Dokument_2.

Aus der Medizinischen Klinik 4 – Nephrologie und Hypertensiologie
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. Kai-Uwe Eckardt
Spannungsabhängige Natriumkanäle – Bedeutung für tonisches und
phasisches Aktivitätsmuster von Neuronen mit renalen Afferenzen
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Johannes Schatz
aus
Nürnberg
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Prof. Dr. Dr. h. c. J. Schüttler
Referent:
Prof. Dr. R. Veelken
Korreferent:
Prof. Dr. K.-F. Hilgers
Tag der mündlichen Prüfung:
29. Mai 2013
Für meine Eltern,
die mich stets unterstützt haben
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung ............................................................................................. 1
2. Einleitung ............................................................................................................ 4
3. Material und Methoden ....................................................................................... 7
3.1. Überblick über den Ablauf .........................................................................................7
3.2. Tiermodell ....................................................................................................................7
3.3. Zur elektrophysiologischen Untersuchungstechnik ...............................................8
3.1.1. Geschichte und Bedeutung der Ganzzellableitung ........................................8
3.1.2. Probleme der Ganzzellableitung und Lösungsstrategien ...........................11
3.2. Patch-clamp-Arbeitsplatz ........................................................................................14
3.2.1. Technischer Aufbau ..........................................................................................14
3.2.2. Patch-clamp-Utensilien und Lösungen ..........................................................16
3.3. Hauptversuch ............................................................................................................17
3.3.1. Fluoreszenzfärbung renaler Neurone ............................................................17
3.3.2. Gewebedissoziation und Zellkultur .................................................................19
3.3.3. Ablauf der Messungen, Konfigurationen und Protokolle .............................22
3.3.4. Current-clamp-Modus .......................................................................................23
3.3.5. Voltage-clamp-Modus.......................................................................................24
3.4. Kontrollversuch .........................................................................................................26
3.4.1. Rechtfertigung des Kontrollversuchs .............................................................26
3.4.2. Gewebedissoziation und Zellkultur .................................................................26
3.4.3. Ablauf der Messungen, Konfigurationen und Protokolle .............................27
3.4.4. Current-clamp-Modus .......................................................................................27
3.5. Auswertung – Anmerkungen und Techniken .......................................................28
3.5.1. Current-clamp-Auswertung ..............................................................................29
3.5.2. Voltage-clamp-Auswertung..............................................................................31
4. Ergebnisse ........................................................................................................ 33
4.1. Hauptversuch ............................................................................................................33
4.1.1. Ergebnisse im Current-clamp-Modus ............................................................33
4.1.2. Ergebnisse im Voltage-clamp-Modus ............................................................39
4.2. Kontrollversuch .........................................................................................................42
5. Diskussion ........................................................................................................ 44
5.1. Kontrollversuch .........................................................................................................44
5.2. Hauptversuch ............................................................................................................45
6. Einordnung in körpereigene Prozesse ............................................................ 54
7. Literaturverzeichnis .......................................................................................... 56
8. Abkürzungsverzeichnis .................................................................................... 62
9. Anhang .............................................................................................................. 63
10. Danksagung .................................................................................................... 64
11. Lebenslauf ....................................................................................................... 65
1
1. Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele
Neurone der Hinterwurzelganglien zeigen durch Stimulation hervorgerufene
elektrophysiologische Reaktionen in Form von Aktionspotentialen. Spezifisch auf
Neurone mit Afferenzen zur Niere bezogene Vordaten offenbaren während
elektrischer Stimulation voneinander abweichende Antwortverhalten – entweder als
kontinuierliche Abfolge von Aktionspotentialen (tonisches Verhalten) oder lediglich
einmalige Reaktion (phasisches Verhalten). Ausgehend von vorherigen Versuchen,
die unterschiedliche Aktivierungskurven für Natriumkanäle in Neuronen beider
Gruppen erkennen lassen, wird das Augenmerk der Untersuchungen auf
spannungsabhängige Natriumkanäle gelegt.
Die
Forschungshypothese
Natriumkanäle
eine
lautet
wichtige
nun,
Rolle
dass tetrodotoxin
für
das
Auftreten
(TTX-)
resistente
eines
tonischen
Antwortverhaltens auf Stimulationsreize an peptidergen afferenten Nervenfasern
spielen. Zusätzlich wird im Rahmen eines weiteren Versuchs ein potentieller
Einfluss
des
verwendeten
Tracers
bzw.
seiner
Trägerlösung
auf
das
Antwortverhalten untersucht.
Methoden
Die Untersuchungen werden an Neuronen der Hinterwurzelganglien vorgenommen,
die aus männlichen Sprague-Dawley-Ratten stammen. Zur Identifikation der
spezifisch renalen neuronalen Somata werden ihre Nieren mit einem farbstoffartigen
Tracer subkapsulär beimpft. In der nach einer Woche Einwirkzeit gewonnenen
Zellkultur afferenter Neurone können so renale von nichtrenalen Neuronen
unterschieden werden. Die Neurone werden mittels Patch-clamp-Technik zunächst
im Current-clamp-Modus und anschließend im Voltage-clamp-Modus untersucht.
Darüber
hinaus
vergleicht
der
Kontrollversuch
Daten
aus
Patch-clamp-
Experimenten mit neuronalen Zellkulturen, die entweder ohne jeglichen Zusatz, mit
Farbstoff oder auch mit Ethanol inkubiert werden.
Ergebnisse und Beobachtungen
Im Hauptversuch werden insgesamt etwa gleich viele tonische und phasische
Neurone gefunden. Die Wahrscheinlichkeit bei renalen Neuronen auf tonische
Neurone zu treffen, ist signifikant höher als bei nichtrenalen Neuronen. Phasische
Neurone sind im mikroskopischen Durchmesser kleiner als tonische Neurone; ein
ähnlicher Vergleich ihrer Zellkapazitäten offenbart hier aber keine signifikanten
2
Unterschiede. Die normalisierte Rheobase ist in tonischen Neuronen signifikant
geringer als in phasischen Neuronen und sinkt mit steigender Anzahl von
Aktionspotentialen.
Tonische
Neurone
sind
durch
signifikant
höhere
Schwellenpotentiale, Overshoots und längere Zeiten im Auf- und Abstrich der
Aktionspotentiale gekennzeichnet. Außerdem zeichnen sich ihre Abstriche durch
signifikant flachere Gefälle und häufigere Schulterbildung aus. Tonische Neurone
weisen im Voltage-clamp-Modus signifikant höhere Natriumgesamtstromdichten
sowie depolarisierter liegende Potentiale für die spannungsabhängige Aktivierung
auf. Die Letztgenannten korrelieren signifikant positiv mit den Overshoots und der
Dauer der Aktionspotentiale sowie negativ mit den Natriumgesamtstromdichten. Im
Kontrollversuch konnten im Hinblick auf die Hauptparameter keine signifikanten
Unterschiede
zwischen
unbehandelten,
farbstoffbehandelten
und
ethanolbehandelten Neuronen beobachtet werden.
Praktische Schlussfolgerungen
Die Ergebnisse legen ein spezifisches Innervationsmuster in Bezug auf die
vorwiegend tonischen renalen Neurone offen. Die Analyse der Aktionspotentiale
und Natriumströme gibt deutliche Hinweise für die ursächliche Beteiligung des TTXresistenten Natriumkanals Nav1.8 an diesem Verhalten, wohingegen überwiegend
TTX-sensible Natriumkanäle das Verhalten der Vergleichsneurone bestimmen. Die
angewandte Färbetechnik für renale Neurone scheint keinen Einfluss auf die
untersuchten Parameter zu haben.
Summary
Background and aims
Upon stimulation dorsal root ganglion neurons show electrophysiological reactions
in the form of action potentials. Preliminary data specifically referring to renal
afferent neurons reveal variant responses, respectively continuous firing (tonic
behaviour) or solely one-time action potentials (phasic behaviour). Based on
previous experiments which show distinct activation curves for sodium channels in
neurons of both groups, the attention is turned to voltage-gated sodium channels.
The research hypothesis is now that tetrodotoxin (TTX-) resistant sodium channels
play an important role for the occurance of tonic response upon stimulation in
peptidergic afferent nerve fibres. Additionally a potential influence of the used tracer
or its carrier solution on firing properties is investigated in yet another experiment.
3
Methods
Experiments are performed with dorsal root ganglia (DRG-) neurons from male
Sprague-Dawley rats. To identify particular renal neuronal somata, their kidneys are
inoculated subcapsulary with a dyestuff-like tracer. Like this, renal neurons can be
distinguished from non-renal ones in the obtained cell culture of afferent neurons
after a week of taking effect. The neurons are analyzed using patch clamp
technique, initially in current clamp mode and subsequently in voltage clamp mode.
Furthermore the control experiment compares data obtained in patch clamp
experiments with neuronal cell cultures which are either incubated blank, with the
dye-stuff, or with ethanol.
Results and observations
Overall about the same quantities of tonic and phasic neurons are found in the main
study. In renal neurons, tonic neurons can be found significantly more likely than in
non-renal ones. Rated microscopically, phasic neurons have smaller diameters than
tonic neurons, but a similar comparison between their cell capacities reveals no
significant differences. Normalized rheobase is significantly lower in tonic neurons
compared to phasic ones and declines with increasing numbers of action potentials.
Tonic neurons are characterized by significantly higher voltage thresholds, higher
overhoots and longer periods in upstroke and downstroke of action potentials. In
addition, their downstrokes feature significantly gentler slopes and inflections more
frequently. In voltage clamp mode tonic neurons display significantly higher total
sodium current densities and also more depolarized voltage dependences of
activation. The latter correlate significantly and positively with overshoots and the
duration of action potentials and negatively with the total sodium current densities. In
control experiment no significant differences with regards to major parameters are
noticed in untreated neurons and neurons incubated with dyestuff or ethanol.
Conclusions
The results reveal a specific innvervation pattern with regard to predominantly tonic
renal neurons. Analysis of action potentials and sodium currents strongly indicate a
causative involvement of tetrodotoxin (TTX-) resistant sodium channel Nav1.8 in this
behavior, whereas the behavior of comparison neurons is determined by
predominantly TTX-sensitive sodium channels. The applied technique for staining
renal neurons appears to have no influence on the researched parameters.
4
2. Einleitung
Im Kontext pathophysiologischer Betrachtungen häufiger Krankheitsbilder unserer
Gesellschaft, beispielsweise dem Bluthochdruck, spielt die Niere eine zentrale Rolle.
Neben der vielfältigen Beteiligung dieses Organs an humoralen Vorgängen im
menschlichen Körper liegen zunehmend Daten vor, die der renalen Innervation
einen hohen Stellenwert in der Regulation physiologischer und pathophysiologischer
Vorgänge beimessen.22 So führt beispielsweise die renale Denervation in
experimentellen Modellen der Hypertonie zu einem langsameren und geringeren
Ansteigen des Bluthochdrucks.20 Der experimentelle Ansatz konnte mittlerweile
auch in Form einer neuen Behandlungsmethode, der
katheterbasierten renalen
Denervation, auf den Menschen übertragen werden und stellt bei therapierefraktärer
arterieller Hypertonie eine gute Behandlungsalternative dar.47 Zudem führt die
Denervation zu einer Reduktion des Schadens im renalen Entzündungsmodell62,
wodurch die neuronale Achse auch in anderer Hinsicht Gegenstand aktueller
Forschungen ist.
Die bei der renalen Denervation erfassten Nervenfasern, die den Nierengefäßen
direkt anliegen, lassen sich funktionell in Afferenzen und Efferenzen gliedern.
Klinisch
bedeutsamer
zeigt
sich
bisher
der
efferente
Schenkel,
dessen
sympathische Fasern seit langem bekannte und physiologisch gut untersuchte
Effekte auf die Funktion der Niere haben. Die vom zentralen Nervensystem zu den
Nieren ziehenden efferenten Sympathikusfasern stimulieren die Reninfreisetzung im
juxtaglomerulären Apparat sowie die tubuläre Resorption von Natrium und
vermitteln
Blutflusses.
eine
Vasokonstriktion
mit
konsekutiver
Abnahme
des
renalen
21,48
Der afferente Schenkel hingegen spielt in den bisherigen Überlegungen eine
untergeordnete Rolle. Nach bisheriger Studienlage überwog die Auffassung, dass
die Afferenzen vor allem das Nierenbecken innervieren.39-41,46 Es konnte jedoch
auch gezeigt werden, dass sich die afferenten Fasern, gemeinsam mit
sympathischen Axonen verlaufend, bis in interstitielle Bereiche zwischen den Tubuli
erstrecken.23 Als primäre Neurotransmitter enthalten die Afferenzen CGRP
(calcitonin gene-related peptide) und Substanz P, die bei Anregung freigesetzt
werden können. Neben der afferenten Informationsweiterleitung sind die nervalen
Strukturen also auch in der Lage, lokal Peptide zu sezernieren und somit
möglicherweise
beeinflussen.60
die
Vasomotorik
und
diverse
Entzündungsgeschehen
zu
5
Ein Grund für die dürftige Studienlage im Hinblick auf den afferenten Teil der
Innervation liegt in der Schwierigkeit, die
Afferenzen im Bereich der Niere
elektrophysiologisch in Messungen zu erfassen.10 Im Gegensatz dazu sind die
Zellkörper der entsprechenden Axone mit vergleichsweise geringem Aufwand gut
zugänglich. Die ersten Neurone der afferenten Nervenfasern befinden sich
hauptsächlich in den Hinterwurzelganglien (DRG, dorsal root ganglia), der
Segmente T6-L4, wobei der Hauptteil der Somata in den Segmenten T12-L3
lokalisiert ist.26,65 Diese Nervenzellen können durch retrograde Anfärbung mit
Fluoreszenzfarbstoffen von anderen Neuronen in den Ganglien mikroskopisch
unterschieden werden. In entsprechenden Vorarbeiten ist diese Technik bereits
erfolgreich zum Einsatz gekommen, um renale Afferenzen anzufärben.23 Für
elektrophysiologische Untersuchungen können diese zum Beispiel nach Entnahme
in Form einer Zellkultur zugänglich gemacht werden.
Bisherige Untersuchungen unserer Forschungsgruppe an solchen Zellkulturen
konnten Unterschiede im elektrophysiologischen Antwortverhalten hinsichtlich der
Säuresensitivität von Hinterwurzelganglienneuronen mit renalen Afferenzen im
Vergleich mit Afferenzen aus anderen Gebieten in den gleichen Ganglien sichtbar
machen. Die nichtrenalen Afferenzen kommen in diesem Falle, wie an Ratten
gezeigt,
hauptsächlich
von
Gefäßen
der
Hinterbeine.45
Die
Unterschiede
manifestieren sich hier im Antwortmuster auf Stimulation an diesen Neuronen und
ihrer Axone. Rechteckförmige Strominjektionen führen bei den kultivierten Neuronen
zur Aktionspotentialbildung, wobei ein Teil der Zellen mit lediglich einem
Aktionspotential reagierte, wohingegen andere mehrere Aktionspotentiale zeigten.
Interessanterweise ergab eine weitergehende Auswertung, dass die repetitiv
antwortenden „tonischen“ Neurone vor allem bei Afferenzen der Niere zu finden
sind, wohingegen die singulär antwortenden „phasischen“ Zellen in der renal
afferenten Innervation weniger häufig vorkommen. Dieses Bild entspricht nicht dem
vergleichbaren Durchschnitt der Afferenzen aus anderen Körperregionen, in denen
umgekehrte Relationen gefunden werden.23 Daher liegt der Verdacht einer im
Hinblick auf die Aktionspotentialmuster nierenspezifisch ausgerichteten Innervierung
nahe.
Letztlich ist der genaue Mechanismus, weshalb sich diese Zellen in den
Eigenschaften „tonisch“ und „phasisch“ unterscheiden, bisher ungeklärt. Ausgehend
von grundlegenden physiologischen Überlegungen müssen mehrere in DRGNeuronen vorkommende Ionenkanaltypen besondere Beachtung finden, die zur
Entstehung von Aktionspotentialen beitragen. Zum Spektrum der Kanäle zählen u.a.
Natriumkanäle, Kalziumkanäle, Kaliumkanäle, TRP-Kanäle (transient receptor
6
potential channels) und protonenaktivierte Kanäle (acid-sensining ion channels). Die
Aktivierung dieser Kanäle führt entweder zu einem Einstrom von Ionen in die Zellen
oder zu einem Ausstrom von Ionen aus den Zellen. Durch Einstrom von Neuronen
oder durch die Inhibierung des Ausstroms kann eine Depolarisation der
Zellmembran entstehen, die das Membranpotential in Richtung Erregungsschwelle
drängt.43
In Vorversuchen der Arbeitsgruppe verdichteten sich die Hinweise, dass sich die
durch Depolarisation evozierten Einwärtsströme in tonischen und phasischen
Zellen unterscheiden. Diese Einwärtsströme sind aufgrund ihrer raschen Kinetik
vermutlich vor allem auf die Öffnung von Natriumkanälen zurückzuführen.
Spannungsaktivierte Natriumkanäle sind an der Generierung von Aktionspotentialen
und deren Fortleitung in erregbaren Zellen, vor allem Neuronen, aber auch
Muskelzellen und neuroendokrinen Zellen, beteiligt. Sie gehören zu einer einzigen
Kanalfamilie, in der eine strukturelle Unterscheidung anhand ihrer 9 verschiedenen
α-Untereinheiten erfolgt. Die α-Untereinheit bildet als Kern des Kanals die Pore für
die Ionenbewegung und ist auch bei alleiniger Expression vollständig funktionell.
Zusätzliche
β-Untereinheiten
stabilisieren
den
Kern,
indem
sie
mit
Adhäsionsmolekülen, der extrazellulären Matrix und dem Zytoskelett interagieren,
und
modifizieren
die
Kinetik
und
Spannungsabhängigkeit
des
gesamten
Membrankomplexes. Bisher sind 9 verschiedene Natriumkanaltypen in Säugern
identifiziert worden, die sich durch pharmakologische und elektrophysiologische
Methoden differenzieren lassen.7 Einige Typen der Natriumkanäle sind auch
funktionell aktiv in DRG-Neuronen der Ratte exprimiert und nehmen dort in
unterschiedlicher Art und Weise Einfluss auf die Aktionspotentialgenerierung und
somit auf das elektrophysiologische Verhalten der Neurone in vivo und in vitro.66
Es soll nun im Hinblick auf das unterschiedliche Antwortverhalten bei renalen
Afferenzen geklärt werden, inwieweit die Eigenschaften „tonisch“ und „phasisch“ von
verschiedenen Natriumkanaltypen beeinflusst oder mitgeprägt werden. Diese
Aufgabenstellung umfasst insbesondere auch die Fragestellung, welche Rolle
sogenannte TXX-resistente Natriumkanäle für das Auftreten des tonischen
Verhaltens bei renalen Afferenzen spielen.
7
3. Material und Methoden
3.1. Überblick über den Ablauf
Die Untersuchung der in der Fragestellung thematisierten neuronalen Eigenschaften
erfolgt in vitro an Rattenneuronen. Dafür werden im Hauptversuch die Neurone von
der afferenten Endigung in der Niere her etwa eine Woche vor der abschließenden
elektrophysiologischen Untersuchung mit einem Farbstoff angefärbt. Nach einigen
Tagen retrograder Wanderung die Zellsomata im Hinterwurzelganglion erreichend,
erlaubt die Anfärbung die mikroskopische Identifikation von renalen Neuronen
gegenüber Neuronen mit Afferenzen nichtrenaler Herkunft auch in der anschließend
hergestellten Zellkultur. In der folgenden Woche werden jene Hinterwurzelganglien
dem Versuchstier entnommen, die den überwiegenden Anteil der Nervenzellkörper
der an der renal afferenten Innervation der Niere beteiligten Neurone enthalten, und
die Zellen dann in Zellkultur gebracht. Am ersten und zweiten Tag nach Herstellung
der Zellkultur erfolgen die elektrophysiologischen Untersuchungen mittels Patchclamp-Technik. Ergänzend zur Hauptversuchsreihe wird ein Kontrollversuch
durchgeführt, der den direkten Einfluss des Farbstoffs in Form von Veränderungen
in der Elektrophysiologie der neuronalen Zellen überprüft. Eine detaillierte
Beschreibung der jeweiligen Vorgänge wird in den nun folgenden Punkten
vorgenommen.
3.2. Tiermodell
Als Versuchstiere für beide Versuchsteile dienen männliche Sprague-Dawley-Ratten
(Charles River, Deutschland). Die Haltung der Ratten erfolgt in Tierställen bei einer
Raumtemperatur von 24±2 Grad Celsius. Die Ernährung der Ratten wird mit frei
zugänglichem
Leitungswasser
und
Standardtrockenfutter
(1324,
Altromin,
Deutschland) sichergestellt. Zum Zeitpunkt der Gewinnung der neuronalen Zellen
waren die 9 verwendeten Ratten im Hauptversuch durchschnittlich 265,6g (min.
195g, max. 393g) schwer. Im Gegensatz dazu umfasste der Kontrollversuch 13
Ratten mit durchschnittlich 211g (min. 151g, max. 270g). Die Haltung sowie der
Ablauf der Prozeduren entsprechen den Richtlinien der American Physiological
Society, liefen gemäß bundesdeutschen Gesetzen ab und waren durch die
zuständigen Behörden genehmigt.
8
3.3. Zur elektrophysiologischen Untersuchungstechnik
3.1.1. Geschichte und Bedeutung der Ganzzellableitung
Bereits im 18. Jahrhundert stellte der italienische Arzt Galvani (1727-1798)
Hypothesen auf, die die Funktion einer Nerven- oder Muskelzelle auf Basis von
unterschiedlichen elektrischen Zuständen beschreiben. Seine Vermutung, das
Innere der Nerven und Muskeln hätte andere elektrische Eigenschaften als das
Äußere, nahm die erst viel später erkannte zentrale Rolle der Zellmembran in ihrer
Funktion als partiell permeabler Regulator der elektrophysiologischen Vorgänge an
erregbaren Membranen vorweg. Im folgenden Jahrhundert erhärtete sich die
Hypothese des Potentials zwischen Oberfläche und Innerem, indem BoisReymonds (1818-1896) in Elektrodenableitungen erstmals der Nachweis von
Spannungsschwankungen in der Erregungsphase von Muskeln und Nerven gelang.
Die Entdeckung der elektrischen Reizweiterleitung ermöglichte es Helmholtz (18211894), die Geschwindigkeit der Reizleitung in einem Froschnerven zu messen. Der
völlig unbekannte Mechanismus dieses Phänomens zwang die Wissenschaft in den
folgenden Jahrzehnten zu Erklärungsmodellen, die Anfang des 20. Jahrhunderts in
den Hypothesen Bernsteins (1839-1917) gipfelten, die den heutigen Vorstellungen
zur Entstehung des Membran- und Aktionspotentials erstaunlich nahekommen. Eine
Art
Durchbruch
bedeutete
die
Ende
der
1930er
Jahre
entwickelte
Spannungsklemme mit zwei in die Zelle eingeführten Elektroden, die eine Erhöhung
der Membranleitfähigkeit einer Nervenzelle bei Erregung nachwies. Eine Elektrode
dient in dieser Anordnung als kontinuierlicher Spannungssensor, der die andere
Elektrode als Stromquelle so steuert, dass eine konstant vorgegebene Spannung
zwischen Zellinnerem und Badelektrode vorliegt. Auf Grundlage dieser Technik
gelang es Hodgkin (1914-1998) und Huxley mit der heute
noch gültigen
Ionentheorie der Erregung, die für die Entstehung von Aktionspotentialen
ursächlichen Natrium- und Kaliumströme über die Nervenzellmembran zu
entdecken
und voneinander
zu
differenzieren. Wichtiger
Bestandteil
ihrer
Erkenntnisse war dabei auch, dass nicht etwa aktive „Carrier“, sondern
spannungsaktivierte Kanäle die Durchtrittsstellen für die jeweiligen Ionen bilden. Der
Nachweis dieser Einzelkanäle jedoch war dem Patch-clamp-Verfahren vorenthalten,
für dessen Entwicklung Neher und Sakman 1991 den Nobelpreis erhielten.
In seiner ursprünglichen Form zielt das Verfahren darauf ab, Einzelkanalströme an
erregbaren Membranen zu untersuchen. Hierfür kommt neben der Badelektrode nur
eine Elektrode zum Einsatz, die kontinuierlich für Spannungsmessung und
9
Strominjektion
benutzt
wird.
Die
grundsätzliche
Problematik
bei
der
Einzelkanalstrommessung ergibt sich aber aus der Größe der zu erwartenden
Ströme. Diese befinden sich aufgrund des Hintergrundrauschens, hervorgerufen
durch unzählige geöffnete Kanäle und Ionentransporter, in einem für konventionelle
Messmethoden unzugänglichen Bereich. Die revolutionäre Lösung liegt in der
Verwendung von gläsernen Pipetten, die einen kleinen Abschnitt der Membran von
der gesamten anderen Zellmembran elektrisch isolieren. Zusätzlich gelang in der
Folgezeit die Entwicklung der Gigasealtechnik, die den Abdichtwiderstand zwischen
Membran und Pipette vom vorher relativ niedrigohmigen (ca. 50MΩ) in den
Gigaohmbereich erhöht. Somit können in dieser sogenannten „Cell-attachedKonfiguration“ die entstehenden kurzen Rechteckströme, die die Öffnung eines
einzelnen aktivierten Kanals unter der Pipettenöffnung widerspiegeln, mit geringem
Hintergrundrauschen sichtbar gemacht werden. Die feste Verbindung, die die
Lipiddoppelschicht in der „Cell-attached-Konfiguration“ mit der Patchpipette eingeht,
ermöglicht
zudem
die
Manipulation
des
Membranflecks,
sodass
weitere
Konfigurationen für die Messung von Strömen unter bestimmten Bedingungen,
beispielsweise der Modifikation des intra- sowie des extrazellulären Milieus, möglich
sind.
Eine dieser Konfigurationen, die bei uns während aller Messungen angewandte
„Whole-cell-Konfiguration“, erhält man, indem der Membranfleck unter der
Pipettenöffnung im Anschluss an die Cell-attached-Konfiguration mit leichtem
Unterdruck zerstört wird und somit eine direkte Verbindung zwischen Zellinnerem
und Pipetteninnerem entsteht:
10
Abbildung 1: Herstellung der Whole-cell-Konfiguration
In dieser vorliegenden Ganzzellableitung wird es dem Untersucher nun möglich,
Ströme über die gesamte Membran der Zelle als Summenströme vieler Kanäle zu
messen. Binnen kurzer Zeit vermischt sich zudem die großvolumige Pipettenlösung
mit der kleinvolumigen intrazellulären Flüssigkeit und ersetzt diese damit praktisch
in ihrer Zusammensetzung. Befinden sich die Zellen zusätzlich in einer
austauschbaren Badlösung, ist es somit möglich, sowohl die Zusammensetzung des
Intrazellularraums als auch die des Extrazellularraums je nach Zweck der
Untersuchung zu variieren.
Die
Messanordnung
erlaubt
neben
der
hier
beschriebenen
Spannungsklemmanordnung („Voltage-clamp-Modus“) mit vorgegebener Spannung
und
variabel gelassenen Strömen auch die Stromklemmanordnung („Current-
clamp-Modus“). In diesem Fall werden die injizierten Ströme kontrolliert und man
kann Veränderungen des Membranpotentials als Darstellung eines physiologischen
11
Erregungsmusters analysieren.49 Beide Techniken sind in dieser Arbeit Teil der
Zellanalyse und kommen bei jeder Zelle nacheinander sukzessiv zur Anwendung.
3.1.2. Probleme der Ganzzellableitung und Lösungsstrategien
Im Zuge der Anwendung der Whole-cell-Konfiguration stellen sich leider auch
diverse Probleme ein, auf die in diesem Rahmen in Gänze nicht eingegangen
werden kann. Dennoch soll hier ein Überblick über die Kernproblematiken und die
zur vorliegenden Arbeit entwickelten Lösungsstrategien zur Behebung bzw.
Minimierung von Fehlerquellen gegeben werden.
Im Fokus stehen der elektrische Widerstand RP (Pipettenwiderstand), verursacht
durch die schmale Öffnung der Pipette, der Serienwiderstand RS, entstehend aus
der Addition von RP und dem Zugangswiderstand zur Zelle, der Widerstand der
Zellmembran RM
und die Kapazität der Zelle CM, die mit steigender Zellgröße
ebenfalls wächst (s. Abb. 2).
Abbildung 2: Überblick über die beteiligten physiologischen Größen in der
Whole-cell-Konfiguration (modifiziert nach: Numberger M.,
Draguhn A.: Patch-Clamp-Technik. Spektrum Akademischer
Verlag. Heidelberg: 1996, S. 89)
Am Anfang eines jeden Spannungswechsels, wie er in vielen Protokollen im
Voltage-clamp-Modus vorkommt, fließen je nach Größe des Kompensators,
welchen die Pipette selbst wie auch die Zellmembran darstellt, mehr oder weniger
große kurzfristige kapazitative Ströme. Durch sie kann der Verstärker kurzzeitig
abgesättigt sein, wodurch die Spannungskontrolle über die Zelle intermediär
ausfällt. Insbesondere bei der Messung von Natriumströmen, die in den ersten
Millisekunden eines Spannungswechsels evoziert werden, stören die gleichzeitig
sichtbaren kompensatorischen Ströme außerdem zusätzlich die Beurteilung dieser
12
Ströme. Daher wurde die Kapazitätskompensation für Pipette und Zelle - wie bei
solchen Messungen üblich– eingesetzt, um eine Übersättigung des Verstärkers zu
vermeiden und die Artefaktgröße zu reduzieren, sodass die Spannungskontrolle
hinreichend gegeben ist und Strommessungen über die Membran leichter
ausgewertet werden können.49
Hinzu kommt, dass die Zeit bis die Zelle bei einem Wechsel der Sollspannung
umgeladen ist, einerseits von der Kapazität des Kompensators – in unserem Fall
der Zellgröße- und andererseits von dem durch den Strom zu überwindenden
Widerstand RS abhängt; allem voran stellt sich beim Studium weiterführender
Literatur
der
sich
im
Verlauf
der
Messungen
potentiell
verändernde
Serienwiderstand RS als bedeutende Variable in Bezug auf die Spannungskontrolle
in der Zelle dar. Wichtig ist in diesem Zusammenhang das Verhältnis des
Zugangswiderstands
RS
Zugangswiderstand
einen
zum
Membranwiderstand
möglichst
geringen
RM,
Wert
in
dem
gegenüber
der
dem
Membranwiderstand besitzen soll.49 Da weder die Zellkapazität verändert werden
kann noch der Membranwiderstand in unserem ursprünglichen Messverfahren
modifiziert wird, fällt der Minimierung des Serienwiderstandes somit große
Bedeutung zu, will man DRGs für die Natriumkanalmessung unter ausreichende
Spannungskontrolle bringen.
Grundsätzlich wurden deshalb nur relativ große, niederohmige Pipetten mit
Pipettenwiderständen zwischen 1 MΩ und 3 MΩ für die Messungen zugelassen.
Ausschlusskriterium für die Zulassung zu unseren Messreihen waren außerdem
Werte im Zugangswiderstand, die 6 MΩ initial nach dem Herbeiführen der Wholecell-Konfiguration überschritten und Membranwiderstände, die das Zehnfache des
Zugangswiderstands unterschritten.
Unabdingbar im Vorfeld der eigentlichen Messungen sind Vorkehrungen zur
Kompensation des Serienwiderstands. Bei richtiger Umsetzung dieser Maßnahmen
beschleunigen sie die Umladung der Zellmembran. In unserem Fall wurde für alle
Zellen eine mindestens 75%ige Kompensation gefordert. Da sich die Messungen
über mehrere Minuten hinziehen, wird die Kompensation immer wieder überprüft
und erneut angepasst. Die Verwendung von EGTA als Kalziumpuffer in der
Pipettenlösung soll zudem dazu beitragen, ein „Resealing“ in Form eines erneuten
Verschlusses der Membran und damit einen ansteigenden Serienwiderstand zu
verhindern.
Ein bedeutendes Problemfeld stellt die Größe der Natriumströme in den
gemessenen Nervenzellen dar. Erhobene Strom-Spannungs-Kennlinien im Vorfeld
der eigentlichen Messreihen offenbarten bereits, dass im Voltage-clamp-Modus die
13
Spannungskontrolle
in
fast
allen
Zellen
bei
normaler
extrazellulärer
Natriumkonzentration von 140 mmol/l (s. Lösung 1, Lösungszusammensetzungen:
s. Anhang) unzureichend ist. Deshalb wurde der Entschluss gefasst, die
extrazelluläre Natriumkonzentration für die Messung der Natriumströme mit einem
Lösungswechsel im Bassin drastisch auf 30mmol/l (s. Lösung 2) zu senken, was
dazu führt, dass hier Zellen bis zu einer Kapazität von 107,42pF unter ausreichend
guter Spannungskontrolle erfolgreich gemessen werden können.
Die mangelnde Spannungskontrolle in der Peripherie verzweigter Nervenzellen, oft
als „Space-clamp-Problematik“ beschrieben, wurde in mehrfacher Hinsicht zu
umgehen versucht.64 Einerseits wird durch die spezielle Dissoziation der Zellen für
die Zellkultur eine möglichst runde Form der Zellen erreicht, zum anderen gilt die
Prämisse, im Auswahlverfahren bevorzugt Zellen für die Messungen heranzuziehen,
die im Mikroskop kompakt wirken und möglichst geringe Abweichungen von einer
runden Form zeigen. Um interzelluläre Interaktionen auszuschließen, richtet sich
besonderes Augenmerk auch auf benachbarte gliale und neuronale Zellstrukturen,
die
auf
dem
Deckglas
möglichst
keinen direkten
Kontakt
mit
dem
zu
untersuchenden Neuron aufweisen sollen.
Neben der Reduzierung der extrazellulären Natriumkonzentration wird der Wechsel
des extrazellulären Mediums nach den erfolgreich durchgeführten Current-clampMessungen auch dafür genutzt, die Natriumströme pharmakologisch von anderen
Stromkomponenten, die man in der „Whole-cell-Konfiguration“ als normalerweise
regulär
auftretende
Kalziumströme
Summenströme
mit
erfasst,
zu
trennen.
So
werden
durch Beimischung von Cadmiumchlorid unterdrückt. Hohe
Konzentrationen von TEA und 4-Aminopyridin haben die Aufgabe vor allem
Ionenströme spannungsaktivierter Kaliumkanäle zu vermindern.12,64 Der Block der
Kaliumkanäle erfolgt im Vergleich zum Ausgangszustand zwar in großem Umfang,
es bleibt jedoch in allen Messungen eine kleine Kaliumstromkomponente zurück,
die
ihr
Maximum
jedoch
zeitlich
erkennbar
nach
dem
Maximum
der
Natriumstromkomponente erreicht. Deshalb wird, obwohl es sich in den Messungen
wohl um Natrium-Kalium-Mischströme handelt, davon ausgegangen, dass die
Messungen zum ganz überwiegenden Teil reale Natriumströme widerspiegeln.
Dementsprechend werden diese Ströme nachfolgend auch als Natriumströme
bezeichnet.
14
3.2. Patch-clamp-Arbeitsplatz
3.2.1. Technischer Aufbau
Für die Durchführung der Patch-clamp-Experimente steht ein bereits über Jahre
bestehendes System zur Verfügung, dessen Aufbau in Abbildung 3 schematisch
dargestellt ist:
Abb. 3:
Schema des Arbeitsplatzes
Bis auf Oszilloskop, Verstärker, Analog-Digital-Wandler und PC sind sämtliche
Aufbauten auf einem Tisch mit einer massiven und damit trägen Granitplatte
montiert. Da bisher keine Störungen der Messungen durch äußere Einflüsse
beobachtet
wurden,
ist
eine
sonst
bei
diesen
Einrichtungen
übliche
Schwingungsdämpfung der Tischplatte bei dem gegenwärtigen Standort der Anlage
im Keller des Hauses nicht nötig. Den Arbeitsplatz umgibt ein Faraday-Käfig, der die
sensible Messtechnik vor elektromagnetischen Einflüssen, herrührend einerseits
von benachbarten Elektroinstallationen und andererseits von heutzutage vielfältigen
Störeinflüssen
wie
beispielweise
elektromagnetischen
Interferenzen
durch
Handystrahlung abschirmt.
Das zentrale Element der insgesamt geerdeten Anlage stellt ein inverses Mikroskop
(Wilovert S, Hund, Deutschland) dar, das sich entkoppelt vom Rest der Anlage
kugelgelagert
unter
dem
Mikroskoptisch
hindurch
bewegen
lässt.
Ein
Mikromanipulator (Leica Micromanipulator, Leica, Deutschland) steht fest auf der
Granitplatte und trägt über ein Winkeleisen den benachbarten Mikroskoptisch, auf
dem sich das Perfusionsbecken für die Zellen befindet. Zur Untersuchung der Zellen
werden die kulturtragenden Deckgläschen in dieses Patch-Bassin gesetzt und dort
15
fixiert. Der Mikromanipulator selbst kontrolliert die Bewegungen der Ableitelektrode
und die der sie umgebenden Patchpipette, wobei die Elektrode über den
Pipettenhalter direkt mit dem Vorverstärker (CV 203BU, Axon instruments, USA)
verbunden ist. Erst durch den Manipulator sind Arbeitsschritte im µm-Bereich
möglich, was unbedingt nötig ist, um die Pipette filigran an eine ausgewählte Zelle in
der Kammer heranzuführen. Als Badelektrode kommt eine Ag/AgCl – Elektrode zum
Einsatz, die über ein Kabel mittels Steckverbindungen ebenfalls mit dem
Vorverstärker verbunden ist.
Das Becken selbst kann ausgehend von 6 Lösungsdepots über ein Schlauchsystem
kontinuierlich perfundiert werden, wobei der Fluss im Schlauchsystem über eine
Perfusionsanlage (Perfusionssystem PF8, E.S.F.electronic, Deutschland) gesteuert
werden kann. Der Perfusionsfluss über die Zellen hinweg beträgt bei der Benutzung
eines einzelnen Schlauchs etwa 1ml/min und wird entweder manuell an einer
Schalteinheit oder via PC geregelt, sodass der Inhalt des Perfusionsbeckens
gleichzeitig oder sukzessiv mit verschiedenen Lösungen gefüllt werden kann.
Zur
Identifikation
fluoreszenzgefärbter
Neurone
befindet
sich
ein
frequenzverdoppelter Neodym-YAG-Laser (DPGL-3010, 10mW, 532nm ≙ grün,
modifizierter Laser, Polytec, Deutschland) über dem Objekttisch und regt mit seinem
Licht den Farbstoff DiI in der Membran zur Emission bei einer Wellenlänge von
564nm an. Um dieses orangerote Licht vom starken Grün des Lasers zu
unterscheiden, ist im Mikroskop ein Langpassfilter mit 550nm Grenzwellenlänge (LP
550, AHF Analysetechnik, Deutschland) verbaut, der praktisch nur Emissionslicht
passieren lässt.
Außerhalb des Faraday-Käfigs ist der Verstärker (Axopatch 200B, Axon
Instruments, USA) angebracht, der über ein Steuerkabel mit dem Vorverstärker
verbunden ist. Die Signalauswertung erfolgt mit einem digitalen Speicheroszilloskop
(HM 205-3, Hameg, Deutschland) und einem über einen Analog/Digital-Wandler
(DIGIdata 1200, Axon Instruments, USA) angeschlossenen Computer (IBMkompatibler Desktop-Computer mit Intel Pentium III®-Prozessor und Microsoft
Windows® XP Betriebssystem).
16
3.2.2. Patch-clamp-Utensilien und Lösungen
Zur Herstellung von Pipetten steht ein Pipettenziehgerät (PP-830, Narishige, Japan)
zur Verfügung, das aus einem Rohling in einem zweistufigen Heiz- und Zugprozess
zwei fast identische Pipetten herstellt. Im ersten Arbeitsschritt wird durch den Heizer
im Wesentlichen die Taille der Pipetten geformt, mit dem zweiten Schritt kann die
durch das Auseinanderziehen des Rohlings in zwei etwa gleich große Pipetten
entstehende
Pipettenöffnung
in
ihrer
Größe
modifiziert
werden.
Als
Ausgangsmaterial für die Pipetten dienen Borosilitglaskapillaren mit einem
Außendurchmesser von 1,5mm, einem Innendurchmesser von 0,8mm und 8cm
Länge (GB150-F-8P, Science Products, Deutschland).
Die exakten Spezifikationen der extra- und intrazellulären Lösungen, mit denen das
Bassin perfundiert wird, sind dem Anhang zu entnehmen. Die intrazelluläre
Pipettenlösung wird, um Schwebeteilchen zu entfernen, zunächst gefiltert und in
Eppendorf-Cups zu je 1ml portioniert. Bis zu ihrer Verwendung sind alle Cups bei 20°C gefroren eingelagert. Die Herstellung der extrazellulären Lösung (Lösung 1),
mit der die Zellen im Kontrollversuch ausschließlich, im Hauptversuch nur zunächst
überspült werden, erfolgt in vierfacher Konzentration und ohne Glukosezusatz.
Nachdem die Lösung gleichermaßen bei -20°C bis zur Verwendung aufbewahrt
wird, gibt man nach dem Auftauen die entsprechende Menge Zucker hinzu und
verdünnt sie mit destilliertem Wasser. Lösung 2 wird wie o.g. Lösungen gelagert und
entspricht in ihrer Zusammensetzung einer modifizierten Lösung von Uebachs et
al.61, wobei die Natriumkonzentration im Gegensatz zur Vorlage noch weiter auf
30mmol/l abgesenkt ist.
Alle Lösungen werden mindestens einer Qualitätskontrolle
bei der Herstellung
sowie einer weiteren kurz vor ihrer Verwendung in puncto Gesamtosmolalität
(Osmomat 030, Gonotec, Deutschland) unterzogen. Alle eingesetzten Lösungen
zeigen bei der Messung Werte zwischen 275mosm und 305mosm, wobei auf einen
Patchtag bezogen die maximale Differenz von 12mosm zwischen den sukzessive
verwendeten Lösungen 1 und 2 erreicht wird. Zum Einsatz kommen nur Lösungen
mit Raumtemperatur.
17
3.3. Hauptversuch
3.3.1. Fluoreszenzfärbung renaler Neurone
Um die Unterscheidung der Zellsomata der Neurone in der Kultur vorzunehmen,
wird auf ein bereits etabliertes Verfahren zur Anfärbung der Neurone in vivo
zurückgegriffen. Der Fluoreszenzfarbstoff DiI (Molecular Probes/Invitrogen, USA)
wurde in mehreren Tiermodellen für eine retrograde Darstellung sensorischer
Afferenzen verwendet, u.a. zur Darstellung der Innervation des Herzens durch
Neurone im Ganglion nodosum und der Nieren, der hinteren Extremitäten und der
Bandscheiben durch Neurone in DRGs.14,15,23,27,42,44,45,59 In Alkohol in Lösung
gebracht, gelangt der Farbstoff dabei nach Applikation auf afferente Endigungen
innerhalb weniger Tage über membranöse Diffusion hin zum Nervenzellsoma, ohne
anliegende Fasern zu beeinträchtigen. Die Konzentration des in 70% Alkohol
gelösten Farbstoffs liegt in unserer Hauptversuchsreihe bei 20mg/ml.
Nach einer Einwirkzeit von 7 Tagen kann die Anfärbung der Neurone nach
Entnahme der Hinterwurzelganglien gut nachvollzogen werden (s. Abb. 4).
Abbildung 4: Darstellung eines Hinterwurzelganglions in der
Fluoreszenzlichtaufnahme. Helles Orange kennzeichnet wenige,
zum Teil in Zellhaufen organisierte, retrograd angefärbte
Neurone mit renalen Afferenzen. (Mikroskop: Nikon Eclipse 80i,
Exitationsfilter 540nm/25nm, Emissionsfilter 605nm/55nm,
Vergrößerung: 50-fach)
18
Zum Einbringen des Farbstoffs in die Ratten werden diese zunächst in einer
abgeschlossenen Plastikkammer gehalten, in die man zur Narkoseeinleitung mittels
eines Narkosegeräts (Trajan808, Drägerwerk, Deutschland) ein Inspirationsgemisch
mit 4 Vol.-% verdampftem Isofluran (Forene®, Abbott, Deutschland) unter einem
Fluss von 0,5l Sauerstoff/min und 0,5l Lachgas/min (Linde Industrial Gases,
Deutschland) einleitet. Zur Aufrechterhaltung der Anästhesie werden die Ratten
anschließend aus der
Kammer
Isoflurananteils auf 1,5 Vol.-%
entnommen und
unter
Reduzierung
des
mit einer Atemmaske während der gesamten
Prozedur in Narkose gehalten.
Nach Entfernung des Fells an den betreffenden Stellen und gründlicher Desinfektion
wird mit einer möglichst kleinen dorsolateralen Inzision kaudal des Rippenbogens
zunächst einseitig der Zugang zum oberen Nierenpol angegangen. Nach
Freipräparation der Niere sowie des anliegenden perirenalen Fettgewebes, was
immer problemlos erfolgen konnte, wird unter Verwendung eines Mikroskops (M
650, Leica, Deutschland) 5-10l des gelösten Farbstoffes DiI mit einer schmalen
Glaskapillare aus Borosilikatglas (GB150-F-8P, Science Products, Deutschland)
subkapsulär in die Niere injiziert. Die Glaskapillare wird dabei über einen Schlauch
an eine 0,1ml fassende Spritze (Microliter® 710, Hamilton Bonaduz, Schweiz)
angeschlossen, um die genaue Menge an Farbstoff dosieren zu können. Nach
sorgfältiger Kontrolle von möglichen Leckagen an der Injektionsstelle ist es möglich,
die langsame Verteilung des Farbstoffdepots unter der Nierenkapsel makroskopisch
zu begutachten und nach einigen Sekunden die Kapillare vorsichtig zu entfernen.
Geringe Verunreinigungen mit Farbstoff im Injektionsbereich können, falls überhaupt
nötig, mit einem sterilen Tupfer gesäubert werden. Im Folgenden werden
sukzessive zunächst Muskel und dann Haut durch Einzelknopfnähte (Prolene 4-0,
Ethicon, Deutschland; Supolene 3,5-0, Resorba, Deutschland) wieder vernäht. Auf
der kontralateralen Seite erfolgt dann die Anfärbung in identischer Prozedur.
Insgesamt kann man den Vorgang mit geübter Hand in etwa 20 Minuten
abschließen.
Die Tiere überstanden die Narkose ausnahmslos gut und konnten nach kurzer
Erholungszeit bei 100 Vol.-% Sauerstoffzufuhr zurück in den Tierstall gebracht
werden. Die Wunden erwiesen sich im postoperativen Verlauf allesamt als nicht
entzündet und unmittelbar vor Entnahme der Nervenzellen zur Zellkulturanfertigung
gut verheilt.
19
3.3.2. Gewebedissoziation und Zellkultur
Die Aufarbeitung des Gewebes orientiert sich grundsätzlich an der Methodik von
Sharma et al.57, die von Linz zunächst modifiziert auf Neurone des Ganglion
nodosum und später durch Linz bzw. Ditting auch auf DRGs angewandt
wurde.12,14,27,45
Bei den Ratten wird die Narkose, wie oben bereits zur Vorbereitung auf den
Färbevorgang beschrieben, durch Beimischung von 4 Vol.-% Isofluran zu Sauerstoff
und Lachgas eingeleitet. Es unterbleibt nun lediglich die Aufrechterhaltung der
Narkose
durch
Reduktion
des
Isoflurananteils,
sodass
der
Tod
durch
Atemdepression beim Versuchstier bei gleichbleibender Luftzusammensetzung in
der geschlossenen Kammer sehr zügig eintritt. Anschließend wird die Ratte von
dorsal her mit einem V-förmigen Hautschnitt eröffnet und die Wirbelsäule vom
thorakalen bis zum sakralen Anteil dargestellt. Anhand der Rippenansätze können
die einzelnen Wirbel identifiziert werden, um anschließend die Wirbelsäule auf Höhe
Th11
und
L2
mit
Wirbelsäulenabschnitt
einer
Schere
zu
durchtrennen
und
den
gesamten
zu entnehmen. An dem entfernten Stück wird der
Wirbelkanal von apikal bzw. kaudal entlang der Dornfortsätze eröffnet und die
entstehenden Hälften nach lateral weggeklappt. Unter dem Mikroskop können nun
unter Zuhilfenahme von Mikroschere und Mikropinzette (Fine Science Tools®,
Deutschland) das Rückenmark bzw. abgehende Fasern mobilisiert und in den
Wirbelzwischenräumen, von medial aus gesehen als kleine Vertiefungen erkennbar,
die jeweiligen DRGs lokalisiert werden. Auf Grundlage eigener Voruntersuchungen
sowie Erkenntnissen aus der Literatur liegt das Hauptinteresse bei den Ganglien auf
Höhe Th11 bis L2, die den Hauptanteil an renal-afferenten Zellkörpern enthalten.38
Die Freipräparation soll möglichst atraumatisch erfolgen, indem ohne direkten
Ansatz der Pinzette am Ganglion die Faserverbindungen abgeschnitten und die
DRGs entnommen werden. Die gewonnenen Ganglien werden direkt in eine mit 1,5
ml PBS-Puffer (Biochrom, Deutschland) gefüllte Petrischale (Falcon® 353001,
Becton Dickinson Labware, USA) überführt und dabei mit leichtem Schwenken
Verunreinigungen abgeschwemmt. Die Entnahme sollte zügig erfolgen, um die
Vitalität der Zellen nicht unnötig zu beeinträchtigen.
Die weiteren Schritte zur Herstellung der Zellkultur werden ab diesem Zeitpunkt in
einer Sterilbank des Labors vorgenommen, um eine versehentliche Keimbesiedlung
zu verhindern. Den PBS-Puffer, in den die Ganglien gelegt wurden, verwirft man
zunächst möglichst vollständig. Bei stärkerer Verunreinigung des entnommenen
Gewebes, vor allem mit Blut, kann ein weiterer Waschschritt mit 1,5ml Puffer nötig
20
werden. Es erfolgt nun die enzymatische Trennung der Bindegewebsstrukturen, in
denen sich die Neurone noch befinden, indem die Ganglien mit 1ml KollagenaseLösung (Typ IA, Sigma-Aldrich, USA; c=4mg/ml in DMEM, Gibco/Invitrogen, USA)
versetzt werden. Um einen raschen Fortgang der enzymatischen Trennung zu
gewährleisten, ist es ratsam, die Petrischale während der einstündigen Inkubation
bei 37 Grad Celsius im Brutschrank (Heracell 240, Heraeus, Deutschland) unter
Umständen mehrere Male leicht zu schwenken. Nach der 60-minütigen Behandlung
sind
die
Neurone
im
Mikroskop
im
Idealfall
schon
einzeln
durch
die
Bindegewebshülle zu sehen, wenngleich sie sich durch diese noch insgesamt in
einem Verband befinden.
Im Folgenden werden die Ganglien einer mechanischen Dissoziation unterzogen,
sodass letztlich möglichst einzelne runde Nervenzellen zur weiteren Verarbeitung
zur Verfügung stehen. Die dazu verwendete Pipette (Sigmacote®, Sigma-Aldrich,
USA) ist mit Silikon beschichtet, um eine Anheftung der Zellen an das Glas zu
vermeiden. Zusätzlich wurde die Pipette im Vorfeld unter Zuhilfenahme eines
Bunsenbrenners vorne verjüngt, um das Verletzungsrisiko für die Zellen zu
minimieren und die Scherkräfte in der anschließend geschilderten Prozedur zu
vergrößern. Diese Pipette wird mit einem Peleusball versehen und der gesamte
Inhalt der Petrischale etwa zehnmal wiederholt aufgesogen und abgelassen. Um
die Scherkräfte, die zur Auflösung des Zellverbands notwendig sind, noch weiter zu
erhöhen, kann die Pipette dabei auch in spitzem Winkel gegen den Boden der
Schale gehalten werden. Der Vorgang stellt nicht nur die notwendige Ergänzung der
enzymatischen Verdauung dar, indem die verbliebenen glialen Strukturen zerstört
werden, sondern führt auch dazu, dass neuronale Zellfortsätze in Form von Axonen
und Dendriten zellnah an der Nervenzelle abgetrennt werden. Die Herstellung einer
Zellsuspension mit einzelnen, möglichst kugelrunden Zellen ist dabei entscheidend
für die Durchführbarkeit des Patch-clamp-Verfahrens im Sinne einer ausreichenden
Spannungskontrolle
(s.
3.3.2.).
Von
größter
Bedeutung
ist
einerseits
Geschicklichkeit im Umgang mit der Pipette und andererseits der Kraftaufwand in
der Bedienung des Peleusballs; Letzteres beeinflusst die Größe der Scherkräfte
maßgeblich. Erzeugt man zu große Scherkräfte, werden Neurone mit großen
Somata unvermeidbar zerstört, sind aber dementgegen die wirkenden Kräfte zu
gering, verbleiben Zellkonglomerate, in denen eine sinnvolle Anwendung des Patchclamp-Verfahrens unmöglich wird. Im Anschluss erfolgt die Überführung der
gesamten Zellsuspension in ein steriles 15ml Zentrifugenröhrchen (Greiner® T1818,
Sigma-Aldrich, USA), das nachfolgend auf 7ml mit Zellkulturmedium (DMEM+,
Zusammensetzung s. Anhang) mit aufgefüllt wird. Das Röhrchen wird nun für 5
21
Minuten bei 100-200G in der Zentrifuge behandelt, sodass sich im Pellet die
Neurone absetzen können. Der Überstand wird mit der Pipette vorsichtig abgezogen
und die Zellen werden nach erneuter Zugabe von Medium bis auf 10ml nochmals
langsam aufsuspendiert, um die Kollagenasewirkung mit Hilfe des enthaltenen FCS
so weit als möglich zu reduzieren. Nach letztmaliger Anwendung der Zentrifuge und
Entfernung des Überstandes werden pro Deckglas 300ml neues Kulturmedium in
das Falcon gegeben. Bei den 10 aus einer Ratte entnommenen Ganglien wurde in
Vorversuchen entschieden, dass 6 Deckgläser die optimale Zelldichte pro Deckglas
für die nachfolgenden Untersuchungen aufweisen.
Die resuspendierten Neurone finden dann in Portionen zu je 300ml auf 6 mit Poly-LLysin
(Poly-L-Lysine
Hydrobromid,
Sigma-Aldrich,
USA)
beschichteten,
18mmx18mm großen Deckgläschen (Menzel, Deutschland) ihren Platz, die einzeln
in 3,8 cm großen Petrischalen liegen. Um den Zellen die Möglichkeit zur Anheftung
an die beschichtete Oberfläche zu geben, erfolgt die abschließende Zugabe von
1,5ml Kulturmedium erst nach 2-3 Stunden Wartezeit, in der die Petrischalen im
Brutschrank aufbewahrt werden. Kurz vor Beginn der Experimente überführt man
die Schälchen in einen anderen Inkubator (Teco 10, Solutec, Germany), der
unmittelbar an der Patch-clamp-Anlage steht. Während der gesamten Dauer bis zur
unmittelbaren Entnahme der Deckgläschen zur Untersuchung findet also die
Inkubation der Zellkulturen in angefeuchteter Luft bei 37°C und 5,0% CO2 statt.
Um eine möglichst homogene Zellpopulation zu garantieren, wird die Zellkultur nur
in einem begrenzten zeitlichen Rahmen verwendet, zumal auch angenommen
werden darf, dass die Zellen bei kurzer Kulturdauer in ihren Membraneigenschaften
noch am ehesten dem physiologischen Zustand entsprechen. Es ergibt sich im
Verlauf außerdem zusehends die Schwierigkeit, einzeln liegende Zellen zu finden,
die keine interagierenden Bindegewebsstrukturen in ihrer unmittelbaren Umgebung
aufweisen, da dem Kulturmedium kein Proliferationshemmer für Bindegewebe
beigesetzt wird. Auch in Bezug auf die Patch-clamp-Versuche gilt zu beachten, dass
ein
extensives
Spannungskontrolle
Neuritenwachstum
stark
die
beeinträchtigt,
Chancen
da
auf
auf
einen
eine
adäquate
entsprechenden
Proliferationsinhibitor ebenfalls verzichtet wird.12 Die Verwendung der Zellen erfolgt
somit jeweils am nächsten Morgen und wird auf maximal zwei Tage beschränkt.
22
3.3.3. Ablauf der Messungen, Konfigurationen und Protokolle
Für
die
Einstellung
des
Bessel-Filters
werden
10kHz
gewählt,
die
Digitalisierungsfrequenz beträgt 20kHz. Als Steuerungs- und Messsoftware steht
„Clampex“ aus dem Softwarepaket „pClamp“ (Version 10.2, Molecular Devices,
USA) zur Verfügung.
An jedem Patchtag werden zunächst alle Lösungen hergestellt und entsprechend in
die Depots der Perfusionsanlage eingefüllt. Unter fortlaufender Perfusion des
Bassins mit Lösung 1 wird ein kulturtragendes Deckglas aus den Petrischälchen der
Zellkultur genommen und in den Strahlengang des Mikroskops in das Bassin
gesetzt. Unter dem Mikroskop erfolgen nun die Begutachtung der Zellkultur und die
anschließende Auswahl eines passenden Neurons (vgl. 3.3.2). Erst nach
Festlegung auf eine entsprechende Zelle wird intermittierend der Neodym-YAGLaser anstatt des Mikroskoplichts eingeschaltet und das Neuron entsprechend den
Kategorien
„fluoreszierend“
(renal)
bzw.
„nicht
fluoreszierend“
(nichtrenal)
klassifiziert. Weiterhin wird die sichtbare Zellgröße in Form des maximalen
Zelldurchmessers anhand einer Skala im verwendeten Objektiv abgeschätzt.
Anschließend wird eine nur in der Spitze mit Pipettenlösung befüllte Mikropipette an
den Pipettenhalter angebracht, die Pipette unter Anlage eines leichten Überdrucks
in das Bassin eingetaucht und über die ausgewählte Zelle in Position gebracht.
Dem Pipettenwiderstand, bestimmt durch einen kontinuierlichen 10mV-Testpuls,
werden Werte im Bereich von 1 MΩ bis 3 MΩ zugestanden. Nach obligater
Korrektur des Pipetten-Offsets wird die Mikropipette vorsichtig in Zellkontakt
gebracht, leichter Unterdruck unter der Pipettenöffnung angelegt und die
Klemmspannung
in der
Voltage-clamp-Konfiguration
von 0mV
auf
-80mV
abgesenkt. Im Idealfall erreicht man den erforderlichen Gigaseal innerhalb weniger
Sekunden, sodass nachfolgend die Pipettenkompensation optimal eingestellt
werden kann. Mit einem kurzen Sog wird dann die Zellmembran durchbrochen und
sofort die Whole-cell-Konfiguration erreicht. In dieser Konfiguration werden in einem
ersten Schritt Serienwiderstand (RS) und Membranwiderstand (RM) mit Hilfe des
von
der
Software
zur
Verfügung
gestellten
Membrantests
überprüft;
bei
unzureichenden Werten wird die Messung gegebenenfalls abgebrochen. Die
Bestimmung des Ruhemembranpotentials als grundlegender Zellparameter erfolgt
nun so rasch wie möglich, damit der erhobene Wert dem Ausgangszustand vor den
Manipulationen an der Zelle am nächsten kommt. Ein Wert unter -40mV wird als
ausreichender Parameter für die Vitalität des Neurons angesehen, sodass mit den
weiteren
Einstellungen
fortgefahren
werden
kann.
Aufgrund
des
hohen
23
Fehlerpotentials bei ungenügenden Kompensationseinstellungen werden nun unter
größter
Sorgfalt
Zellkapazität
und
Serienwiderstand
zu
mindestens
75%
kompensiert. Der eingestellte Lag liegt, je nach Zellgröße, zwischen 25µs und 35µs.
Mit der in Bezug auf Zugangswiderstand und Zellgröße optimal kompensierten Zelle
wird nun zu den eigentlichen Messprotokollen übergegangen.
3.3.4. Current-clamp-Modus
Zunächst werden die Zellen im Current-clamp-Modus gehalten und auf divergentes
Verhalten bei Strominjektionen untersucht. Die Untersuchung im Current-clampModus umfasst 3 Protokolle, in denen jeweils der Reizstrom in 10 sukzessiven
Sweeps gesteigert wird (s. Abb. 5, 6, 7).
Abb. 5, 6 (oben) und 7 (unten):
Schema des Injektionsstroms der Protokolle
1, 2 und 3 (Current-clamp-Modus)
Vor dem 600ms dauernden Hauptreiz wird nach 2ms zunächst ein Vorpuls (5ms, mit
2nA beginnend um 2nA pro Sweep auf 20nA erhöht, im ersten Protokoll oben links
unvollständig dargestellt) gesetzt, dem sich ein Intervall von 100ms ohne Reizung
anschließt. Beim darauf folgenden Hauptreiz wird der injizierte Strom über 600ms
24
konstant gehalten. Er erhöht sich ebenfalls mit jedem Sweep, wobei in den 10
Durchgängen des ersten Protokolls der Bereich von 40pA bis 400pA (s. Abb. 5), im
zweiten Protokoll aufbauend darauf der Bereich von 400pA bis 4000pA (s. Abb. 6)
und im letzten Protokoll 4000pA bis 11200pA (s. Abb. 7) abgedeckt werden. Die
Dauer eines Sweeps beläuft sich auf 5,1612s bei minimal gehaltener Verzögerung
zwischen den Durchgängen.
3.3.5. Voltage-clamp-Modus
Im Anschluss an die Current-clamp-Messungen werden die Bestimmungen an der
Zelle im Voltage-clamp-Modus fortgesetzt. Für die nachfolgenden Messungen muss
zur Reduktion bzw. Selektion der Natriumeinwärtsströme die extrazelluläre Lösung
1 im Bassin komplett gegen Lösung 2 getauscht werden. Um den Erfolg des
Lösungswechsels sicherzustellen, wird deshalb der erwartete Rückgang der Ströme
während des Vorgangs über mehrere Minuten in einem Protokoll mit repetitiv
ablaufendem Stimulationsmuster (s. Abb. 8) beobachtet.
Abb. 8:
Dargestellt ist lediglich ein ausgewählter zeitlicher Bereich im
Protokoll 4 (Voltage-clamp-Modus). Die Zelle wird zunächst vom
geklemmten Membranpotential (-80mV) für 100ms bei -100mV
gehalten und anschließend innerhalb von 10ms auf +100mV
depolarisiert. Das Membranpotential beträgt danach für 100ms
wieder -100mV. Das Protokoll umfasst insgesamt 10 Sweeps zu
je 500ms, die gleichartig ablaufen. Zwischen den Durchläufen
liegt eine Latenzzeit von 15s, sodass der letzte Sweep nach 2min
19,5s durchlaufen wird.
25
Nach dem Durchlauf des ersten Sweeps, dessen hervorgerufener Natriumstrom als
Referenzwert dient, beginnt der Lösungswechsel, indem der Zufluss mit Lösung 2 in
das Bassin durch 2 Zuläufe aktiviert wird. Gleichzeitig wird die Perfusion mit Lösung
1 eingestellt, sodass die kontinuierliche Flutung lediglich mit Lösung 2 erfolgt. Beide
Bassinzuläufe sorgen innerhalb weniger Sweeps für einen kompletten Austausch
der Lösung, was gut an der Reduktion der Mischströme auf einen konstanten Wert
zu erkennen ist.
Nach Austausch der Lösungen schließt sich zunächst eine wiederholte Readaption
der Kompensation und anschließend die Messung der Gesamtnatriumströme
anhand eines stufenförmigen Stimulationsprotokolls an (s. Abb. 9).
Abb. 9:
Verlauf des Membranpotentials im Protokoll 5 (Voltage-clampModus). Nach leichter Depolarisation der Zelle von -120mV auf 100mV erfolgt in 17 Sweeps eine schrittweise Depolarisation von
-100mV auf +60mV, wobei dieses Potential für 50ms gehalten
wird.
Insgesamt
dauert
ein
Sweep
153,6ms
mit
einer
Verzögerung von 1s zwischen den Sweeps.
Zur Vorbereitung auf die Untersuchung einer weiteren Zelle wird nach dem Ende
der Messreihe mit einer Zelle das Bassin manuell zunächst gründlich mit 70%iger
Ethanollösung und destilliertem Wasser gespült, mit einem saugfähigen Tuch
getrocknet und mit Lösung 1 reperfundiert. Die Anlage steht somit gründlich
gereinigt für die nächste Messung zur Verfügung.
26
3.4. Kontrollversuch
3.4.1. Rechtfertigung des Kontrollversuchs
Obwohl der Farbstoff 9-DiI bereits vorher in mehreren Tierversuchen als
neuronaler Tracer Verwendung fand14,15,23,27,42,44,45,59, stellt sich dennoch die Frage
nach potentiellen Einflüssen, die ein entsprechend gelöster Farbstoff auf die
neuronale Aktivität der Zellen haben könnte. Diese Frage gewinnt insofern noch
mehr an Bedeutung, als in Vorversuchen bereits entsprechende Unterschiede
zwischen angefärbten (respektive renalen) und nicht angefärbten (respektive
nichtrenalen) Neuronen festgestellt wurden und sich diese Unterschiede im Verlauf
der Hauptversuchsreihe zu bestätigen schienen. Der Farbstoff DiI wird in Pulverform
geliefert und zu unseren Zwecken, wie vom Hersteller empfohlen, in Ethanol gelöst.
Deshalb führt man, um den potentiellen Einfluss des gelösten Farbstoffs von dem
des alleinigen Lösungsmittels differenzieren zu können, im Kontrollversuch eine
Gruppe mit, die im Kulturmedium einen dem mit Farbstoff versehenen Kulturmedium
gleichwertigen Alkoholanteil besitzt.
3.4.2. Gewebedissoziation und Zellkultur
Es werden unbehandelten Sprague-Dawley-Ratten (Charles River, Deutschland)
Neurone aus den entsprechenden Segmenten Th11-L2 in analoger Weise zum
Hauptversuch entnommen. Die Aufarbeitung des entnommenen Gewebes erfolgt in
identischer Weise zum Hauptversuch (vgl. 3.5.2.) bis hin zum letzten Schritt, in dem
die Neurone in 300ml Kulturmedium pro Deckglas aufsuspendiert und auf die
Deckgläser verteilt werden. Die Petrischalen werden ebenfalls nach 2-3 Stunden mit
Kulturmedium versehen. Statt wie im Hauptversuch lediglich 1,5ml normales
Kulturmedium (DMEM+) für die erste Kontrollgruppe einzusetzen, werden in zwei
weiteren Kontrollgruppen jeweils 1,5ml DMEM+-Medium mit in 70% Alkohol
gelöstem
9-DiI
(Farbstoffkonzentration
c=
1µg
diI/ml
Medium,
0,05µl
Farbstofflösung/ml Medium) bzw. 1,5ml DMEM+-Medium mit lediglich 70%igem
Ethanol (0,05µl Ethanol/ml Medium) verwendet. Die Petrischalen, in denen sich nur
gleichartig behandelte Neurone befinden, werden entsprechend mit „ETOH“, „DI“
und „Kontrolle“ gekennzeichnet, um ein versehentliches Vertauschen in der
Zuordnung zu den Versuchsreihen zu verhindern. Für die darauffolgenden 2 Tage
stehen die Kulturen für Patch-clamp-Experimente zur Verfügung.
27
3.4.3. Ablauf der Messungen, Konfigurationen und Protokolle
Die Digitalisierungsraten und Filter entsprechen denen des Hauptversuchs.
Ergebnisse werden ebenfalls mit „Clampex“ aus dem Softwarepaket „pClamp“
(Version 10.2, Molecular Devices, USA) ermittelt und aufgezeichnet.
Sämtliche Untersuchungen des Kontrollversuchs benötigen nur die kontinuierliche
Perfusion des Bassins mit Lösung 1. Die Deckgläschen, von denen die
Zugehörigkeit zu einer der drei Kontrollgruppen bekannt ist, werden in das Bassin
eingelegt, eine passende Zelle wird unter dem Mikroskop ausgesucht und, wie im
Hauptversuchsteil
geschildert,
der
Whole-cell-Modus
hergestellt.
Die
entsprechenden Zellparameter werden erhoben und die Kompensationen in zum
Hauptversuch analoger Art und Weise durchgeführt.
3.4.4. Current-clamp-Modus
Der Kontrollversuch umfasst lediglich Messungen im Current-clamp-Modus. Es
finden dieselben drei Protokolle im Current-clamp-Modus Anwendung, die auch
schon für den Hauptversuch ausführlich beschrieben sind. Nach dem Wechsel des
neuronentragenden Deckglases steht die Anlage für die nächsten Messungen sofort
zur Verfügung.
28
3.5. Auswertung – Anmerkungen und Techniken
Die Komplexität der Auswertung zeigt sich für den elektrophysiologischen Laien erst
im Studium entsprechender Literatur. Es finden sich zur Analyse der Daten zum Teil
widersprüchliche Informationen oder Anleitungen, in manchem Fall sind gar
mehrere Analysetypen nebeneinander aufgeführt. Insgesamt orientiert man sich bei
der Auswertung größtenteils an bestehender
Literatur. Auf eigene Prämissen
vertrauend, aber auch in Abstimmung mit Elektrophysiologen der Physiologie 1,
Universität Erlangen, sollen in sinngebender Weise Lücken bei den Ausführungen
in der Literatur geschlossen werden, um ein möglichst objektives und einheitliches
Analyseverfahren für jede Zelle zu garantieren.
Die Zellgrößen werden einerseits mittels Mikroskop in ihrem Durchmesser und
andererseits über die Kapazität erfasst. Diese ist in jedem aufgezeichneten
Versuchsprotokoll hinterlegt, sodass sich beispielsweise der gemessene Strom pro
Zellgröße („Stromdichte“ in pA/pF) auf die aktuelle Kompensation im jeweiligen
Protokoll bezieht. Im grundsätzlichen Vergleich der Zellgrößen ist zur besseren
Einordnung in die Literatur die morphologische Zellgröße ausschlaggebend.
Der Bestimmung des Ruhepotentials als erstem erhobenen Parameter kommt große
Bedeutung zu. Noch vor der ersten Kompensation der Zelle wird Wert darauf gelegt,
möglichst früh nach Ausbildung des Whole-cell-Modus das Ablesen des Werts am
Verstärker zu gewährleisten, um ein Ruhepotential zu erhalten, das dem
physiologischen Zustand am nächsten liegt. Diese Angaben gelten sowohl für
Haupt- als auch Kontrollversuch.
Für die primäre Datenerhebung und Analyse steht mit „Clampfit“ aus dem
Softwarepaket „pClamp“ (Version 10.2, Molecular Devices, USA) ein geeignetes
Programm zur Verfügung. Sekundär werden die Daten in „Microsoft Excel“ (Version
2007) transferiert und bearbeitet, wobei mit „Origin“ (Version 8) für die BoltzmanAnpassung der Kurve der Natriumaktivierung, mit „SigmaStat“ (Version 3.5) für die
statistische Bearbeitung sowie „SigmaPlot“ (Version 12.0) für die grafische
Darstellung der Ergebnisse auf funktionell ergänzende Programme zurückgegriffen
wird.
Mittels
Normalverteilung
SigmaStat
bzw.
werden
die
Varianzhomogentiät
entsprechenden
getestet
und
Ergebnisse
auf
anschließend
der
zweiseitige studentische T-Test für gleiche Varianzen (T-Test1) in den Stichproben
bzw. der zweiseitige studentische T-Test für ungleiche Varianzen (T-Test2, in
„Microsoft Excel“) durchgeführt. Schlägt der Test auf Normalverteilung (ShapiroWilks-Test) fehl, kommt der Wilcoxon-Rangsummen-Test (WR-Test) zum Einsatz.
Für die Prüfung auf Unabhängigkeit zweier dichotomer Merkmale in zwei bzw. drei
29
Gruppen kommt der Chi-Quadrat-Test (χ2-Test) zum Einsatz. Auf einige Daten wird
zur Ermittlung der bestmöglichen die Datenpunkte beschreibenden Funktion eine
polynomielle
Regressionsanalyse
angewandt
und
infolgedessen
der
Korrelationskoeffizient nach Pearson (P-Test) bzw. der Rangkorrelationskoeffizient
nach Spearman (S-Test) bestimmt. Im Kontrollversuch analysiert man die
Parameter der drei bestehenden Gruppen mittels ANOVA (Kruskal-Wallis-Test, KWTest). Gemäß üblicher Konvention wird p<0,05 als Grenze für die statistische
Signifikanz bei allen Tests vorausgesetzt.
3.5.1. Current-clamp-Auswertung
Zur Unterscheidung der Zellen in ihrem elektrophysiologischen Verhalten wird die
Zellaktivität hinsichtlich ihrer Reaktion auf die 600ms dauernde Depolarisation
analysiert. Bei nur einem auftretenden Aktionspotential während der 600ms
dauernden Depolarisation geht man von phasischem, bei mehr Aktionspotentialen
von tonischem Verhalten aus. Die Reizschwelle („current-treshold“), die hier mit der
Rheobase gleichgesetzt wird, beschreibt den Wert der sich über mehrere Sweeps
steigernden
stimulativen
Strominjektion
über
600ms,
bei
dem
das
erste
Aktionspotential ausgelöst wird. Für alle anderen Messungen ist nicht das erste
ausgelöste
Aktionspotential
entscheidend,
sondern
das
erste
auftretende
Aktionspotential auf der nächsthöheren Reizstromstufe des Protokolls. Als Peak
wird derjenige Wert verstanden, der während des Overshoots des Aktionspotentials
den maximal positiven Wert erreicht. Problematisch gestaltet sich das Aufsuchen
des
Schwellenpotentials
(„voltage-treshold“)
am
Aktionspotential.
Bisherige
Methoden vertrauen u.a. auf das Augenmaß des geübten Auswerters oder anderen
semiquantitativen
Methoden,
deren
subjektive
Komponenten
z.T.
stark
divergierende Ergebnisse erbringen. In dieser Auswertung wird einer Methode
vertraut, die das Aufsuchen des Wendepunkts zu Beginn des Aufstrichs des
Aktionspotentials in der ersten grafischen Ableitung beinhaltet. Der Vorgang
gestaltet sich, einfach ausgedrückt, in der Weise, dass man in der ersten Ableitung
den Punkt aufsucht, an dem die Kurve kontinuierlich zu steigen beginnt. Dadurch
sollen sowohl realistische als auch untereinander vergleich- und verrechenbare
Werte garantiert werden.56
Die weiteren Messungen umfassen den minimalen Membranpotentialwert der
Nachhyperpolarisation des Aktionspotentials, den Wert des Membranpotentials kurz
vor Reizbeginn und einen von uns eingeführten Messpunkt auf Höhe von 50% der
maximalen
Gesamthöhe
des
Aktionspotentials.
Dieser
Punkt
stellt
das
30
Membranpotential
dar,
das
sich
vom
Wert
her
genau
zwischen
dem
Membranpotential vor dem Reiz und dem des Peaks befindet. Zu den erhobenen
Potentialen der Schwelle, des Peaks, der Nachhyperpolarisation und des definierten
Messpunkts auf 50% der Gesamthöhe des Aktionspotentials werden zusätzlich die
relativen Zeiten ihres Erreichens, bezogen auf den Reizbeginn, gemessen. Die
Bestimmung der Breite (Dauer vom Aufstrich bis Abstrich) des Aktionspotentials
wird am Schwellenpotential sowie auf 50% der Gesamthöhe des Aktionspotentials
vorgenommen.
Im letzten Schritt wird die grafische zweite Ableitung des Aktionspotentials
betrachtet (s. Abb. 10,11). Findet man im Übergang vom Abstrich zur
Nachhyperpolarisation des Aktionspotentials in der zweiten Ableitung einen
Abschnitt, der nochmals ins Negative ausschlägt, wird von dem Aktionspotential
angenommen, eine Schulter zu haben (vgl. Abb. 11 bei ca. 2,5ms).
Abb. 10, 11 : Aktionspotential mit Schulter (links) und ohne Schulter (rechts),
beide aus Originaldaten
Im Kontrollversuch, in dem sich die Messungen auf den Current-clamp-Modus
beschränken, sind diejenigen Parameter von Bedeutung, in denen wegweisende
Unterschiede im Hauptversuch auftreten. Zu diesen Parametern gehören die
Zuordnung der Zellen zu den Kategorien „tonisch“ und „phasisch“ sowie in Bezug
auf die Aktionspotentiale dieser Zellen auch deren Reizschwelle, Peakwert,
Schwellenpotential und die Dauer des Auf- und Abstrichs.
31
3.5.2. Voltage-clamp-Auswertung
Für die Auswertung der Maximalströme bzw. Ströme in Abhängigkeit des
Membranpotentials wird Protokoll 5 herangezogen. Der erste Schritt ist die
Erstellung einer Strom-Spannungs-Kennlinie, in der die maximal hervorgerufenen
Natriumströme gegen das jeweilig angelegte Membranpotential aufgetragen
werden. Zellen mit schlechter Spannungskontrolle, die eine sprunghafte Aktivierung
ihrer Kanäle zeigen, werden von den Strommessungen im Voltage-clamp-Modus
per se ausgeschlossen. Durch dieses Verfahren kann der reelle maximale
Einwärtsstrom der jeweiligen Zelle quantifiziert werden.
Im Programm Excel 2007 steht eine Funktion (lineare „Trendlinie“) zur Verfügung,
mittels derer das Gleichgewichtspotential für Natriumionen (Erev) sowohl grafisch als
auch anhand einer Funktionsformel abgeschätzt werden kann (s. Abb. 12).
Abb. 12:
Das
Gleichgewichtspotential
für
Natriumionen
ist
der
Schnittpunkt der an die Kurve angepassten Trendlinie mit der xAchse (Kurve aus Originaldaten)
Mit bekannter „Triebkraft“ (Membranpotential Vm, Gleichgewichtspotential Erev) und
den Natriumströmen (I) zu jedem Punkt können nun die Leitfähigkeiten (g) zu jedem
angelegten Membranpotential errechnet werden:
𝐼
𝑔 = V(m)−E(rev )
32
Bei zusätzlich bekanntem maximalen Natriumeinstrom (Imax) und damit auch gmax
sind weiterhin die relativen Leitfähigkeiten (grel) bestimmbar:
𝑔
𝑔(𝑟𝑒𝑙) = 𝑔(max )
Unter der Annahme, dass ein Strom durch einen Kanal sich linear verhält, spiegelt
somit die entstehende Leitfähigkeits-Spannungs-Kurve eine Aktivierungskurve für
die Natriumkanäle wider (s. Abb. 13).
Abb. 13:
Leitfähigkeits-Spannungs-Beziehung
als
Ausdruck
der
Natriumkanalaktivierung (aus Originaldaten, passend zu Abb.
14)
Die so gewonnenen Punkte können mittels Origin über eine BoltzmannKurvenermittlung zu einer passenden Kurve angepasst werden, aus der das
Potential für die spannungsabhängige Aktivierung auf halbmaximaler Höhe (V0,5) als
Kenngröße ermittelt wird.
33
4. Ergebnisse
4.1. Hauptversuch
4.1.1. Ergebnisse im Current-clamp-Modus
Insgesamt werden 66 Zellen, davon 25 nichtrenale (nichtfluoreszierende) und 41
renale (fluoreszierende) Neurone untersucht. Es finden sich sowohl phasisch
reagierende Neurone (1 Aktionspotential) als auch tonisch reagierende Neurone (>1
Aktionspotential, vgl. Abb. 14) in beiden Gruppen. Tonische Zellen beantworten die
erste überschwellige Reizung meist mit nur wenigen Aktionspotentialen, die sich wie bei phasischen Zellen auch - immer am Anfang der über 600ms andauernden
Reizung entwickeln. Ihre maximale Frequenz erreichen sie erst innerhalb von
einigen höheren Reizstufen. Die dem ersten Aktionspotential folgenden sind
gegenüber dem ersten in ihrer Höhe entweder gleichwertig und verlieren kaum an
Amplitude oder verlieren sukzessive an Höhe im Overshoot. Die abnehmende Höhe
wird vor allem bei denjenigen tonischen Zellen beobachtet, die eine niedrige Anzahl
an Aktionspotentialen zeigen. Phasische Zellen hingegen lassen sich auch durch
gesteigerte Reizstärken nicht zu salvenartigen Entladungen stimulieren.
Abb. 14:
Phasisch (links) und tonisch (rechts) reagierende Neurone
(Reizstärke
je
2000pA,
Originaldaten).
Hier
nehmen
die
Peakwerte der Aktionspotentiale beim tonischen Neuron kaum
ab.
Ein Überblick über alle Zellen und ihre maximal gezeigten Aktionspotentiale
offenbart eine hohe Zellzahl, die nur ein Aktionspotential ausbildet. Diese Zellen
fallen in die Kategorie der phasischen Zellen. Tonische Zellen, die mehr als ein
Aktionspotential auf Reizung entwickeln, zeigen eine weitgehend konstante
34
Verteilung ohne auffällige Maxima. Bei nichtnormalverteilten Werten weisen
tonische Zellen im Median 14 (min. 2, max. 30) Aktionspotentiale auf (s. Abb. 15).
Abb. 15:
Verteilung der Neurone im Bezug auf die Anzahl der gezeigten
Aktionspotentiale
Insgesamt entspricht die Anzahl der gefundenen phasischen Neurone (n=31; 47%)
in etwa der Anzahl der tonischen Neurone (n=35; 53%). Im Vergleich der
Zugangswiderstände zwischen tonischen und phasischen Neuronen sind keine
signifikanten Unterschiede erkennbar (p=0,83; 3,45MΩ ±0,20 vs. 3,39MΩ ±0,19; TTest1).
Von 25 nichtrenalen Neuronen weist mit 80% der überwiegende Teil phasisches
Verhalten auf. Lediglich 20% der bearbeiteten nichtfluoreszierenden Zellen sind
tonisch. Im Gegensatz dazu sind von 41 Zellen, die die Niere innervieren, nur 27%
phasisch. Mit 73% zeigt der überwiegende Teil der nichtfluoreszierenden Neurone
tonisches Verhalten (vgl. Abb. 16). Damit überwiegt bei renalen Neuronen der Anteil
an tonisch reagierenden Zellen im Gegensatz zu nichtrenalen Neuronen. Die
Verteilung
des
Merkmals
„tonisch“
bzw.
„phasisch“
unterscheidet
2
hochsignifikant in Bezug auf die Herkunft der Zellen (p<0,001; χ -Test).
sich
35
Abb. 16:
Verteilung tonischer bzw. phasischer Neurone bei nichtrenaler
und renaler Innervation
Die Differenzierung der Neurone auf Grundlage ihres Zelldurchmessers als
Schätzparameter für die Zellgröße gelingt bei den Neuronen trotz geringer mittlerer
Differenzen auf signifikantem Niveau. Phasische Zellen
sind
in ihrem
Zelldurchmesser demnach kleiner als tonische Zellen (p<0,05; 40µm [32-40] vs.
32µm, [32- 40]; WR-Test). Diese Differenz kann durch die über die kompensierten
Zellkapazitäten geschätzte Größe nicht bestätigt werden. Die hier erhaltenen
Ergebnisse erreichen in ihrer statistischen Gegenüberstellung keine Signifikanz
(p=0,21; 57,62pF [50,90-66,04] vs. 66,89pF [50,66-80,93]; WR-Test).
Beim durchschnittlichen Ruhemembranpotential beider Gruppen sind in der
statistischen Auswertung keine signifikanten Unterschiede erkennbar. Phasische
wie tonische Zellen bewegen sich im Mittel in einem Bereich knapp unter -50mV
(p>0,05; -52,90mV ±1,01 vs. -51,89mV ±1,02; T-Test1).
Als weitere wichtige Kennzahl wird die Reizstärke untersucht, die nötig ist, um ein
Aktionspotential auszulösen (Rheobase). Der benötigte Reizstrom wird hierbei auf
die Zellgröße normiert. Tonische und phasische Neurone unterscheiden sich dabei
ebenfalls signifikant, wobei phasische Zellen höhere Reizströme als tonische zur
Aktionspotentialgenerierung
benötigen
(p<0,05;
13,88pA/pF
[6,07-26,19]
vs.
8,91pA/pF [3,79-17,21]; WR-Test).
Die Anzahl von gezeigten Aktionspotentialen bei tonischen Neuronen korreliert
hierbei in signifikanter Art mit der normalisierten Rheobase in diesen Zellen (p<
0,01; r=0,77; S-Test, vgl. Abb. 17). Geringe Rheobasen sind mit einer hohen Anzahl
36
von Aktionspotentialen vergesellschaftet, wohingegen höhere Werte in der
Reizschwelle mit geringen Aktionspotentialzahlen einhergehen.
Abb. 17:
Korrelation von normalisierter Rheobase und Anzahl der
Aktionspotentiale in tonischen Neuronen
Anhand von Medianen (bei Normalverteilung: Mittelwerten) diverser Messpunkte,
deren Lage und Bestimmung im Teil „Material und Methoden“ ausführlich
beschrieben sind, gelingt es sowohl für das tonische als auch phasische
„Durchschnittsneuron“ eine schematische Abbildung zu entwickeln. Dem Betrachter
soll es damit leichter fallen, morphologische Unterschiede zwischen tonischen und
phasischen Neuronen im Zuge ihrer statistischen Beschreibung zu erkennen und zu
begreifen. Die entsprechenden Hauptunterschiede sind in der Schemazeichnung
bereits gekennzeichnet (vgl. Abb. 18).
37
Abb. 18:
Schematische Gegenüberstellung eines phasischen und eines
tonischen Aktionspotentials mit Darstellung von wichtigen
Messpunkten
In Abb. 18 ist relativ offensichtlich, dass sowohl Schwellenpotential als auch
Peakwert der phasischen Zellen bei negativeren Werten liegen. Statistisch lässt sich
sowohl beim Schwellenpotential (p< 0,01; -31,08mV ±1,89, vs. -22,14mV ±1,21; TTest2) als auch beim Membranpotential am Peak ein signifikanter Unterschied
(p<0,001; 45,26mV [36,04-52,30] vs. 56,730mV [53,38-60,65], WR-Test) ermitteln.
Die erreichten Peakwerte können dabei nur in phasischen, nicht aber in tonischen
Neuronen in signifikant korrelative Verbindung zu den Ruhemembranpotentialen der
Zellen
gesetzt
werden.
In
phasischen
Zellen
korrelieren
negativere
Ruhemembranpotentiale mit höheren Peakwerten und positivere Potentiale mit
geringeren Peakwerten (p<0,05; r=-0,36; P-Test). Ein gleichartiger Zusammenhang
ist bei tonischen Zellen nicht in signifikanter Weise nachweisbar (p>0,05).
Bei Betrachtung zunächst nur subjektiv auffällig, im Vergleich der Dauer des
Aktionspotentials auf Höhe des Schwellenwerts („Dauer Auf- und Abstrich“) auch
statistisch erfasst, zeigen tonische Zellen insgesamt prominentere, breitere
Aktionspotentiale mit signifikant längeren Zeiten von Auf- bis Abstrich auf Höhe der
Schwelle (p<0,001; 2,72ms [2,08-4,29] vs. 5,03ms [4,21-6,97]; WR-Test). Diese bei
tonischen Zellen verlängerte Dauer setzt sich sowohl aus einer signifikant
verlängerten Zeit vom Schwellenwert bis zum Erreichen des Peakwerts (p<0,05;
1,31mV [1,11-1,98] vs. 1,88 mV [1,30-2,33]; WR-Test) als auch einer verlängerten
38
Zeit im Abstrich vom Peak bis zum Wiedererreichen des Schwellenwerts (p<0,001;
1,19mV [0,91-2,56] vs. 3,16mV [2,20-5,41]; WR-Test) zusammen.
Die
genauere
Begutachtung
der
Primärdaten
bringt
überdies
bei
einer
überwiegenden Zahl der tonischen Neurone eine schulterartige Ausbuchtung im
Abstrich des Aktionspotentials zum Vorschein.
Der morphologisch eindeutige Beweis dieser Beobachtung zeigt sich in einer
Umkehr der Krümmung im Abstrich des Aktionspotentials (s. 3.7.1.). Demnach
können die Neurone nach der dichotomen Eigenschaft, eine Schulter oder keine
Schulter zu besitzen, geordnet werden. Im Bezug auf diese Merkmale besteht
zwischen
phasischen
und
tonischen
Neuronen
ebenfalls
ein
signifikanter
Unterschied (p<0,05; χ2-Test, vgl. Abb. 19).
Abb. 19:
Anteil von schulteraufweisenden Neuronen bei tonischen und
phasischen Neuronen
Mittels des Hilfsparameters „k“, der das durchschnittliche Gefälle im Abstrich
beschreibt, kann der Unterschied auch quantitativ erfasst werden. Demnach ist das
durchschnittliche Gefälle bei tonischen Neuronen signifikant geringer als bei
phasischen Neuronen (p<0,01; 30,49mV/ms ±3,87mV/ms vs. -60,33mV/ms
±6,991mV/ms, T-Test2).
39
4.1.2. Ergebnisse im Voltage-clamp-Modus
Zur elektrophysiologischen Untersuchung der in der Fragestellung formulierten
Hypothese, phasische Antwortmuster beruhten im Vergleich zu tonischen auf
divergierendem Verhalten bezüglich ihrer Natriumströme, gehört neben einer
ausführlichen Auswertung der Daten im Current-clamp-Modus vor allem die Analyse
der Ströme im Voltage-clamp-Modus. Zur primären Charakterisierung dieser Ströme
in phasischen wie tonischen Versuchsneuronen erfolgt die Beschreibung der unter
optimierten
extrazellulären
Natriumkonzentration)
Lösungsbedingungen
anhand
von
durch
(reduzierte
Spannungssprüngen
extrazelluläre
induzierten
Natriumströmen (s. Abb. 9). Dafür stehen nach erfolgreicher Durchführung der
treppenartigen
Stimulationsprotokolle
und
approximativer
Bestimmung
des
Umkehrpotentials inklusive relativer Leitfähigkeiten insgesamt Daten von 17
tonischen und 8 phasischen Neuronen zur Verfügung.
Die Natriumgesamtströme beider Gruppen, als subsumierte Ströme durch alle in
den Neuronen vorkommenden Natriumkanäle zu verstehen, zeigen in der
statistischen Auswertung große Unterschiede. Im Vergleich zu tonischen Neuronen
strömen in phasische Zellen im Durchschnitt mehr als doppelt so viele Natriumionen
pro Oberflächeneinheit ein. Diese Differenz in puncto Natriumstromdichte drückt
sich auch in statistisch signifikanter Weise aus (p<0,05; 268,93pA/pF±56,47 vs.
105,79pA/pF ±14,82; T-Test2).
Abb. 20:
Vergleich der Gesamtnatriumstromdichte von tonischen und
phasischen Neuronen
40
Die
tiefergehende
Charakterisierung
der
Neurone
soll
nun
anhand
der
Aktivierungskurven bzw. der Potentiale für die spannungsabhängige Aktivierung der
Gesamtnatriumströme auf halbmaximaler Höhe (V0,5) erfolgen.
In den Mittelwerten ergeben sich die Aktivierungskurven von phasischen (n=8) und
tonischen Neuronen (n=17), wie in Abbildung 21 dargestellt. Im Vergleich beginnen
die Natriumkanäle phasischer Neurone bei negativeren Membranpotentialen,
Leitfähigkeiten
für
Natriumionen
zu
entwickeln
und
erreichen
auch
ihre
Maximalleitfähigkeit bei negativeren Werten. V0,5 ist bei phasischen Neuronen
insgesamt in hyperpolarisiertere Bereiche verschoben und differiert signifikant vom
tonischen Wert (p<0,001; -23,92mV ±4,417 vs. -5,52mV ±1,72; T-Test1).
Abb. 21:
Aktivierungskurven tonischer und phasischer Neurone (als
Durchschnittskurven)
Die gewonnenen Werte für V0,5 können über den Korrelationskoeffizienten nach
Pearson sinnvoll in Bezug zu einigen im Current-clamp-Modus ermittelten
Parametern gesetzt werden. In allen Fällen greift nach Regressionsanalyse die
lineare Regression zur Beschreibung der Daten am besten.
So korreliert V0,5 signifikant mit der Gesamtstromdichte an Natriumströmen
(p<0,001; r=-0,72; P-Test, s. Abb. 22), mit dem erreichten Peakwert (p<0,01; r=0,56;
P-Test, s. Abb. 23) und mit der Dauer des Auf- und Abstrichs des Aktionspotentials
(p< 0,01; r=0,70; P-Test, s. Abb. 24). Positivere Werte von V0,5 sind mit niedrigeren
Stromdichten, höheren Peakwerten und längeren Zeitspannen im Auf- und Abstrich
vergesellschaftet.
41
Abb. 22, 23 (oben) und 24 (unten):
Korrelationen von V0,5 mit der Gesamtstromdichte, dem Peakwert (oben) und
der Aktionspotentialdauer (unten)
42
4.2. Kontrollversuch
Die im Kontrollversuch bearbeiteten Zellen werden in der Auswertung je nach
Vorbehandlung drei Gruppen zugeordnet. Bei mit DiI behandelten („DiI-Gruppe“),
ethanolbehandelten
(„EtOH-Gruppe“)
und
nichtbehandelten
Zellen
(„Kontrollgruppe“) interessiert zunächst die Verteilung von tonischem bzw.
phasischem Verhalten innerhalb der Gruppen. Der Anteil tonischer Neurone beträgt
in der DiI-Gruppe 26%, in der EtOH-Gruppe 22% und in der Kontrollgruppe 23%.
Zwischen keiner der drei Gruppen lässt sich ein signifikanter Unterschied bezüglich
der Anzahl tonischer bzw. phasischer Neurone feststellen (p=0,91; χ2-Test, vgl. Abb.
25).
Abb. 25:
Anteile tonischer Neurone in den Gruppen des Kontrollversuchs
Zu den wichtigsten Parametern, die im Hauptversuch signifikante Unterschiede
zwischen tonischen und phasischen Neuronen im Current-clamp-Modus offenbaren,
gehören die Reizschwelle, das Schwellenpotential, der Peakwert sowie die Dauer
des Auf- und Abstrichs. In der statistischen Analyse zeigt keine der Gruppen
signifikante Unterschiede bezogen auf die jeweiligen Werte (p>0,05; KW-Test).
Zusammenfassend sind in Abb. 26 Boxplots zu den erhobenen Parametern
dargestellt.
43
Abb. 26: Boxplot-Darstellung der 4 Hauptmerkmale im Current-clamp-Modus
44
5. Diskussion
5.1. Kontrollversuch
Die Verwendung von DiI und Ethanol erfolgt im Kontrollversuch in sehr hoher
Konzentration und mit direkter Einwirkung auf den Zellkörper der Neurone. Im
Hauptversuch in vivo hingegen wirken die Stoffe nebst geringerer Konzentration nur
auf die Endigungen der Axone innerhalb der Niere ein und können durch
retrograden Transport in die Zellkörper eindringen. Deshalb ist davon auszugehen,
dass
die
Ergebnisse
mögliche
Einflüsse
der
Substanzen
auf
das
elektrophysiologische Verhalten verlässlich anzeigen.
Die untersuchten Eigenschaften der Neurone umfassen im Wesentlichen die im
Hauptversuch als signifikant unterschiedlich gefundenen Parameter. Die im
Kontrollversuch auf Interaktionen durch den Farbstoff DiI bzw. dessen Lösungsmittel
Ethanol untersuchten Neurone zeigen weder hinsichtlich des elektrophysiologischen
Verhaltens noch in den untersuchten Eigenschaften der Aktionspotentiale
signifikante Unterschiede. In Anbetracht der im Vergleich zum Hauptversuch sogar
höheren Anzahl an Zellen kann angenommen werden, dass die im Hauptversuch
erhaltenen Resultate nicht durch Interaktionen mit dem Farbstoff oder dessen
Lösungsmittel beeinträchtigt werden.
45
5.2. Hauptversuch
Befasst man sich mit der Klassifikation des Antwortverhaltens bei DRG-Neuronen
von Säugetieren im Sinne von tonischem und phasischem Verhalten, handeln viele
neuere Veröffentlichungen die Thematik vor dem Hintergrund eines identifizierten
pathologischen
Antwortmusters
ab.
Insbesondere
in
der
Schmerz-
und
Entzündungsforschung der Natriumkanäle wird unser „phasischer“ Zustand als
normal und der als „tonisch“ definierte eher als pathologische Variante angesehen.
Beispielhaft hierfür sind Natriumkanäle betreffende erbliche Schmerzsyndrome, wie
die „Erythromelalgie“19,33,53 und die „extreme paroxysmale Schmerzstörung“18,29, bei
denen eine durch Stimulation erzeugte erhöhte Aktionspotentialfrequenz in vitro als
auch in vivo mit Hyperalgesie und anderen klinischen Symptomen kausal in
Verbindung gebracht wird.
Im Gegensatz zu oben genannten pathologischen Ansätzen zur Erklärung des
tonischen Verhaltens findet man wenige Versuche, das physiologische Vorkommen
von phasisch und tonisch afferenten Zellen auf DRG-Ebene zu beschreiben und
deren funktionelle Einbettung vor allem organspezifisch zu erklären. Sicher scheint
nur, dass ein gewisser Anteil an repetitiv feuernden Zellen bei Neuronen, die
gleichermaßen andere innere Organe innervieren, in Patch-clamp-Versuchen auch
ohne pathologische Umstände gefunden wird.16,34,36 In den vorliegenden Daten wird
nun deutlich, dass mit 53% phasischen und 47% tonischen Zellen aus den
Segmenten Th11-L2 insgesamt ein nahezu ausgewogenes Verhältnis bei
denjenigen Neuronen vorliegt, die hier bearbeitet wurden. Diese Zahlen dürfen aber
nicht darüber hinwegtäuschen, dass vermutlich andere Verhältnisse in der
Verteilung des Merkmals, bezogen auf sämtliche Neurone der entnommenen
Ganglien, vorliegen. So sind im Hinblick auf die Selektion der Zellen klare
Einflussfaktoren vorhanden wie beispielsweise die Auswahl der Zellen unter dem
Mikroskop, die Herstellung der Zellkultur oder die Begrenzung des Patch-clampVerfahrens auf Zellen mit kleinem Durchmesser. Das Bild, das hier gezeichnet wird,
kann also nicht repräsentativ für das anteilige Vorkommen in den jeweiligen
Ganglien stehen.
Bemerkenswert bleibt dennoch, dass bei der Betrachtung der renalen Innervation im
Vergleich zur Referenzpopulation klare Unterschiede bezüglich des reizinduzierten
Verhaltens auftreten. Die Niere scheint im Vergleich zu den anderen erfassten
Afferenzen dieser Segmente eine absolute Sonderstellung einzunehmen. Diese
Daten decken sich mit vorherigen Ergebnissen unserer Arbeitsgruppe, die bei
nichtrenalen Neuronen einen Anteil von 15%, bei renalen jedoch einen Anteil von
46
48% tonischer Neurone beschreiben.23 Mit 73% fällt der Anteil tonischer Neurone an
den die Niere innervierenden Neuronen, allerdings bei leicht verschobenen
Grenzkriterien für die Unterteilung in „tonisch“ und „phasisch“, hier nun noch
deutlicher als vorher aus und unterstreicht die diesbezügliche Ausnahmestellung der
renalen Innervation.
Obwohl, wie oben beispielhaft erläutert, die erhöhte Aktionspotentialfrequenz alleine
als pathologische Überreaktion auf einen überschwelligen Stimulus gesehen werden
kann,
integriert
der
Begriff
„Übererregbarkeit“
zusätzlich
zur
Aktionspotentialfrequenz in der Regel auch eine geringere Reizschwelle um
überhaupt Aktionspotentiale auszulösen.12 Ganz
in diesem Sinn zeigen die
tonischen Neurone nicht nur mehrere Aktionspotentiale, sondern reagieren auch
schon
bei
signifikant
geringeren
Reizen
als
phasische
Neurone
mit
Aktionspotentialbildung. Diese Betrachtung führt in den bisherigen Publikationen
relativ eindimensional zur Einteilung in die Gruppe der „übererregbaren Neurone“
und „nicht übererregbaren (normalen) Neurone“, was aber in unserem Fall der
tatsächlichen Situation nicht gerecht wird. Vielmehr erhöht sich der Grad der
Erregbarkeit mit steigender Aktionspotentialzahl bzw. mit fallender Reizschwelle,
sodass beide Parameter in tonischen Neuronen signifikant miteinander korrelieren
(s. Abb. 17). Somit stehen beide Werte als Maß für die Erregbarkeit zur Verfügung
und die „Übererregbarkeit“ wird zu einem Begriff mit extrem breitem Spektrum.
Anhand der Verteilung der Neurone in Bezug auf die Anzahl der gezeigten
Aktionspotentiale (vgl. Abb. 15) wird dieses Spektrum besonders deutlich. So hat
die Gruppe tonischer Zellen an sich noch unterschiedliche Grade an Erregbarkeit,
die von gering (2 Aktionspotentiale) bis maximal erregbar (30 Aktionspotentiale)
reicht.
Es
wird
Aufgabe
dieser
Diskussion
sein,
den
unterschiedlichen
Erregbarkeitsgraden Rechnung zu tragen und, wenn möglich, auf Grundlage der
Natriumkanäle nicht nur per se das „phasische“ und „tonische“ Verhalten zu
erklären, sondern auch das Kontinuum innerhalb der Gruppe der tonischen Neurone
zu interpretieren.
Nach Eingrenzung der Natriumkanaltypen, die an Aktionspotentialen der hier
untersuchten
Neurone
beteiligt
sein
könnten,
verbleiben
nach
bisheriger
Forschungslage mehrere Subtypen. Eine Fokussierung kann hierbei über die
Größenzuordnung der vorgefundenen Neurone erfolgen, da DRGs mit größeren
Zellkörpern tendenziell einen anderen Besatz an Natriumkanälen als solche mit
kleineren Zellkörpern haben. Der Großteil der hier untersuchten Zellen fällt
kategorisch in die Gruppe der kleinen bis mittelgroßen DRG-Neurone (Median 32μm
bei tonischen bzw. 40μm bei phasischen Neuronen). In der Zellgruppe der kleinen
47
(<25μm) bis mittelgroßen DRG-Neurone (25-45μm) werden neben den TTXsensiblen Kanälen Nav1.1, Nav1.6 und Nav1.7 auch die TTX-resistenten Kanäle
Nav1.8 und Nav1.9 in entsprechenden DRGs der Ratte exprimiert.4,7 Diesen Kanälen
werden, in Abhängigkeit ihrer Kinetik und Verfügbarkeit, unterschiedliche Rollen bei
der Entstehung von Aktionspotentialen zugeschrieben.
Da hier unser Hauptaugenmerk auf der Beobachtung des repetitiven Feuerns liegt,
lohnt es sich zunächst, den Schwerpunkt auf den TTX-resistenten Natriumkanal
Nav1.8 zu legen. Auf der Ebene von DRGs ist insbesondere dieser Kanal in den
letzten Jahren zu einem zentralen Element in der Diskussion um „Übererregbarkeit“
geworden. So scheint das Vorhandensein von Nav1.8 mit seiner speziellen Kinetik in
vielen Zellen eine beinahe unabdingbare Voraussetzung zum beobachteten
tonischen Verhalten zu sein.6,51 Dabei trägt der Einwärtsstrom durch diesen Kanal
nicht nur die Hauptlast während des Aufstrichs in kleineren DRG-Neuronen,
sondern ist auch Träger der folgenden Aktionspotentiale im Falle eines repetitiven
Feuerns. Modellhaft hierfür stehen die Ergebnisse von Renganathan48, die zeigen,
dass in DRG-Neuronen von Mäusen, die Nav1.8 nicht exprimieren können, die
Menge an Aktionspotentialen bei einem längeren Depolarisationsreiz auf einige
wenige Aktionspotentiale, meist jedoch auf nur eines, beschränkt bleibt. Außerdem
spielt die Menge des funktionellen Kanalproteins auf der Oberfläche, messbar mit
der Leitfähigkeit durch den Kanal, eine entscheidende Rolle. Beispielsweise ist ein
Neuron bei genügend hoher Expression von Nav1.8 in der Lage, repetitiv
Aktionspotentiale auszubilden und die Amplitude der Aktionspotentiale auch bei
andauernder Depolarisation auf relativ konstantem Niveau zu halten.50 Zellen dieser
Art sind bei uns genauso gefunden worden wie solche, deren Amplitude bei
repetitivem
Feuern
stark
nachlässt.
Ähnliche
Ergebnisse
sind
bereits
in
einschlägiger Literatur vorbeschrieben und werden dort mit nutzungsabhängiger
Inaktivierung von Nav1.8-Kanälen erklärt, was zu einer Abnahme der zur Verfügung
stehenden
aktivierbaren
Aktionspotentialen führt.
Natriumkanäle
bei
repetitiv
aufeinanderfolgenden
9
Die elektrophysiologische Begründung für die Fähigkeit, repetitive Aktionspotentiale
auszubilden, ist einerseits in der potentialabhängigen langsamen Inaktivierung (sog.
„steady-state inactivation“) und andererseits im besonderen Übergang des inaktiven
in den aktiven Zustand des Kanals zu suchen. Nav1.8 bietet als einziger Kanal
sowohl eine schnelle zeitliche Erholung als auch die Möglichkeit der Erholung und
Aktivierbarkeit
bei
positiveren
Membranpotentialen,
um
für
folgende
Aktionspotentiale wieder repetitiv zur Verfügung zu stehen.28,55 Man geht davon aus,
dass bis zu 80% der Nav1.8-Kanäle selbst bei Membranpotentialen von -40mV noch
48
aktivierbar bleiben, wohingegen die anderen Natriumkanäle bei so positiven
Membranpotentialen dauerhaft langsam inaktiviert sind oder infolge des ersten
ausgelösten Aktionspotentials der schnellen Inaktivierung unterliegen. Aufgrund
oben genannter Vorgänge sind in der Phase der Nachyperpolarisation bei normalen
Membranpotentialen etwa 90% der TTX-resistenten Kanäle wieder aktivierbar,
wohingegen
lediglich
20%
der
TTX-sensiblen
Kanäle
für
das
nächste
Aktionspotential zur Verfügung stehen.9 Deshalb ist bei beobachteter repetitiver
Reizantwort relativ sicher davon auszugehen, dass der Träger der ersten
Aktionspotentiale
nachfolgenden
in
tonischen
Neuronen
teilweise
Nav1.8
und
der
bei
Aktionspotentialen unter höheren Entladungsfrequenzen fast
ausschließlich Nav1.8 ist.
Entgegen der Verhältnisse bei den nachfolgenden Aktionspotentialen müssen bei
der Konturanalyse des ersten Aktionspotentials auch die anderen Natriumkanäle mit
ins Kalkül gezogen werden. Dies trifft vor allem auf phasische Neurone zu, die durch
die Ausbildung lediglich eines Aktionspotentials keinen Rückschluss auf die
Beteiligung von Nav1.8 lassen. Obwohl bei normalen Membranpotentialen in DRGs
von -60mV bis -50mV TTX-sensible Kanäle größtenteils in den inaktiven Zustand
versetzt vorliegen11, ist eine Beteiligung TTX-sensibler Kanäle an Initiierung und
Aufstrich des ersten Aktionspotentials in normalen DRG-Neuronen dennoch
nachgewiesen.30 In DRG-Neuronen, denen die genetische Disposition zur
Exprimierung von Nav1.8 fehlt, können ebenfalls Aktionspotentiale nachgewiesen
werden.51
Diese
unterscheiden
sich
jedoch
in
einigen
Parametern
in
charakteristischer Art und Weise von denjenigen, die eine Beteiligung von Nav1.8
aufweisen. Auch tonische und phasische Neurone zeigen ähnliche Unterschiede,
die nur durch eine andere Kanalzusammensetzung auf der Oberfläche der Zellen
erklärt werden können.
Ein signifikanter Unterschied, der einen andersartigen Kanalbesatz widerspiegelt,
eröffnet sich im Schwellenwert (voltage-treshold) von tonischen und phasischen
Neuronen (vgl. Abb. 18). Betrachtet man Analysen der Natriumströme in Regionen
um das Schwellenpotential, sind bei Aktionspotentialen mit Beteiligung von TTXsensiblen Strömen und Nav1.8 beide Kanaltypen zu etwa identischen Anteilen am
Einstrom von Natriumionen beteiligt.5 Somit tragen sowohl TTX-resistente als auch
TTX-sensible Natriumkanäle zur Einstellung des Schwellenpotentials maßgeblich
bei. Aus dem Vergleich von TTX-sensiblen Strömen und Strömen von Nav1.8 in
anderen
Veröffentlichungen
ist
ersichtlich,
dass
die
Potentiale
für
die
spannungsabhängige Aktivierung TTX-sensibler Kanäle auf halbmaximaler Höhe
(V0,5) bei signifikant hyperpolarisierteren Potentialen liegt.52 Der geringere
49
Schwellenwert in phasischen Neuronen in unserem Experiment deutet nun auf
einen erhöhten Einfluss von TTX-sensiblen Natriumkanälen hin, da deren
Aktivierung im Gegensatz zu TTX-resistenten Natriumkanälen insgesamt bei schon
negativeren
herabsetzt.
Membranpotentialen
Andererseits
erfolgt
hätte
und
bei
somit
das
Schwellenpotential
gleichbleibender
TTX-sensibler
Stromkomponente auch ein geringerer Einfluss durch TTX-resistente Kanäle
ähnliche Auswirkungen auf die Einstellungen des Schwellenpotentials im Currentclamp-Modus. Ein Blick auf die Aktivierungskurven der Gesamtströme tonischer und
phasischer Neurone bestätigt jedenfalls, dass die Lage des Schwellenpotentials
offenbar von den Aktivierungseigenschaften tonischer bzw. phasischer Neurone
determiniert wird: Dem höheren Einfluss TTX-sensibler Ströme bzw. geringerem
Einfluss von Nav1.8-Strömen geschuldet, stellt sich V0,5 bei phasischen Neuronen
signifikant negativer als die bei tonischen Neuronen dar (s. Abb. 21).
Dass diese Verschiebung Richtung Hyperpolarisation vor allem aufgrund erhöhter
TTX-sensibler und nicht aufgrund geringerer TTX-resistenter Stromkomponenten
erfolgt, findet Bestätigung im signifikanten, linear gerichteten Zusammenhang
zwischen V0,5 und den Gesamtströmen der einzelnen Zellen. In Richtung
Hyperpolarisation fallende Potentiale für die spannungsabhängige Aktivierung
korrelieren hierbei mit steigenden Gesamtstromdichten (s. Abb. 22), die folglich vor
allem auf TTX-sensiblen Natriumströmen beruhen dürften. Der äußerst positive
Wert von V0,5 bei tonischen Neuronen steht zudem fast beweisend für die massive
Beteiligung von Nav1.8 an deren Aktivierungskurve. Bisherige Untersuchungen zu
Nav1.8 zeigen als praktisch exklusives Charakteristikum für diesen Kanal Werte von
bis zu +6,8mV58 was im Bereich der von uns ermittelten Werte liegt.
Bei dem Versuch, die im Current-clamp-Modus erreichten Peakwerte der
Aktionspotentiale
zu
interpretieren,
stößt
man
bei
Einbeziehung
der
Natriumgesamtströme zunächst auf paradoxe Verhältnisse. Trotz der signifikant
höheren Natriumstromdichte phasischer Neurone zeigen gerade tonische Neurone
weitaus höhere Peakwerte im Aktionspotential.
Die Ursache liegt in den
Determinanten der Peakhöhe bei DRG-Neuronen, zu denen auf Ebene der
Natriumkanäle vor allem die Leitfähigkeit von Nav1.8 sowie in geringerem Maße
auch die Leitfähigkeiten von TTX-sensiblen Kanälen zählen. Im Unterschied zu
TTX-resistenten Leitfähigkeiten liegen die Hauptleitfähigkeiten der TTX-sensiblen
Kanäle im unmittelbaren Aufstrich des Aktionspotentials und enden relativ abrupt
durch Inaktivierung in Regionen des Peakwerts. Am Peak selbst beträgt die
Leitfähigkeit von TTX-sensiblen Kanälen in vergleichbaren Zellen nurmehr etwa
20% ihres Maximalwerts.5 Der TTX-resistente Kanal Nav1.8 zeigt eine andere
50
Kinetik, die zeitlich später beginnt, am Peak des TTX-sensiblen Stroms ebenfalls
maximale Einströme zeigt, aber auch anschließend noch den gesamten Abstrich
des Aktionspotentials über aktiv bleibt und in der zweiten Hälfte des Abstrichs sogar
eine kurzandauernde Schulter im Natriumeinstrom zeigt. Insgesamt resultiert also
eine zwar niedrigere TTX-resistente Gesamtstromdichte im Spitzenwert, die Menge
der Ströme über die Zeit ermöglicht aber höhere Peakwerte im Aktionspotential. Die
zusätzliche Wirkung von Nav1.8 in tonischen Neuronen führt daher, wie auch in der
Literatur beschrieben, zu höheren Peakwerten im Aktionspotential im Gegensatz zu
Aktionspotentialen, in denen lediglich TTX-sensible Kanäle zur Verfügung stehen.51
Aktionspotentiale, die auf TTX-sensiblen Strömen beruhen, zeigen zudem aufgrund
von potentialabhängigen Inaktivierungsvorgängen eine Reduzierung der Amplitude
bei positiveren Membranpotentialen, die bei zu hohem Membranpotential sogar zum
vollständigen
Verlust
der
überschwelligen
Reizantwort
führt.
Da
die
Inaktivierungspotentiale für Nav1.8 in weit positiveren Bereichen liegen, fehlt dieser
Zusammenhang in Neuronen, die diesen Kanal stark exprimieren.51 Eine solche
Reduzierung der erreichten Peakwerte in Korrelation zum Membranpotenial liegt
hier in signifikanter Art bei phasischen, nicht jedoch bei tonischen Zellen vor. Mit
den Vorkenntnissen lässt sich also der bereits bei Schwellenpotential und
Aktivierungskurven ausgemachte, starke Einfluss von Nav1.8 bei tonischen
Neuronen mit der Folge eines höheren Peakwerts, der auch bei positiveren
Membranpotentialen erhalten bleibt, erklären.
Aufgrund des länger anhaltenden Einstroms an Natriumionen, getragen durch
Nav1.8, wird auch die signifikant breitere Kontur der tonischen Aktionspotentiale
sowie die Schulterbildung im Abstrich erklärbar. Phasische Neurone zeigen durch
eine zeitlich rapide exponentielle Aktivierung von TTX-sensiblen Kanälen, aber
wahrscheinlich auch durch fehlende TTX-resistente Leitfähigkeiten eine signifikant
kürzere Zeit im Aufstrich und durch das offensichtliche Fehlen von ausreichend
sistierend aktivierten TTX-resistenten Kanälen auch eine signifikant kürzere Zeit im
Abstrich des Aktionspotentials. Das höhere maximale Gefälle im Abstrich der
phasischen
Aktionspotentiale
verdeutlicht
das
Fehlen
einer
bleibenden
depolarisierenden Stromkomponente, wie sie beispielsweise von Nav1.8, aber auch
von Kalziumkanälen
unterhalten wird.
Die
hier
bei fast
allen tonischen
Aktionspotentialen beobachtete Schulter wird in der Literatur oft im Zusammenhang
mit einer vermehrten Expression von TTX-resistenten und einer verminderten
Expression
von
TTX-sensiblen
Natriumkanälen
in
DRGs
in
Verbindung
gebracht.31,63 Zumindest kann man daher eine Assoziation zwischen einer starken
Expression von Nav1.8 und dem Vorliegen einer breiten Schulter bzw. eines breiten
51
Aktionspotentials vermuten. Andererseits ist beschrieben, dass eine Blockade von
Calciumkanälen durch Cadmium bei einigen Neuronen zu einer Unterdrückung der
Schulter führen kann, allerdings ohne die Dauer des Abstrichs zu verkürzen. Ferner
kommen auch Schultern generell ohne Beteiligung von Nav1.8 in Neuronen vor.1,5
Unbestritten
scheint
jedoch,
dass
der
langanhaltende
Nav1.8-getriggerte
Natriumeinstrom zur Schulter beitragen kann und auch die Dauer des Abstrichs
verlängert. Die Expression von Nav1.8 führt in Simulationstudien per se jedenfalls zu
einem verlängerten Aktionspotential und der Entwicklung einer Inflektion im
Abstrich.8 Somit kann auch eine auf das Aktionspotential verlängernd wirkende, die
Inflektion im Abstrich unterstützende Funktion von Nav1.8 in tonischen Zellen
angenommen werden.
Letztlich
stehen
auf
Basis
obiger
Überlegungen
die
Potentiale
für
die
spannungsabhängige Aktivierung auf halbmaximaler Höhe (V0,5) repräsentativ für
den Grad der Beteiligung TTX-resistenter Ströme in tonischen Neuronen. Diese
Hypothese bestätigt sich einerseits in der signifikanten linearen Korrelation von V0,5
zur Höhe des Peakwerts und andererseits in der linearen Korrelation von V0,5 mit
der Aktionspotentialdauer (s. Abb. 23, 24). Beide Korrelationen verdeutlichen den
Zusammenhang zwischen Einfluss von Nav1.8 und der Stärke der Ausbildung von
Parametern, die durch eben jenen Kanal mitbestimmt werden dürften. Dadurch wird
in tonischen Neuronen bereits auf Ebene der Aktionspotentialform ein Spektrum
sichtbar, das auf unterschiedlich starker Nav1.8-Beteiligung beruht.
Neben Nav1.8 ist bei der Fragestellung, welche Natriumkanäle die Frequenz
repetitiver Aktionspotentiale mitbestimmen, auch der TTX-sensible Kanal Nav1.7
von Bedeutung. Als Folge seiner biophysikalischen Eigenschaften wird ihm in DRGNeuronen die Eigenschaft zugeschrieben, bei andauernden Depolarisationen
Oszillationen im unterschwelligen Bereich des Membranpotentials zu erzeugen und
somit potentiell frequenzmodulatorisch zu wirken.53 Diese Oszillationen scheinen
ohnehin schon durch Nav1.8 unterhalten zu werden, sind aber bei Koexpression von
Nav1.7 in ihrer Amplitude verstärkt und stehen auch in zeitlich geringerem Abstand
zueinander.8 Insofern kann die unterschiedliche Expression dieses Kanals,
insbesondere aber interaktiv im gemeinsamen Auftreten mit Nav1.8, eine weitere
Ursache für das Spektrum der Aktionspotentialfrequenzen in tonischen Neuronen
sein.
Nav1.8 und Nav1.7 senken bei erhöhter Expression ebenfalls die Reizschwelle in
DRG-Neuronen und können damit zur erhöhten Erregbarkeit beitragen.8 Dieser
Umstand bietet eine Erklärung für die in tonischen Neuronen zur Anzahl der
Aktionspotentiale korrelativ fallende Reizschwelle (s. Abb. 17).
52
Die wohl geringste Bedeutung für die beim Aufstrich von Aktionspotentialen
anfallenden Gesamtströme spielt der TTX-resistente Natriumkanal Nav1.9. Die Rolle
von Nav1.9 ist aufgrund seiner langsamen Kinetik eher im unterschwelligen Bereich
der Aktionspotentiale zu suchen, indem der Kanal induzierte Depolarisationen durch
eigene Aktivierung verstärkt und verlängert.35 Somit wird die Reizschwelle zur
Auslösung
von
Aktionspotentialen
gesenkt
und
auch
nachhaltige
Aktionspotentialgenerierung unterstützt.3 In diesem Sinn würde Nav1.9 in Neuronen
die Reizschwelle während der anhaltenden Depolarisationen senken und somit eine
weitere Ursache unterschiedlicher Erregbarkeit bei tonischen und phasischen
Neuronen erklären. Die annähernd gleichen mittleren Membranpotentiale tonischer
und phasischer Neurone sprechen aber gegen eine unterschiedlich starke
Beteiligung dieser Ströme, da Nav1.9 durch überlappende Aktivierungs- und
Inaktivierungskurven ein Stromfenster für konstante Ströme auf Niveau des
Membranpotentials offen
lässt,
was
in der
Regel zu einem
positiveren
Membranpotential führt.3 Leider fehlen den Protokollen im Voltage-clamp-Modus die
Eigenschaften zum direkten Nachweis solcher Ströme. Der TTX-resistente Kanal
Nav1.9 zeigt nach seiner Aktivierung in stark negativen Membranpotentialbereichen
sehr lang andauernde Einströme,13,35 die bei positiven Membranpotentialen durch
andere Kanäle in ihrer Aktivierung überlagert werden. In der Aktivierungskurve der
Gesamtströme (s. Abb. 21) fehlt aber eine solche Stromkomponente, die den
Aktivierungsbereich der zwei sigmoidalen Kurven in hyperpolarisierte Bereiche
erweitern würde - insbesondere den der tonischen Neurone - komplett. Ursächlich
könnten die trotz des Einsatzes hochkonzentrierter Kaliumkanalblocker noch
nachweisbaren Restkaliumströme sein, die mit den langanhaltenden, vermutlich
sehr geringen Natriumeinströmen durch Nav1.9 in der Auswertung gegenläufig
interferieren. Somit ist eine Beteiligung von Nav1.9 bei den vorliegenden Neuronen
nicht auszuschließen.
Überdies stützen die vorgefundenen Zellgrößen die höhere Relevanz von Nav1.8 in
tonischen Zellen gegenüber der Bedeutung von Nav1.8 in phasischen Zellen, da
der mittlere Zelldurchmesser der behandelten tonischen Neurone signifikant kleiner
ist. Generell wird nichtmyelinisierten, nozizeptiven (Typ C), dünn myelinisierten (Typ
Aδ) und in geringerem Maße Aα/β Schmerzeinheiten aufgrund ihres hohen
Besatzes
mit
Nav1.8-Kanälen
Aktionspotentiale zu generieren.
die
2,25,54
Möglichkeit
zugestanden,
kontinuierliche
Ausgehend von Vorpublikationen, die den
Großteil der renalen Afferenzen als Neurone mit schwach myelinisierten bzw.
unmyelinisierten Nervenfortsätzen beschreiben,37 und der Annahme, dass diese
auch morphologisch kleinere Zellkörper besitzen,32 wird einerseits eine größere
53
Bedeutung dieses Natriumkanals in den kleineren Zellen und andererseits der
größere Anteil von tonischen Neuronen in der renalen Zellpopulation erklärbar.
Interessanterweise decken sich diese Daten mit direkt in vivo gewonnenen
Erkenntnissen von DRGs in Ratten. Lange Aktionspotentiale und hohe Peakwerte
korrelieren hier vor allem in A-Fasern und C-Fasern signifikant mit der Menge
vorkommender
Nav1.8-Kanäle
in
der
Membran25
und
unterstreichen
den
morphologisch-elektrophysiologischen Zusammenhang, der hier gefunden wird.
Die diskutierten Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass Nav1.8 in phasischen
Neuronen eine untergeordnete Rolle spielt, da die Aktionspotentiale lediglich die
typischen Charakteristiken von TTX-sensiblen Natriumkanälen widerspiegeln. Es
muss also davon ausgegangen werden, dass es sich bei phasischen Neuronen um
Aktionspotentiale handelt, die im Gegensatz zu denen tonischer Neurone
weitestgehend auf der Aktivierung von TTX-sensiblen Kanälen beruhen. In
tonischen Zellen kommen hingegen viele vor dem Hintergrund der massiven
Beteiligung von Nav1.8 herleitbaren Parameter in der Form des Aktionspotentials
zum Ausdruck. Deshalb sind diese Neurone bei wachsendem Einfluss von Nav1.8
durch
graduell
steigende
klassische
Zeichen
einer
Übererregbarkeit
gekennzeichnet, die in phasischen Neuronen nicht beobachtet werden kann.
54
6. Einordnung in körpereigene Prozesse
Die vorliegenden Ergebnisse können als Versuch aufgefasst werden, die bisherigen
experimentell erfassten Kenntnisse über die natürliche Funktion der afferenten
Innervation der Niere auf die Ebene der Aktionspotentiale auszuweiten. Die in den
Versuchen vorgefundenen tonischen und phasischen Neurone scheinen im
physiologischen Zustand in einem gewissen numerischen Verhältnis zueinander zu
stehen. Dieses Verhältnis prägt, neben den vielfältigen Möglichkeiten, diese Nerven
beispielsweise mechanisch oder chemisch zu erregen, sicherlich auch das Muster
der Aktivitäten, die in der direkten Nervableitung des afferenten Schenkels gefunden
werden können.
Diese Aktivitätsmuster legen bisher einen reno-renalen Reflexbogen nahe, in dem
die tonische Aktivität afferenter Neurone inhibitorisch auf die Aktivität der renalefferenten sympathischen Innervation wirkt.38 Die Interaktion dieser Afferenzen mit
den Efferenzen ist aber entgegen früherer Vorstellungen nicht nur im ZNS möglich,
sondern findet wahrscheinlich auch auf Ebene autonomer Ganglien sowie im
Nierenparenchym selbst statt, wo Efferenzen wie Afferenzen in unmittelbarer Nähe
zueinander liegen. Die Tatsache, dass der afferente Schenkel hierbei nach neueren
Erkenntnissen nicht nur durch mechano– und chemorezeptorische Stimulation im
Nierenbecken beeinflusst wird, sondern ebenfalls – offensichtlich in funktionell
separater Art und Weise – durch eventuell sogar andersartige parenchymeigene
Nervenfasern modifiziert wird, sollte in der Vorstellung von reno-renalen
Reflexbögen vor allem in pathophysiologischer Hinsicht eine zunehmende Rolle
spielen.24
In vielen Modellen wurde längst eine beeinträchtigte Funktion des afferenten
Schenkels des reno-renalen Reflexbogens festgestellt, u.a. bei Modellen zu
Bluthochdruck, kongestiver Herzinsuffizienz, Diabetes mellitus, ischämiebedingter
Niereninsuffizienz und obstruktiver Nephropathie.38 Es ist anzunehmen, dass das in
diesen Zuständen vorherrschende extrazelluläre Milieu der Niere auch die
Natriumkanalzusammensetzung der beteiligten Afferenzen beeinflusst und somit auf
diese Weise zu regulatorischen Ungereimtheiten im Krankheitsprozess beiträgt.
Jedenfalls sind Einflüsse von diversen Entzündungsmediatoren auf Leitfähigkeit und
Expression von Natriumkanälen in DRG-Neuronen bekannt und werden andernorts
mit krankhaft veränderten Eigenschaften ursächlich in Verbindung gebracht.17
Letztendlich
müssen
weitere
Forschungsarbeiten
die
krankheitsinduzierten
Veränderungen der Kanalzusammensetzung auf der Membran renaler Afferenzen
aufklären.
Dabei
können
diese
Erkenntnisse
neben
einem
Beitrag
zum
55
pathophysiologischen Verständnis nicht zuletzt auch Aufklärung über bisher
unverstandene Vorgänge im gesunden Körper leisten.
56
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8. Abkürzungsverzeichnis
FCS
Fetal Calf Serum
EGTA
Ethylenglykol-bisaminoethylether-N,N,N′N′-tetraessigsäure
DiI
1,1´-Dioleyl-3,3,3´,3´,-tetramethylindocarbocyaninmethansulfonat
DMEM
Dulbecco´s modified Eagle´s Medium
DRG
Dorsal Root Ganglia
HEPES
N(2-Hydroxyethyl)piperazine-N´-(2-ethanesulfonic acid)
KW-Test
Kruskal-Wallis-Test (ANOVA)
P-Test
Pearson-Korrelationskoeffizient
PBS
Phosphat Buffered Saline
T-Test1
Studentischer T-Test, gleiche Varianzen
T-Test2
Studentischer T-Test, ungleiche Varianzen
TMA-OH
Tetramethylammoniumhydroxid
TTX
Tetrodotoxin
S-Test
Spearman-Rangkorrelationskoeffizient
V0,5
Potential
für
die
spannungsabhängige
Aktivierung
Natriumkanälen auf halbmaximaler Höhe (Kennzahl)
WR-Test
Wilcoxon-Rangsummen-Test
ZNS
Zentrales Nervensystem
von
63
9. Anhang
Zusammensetzung der Lösungen in der Zellkultur:
DMEM+ - Medium: DMEM und 1% Penicillin/Streptomycin, beide Biochrom AG,
Deutschland, versetzt mit
10% FCS, Gibco/Invitrogen, USA, und 0,1% Insulin,
Sigma-Aldrich, USA
Zusammensetzung der Patch-clamp-Lösungen:
Lösung 1
Substanz
NaCl
KCl
MgCl2·6H2O
CaCl2·2H2O
HEPES
D(+)Glucose
Natriummethansulfonat
TetraethylammoniumChlorid
4-Aminopyridin
CdCl2
EGTA
Mg-ATP
Na-GTP
Adjustierung pH-Wert
M (g/mol)
58,44
74,56
203,31
147,02
238,31
180,16
118,09
165,7
94,12
380,35
507,2
523,2
140
5
1
2
10
10
Auf pH
7,35 mit
NaOH
Lösung 2
Pipettenlösung
Konzentration (mmol/l)
5
140
2
2
1,6
1
10
10
15
30
100
5
0,2
Auf pH
7,35 mit
TMA-OH
11
2
0,3
Auf pH 7,35 mit
KOH
Herstellerübersicht eingesetzter Substanzen
Kollagenase Typ 1A
Sigma-Aldrich, USA
DiI
Molecular Probes/Invitrogen, USA
DMEM
Biochrom AG, Deutschland
FCS
Gibco/Invitrogen, USA
Insulin
Sigma-Aldrich, USA
Penicillin/Streptomycin
Biochrom AG, Deutschland
PBS
Biochrom AG, Deutschland
Poly-L-Lysin
Sigma-Aldrich, USA
Sigmacote
Sigma-Aldrich, USA
64
10. Danksagung
Ich möchte mich ganz herzlich bei Prof. Dr. Roland Veelken für die Vergabe der
Doktorarbeit, für die freundliche Aufnahme in seine Arbeitsgruppe und seine stete
fachliche Anleitung und Unterstützung bedanken.
Besonderer Dank ergeht zum einen an Herrn Dr. Wolfgang Freisinger, der mich
zeitintensiv an der Patch-clamp-Anlage betreut sowie in puncto Auswertung
eingewiesen hat und mich so an seiner Forschungsarbeit teilhaben ließ.
Ferner war die Zusammenarbeit mit Frau Sonja Heinlein in allen medizinischtechnischen Bereichen bei der Bewältigung der Arbeit unverzichtbar.
Weiterhin soll nicht unerwähnt bleiben, dass Herr Dr. Peter Linz mir bei der Arbeit
an „seiner“ Patch-clamp-Anlage, insbesondere bei auftauchenden Problemen,
immer hilfreich zur Seite stand.
Zum anderen danke ich Frau PD Dr. Angelika Lampert für ihre intensive
Beschäftigung mit dem Themenbereich und für die Anregungen bei allen
tiefergehenden elektrophysiologischen Fragestellungen.
Dem Leiter der Medizinischen Klinik 4, Herrn Prof. Dr. Kai-Uwe Eckardt, sowie der
Leiterin des Nephrologischen Forschungslabors, Frau Prof. Dr. Margarete GoppeltStrübe, danke ich für die Möglichkeit, die Arbeit im Labor der Medizinischen Klinik 4
durchzuführen. Außerdem sei an dieser Stelle Prof. Dr. Christian Alzheimer und
allen Mitarbeitern des 1. Physiologischen Instituts der Universität Erlangen für die
freundliche Aufnahme in die Laboratorien ihres Haus gedankt.
65
11. Lebenslauf
Name:
Johannes Schatz
Geburtstag:
09. März 1986
Geburtsort:
Nürnberg
Familienstand:
ledig
Eltern:
Wendelin Schatz
Doris Schatz
Geschwister:
Dipl.-Kfm. Tobias Schatz, Dipl.-Kfm. Andreas
Schatz, StRin Susanne Schatz
Schulbildung:
1992 – 1996
Grundschule Ebermannstadt
1996 – 2005
Gymnasium
Fränkische
Schweiz,
Ebermannstadt. Besuch des mathematischnaturwissenschaftlichen Zweiges. Abschluss:
Allgemeine Hochschulreife
Studium:
10/2005
Beginn des Studiums der Humanmedizin an der
Friedrich-Alexander
Universität
Erlangen-
Nürnberg
09/2007
Ablegung des Ersten Abschnitts der Ärztlichen
Prüfung an der Friedrich-Alexander Universität
Erlangen-Nürnberg
02/2011-06/2011
Praktisches Jahr in Thun, Schweiz (Spital Thun,
Prof. Dr. Wagner)
06/2011-10/2011
Praktisches
Jahr
in
Erlangen
(Anästhesiologische Klinik, Prof. Dr. Dr. h.c.
Schüttler)
10/2011-02/2012
Praktisches Jahr in Erlangen (Innere Medizin,
Prof. Dr. Daniel und Prof. Dr. Neurath)
66
05/2012
Ablegung
der
Ärztlichen
Prüfung
Friedrich-Alexander-Universität
an
der
Erlangen-
Nürnberg sowie Approbation als Arzt
Beruf:
seit 10/2012
Arzt am Klinikum Nürnberg, Medizinische Klinik
4 für Nephrologie und Hypertensiologie