DNA-Polymerase
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Die DNA-Replikation erfolgt bi-direktional Replikationsgabel DNA-Polymerasen starten die Replikation am Replikations-Startpunkt = “Origin“ Wie funktioniert der einzige “Origin of Replication“ in E. coli? OriC DnaA ( ATPase) Erkennung leichtes „Schmelzen“ der DNA 30°C DnaB = Helikase DnaC ATP Startkomplex Offener Komplex „Prä-Priming“ Komplex Replikation - Primase - DNA-Polymerase 5' 3' A T G C A AG A T A G C T A A T A C G T T C T A T C GA T T ori 3' Brechen der H-Brücken ( Helicase) entlang der Basenpaare Elternstrang 1 Elternstrang 2 5' Die Biochemie der DNA-Kettenverlängerung 5‘ Wie werden die Desoxy-Nukleotid-Bausteine in die DNA eingebaut? allgemein gilt: Desoxynukleosid-5‘-Triphosphate sind die aktivierten Vorstufen bei der DNA-Synthese: dATP, dCTP, dGTP, dTTP (dNMP) n + QuickTime™ and a Animation decompressor dNTP (dNTP) are needed to see this picture. DNA-Polymerase o 5‘ > 3‘ Verknüpfung Nukleophiler Angriff (Phospho-Diester-Brücken) Neu-eintretendes Desoxy-Nukleosid-Triphosphat 3‘ 5‘ der 3‘-OH Gruppe o 5‘-Ende mit Phosphat-Gruppe am a-Phosphoatom o 3‘-Ende mit freier OH-Gruppe O 0 + 0 3‘ 0 n+1+ PPi Die Biochemie der DNA-Kettenverlängerung Wie werden die Desoxy-Nukleotid-Bausteine in die DNA eingebaut? QuickTime™ and a H.264 decompressor are needed to see this picture. Die Biochemie der DNA-Replikation (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1+ PPi DNA-Polymerase grundsätzlich gilt, daß DNA-Polymerasen nur synthetisieren können 5‘>3‘ d. h . DNA-Polymerasen besitzen eine 5‘>3‘ Polymerase-Aktivität 3‘ Bewegung 5' der Replikationsgabel 3' A A T C G A T 5‘ A G A A C 3‘ A TG DNA-Polymerase T A C G 5‘ T TC TAT C GA 3‘ TT DNA-Polymerase 5‘ Das Problem der “lagging strand“ DNA-Replikation DNA-Polymerasen besitzen eine 5‘>3‘ Polymerase-Aktivität DNA-Polymerase kontinuierlicher Strang (“leading strand“) 3‘ 5‘ 3‘ dis-kontinuierlicher Strang (“lagging strand“) 5‘ 3‘ QuickTime™ and a Cinepak decompressor are needed to see this picture. 5‘ 3‘ 5‘ Bewegung der Replikationsgabel Noch ein anderes Problem bei der DNA-Replikation...... DNA-Polymerasen benötigen einen kurzen “RNA-Primer“ zum Start der Replikation DNA-Polymerasen verwenden den einzelsträngigne DNA-Strang als Matritze, aber der Einzelstrang muß einen Primer gebunden haben (doppelsträngiger Abschnitt), damit die DNA-Polymerase den 2. Strang auffüllen kann Primer DNA-Polymerase DNA-Polymerasen benötigen einen kurzen “RNA-Primer“ zum Start der Replikation DNA-Polymerase leading strand 3‘ 5‘ 3‘ lagging strand 5‘ 3‘ QuickTime™ and a Primer Cinepak decompressor are needed to see this picture. 5‘ 3‘ QuickTime™ and a 5‘ Animation decompressor are needed to see this picture. Die vollständige Synthese des Folgestrangs Primer Okazaki Fragment Primer Die Ligase-Reaktion DNA-Ligase + ATP + PPi Die einzelnen Schritte der Ligase-Reaktion e-Aminogruppe eines Lysins ATP PPi Enzym-AMP AMP Vergleich der drei DNA-Polymerasen von E. coli DNA-Reparatur DNA-Reparatur DNA-Replikation Anzahl der Untereinheiten Synthese-Rate (Nukleotide/sec) Prozessivität (eingefügte Nukleotide vor dem Abdissoziieren) 3‘>5‘ Exonuclease (Korrekturlesen) ja ja ja 5‘>3‘ Exonuclease ja nein nein Molekulargewicht 103 kDa 88 kDa 900 kDa Untereinheiten und Struktur der DNA-Polymerase III von E. coli DNA-Polymerase III b-Untereinheit für die Bindung an die DNA a-Untereinheit mit DNA-PolymeraseAktivität (5‘>3‘) vermutlich Schleifenbildung e-Untereinheit 3‘>5‘ Exonuclease Die DNA-Polymerase III (Holoenzym) bildet einen Dimer und kann dadurch gleichzeitig sowohl am Leitstrang wie am Folgestrang synthetisieren. Die Synthesegeschwindigkeit beträgt: V = 1000 BP/sec „Akzessorische Proteine“ der DNA-Polymerase Kristallstruktur von Klammer-Dimer Komplex Klammer Griff QuickTime™ and a MPEG-4 Video decompressor are needed to see this picture. DNA DNA-Polymerase III Der Griff-Klammer-Komplex (RFC-PCNA) kann armreifartig an der DNA entlanggleiten. An den Griff-Klammer-Komplex bindet die DNA-Polymerase III, die während der Replikation dadurch mit hoher Prozessivität an der DNA entlangwandern kann, ohne dabei abzufallen Das E. coli Replisom mit seinen verschiedenen Komponenten Damit die DNAReplikation in der Replikationsgabel kontinuierlich voranDamit die entwundene DNA schreiten kann, muß die kurzzeitig einzelsträngig bleibt, doppelsträngigeDNA in bindet das SSB (“single-stranded der Gabel in die DNA-binding protein“) an die noch Einzelstränge nicht replizierte DNA.von Damit wird Später wird das SSB getrennt werden. die derVerknäuelung vorrückendender ss-DNA verhindert. DNA-Polymerase >> Eine DNA-Helicase wieder von der Matritze windet unter ATPabgetrennt. Verbrauch die DNA auf. Bewegungsrichtung der Replikationsgabel Helicase Primosom SSB 3‘ 5‘ Pol III (DNA-Polymerase) Primase 3‘ OkazakiStücke RNA-Primer Leitstrang DNA-Polymerase I + Ligase Folgestrang Eine konzertierte Aktion bei der Synthese von Leit- und Folgestrang QuickTime™ and a Cinepak decompressor are needed to see this picture. jedoch: ein- und dieselbe DNA-Polymerase III synthetisiert gleichzeitig Leit- und Folgestrang! „Schleifenbildung“ am Folgestrang bei der DNA-Replikation Helicase Primosom Schleifenbildung Bewegungsrichtung der Replikationsgabel DNA-Polymerase III Holoenzym-Dimer Primer DNA-Polymerase III Holoenzym-Dimer Primer OkazakiStück Leitstrang Folgestrang Schleifenbildung bei der Synthese von Leit- und Folgestrang Helicase Primosom Schleifenbildung 3‘ 5‘ 3‘ OkazakiStück Primer 5‘ DNA-Polymerase III Holonenzym-Dimer DNA-Polymerase III Holoenzym-Dimer DNA-Polymerase III Holonenzym-Dimer Die Schleifenbildung an der DNA-Folgestrangmatritze ermöglicht der dimeren DNA-Polymerase III die Synthese beider Tochterstränge in der Replikationsgabel. Dadurch wird die physikalische Richtung am Folgestrang, nicht aber die biochemische Richtung (5´>3´) umgedreht Eine konzertierte Aktion bei der Synthese von Leit- und Folgestrang Leitstrang Griff Bewegungsrichtung der Replikationsgabel Klammer DNA-Polymerase III Ligase DNA-Polymerase I Helicase Primase RNA-Primer SSB Folgestrang Okazaki- RNA-Primer Stücke Topoisomerase Die gleichzeitige Synthese von DNA Leit- und Folgestrang durch die dimere DNA-Polymerase III QuickTime™ and a Animation decompressor are needed to see this picture. Eine Computer-Animation: gleichzeitige Synthese von DNA Leitund Folgestrang durch das Holo-Enzym DNA-Polymerase III QuickTime™ and a Sorenson Video 3 decompressor are needed to see this picture. Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung 53 Essentielle Grundlage des Lebens ist die Fähigkeit der identischen Reduplikation des genetischen Materials und damit letztendlich der Vererbung einer funktionsfähigen Zellstruktur. Welche Aussage zur Replikation der DNA trifft zu? (A) (B) (C) (D) (E) Beim Start der Replikation werden RNA-Primer synthetisiert. Die Neusynthese der DNA erfolgt an beiden Strängen einer Replikationsgabel in kürzeren Stücken, so genannten Okazaki-Fragmenten. Für die Verknüpfung der DNA-Fragmente nach Entfernen der Primer phosphoryliert die DNA-Ligase das 3’-OH-Ende eines Fragmentes. Helicasen schützen intermedär gebildete einzelsträngige DNA-Bereiche vor Schädigungen und Strangbrüchen. Interkalatoren, die als Zytostatika in der Tumortherapie eingesetzt werden, binden spezifisch die DNA-Polymerasen. Die Entwindung des DNA-Matritzenstrangs während der DNA-Replikation führt zu Verdrillungen Entwinden der DNA während der Replikation durch die Helicase Replikation dadurch Verdrillung der DNA Transienter Bruch des einen Strangs erlaubt freie Rotation der DNA-Stränge und Entdrillung der beiden Stränge >>katalysiert durch DNA-Topoisomerase QuickTime™ and a Cinepak decompressor are needed to see this picture. Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung Nukleosomen-Assemblierung nach DNA-Replikation in Eukaryonten Die Enden der menschlichen Chromosomen sind linear >>> Probleme bei der Replikation Telomerase mit RNA Primer QuickTime™ and a Animation decompressor are needed to see this picture.
