Differentielle hepatische Genexpression in einem Mausmodell mit
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Differentielle hepatische Genexpression in einem Mausmodell mit polygener Adipositas, Insulinresistenz und Hyperglykämie Katharina Linnartz Differentielle hepatische Genexpression in einem Mausmodell mit polygener Adipositas, Insulinresistenz und Hyperglykämie Von der Medizinischen Fakultät der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Medizin genehmigte Dissertation vorgelegt von Katharina Linnartz aus Koblenz Berichter: Herr Professor Dr. rer. nat. Walter Becker Herr Universitätsprofessor Dr. med. Dipl.-Biochem. Siegfried Matern Tag der mündlichen Prüfung: 15. Februar 2005 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar. INHALTSVERZEICHNIS Abbkürzungsverzeichnis V Offizielle Genbezeichnungen nach der Nomenklatur der Mouse Genome Database (MGD) VII 1 EINLEITUNG 1 1.1 Insulinresistenz und Diabetes mellitus Typ2 1 1.2 Die Rolle der Leber bei der Regulation des Fett- und Lipidstoffwechsels 2 1.3 Adipositas und Insulinresistenz 6 1.4 Die NZO-Maus 7 1.5 Das NSZO-Rückkreuzungsmodell 9 1.6 Zielsetzung der Arbeit 11 2 MATERIAL UND METHODEN 13 2.1 Tiere 13 2.2 Bestimmung der phänotypischen Parameter der Mäuse 14 2.3 Isolierung der RNA und Analyse im Northern und Dot blot 15 I 3 ERGEBNISSE 19 3.1 Charakterisierung der Versuchstiere 19 3.1.1 Die NZO-Maus 19 3.1.2 Einteilung der Mäuse in Gruppen unterschiedlichen Phänotyps 20 3.1.3 Einfluss von Geschlecht und Diät 22 3.2 Nachweis spezifischer mRNAs durch Northern und Dot blots 24 3.3 Auswahl der untersuchten Gene 27 3.4 An der Lipogenese beteiligte Enzyme und PLTP 28 3.5 Fettsäure-Oxidation 31 3.6 Gluconeogenese 34 3.7 3ß-Hydroxysteroid-dehydrogenase 5 (Hsd3b5) 36 3.8 Gene des Nidd/SJL-Diabetes-Locus 38 3.9 Expression von Resistin und Leptin im Fettgewebe 40 4 DISKUSSION 43 4.1 Vorteile der NSZO-Rückkreuzung 43 4.2 Änderungen der hepatischen Genexpression bei Insulinresistenz 44 4.2.1 Ein primärer Defekt der Glucosehomöostase 44 4.2.2 Ein primärer Defekt des Fettstoffwechsels 47 4.3 Fettreiche Fütterung 48 4.4 Der Geschlechtseffekt 4.4.1 Geschlechtsdimorphismus der Cytochrom P450-Isoformen 4.4.2 Geschlechtsdimorphismus von SCPx 50 52 52 4.5 Phospholipidtransferprotein (PLTP) 53 4.6 3ß-Hydroxysteroid-dehydrogenase 5 (Hsd3b5) 54 4.7 Stearoyl-CoA-desaturase 1 (SCD1) 55 II 4.8 Einfluss des Fettgewebes auf den Leberstoffwechsel 4.8.1 Leptin 4.8.2 Resistin 56 56 57 4.9 Gene des Nidd/SJL-Locus 58 5 ZUSAMMENFASSUNG 60 6 LITERATURVERZEICHNIS 61 7 ANHANG 62 III IV Abkürzungsverzeichnis BG Blutglucose BMI body mass index CPT Carnitin-palmitoyl-transferase CYP 4A14 Cytochrom P450 4A14 D diabetisch (hyperglykämisch/ hypo-bis aninsulinämisch) DEHP Di (2-ethylhexyl)phthalat DNA Desoxyribonukleinsäure EDTA Ethylendiamintetraessigsäure FAS Fettsäuresynthase G6Pase Glucose-6-phosphatase H insulinresistent (normoglykämisch/ hyperinsulinämisch) HDL high density lipoproteins HSD3b5 3ß-Hydroxysteroid-dehydrogenase IR Insulinrezeptor IRS Insulinrezeptorsubstrat KG Körpergewicht m Männchen mRNA messenger Ribonukleinsäure N normal (normoglykämisch/ normoinsulinämisch) n Anzahl NSZO Rückkreuzungsstamm NZOxF1 (SJLxNZO) NZO New Zealand obese-Mausstamm PEPCK Phosphoenolpyruvatcarboxykinase PLTP Phospholipidtransferprotein V PPAR peroxisome proliferator-activated receptor RNA Ribonukleinsäure RXRß Retinoid-X-Rezeptor ß SCD1 Stearoyl-CoA-desaturase 1 SCP sterol carrier protein SDS Natriumdodecylsulfat SJL Swiss Jim Lambert-Mausstamm SREBP sterol response element binding proteins SSC Natriumchlorid-Natriumcitrat TZD Thiazolidindione w Weibchen wk Lebenswoche VI Offizielle Genbezeichnungen nach der Nomenklatur der Mouse Genome Database (MGD) (http://www.informatics.jax.org/javawi2/servlet/WIFetch) • Acox1 (acyl-Coenzyme A oxidase 1) • Hsd3b5 (hydroxysteroid dehydrogenase-5, delta5-3-beta) • Cpt2 (carnitine palmitoyltransferase 2) • Cyp4a14 (cytochrome P450, family 4, subfamily a, polypeptide 14) • Ech1 (enoyl coenzyme A hydratase 1, peroxisomal) • Fasn (fatty acid synthase) • Ftl1 (ferritin light chain 1) • Gck (glucokinase) • G6pc (glucose-6-phosphatase, catalytic) • Irs2 (insulin receptor substrate 2) • Acaa1 (acetyl-Coenzyme A acyltransferase 1) • Lep (leptin) • Mod1 (malic enzyme) • Pex11a (peroxisomal biogenesis factor 11a) • Pik3r3 (phosphatidylinositol 3 kinase, regulatory subunit, polypeptide 3 (p55)) • Pck1 (phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, cytosolic) • Pltp (phospholipid transfer protein) • Pklr (pyruvate kinase liver and red blood cell) • Retn (resistin) VII • Rxrb (retinoid X receptor beta) • Srebf1 (sterol regulatory element binding factor 1) • Scd1 (stearoyl-Coenzyme A desaturase 1) • Scp2 (sterol carrier protein 2, liver) • Txnrd (thioredoxin reductase 1) VIII 1 EINLEITUNG 1 1 EINLEITUNG 1.1 Insulinresistenz und Diabetes mellitus Typ2 Diabetes mellitus ist definiert als eine Regulationsstörung des Glucoseund Lipidstoffwechsels aufgrund gestörter Insulinsekretion oder –wirkung. Diese resultiert in erhöhten postprandialen und Nüchternblutzuckerspiegeln (Alberti et Zimmet, 1998). Der Diabetes mellitus Typ2 findet sich mit einem Anteil von 90-95% weitaus häufiger, als der durch autoimmune Inselzelldestruktion bedingte Diabetes mellitus Typ1 (Saltiel, 2001). Der Typ2-Diabetes ist eine komplexe multifaktoriell bedingte Erkrankung. Insulinresistenz und verminderte Glucosetoleranz sind frühe Veränderungen auf dem Weg zur Entwicklung eines Diabetes mellitus Typ2. Die Insulinresistenz ist definiert als ein Zustand verminderter Ansprechbarkeit der Zellen auf normale Insulinkonzentrationen. Bei der Entwicklung der Insulinresistenz spielen Lebensbedingungen, wie neben zum genetischen Beispiel fettreiche Ursachen Ernährung auch und Bewegungsmangel, eine entscheidende Rolle (Winer et Sowers, 2004, Newman et al., 1987, Kaprio et al., 1992, Manson et al., 1991, Helmrich et al.,1991). Die Insulinresistenz ist ein definierendes Merkmal des Typ2-Diabetes, das schon lange vor dem Auftreten eines manifesten Diabetes nachweisbar ist. Sie kann aber über lange Zeit durch eine erhöhte Insulinsekretion kompensiert werden. Erst wenn die Inselzellen den erhöhten postprandialen Insulinbedarf nicht mehr decken können, kommt es zu Hyperglykämie und Typ2-Diabetes. Insulinresistenz ist jedoch nicht nur als Vorstufe des manifesten Diabetes von Bedeutung, sondern stellt auch ein Merkmal und 1 EINLEITUNG 2 auslösenden Faktor des Metabolischen Syndroms dar, zusammen mit Adipositas, Dyslipidämie und Hypertonus (Howard et al., 1996). So ist die Hyperinsulinämie in der Phase der Insulinresistenz nicht nur als erfolgreiche Maßnahme des Organismus zur Erhaltung der Glucosehomöostase im Blut anzusehen. Im Gegenteil prädisponiert die Hyperinsulinämie selbst zur Entwicklung anderer Störungen, wie zum Beispiel hohe Triglyceridspiegel im Plasma, Bluthochdruck, Hyperurikämie und erhöhte Spiegel von Plasminogenaktivator-Inhibitor 1. Diese verschiedenen Elemente des Metabolischen Syndroms erhöhen gemeinsam das Risiko für koronare Herzerkrankungen (Reaven, 1995, Haffner et al., 1999, Haffner et Cassels, 2003). Wir interessieren uns für die metabolischen Veränderungen, die auf der Stufe der Insulinresistenz auftreten. Deshalb sollte in dieser Arbeit unter anderem untersucht werden, welche Veränderungen der Genexpression bei Mäusen mit Insulinresistenz ohne Hyperglykämie in der Leber vorliegen. 1.2 Die Rolle der Leber bei der Regulation des Fett- und Lipidstoffwechsels Die Homöostase des Lipid- und Glucosestoffwechsels wird zum großen Teil durch die Leber kontrolliert und gewährleistet. Leberzellen können dem Organismus bei Bedarf Glucose aus Glykogenspeichern oder durch Gluconeogenese zur Verfügung stellen. Die Leber ist das erste Organ, zu dem die Glucose nach intestinaler Absorption gelangt und auch das erste Zielorgan des Insulin nach seiner Sekretion aus den ß-Zellen des Pankreas. 1 EINLEITUNG 3 Wird Glucose in großen Mengen absorbiert, kann die Leber Fettsäuren synthetisieren, die als Triglyceride eingebettet in Lipoproteinen abtransportiert werden (Towle et al., 1997, Foretz et al., 1999a). Die zentrale Rolle der Leber auf die Insulinwirkung zeigt sich auch dadurch, dass Mäuse mit homozygotem Defekt des Insulinrezeptors (IR-/-) in der Leber eine deutliche Insulinresistenz mit Glucoseintoleranz, Hyperinsulinämie und Hyperglykämie entwickeln (Michael et al., 2000). Bei muskelspezifischem knock-out des Insulinrezeptors (IR-/-) hingegen bleiben Blutglucose, Seruminsulin und Glucosetoleranz normal (Brüning, 1998; Kido, 2000). Insulin ist dabei der wichtigste Regulationsfaktor des hepatischen Glucosemetabolismus und kontrolliert die Expression spezifischer Gene. Die im Rahmen des Diabetes mellitus Typ2 auftretende Hyperglykämie wird zum einen durch vermehrte, nicht mehr durch Insulin reprimierte hepatische Glucoseproduktion (Dinneen et al., 1992, Meyer et al., 1998) verursacht, zum anderen durch eine reduzierte Aufnahme von Glucose in die Leber (Nielsen et al., 1998). Gegenwärtig sind die zellulären und molekularen Mechanismen dieser Störung der Glucosehomöostase noch nicht geklärt. Die metabolischen Effekte des Insulin werden durch ein breites Spektrum gewebespezifischer Aktionen vermittelt. Dazu zählen neben schnellen Änderungen auf der Ebene von Proteinphosphorylierungen langsamer wirksam werdende Änderungen auf der Ebene der Genexpression (O’Brien et Granner, 1996, Kahn et Flier, 2000). Letztere wurden in der folgenden Arbeit untersucht. Abb. 1 zeigt eine Übersicht über die Wirkung von Insulin auf Enzyme, die in den hepatischen Glucose- und Lipidstoffwechsel involviert sind. Die Regulation der in dieser Arbeit betrachteten Enzyme erfolgt im Wesentlichen über zwei unterschiedliche Signalwege. Die Expression von Enzymen der 1 EINLEITUNG 4 Gluconeogenese, wie Glucose-6-phosphatase und Phosphoenolpyruvatcarboxykinase (PEPCK), wird durch Insulin über den Pfad IRS2, Phosphoinositol-3-kinase (PI3-kinase), Akt reprimiert (Pessin et Saltiel, 2000, Saltiel et Kahn, 2001). Der Transkriptionsfaktor SREBP1 vermittelt die Insulininduzierte Expression von Enzymen, die die Glykolyse und die Umwandlung von Glucose in Fettsäuren katalysieren (Glucokinase, Pyruvatkinase, Malatenzym, Fettsäuresynthase und Stearoyl-CoA-desaturase 1) (Foretz et al., 1999b). Die Fettsäureoxidation wird über PPARN reguliert (Kersten et al., 2000; Mandard et al., 2004). Insulin Insulin-Rezeptor Glucose ? Glykolyse Glucokin ase Glucose Lipogenese SREBP1 Malatenz ym P yruvatkinase Glucose-6Phosphat G6Pase FAS Pyruvat Acetyl-CoA ACO PEPCK SCD1 Fettsäuren CYP4A14 KCO Gl uconeogenese Triglyzeride ECH Fettsäureoxidati on Akt IRS2 PPAR Abb. 1: Wirkung von Insulin auf Enzyme des hepatischen Glucose- und Lipidstoffwechsels. SREBP1 vermittelt die durch Insulin induzierte Expression von Enzymen, die die Umwandlung von Glucose zu Fettsäuren katalysieren. Über IRS2 bewirkt Insulin eine Hemmung der Expression von an der Gluconeogenese beteiligten Enzymen. Der Transkriptionsfaktor PPARN ist an der Regulation der Expression von Enzymen der Fettsäureoxidation beteiligt. (G6Pase = Glucose-6-phosphatase; PEPCK = Phosphoenolpyruvatcarboxykinase; ACO = Acyl-CoA-oxidase; CYP 4A14 = Cytochrom P450 4A14; KCO = Ketoacyl-CoAthiolase; ECH = Enoyl-CoA-hydratase; FAS = Fettsäuresynthase; SCD1 = Stearoyl-CoA-desaturase 1) 1 EINLEITUNG 5 Eine über einige Jahre favorisierte Vorstellung bezüglich der Mechanismen dieser Dysregulation des Glucosestoffwechsels sieht freie Fettsäuren als ursächlich für eine pathologisch veränderte hepatische Glucoseproduktion und –aufnahme an (Randle et al., 1963). Die bei Fettleibigkeit vermehrt im Organismus freigesetzten und zirkulierenden freien Fettsäuren inhibieren demnach die Fähigkeit von Insulin, die hepatische Glucosefreisetzung zu hemmen und die Glucoseaufnahme in den Skelettmuskel zu steigern (Bergman et Ader, 2000). Interessant ist in diesem Zusammenhang die Tatsache, dass freie Fettsäuren als mögliche Liganden von PPARN bekannt sind (Forman et al., 1997, Kliewer et al., 1997). Insulinresistenz kann ebenso Konsequenz eines Leptinmangels sein. Leptin hat Einfluss auf Sattheit, Energiehaushalt und neuroendokrine Funktionen (Friedman, 2000). Leptinmangel führt bei den meisten Nagern zu Insulinresistenz und Hyperinsulinämie. Leptinsubstitution bei ob/ob-Mäusen führt innerhalb von Stunden zu einem Sinken des Blutzuckers und Insulinspiegels, noch vor einer Änderung von Gewicht oder Futteraufnahme (Halaas et al., 1995; Pelleymounter et al., 1995). Auch bei lipodystrophen Mäusen (transgene aP2-SREBP1c-Mäuse; Shimomura et al., 1998a), die aufgrund eines Mangels an Fettgewebe einen sehr niedrigen Leptinplasmaspiegel aufweisen, bessert sich die Insulinresistenz nach Leptinsubstitution. Die Steigerung der Sensibilität gegenüber Insulin ist nicht durch verminderte Nahrungsaufnahme und Gewichtsverlust bedingt, sondern beruht auf der Leptinwirkung (Shimomura et al., 1999b) Leptinmangel kann demnach unter anderem verursacht werden durch Mutationen im Leptingen (Lep ob/ob) oder durch Lipodystrophie. Interessanterweise zeigt die Leber in diesen beiden Fällen des Leptinmangels ein gemischtes Bild von Insulinresistenz und –sensitivität. So kann Insulin die hepatische Glucoseproduktion und –freisetzung nicht mehr supprimieren, 1 EINLEITUNG 6 kann aber weiterhin die Fettsäuresynthese stimulieren (Shimomura et al., 2000). Diese Kombination aus Überproduktion und vermehrter Abgabe von Glucose ins Blut mit vermehrter Fettsäuresynthese führt zu einer weiteren Steigerung der Insulinsekretion und –resistenz. So entsteht ein Circulus vitiosus, der möglicherweise der Entwicklung des Typ2-Diabetes zugrunde liegt (McGarry, 1992). Es ist derzeit unbekannt, ob diese Pathomechanismen, die für Mausmodelle mit genetisch bedingtem Leptinmangel gelten, auch verantwortlich sind für die Diabetesentwicklung anderer Genese, zum Beispiel Diät-induzierter oder polygen bedingter Diabetes. 1.3 Adipositas und Insulinresistenz Fettleibigkeit ist ein Symptom, aber auch ein auslösender Faktor, des metabolischen Syndroms beim Menschen. In epidemiologischen Studien konnte gezeigt werden, dass das Risiko an Diabetes zu erkranken – und das Risiko eine Insulinresistenz zu entwickeln – proportional zum body mass index (BMI) ansteigt (Colditz et al., 1990, Chan et al., 1994). Fettreiche Ernährung steigert das Risiko, an Diabetes zu erkranken (van Dam, 2003). Dem Fettgewebe kommt somit ebenfalls eine bedeutende Rolle in der Verursachung und Entstehung des Diabetes zu. So ist ein direkter Einfluss der Adipozyten auf die Glucosehomöostase, im Sinne einer Hemmung der Insulinwirkung durch freie Fettsäuren, denkbar (siehe Kapitel 1.2). Andererseits wurde in den letzten Jahren immer mehr die Funktion der Adipozyten als endokrine Zellen entdeckt. Dabei ist zum einen das schon erwähnte Leptin zu nennen (siehe Kapitel 1.2). 1 EINLEITUNG 7 Ein anderes von Fettzellen sezerniertes und im Blut zirkulierendes Protein ist Resistin. Resistin wurde als Zielmolekül der relativ neuen oralen Antidiabetika aus der Gruppe der Thiazolidindione (TZD) identifiziert. TZDs reduzieren die Genexpression und Sekretion von Resistin in und aus Fettzellen. Erhöhte Spiegel von Resistin wurden im Blut von Nagern mit diätbedingter oder genetisch bedingter Fettleibigkeit gefunden. Bei Behandlung normaler stoffwechselgesunder Mäuse mit Resistin zeigten diese Tiere eine verminderte Glucosetoleranz und Insulinsensitivität. Hingegen besserten sich auf die Gabe von Anti-Resistin-Antikörpern die Blutzuckerwerte und Insulinwirkung bei einem Mausstamm mit diätbedingter Adipositas (Steppan et al., 2001). Diese konsistenten und eindeutigen Ergebnisse erhielten sehr viel Aufmerksamkeit, da erstens ein potentieller Wirkmechanismus der TZDs gefunden war und es schien, dass sich neue therapeutisch nutzbare Ansätze eröffneten, zum zweiten da eine mögliche Verknüpfung zwischen Adipositas und Insulinresistenz beziehungsweise Diabetes gefunden war. Weitere Untersuchungen ergaben jedoch, dass der Kausalzusammenhang keineswegs so einfach und eindeutig ist, wie es anfangs erschien (Hotamisligil, 2003) 1.4 Die NZO-Maus Unser Objekt für Untersuchungen zu Insulinresistenz und Diabetes ist die New Zealand Obese (NZO) –Maus. Unterschiedliche Nagerstämme wurden schon verwendet, um die Störungen zu untersuchen, die zum metabolischen Syndrom des Menschen gezählt werden (Herberg et Coleman, 1977). Diese präsentieren jedoch jeweils nur Teilaspekte des metabolischen Syndroms. 1 EINLEITUNG 8 Außerdem sind in vielen anderen Tiermodellen die Stoffwechselstörungen monogen bedingt. Bei der NZO-Maus handelt es sich um einen MausInzuchtstamm mit polygen bedingter Adipositas, Hyperphagie, Insulinresistenz, Dyslipidämie und Hypertonie (Ortlepp et al., 2000); damit ist dieses Tiermodell dem metabolischen Syndrom des Menschen näher als viele andere Diabetesmodelle. Abb. 2a: NZO-Mäuse. (Bild freundlicherweise zur Verfügung gestellt von L. Plum) Außerdem weisen NZO-Mäuse eine deutliche Resistenz gegenüber Leptin auf – ebenso wie Menschen mit Adipositas (Halaas et al., 1997; Igel et al., 1997). Es ist bekannt, dass Leptin wichtige Mediatorfunktionen im Regelkreis von Körperfett und zentral gesteuertem Essverhalten und Energiehaushalt wahrnimmt (Campfield et al., 1995). Bei NZO-Mäusen geht die Adipositas mit vermehrter Expression von Leptin-mRNA im Fettgewebe einher, jedoch zeigen sie trotz hoher Serumleptinwerte keine reduzierte Futteraufnahme. Ein bei NZO-Mäusen gefundener Polymorphismus des 1 EINLEITUNG 9 Leptinrezeptors (Lepr NZO ) kann dies nicht komplett erklären, da der schlanke New Zealand black (NZB) -Stamm diese Variante des Leptinrezeptors ebenfalls trägt. Vermutet wird ein Defekt des Signalweges distal des Leptinrezeptors oder auf der Ebene des Leptintransports durch die Blut-HirnSchranke (Igel et al., 1997). Wie dies häufig bei Nagern mit starker Adipositas zu beobachten ist, entwickelt ein Großteil der Tiere eine Hyperinsulinämie, und ein Teil der männlichen Tiere einen Diabetes (Leiter et al., 1998). Die Mäuse zeigen schon früh eine hepatische Glucoseüberproduktion, die durch Insulin nicht regulierbar ist (Rudorff et al.,1970; Veroni et al., 1991). Außerdem lagern NZO-Mäuse geringere Mengen Glucose in Form von Glykogen in der Leber ab, wandeln dafür aber vermehrt Glucose in Fett um (Subrahmanyam, 1960), was zu der extremen Adipositas und Steatosis hepatis beiträgt. Bei der NZOMaus scheint also die Leber eine entscheidende Rolle in der Pathogenese von Insulinresistenz und Diabetes zu spielen. 1.5 Das NSZO-Rückkreuzungsmodell Folglich ist die NZO-Maus ein ideales Modell, um anhand der Genexpression der Leber die Pathophysiologie des metabolischen Syndroms zu untersuchen, und verantwortliche Gene zu identifizieren. Die Arbeitsgruppe Joost am Institut für Pharmakologie und Toxikologie der RWTH Aachen etablierte eine Rückkreuzung der NZO-Maus mit der schlanken, normoglykämischen und arterioskleroseresistenten Swiss Jim Lambert (SJL) -Maus (Ortlepp et al., 2000). Durch diese Rückkreuzung NZOxF1(SJLxNZO), im Folgenden kurz NSZO genannt, wurde eine Population von Tieren erzeugt, die unterschiedliche Anteile des NZO-Genoms tragen und dadurch 1 EINLEITUNG 10 auch unterschiedliche Phänotypen zeigen. Auf diese Art und Weise konnte die Korrelation zwischen Genotyp und verschiedenen Ausprägungen der Stoffwechselveränderungen studiert werden. Es konnten Suszeptibilitätsloci für Adipositas/Hyperinsulinämie (Kluge et al., 2000) und ein weiterer für Hyperglykämie/Hypoinsulinämie aufgedeckt werden. Letzterer wird überraschenderweise vom SJL-Genom (Nidd/SJL) beigesteuert (Plum et al., 2000). Abb. 2b: SJL-Maus. (Bild freundlicherweise zur Verfügung gestellt von L. Plum) Diese Untersuchungen unterstützen zusätzlich die Hypothese, dass in diesem Mausmodell der Diabetes durch eine Kombination von Adipositas und zugrunde liegende Diabetesgene bedingt ist (Leiter et Herberg, 1997; Leiter et al., 1998). Der im SJL-Genom gefundene Diabetes-Locus reicht nicht aus, um bei den schlanken SJL-Tieren einen Diabetes mellitus zu verursachen, er erniedrigt jedoch die Schwelle des Körpergewichts, bei dem es zur Entwicklung eines Diabetes kommt. Erst in Kombination mit der Adipositas 1 EINLEITUNG 11 der NZO-Tiere kommt es regelmäßig zur Entstehung eines Diabetes. Das Interessante des hier untersuchten Rückkreuzungsstammes ist also die Nähe zu der polykausalen Verursachung des in der humanen Pathologie bestehenden metabolischen Syndroms. Der NSZO-Rückkreuzungsstamm besteht aus Tieren, die phänotypisch unterschiedliche Stoffwechselparameter aufweisen. So finden sich unter den männlichen Tieren sowohl normoglykämische/normoinsulinämische Mäuse, hyperinsulinämische Mäuse im Zustand der durch die hohen Insulinwerte noch kompensierten Insulinresistenz und diabetische Tiere mit Hyperglykämie und geringen bis nicht mehr nachweisbaren Insulinwerten. Interessanterweise entwickeln die Weibchen keinen Diabetes, so dass es nur normoglykämische/normoinsulinämische und hyperinsulinämische Weibchen gibt. Diese Beobachtung wurde auch schon bei NZO-Mäusen und auch bei einem anderen Mausstamm mit Adipositas-induziertem Diabetes gemacht (Leiter et al., 1998 und Leiter et al., 1991). Es scheint, dass die weiblichen Östrogene einen protektiven Effekt ausüben. 1.6 Zielsetzung der Arbeit Mit den NSZO-Tieren steht somit eine Population mit heterogenem Stoffwechselgeschehen und vergleichbarem genetischem Hintergrund zur Verfügung. Anhand des NSZO-Rückkreuzungsstammes sollen in dieser Arbeit die Unterschiede der hepatischen Genexpression im Diabetes und in der Insulinresistenz charakterisiert werden. Enzyme der Lipolyse, der Lipogenese, des Glucosestoffwechsels und andere als interessant für die 1 EINLEITUNG 12 Fragestellung erachtete Proteine wurden hinsichtlich der Menge der Expression ihrer mRNA in Leberzellen quantifiziert. Die Heterogenität der Tiere bezüglich der Stoffwechselsituation beschreibt verschiedene Stadien auf dem Weg zur Entwicklung eines Diabetes mellitus. Diese Stadien sollen auf Ebene der Änderung der Genexpression in der Leber nachvollzogen werden. Auf diese Weise soll die Frage beantwortet werden, durch welche Stoffwechselveränderungen es schrittweise Insulinresistenz letztendlich zum Diabetes kommt. über das Stadium der 2 MATERIAL UND METHODEN 13 2 Material und Methoden 2.1 Tiere Mäuse der Stämme SJL (SJL/NBom) und NZO (NZO/HIBom) wurden von der Fa. Bomholtgard (Ry, Dänemark) bezogen. In einem ersten Versuch wurde mit SJL-Weibchen und NZO-Männchen eine F1-Generation gezüchtet, dann eine Rückkreuzungspopulation SJLxF1 und NZOxF1 generiert (Plum et al., 2000). Ein Jahr später wurde eine davon unabhängige Rückkreuzung initiiert. In der vorliegenden Arbeit wurden ausschließlich Tiere der Rückkreuzung NZOxF1 (in dieser Arbeit kurz NSZO genannt) dieses zweiten Rückkreuzungsansatzes und als Kontrolle einige Tiere des Parentalstammes SJL berücksichtigt. Nach Beendigung der Milchfütterung durch die Mütter im Alter von drei Wochen erhielten die Tiere entweder Standardfutter für Nager (Altromin, Lage, Nr. 1314, 5% Fett, 48% Kohlenhydrate und 22,5% Eiweiß; 12,5 kJ/g) oder fettreiches Futter (Altromin, Lage, Nr. C1057, 16% Fett – davon 4,4 % Ölsäure und 14% Linolsäure, 46,8% Kohlenhydrate, 17,1% Eiweiß; 15,4 kJ/g). Während der gesamten Studiendauer hatten die Mäuse freien Zugang zu Futter und Wasser (Trinkwasser, zweifach ozoniert, UV-bestrahlt, entkalkt). Die Tiere wurden getrennt nach Geschlecht als Geschwistergruppen mit drei bis sechs Tieren pro Käfig (Macrolon-Käfige, Typ III; Fa. EBECO, Castrop-Rauxel) bei konstanter Umgebungstemperatur (20°C, 55 ±5% relative Luftfeuchtigkeit) und einem 12 Stunden Tag-NachtZyklus (Anschalten der Lichter um 6.00 Uhr) gehalten. Die Organisation der Tierpflege und –haltung wurde im Rahmen einer Zusammenarbeit mit dem Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen 2 MATERIAL UND METHODEN 14 Fakultät der RWTH Aachen von Reinhard Kluge übernommen. Für weitere Informationen bezüglich Rückkreuzung und Tierpflege sei auf das Kapitel Material und Methoden der Dissertation von Leona Plum „Identifizierung und Charakterisierung von Suszeptibilitätsloci für Typ-2-Diabetes mellitus in einem Mausmodell für das metabolische Syndrom“ hingewiesen (Plum, 2003). 2.2 Bestimmung der phänotypischen Parameter der Mäuse Im Alter von 22 Wochen wurde den Tieren in Isoflurananästhesie durch Herzpunktion Blut entnommen und für weitere Untersuchungen aufbewahrt. Dann wurde durch zervikale Dislokation der Tod herbeigeführt. Bei allen Tieren wurden die Lebern präpariert, bei einigen Tieren auch andere Organe (perigonadales Fett, Herz, Muskel und Pankreas), und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Langzeitlagerung der entnommenen Organe und Gewebeproben erfolgte bei -70°C. Das Körpergewicht wurde von der 3. bis einschließlich zur 22. Woche einmal wöchentlich bestimmt. Die Körperlänge (ohne Schwanz) wurde in der 22. Woche einmalig gemessen. Aus diesen Werten wurde der body mass index ermittelt (BMI = Körpergewicht [g]/Körperlänge [cm²]). Zur Überwachung des Verlaufs der Blutglucosewerte wurde in der 10., 12., 15., 17. und 22. Woche mittels eines Glucometers (Glucometer Elite, Fa. Bayer, Leverkusen) die Blutglucose bestimmt. Das Blut wurde dazu durch Punktion einer Schwanzvene mittels Lanzette beziehungsweise durch Blutentnahme (in der 10. und 22. Woche) gewonnen. Die Messung der 2 MATERIAL UND METHODEN 15 Glucosewerte im Plasma erfolgte unmittelbar nach Tötung der Tiere unter Verwendung eines Auto-Analyzers (Fa. Johnson & Johnson, Neckargemünd). Das Seruminsulin wurde bei allen Tieren nach Tötung in der 22. Woche, bei einigen Tieren auch in der 10. Woche, mittels eines Radio-Immuno-Assay mit dem BiotrakTM-System (Amersham, Buckinghamshire, England) bestimmt; dies alles in doppeltem Ansatz und wenn nötig, nach vorheriger Verdünnung des Ansatzes. Die Messung der Insulinwerte erfolgte freundlicherweise durch S. Winandy. 2.3 Isolierung der RNA und Analyse im Northern und Dot blot Aus den entnommenen Lebern ausgewählter Tiere wurde die GesamtRNA mittels der single-step Methode nach Chomczynski und Sacchi (1987) extrahiert. Northern blots wurden hergestellt, indem die Gesamt-RNA (je 15 Zg) in einem Agarosegel (1%) durch Formaldehyd-Elektrophorese aufgetrennt und mittels eines Kapillarblot auf positiv geladene Nylonmembran transferiert (Hybond N+, Amersham) wurde. Die gleichmäßige Beladung der Bahnen des Agarosegel mit gleichen Mengen RNA wurde durch Färbung mit Ethidiumbromid unter der UV-Lampe überprüft. Die Identität sämtlicher IMAGE cDNA-Klone (Lennon et al., 1996) wurde mittels Nukleotidsequenzanalyse bestätigt (Thermosequenase-CycleSequencing Kit, Amersham). Die Auftrennung im Polyacrylamid-Gel erfolgte mit der LI-COR 4000-Apparatur (LI-COR Inc), die Auswertung mit der zugehörigen Verwendung Base ImagIR-Software. geeigneter Die Restriktionsenzyme Plasmide verdaut, wurden durch die Inserts anschließend mit Hilfe des QIAquick gel extraction kit (Quiagen, Hilden) isoliert. 2 MATERIAL UND METHODEN 16 Tabelle 1: Liste der für die Northern blot und Dot blot –Hybrisierungen verwendeten cDNA Klone. Die Auswahl der untersuchten cDNAs basiert auf den Ergebnissen differentieller Hybridisierung eines high-density filter arrays und eines Affymetrix microarrays, außerdem auf Literatursuche und aufgrund ihrer Lage nahe des Genlocus Nidd/SJL (siehe Kapitel 3.3) (Lit. = Literatur; Kontr. = Kontrolle) Acyl-CoA-oxidase 3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase 5 Carnitin-palmitoyltransferase 2 Cytochrom P450 4A14 Enoyl-CoA-hydratase Fettsäuresynthase Ferritin light chain Glucokinase Glucose-6-phosphatase Insulinrezeptor-substrat 2 Ketoacyl-CoA-thiolase Leptin Malatenzym PEX 11a Phosphatidylinositol-3kinase, regulatory subunit Phosphoenolpyruvatcarboxykinase Phospholipidtransferprotein Abkürzung ACO Gen bank AI226683 Vektor pME18S-FL3 Verdau Xho I HSD3b5 AA880856 pBluescript SK EcoR I/Xho I CPT2 AI323697 pT7T3D-Pac EcoR I/Hind III CYP 4A14 ECH FAS W41435 AF030343 W43965 pT7T3D-Pac pME18S-FL3 pT7T3D-Pac pT7T3D-Pac pBS EcoR I/Hind III Xho I EcoR I/Hind III EcoR I/Hind III Pst I a b Sterol response element binding protein 1 Thioredoxinreductase a Kontr. x x x x x x x x G6Pase b IRS2 3986921 pCMV-Sport6 EcoR I/Hind III KCO AI195705 pME18S-FL3 Xho I AA823246 AA543997 pT7T3D-Pac pT7T3D-Pac EcoR I/Hind III EcoR I/Hind III p55PIK AA414954 pBluescribe Mlu I/Sal I PEPCK AF009605 pCMV-Sport6 EcoR I/Hind III PLTP AA681565 pT7T3D-Pac EcoR I/Hind III x AA475121 pT7T3D-Pac EcoR I/Hind III x RXRß AA139082 AI323514 pT7T3D-Pac pT7T3D-Pac EcoR I/Hind III EcoR I/Hind III SCD1 AI265570 pME18S-FL3 Xho I x SCPx AI226560 pME18S-FL3 BamH I/Nco I x SREBP1 BE632748 pT7T3D-Pac EcoR I/Hind III AI118416 pME18S-FL3 Xho I x x x x x c Pyruvatkinase, liver type Resistin Retinoid-X-receptor ß Stearoyl-CoAdesaturase 1 Sterol carrier protein X d Filter Chip Lit. Nidd/SJL x x x x x x x x x x x x cDNA Klon für Ferritin wurde zufällig durch Sequenzierung eines vertauschten IMAGE cDNA Klon identifiziert b cDNA Klone für Glucokinase und Glucose-6-phosphatase wurden freundlicherweise von den Drs. Tiedge (Hannover) und Barthel (Düsseldorf) zur Verfügung gestellt c cDNA Klon für Leptin lag vor (Igel et al., 1997) d Nidd/SJL-Gene im Bereich des Diabetes-Suszeptibilitätslocus auf Chromosom 4 (siehe Kapitel 3.3) 2 MATERIAL UND METHODEN Die so erhaltenen Sonden wurden durch 17 random oligonucleotide priming (Feinberg et Vogelstein, 1983) mit [N-32P]-dCTP (Amersham Biosciences) markiert und für die Hybridisierungen verwendet (siehe Tabelle). Die zu hybridisierenden Blots wurden drei Stunden bei 42°C in Prähybridisierungspuffer (4x SSC, EDTA, 50% Formamid, 5x DenhardtReagenz, 0,5% SDS, 0,1 mg/ml Fischsperma-DNA) vorhybridisiert. Dann wurde die markierte Sonde zugegeben und über Nacht bei 42°C hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Blots stringent in einer Waschlösung mit 120 mM Natriumchlorid, 12 mM Natriumcitrat, 0,1% SDS bei 55°C etwa 1 Stunde und 15 Minuten gewaschen. Zur Beseitigung der Sonde wurden die Blots mit 1% SDS bei 100°C für 20 Minuten gespült und anschließend mit anderen cDNA-Sonden rehybridisiert. Jeder Blot wurde zwei bis vier Mal wiederverwendet. Die Detektion der Banden erfolgte zum einen durch Auflegen eines Röntgenfilms, aber auch durch quantitative Phosphoreszenz-Analyse mit einem Phosphoimager. Die Auswertung der Signale wurde mittels des OptiQuant-Analyseprogramms durchgeführt. Bei der Auswertung der Dot blots wurden leere Stellen, an denen keine RNA aufgetragen worden war, als Hintergrund abgezogen. Von den mit Hilfe des OptiQuant-Analyseprogramms erhaltenen Werten wurden Mittelwert und Standardabweichung berechnet. Diese wurden in Säulendiagrammen dargestellt. Die Signifikanz der Ergebnisse (jeweils berechnet zwischen normalen und diabetischen und zwischen normalen und hyperglykämischen/insulinresistenten Tieren) wurde mit einem zweiseitigen T-Test errechnet. Signifikante Unterschiede der Expression (p<0,05) wurden durch Sternchen in den Diagrammen markiert. 2 MATERIAL UND METHODEN 18 Von ausgewählten männlichen Tieren wurde die Gesamt-RNA aus Fett von A. Scheepers (Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Medizinische Fakultät der RWTH Aachen) isoliert, auf Northern blots aufgebracht und freundlicherweise für die Hybridisierung mit den Sonden Leptin und Resistin zur Verfügung gestellt. 3 ERGEBNISSE 19 3 Ergebnisse 3.1 Charakterisierung der Versuchstiere 3.1.1 Die NZO-Maus Bei der NZO–Maus handelt es sich um einen Maus-Inzuchtstamm mit polygen bedingter Adipositas, die mit Insulinresistenz einhergeht. Ein Großteil der männlichen Tiere entwickelt einen Diabetes. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung der hepatischen Genexpression eines Mausstammes, der durch Rückkreuzung der NZO-Maus mit der SJL-Maus erzeugt wurde. Ursprünglich wurde dieses Rückkreuzungsmodell entwickelt, um die genetischen Grundlagen des Krankheitsbildes dieses Mausstammes aufzuklären (siehe Kapitel 1.5). Durch Rückkreuzung der F1-Generation (SJLxNZO) auf weibliche NZO-Mäuse entstanden die im Folgenden als NSZO-Mäuse bezeichneten Tiere, eine Population mit heterogenem Stoffwechselgeschehen und vergleichbarem genetischem Hintergrund. Um den Einfluss des Fettgehalts der Nahrung auf den Stoffwechsel der Mäuse untersuchen zu können, wurde ein Teil der Tiere mit normalem, andere mit fettreichem Futter gefüttert. Die Mäuse wurden ab der 3. Lebenswoche wöchentlich gewogen, der Blutzucker ab der 10. Woche regelmäßig bestimmt. Bei einigen Tieren wurde in der 10. Woche zusätzlich die Insulinkonzentration im Serum bestimmt. Zum Tötungstermin in der 22. Woche wurde die Länge gemessen, Blutzucker und Plasmainsulin bestimmt, Leber und Fett zur RNA-Isolierung entnommen. Die genannten Parameter wurden gemessen, um die Stoffwechselsituation der einzelnen Mäuse zu charakterisieren. 3 ERGEBNISSE 20 3.1.2 Einteilung der Mäuse in Gruppen unterschiedlichen Phänotyps Aus einer Anzahl von insgesamt 467 Mäusen (davon 378 fettreich gefüttert, 89 mit Standardnagerfutter) wurden für die in dieser Arbeit beschriebene Charakterisierung der hepatischen Genexpression sowohl aus der Gruppe der fettreich als auch aus der Gruppe der mit Standardnagerfutter gefütterten Tiere nach ausgewählt bestimmten und den zuvor definierten Kriterien Tiere drei Gruppen „normal“ (normoglykämisch/normoinsulinämisch), „diabetisch“ (hyperglykämisch/hypobis aninsulinämisch) und „hyperinsulinämisch/insulinresistent“ (normoglykämisch/hyperinsulinämisch) zugeordnet (siehe Tabelle 2). Um die Unterschiede in der hepatischen Genexpression zwischen diesen drei Stadien des normalen und des gestörten (d.h. Diabetes und Insulinresistenz) Fett- und Glucosestoffwechsels so klar wie möglich nachweisen zu können, wurden aus der großen zur Verfügung stehenden Tierzahl Mäuse ausgewählt, deren metabolischer Zustand möglichst charakteristisch war, also die diabetischen Tiere mit besonders hohem Blutzucker und niedrigem Insulin, die hyperinsulinämischen Tiere mit besonders hohen Insulinwerten und normalem Blutzucker. Dabei ist jedoch zu beachten, dass die Grenzwerte für Blutglucose und Plasmainsulin bei den einzelnen Gruppen unterschiedlich gewählt werden mussten, da zum Beispiel selbst eindeutig insulinresistente Weibchen nicht so extrem hohe Insulinwerte erreichten wie die entsprechenden Männchen. Außerdem gab es unter Standardfütterung deutlich weniger kranke Tiere als unter fettreicher Diät. Daher wurden von den Tieren unter Standarddiät alle diabetischen Tiere in die Versuche einbezogen, die zum Zeitpunkt des Beginns der Versuche zur Verfügung standen, während unter den fettreich gefütterten Tieren aus einer relativ großen Zahl kranker Tiere die am geeignetsten erscheinenden ausgewählt werden konnten. 3 ERGEBNISSE 21 Als normal galten die Tiere, wenn sie zum Zeitpunkt der Tötung in der 22. Woche einen normalen Insulinspiegel im Plasma und normale Blutzuckerwerte aufwiesen. Für die Mäuse dieser Rückkreuzung kann ein Blutzuckerwert bis ca. 15 mmol/l noch als normal angenommen werden, ein Wert, der für andere Nager schon als pathologisch einzustufen wäre. So hatte zum Beispiel kein Tier der als Kontrolle verwendeten SJL-Tiere einen Blutzucker von über 9 mmol/l. Ähnliches gilt für die Plasmainsulinwerte, die bei männlichen NSZO-Mäusen noch bei Werten bis 10 ng/ml als normal betrachtet werden können. Tabelle 2: Einteilung der Versuchstiere in Gruppen in Abhängigkeit von Blutglucose (BG) und Plasmainsulin (Plas-Insulin). (KG = Körpergewicht; BMI = body mass index = KG/Körperlänge²); angegeben sind Mittelwert und Standardabweichung. n KG KG-Diff. BMI BG Plas-Insulin Grenzwerte Grenzwerte wk. 22 12.-22. wk. wk. 22 wk. 22 wk. 22 BG Plas-Insulin g g g/cm² mM ng/ml mM ng/ml Fettreiche Fütterung NSZO, männlich normoglykämisch 7 53,0 ±8,1 11,6 0,42 <15 7 54,8 ±6,7 1,5 0,42 6,6 ±2,4 33,0 ±0,7 a 4,5 ±2,5 diabetisch 0,6 ±0,8 >30 <10 < 0,6 b hyperinsulinämisch 7 70,7 ±5,0 17,2 0,52 12,6 ±1,5 57,3 ±26,5 <15 >25 <15 <15 c <2 >10 d <10 NSZO, weiblich normoglykämisch 7 45,3 ±5,4 7,6 0,37 7,3 ±1,2 0,8 ±0,4 hyperinsulinämisch 7 54,9 ±6,2 13,8 0,43 10,0 ±2,5 16,9 ±8,5 6 30,2 ±2,9 3,0 0,31 8,3 ±0,5 0,5 ±0,4 6 21,5 ±0,6 2,2 0,24 7,7 ±0,5 0,2 ±0,1 SJL, männlich normoglykämisch SJL, weiblich normoglykämisch Standardfütterung NSZO, männlich normoglykämisch 3 44,1 ±4,6 6,5 0,36 <15 3 42,8 ±2,1 -5,9 0,34 10,3 ±3,5 33,2 ±0,1 a 4,6 ±0,9 diabetisch 1,3 ±0,7 >30 <2 hyperinsulinämisch 4 55,2 ±2,7 11,1 0,42 12,7 ±1,6 41,9 ±2,1 <15 >25 3 37,9 ±2,1 4,7 0,33 7,8 ±1,0 1,2 ±0,2 <15 <2 NSZO, weiblich normoglykämisch a bei mehreren Tieren wurde das Ende des Messbereichs des Glucometers erreicht (Anzeige „HI“ > 600mg/dl = 33,31 mmol/l) b ein Tier mit 2,65 ng/ml c ein Tier mit 15, 93 mM d ein Tier mit 2,85 ng/ml 3 ERGEBNISSE 22 Zu der Gruppe der diabetischen Tiere wurden Mäuse gezählt, die bei Tötung nur noch sehr wenig Insulin hatten und entsprechend die Blutglucose nicht mehr auf normale Werte herunterregeln konnten. Bei in der 10. Woche durchgeführten Messungen des Seruminsulins zeigten fast alle der untersuchten diabetischen Tiere erhöhte Insulinspiegel bei noch normalem Blutzucker, im Sinne einer Insulinresistenz (Werte nicht in Tabelle 2 aufgeführt). Als hyperinsulinämisch/insulinresistent wurden die Tiere klassifiziert, wenn sie noch normale Blutzuckerwerte zeigten, dies aber im Zusammenhang mit extrem hohen Insulinwerten. Damit standen phänotypisch klar definierte Gruppen von Tieren zur Verfügung, an denen die Auswirkungen der metabolischen Dysregulation auf die hepatische Genexpression studiert werden konnten. 3.1.3 Einfluss von Geschlecht und Diät Um geschlechtsspezifische Unterschiede aufdecken zu können, wurden sowohl weibliche als auch männliche Tiere in die Versuche einbezogen. Vergleicht man die Unterschiede zwischen den Geschlechtern, so fällt auf, dass die männlichen Tiere insgesamt ein schwereres Krankheitsbild aufweisen. So fallen die Insulinwerte der hyperinsulinämischen Tiere, als Maß des Grades der Insulinresistenz, bei den weiblichen Tieren weniger hoch aus als bei den Männchen. Außerdem entwickelte keines der Weibchen bis zur 22. Woche einen Diabetes, so dass in der Gruppe der mit fettreichem Futter gefütterten Weibchen nur normoglykämische und 3 ERGEBNISSE 23 hyperinsulinämische Tiere für die Experimente zur Verfügung standen. Die Gruppe der mit Standardfutter gefütterten Weibchen war einheitlich normoglykämisch und normoinsulinämisch und in ihrem Phänotyp den stoffwechselgesunden SJL-Tieren ähnlich. Fettreiches Futter verstärkte die Tendenz zur Entwicklung von Adipositas und Insulinresistenz beziehungsweise Diabetes. Dies zeigt sich schon in der Fallzahl: während sich unter den fettreich gefütterten Männchen sehr viele stoffwechselkranke Tiere fanden, waren Diabetes und Insulinresistenz bei den normal gefütterten Tieren eher selten. Bei den Weibchen wurde nur unter fettreicher Fütterung eine pathologische Veränderung der Stoffwechselparameter im Sinne einer Insulinresistenz gefunden. Auffällig ist, dass die Tiere, die einen Diabetes entwickeln, zwischen der 12. und 22. Woche nur noch wenig an Gewicht zunehmen oder sogar, bei Fütterung mit Standarddiät, Gewicht verlieren. Die Tiere, die bis zur Tötung in der 22. Woche eine Insulinresistenz entwickelten, zeigten eine stärkere Gewichtszunahme als die normalen Tiere. Generell sind unter Standarddiät BMI und Körpergewicht niedriger als unter fettreicher Fütterung. Um einen extrem schlanken Mausstamm zum Vergleich heranziehen zu können, wurden auch Tiere der Parentalgeneration untersucht. Die als Muttertiere verwendeten Blutzuckerwerte SJL-Mäuse und ein deutlich Rückkreuzungstiere. Die zeigten niedrigeres NZO-Männchen normale Insulin- Körpergewicht konnten nicht und als die in die Untersuchungen mit einbezogen werden, da diese Tiere einen so schweren Diabetes entwickeln, dass sie großteils schon vor Erreichen der 22. Woche starben oder aber wegen des schweren Krankheitsbildes getötet werden mussten. 3 ERGEBNISSE 24 3.2 Nachweis spezifischer mRNAs durch Northern und Dot blots Die Methode zum Nachweis der mRNA verschiedener am Fett- und Glucosestoffwechsel beteiligter Enzyme sollte es erlauben, interindividuelle Unterschiede zwischen den Tieren einer Untergruppe zu identifizieren und diese auszuwerten. Es wurden Northern blots hergestellt, in denen pro Spur die RNA eines Tieres aufgetragen wurde. Zum Vergleich wurden Dot blots hergestellt, in denen jeder Punkt die RNA eines Tieres enthält. Die Abb. 3A zeigt eine Gegenüberstellung der Northern blots einzelner Tiere und der entsprechenden Punkte im Dot blot am Beispiel von SREBP1, einem insulinregulierten Transkriptionsfaktor (siehe Kapitel 3.4). Es gibt drei Isoformen von SREBP, die von zwei verschiedenen Genen transkribiert werden, dem SREBP1- und dem SREBP2-Gen. Zwei dieser drei Isoformen stammen von dem SREBP1-Gen. Durch Benutzung zweier verschiedener Promotoren entstehen mRNAs mit zwei alternativen 5’-Exons, die für Proteinvarianten mit alternativem N-Terminus kodieren (Brown et Goldstein, 1997). Entsprechend können in den Northern blots diese beiden als SREBP1a und SREBP1c bezeichneten Varianten nicht voneinander unterschieden werden. Es ist bekannt, dass SREBP1c in der Leber um ein vielfaches höher exprimiert wird als SREBP1a (Shimomura et al., 1997). Man kann also davon ausgehen, dass die im Northern blot gezeigte Bande in erster Linie SREBP1c repräsentiert. Da jedoch eine klare Unterscheidung nicht möglich ist, wird in dieser Arbeit unter Bezug auf die Ergebnisse nur von SREBP1 gesprochen werden. Die Intensität der Signale entspricht einander bei einem Vergleich der beiden Methoden. Es ist jedoch zu beachten, dass die Punkte eine generell etwas höhere Signalintensität haben, da auch die unspezifisch bindenden 3 ERGEBNISSE 25 RNAs enthalten sind, wie zum Beispiel die 18S- und 28S-Banden der ribosomalen RNA. Dieses Ergebnis zeigt, dass die mit der Hybridisierung erreichten Signalintensitäten der Northern und der Dot blots der Einzeltiere gut korrelieren (Abb. 3A). Daher wurde die leichter handhabbare Methode der Dot blots verwendet. Diese bietet neben der besseren Praktikabilität außerdem den Vorteil einer besseren Vergleichbarkeit, da bei Verwendung eines Dot blots alle untersuchten RNAs auf einer Membran Platz finden, während bei den Northern blots die Proben auf unterschiedliche Gele aufgetragen werden und deshalb mehrere Hybridisierungsansätze in mehreren Hybridisierungsröhren notwendig sind. Gleichzeitig bleibt die Möglichkeit erhalten, interindividuelle Unterschiede zwischen einzelnen Tieren und die Streuung beobachten und kontrollieren zu können (siehe Kapitel 3.8). Als Kontrolle, ob die Sonde mit der RNA der richtigen Größe hybridisiert hatte, wurden die RNAs der den Gruppen zugeordneten Einzeltiere vereinigt und im Northern blot untersucht. Für jedes untersuchte Gen, das heißt mit jeder der verwendeten Sonden, wurde also ein Dot blot mit den RNAs aller Einzeltiere und ein Northern blot mit den 11 Pools der 11 Tiergruppen hybridisiert (Abb. 3B). 3 ERGEBNISSE A 26 diabetisch hyperinsulinämisch normoglykämisch hyperinsulinämisch NSZO Fettreiches Futter NSZO normoglykämisch normoglykämisch diabetisch hyperinsulinämisch normoglykämisch NSZO Standardfutter SJL normoglykämisch B Fettreiches Fu tter NSZO SJL Standardfu tter NSZO Northern b lot Poo ls 1,8 1,6 1,4 1,2 Dot blot Einze ltiere 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 N D H N H N N N D H N N D H N H N N N D H N 1,6 1,4 1,2 1 Northern b lot 0,8 E inzeltiere 0,6 0,4 0,2 0 Kontrolle: Ferritin Abb. 3: Hepatische Genexpression von SREBP1 bei NSZO-Mäusen. A) NSZO-Mäuse wurden mit Standardoder fettreichem Futter gefüttert. Anhand ihrer metabolischen Eigenschaften wurden die Tiere in Gruppen eingeteilt (N, normal; D, diabetisch; H, hyperinsulinämisch). In der 22. Woche wurde von NSZO-Tieren und SJL-Tieren LeberRNA gewonnen und zur Northern- bzw. Dot blot-Analyse mit cDNA-Sonden verwendet. Hier sind die Hybridisierungsergebnisse von Northern und Dot blots am Beispiel des Transkriptionsfaktors SREBP1 gegenübergestellt. Jeder Punkt bzw. jede Bande entspricht der RNA eines Tieres. B) Zur besseren Darstellung wurden die RNAs der individuellen Tiere einer Gruppe gepoolt. Darunter im Vergleich die Auswertung der Northern und Dot blots von Einzeltieren im Säulendiagramm (Mittelwert und Standardabweichung; gefüllte Balken für Männchen, offene für Weibchen). Für die Hintergrundintensität wurden jeweils am Blot gemessene Werte abgezogen Die Kontrollhybridisierung mit Ferritin zeigt eine gleichmäßige Beladung der Gelspuren. 3 ERGEBNISSE 27 Im Folgenden wurden zur quantitativen Auswertung (zur Darstellung in den Diagrammen) die Dot blots herangezogen, um so auch die Streuung der experimentell ermittelten Messwerte innerhalb der drei Tiergruppen kontrollieren zu können. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind begleitend die Northern blots der zu Pools vereinigten RNAs gezeigt. Sie wurden jedoch nicht zur quantitativen Auswertung verwendet. 3.3 Auswahl der untersuchten Gene Insgesamt wurden 22 Gene auf ihre differentielle Expression in den verschiedenen Tiergruppen untersucht (siehe Tabelle 1). Ein Teil dieser Gene war zuvor durch globale Expressionsuntersuchungen identifiziert worden. Dabei wurden in unabhängig von dieser Arbeit durchgeführten Versuchen aus Leber-RNA von ebenfalls in drei Gruppen eingeteilten NSZO-Mäusen cDNASonden erzeugt und zur Hybridisierung von high-density filter arrays und Affymetrix microarrays eingesetzt (Dissertation T. Kantner, in Vorbereitung). Gene, die in diesen Array-Analysen eine differentielle Expression gezeigt hatten, wurden in dieser Arbeit, die zusätzlich weibliche Tiere und verschieden fettreiche Fütterungen einbezieht, erneut untersucht. Andere, als „Kandidatengene“ bezeichnete Gene wurden untersucht aufgrund ihrer Lage in der Nähe des Genlocus (Nidd/SJL) auf Chromosom 4, der in anderen Versuchen als Genort für ein Diabetes-induzierendes oder die Diabetesentwicklung begünstigendes Gen identifiziert worden war (Plum et al., 2000). 3 ERGEBNISSE 28 Schließlich wurden in die Versuche Gene einbezogen, die aufgrund ihrer bekannten Rolle im Insulin- und Glucosestoffwechsel versprachen, Aufschluss über die Pathophysiologie von Diabetes und Insulinresistenz bei der NSZO-Rückkreuzung zu geben. 3.4 An der Lipogenese beteiligte Enzyme und PLTP Ein Teil der untersuchten Gene kodiert für Enzyme, wie Fettsäuresynthase (FAS), Malatenzym und Stearoyl-CoA-Desaturase 1 (SCD1), die im Stoffwechsel an der Lipogenese beteiligt sind, indem sie die Umwandlung von Kohlenhydraten in Fettsäuren katalysieren. Es ist bekannt, dass die Expression einiger dieser Gene durch Insulin induziert wird (siehe Kapitel 1.2). Dem entsprechend sind ihre mRNAs im Diabetes reduziert und bei den hyperinsulinämischen Tieren hochreguliert (siehe Abb. 4). Von einigen der aufgeführten Transkripte ist bekannt, dass der Insulineffekt über den Transkriptionsfaktor SREBP1 vermittelt wird (Shimomura et al., 1998b; Foretz et al., 1999b). Daher wurde auch die Expression von SREBP1 untersucht und ein im Prinzip ähnliches Expressionsprofil gefunden, d.h. eine verminderte, jedoch nicht völlig supprimierte Expression im Diabetes bei leichter Erhöhung im Status der Insulinresistenz. Überraschend ist der Einfluss des fettreichen Futters: trotz des hohen Fettgehalts der Nahrung zeigt sich eine vermehrte Aktivierung der Lipogenese in Form einer vermehrten Expression der an der Lipogenese 3 ERGEBNISSE 29 beteiligten Enzyme. Die ebenfalls fettreich gefütterten SJL-Mäuse hingegen zeigen eine niedrigere Expression von FAS und SCD1. Fettreiches Futter 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Fettreiches Futter NSZO NSZO Standardfutter SJL NSZO 3 * * * * 2,5 2 * 1,5 1 * 0,5 0 N D H N 3 H N N N D H N N H N H N N N D H N H N SREBP 1 1,6 2 1,5 1 * 0,5 D 1,8 * 2,5 SCD 1 Standardfutter SJL Malatenz ym FAS NSZO * 1,4 1,2 1 * 0,8 0,6 0,4 * 0,2 0 0 N D H N H N N N D H N N D H N H N N N D Abb. 4: Hepatische Genexpression von an der Lipogenese beteiligten Enzymen. SREBP1 vermittelt die durch Insulin induzierte Expression von Enzymen, die an der Umwandlung von Kohlenhydraten zu Fettsäuren beteiligt sind, wie Fettsäuresynthase (FAS), Malatenzym und Stearoyl-CoA-Desaturase (SCD 1). Verwendet wurde eine cDNA-Sonde für SREBP1. Da in der Leber hauptsächlich die Spleißvariante SREBP1c exprimiert wird (Shimomura et al., 1997), kann davon ausgegangen werden, dass die Hybridisierung vor allem mit dieser Isoform stattfand (siehe Kapitel 3.2). Zur Erklärung der Darstellungsweise, siehe Abb. 3. Signifikante Änderungen der Expression (p<0,05) sind mit Sternchen gekennzeichnet (jeweils im Vergleich zwischen normalen und diabetischen bzw. normalen und hyperinsulinämischen/insulinresistenten Tieren). Pyruvatkinase, ein Enzym der Glykolyse, zeigt ein ähnliches Expressionsmuster wie die zuvor genannten Enzyme der Lipogenese: eine Reduktion im Diabetes und eine vermehrte Expression bei 3 ERGEBNISSE 30 hyperinsulinämischen Tieren. Dies gilt auch für das an Glykogenese und Lipogenese beteiligte Enzym Glucokinase, welches, wie die schon erwähnte Pyruvatkinase, ebenfalls der Regulation von SREBP1 unterliegt (Foretz et al., 1999a). Demnach ist SREBP1 als Transkriptionsfaktor auch für frühe Schritte der Lipogenese von Bedeutung. Bei beiden Enzymen, Glucokinase und Pyruvatkinase, findet sich auf der Ebene der Genexpression eine Steigerung der entsprechenden mRNAs durch fettreiche Fütterung (siehe Abb. 5). 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Standardfutter NSZO Fettreiches Futter NSZO SJL Standardfutter NSZO 1,6 Glucokin ase Pyruvatkinase Fettreiches Futter NSZO SJL * 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 N D H N H N N N D H N N D H N H N N N D H N Abb. 5: Expression der mRNA von Pyruvatkinase und Glucokinase in der Leber. Aufgrund von Kreuzhybridisierung mit einer nicht identifizierten mRNA (*) konnte der Dot blot nicht zur quantitativen Auswertung verwendet werden. Stattdessen wurde die untere Bande des abgebildeten Northern blot der gepoolten RNAs zur Auswertung herangezogen. Daher war eine Berechnung von Standardabweichung und Signifikanz nicht möglich. Phospholipidtransferprotein (PLTP) vermittelt den Transfer von Phospholipiden aus triglyceridreichen Lipoproteinen auf high densityLipoproteine (HDL). Es übernimmt eine wichtige Regulationsfunktion für Zusammensetzung und Größe, wie auch für die Plasmaspiegel von HDL (Yamashita et al., 2001; Huuskonen et al., 2001). 3 ERGEBNISSE 31 Die mRNA von PLTP zeigt ein ähnliches Expressionsschema wie die zuvor erwähnten Enzyme der Lipogenese, nämlich eine Reduktion im Diabetes bei vermehrter Expression in der Insulinresistenz (siehe Abb. 6). Außerdem findet sich ein Geschlechtsdimorphismus. Bei den weiblichen Tieren, vergleicht man normale Männchen mit normalen Weibchen beziehungsweise insulinresistente Männchen mit den entsprechenden Weibchen, ist PLTP fast doppelt so stark exprimiert. Auch bei den als Kontrolle verwendeten SJL-Weibchen findet sich diese vermehrte Expression. Fettreiche Fütterung steigert auch in diesem Fall die Genexpression. Fettreiches Futter NSZO 3 Standardfutter NSZO SJL Abb. 6: Expression v on Phospholipidtransf erprotein (PLTP ). * 2,5 PLTP 2 1,5 1 * * 0,5 0 N D H N H N N N D H N 3.5 Fettsäure-Oxidation Es wurden mehrere an der Oxidation von freien Fettsäuren beteiligte Gene untersucht, darunter Ketoacyl-CoA-thiolase, Acyl-CoA-oxidase, EnoylCoA-hydratase und Cytochrom P450 4A14 (CYP 4A14). Es ist bekannt, dass 3 ERGEBNISSE 32 die Expression dieser Gene durch den Transkriptionsfaktor PPARN reguliert wird (siehe Kaptitel 1.2). ß-Oxidation findet in Mitochondrien und Peroxisomen statt. In Mitochondrien wird der Großteil der kurz-, mittel- und langkettigen Fettsäuren ß-oxidiert, die mit der Nahrung aufgenommen werden. Peroxisomen sind vor allem an der Kürzung langkettiger Fettsäuren und Fettsäure-CoAs beteiligt (Reddy et Hashimoto, 2001). Drei der aufgeführten Enzyme, nämlich Ketoacyl-CoA-thiolase, Acyl-CoA-oxidase und Enoyl-CoA-hydratase, sind an der peroxisomalen ß-Oxidation beteiligt. Fettreiches Futter Fettreiches Futter Standardfutter SJL NSZO NSZO Acyl-CoA-oxid ase Keto-acyl-CoA-thiolase NSZO 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 D H N H N N N D H 3,5 * 3 2,5 * 2 * 1,5 1 0,5 NSZO * N N Cytochrom 4A14 Eno yl-CoA-h ydratase N 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Standardfutter SJL 8 D H N H N N N H N H N N N D H N * 7 6 5 4 3 2 1 0 0 N D H N H N N N D H N N D D H N Abb. 7: mRNA-Expression von an der Oxidation freier Fettsäuren beteiligter Enzyme. Peroxisomale Ketoacyl-CoA-thiolase, Acyl-CoA-oxidase, Enoyl-CoAhydratase und Cytochrom P450 4A14. 3 ERGEBNISSE 33 CYP 4A14 ist eine mikrosomale a-Oxidase, das heißt sie oxidiert gesättigte und ungesättigte Fettsäuren am letzten und vorletzten C-Atom. Oxidaton von Fettsäuren an der a-Position ist normalerweise ein quantitativ vernachlässigbarer Nebenpfad des Fettsäuremetabolismus, im Verhältnis zur mitochondrialen ß-Oxidation. Jedoch gewinnt dieser Pfad an Bedeutung in Phasen gesteigerten Fettsäureangebots an die Leber, wie dies zum Beispiel im Diabetes der Fall ist (Kroetz et al., 1998). Die genannten Fettsäure-abbauenden Enzyme werden bei diabetischen Tieren teilweise deutlich vermehrt exprimiert. Ebenfalls in der Phase der Insulinresistenz wird ihre Expression in der Leber leicht vermehrt induziert, im Vergleich zu den normalen Tieren. Besonders eindrücklich zeigen sich diese Veränderungen bei CYP 4A14; außerdem fällt deutlich der Effekt des fettreichen Futters ins Auge, der die schon gesteigerte Expression – besonders im Diabetes – noch weiter steigert (siehe Abb. 7). Fettreiches Fu tter Standardfu tter SJ L NSZO NSZO 1,2 1,0 SCPx 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 N D H N H N N N D H N Abb. 8: Hepatische Genexpression v on Sterol Carrier Protein X (SCPx). SCPx (2,8 kb) wird diff erentiell exprimiert. Die ebenf alls abgebildete, mit 1,5 kb kleinere Spleißv ariante SCP2 (*) zeigt keine diff erentielle Expression. Auf grund der Überlagerung der Sign ale v on SCPx und SCP2 in den Punkten des Dot blot wurde i n diesem Falle nur die oberste Bande (SCPx, kein *) des abgebildeten Northern blot zur quantitativ en Auswertung herangezog en. Eine Berechn ung der Standardab weichung ist daher nicht möglich. 3 ERGEBNISSE 34 Durch zwei unabhängig voneinander regulierte Promotoren werden von dem SCPx/SCP2-Gen zwei in Größe und Funktion unterschiedliche mRNAs transkribiert, die für zwei Proteine mit unterschiedlichen Funktionen codieren. Sterol carrier protein 2 (SCP2) ist involviert im intrazellulären Lipidtransfer, während Sterol carrier protein x (SCPx) als peroxisomale ßKetothiolase fungiert und spezifisch verzweigtkettige Fettsäuren abbaut (Ohba et al., 1995, Wanders et al., 1997). Auffällig ist vor allem der Unterschied zwischen den Geschlechtern, der bei den Männchen eine deutlich höhere Expression als bei den Weibchen zeigt. Dieser Effekt ist nicht nur auf die NSZO-Tiere beschränkt, sondern findet sich auch in der Kontrollgruppe der SJL-Mäuse. Die Spleißvariante SCP2 hingegen weist keinen Geschlechtseffekt auf (siehe Abb. 8). Bemerkenswert ist, dass SCPx bei den Männchen in der Insulinresistenz vermindert exprimiert wird, im Diabetes jedoch in einer Menge ähnlich wie man sie bei den normalen Tieren findet. Dies gilt sowohl für die fettreiche, als auch für die normale Fütterung. Bei den Weibchen hingegen bewirkt die Insulinresistenz eine Steigerung der Expression von SCPx. 3.6 Gluconeogenese Phosphoenolpyruvatcarboxykinase (PEPCK) und Glucose-6- phosphatase sind Schlüsselenzyme der Gluconeogenese (siehe Kapitel 1.2). Ihre Expression wird normalerweise durch Insulinwirkung reprimiert. 3 ERGEBNISSE 35 Fettreiches Futter Glucose-6-Phosphatase NSZO Standardfutter SJL Fettreiches Futter NSZO NSZO 1,6 Standardfutter SJL NSZO 3 1,4 2,5 IRS 2 1,2 1 0,8 0,6 2 1,5 1 0,4 0,5 0,2 0 0 N 6 D H N H N N N D H N * PEPCK 4 3 D H N H N N N D H N Abb. 9: Differentielle Expression der mRNA von an der Gluconeogenese beteiligten Enzymen. Glucose-6-Phosphatase, InsulinRezeptor-Substrat (IRS2) und Phosphoenolpyruvatcarboxykinase (PEPCK). * 5 N * 2 1 0 N D H N H N N N D H N Entsprechend sieht man in Abb. 9, dass die PEPCK-mRNA aufgrund des Fehlens von Insulin im Diabetes deutlich stärker exprimiert wird. Bei den insulinresistenten, hyperinsulinämischen Tieren zeigt sich in Folge der Resistenz gegenüber der Insulinwirkung trotz der hohen Insulinspiegel keine verminderte Expression, sondern eine den normalen Tieren (mit normalen Insulinwerten) entsprechende Menge an PEPCK-mRNA bei Fütterung mit Standardnagerfutter, bei fettreicher Fütterung kommt es sogar zu einer signifikant gesteigerten PEPCK-mRNA-Expression in der Insulinresistenz. Im Gegensatz zu den meisten anderen untersuchten Genen wirkt sich die fettreiche Fütterung nicht auf die Expression aus. 3 ERGEBNISSE 36 Überraschenderweise zeigt die ebenfalls an der Gluconeogenese beteiligte Glucose-6-phosphatase ein gänzlich anderes Expressionsmuster: sämtliche NSZO-Mäuse – unabhängig von Geschlecht und metabolischem Status – zeigen deutlich höhere mRNA-Mengen als die zur Kontrolle untersuchten SJL-Parentaltiere. Selbst die mit Standarddiät gefütterten NSZO-Weibchen, die weder insulinresistent noch adipös sind, weisen eine höhere Expression an Glucose-6-phophatase-mRNA auf, als die fettgefütterten SJL-Tiere (siehe Abb. 9). IRS2 ist ein Protein, welches an der durch Bindung von Insulin am Insulinrezeptor ausgelösten Signalkaskade beteiligt ist und unter anderem die Hemmung der Expression von PEPCK und Glucose-6-Phosphatase vermittelt (Shimomura et al., 2000). Die mRNA von IRS2 ist bei diabetischen Tieren leicht vermehrt, bei den hyperinsulinämischen Mäusen leicht vermindert exprimiert. Außerdem haben die weiblichen Tiere generell eine etwas höhere IRS2-Expression in den Hepatozyten. Zwischen SJL- und NSZO-Mäusen ist kein großer Unterschied in der Expression zu erkennen. Die unterschiedlich fettreiche Fütterung zeigt keinen erkennbaren Effekt (siehe Abb. 9). 3.7 3ß-Hydroxysteroid-dehydrogenase 5 (Hsd3b5) Die differentielle Regulation dieses Gens wurde erstmals durch ArrayUntersuchungen aufgedeckt. Wie bei SCPx, so konnte auch im Falle der 3ßHydroxysteroid-dehydrogenase 5 (Hsd3b5) die Auswertung nicht anhand der Dot blots vorgenommen werden, da auch in diesem Falle mehrere RNAs mit der Sonde hybridisierten und die Signalintensitäten der verschiedenen Kreuzhybridisierungen in einem Punkt vereint waren. 3 ERGEBNISSE 37 Fettreiches Futter NSZO SJL Standardfutter NSZO 1,6 1,4 Hsd3b5 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 Abb. 10: Genexpression v on 3ßHy droxy steroid-dehy drogenase 5 (Hsd3b5). Die kreuzreagierende Isof orm (*) zeigt keine diff erentielle Expression. Um die Isoformen in der quantitativ en Auswertung v oneinander trennen zu können, wurde nur die oberste Bande des hier abgebildeten Northern blot der gepoolten RNAs berücksichtigt. 0,2 0,0 N D H N H N N N D H N Hsd3b5 gehört zu einer Familie recht nahe verwandter Enzyme, die eine essentielle Rolle für den Metabolismus von Steroidhormonen spielen (Abbaszade et al., 1995, Payne et al., 1997). Aufgrund der starken Ähnlichkeit der Sequenzen der verschiedenen Isoformen hat die verwendete Sonde offensichtlich mit mehreren dieser Isoformen kreuzreagiert (davon eine abgebildet, *). Das in den Hybridisierungen differenziell exprimierte Enzym ist mit großer Wahrscheinlichkeit Hsd3b5, da dieses bekanntermaßen bevorzugt in der Leber vorkommt und einen starken Geschlechtsdimorphismus aufweist; Hsd3b5 ist fast ausschließlich ab der Pubertät in den Lebern männlicher Tiere nachzuweisen. Es fungiert als 3-Ketosteroidreduktase in der Inaktivierung von Androgenen (Abbaszade et al., 1995, Payne et al., 1997). Der Northern blot zeigt eine deutliche Reduktion der Expression im Diabetes. Die mRNA-Menge in der Insulinresistenz und bei den normalen Tieren, sowohl bei den Weibchen als auch bei den Männchen, ist nahezu identisch. Es zeigt sich deutlich die zu erwartende bei den weiblichen Tieren 3 ERGEBNISSE 38 verminderte Expression von Hsd3b5. Die mit Standardfutter gefütterten normalen Männchen exprimieren höhere Mengen Hsd3b5-mRNA als die fettreich gefütterten normalen Mäuse (siehe Abb. 10). Dies ist interessant in Hinsicht auf die Tatsache, dass es bei mehreren der untersuchten Gene die fettreiche Fütterung ist, die zu einer Expressionssteigerung führt. 3.8 Gene des Nidd/SJL-Diabetes-Locus Die in dieser Arbeit unter dem Begriff „Kandidatengene“ zusammengefassten Gene haben sehr unterschiedliche Funktionen und Effekte. Gemeinsam ist ihnen, dass sie nahe eines die Diabetesentstehung der NZO-Maus begünstigenden Locus auf Chromosom 4 des Mausgenoms lokalisiert sind (siehe Kapitel 1.5). Phosphatidylinositol-3-kinase (p55PIK) und Thioredoxinreductase (siehe Tabelle 1) zeigen keine differentielle Expression und sind daher nicht abgebildet. Fettreiches Futter NSZO SJL 1,8 NSZO Standardfutter SJL NSZO 3 * 1,6 2,5 1,4 1,2 RXRß CPT2 Fettreiches Futter Standardfutter NSZO * 1 0,8 2 1,5 * 1 0,6 0,4 * 0,5 0,2 0 0 N D H N H N N N D H N N D H N H N N N D H N Abb. 11: Carnitin-palmitoyl-transferase 2 (CPT2) und Retinoid-X-Rezeptor ß (RXRß). Bei der quantitativen Auswertung von RXRß im Säulendiagramm wurden vier Tiere, die zu unterschiedlichen Gruppen gehören und auffallend hohe Mengen RXRß-mRNA aufwiesen, nicht berücksichtigt (siehe Abb. 12) 3 ERGEBNISSE 39 Carnitin-palmitoyl-transferase 2 (CPT2) ist ein in der inneren Mitochondrienmembran lokalisiertes Protein. Zusammen mit der in der äußeren Mitochondrienmembran gelegenen CPT1 initiiert sie die mitochondriale Oxidation langkettiger Fettsäuren, indem sie diese ins Mitochondrium transportiert. CPT1 wird durch Malonyl-CoA inhibiert, CPT2 hingegen nicht (Park et al., 1995). Die für CPT2 gefundenen Effekte auf Ebene der Genexpression sind allerdings gering. Lediglich die diabetischen Tiere weisen deutlich erhöhte Mengen CPT2-mRNA in der Leberzelle auf (siehe Abb.11). Abb. 12: Mit RXRß-cDNA-Sonde hybridisierter Dot blot. Wiederholung mit einem zweiten Dot blot und mit Northern blots der Einzeltiere ergaben identische Ergebnisse (nicht abgebildet). Tabelle 3: Blutwerte und Körpermaße für die vier Tiere mit extremen Signalintensitäten. (Werte für Triglyceride (TG) und Cholesterin (Chol) freundlicherweise zur Verfügung gestellt von S. Winandy) Futter Fett Fett Standard Standard Sex D D N R m m w m KG-Diff. 12.-22. wk. g 7,2 8,4 6,9 10,9 BMI wk. 22 g/cm² 0,45 0,42 0,34 0,43 BG wk. 22 mM 31,31 33,31 8,72 9,55 Ser-Insulin wk. 10 ng/ml 9,9 5,63 8,6 Plas-Insulin wk. 22 ng/ml 0,25 2,65 1,05 44 TG wk. 22 mmol/l 1,19 1,27 0,83 3,65 Retinoid-X-Rezeptor ß (RXRß) ist ein Transkriptionsfaktor, der als Heterodimer mit PPARs in der Zelle vorliegt. Bindung eines Liganden an einem der beiden Rezeptoren kann den ganzen Komplex aktivieren, Bindung an beiden Rezeptoren führt zu stärkerer Aktivierung (Kersten et al., 2000). Auf den Dot blots und auch auf zur Kontrolle durchgeführten Northern blots Chol wk.22 mmol/l 4,3 4,83 3,57 4,72 3 ERGEBNISSE 40 nicht gepoolter RNAs fanden sich einzelne Tiere, die extreme Werte in der Expression des RXRß aufwiesen (siehe Abb. 12). Bei diesen vier Tieren fanden sich bei den untersuchten Stoffwechselparametern keine Gemeinsamkeiten, die die Ursache für die starke Expression von RXRß erklären könnten (siehe Tabelle 3). In die in Abb. 11 dargestellte Auswertung wurden diese vier Tiere nicht miteinbezogen. Ohne Berücksichtigung dieser vier extremen Signale zeigt sich eine leichte Reduktion der Genexpression im Diabetes und auch eine Reduktion bei den hyperinsulinämischen Tieren. Ebenfalls in der Nähe des erwähnten Genlocus auf Chromosom 4 liegt das für die Spleißvarianten SCP2 und SCPx kodierende Gen. Die differentielle Expression von SCPx, welche einen deutlichen Geschlechtsdimorphismus aufweist, wurde schon in Kapitel 3.5 besprochen. 3.9 Expression von Resistin und Leptin im Fettgewebe Resistin und Leptin sind von Adipozyten sezernierte Hormone, die einen wesentlichen Einfluss auf die Insulinempfindlichkeit der Leber haben und darüber den Stoffwechsel modulieren. Leptin ist ein wichtiger Mediator im Regelkreis von Körperfett und zentral gesteuertem Essverhalten und Energiehaushalt: es zirkuliert im Blutkreislauf proportional zu der Menge des vorhandenen Fettgewebes und führt zu einer verminderten Nahrungsaufnahme und Gewichtsverlust. Bei Nagern resultiert Leptinmangel in starker Adipositas (siehe Kapitel 1.2). Bei den als Parentaltiere 3 ERGEBNISSE 41 verwendeten adipösen NZO-Mäusen findet sich eine gesteigerte Expression von Leptin-mRNA im Fettgewebe (Igel et al, 1997). Standardfutter Fettreiches Futter N D N R D 1,8 Leptin 1,6 * 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 N D H N D H Resistin 1,6 1,4 1,2 * 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 N D H N D H R Abb. 13: Leptin und Resistin. Leptin und Resistin sind von Adipozyten sezernierte Hormone. Der abgebildete Northern blot zeigt die Hybridisierung von aus Fettgewebe isolierter mRNA mit cDNASonden von Leptin (obere Bande) und Resistin (untere Bande). Es handelt sich um Fett-RNA, die überwiegend von denselben Tieren entnommen und isoliert wurde, von denen die Leber-RNA für die übrigen in dieser Arbeit durchgeführten Hybridisierungen stammt. Einige Tiere sind nicht in Tabelle 2 mit aufgeführt, jedoch wurden bei ihrer Auswahl die Grenzwerte der Stoffwechselparameter respektiert. In Hybridierungen von Northern blots mit aus Fett isolierter GesamtRNA männlicher Tiere fanden sich für Leptin unterschiedliche Mengen LeptinmRNA. Die diabetischen Tiere, die aufgrund ihrer Erkrankung schon an Gewicht und damit Körperfett verloren haben, zeigen eine nur geringe bis fehlende Leptin-Expression. Hingegen ist die Leptin-mRNA bei den schweren hyperinsulinämischen Tieren deutlich erhöht im Vergleich zu den normalen Tieren. Die fettreich gefütterten Tiere haben mehr Leptin-RNA als die dünneren mit Standardfutter gefütterten Mäuse (siehe Abb. 13). 3 ERGEBNISSE 42 Resistin wird ebenfalls von Adipozyten produziert und sezerniert. Seine Blutspiegel sind vermehrt im Diabetes bei bestimmten Mausstämmen. Durch Thiazolidindione (TZD), eine neue Gruppe oraler Antidiabetika, lassen sich bei bestimmten Nagerstämmen die erhöhten Resistinspiegel senken. Dieses erst seit relativ kurzer Zeit bekannte Protein soll die Insulinresistenz bei Fettleibigkeit erklären (Steppan et al., 2001). In unserem Mausmodell findet sich hingegen keine differentielle Expression von Resistin (siehe Abb. 13). Die Resistin-mRNA in Adiopozyten ist bei normalen, diabetischen und hyperinsulinämischen Mäusen etwa gleich hoch und auch die unterschiedliche Fütterung scheint trotz der verschieden stark ausgeprägten Adipositas der untersuchten NSZO-Männchen keinen Einfluss auf die Resistin-Expression zu nehmen. Allein in der Gruppe der mit Standardfutter gefütterten Tiere zeigt sich eine signifikant verminderte Expression von Resistin in der Phase der Insulinresistenz. Aufgrund der geringen Tierzahl (2 bis 4 Mäuse pro Gruppe), lässt sich jedoch keine gesicherte Aussage bezüglich dieses Effekts treffen. Ob es bei insulinresistenten Tieren der NSZO-Rückkreuzung tatsächlich zu einer Reduktion der Resisten-mRNA-Menge kommt, bedarf daher weiterer Untersuchungen. 4 DISKUSSION 43 4 DISKUSSION 4.1 Vorteile der NSZO-Rückkreuzung Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Unterschiede der hepatischen Genexpression bei einem adipösen, zu Insulinresistenz und Diabetes neigenden Mausstamm – wie dem der NZO-Maus – zu beschreiben. Ein direkter Vergleich zwischen dem regelmäßig insulinresistenten NZOMausinzuchtstamm und einem gesunden Mausstamm, wie zum Beispiel dem der SJL-Mäuse, gestaltet sich schwierig aufgrund des unterschiedlichen genetischen Hintergrundes. Der Rückkreuzungsstamm NZOxF1(SJLxNZO) hingegen erlaubt einen Vergleich unterschiedlicher Phänotypen auf der Basis eines vergleichbaren Genotyps. Alle Tiere der Rückkreuzung sind jeweils mit Hälfte des Genoms homozygot für den NZO-Genotyp, in der anderen Hälfte heterozygot (NZO/SJL). Die anhand des Phänotyps zusammengestellten Tiergruppen sind genotypisch uneinheitlich, haben aber gleiche Anteile der Genome der Parentaltiere, so dass eventuell festgestellte Gemeinsamkeiten der Genexpression innerhalb dieser Tiergruppen nicht beliebige Unterschiede zwischen NZO- und SJL-Mäusen widerspiegeln, sondern durch den Phänotyp begründet sein müssen, bzw. diesen verursachen. Ausgewählte Tiere des NSZO-Stammes wurden in die Gruppen normoglykämisch/normoinsulinämisch, hyperglykämisch/hypo- bis aninsulinämisch und normoglykämisch/hyperinsulinämisch eingeteilt (siehe Kapitel 3.1.2). Dadurch erlauben die in den Versuchen erzielten Ergebnisse, die Veränderungen der Expression von an der Regulation von Fett- und Glucosestoffwechsel beteiligten Genen in metabolischen Situation der Tiere zu beurteilen. Abhängigkeit von der 4 DISKUSSION 44 4.2 Änderungen der hepatischen Genexpression bei Insulinresistenz Ein wesentliches Ergebnis dieser Arbeit ist, dass sich schon in der Phase der Insulinresistenz, also noch vor der Entstehung eines Diabetes mellitus, das Muster der hepatischen Genexpression ändert. So werden insulinregulierte Gene der Lipogenese wie Fettsäuresynthase, Malatenzym und Stearoyl-CoA-desaturase 1, ebenso Glucokinase und Pyruvatkinase, und auch der für ihre Regulation mitverantwortliche Transkriptionsfaktor SREBP1 erhöht exprimiert in der Phase der Hyperinsulinämie/Insulinresistenz, während sie ohne Insulin, das heißt in der diabetischen Stoffwechselsituation, vermindert exprimiert werden (siehe Abb. 1 und Abb. 4). Es fällt also vor allem eine Induktion von an der Fettsäuresynthese beteiligten Genen in den Lebern insulinresistenter Tiere auf. Es scheint möglich, dass diese Dysregulation des Fettstoffwechsels die biochemische Grundlage der schon beschriebenen (Subrahmanyam, 1960; Rudorff et al., 1970; Veroni et al., 1991) schweren hepatischen Insulinresistenz der NZO-Maus ist. Da der oder die letztlich auslösenden molekularen Defekte noch nicht bekannt sind, die das polygen bedingte metabolische Syndrom der Tiere verursachen, sind die gefundenen Daten nicht eindeutig zu interpretieren. Zweierlei Mechanismen der Entwicklung der Stoffwechselstörung sind denkbar. 4.2.1 Ein primärer Defekt der Glucosehomöostase So kann es eine Vorstellung sein, dass primär die Glucosehomöostase der NZO-Tiere durch eine vermehrte hepatische Glucoseausschüttung 4 DISKUSSION 45 gestört wird (Veroni et al., 1991), aufgrund einer Resistenz gegenüber der die Glucoseproduktion und –abgabe der Leber hemmenden Insulinwirkung. Die erhöhten Blutzuckerwerte bewirken reflektorisch erhöhte Insulinspiegel, was wiederum die Lipogenese stimuliert. So kommt es zu erhöhten Spiegeln freier Fettsäuren, welche die Insulinresistenz der Leber bezüglich der hepatischen Glucoseausschüttung verstärken und somit zu einem Circulus vitiosus führen (McGarry, 1992). Diese Vorstellung zur Genese der Stoffwechseldysregulation ist kompatibel mit den vorhandenen Daten, denen zufolge die Lipogenese sich sensitiv gegenüber erhöhten Insulinspiegeln zeigt, während der Glucosestoffwechsel resistent gegenüber der Insulinwirkung ist (Shimomura et al., 2000). Das hier dargestellte Szenario ist den Veränderungen in anderen Mausmodellen mit Insulinresistenz und Diabetes ähnlich. In Leberzellen von Ratten mit Streptozotocin-induziertem Diabetes steigert Insulin die Expression von SREBP1-mRNA und damit auch die Transkription der von SREBP-1 regulierten Gene der Fettsäuresynthese (Shimomura et al., 1999a). Sowohl Ob/ob- als auch lipodystrophe, transgene aP2-SREBP1c-Mäuse (siehe Kapitel 1.2), beides Mausstämme mit einem genetisch bedingten Leptinmangel und chronischer Hyperinsulinämie, zeigen eine Resistenz gegenüber der hemmenden Wirkung von Insulin auf die hepatische Gluconeogenese bei gleichzeitiger Sensitivität gegenüber der fördernden Wirkung von Insulin auf die Lipogenese (Shimomura et al., 2000). Mit dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass dies auch für das NSZO-Mausmodell gilt, einen Mausrückkreuzungsstamm mit polygen verursachter Insulinresistenz und einem Krankheitsbild, welches dem menschlichen Diabetes mellitus Typ2 näher steht als monogen bedingte Stoffwechselstörungen. Diese differentielle Regulation der hepatischen Glucosespeicherung und der Fettsäuresynthese hat ihren Ursprung in unterschiedlichen 4 DISKUSSION Signalkaskaden 46 (siehe Abb. 1). Die Genexpression von an der Gluconeogenese beteiligten Enzymen, wie zum Beispiel PEPCK und Glucose-6-phosphatase, wird über als Insulinrezeptorsubstrate (IRS) bezeichnete Proteine vermittelt und läuft über eine Kinasekaskade, die die Insulinwirkung in Leber und anderen Geweben vermittelt (White, 1998; Virkamaki et al., 1999). Dabei scheint in Hepatozyten IRS2 eine wichtigere regulatorische Funktion zu haben als IRS1 (Previs et al., 2000). Dieser Signaltransduktionsweg ist bei hepatischer Insulinresistenz supprimiert, da IRS2 in Nagern durch chronisch erhöhte Plasmainsulinspiegel herunterreguliert wird (Shimomura et al., 2000; Zhang et al., 2001). Die chronische Hyperinsulinämie alleine scheint jedoch bei den NSZO-Tieren keine deutliche Repression von IRS2 bewirken zu können (siehe Abb. 9), so dass hier eventuell andere Faktoren eine zusätzliche regulierende Wirkung auf die IRS2-mRNA-Expression haben. Im Gegensatz dazu wird die Wirkung von Insulin auf die Expression von an der Lipogenese beteiligten Enzymen vom Transkriptionsfaktor SREBP1 vermittelt. SREBP1 scheint unabhängig von IRS2 reguliert, da sich bei IRS2-knockout-Mäusen erhöhte Expression von sowohl SREBP1 als auch von an der Lipogenese beteiligten Genen fand (Tobe et al., 2001). Diese Hypothese zur Erklärung der Genese des Stoffwechseldefekts der Mäuse, die von einem primären Defekt der Glucoseproduktion der Leber ausgeht, ist konsistent mit allen bisher erhobenen Daten über die metabolischen Störungen der NZO-Maus. Diese Daten hatten gezeigt, dass die Wirkung von Insulin auf den Glucosestoffwechsel getrennt von der Wirkung auf den Fettstoffwechsel abläuft. Bei den NZO-Tieren wird aufgrund dieser dissoziierten Insulinwirkung Glucose zu Fett umgewandelt, anstatt zu dem Speicherprodukt Glykogen (Subrahmanyam, 1960; Rudorff et al., 1970). Folglich könnte die Dysregulation der an der hepatischen Glucosefreisetzung 4 DISKUSSION 47 beteiligten Enzyme einer der grundlegenden metabolischen Defekte der NZO-Maus sein. Eines dieser potentiell fehlregulierten Enzyme der Gluconeogenese ist Glucose-6-phosphatase, deren mRNA bei allen untersuchten Tieren mit NZOGenom (d.h. nur bei den NSZO-Tieren, aber nicht bei den SJL-Tieren, siehe Abb.9) sehr stark exprimiert wurde und dessen Expressionsmuster deutlich anders als das von IRS2 und PEPCK aussieht. Bei Überexpression von Glucose-6-phosphatase in der Leber ansonsten normaler Ratten wurde ein dem metabolischen Syndrom der NZO-Maus ähnelndes Krankheitsbild mit Glucoseintoleranz, Hyperinsulinämie und vermehrter peripherer Triglyceridspeicherung beschrieben (Trinh et al., 1998). Auch bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ2 wurde erhöhte Glucose-6-phosphatase-Aktivität in der Leber beschrieben (Clore et al., 2000). 4.2.2 Ein primärer Defekt des Fettstoffwechsels Eine alternative Erklärungshypothese sieht einen primären Defekt des Fettstoffwechsels als ursächlich für das metabolische Syndrom der NZOTiere an. Bei gesunden Nachkommen von Typ2-Diabetikern fand man eine umgekehrte Beziehung zwischen dem Spiegel freier Fettsäuren im Plasma und der Insulinsensitivität (Perseghin et al., 1997), was übereinstimmt mit der Vorstellung, dass ein veränderter Fettsäuremetabolismus zur Entstehung der Insulinresistenz beiträgt. Gemäß einer Hypothese von Randle et al. (1963) inhibiert gesteigerte Fettsäureoxidation den Glucosestoffwechsel im Muskel und stimuliert die 4 DISKUSSION 48 Gluconeogenese der Leber. Konsistent mit dieser Vorstellung zeigten die NSZO-Tiere eine gesteigerte Expression von an der Oxidation freier Fettsäuren beteiligten Genen, sowohl in den Lebern insulinresistenter Tiere und noch deutlicher bei diabetischen Tieren. Es wurden verschiedene Mechanismen vorgeschlagen, wie die freien Fettsäuren zur Entstehung der Insulinresistenz beitragen. Randle et al. (1963) postulierten einen durch intrazellulären Abbau der freien Fettsäuren bedingten Anstau von Glucose-6-Phosphat, welches die Hexokinaseaktivität der Zelle hemmt und darüber zu verminderter Aufnahme von Glucose führt. Alternativ könnten freie Fettsäuren oder Metabolite direkt durch Wirkung am Insulinrezeptor oder auf die Signalkaskade eine verminderte Glucoseaufnahme in die Zelle bewirken (Roden et al., 1996, Shulman, 2000). Diese Vorstellung, dass es primär eine Störung des Fettstoffwechsels ist, der zur Entstehung der Insulinresistenz führt, lässt sich auch durch die Tatsache nicht widerlegen, dass die Expression lipogenetischer Enzyme bei der NSZO-Maus sensibel gegenüber der Insulinwirkung erscheint. Es wäre vorstellbar, dass ein im Überschuss erzeugter Metabolit, zum Beispiel AcetylCoA, die Lipogenese stimuliert und gleichzeitig den Glucosestoffwechsel der Leber stört. Letztendlich wird erst die Aufdeckung des Defekts auf molekularer Ebene zeigen, welche dieser beiden Vorstellungen korrekt ist. 4.3 Fettreiche Fütterung Ein überraschendes Ergebnis dieser Arbeit ist der stimulierende Effekt der fettreichen Fütterung auf die Expression von Enzymen der Lipogenese, 4 DISKUSSION 49 wie zum Beispiel der Fettsäuresynthase, des Malatenzym und der StearoylCoA-Desaturase (Abb. 4). Die gesteigerte Expression dieser Enzyme scheint die parallel gesteigerte Expression des Transkriptionsfaktors SREBP1 widerzuspiegeln. Dies war ein nicht erwarteter Effekt, da SREBP1 als Transkriptionsfaktor für die Aktivierung von Enzymen fungiert, die die hepatische Fettsäuresynthese von mit kohlenhydratreicher Diät gefütterten Nagern katalysieren (Kawaguchi et al., 2001; Osborne, 2000). Außerdem zeigten verschiedene Studien, dass die Transkription von SREBP1 durch an mehrfach ungesättigten Fettsäuren reiches Futter inhibiert wird (Xu et al., 1991, Cheema et Clandinin, 1996, Worgall et al, 1998). Entsprechend wäre eine Reduktion der Expression von SREBP1 durch fettreiche Fütterung zu erwarten gewesen. Das Fett in dem verwendeten fettreichen Futter enthielt 14% Linolsäure. Man mag vermuten, dass die ausgeprägte Belastung mit Fett durch eine Steigerung der Fettsäureoxidation einen regulierenden Schlüsselmetaboliten produziert, wie zum Beispiel Acetyl-CoA oder MalonylCoA. Dieser Schlüsselmetabolit wiederum steigert die Fettsäuresynthese. Auch das erhöhte Seruminsulin bei fettreich gefütterten Tieren kann zu der Induktion der Expression lipogenetischer Enzyme geführt haben. Zur Induktion der mRNA-Synthese verschiedener Enzyme der Lipogenese, wie zum Beispiel der mRNA von FAS, werden zusätzlich zum Transkriptionsfaktor SREBP1 hohe Serumspiegel an Insulin und Glucose benötigt (Kim et al., 1998). Eine andere Vorstellung ist, dass die Expression von SREBP1 über IRS1 reguliert wird (Matsumoto et al., 2002). Demzufolge würde hohes Seruminsulin vermehrt diese Signalkaskade aktivieren und dadurch die 4 DISKUSSION 50 Expression von SREBP1 und letztendlich auch von Enzymen der Lipogenese steigern. Die Induktion von Enzymen der Lipogenese bei fettreicher Fütterung spiegelt die metabolische Dysregulation der NZO-Tiere wider: trotz fettreichen Futters kommt es zu reduzierter Glucosespeicherung und gesteigerter Fettsäuresynthese in der Leber (Veroni et al., 1991). Die fettreiche Fütterung trägt also zu einer weiteren Verschlechterung der Stoffwechsellage bei. Hingegen ist die Induktion der Enzyme der Fettsäureoxidation bei vermehrtem Substratangebot durch fettreiche Fütterung zu erwarten gewesen und auch in Hinsicht auf die Substratverwertung sinnvoll (Asayama et al., 1999, Zangar et al.,1997). 4.4 Der Geschlechtseffekt Das metabolische Syndrom der Mäuse weist deutliche Unterschiede zwischen Männchen und Weibchen auf. Die Insulinresistenz der Männchen ist ausgeprägter als die der Weibchen und keines der Weibchen entwickelt einen Diabetes. Die mit Standardnagerfutter gefütterten Weibchen haben sogar einen einheitlich normoglykämischen, normoinsulinämischen Phänotyp. Unter diesem Gesichtspunkt sind jegliche Unterschiede der Genexpression zwischen den beiden Geschlechtern von Interesse, da sie zur Erklärung der Entstehung des Diabetes bei NZO-Mäusen beitragen können. Bei einem anderen Mausstamm (C3.SW/Lt-db/db) mit genetisch bedingter Adipositas aufgrund einer Mutation des Leptinrezeptors ist die 4 DISKUSSION 51 Entwicklung eines Diabetes mellitus ebenfalls an das männliche Geschlecht gebunden. Wurde bei diesen Männchen die Funktion des Androgenrezeptors durch Introduktion einer Mutation gestört und die Tiere damit phänotypisch weiblich (ähnlich dem humanen Krankheitsbild der Testikulären Feminisierung), entwickelten sie trotzdem einen von den normalen Männchen dieses Mausstammes nicht zu unterscheidenden Diabetes (Prochazka et Leiter, 1991). Auch Kastration, das heißt normale Androgenrezeptoren und reduzierte Testosteronspiegel, verursachte keine Änderung des Krankheitsbildes (Prochazka et Leiter, 1991). Da also die bevorzugte Diabetesentwicklung bei Männchen eines gegebenen Mausstammes anscheinend nicht auf den im Vergleich zu den Weibchen absolut höheren zirkulierenden Androgenen beruht, liegt die Vermutung nahe, dass der Geschlechtsdimorphismus in Bezug auf die Diabetesentwicklung durch das Mengenverhältnis von Östrogenen zu Androgenen in Geweben, die am Glucosestoffwechsel beteiligt sind, bedingt ist. Die Leber, als Organ in dem auch Steroidhormone metabolisiert werden, könnte dabei eine zentrale Rolle übernehmen. Leiter stellte 1989 fest, dass die Diabetessuszeptibilität verschiedener Mausstämme und auch von Weibchen und Männchen desselben Mausstammes von der Fähigkeit abhing, Testosteronvorstufen und andere Androgene zu sulfurylieren. Diese Tatsache, dass es maßgeblich abhängt von der Sulfotransferase-Aktivität, welche das intrahepatische Androgen/Östrogen-Verhältnis kontrolliert, ob bei gleichem genetischen Hintergrund Weibchen und Männchen oder nur die Männchen einen Diabetes entwickeln, wurde in mehreren Mausstämmen bestätigt. Es wird vermutet, dass Östrogene einen protektiven Effekt ausüben und ihrem Stoffwechsel wird eine bedeutende Rolle zugeschrieben (Leiter et al., 1991). Die 4 DISKUSSION 52 Mechanismen der Wirkung von Östrogenen und Andogenen auf die Stoffwechsellage sind unbekannt. 4.4.1 Geschlechtsdimorphismus der Cytochrom P450-Isoformen Es ist bekannt, dass diverse Cytochrom P450-Isoformen (z.B. CYP 2B9, CYP 3A16) einen sexuellen Dimorphismus bei Mäusen aufweisen (Shapiro et al., 1995). Bei der Charakterisierung der Genexpression der NSZO-Rückkreuzung zeigte sich, dass Isoformen von Cytochrom P450 bei diesen Tieren differentiell exprimiert werden, und zwar mit Unterschieden sowohl zwischen Männchen und Weibchen als auch mit Unterschieden zwischen diabetischen und nicht-diabetischen Tieren (CYP 2B9 und CYP 3A16 Weibchen> Männchen, CYP 7B1 Weibchen<Männchen; Pass et al., 2002). Das in dieser Arbeit untersuchte CYP 4A14 entspricht in Funktion und Struktur dem CYP 4A2 und 4A3 der Ratte. Bei Ratten ist eine geschlechtsabhängige Expression dieser beiden Cytochrome bekannt, die jedoch bei Mäusen nicht auftritt (Heng et al., 1997), auch nicht bei der NSZORückkreuzung (siehe Abb. 7). 4.4.2 Geschlechtsdimorphismus von SCPx Bei Ratten mit Streptozotocin-induziertem Diabetes mellitus fand man erhöhte hepatische mRNA-Expression von SCPx (McLean et al., 1995), welches am Abbau verzweigtkettiger Fettsäuren beteiligt ist (Ohba et al., 1995, Wanders et al., 1997). Bei den NSZO-Tieren war die Expression im 4 DISKUSSION 53 Diabetes und bei den normalen Tieren fast identisch. Es fanden sich jedoch bei den Männchen deutlich höhere mRNA-Mengen von SCPx, als bei den Weibchen (siehe Abb. 8). Diese Tatsache kann einen geschlechtsabhängigen Unterschied in der Fettsäureoxidation widerspiegeln. Das würde bedeuten, dass die Männchen schon im normalen Stoffwechselzustand eine gestörte Regulation des Fettsäurestoffwechsels aufweisen. Dies lässt sich vereinen mit dem Konzept der lipotoxicity (Unger, 1995). Dieser Theorie zufolge wird bei adipösen Mäusen durch einen schädigenden Effekt von Metaboliten des Fettstoffwechsels eine Inselzelldestruktion vermittelt. 4.5 Phospholipidtransferprotein (PLTP) In der hier präsentierten Arbeit zeigt die Expression von PLTP, einem wichtigen Modulator von HDL-Größe und –Zusammensetzung (Jiang et al., 1999, Jiang et al., 2001), Ähnlichkeiten zu der Expression von Enzymen der Lipogenese, die durch den Transkriptionsfaktor SREBP1 gesteuert wird. Es ist beschrieben worden, dass die hepatische Expression von PLTP in Mäusen durch PPARN reguliert wird (Bouly et al., 2001). Die reduzierte mRNA-Menge von PLTP bei den diabetischen Tieren (siehe Abb. 6) steht in deutlichem Kontrast zu der gesteigerten Expression der anderen PPARN-regulierten Gene der Fettsäureoxidation. Demnach müssen andere Regulationsmechanismen für diesen Effekt verantwortlich sein; es bedarf weiterer Klärung, um diese Mechanisemen aufzudecken. Untersuchungen in humanen Hepatozyten haben gezeigt, dass Hyperglykämie die hepatische PLTP-mRNA-Expression steigert (Tu et Albers., 2001). Bei den NSZO-Tieren hingegen ist die Expression von PLTP im Diabetes, vor allem bei fettreicher Fütterung, deutlich reduziert. 4 DISKUSSION 54 Es scheint, dass auch das Geschlecht Einfluss auf die Expression von PLTP nimmt, da alle Weibchen – auch die diabetesresistenten SJL-Tiere – höhere PLTP-mRNA-Mengen aufweisen, als die entsprechenden Männchen. Studien am Menschen haben keine geschlechtsabhängige Expression gezeigt (Oka et al., 2000, Cheung et al., 2002). Es lässt sich also vermuten, dass die PLTP-Expression bei Mensch und Nager unterschiedlich reguliert wird. 4.6 3ß-Hydroxysteroid-dehydrogenase 5 (Hsd3b5) Die Isoform Hsd3b5 aus der Familie der in den Steroidmetabolismus involvierten Ketosteroidreduktasen (Abbaszade et al., 1995) zeigt bei den NSZO-Tieren eine verminderte mRNA-Expression in Diabetes und Insulinresistenz. Interessant ist dabei die Tatsache, dass die reduzierte Expression von Hsd3b5 bei hyperinsulinämischen und diabetischen Mäusen durch die Aktivierung von PPARN vermittelt scheint. Deutlich verminderte mRNA-Spiegel von Hsd3b5 in der Leber wurden durch Exposition mit dem Peroxisomenproliferator DEHP erzeugt (Wong et al., 2002). Es zeigt sich entsprechend ein Expressionsmuster, dass sich fast spiegelbildlich zu den durch PPARN gesteigert exprimierten Enzymen der Fettsäureoxidation verhält (siehe Abb. 10). Anhand der NSZO-Mäuse konnte ein erster Nachweis erbracht werden, dass dieser Regulationsmechanismus pathophysiologischen Bedingungen eine Rolle spielt. auch unter 4 DISKUSSION 55 4.7 Stearoyl-CoA-desaturase 1 (SCD1) Unter den an der Lipogenese beteiligten Enzymen scheint SCD1 eine Schlüsselrolle in der Körperfettsynthese zu spielen. Bei Mäusen finden sich mehrere Isoformen von SCD, die gewebeabhängig unterschiedlich stark exprimiert werden. Beim Menschen wurde eine Isoform identifiziert, die große Homologie gegenüber dem SCD1 der Maus aufweist, welches vor allem in Fettgewebe und Leber exprimiert wird. Die Expression wird durch den Transkriptionsfaktor SREBP1 gesteigert, scheint jedoch durch andere Faktoren, wie z.B. mehrfach ungesättigte Fettsäuren, reprimierbar zu sein (Ntambi, 1999, Ntambi et Miyazaki, 2004). SCD1 ist Schlüsselenzym für die Synthese einfach ungesättigter Fettsäuren, vor allem von Öl- und Palmitinsäure, die Hauptbestandteil der Membranphospholipide sind. Das Verhältnis gesättigter und ungesättigter Fettsäuren trägt zu der Membranfluidität bei. Änderungen in diesem Verhältnis und damit Änderungen der Membranfluidität wurden in Verbindung gebracht mit einer Vielzahl von Erkrankungen, wie zum Beispiel Diabetes mellitus Typ2, Adipositas, KHK, Hypertonie etc. (Ntambi, 1999, Ntambi et Miyazaki, 2004). Interessant ist, dass Mäuse mit einer Disruption des SCD1-Gens (SCD1 -/-) vermehrten Energieumsatz, gesteigerte Insulinsensitivität, sowie eine Resistenz gegen diätinduzierte und eine Reduktion genetisch bedingter Fettleibigkeit, zeigen (Cohen et al., 2002, Ntambi et al., 2002, Dobrzyn et Ntambi, 2004). In Array-Untersuchungen, bei denen man Zielgene von Leptin finden wollte, zeigte sich als stärkster Effekt eine Repression von SCD1mRNA durch Leptin (Cohen et al., 2002, Cohen et al., 2003). Es scheint also, dass die verminderte Expression von SCD1 eine bedeutende Komponente der Wirkung von Leptin auf Körpergewicht und Energiehaushalt darstellt. Das 4 DISKUSSION 56 Expressionsmuster von Leptin (siehe Abb. 13) spricht gegen eine bedeutsame Regulation von SCD1 durch Leptin bei den NSZO-Tieren. Für Mäuse ist außerdem eine geschlechtsabhängige Expression von SCD1 in der Leber beschrieben worden, mit deutlich höheren Werten bei den Weibchen (Lee et al., 1996); ein Effekt der bei der NSZO-Rückkreuzung nicht auftritt. 4.8 Einfluss des Fettgewebes auf den Leberstoffwechsel 4.8.1 Leptin Es ist seit geraumer Zeit bekannt, dass das Fettgewebe auf unterschiedliche Art und Weise auf den Leberstoffwechsel Einfluss nimmt (siehe Kapitel 1.3). In dieser Arbeit sind zwei in Adipozyten synthetisierte und von ihnen sezernierte Stoffe untersucht worden, Leptin und Resistin. Leptin hat klare insulinsensiblilisierende Effekte bei Nagern, akut und chronisch (Halaas et al., 1995; Campfield et al., 1996; Pelleymounter et al., 1995). Überexpression von Leptin im Fettgewebe führt zu einem extrem schlanken Mausstamm mit erhöhter Insulinsensibilität (Ogawa et al., 1999). Eine gesteigerte Expression von Leptin-mRNA in Adipozyten findet sich auch bei den stark adipösen NZO-Parentaltieren (Igel et al., 1997). Auch bei anderen Nagerstämmen mit Adipositas wurden erhöhte Mengen an LeptinmRNA gemessen. Bei einem Großteil dieser Nager beruht die Fettleibigkeit, ebenso wie beim Menschen (El-Haschimi et Lehnert, 2003), auf einer Leptinresistenz (Igel et al., 1997). 4 DISKUSSION Wie 57 erwartet, Rückkreuzungstieren zeigt in der die Leptin-mRNA Expression eine bei den NSZO- Abhängigkeit von der Fettleibigkeit der Mäuse. Je höher der BMI, desto mehr Leptin-mRNA wird von den Adipozyten exprimiert. Die höchsten Leptinwerte haben die hyperinsulinämischen, insulinresistenten Tiere der fettreichen Fütterung (siehe Abb. 13). Die NSZO-Tiere zeigen also keine Sensibilität gegenüber Leptin, im Sinne einer Gewichtsminderung oder einer Besserung der Insulinresistenz. 4.8.2 Resistin Das Adipozyten-Hormon Resistin soll in Nagern die Verknüpfung von Adipositas mit Insulinresistenz und Diabetes darstellen (Steppan et al., 2001). In vielen anderen Tiermodellen mit Adipositas konnte keine erhöhte Expression von Resistin-mRNA in Adipozyten und keine erhöhten ResistinSerumspiegel nachgewiesen werden, sondern im Gegenteil verminderte Expression und niedrige Serumspiegel (Way et al., 2001, Fukui et Motojima, 2002). Die Gabe verschiedener oraler Antidiabetika, darunter TZDs, zeigte komplexe Änderungen der Resistin-Expression (Moore et al., 2001, Way et al., 2001, Fukui et Motojima, 2002). Auch bei den NSZO-Tieren scheint die Resistin-mRNA-Menge nicht direkt korreliert zu sein mit dem Grade der Insulinsensitivität oder des BMI (siehe Abb.13). Die Insulinresistenz der NSZO-Tiere beruht nicht auf erhöhten Resistinspiegeln. Da NZO-Mäuse als basale Regulationsstörung ihres Glucosestoffwechsels eine durch Insulin nicht reprimierbare hepatische Glucoseüberproduktion zeigen, ist interessant, dass neueren Studien zufolge Resistin die hepatische Insulinwirkung moduliert. So soll 4 DISKUSSION 58 Resistinadministration schwere hepatische, nicht periphere Insulinresistenz bei Ratten induzieren, vor allem durch vermehrte hepatische Glucoseproduktion (Rajala et al., 2003). Da keine Bestimmung der ResistinmRNA bei Kontrolltieren durchgeführt wurde, ist nicht klar, ob bei den NSZOTieren die Expression uniform niedrig oder aber uniform hoch ist und somit zu der Erklärung eines basalen Defekts des hepatischen Glucosemetabolismus beitragen könnte. Erwähnt sei in diesem Zusammenhang nochmals die einheitlich erhöhte Expression der Glucose-6-Phosphatase bei den NSZOMäusen (siehe Kapitel 4.2.1). 4.9 Gene des Nidd/SJL-Locus Aufgrund der Lage des CPT2-Gens nahe eines als diabetogen identifizierten Genlocus (Plum et al., 2000) im Mausgenom und aufgrund seiner Funktion im Metabolismus langkettiger Fettsäuren wäre eine differentielle Regulation der Expression von Interesse gewesen. Die gesteigerte Expression im Diabetes erinnert an das Expressionsprofil von in der Fettsäureoxidation involvierten Enzymen (siehe Abb. 7). Für CPT2 ist jedoch keine Regulation durch PPARN bekannt. Die Regulation der hepatischen mitochondrialen ß-Oxidation langkettiger Fettsäuren durch den CPT-Komplex erfolgt durch Malonyl-CoA, welches das an der äußeren Mitochondrienmembran gelegene CPT1 inhibiert (Park et al., 1995). CPT2-Mangel ist eine der häufigsten erblichen Krankheiten der mitochondrialen Fettsäure-Oxidation. Es gibt verschiedene Mutationen, die zu 4 DISKUSSION 59 einem Mangel an CPT2 führen, die wiederum unterschiedliche Schweregrade der Krankheit verursachen (Thuillier et al., 2003). Interessant ist im Zusammenhang mit dieser Arbeit zum Thema Diabetes, dass die infantile Form des CPT2-Mangels durch schwere Attacken hypoketotischer Hypoglykämie gekennzeichnet ist (Bonnefont et al., 1999) Es hat sich bei den durchgeführten Untersuchungen kein Hinweis darauf ergeben, dass CPT2 oder eines der anderen untersuchten „Kandidatengene“ an der Entstehung von Diabetes und Insulinresistenz beteiligt ist. 5 ZUSAMMENFASSUNG 60 5 Zusammenfassung Die New Zealand Obese (NZO)-Maus zeigt ein dem menschlichen metabolischen Syndrom ähnliches, polygenes Krankheitssyndrom mit Adipositas und Insulinresistenz. Um die biochemischen Grundlagen dieses Krankheitsbildes aufzuklären, wurde die differentielle Expression von im hepatischen Glucoseund Lipidstoffwechsel involvierten Genen untersucht. Dazu wurden Tiere einer Rückkreuzung auf die normgewichtige SJL-Maus (NZOxF1(SJLxNZO)) verwendet, die eine Population mit unterschiedlichen Stoffwechselparametern bei vergleichbarem genetischem Hintergrund bilden. Die Tiere wurden in drei Gruppen eingeteilt: Normal (normoglykämisch/normoinsulinämisch), Insulinresistenz (normoglykämisch/hyperinsulinämisch) und Diabetes (hyperglykä- misch/hypoinsulinämisch). Zum Vergleich wurden SJL-Parentaltiere untersucht. Im Alter von 22 Wochen wurden die Tiere getötet (3-7 Tiere pro Gruppe), die Leber-RNA isoliert und für Genexpressions-Untersuchungen durch Northern und Dot blots eingesetzt. Die Ergebnisse zeigen, dass in der Insulinresistenz die Expression von Enzymen der Lipogenese (z.B. Fettsäuresynthase [fasn], scd1, mod1, gck, pklr – offizielle Genbezeichnungen der Maus-Genom-Datenbank) und der Fettsäureoxidation (Cyp4a14, Acox1, Ech1, Acaa1) gleichzeitig gesteigert war, während die Expression von Enzymen der Gluconeogenese (Glucose-6phosphatase [G6pc], Pck1) nicht reprimiert war. Fettreiche Fütterung steigerte die Expression von Enzymen der Lipogenese. Einige der mRNAs weisen einen Geschlechtsdimorphismus auf, im Sinne einer höheren Expression in Männchen (Sterol carrier protein x [Scp2], Hsd3b5) bzw. in Weibchen (Pltp). Die gefundenen Unterschiede der Genexpression in der Insulinresistenz können durch einen dissoziierten Effekt der Insulinwirkung auf Gene des Glucose- und Lipidstoffwechsel erklärt werden: eine durch Insulin nicht mehr reprimierbare hepatische Glucoseproduktion führt zu Hyperinsulinämie, welche die weiterhin insulinsensitive Lipogenese fördert und dadurch die Insulinresistenz im Sinne eines Circulus vitiosus steigert. Die Adipokine Leptin und Resistin zeigten im Fettgewebe eine mit dem body mass index korrelierte Leptin-mRNA-Menge und keine Variation in der Genexpression von Resistin. 6 LITERATURVERZEICHNIS 61 6 Literaturverzeichnis Abbaszade, I.G., Clarke, T.R., Park, C.H., Payne, A.H. (1995): The mouse 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase multigene family includes two functionally distinct groups of proteins. Mol Endocrinol 9 1214-1222 Alberti, K.G., Zimmet, P.Z. (1998):Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med 15 539-553 Asayama, K., Sandhir, R., Sheikh, F.G., Hayashibe, H., Nakane, T., Singh, I. (1999): Increased peroxisomal fatty acid beta-oxidation and enhanced expression of peroxisome proliferator-activated receptoralpha in diabetic rat liver. Mol Cell Biochem 194 227-234 Bergman, R.N., Ader, M. 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Proc Natl Acad Sci USA 98 3756-3761 7 ANHANG 75 Ein Teil der Ergebnisse dieser Arbeit wurde bereits in folgenden Publikationen veröffentlicht: • Plum, L., Giesen, K., Kluge, R., Junger, E., Linnartz, K., Schürmann, A., Becker, W., Joost, H.G. (2002): Characterisation of the mouse diabetes susceptibility locus Nidd/SJL: islet cell destruction, interaction with the obesity QTL Nob1, and effect of dietary fat. Diabetologia 45 823-830 • Pass, G.J., Becker, W., Kluge, R., Linnartz, K., Plum, L., Giesen, K., Joost, H.G. (2002): Effect of hyperinsulinemia and type 2 Diabetes-like hyperglycemia on expression of hepatic cytochrome P450 and glutathione S-transferase isoforms in a New Zealand Obese-derived mouse backcross population. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 302 442-450 • Becker, W., Kluge, R., Kantner, T., Linnartz, K., Korn, M., Tschank, G., Plum, L., Giesen, K., Joost, H.G. (2004): Differential hepatic gene expression in a polygenic mouse model with insulin resistance and hyperglycemia: evidence for a combined transcriptional Dysregulation of gluconeogenesis and fatty acid synthesis. Journal of Molecular Endocrinology 32 195-208 7 ANHANG 76 Danksagung Herrn Prof. Dr. Dr. Hans-Georg Joost danke ich für die freundliche Überlassung des Themas. Herrn Prof. Dr. Walter Becker danke ich für die ausnahmslos außerordentliche Betreuung und Förderung, für seine ständige Bereitschaft, Fragen zu diskutieren und Hilfestellungen zu geben und für die ausgezeichneten Arbeitsbedingungen im Labor. Herrn Dr. Reinhart Kluge möchte ich für die Züchtung der Mäuse, die Tierpflege und für seine Hilfe bei Tötung und Organentnahme der Tiere danken. Leona Plum danke ich für das Überlassen der Fotografien der Mäuse. Generell möchte ich Leona Plum, Kirsten Giesen und Giorgia Pass danken für die gute Zusammenarbeit bei Messungen und Organentnahmen bei den Mäusen. Stefanie Winandy danke ich für die Messung und das Überlassen der Insulinwerte. Bei meinen Eltern und meinem Bruder Franz möchte ich mich ganz herzlich für ihre, nicht nur im Rahmen dieser Arbeit, sondern immer wieder unter Beweis gestellte bedingungslose Unterstützung bedanken. 7 ANHANG 77 Lebenslauf Name Katharina Linnartz Geburtsort und -datum 3. November 1977 in Koblenz Eltern Franz-Joseph Linnartz, Bankprokurist im Ruhestand Maria Linnartz, Hausfrau Schulausbildung 1983-1987: Schenkendorf-Grundschule, Koblenz 1987-1996: Eichendorff-Gymnasium, Koblenz 17. Juni 1996: Allgemeine Hochschulreife, Note: 1,0 (sehr gut) Studium Oktober 1996 – Mai 2003: Medizinische Fakultät der RheinischWestfälischen Technischen Hochschule Aachen Oktober 1999 – Januar 2000: Auslandsstudium an der Facoltà di Medicina e Chirurgia der Universität von Padova (Italien) April 2003: Studienabschluss, Endnote: 1,33 (sehr gut) Stipendium 1996-2003: Begabtenförderung durch die „Studienstiftung des Deutschen Volkes” Berufliche Erfahrungen seit 16. Juni 2003: Assistenzärztin in der chirurgischen Abteilung des Ospedale Regionale di Lugano, Sede Civico
