X - Genaxxon bioscience

Version: 301013
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X GENAXXON
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fon:
+49 (0 )731 – 360 8
12 3
fax:
+49 (0 )731 – 360 8 962
Micrococcal Nuclease
eMail:
[email protected]
internet:
www.genaxxon.com
I.U.B. 3.1.31.1 from Staphylococcus aureus (strain Foggi)
Product
Micrococcal Nuclease (>100units/µL)
Cat#
Package size
S5238.0015
15000 units
Product description
Micrococcal nuclease is the extracellular nuclease of Staphylococcus aureus. Micrococcal nuclease exhibits exoas well as endo-5'-phosphodiesterase activity and catalyses the cleavage of DNA and RNA to yield 3'nucleotides. The enzyme catalyses preferentially the endohydrolysis of RNA and DNA at sites rich in adenylate,
uridylate, deoxyadenylate or thymidylate. The enzyme has a molecular weight of 16,807 Da and is calcium
dependent. pH optimum is 9.2 varying depending on the concentration of calcium ions. Therefore the enzyme
is easily deactivated by EGTA or EDTA.
The high hydrolysis specificity of micrococcal nuclease makes it very useful for the elucidation of nucleic acid
and oligonucleotide sequence. Micrococcal Nuclease is suitable for removing nucleic acids from cell lysates,
releasing chromatin-bound proteins and shearing chromatin for use in chromatin immunoprecipitation (ChIP)
experiments.
Specifications
Activity:
min. 100 units/µL
Formulation:
in 10mM Tris-HCl pH7.5, 50mM NaCl, 1mM EDTA, 50% glycerol.
Ca2+ is essential for activity. Both RNAse and DNAse activities are competitively inhibited by
deoxythymidine 3’,5’ diphosphate. The kinetics of degradation of RNA and DNA differ.
There is no activation with Sr2+.
pH-Optimum:
The pH optimum is reported as 9.2. However, the enzymatic activity has an absolute
requirement for Ca2+ and the pH optimum varies according to the Ca2+ concentration (pHrange between pH7.0 and pH10.0).
Inhibitors:
While 5’-dioxynucleotides and 5’-ribonucleotides are both inhibitors, 5’-dioxynucleotides
show higher inhibition.
all Ca2+ chelators as EDTA and EGTA
Stability:
Micrococcus nuclease preparations are stable for at least 12 months at -20°C.
Unit Definition: 1 unit is defined as the amount of enzyme required to produce an increase in absorbance at
260nm of 0.001/min/mL at 25°C of highly polymerized DNA.
Source:
Staphylococcus aureus (strain Foggi)
Storage:
Store product at -20°C after delivery. Keep enzyme on ice during use.
Genaxxon bioscience GmbH
fon: +49 731 3608 123
fax: +49 731 3608 962
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Highlights:
•
•
•
Enzyme digests nucleic acids (DNA and RNA)
Effective for double-stranded, single-stranded, circular and linear nucleic acids
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Active in neutral to alkaline buffer conditions containing divalent calcium ions
Properties of delivered Micrococcal Nuclease (MNase):
•
•
•
Product is delivered as a liquid at -20°C (50% glycerol). Keep enzyme on ice during use.
Micrococcal nuclease is dependent on Ca++ for activity.
Avoid calcium chelators, such as EGTA, in reaction buffers.
Enzyme is active at pH7 to pH10 with a salt concentration less than 100mM. Optimal enzyme activity
occurs at 37°C; however, the enzyme is active at room temperature. Monovalent metal ions, such as
Na+ and K+, will decrease activity. EGTA or heating to 65°C for 10 minutes will inactivate the enzyme.
Additional Materials required but not supplied
•
•
•
Reaction buffer: 50mM Tris/HCl, pH8.0, 5mM CaCl2
10X Stop solution (optional): 200mM EGTA, pH8.0
100X BSA (optional): 10mg/mL in phosphate buffered saline
Generalized Protocol for use of Micrococcal Nuclease (MNase):
1.
2.
3.
4.
Dilute sample in Reaction buffer (50mM Tris-HCl pH 8.0, 5mM CaCl2).
If sample only contains nucleotides (i.e., no protein), add BSA at a final concentration of 0.1mg/mL.
Add micrococcal nuclease and incubate reaction at 37°C until the nucleotides are degraded.
Optional: Stop reaction by adding EGTA, pH8.0 to a final concentration of 20mM.
Trouble shooting
Problem
Possible Cause
Solution
Minimal or no
nucleotide
degradation
No Ca2+ present in the
reaction buffer.
Add final concentration of 5mM CaCl2 to the reaction
buffer.
Reaction not complete
Incubate reaction longer.
Reaction temperature too
high/low.
Incubate reaction at 37°C.
Incorrect reaction pH.
Maintain reaction at pH7-10 using an appropriate buffer.
Presence of monovalent
cation.
Reduce monovalent cation concentration to <100mM by
dialyzing or desalting the sample.
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Micrococcus Nuklease
I.U.B. 3.1.31.1 aus Staphylococcus aureus (Foggi)
Product
Micrococcal Nuklease (>100units/µL)
Cat#
Package size
S5238.0015
15000 units
Produktbeschreibung
Mikrococcus Nuklease ist die extrazelluläre Nuklease von Staphylococcus aureus. Mikrococcus Nuklease zeigt
sowohl exo- als auch endo-5'-phosphodiesteraseaktivität und katalysiert die Spaltung von DNA und RNA zu 3'Nukleotiden. Das Enzym katalysiert vorzugsweise die Endohydrolyse von RNA und DNA an Adenylat-, Uridylat-,
Deoxyadenylat- und Thymidilatseiten. Das Enzym hat ein Molgewicht von 16.807 Da und zeigt eine starke
Calziumabhängigkeit. Das pH-Optimum liegt bei 9.2 ist aber stark von der Konzentration an freien Ca-Ionen
abhängig. Daher wird das Enzym durch EGTA oder EDTA stark inhibiert.
Die hohe Spezifität der Micrococcus Nuklease macht diese zu einem idealen Werkzeug für die Aufklärung von
DNA- und Oligonukleotidsequenzen. Micrococcus Nuklease kann eingesetzt werden um Nukleinsäuren aus
Zelllysaten zu entfernen, um an Chromatin gebundene Proteine frei zu setzen oder um Chromatin für die
Anwendung in Chromatin-Immunopräzipitationsexperimenten zu bearbeiten (CHIP-Experimente).
Spezifikationen
Aktivität:
min. 100 units/µL
Formulierung:
in 10mM Tris-HCl pH7.5, 50mM NaCl, 1mM EDTA, 50% Glycerin.
Ca2+ ist für die Aktivität essentiell.
Sowohl die RNAse als auch die DNAse Aktivität werden durch Deoxythymidin 3’,5’ diphosphat
kompetitiv inhibiert.
Die Kinetik des Abbaus von RNA und DNA ist unterschiedlich.
Das Enzym wird durch Zugabe von Sr2+ nicht aktiviert.
pH-Optimum:
The pH-Optimum liegt bei pH9,2. Da Ca2+ aber ein essentieller Bestandteil für die
Enzymaktivität ist und das pH-Optimum mit der Calciumkonzentration variiert wird eine
Enzymaktivität im pH-Bereich von pH7,0 bis pH10,0 beobachtet.
Inhibitoren:
Während sowohl 5’-Dioxynucleotide als auch 5’-Ribonucleotide Inhibitoren sind, zeigen
5’-Dioxynucleotide eine höhere Inhibition.
Alle Ca2+ Chelatoren, wie EDTA und EGTA
Stabilität:
Micrococcus Nuklease ist für mind. 1 Jahr bei -20°C stabil.
Definition der : 1 unit is defined as the amount of enzyme required to produce an increase in absorbance at
Einheit
260nm of 0.001/min/mL at 25°C of highly polymerized DNA.
Ursprung:
Staphylococcus aureus (Foggi)
Lagerung:
Nach Lieferung bei -20°C lagern. Das Enzym beim Arbeiten immer auf Eis aufbewahren.
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Highlights:
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Das Enzym verdaut Nukleinsäuren (DNA und RNA)
Effektiv für doppelsträngige, einzelsträngige, zirkuläre oder lineare Nukleinsäuren.
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Aktiv in neutralem bis alkalischen Puffern die das bivalente Calciumion enthalten.
Eigenschaften der gelieferten Micrococcus Nuklease (MNase):
•
Das Enzym wird in 50% Glycerin geliefert. Dadurch liegt das Enzym in flüssiger Form bei -20°C vor. Das
Enzym sollte während der Arbeit auf Eis gelagert werden.
•
Micrococcus Nuklease ist ein Calciumionen abhängiges Enzym.
Beim Arbeiten dürfen Calciumchelatoren, wie EGTA nicht im Reaktionspuffer enthalten sein.
•
Das Enzym ist bei pH-Werten von pH7 bis pH10 bei einer Salzkonzentration von weniger als 100mM
aktiv.
Die optimale Reaktionstemperatur liegt bei 37°C, doch ist das Enzym auch schon bei Raumtemperatur
aktiv.
Monovalente Metalionen, wie Na+ oder K+ verringern die Enzymaktivität.
EGTA oder erhitzen auf 65°C für 10 Minuten inaktivieren das Enzym.
Zusätzlich benötigtes Materials (nicht mitgeliefert)
•
•
•
Reaktionspuffer: 50mM Tris/HCl, pH8,0, 5mM CaCl2.
10X Stopplösung (Optional): 200mM EGTA, pH8,0.
100X BSA (Optional): 10mg/mL in PBS.
Generalisiertes Protokoll zum Gebrauch der Micrococcus Nuklease (MNase):
1.
2.
3.
4.
Probe in Reaktionspuffer verdünngen (50mM Tris-HCl pH8,0, 5mM CaCl2).
Wenn die Probe nur Nukleotide/Nukleinsäuren enthält (keine Proteine), sollte BSA einer
Endkonzentation von 0,1mg/mL dazu gegeben werden.
Nun die Micrococcus Nuklease zugeben und bei 37°C inkubieren bis die Nukleinsäuren komplett
abgebaut sind.
Optional: Die Reaktion kann durch Zugabe von EGTA, pH8,0 mit einer Endkonzentration von 20mM
gestoppt werden.
Trouble shooting
Problem
Mögliche Ursache
Lösungsvorschlag
Minimaler order
kein
Nukleotidabbau.
Es ist kein Ca2+ im
Reaktionspuffer
vorhanden.
Hinzufügen von CaCl2 zum Reaktionspuffer bis zu einer
Endkonzentration von 5mM.
Reaktion noch nicht zu
Ende.
Länger inkubieren
Reaktionstemperature zu
hoch/zu niedrig.
Bei 37°C inkubieren
Falscher pH-Wert
Reaktion bei pH7 bis pH10 ablaufen lassen.
Anwesenheit von
Monovalenten Kationen.
Die Konzentration der monovalenten Kationen auf unter
100mM durch Dialyse oder Entsalzung reduzieren.
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