Rec 1

Patch – Clamp – Ableitungen
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- Einführung
- Methodik
- Auswertung von Rohdaten
- Fazit / Ausblick
Einführung
- Entwicklung 1976 (Nobelpreis 1991)
Erwin NEHER
Bert SAKMANN
The Nobel Prize in Physiology or Medicine for 1991 is awarded
for the discoveries of the function of ion channels.
The two German cell physiologists Erwin Neher and
Bert Sakmann have together developed a technique
that allows the registration of the incredibly small electrical
currents (amounting to a picoampere - 10-12A) that passes
through a single ion channel. The technique is unique in
that it records how a single channel molecule alters its shape
and in that way controls the flow of current within a time
frame of a few millionths of a second.
Revolution !
- hohe räumliche Auflösung
 Untersuchung von Einzelkanalströmen unter
verschiedensten Bedingungen möglich;
damit: Größe von Einzelkanalströmen /
(In-) Aktivierungskinetik, Einflüsse
Cell- Attached:
physiolog. Bedingungen;
EM unverändert
Inside-Out: Wirkung intrazellulärer
Transmitter (isoliertes Fragment)
Whole-Cell: Summenstrom
Outside- Out: Wirkung
extrazellulärer Transmitter
Methodik
Der Patch-Clamp-Verstärker
1: Differenzialverstärker erzeugt eine Spannung, die in linearer Beziehung zur
Spannungsdifferenz an beiden Eingängen steht
2: Eingangswiderstand liegt in Größenordnung von 1012 Ω
3: Spannungsabfall über Rf ist proportional zur Stromstärke zwischen 1 und 2
 verwendete Zellen: Neuroblastoma-Tumorzellen
der Zelllinie B35 von Rattenembryonen
 Zugabe von K+-Kanal-Blockern (Ziel: Untersuchung
der Na+-Kanäle)
 Anvisierung der ausgewählten Zelle im LM mit der
Elektrode
 kurz vor Berührung: Überdruck-Erzeugung
 2 Informations-Quellen über Abstand der
Elektrode zur Zelle:
 akustische Informationen über den Widerstand
 visuelle Informationen durch Eindrücken der
Zellmembran
aufgrund des Überdrucks
 Nach hinreichender Annäherung: Erzeugung eines
Unterdrucks
 Ansaugen der Zellmembran (Cell-attachedKonfiguration): Gigaseal erkennbar durch
flachere Stromspur
 Minimierung der kapazitiven Ströme notwendig
 Weiter Unterdruck sorgt für Aufreißen der
Zellmembran (Whole-Cell-Konfiguration)
 Erneute Minimierung der kapazitiven Ströme nötig
 Ausführung verschiedener Messprotokolle
 Datenauswertung
Auswertung: von den Rohdaten zur Erkenntnis…
Welche interessanten Größen lassen
sich aus den Rohdaten bestimmen ?
 Messung eines (Ionenkanal-) Stroms bei
vorgegebener Spannung
U=R*I  I=U/R=U*g
Strom – Spannung
Aktivierung
Inaktivierung
Refraktärität
Strom-Spannungs-Kurve
Ergebnisse
Protokoll: Sodium 1
Haltepotential: Ruhemembranpotential bei -80 mV
Dann: 15 Spannungssprünge für jeweils 45 ms in Zehnerschritten von -60 mV bis +80
mV
Der Strom wird gegen die vorgegebene Spannung
aufgetragen
Es gibt 3 Phasen sowie 2 wichtige Größen
Stromspannungs-Kurve, Zelle E12
Spannung [mV]
Strom [pA]
-70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0
0
-100
-200
-300
-400
-500
-600
-700
-800
10 20 30 40 50 60 70 80 90
Reihe1
3 Phasen:
Einwärtsstrom
Anstieg bis Epeak
Abfall bis Erev
Auswärtsstrom
2 wichtige Größen:
Epeak
Erev
Aktivierungskinetik
 Zusammenhang zwischen Membranspannung
E und Leitfähigkeit g der (Natrium-) Kanäle
INa
gNa = -------------E - Erev
gemessene Spannung
ENa (50 mV) gesetzt
(normiert)
Boltzmann
g
1
----- = --------------------------------gmax 1 + 1 / [e^ [(E – E0.5):k]]
g
1
----- = --------------------------------gmax 1 + 1 / [e^ [(E – E0.5):k]]
E 0.5
E0.5 ist die Spannung, bei welcher die Hälfte aller Na+ - Kanäle
geöffnet ist (halbmaximale Gesamtleitfähigkeit !)
g
1
----- = --------------------------------gmax 1 + 1 / [e^ [(E – E0.5):k]]
k verhält sich invers zur Steilheit der Kurve (etwa zur Steigung bei E0,5)
 Maß für die Spannungsabhängigkeit der Aktivierung
(je kleiner k, desto größer)
E10_2_7_2011
Zelle
E(1/2)
k
1
0.8
2
-0.031
0.009
-0.029
0.00825
-0.0469
0.0051
-0.046
0.005
-0.037
0.01
-0.0368
0.0122
-0.036
0.0078
-0.0369
0.0079
6
-0.045
0.011
7
-0.0426
0.012
Mean
-0.03872
0.008825
VAR²
0.00619889
0.00254638
0.6
0.4
3
0.2
0
-0.07
-0.06
-0.05
-0.04
-0.03
-0.02
-0.01
0
4
-0.2
E9_2_8_2111
5
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
-0.08
-0.07
-0.06
-0.05
-0.04
-0.03
-0.02
-0.01
0
Variabilität von E 0.5 und k : zell- und zelltypspezifische
Unterschiede in Expressionsmustern
verschiedener (Sub-) Kanaltypen…
Inaktivierungskinetik
Noch während der Depolarisation schließen
die Nav-Kanäle wieder
Diese Inaktivierung findet mit zeitlicher
Verzögerung (ms) statt und ist für
Repolarisation zurück zum Ruhepotential
der Zellmembran mitverantwortlich
Untersuchung der
Spannungsabhängigkeit
der Inaktivierung im
Gleichgewichtszustand
Spannung für
depolarisierende
Konditionierung: -120mV
bis -30mV
in Schritten von 10mV
Dauer der Depolarisation:
100ms
Auswertung:
- Steady-StateInaktivierung mit
NaInact1-Protokoll
- Stromamplituden während
Spannungssprung nach
Epeak auf maximalen
Einwertsstrom normieren
E1/2 : Spannung, bei der die Hälfte der
Nav-Kanäle inaktiviert sind
k : Im steilsten Bereich der Kurve ist die
Spannungsabhängigkeit am größten
- Auftragen von E; I /I(max);
Boltzmann-Fit
Idealbild einer Inaktivierungskurve
Beispielhafte Auswertung einer Zelle
E in mV
I/I(max)
boltzmann
Δ²
E9_NaInac_1_4_1_4_Boltzmann
-1.20E-01
0.97430824
0.99827987
0.00057464
-1.10E-01
1
0.98949616
0.00011033
-1.00E-01
0.90028672
0.93861689
0.0014692
-9.00E-02
0.7376619
0.7128141
0.00061741
0.4
-8.00E-02
0.28075044
0.2871859
4.1415E-05
0.2
-7.00E-02
0.08220838
0.06138311
0.00043369
-6.00E-02
0.04514798
0.01050384
0.00120022
-5.00E-02
0.04333555
0.00172013
0.00173184
-4.00E-02
0.04783218
0.00027961
0.00226125
-3.00E-02
0.0498849
4.5398E-05
0.00248398
-2.00E-02
0.03855515
7.3693E-06
0.00148593
-1.00E-02
0.04430696
1.1962E-06
0.001963
1.2
1
I / I(max)
0.8
0.6
0
-0.14
-0.12
-0.1
-0.08
-0.06
-0.04
Spannung (V)
E(0.5)
k
-0.085
-0.02
0
-0.0055
Refraktärität
 Na+-Kanäle nach AP inaktiviert
 Wiederaktivierung zeitabhängig (Refraktärzeit)
 Schnelligkeit der AktionspotentialWiederholungen limitiert
 absolute Refraktärzeit nach AP: weiteres AP
kann unter keinen Umständen ausgelöst werden
 relative Refraktärzeit nach AP: weiteres AP kann
durch starke Spannungspulse ausgelöst werden
(erhöhtes Schwellenpotential, schwächere APs)
 Rec 1: zweiter Spannungspuls in 1ms-Abständen
verschoben
 Rec 1: Ergebnisse
 Rec 1: Auswertung: I2/I1 im Zeitverlauf
Sättigungsfunktion
 Rec 2: zweiter Spannungspuls in exponentiellen
Abständen verschoben
 Rec 2: Ergebnisse
 Rec 2: Auswertung (I2/I1 im Zeitverlauf)
Sättigungsfunktion
 Charakterisierung der Graphen anhand der
Zeitkonstante der Natrium-Aktivierung: 
 Charakterisierung der Graphen anhand der
Zeitkonstante der Natrium-Aktivierung: 
 Charakterisierung der Graphen anhand der
Zeitkonstante der Natrium-Aktivierung: 
Patch-Clamp: Fazit
Vorteile
- Besseres Signal-Rausch-Verhältnis als bei
Intrazellulärableitungen
- Ableitungen von einzelnen Kanälen möglich
Nachteile
- Keine Ableitung von neuronalen Netzwerken
möglich
- Für gute Ableitungen braucht man Einiges an
Übung und Geschick
Ausblick : Planares Patch - Clamp
- keine adhärenten Zellen, sondern Zellsuspension auf
einem Chip
- Zellen werden durch eine Öffnung im Chip angesaugt
(Gigaseal); daraufhin wird abgeleitet
Spiel gefällig?
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