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Kritische Aspekte der HPV-Genotypisierung Univ.-Prof. Dr. Jörg Berg Institut für Med.-Chem. Labordiagnostik Allgemeines Krankenhaus der Stadt Linz Seminar Molekulare Diagnostik, 27. November 2013, Wien Univ.-Prof. Dr. Jörg Berg Übersicht Allgemeines zu HPV Erkrankungen Fokus Zervixkarzinom + Vorsorge HPV-Nachweisverfahren Leitlinien (ÖGGG, DGGG, ACOG, ACS, ASCP) Zusammenfassung Jörg Berg, AKH, Linz Humane Papillomaviren Ca. 120 Typen Infektion der Haut und Schleimhäute • Schmierinfektion, Austausch von Körperflüssigkeiten, e.g. Geschlechtsverkehr > 80% Menschen irgendwann infiziert mit HPV • Infektion symptomlos, • meist selbst-limitierend ca. 20% der Infektionen chronischen Verlauf Typen-spezifische Assoziation mit malignen und benignen Erkrankungen hoch-Risiko (HR), niedrig-Risiko (LR) HPV-Typen Jörg Berg, AKH, Linz Benigne Infektionen Niedrig-Risiko HPV-Typen (low risk, LR) sind mit benignen, papillomatösen Haut-/Schleimhauterkrankungen assoziiert (e.g.: 6, 11, 40-44, 54, 70,72, 81) Papillome (Warzen): • Fußsohle, Hände • Stimmbänder • Mundhöhle Epidermodysplasia veruciformis Kondylome • männliches /weibliches Genitale Zervix-Dysplasien Jörg Berg, AKH, Linz Maligne HPV-Infektionen Hoch-Risiko HPV-Subtypen sind mit Karzinomen der Haut oder Schleimhäute assoziiert Oropharyngeale Tumore Vaginale Tumore Vuvla- und Penis-Tumore Zervix-karzinome Infektion mit HR-HPV-Typen ist ursächlich an Onkogenese von Zervixkarzinomen beteiligt Univ.-Doz. Dr. Jörg Berg, AKH, Linz Epidemiologische Klassifikation der HPV-Typen 12 6 12 89 Munoz, Vaccine, 24:S1-10, 2004 Bouvard, Lancet Oncol , 10:321-2, 2009 Jörg Berg, AKH, Linz HPV-Typen bei Zervixkarzinom Munoz, Intl. J. Cancer, 2004 Jörg Berg, AKH, Linz Zervix-Karzinogenese PAP III/IIId PAP IV PAP V Progression 15+ Jahre CIN Zervixkarzinom: > 15 J. (Zeit für Früherkennung) peristente HPV-Infektion nötig für Progression zu CIN III oder Cervix-Ca Burd EM., Clin Microbiol Rev, 2003 Jörg Berg, AKH, Linz HPV-Infektionsverlauf und Zervixkarzinom nach HPV-Infektion dauert Karzinogenese ca. 20 – 25 Jahre HPV-Infektion mit Beginn der sexuell aktiven Lebensphase ~15. Lebensjahr Hohe Selbstlimitierung der HPV-Infektion bis ca. zum 30. Lebensjahr persisierende HPV-Infektion nötig für Progression zu Jörg Berg, AKH, Linz CIN III oder Zervixkarzinom Schiffman, Lancet 2007 Fakten: HPV-Infektion und Zervixkarzinom Hohe spontane Limitierung der HPV-Infektion bis zum Alter von ca. 30 Jahren Hohe Selbstlimitierung der HPV-Infektion im Verlauf eines Jahres nach Infektion: ca. 70% 20% - 30% Mischinfektionen mit mehreren HPV-Typen Bei 5-10 % der Infizierten entwickelt sich eine persistierende Infektion • 10% - 40% der HR-HPV-Infektionen persistieren • 10% - 50% jener Infektionen progredieren zu CIN III in ca. >10 Jahren Progressionsrate von CIN III zum invasiven Zervixkarzinom beträgt > 12% Virale Persistenz wichtigster Prognosefaktor Brink et al., 2007, Disease Markers; Lie et al., 2008, Expert Reviews Jörg Berg, AKH, Linz HPV-Testung bei Fragestellung „Zervixkarzinom“ Primärscreening Vorsorge HPV-Triage bei CIN Nachverfolgung nach Therapie (e.g. Konisation) Diagnostik bei Patientinnen mit unklaren zytologischen / histologischen Befunden Jörg Berg, AKH, Linz ATHENA Studie (Auszug) Zervixkarzinom Screening-Studie n = 47 208 • Roche, Cobas HPV-Test • Ziel: Aufzeigen eines Nutzens von HPV 16/18 und HRTypen Detektion auch im Vergleich mit Dünnschicht Zytologie • Screening ab 25 J • Ergebnisse: Sensitivität der Detektion von CIN 3+ HPV-Testung 92% Zytologie 53,3% Kombiniert 96,7% • kombiniertes gleichzeitiges Screening sinnvoll! • HPV 16/18 Detektion wichtig, Progression rascher als bei Jörg Berg, AKH, Linz nicht 16/18 HR Typen CIN-Prävalenz bei PAP III abhängig von HPV-Typ Detektion von HPV 16/18 und HR-Gruppendetektion zur Jörg Berg, AKH, Linz Diagnose bedeutsam Metaanalyse und Follow-up (6,5 Jahre) von 4 HPV-Screening Studien (n > 175 000) Ronco G. et al., Lancet 2013 Screening: HPV (exp. arm) versus Zytologie (control arm) Nach > 2,5 Jahren geringere Inzidenz-Raten an invasiven Zervix-CA pro 105 Wirksamkeit von HPV-Screening bei ZervixKarzinom-Vorsorge belegt! Ronco G. et al., Lancet 2013 Metaanalyse und Follow-up (8 Jahre) von > 175 000 Frauen in 4 Studien (Schweden, England Italien, Holland) HPV-Screening detektiert CIN2+ früher als Zytologie HPV-Screening hat in den Studien zur Reduktion der Inzidenzrate an Zervixkarzinomen geführt, um 60-70%. HPV-Testung alle 5 Jahre ist sicherer als PAP alle 3 Jahre Daten schlagen vor, HPV-Screening zur Zervixkarzinomvorsorge ab dem 30 Jahr zu initiieren. Kosten der HPV-Testung < als Kosten der CATherapien Diagnostische Nachweismethoden für HPV Virus-Kultur ist bisher nicht gelungen Serologie als Nachweis der Infektion diagnostisch unbedeutend, in epidemiologischen Studien verwendet Serologie nach Impfung: • Serokonversion (Typen-spezifisch) > 98% • Titer 80-100-fach höher als bei Infektion Elektronenmikroskopie zu aufwendig Immunhistochemie molekulargenetische Methoden Nachweis von HPV-DNA oder -RNA Material: Bürsten-Abstrich oder Gewebe Jörg Berg, AKH, Linz Wichtigkeit des Materials für HPVDiagnostik 2013 Biopsie verglichen mit Bürstenabstrich n = 443 HPV-Test: Macro-Array Chipron, Berlin Jörg Berg, AKH, Linz Erkenntnisse 35% der Untersuchten mit HPV 16 im Bürstenabstrich waren in Biopsie negativ. aus Bürstenabstrichen signifikant mehr HPVMischinfektionen diagnostiziert als aus Biopsien. Bürstenabstrich ist Material der Wahl; denn Biopsien haben größere Chance HPV-Diagnose zu verpassen als Bürstenabstrich Biopsien zum Screening und zur Abklärung bei PAP III wenig geeignet Jörg Berg, AKH, Linz Bürstchen oder Spatel zum Gewinnen von Zervix-Abstrichen? Bürstchen! Chakrabarti, S. et al., 1994, Acta Cytol, 38:315-318 • > 1300 Abstriche verglichen • Abstriche mit Zellmaterial • in 94% der Bürstenabstriche • in 63% bei Verwendung von Spatel Martin-Hirsch P, et al., 2000. Collection devices for obtaining cervical cytology samples. Cochrane Database of Systematic Reviews, Issue 3. Art. No.: CD001036. DOI: 10.1002/14651858.CD001036 • Metanalyse von 36 klinischen Studien und 6 vergleichenden Studien • Am meisten Zellmaterial und beste Abstrichqualität nur bei Verwendung von Zytobürstchen mit verlängerter Spitze. Abnahmebesteck bei zervikaler HPV-Testung Nur Bürsten geeignet Molekulargenetische HPV-Tests In-Situ-Hybridisierung auf Zellen oder Geweben: • Nachweis und Einteilung in HR/LR Typen Direkte DNA-Hybridisierung (Hybrid-Capture) • Nachweis und Einteilung in HR/LR Typen DNA-Amplifikation und Detektionsverfahren • PCR und Hybridisierung zur HPV-Typisierung RNA-Tests • Nachweis der HPV-E6/E7 mRNA onkogene HPV-Aktivität DNA-Sequenzier-Tests • PCR gefolgt von Sequenzierreaktion Jörg Berg, AKH, Linz Kommerzielle Tests (Auswahl) Hybrid Capture2, Digene (Gruppe von 13 HR und 5 LR) Cervista HPV 16/18 (nur HPV 16 und 18) Cobas® 4800 HPV Test (HPV 16, 18 + weitere HR in Gruppe) Aptima HPV-asasay (RNA E6/E7 HR-HPV) • von FDA zum Screening für Zervixkarzinomvorsorge zugelassen Inno-Lipa HPV, Innogenetics (Typisierung von 25 HPV-Typen) PapilloCheck, Greiner bio-one (Differenzierung 24 HPV-Typen) Linear Array, Roche (Differenzierung 37 HPV-Typen) NucliSensEasy Q HPV, bioMerieux (mRNA der E6/E7-Region von HPV 16, 18, 31, 33, 45) GenoFlow HPV Array Test DiagCor (Differenz. 18 HR, 15 LR) Macroarray HPV 3.5, Chipron (nur RUO) Jörg Berg, AKH, Linz Welchen HPV Test im Labor auswählen? Eklund C et al.: 2013 J. Clin. Microbiol. JCM.02453-13; published ahead of print 20 November 2013 doi:10.1128/JCM.02453-13 Global improvement in genotyping of Human Papillomavirus DNA: The 2011 HPV LabNet International Proficiency Study Aufbau der Studie • 25 unterschiedliche Tests • Linear Array, Lineblot/Inno-LiPa, Papillocheck, Roche Cobas , Chipron, PCR-Luminex, etc….. • HPV in 50 IU oder in 500 GE zu detektierten • HPV Panel mit 43 Proben (HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 39 56, 58, 59, 66, 68a and 68b) und 3 Extraktion Kontrollen. Die Publikation enthält eine ausführliche Liste an Tests und Performances Jörg Berg, AKH, Linz Eklund C et al.: 2013 J. Clin. Microbiol. JCM.02453-13; published ahead of print 20 November 2013 doi:10.1128/JCM.02453-13 Eklund C et al.: 2013 J. Clin. Microbiol. JCM.02453-13; published ahead of print 20 November 2013 doi:10.1128/JCM.02453-13 Ergebnisse • HPV 16 detektiert von 97.0% • HPV 18 detektiert von 87.0% der Datensätze • Alle Tests haben guten Standard Jörg Berg, AKH, Linz Hybrid-Capture Test (HC2) Direktnachweis von HPV-DNA Klassifizierung in HR- und LR- HPV-Typen klinisch gut validiert Detektionslimit bei ca. 5000 Kopien / Reaktion Nachteil: • Keine HPV-Genotypisierung nur HR/LR Diskriminierung • spezielles Gerät zur Auswertung Jörg Berg, AKH, Linz Line Blot Tests = Linear Array Tests PCR + reverse Hybridisierung HPV-DNA-Nachweis und Typisierung Detektion von Mischinfektionen Detektionslimit < 100 - 1000 HPV-Kopien / Reaktion Jörg Berg, AKH, Linz Vergleich zweier Line Blot Assays CE-markierte Tests stimmen relativ gut überein Unterschiede im Spektrum der HPV-Typen van Ham et al. 2005, JCM, 43: 2662 Jörg Berg, AKH, Linz Microarray Tests (HPV-Chip) PCR + Hybridiserung auf DNA-Chip Verschiedene Anzahl (~ 24) von HPV-Typen „auf Chip“ Unterschiede im Spektrum der HPV-Typen Detektionslimit < 100 – 1000 Kopien/Reaktion Jörg Berg, AKH, Linz DiagCor GenoFlow HPV Array Test - PCR und Hybridisierung mit Flow-through-Waschen der Membranen - 33 der wichtigen HPV Typen detektiert - Hybridisierung und Waschen in 45 min - Nachteil: spezielles Gerät nötig Jörg Berg, AKH, Linz Chipron HPV-Array Test (RUO) PCR-Amplifikation (MY11/09 primer) Hybridisierung in 45 min 24 HPV-Typen-spezifische Sonden Dia-Scanner + Software keine CE-Markierung Jörg Berg, AKH, Linz HPV mRNA Nachweis untersucht Genexpression der HPV-Onokogene E6/E7 Frage: onkogene HPV-Infektion HR-HPV Genotypen 16, 18, 31, 33 und 45 üblicherweise inkludiert technisch sehr sensitiver Test Studien zur Zervixkarzinogenese • E6/E7 mRNA-Nachweis zunehmend mit CIN-Grad, CIN III: 95% mRNA positiv (n=495) (Sotlar et al., 2004, JMV) • mRNA positive Testung zeigt hohen Trend mit Läsionsgrad (Castle et al., 2007, Clin Cancer Res) Guter prädiktiver Wert der mRNA-Testung zur Vorsorge des Zervixkarzinoms Aptima HPV-Assay: FDA- Zulassung Jörg Berg, AKH, Linz Konventionelle Sequenzierung z.B. Kösel S. et al., 2003 : Clin Chem Lab Med. 41:787–791 Testsysteme erlauben Nachweis und Typisierung nicht Standard in diagnostischen Routinelabors Problem: 20% - 30% der HPV-Infektionen sind Mischinfektionen • Sequenzierung versagt • Mischinfektionen werden nicht erfasst Jörg Berg, AKH, Linz Nextgeneration Sequencing und HPV 2012 2013 Detektion von HPV-Typen möglich, die durch herkömmliche Tests nicht erfasst werden Methoden funktionieren sehr sensitiv Mischinfektionen gut erfasst klinische Notwendigkeit derzeit unklar Jörg Berg, AKH, Linz Welche Kontrollen bei Testsystemen Kontrolle für humane DNA • Genug DNA von Bürstenabstrich / Biopsie isoliert Amplifikationskontrolle • Probe war nicht inhibiert Hybridisierungskontrolle • Reagenzien zur Hybridisierung bewirken Farbreaktion Allgemeine HPV-DNA Kontrolle • Falls HPV-Typ im Test nicht repräsentiert, dann trotzdem Nachweis von irgendeiner HPV-DNA ggf. weiter testen Eigenschaften der HPV-DNA Tests zur Zervixkarzinomvorsorge Sensitivität Spezifität für HPV Spezifität für Prognose CA PPV für CA NPV für CA hoch hoch niedrig niedrig hoch > 95% > 95% ~25% ~25% ~98% • keine HPV-Infektion kein Zervixkarzinom HPV-DNA Untersuchungen diskriminieren nicht zwischen normaler und pathologischer Zytologie Klug SJ, et al., 2008, J Med Virol Jörg Berg, AKH, Linz Leitlinie der ÖGGG 3/2005, seither keine Neufassung www.kup.at/speculum Screening nur zytologisch Histologische Abklärung ab PAP III empfohlen Follow-up nach Therapie von CIN: • HPV nach 6 und 12 Monaten. • Bei negativem HPV-HR Zytologie 1 x jährlich HPV-Testung unterrepräsentiert verpassen von CIN 3-4 wahrscheinlich 3/2005 HPV-Testung !? HPV-Testung !? HPV-Testung !? ? Leitlinien der DGGG für HPV-Testung zur Zervixkarzinom-Vorsorge 8/2008 derzeit in Überbearbeitung HPV-Test (DNA) in Kombination mit Zytologie ab dem 30. Lebensjahr: Nachteil: erst Zytologie, dann HPV bei Pap IV und höher keine HPV-Testung, sondern histologische Diagnose und Therapie 2 - 5 Jahre Jörg Berg, AKH, Linz Weitere Indikationen zur HPV-Testung laut DGGG-Leitlinien 08/2008 kolposkopische Auffälligkeiten • • • • blutende Ektopie essigweiße Areale der Portio nicht einstellbare Portio nicht sondierbarer Zervikalkanal Frauen mit Immunsuppression (TxP, HIV, etc) • Vorsorgeuntersuchung 2x jährlich (Zytologie) • alle 2 Jahre zusätzlich HPV-Testung Jörg Berg, AKH, Linz Nachsorge nach invasiver Therapie HPV-DNA Testung soll in Nachsorge eingeschlossen werden • Bei negativem HPV-Test sechs Monate oder mehr nach der Therapie sind neoplastische Residuen mit hoher Sicherheit ausgeschlossen. Kontrolle mittels Zytologie und HPV-Test nach zwölf Monaten ist ausreichend. Bei wiederholten negativen Befunden wird die Patientin in die Routinevorsorge entlassen Jörg Berg, AKH, Linz Guidelines der ACS, ACOG, ASCP (2012) 21-29 Jahre: 30-65 Jahre: > 65 Jahre: Screening nur Zytologie alle 3 Jahre Screening HPV und Zytologie alle 5 Jahre kein Screening » falls kein CIN2+ in letzten 20 Jahren » falls letzten zwei Untersuchungen vor 5 und 10 Jahren negativ waren HPV-Geimpfte: Screening wie Nichtgeimpfte Nach Hysterektomie kein Screening Jörg Berg, AKH, Linz Zusammenfassung HPV-DNA Testung muss Bestandteil der Zervixkarzinomvorsorge in Österreich werden (> 30J) bevorzugtes Material zur HPV-Testung: • Bürstenabstrich verfügbare kommerzielle HPV-DNA Tests haben alle guten Standard • HPV-Genotypisierung sinnhafter als HR/LR Diskriminierung HPV-16! HPV-Testung ist Bestandteil der Nachsorge bei invasiver Therapie bei Zervix-CA oder Vorstufen Jörg Berg, AKH, Linz Zukunft HPV-Testung ohne Dünnschicht Zytologie in der Zervixkarzinomvorsorge? mRNA-HPV-Tests zur Vorsorge des Zervixkarzinoms? Epidemiologische Verschiebung der HPV-Typen durch Impfung für HPV 16, 18? Leitlinien in Österreich zur HPV-Testung zur Vorsorge bei Zervixkarzinom bedürfen dringend der Überarbeitung! Jörg Berg, AKH, Linz Zukunft HPV-Testung und Genotypisierung bei oropharyngealen Karzinomen • HPV+ CAs zeigen • Besseres Ansprechen auf Therapie • Höheres Überleben • Günstige Prognose HPV-Testung und Genotypisierung bei Anus- und Penis Karzinomen • MSM hohe HPV-Durchseuchung • Primärscreening oder auch Bedeutung des HPV-Testens noch unklar Jörg Berg, AKH, Linz Literatur Cubie, H.A. Cusgieri, and K., 2013. Understanding HPV tests and their appropiate applications. Cytophathology, 24 289-309 Massad L.S. et al., 2013. Updated consensus guidelines for the management of abnormal cervical cancer screening tests and cancer precursors. Obstr & Gynecol., 121:829-846. Jin, X.W. et al., 2013. Cervical cancer screening: Whats‘s new and what‘s coming? Cleveland Clinic Journal of Medicine, 80:153-160 Ronco G. et al., 2013. Efficacy of HPV-based screening for prevention of invasive cervical cancer: follow-up of four European randomised controlled trials. Lancet, published online November 3. Polterauer S. und Grimm C., 2012. Ergebnisse der ATHENA-Studie und deren Bedeutung für die klinische Praxis. JATROS, 4: 104-107 Jörg Berg, AKH, Linz Danke!
