockeneis angeliefert und kann im Kühlschrank bei –20°C über Monate aufbewahrt werden. Die Chemikalien im Kit reichen für die dreimalige Durchführung des Experiments mit 8 Arbeitsgruppen 16.05.2016 4 Experimentvorbereitungen 1. Ansetzen der Stammlösungen - Die entnommenen Aliquots aus den angesetzten Stammlösungen werden bis zum Versuchsbeginn im Eis aufbewahrt. - 16.05.2016 Die restlichen Stammlösungen können bei -20°C über Monate gelagert werden. 5 Experimentvorbereitung 2. Wasserbad auf 30oC erhitzen! 30°C 16.05.2016 6 Experimentvorbereitung 3. Herstellung von RNase-/DNase-freiem H2O 400 µl steriles H2O werden in einem verschlossenen Schraubtube in der Mikrowelle 7 Minuten bei 600 Watt erhitzt. 16.05.2016 7 Experimentvorbereitung 4. Ansetzen des Elektrophorese-Puffers Der konzentrierte Tris/Glycin/SDSPuffer (TGS) wird mit H2Odest. 1 : 10 verdünnt. Pro Kammer 350 ml: 35 ml konzentrierter TGS-Puffer + 315 ml H2Odest. (2 Kammern mit je 2 Gelen werden benötigt) 16.05.2016 8 Experimentvorbereitung 5. Gruppenarbeit: Aliquotieren der 8 Stammlösungen für 8 Arbeitsgruppen 16.05.2016 9 Experimentvorbereitung Gruppe 1: Aliquotieren der E.-coli-Lysat-Lösung 1. Beschriften Sie 8 rote Tubes mit Ihrer Gruppennummer. 2. Pipettieren Sie jeweils 12 µl der Stammlösung aus dem roten Vorratsgefäß 1 (VG 1, Gesamtvolumen 120 µl) in die 8 von Ihnen zuvor beschrifteten Tubes. 3. Geben Sie jeweils ein Tube an die 8 Arbeitsgruppen. 16.05.2016 10 Experimentvorbereitung Gruppe 2: Aliquotieren der Reaction mix Lösung 1. Beschriften Sie die 8 vorbereiteten grünen Tubes mit Ihrer Gruppennummer. 2. Pipettieren Sie jeweils 12 µl der Stammlösung aus dem grünen Vorratsgefäß 2 (VG 2, Gesamtvolumen 110 µl) in die 8 von Ihnen zuvor beschrifteten Tubes. 3. Geben Sie jeweils ein Aliquot an die 8 Arbeitsgruppen. 16.05.2016 11 Experimentvorbereitung Gruppe 3: Aliquotieren der Aminosäurelösung 1. Beschriften Sie die 8 vorbereiteten blauen Tubes mit Ihrer Gruppennummer. 2. Pipettieren Sie jeweils 14 µl der Stammlösung aus dem blauen Vorratsgefäß 3 (VG 3, Gesamtvolumen 130 µl) in die 8 von Ihnen zuvor beschrifteten Tubes. 3. Geben Sie jeweils ein Aliquot an die 8 Arbeitsgruppen. 16.05.2016 12 Experimentvorbereitung Gruppe 4: Aliquotieren der Methioninlösung 1. Beschriften Sie die 8 vorbereiteten gelben Tubes mit Ihrer Gruppennummer. 2. Pipettieren Sie jeweils 10 µl der Stammlösung aus dem gelben Vorratsgefäß 4 (VG 4, Gesamtvolumen 105 µl) in die 8 von Ihnen zuvor beschrifteten Tubes. 3. Geben Sie jeweils ein Aliquot an die 8 Arbeitsgruppen. 16.05.2016 13 Experimentvorbereitung Gruppe 5: Aliquotieren des Rekonstitutionspuffers 1. Beschriften Sie die 8 vorbereiteten pink farbigen Tubes mit Ihrer Gruppennummer. 2. Pipettieren Sie jeweils 7 µl Puffer aus Vorratsgefäß 5 (VG 5, Gesamtvolumen 70 µl) in die 8 von Ihnen zuvor beschrifteten Tubes. 3. Geben Sie jeweils ein Aliquot an die 8 Arbeitsgruppen. 16.05.2016 14 Experimentvorbereitung Gruppe 6: Aliquotieren des GFP-Vektors 1. Beschriften Sie die 8 vorbereiteten farblosen Tubes mit Ihrer Gruppennummer. 2. Pipettieren Sie jeweils 10 µl DNase-freies Wasser in die 8 von Ihnen zuvor beschrifteten Tubes. 3. Pipettieren Sie jeweils 1 µl GFP-Vektor aus VG 6 (Gesamtvolumen 16 µl) hinzu und durchmischen Sie durch Anschnippen. 4. Geben Sie jeweils ein Aliquot an die Arbeitsgruppen. 16.05.2016 15 Experimentvorbereitung Gruppe 7: Aliquotieren des Kaleidoskop-Standards 1. Beschriften Sie die 8 vorbereiteten Tubes mit Ihrer Gruppennummer. 2. Pipettieren Sie jeweils 12 µl des KaleidoskopStandards aus VG 7 (Gesamtvolumen 110 µl) in die 8 von Ihnen zuvor beschrifteten Tubes. 3. Geben Sie jeweils ein Aliquot an die Arbeitsgruppen. 16.05.2016 16 Experimentvorbereitung Gruppe 8: Aliquotieren des Lämmli-Puffers 1. Beschriften Sie die 8 vorbereiteten Tubes mit Ihrer Gruppennummer. 2. Pipettieren Sie jeweils 22 µl des Lämmli-Puffers aus VG 8 (Gesamtvolumen 200 µl) in die 8 von Ihnen zuvor beschrifteten Tubes. 3. Geben Sie jeweils ein Aliquot an die Arbeitsgruppen. 16.05.2016 17 Verteilen der Aliquots Jede Arbeitsgruppe hat nach dem Verteilen der aliquotierten Chemikalien folgende Tubes zum Ansetzen der In-vitro-Expression zur Verfügung: 16.05.2016 18 1. Ansetzen der In-vitroExpression 16.05.2016 19 1. Ansetzen der In-vitro-Expression 1.1 Pipettieren Sie in Ihr rotes Tube 1, das bereits 12 µl E.-coli-Lysat enthält: 1. 10 µl Reactionmix (grünes Tube 2) 2. 12 µl Aminosäuren (blaues Tube 3) 3. 1 µl Methionin (gelbes Tube 4) 4. 5 µl Puffer (pinkes Tube 5) 5. 10 µl GFP-Vektor (farbloses Tube 6) 16.05.2016 20 1. Ansetzen der In-vitro-Expression Aufgabe: Prüfen Sie Ihren In-vitroAnsatz im UV-Feld auf Fluoreszenz (Kontrolle)! 16.05.2016 21 1. Ansetzen der In-vitro-Expression 1.2 Inkubieren Sie Ihr Reaktionsgemisch 120 Minuten bei 30°C im Wasserbad. 30°C Eine Inkubation von bis zu 24 Stunden erhöht die GFP-Produktion! 16.05.2016 22 Auswertung In-vitro-Expression Stellen Sie nach 120 min Expressionsdauer im UV-Feld fest, ob das Grün Fluoreszierende Protein exprimiert wurde. 16.05.2016 23 Durchführung der SDS-PAGE 16.05.2016 24 2. Vorbereiten der Gelplatte 2.1 Schneiden Sie die Verpackung des Fertiggels entlang der vorgegebenen Linie auf und entnehmen Sie die Gelkassette. 16.05.2016 25 2. Vorbereiten der Gelkassette 2.2 Schneiden Sie mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell die Klebefolie der Gelkassette entlang der markierten unteren Linie ein und ziehen Sie den unteren Streifen ab. 16.05.2016 26 3. Vorbereiten der Elektrophoresekammer 3.1 Setzen Sie die Gelkassette mit der kürzeren Platte nach innen gerichtet in den Elektrodenstand ein. Setzen Sie auf der gegenüberliegenden Seite eine weitere Gelkassette oder eine Blindplatte ein. 3.2 Drücken Sie den Elektrodenstand im Klammerrahmen nach unten und schließen Sie die 2 Klemmklappen. 3.3 Setzen Sie den Klammerrahmen mit dem Elektrodenstand in den Pufferbehälter ein. 3.4 Ziehen Sie den Kamm. 16.05.2016 27 4. Befüllen der Kammer mit Puffer 4.1 4.2 Befüllen Sie den Elektrodenstand mit 140 ml TGS-Puffer. Befüllen Sie den Pufferbehälter ebenfalls mit 200 ml TGS-Puffer. 16.05.2016 28 Vorbereiten der Elektrophoresekammer Tipp: Läuft der Puffer aus dem Klammerrahmen aus, Puffer wieder entfernen und Elektrodenstand erneut festklemmen. Läuft dennoch Puffer aus, kann der Pufferbehälter auf die gleiche Höhe mit Puffer wie im Elektrodenstand gefüllt werden. 16.05.2016 29 5. Probenvorbereitung für die PAGE 5.1 Beschriften Sie ein neues farbloses Tube mit Ihrer Gruppennummer. 5.2 Überführen Sie etwa 2 Stunden nach Beginn der In-vitro-Genexpression 20 µl aus dem roten Reaktionsgefäß in das zuvor beschriftete Tube. 5.3 Pipettieren Sie 20 µl Lämmli-Puffer (aus Tube 8) hinzu und vermischen Sie durch Anschnippen. 16.05.2016 30 6. Befüllen der Geltaschen • Zwei Arbeitsgruppen arbeiten mit einem Fertiggel! • Rechte und linke Geltasche bleibt frei! 16.05.2016 31 6. Befüllen der Geltaschen 6.1 Befüllen Sie die Geltaschen mit: - 10 µl Kaleidoskop-Längenstandard (KL, Tube 7) - 10 µl Probe Arbeitsgruppe 1 (P1) - 10 µl Probe Arbeitsgruppe 2 (P2) - 10 µl Kaleidoskop-Längenstandard (KL, Tube 7) -- KL 16.05.2016 - P1 - - P2 - KL -- 32 7. Durchführung der Elektrophorese 7.1 Schließen Sie die Gelkammer und starten Sie die Elektrophorese bei 200 V. 7.2 Beenden Sie die Elektrophorese wenn Bromphenolblau den unteren Rand des Gels erreicht hat (Dauer: ca. 20 Minuten). 16.05.2016 33 8. Entnahme des Gels 8.1 Entnehmen Sie den Klammerrahmen aus dem Pufferbehälter und dekantieren Sie den Puffer ab. (Puffer ist wieder verwendbar!) 8.2 Entnehmen Sie die Gelkassette aus dem Elektrodenstand. 16.05.2016 34 9. Gelauswertung 9.1 Stellen Sie im UV-Feld fest, ob das Grün Fluoreszierende Protein exprimiert wurde. Markieren Sie die Bande. 9.2 Ermitteln Sie die molekulare Masse von GFP anhand einer Eichkurve. 16.05.2016 35 9. Gelauswertung Protein Farbe MG Myosin Blau 201090 u ß-Galactosidase Magenta 133730 u Rinderalbumin Grün 83559 u Karbonanhydrase Violett 39559 u Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor Orange 31405 u Lysozym Rot 17408 u Aprotinin Blau 7081 u Tab.: Molekulare Masse der Proteine im Kaleidoskop-Standard 16.05.2016 36 -- KL - P1 - - P2 - KL -- kD ? ? 200 134 84 40 31 17 7 Ergebnis der SDSGelelektrophorese (schematisch) + KL = Kaleidoskop-Längenstandard; P1 = Probe 1; P2 = Probe 2 16.05.2016 37 Mathematische Auswertung der Gelelektrophorese 10000 Erstellen einer Eichkurve mit Hilfe des ProteinStandards: Abmessen der Wegstrecken zwischen Tasche und ProteinBanden. (Gemessen wird jeweils zwischen 1000 100 0 1 16.05.2016 2 3 4 5 6 7 8 Unterkante Geltasche und Bandenmitte) 38 Mathematische Auswertung der Gelelektrophorese Zur Excel Auswertung 16.05.2016 • Fügen Sie Ihre Messwerte [mm] des KaleidoskopLängenstandards und der GFP-Bande in die Tabelle des Arbeitsblattes „Eichkurve“ ein. • Erstellen Sie eine Eichkurve und bestimmen Sie MGFP a) von Hand b) über die Excel-Tabelle. 39 Ergebnis Die molare Masse von GFP beträgt 27 000 U 16.05.2016 40
