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Version: 301013 G:\products\productflyer\descr_s5238_micrococcal_nuclease.docx X GENAXXON b i o s c i e n c e ______________________ fon: +49 (0 )731 – 360 8 12 3 fax: +49 (0 )731 – 360 8 962 Micrococcal Nuclease eMail: [email protected] internet: www.genaxxon.com I.U.B. 3.1.31.1 from Staphylococcus aureus (strain Foggi) Product Micrococcal Nuclease (>100units/µL) Cat# Package size S5238.0015 15000 units Product description Micrococcal nuclease is the extracellular nuclease of Staphylococcus aureus. Micrococcal nuclease exhibits exoas well as endo-5'-phosphodiesterase activity and catalyses the cleavage of DNA and RNA to yield 3'nucleotides. The enzyme catalyses preferentially the endohydrolysis of RNA and DNA at sites rich in adenylate, uridylate, deoxyadenylate or thymidylate. The enzyme has a molecular weight of 16,807 Da and is calcium dependent. pH optimum is 9.2 varying depending on the concentration of calcium ions. Therefore the enzyme is easily deactivated by EGTA or EDTA. The high hydrolysis specificity of micrococcal nuclease makes it very useful for the elucidation of nucleic acid and oligonucleotide sequence. Micrococcal Nuclease is suitable for removing nucleic acids from cell lysates, releasing chromatin-bound proteins and shearing chromatin for use in chromatin immunoprecipitation (ChIP) experiments. Specifications Activity: min. 100 units/µL Formulation: in 10mM Tris-HCl pH7.5, 50mM NaCl, 1mM EDTA, 50% glycerol. Ca2+ is essential for activity. Both RNAse and DNAse activities are competitively inhibited by deoxythymidine 3’,5’ diphosphate. The kinetics of degradation of RNA and DNA differ. There is no activation with Sr2+. pH-Optimum: The pH optimum is reported as 9.2. However, the enzymatic activity has an absolute requirement for Ca2+ and the pH optimum varies according to the Ca2+ concentration (pHrange between pH7.0 and pH10.0). Inhibitors: While 5’-dioxynucleotides and 5’-ribonucleotides are both inhibitors, 5’-dioxynucleotides show higher inhibition. all Ca2+ chelators as EDTA and EGTA Stability: Micrococcus nuclease preparations are stable for at least 12 months at -20°C. Unit Definition: 1 unit is defined as the amount of enzyme required to produce an increase in absorbance at 260nm of 0.001/min/mL at 25°C of highly polymerized DNA. Source: Staphylococcus aureus (strain Foggi) Storage: Store product at -20°C after delivery. Keep enzyme on ice during use. Genaxxon bioscience GmbH fon: +49 731 3608 123 fax: +49 731 3608 962 1 www.genaxxon.com e-mail: [email protected] Version: 301013 G:\products\productflyer\descr_s5238_micrococcal_nuclease.docx X GENAXXON b i o s c i e n c e ______________________ fon: +49 (0 )731 – 360 8 12 3 fax: +49 (0 )731 – 360 8 962 Highlights: • • • Enzyme digests nucleic acids (DNA and RNA) Effective for double-stranded, single-stranded, circular and linear nucleic acids eMail: [email protected] internet: www.genaxxon.com Active in neutral to alkaline buffer conditions containing divalent calcium ions Properties of delivered Micrococcal Nuclease (MNase): • • • Product is delivered as a liquid at -20°C (50% glycerol). Keep enzyme on ice during use. Micrococcal nuclease is dependent on Ca++ for activity. Avoid calcium chelators, such as EGTA, in reaction buffers. Enzyme is active at pH7 to pH10 with a salt concentration less than 100mM. Optimal enzyme activity occurs at 37°C; however, the enzyme is active at room temperature. Monovalent metal ions, such as Na+ and K+, will decrease activity. EGTA or heating to 65°C for 10 minutes will inactivate the enzyme. Additional Materials required but not supplied • • • Reaction buffer: 50mM Tris/HCl, pH8.0, 5mM CaCl2 10X Stop solution (optional): 200mM EGTA, pH8.0 100X BSA (optional): 10mg/mL in phosphate buffered saline Generalized Protocol for use of Micrococcal Nuclease (MNase): 1. 2. 3. 4. Dilute sample in Reaction buffer (50mM Tris-HCl pH 8.0, 5mM CaCl2). If sample only contains nucleotides (i.e., no protein), add BSA at a final concentration of 0.1mg/mL. Add micrococcal nuclease and incubate reaction at 37°C until the nucleotides are degraded. Optional: Stop reaction by adding EGTA, pH8.0 to a final concentration of 20mM. Trouble shooting Problem Possible Cause Solution Minimal or no nucleotide degradation No Ca2+ present in the reaction buffer. Add final concentration of 5mM CaCl2 to the reaction buffer. Reaction not complete Incubate reaction longer. Reaction temperature too high/low. Incubate reaction at 37°C. Incorrect reaction pH. Maintain reaction at pH7-10 using an appropriate buffer. Presence of monovalent cation. Reduce monovalent cation concentration to <100mM by dialyzing or desalting the sample. Genaxxon bioscience GmbH fon: +49 731 3608 123 fax: +49 731 3608 962 2 www.genaxxon.com e-mail: [email protected] Version: 301013 G:\products\productflyer\descr_s5238_micrococcal_nuclease.docx X GENAXXON b i o s c i e n c e ______________________ fon: +49 (0 )731 – 360 8 12 3 fax: +49 (0 )731 – 360 8 962 eMail: [email protected] internet: www.genaxxon.com Micrococcus Nuklease I.U.B. 3.1.31.1 aus Staphylococcus aureus (Foggi) Product Micrococcal Nuklease (>100units/µL) Cat# Package size S5238.0015 15000 units Produktbeschreibung Mikrococcus Nuklease ist die extrazelluläre Nuklease von Staphylococcus aureus. Mikrococcus Nuklease zeigt sowohl exo- als auch endo-5'-phosphodiesteraseaktivität und katalysiert die Spaltung von DNA und RNA zu 3'Nukleotiden. Das Enzym katalysiert vorzugsweise die Endohydrolyse von RNA und DNA an Adenylat-, Uridylat-, Deoxyadenylat- und Thymidilatseiten. Das Enzym hat ein Molgewicht von 16.807 Da und zeigt eine starke Calziumabhängigkeit. Das pH-Optimum liegt bei 9.2 ist aber stark von der Konzentration an freien Ca-Ionen abhängig. Daher wird das Enzym durch EGTA oder EDTA stark inhibiert. Die hohe Spezifität der Micrococcus Nuklease macht diese zu einem idealen Werkzeug für die Aufklärung von DNA- und Oligonukleotidsequenzen. Micrococcus Nuklease kann eingesetzt werden um Nukleinsäuren aus Zelllysaten zu entfernen, um an Chromatin gebundene Proteine frei zu setzen oder um Chromatin für die Anwendung in Chromatin-Immunopräzipitationsexperimenten zu bearbeiten (CHIP-Experimente). Spezifikationen Aktivität: min. 100 units/µL Formulierung: in 10mM Tris-HCl pH7.5, 50mM NaCl, 1mM EDTA, 50% Glycerin. Ca2+ ist für die Aktivität essentiell. Sowohl die RNAse als auch die DNAse Aktivität werden durch Deoxythymidin 3’,5’ diphosphat kompetitiv inhibiert. Die Kinetik des Abbaus von RNA und DNA ist unterschiedlich. Das Enzym wird durch Zugabe von Sr2+ nicht aktiviert. pH-Optimum: The pH-Optimum liegt bei pH9,2. Da Ca2+ aber ein essentieller Bestandteil für die Enzymaktivität ist und das pH-Optimum mit der Calciumkonzentration variiert wird eine Enzymaktivität im pH-Bereich von pH7,0 bis pH10,0 beobachtet. Inhibitoren: Während sowohl 5’-Dioxynucleotide als auch 5’-Ribonucleotide Inhibitoren sind, zeigen 5’-Dioxynucleotide eine höhere Inhibition. Alle Ca2+ Chelatoren, wie EDTA und EGTA Stabilität: Micrococcus Nuklease ist für mind. 1 Jahr bei -20°C stabil. Definition der : 1 unit is defined as the amount of enzyme required to produce an increase in absorbance at Einheit 260nm of 0.001/min/mL at 25°C of highly polymerized DNA. Ursprung: Staphylococcus aureus (Foggi) Lagerung: Nach Lieferung bei -20°C lagern. Das Enzym beim Arbeiten immer auf Eis aufbewahren. Genaxxon bioscience GmbH fon: +49 731 3608 123 fax: +49 731 3608 962 3 www.genaxxon.com e-mail: [email protected] Version: 301013 G:\products\productflyer\descr_s5238_micrococcal_nuclease.docx X GENAXXON b i o s c i e n c e ______________________ fon: +49 (0 )731 – 360 8 12 3 fax: +49 (0 )731 – 360 8 962 Highlights: • • • Das Enzym verdaut Nukleinsäuren (DNA und RNA) Effektiv für doppelsträngige, einzelsträngige, zirkuläre oder lineare Nukleinsäuren. eMail: [email protected] internet: www.genaxxon.com Aktiv in neutralem bis alkalischen Puffern die das bivalente Calciumion enthalten. Eigenschaften der gelieferten Micrococcus Nuklease (MNase): • Das Enzym wird in 50% Glycerin geliefert. Dadurch liegt das Enzym in flüssiger Form bei -20°C vor. Das Enzym sollte während der Arbeit auf Eis gelagert werden. • Micrococcus Nuklease ist ein Calciumionen abhängiges Enzym. Beim Arbeiten dürfen Calciumchelatoren, wie EGTA nicht im Reaktionspuffer enthalten sein. • Das Enzym ist bei pH-Werten von pH7 bis pH10 bei einer Salzkonzentration von weniger als 100mM aktiv. Die optimale Reaktionstemperatur liegt bei 37°C, doch ist das Enzym auch schon bei Raumtemperatur aktiv. Monovalente Metalionen, wie Na+ oder K+ verringern die Enzymaktivität. EGTA oder erhitzen auf 65°C für 10 Minuten inaktivieren das Enzym. Zusätzlich benötigtes Materials (nicht mitgeliefert) • • • Reaktionspuffer: 50mM Tris/HCl, pH8,0, 5mM CaCl2. 10X Stopplösung (Optional): 200mM EGTA, pH8,0. 100X BSA (Optional): 10mg/mL in PBS. Generalisiertes Protokoll zum Gebrauch der Micrococcus Nuklease (MNase): 1. 2. 3. 4. Probe in Reaktionspuffer verdünngen (50mM Tris-HCl pH8,0, 5mM CaCl2). Wenn die Probe nur Nukleotide/Nukleinsäuren enthält (keine Proteine), sollte BSA einer Endkonzentation von 0,1mg/mL dazu gegeben werden. Nun die Micrococcus Nuklease zugeben und bei 37°C inkubieren bis die Nukleinsäuren komplett abgebaut sind. Optional: Die Reaktion kann durch Zugabe von EGTA, pH8,0 mit einer Endkonzentration von 20mM gestoppt werden. Trouble shooting Problem Mögliche Ursache Lösungsvorschlag Minimaler order kein Nukleotidabbau. Es ist kein Ca2+ im Reaktionspuffer vorhanden. Hinzufügen von CaCl2 zum Reaktionspuffer bis zu einer Endkonzentration von 5mM. Reaktion noch nicht zu Ende. Länger inkubieren Reaktionstemperature zu hoch/zu niedrig. Bei 37°C inkubieren Falscher pH-Wert Reaktion bei pH7 bis pH10 ablaufen lassen. Anwesenheit von Monovalenten Kationen. Die Konzentration der monovalenten Kationen auf unter 100mM durch Dialyse oder Entsalzung reduzieren. Genaxxon bioscience GmbH fon: +49 731 3608 123 fax: +49 731 3608 962 4 www.genaxxon.com e-mail: [email protected]
