Immunisierung von Muttersauen mit definierten Hapten

Aus dem Institut für Immunologie
und der
Außenstelle für Epidemiologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
______________________________________________________
Immunisierung von Muttersauen mit definierten
Hapten-Carrier-Komplexen zur Prüfung des
Konzeptes der Idiotyp-Vakzinierung
von Ferkeln nach Kolostrumaufnahme
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
Vorgelegt von
Maria Gellermann
aus Hilter a.T.W.
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung:
Apl. Prof. Dr. med. vet. Hans-Joachim Schuberth
Priv. Doz. Dr. med. vet. Elisabeth große Beilage
1. Gutachter:
Apl. Prof. Dr. med. vet. Hans-Joachim Schuberth
2. Gutachter:
Prof. Dr. med. vet. Peter Valentin-Weigand
Tag der mündlichen Prüfung:
23. Mai 2006
Gefördert durch die Niedersächsische Tierseuchenkasse
Meinen Söhnen Stefan und Michael
sowie
meinem Vater
Heinrich Gellermann († 2004)
◊
In Liebe und Dankbarkeit
Inhaltsverzeichnis
1
2
Einleitung und Zielsetzung................................................................................................. 5
Literatur.............................................................................................................................. 8
2.1
Porzine humorale Immunität...................................................................................... 8
2.1.1
IgA und IgM....................................................................................................... 8
2.1.2
IgG .................................................................................................................... 9
2.1.3
Porzine IgG-Isotypen ....................................................................................... 11
2.1.4
Untersuchungen zu funktionellen Unterschieden zwischen IgG1
und IgG2................................................................................................... 13
2.1.5
Steuerungsmechanismen der Ig-Isotypenexpression ....................................... 15
2.2
Entwicklung der erworbenen humoralen Immunität beim Schwein........................ 16
2.2.1
Entwicklung des Immunsystems im Ferkel vor und nach der
Geburt....................................................................................................... 16
2.2.2
Maternal übertragene Immunität...................................................................... 17
2.2.3
Transfer maternaler Immunglobuline über Kolostrum und Milch................... 19
2.2.4
Interferenz maternaler Antikörper mit Impfantigenen ..................................... 20
2.3
Immunisierung von Schweinen................................................................................ 24
2.3.1
Schutzimpfung von Sauen................................................................................ 24
2.3.2
Schutzimpfung von Ferkeln ............................................................................. 24
2.3.3
Adjuvantien ...................................................................................................... 25
2.3.4
Die Bedeutung anti-idiotypischer Antikörper .................................................. 25
2.3.5
Idiotypvakzinen................................................................................................ 28
2.4
Experimentelle Immunisierung mit Hapten-Carrier-Konjugaten ............................ 30
2.4.1
Verwendung von NP und FITC als Haptene.................................................... 31
2.5
ELISA (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay) ................................................... 32
3
Material und Methoden .................................................................................................... 34
3.1
Versuchstiere und Versuchsbetriebe ........................................................................ 34
3.2
Immunisierungen und Probenentnahmen................................................................. 35
3.2.1
Hapten-Carrier-Konjugate................................................................................ 35
3.2.2
Immunisierung der Versuchstiere .................................................................... 36
3.2.3
Probenentnahme und Aufbereitung.................................................................. 36
3.2.4
Kennzeichnung der Versuchstiere und des Probenmaterials ........................... 37
3.3
Geräte und Material.................................................................................................. 38
3.3.1
Geräte ............................................................................................................... 38
3.3.2
Material ............................................................................................................ 38
3.3.3
Reagenzien ....................................................................................................... 39
3.3.4
Puffer und Lösungen ........................................................................................ 40
4
5
6
7
8
3.3.5
Isotyp-spezifische Antikörper .......................................................................... 40
3.4
Immunisierung von Mastschweinen......................................................................... 41
3.5
Immunisierung von tragenden Sauen und deren Ferkeln......................................... 42
3.5.1
Sauen ................................................................................................................ 43
3.5.2
Ferkel................................................................................................................ 45
3.6
Serologische Untersuchungen .................................................................................. 47
3.6.1
ELISA............................................................................................................... 47
3.6.2
Nachweis Carrier- und Hapten-spezifischer Antikörper .................................. 50
Ergebnisse ........................................................................................................................ 53
4.1
Methodische Vorarbeiten ......................................................................................... 53
4.2
Die Immunantwort experimentell immunisierter Mastschweine gegen ModellProteine (Carrier-Proteine) und Haptene ................................................................. 58
4.2.1
Carrier-spezifische Immunantwort immunisierter Mastschweine ................... 58
4.2.2
Hapten-spezifische Immunantwort immunisierter Mastschweine ................... 60
4.2.3
Bildung unterschiedlicher IgG-Isotypen gegen Haptene und
Carrierproteine immunisierter Mastschweine .......................................... 62
4.3
Immunisierung tragender Sauen mit Hapten-Carrier-Konjugaten ........................... 64
4.3.1
Hapten-spezifische Immunantwort immunisierter Sauen ................................ 65
4.3.2
Individuelle Antikörperbildung von Hapten-Carrier-immunisierten
Sauen ........................................................................................................ 67
4.4
Hapten-spezifische Immunantwort immunisierter Ferkel........................................ 70
4.4.1
Ferkel mit maternalen Antikörpern gegen beide Haptene ............................... 70
4.4.2
Ferkel mit maternalen Antikörpern gegen ein Hapten ..................................... 72
Diskussion ........................................................................................................................ 74
5.1
Methodische Aspekte ............................................................................................... 74
5.1.1
Verwendung von Hapten-Carrier Komplexen als Modellantigene.................. 74
5.1.2
Auswahl der Versuchstiere............................................................................... 75
5.1.3
Der Antigen-spezifische und Isotyp-spezifische ELISA ................................. 77
5.2
Antikörperbildung immunisierter Schweine ............................................................ 78
5.2.1
Mastschweine ................................................................................................... 78
5.2.2
Sauen ................................................................................................................ 81
5.2.3
Ferkel................................................................................................................ 82
5.3
Das IgG2/IgG1 Verhältnis in der Immunantwort auf Hapten-CarrierKonjugate beim Schwein ......................................................................................... 85
Zusammenfassung............................................................................................................ 87
Summary .......................................................................................................................... 90
Literaturverzeichnis.......................................................................................................... 93
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
ADE
ADV
Ak
AK
APC
APP
BSA
bspw.
DMSO
DNA
DNP
E.coli
FIP
FITC
Hb
HEL
kDa
KSP
IDAS
IFN
Ig
IgG
IgG1
IgG2
IL
i.m.
mAk
MMA
NP
OD
OVA
PRRS
p.n.
p.p.
RT
TMB
Antibody-dependent enhancement (Antikörper-abhängige Verstärkung)
Aujeszky’s disease virus
Antikörper
Aujeszkysche Krankheit
Antigen presenting cell (Antigen-präsentierende Zelle)
Actinobacillus pleuropneumoniae
Bovines Serumalbumin
beispielsweise
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonucleinsäure
2,4 Dinitrophenyl
Escherichia coli
Feline Infektiöse Peritonitis
Fluoreszeinisothiocyanat
Hämoglobin
Hühnereiweiss-Lysozym
Kilodalton (Molekulargewicht)
Klassische Schweinepest
Indirect double antibody sandwich assay (Indirekter, doppelter AntikörperschichtELISA)
Interferon
Immunglobuline
Immunglobulin Gamma
Immunglobulin Gamma, Isotyp 1
Immunglobulin Gamma, Isotyp 2
Interleukin
intramuskulär
maternale Antikörper
Mastitis- Metritis- Agalaktie
4-hydroxy-3-Nitrophenylsäure
Optische Dichte
ovines Serumalbumin
Porzines Respiratorisches Reproduktives Syndrom
post natum
post partum
Raumtemperatur
Tetramethyl-Benzidin
1 Einleitung und Zielsetzung
In der Schweineproduktion steht zum Aufbau einer protektiven Bestandsimmunität die Immunprophylaxe im Mittelpunkt der Maßnahmen. Die früher übliche Haltung mehrerer Produktionsstufen und Altersgruppen in kleinen Beständen führte durch den intensiven Tierkontakt meist zuverlässig zum Aufbau einer Bestandsimmunität. Demgegenüber steht heute die
geteilte Produktion in sehr viel größeren Beständen. Die Haltung von Schweinen in großen
Gruppen bringt zwangsläufig Tiere mit unterschiedlichem Infektions- und Immunstatus in
einen engen Kontakt, was die ständige Ausbreitung von Infektionen fördert und die Ausbildung einer stabilen Bestandsimmunität einschränkt. Besondere Risiken bestehen für Absetzferkel, die nach dem Verlust der maternal übertragenen Antikörper auf Infektionen mit diversen Erregern immunologisch reagieren müssen. Ein weiterer Risikobereich ist die Eingliederung von jungen Zuchtschweinen, die zur Remontierung des Bestandes regelmäßig zugekauft
werden müssen. Die Bedeutung des Schutzes vor Aufzuchtkrankheiten, insbesondere respiratorischer Erkrankungen, ist in den letzten Jahrzehnten, auch aufgrund der Restriktionen bei
der Anwendung von Antibiotika, erheblich gestiegen.
Die Konzepte zur Immunisierung von Ferkeln sehen entweder allein die Induktion einer aktiven Immunreaktion durch Impfung der Ferkel vor oder werden durch eine Kombination von
Mutterschutzimpfung und Impfung der Ferkel erreicht. Durch die Aufnahme von Immunglobulinen (maternale Antikörper), insbesondere von IgG mit dem Kolostrum, erhalten die immunologisch naiv geborenen Ferkel einen natürlichen lebenswichtigen Schutz während der
ersten Lebenswochen. Mit der Mutterschutzimpfung tragender Sauen kann die Bildung von
maternalen Antikörpern gezielt induziert werden, die dann mit dem Kolostrum auf die Ferkel
übertragen werden und einen passiven Schutz vermitteln. Die Schutzimpfung tragender Sauen
spielt eine wichtige Rolle bei der Weitergabe einer protektiven Immunität an die Ferkel. Während der Säugephase oder kurze Zeit nach dem Absetzen werden die maternal erworbenen
Antikörper abgebaut. In dieser Phase infizieren sich die Ferkel häufig mit den verschiedenen
Erregern, gegen die sie dann eine eigene, aktive Immunität aufbauen müssen. Die Säugeperiode beträgt bei den derzeitig verbreiteten Produktionsverhältnissen etwa 21 bis 24 Tage. Unter Praxisbedingungen werden diverse Impfungen bereits während der Säugephase durchgeführt um eine Immunreaktion rechtzeitig vor einer Infektion zu induzieren. Da Infektionen
direkt nach dem Absetzen, aber auch noch während der späteren Mastphase stattfinden, wird
die aktive Immunisierung von Ferkeln mit dem Ziel durchgeführt einen belastbaren Schutz
vom Zeitpunkt des Absetzens bis zum Mastende zu erreichen. Die Ausbildung einer belastbaren Immunreaktion setzt üblicherweise eine Impfung zwei bis drei Wochen vor der mutmaßlichen Infektion voraus. Die Impfungen vor dem Absetzen finden zu einem Zeitpunkt statt, zu
dem im Ferkelserum noch maternale Antikörper zirkulieren.
5
Der Einfluss von maternalen Antikörpern auf die Immunitätsbildung im Ferkel wird im Hinblick auf den geeigneten Impfzeitpunkt seit Jahren kontrovers diskutiert und ist Gegenstand
zahlreicher Untersuchungen. Gegen einige Erkrankungen sind persistierende maternale Antikörper sehr lange im Ferkelserum nachweisbar und können dann den Aufbau einer eigenen
Immunität behindern. Für das Virus der Aujeszkyschen Krankheit sind maternale Antikörper
bis max. 16 Wochen nachweisbar, was zu einer Modifizierung des Impfzeitpunktes frühestens
ab der zehnten Lebenswoche geführt hat (FRIEDEL et al., 1989). Gegen Mycoplasma hyopneumoniae, dem Erreger der Enzootischen Pneumonie sind durchschnittlich 9 Wochen zirkulierende Antikörper nachweisbar (MORRIS et al., 1994). In einer Untersuchung von
GROSSE BEILAGE, E. und A. SCHREIBER (2005) zur Auswirkung des Impfzeitpunktes
gegen M. hyopneumoniae bildeten Tiere, die zu einem späteren Zeitpunkt geimpft wurden
(vierte und achte Lebenswoche), deutlich höhere Antikörperkonzentrationen aus als Tiere, die
mit dem praxisüblichen Impfschema (erste und vierte Lebenswoche) geimpft wurden.
Gleichwohl zeigt sich auch nach einer frühen Impfung ein protektiver Effekt gegenüber nicht
geimpften Kontrolltieren, wobei die Menge der maternal übertragenen Antikörper einen größeren Einfluss hat (KOBISCH et al., 1994; RAUTIANEN u. WALLGREN, 2001).
Zahlreiche Untersuchungen befassen sich mit möglichen negativen Interferenzen zwischen
maternal aufgenommenen Immunglobulinen und der aktiven Immunreaktion auf eine Impfung der Ferkel und kommen z.T. zu widersprüchlichen Ergebnissen. Genaue Untersuchungen der immunologischen Prozesse, welche die Effekte maternaler Antikörper auf die Immunitätsbildung der Nachkommen beschreiben, liegen für viele Tierarten vor. Die Untersuchungen schließen auch Charakterisierung der Isotypen des IgG mit ihren unterschiedlichen Effektorfunktionen ein. Für Rind, Maus und Mensch liegen hier gesicherte Erkenntnisse vor.
Für das Schwein existieren dagegen nur wenige Studien. In den meisten Untersuchungen
wurde unter Feldbedingungen die humorale Immunantwort Ig-klassenspezifisch ermittelt.
Erst seit der Entwicklung porziner isotypspezifischer Antikörper vor einigen Jahren wird in
Studien die Qualität der humoralen Immunantwort untersucht, allerdings mit einer meist geringen und daher wenig repräsentativen Anzahl von Versuchstieren. Im Mittelpunkt stehen
dabei neben der lokalen und systemischen IgA- sowie IgM-Antwort die Bildung des häufigsten Immunglobulins im Schweineserum, des IgG und dessen Isotypen IgG1 und IgG2. Obgleich der erworbenen zellulären Immunantwort auch beim Schwein große Bedeutung zukommt, korrelieren hohe IgG-Konzentrationen gegen die meisten Pathogene mit einer belastbaren humoralen Immunität. Welche Effekte maternal übertragene isotypspezifische IgMuster auf die Immunreaktion des Ferkels haben, ist dabei noch weitgehend ungeklärt. In der
existierenden Literatur hierzu weisen außerdem nahezu alle Untersucher auf die große Variabilität der Immunantworten hin.
6
Der Erforschung der Qualität der Immunantwort des Ferkels in Gegenwart maternaler Antikörper fällt im Hinblick auf die Optimierung von Impfstrategien unter ökonomischen und
epidemiologischen Gesichtspunkten eine erhebliche Bedeutung zu.
Im Mittelpunkt der vorliegenden Untersuchung steht die Darstellung der Immunreaktion von
Ferkeln, die kolostral ein bekanntes, isotypspezifisch definiertes IgG-Repertoire erhalten haben und mit einem „bekannten“ und/oder „unbekanntem“ Antigen zu verschiedenen Zeitpunkten immunisiert wurden.
Neben der isotypspezifischen Darstellung der Immunantworten stellte sich weiterhin auch die
Frage nach der möglichen Bedeutung anti-idiotypischer Antikörper, d. h. vom Ferkel gebildeter Antikörper gegen idiotypische Determinanten der maternalen Antikörper.
7
2 Literatur
2.1 Porzine humorale Immunität
2.1.1 IgA und IgM
IgA liegt, durch eine sekretorische Komponente vor Proteolyse geschützt, beim Schwein
hauptsächlich als Dimer vor (BUTLER u. BROWN, 1994). Es ist als ‚Oberflächenimmunglobulin’ für die Abwehr auf allen Körperschleimhäuten wichtig.
KLOBASA et al. (1985a) fanden in sieben bis neun Monate alten Schweinen verschiedener
Rassen Werte von 1,1 bis 1,5 g IgA/l Serum, was einem Anteil von 3,3 % an allen Immunglobulinen entspricht. Im Kolostrum sind 21,2 g/l enthalten (etwa 14 % der Antikörper).
Innerhalb von 24 Stunden reduziert sich der Anteil auf 30 % des initial vorhandenen IgA’s.
Ab der zweiten Laktationswoche wird IgA mit über 5 g/l zum dominierenden ImmunglobulinIsotyp in der Milch (KLOBASA et al., 1981).
IgM kommt vor allem im Serum vor (14 % der Ig’s, 100 bis 500 g/l; TIZARD, 2000). Die
Hauptaufgabe des IgM liegt in der Agglutination und der Komplementaktivierung nach Antigenbindung. Es ist ein über Disulfidbrücken ringförmig verbundenes Pentamer
(TRAUTWEIN, 1990) und hat als größtes Immunglobulin ein Gewicht von 900 kDa. Mit 9,1
g/l (KLOBASA et al. 1981) und einem Anteil an allen Immunglobulinen von 5-6 %
(PORTER 1969, KLOBASA und WERHAHN 1984) lässt sich IgM im Kolostrum nachweisen, fällt aber bereits am ersten Laktationstag um 75 % ab (CURTIS und BOURNE 1971;
KLOBASA und WERHAHN 1984). In der Milch hat IgM einen Anteil von 18 % der gesamten Immunglobuline (CURTIS und BOURNE, 1971). Im Ferkelserum beträgt die Halbwertzeit von maternal übertragenem IgM 3,0 bis 4,5 Tage (CURTIS u. BOURNE 1971;
KLOBASA et al. 1981).
IgM und IgA haben eine erhebliche Bedeutung für die Abwehr im Darm neugeborener Ferkel.
Während sich bei der Geburt im Ferkelserum nahezu keine Immunglobuline nachweisen lassen, können IgA und IgM bereits in den Peyerschen Platten des Darms nachgewiesen werden
(KLOBASA et al. 1981). In den Plasmazellen der Lamina propria überwiegen bis zu einem
Alter von vier Wochen IgM-Antikörper, beim erwachsenen Schwein finden sich dort zu 90 %
IgA-positive Plasmazellen (ALLEN u. PORTER 1977; KLOBASA et al. 1981).
8
Hinweise auf weitere Ig-Klassen gaben Studien zur cutanen Anaphylaxie von BARRIGA und
INGALLS (1984), in der das mögliche Vorkommen von IgE beschrieben wird. In Studien
von ZIKAN et al. (1983), wurden Hinweise auf porcines IgD festgestellt.
Eine Übersicht über das Vorkommen und die Verteilung der drei Hauptklassen von Immunglobulinen in verschiedenen Körperflüssigkeiten des Schweins zeigt Tabelle 1.
Tabelle 1: Vorkommen von Immnglobulinen in verschiedenen Körperflüssigkeiten beim
Schwein
Serum
Kolostrum
Milch
g/l
Anteil Ig (%)
g/l
Anteil Ig (%)
g/l
Anteil Ig (%)
IgG
26,9-40,3c
88a,c
95,6a,e
80c,a
1,5d
20-30
IgA
1,5e
3,3c,e
21,2d,f
14c
5,3a
82c
IgM
5,2b
14a,e
9,1d
5-6a,e
1,4d
18b,e
a) PORTER 1969; b) CURTIS u. BOURNE 1971; c) PORTER u. ALLEN 1972; d) KLOBASA et al.
1981 ; e) KLOBASA u. WERHAHN 1984; f) WICHERN 1993
2.1.2 IgG
IgG ist das häufigste Serumimmunglobulin. Allgemein liegt IgG in monomerer Struktur vor,
was den Austritt aus Blutgefäßen und eine gleichmäßige Verteilung aus dem Intra- und Extrazellulärraum erleichtert (TIZARD 2000). Der Aufbau eines Immunglobulins wird in Abbildung 1 dargestellt.
IgG ist bakterizid und neutralisiert z.B. Toxine. Nach der initialen Komplementaktivierung
durch IgM (KLOBASA et al., 1985a) vermag IgG weiteres Komplement zu aktivieren. IgG
hat auch die Fähigkeit zur Opsonisierung von Antigenen, die deren Phagozytose ermöglicht.
Schweineserum enthält zu 88 % IgG und mit 17,0 - 29,0 g IgG/l Serum im Speziesvergleich
noch vor dem Rind die größte Menge IgG aller untersuchten Spezies. Im Vergleich zum Menschen (8,0-16,0 g/l) hat das Schwein annähernd die doppelte Menge IgG (TIZARD 2000).
Im Kolostrum hat IgG einen Anteil von 80 %, der in der Milch auf 20-30 % zurückgeht
(PORTER und ALLEN 1972; KLOBASA u. BUTLER 1987). KLOBASA u. WERHAHN
(1984) weisen in ihren Arbeiten aber ausdrücklich auf die Schwierigkeiten zur Ermittlung von
„Normalwerten“ porziner Immunglobuline hin. Der Ig- Spiegel ist demnach unter anderem
abhängig vom Alter, bei Sauen auch von der Wurfnummer (höhere Ig-Konzentrationen bei
9
älteren Tieren) und dem Trächtigkeitsstadium. In zahlreichen Arbeiten sind stets auch starke
individuelle Schwankungen festgestellt worden, die eine Angabe von allgemeinen Durchschnittswerten bisher nicht ermöglicht haben.
Abbildung 1: Modell eines Immunglobulins
(Quelle:http://home.earthlink.net/~dayvdanls/antibody.gif)
Die Bildung von Immunglobulin G im Rahmen einer adaptiven Immunantwort wird über Zytokine gesteuert. Allgemein werden diese eingeteilt in Typ-1 Zytokine (IFN-γ, IL-12), welche
Komplement- sowie Phagozytose-aktivierende IgG-Isotypen induzieren, und Typ-2 Zytokine
(IL-4, IL-10), welche zur Bildung von Antikörpern führen, deren Fähigkeit Komplement zu
aktivieren und nach Antigenbindung an zelluläre Fc-Rezeptoren zu binden schwächer ist.
IgG ist sehr widerstandsfähig gegenüber proteolytischen Verdauungsenzymen (FRANEK
1987). Vergleichende Studien von STONE et al. (1979) zeigen eine höhere Stabilität von
IgG2 gegenüber IgM, während sich IgA als noch stabiler erwies. Im Ferkelserum wird die
Halbwertzeit von maternal übertragenem IgG mit 8 bis 14 Tagen angegeben (CURTIS und
BOURNE 1973; HABE 1974; PROCHAZKA et al. 1979; FRENYO et al. 1981).
10
2.1.3 Porzine IgG-Isotypen
Isotypen innerhalb einer Ig-Klasse unterscheiden sich durch den jeweils charakteristischen
Typ der schweren Kette (H-Kette). Beim Schwein sind bisher fünf IgG-Isotypen bekannt:
IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 und IgG4 (KACSKOVICS et al. 1994).
Ein besseres Verständnis und letztlich der Zweck einer optimierenden Beeinflussung der Immunantwort durch verbesserte Impfstoffe war Gegenstand der Beschreibung der Struktur und
später auch der Funktion der IgG-Isotypen. Beim Schwein bereitete diese Charakterisierung
erheblich mehr Schwierigkeiten als bei anderen Tierarten. Erstens zeigten sich große strukturelle Unterschiede zu taxonomisch eigentlich nah verwandten Spezies (z.B. dem Rind) und
zweitens erwiesen sich die Unterschiede der IgG-Isotypen untereinander als viel geringer und
damit schwieriger zu differenzieren, als bei Rindern, Mäusen und Meerschweinchen. Die Varianten von porzinem IgG ließen sich auch nicht, wie bei anderen Tierarten, problemlos immunelektrophoretisch oder chromatographisch unterscheiden. Hier eröffnete erst der Einsatz
der rekombinanten DNA-Technologie neue Möglichkeiten.
Obwohl dieser deutliche Unterschied zu nahe verwandten Spezies besteht, gibt es überraschend viele Ähnlichkeiten mit menschlichem IgG. So fanden sich Übereinstimmungen in der
Aminosäurensequenz zwischen humanen und porzinen leichten Ketten (FRANEK u.
ZORINA 1967; RUFFILI u. BAGLIONI 1970). Die Methoden zur Identifizierung von Isotypen waren dabei unterschiedlich, einige Autoren stellten neben immunelektrophoretischen
Heterogenitäten Proteolyseunterschiede fest oder arbeiteten mit Isotyp-spezifischen Reagenzien.
Von METZGER und FOUGEREAU sind 1967 zunächst zwei IgG-Subklassen, IgG1 und
IgG2, beschrieben worden. CURTIS und BOURNE (1971), BOKHOUT et al. (1986) und
VAN ZAANE und HULST (1987) berichteten von drei, und 1972 differenzierten
KALTREIDER und JOHNSSON vier IgG-Subklassen.
KACSKOVICS et al. (1994) konnten durch den Einsatz rekombinanter DNA-Technologie
durch Hybridisation von porziner genomischer DNA mit cDNA schließlich fünf IgGSubklassen nachweisen; IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 und IgG4, einige mit allotypischen Varianten. Nach der Sequenzähnlichkeit sind die porzinen IgG’s in zwei Cluster eingeteilt worden; ein Cluster enthält IgG1 und IgG3 und der andere IgG2a, IgG2b und IgG4
(KACSKOVICS et al. 1994). Diese Einteilung konnte von CRAWLEY und WILKIE (2003)
bestätigt werden.
Untersuchungen zur Funktion von porzinen IgG-Isotypen waren erst mit monoklonalen Antikörpern möglich. VAN ZAANE und HULST (1987) entwickelten IgG1- und IgG211
spezifische monoklonale Mausantikörper, mit deren Hilfe die Expression und die Funktion
Isotyp-spezifisch in vivo und in vitro nachgewiesen werden konnten. CRAWLEY und
WILKIE (2003) untersuchten die Komplexität der Struktur-Funktionsbeziehung der Immunglobulinisotypen des Schweins. Variationen in der Proteinstruktur determinieren funktionelle Unterschiede zwischen Ig-Isotypen. Demnach ist die Kenntnis der Struktur unabdingbar,
um die Funktion eines Isotypes zu definieren und anschließend gezielt, bspw. im Rahmen von
Vakzine-Neuentwicklungen einen favorisierten Typ zu stimulieren.
In der Untersuchung von CRAWLEY u. WILKIE (2003) wurden nach Komplementaktivierung und Detektion der durch monoklonale Antikörper erhaltenen Bindungen diese Strukturen
molekularanalytisch dargestellt. Besondere funktionelle Bedeutung kommt demnach der Gelenkregion (engl. ‚hinge region’) des Antikörpers zu, über die beim Schwein strukturell bisher
nur wenig bekannt war. Die hinge region ist mit der Auslösung der klassischen KomplementKaskade assoziiert und wird in die obere, mittlere und untere hinge region eingeteilt. In anderen Spezies variiert die Länge und Flexibilität der hinge region stärker als beim Schwein.
Humanes IgG3 ist z.B. schwerer als andere IgG-Moleküle, weil es viele Disulfidbrücken in
der hinge region aufweist und daher besonders gut Komplement bindet.
Hinges bestehen aus hydrophoben Aminosäuren, welche die Fab-Arme so positionieren, dass
sie mit der C1q-Bindung interferieren. Die obere hinge region stellt die Flexibilität zwischen
den Fab-Armen (mit den Ag-Bindungsstellen) her und ermöglicht deren Rotationsbewegung.
Die starre mittlere hinge region wirkt stabilisierend durch cystingeformte Disulfidbrücken
zwischen den Ketten und fungiert als Abstandhalter zwischen den Fab-Armen und Fc-Teilen,
die an der Bindung der ersten Komponente der Komplementkaskade, des C1q, beteiligt sind.
Die mittlere hinge region ist weniger flexibel als die untere hinge region. Kleinere, hydrophile
Aminosäuren erzeugen flexiblere Strukturen. Bovines IgG2a besitzt flexiblere hinges, als
IgG2b, was deren überragende Fähigkeit zur Komplementaktivierung erklären könnte.
Die unterschiedliche Flexibilität der hinge region des Schweines, wurde bereits von
METZGER u. HOUDAYER. (1971) angedeutet, wonach Schweine weniger Varianten dieser
Region aufweisen könnten als andere Spezies, dem auch BUTLER u. BROWN (1994) zustimmten. Isotypische Varianzen porziner IgG-Isotypen finden sich neben der hinge region in
der heavy chain (CH)-3-Region. Die Flexibilität in der mittleren hinge region ist für IgG2a,
IgG2b und IgG4 höher als bei IgG1 und IgG3. Demzufolge können die erstgenannten Isotypen besser Komplement aktivieren.
12
2.1.4 Untersuchungen zu funktionellen Unterschieden zwischen IgG1 und
IgG2
IgG besteht in Schweineserum überwiegend aus IgG2, altersabhängig zu 46-75%
(BOKHOUT et al., 1986). Jüngere Schweine weisen einen höheren Prozentsatz von IgG1 auf.
Im Serum von zehn adulten Schweinen fand BOKHOUT 14 g/l IgG2, im Kolostrum 67 g/l.
(BOKHOUT et al., 1986). Tiere, die zur Produktion von mehr IgG1 tendieren, bilden weniger
IgG2 und umgekehrt (FURESZ et al. 1998). Kolostrales IgG scheint überwiegend aus IgG2
zu bestehen (CURTIS u. BOURNE, 1971).
Nach Untersuchungen, die eine mögliche Korrelation zwischen IgG-Subklassen und der Protektion gegen eine bestimmte Infektion prüften, wurde eine IgG1 dominierte Immunantwort
gegenüber einer IgG2 dominierten Antwort bei vielen Autoren als effektiver angesehen. IgG1
steigt bei Immunisierungen schneller an und ist aktiver in der Virusneutralisation. In immunelektrophoretischen Mobilitätsanalysen lässt sich für IgG1 eine schnellere Beweglichkeit
nachweisen (CRAWLEY et al. 2002). Ergänzend zeigten molekulargenetische Studien, dass
die cDNA von IgG1 die am häufigsten exprimierte IgG-Subklasse ist (KACSKOVICS et
al.1994).
Nach intranasaler Applikation eines AK-Lebendimpfstoffes und anschließender experimenteller Infektion mit einer geringen Menge des Virus der Aujeszkyschen Krankheit (Porzines
Herpesvirus 1) wiesen KIMMAN et al. (1992) einen höheren und schnelleren Anstieg von
IgG1 (auf 4,5 10 log ELISA-Einheiten) nach, dem eine etwas geringere IgG2 Reaktion folgte.
KIMMAN et al. (1992) prüften dabei auch das isotypische Reaktionsmuster auf die primäre
Immunantwort nach Impfung mit einer intranasal applizierten Lebendvakzine bzw. einer i.m.
okulierten Totvakzine im Alter von 10 Wochen. Anschließend prüften sie die sekundäre Immunantwort auf eine PHV-1-Infektion mit drei Monaten dieser Schweine im Vergleich mit
einer ungeimpften Kontrollgruppe. Hierbei zeigte sich, dass IgG1 stets früher als IgG2 gebildet wird, am deutlichsten nach Infektion ungeschützter Schweine. IgG1 ist dann ab dem 10.
Tag p. i. messbar und erreicht seinen maximalen Titer am 19. Tag p. i., während IgG2 ab dem
15. Tag p. i. erstmals und am 22. Tag mit maximalen Serumtitern vorhanden ist. Beim Vergleich der Immunantworten auf die Lebend- und Totvakzine war ein ausgewogenes Verhältnis beider Isotypen feststellbar, sowohl die erste Detektion im Serum als auch die Titerhöhen
betreffend. Unterschiede waren in der Bildungsgeschwindigkeit deutlich: Hier wurden für
IgG1 durch die Lebendvakzine früher maximale Titern erreicht -nach 29 Tagen, gegenüber
IgG2 mit 46 Tagen-, während es bei der Totvakzine umgekehrt war. (Am meisten IgG1 wurde
hier nach 66 Tagen gemessen, gegenüber 56 Tagen für IgG2). In der sekundären Immunantwort einer experimentellen PHV-1-Infektion geimpfter Ferkel waren kaum Unterschiede zwischen Tot- und Lebendvakzinen für IgG1 und IgG2 zu ermitteln. Jedoch konnte in diesem
13
Versuch IgG1 im Gegensatz zu IgG2 auch in Tränen- und Lungenlavageflüssigkeit festgestellt werden.
Eine ähnliche Beziehung wird von mehreren Autoren beschrieben. So lassen sich auch bei
intranasaler Applikation eines APP-haltigen Aerosols ähnliche Konzentrationen von IgG1
und IgG2 darstellen (FURESZ et al. 1998). Hohe IgG1-Titer waren hier negativ korreliert mit
dem Merkmal Pneumonie bei der Sektion, woraus die Autoren auch hier auf eine höhere Protektivität durch eine IgG1 dominierte Immunantwort schlossen. In Infektionsversuchen mit
dem Influenzavirus Subtyp H3N2 bei sechs 10 Wochen alten Ferkeln ermittelten HEINEN et
al. (2000) die spezifische Immunantwort von IgG, IgG1, IgA und IgM in Serum sowie bronchoalveolärer und nasaler Spülflüssigkeit. Nach raschem Anstieg von IgM (Serummaximum
nach 5 Tagen p .i.) folgte ein IgA und dann ein IgG1-Anstieg, der sein Maximum im Serum
an Tag 23 p. i. erreichte. Vergleichbare Ergebnisse, d.h. ein sehr schneller Anstieg von IgM,
gefolgt von einem IgG1 und einem etwas niedrigerem IgG2-Titer fanden sich in weiteren
Versuchen, so bei Infektionen mit Trichinella spiralis (SERRANO et al. 2001) und in der
Prüfung einer Vakzine gegen Maul- und Klauenseuche (COX u. BARNETT 2003).
FRONTERA et al. (2003) führten Infektionsversuche mit Ascaris (A.) suum an immunisierten
und nicht immunisierten 8 und 15 Wochen alten Schweinen durch. Dabei immunisierten sie
zwei Gruppen mit ansteigenden Dosen des infektiösen Antigens (Eier von A. suum) und drei
Gruppen mit inaktivierten Proteinfraktionen von A. suum. Die Messung der Immunantwort
durch Bestimmung von IgG1, IgG2 und IgM sowie festgestellte klinische Erkrankungen zeigten für die Gruppen der mit inaktiviertem Antigen vakzinierten Tiere einen hohen IgG1 und
IgG2 Titer, während die zuvor infizierte Gruppen sehr hohe, effektive IgG1 und IgM-Titer
bildete. Ein hoher IgG1 Spiegel war negativ korreliert mit der Anzahl der Lungenlarven, aber
positiv mit der Anzahl von „Milk spots“ auf der Leber. IgG2 war mit beiden Merkmalen positiv und IgM mit beiden Merkmalen negativ korreliert. Im Ergebnis wird ein hoher IgG1 und
IgM Spiegel mit erworbener Resistenz assoziiert und die Induktion einer Th2-gesteuerten
IgG1 Antwort favorisiert.
Um den Zeitpunkt der Ausbildung einer humoralen Immunantwort zu untersuchen, wurde die
IgG1, IgG2, IgM und IgA-Antwort nach einer Infektion mit SVD-Virus (swine vesicular disease) von DEKKER et al. (2002) geprüft. IgG1 stieg demnach schneller an als IgG2. Auch
wurde der Zeitpunkt angegeben, bei welchen 50 % der Tiere eine entsprechende Immunantwort aufwiesen (In Klammern angegeben). Demnach begann die IgG(-gesamt)-Antwort acht
bis 15 (12) Tage; die IgG1- acht bis 28 (12) Tage und die IgG2-Antwort 11 bis 35 (24) Tage
post infectionem.
Obgleich in den meisten Untersuchungen die Induktion eines IgG1-Titers als „protektiver“
favorisiert wird, wird in mehreren Arbeiten eine sich in der Wirkung ergänzende Kombination der Isotypenantwort als besser erachtet. So konnten CRAWLEY et al (2002) bei in vitro
14
Versuchen zur Komplementaktivierung feststellen, dass isoliertes IgG2 mehr Meerschweinchenkomplement aktiviert als IgG1. Eine Mischung aus IgG1, IgG2 und IgM induzierte die
potenteste Immunreaktion, wohingegen isoliertes IgM kein Komplement aktivieren konnte.
Allerdings relativieren mehrere Untersucher ihre Ergebnisse mit dem Hinweis auf starke individuelle Schwankungen der IgG1- und IgG2-Titer. Außerdem wird auf das Vorkommen so
genannter Non-responder verwiesen.
Dennoch wird überwiegend eine Beeinflussung der Immunantwort in Richtung selektiver
IgG1 Expression im Hinblick auf die Entwicklung potenterer Vakzinen als vielversprechend
angesehen. Nach Ansicht von FURESZ et al. (1998) könnte diese Beeinflussung zielgerichtet
über die Veränderung der Adjuvanzien, der Antigendosis oder der Applikationsroute erreicht
werden. Über den Typ Antigen-präsentierender Zellen, könnte außerdem der Typ der Immunantwort gezielt gesteuert und entsprechende Vakzinen kontrolliert eingesetzt werden.
2.1.5 Steuerungsmechanismen der Ig-Isotypenexpression
Bei Menschen und Mäusen ist der Mechanismus zur Beeinflussung eines Antikörperisotyps
durch T-Zytokine umfassend untersucht worden (CONSTANT u. BOTTOMLY 1997;
ROMAGNANI 1997). Danach wird die Bildung von IgG2 durch CD4+ Th1-Zellen über IL2,
IFNγ und TNFα gesteuert; hingegen durch CD4+ Th2 Zellen über IL4, IL5 ,IL10 und IL13
eine IgG1 Antwort induziert. Für das Schwein liegen nur wenige entsprechende Kenntnisse
vor.
CRAWLEY et al. (2002) konnten in porzinen B-Zellen in vitro mit rekombinanten IFNγ und
IL-12 einen (mit starken individuellen Schwankungen) Klassenwechsel zum IgG2 indzuzieren und mit IL10 den Wechsel zum IgG1 erreichen. Die bereits von FURESZ et al. (1998)
beschriebene Zuordnung von porzinem IgG1 als einem Typ2-Immunantwort-IgG und IgG2
als einem Typ1-Immunantwort-IgG konnten somit von CRAWLEY et al. (2002) bestätigt
werden. In einer weiteren Studie kultivierten CRAWLEY u. WILKIE (2003) porzine BZellen mit bakteriellen Mitogenen (von Staphylococcus aureus und E.coli) und mit Zytokinen, um den Th1/Th2-Paradigmus beim Schwein zu untersuchen. Durch die Mitogene konnte
ein Anstieg von IgG1 und IgG2 in nahezu gleichem Verhältnis sowie die Produktion von IgM
ausgelöst werden. Die Zytokine hatten keinen zusätzlichen Effekt, in einigen Fällen mit einer
schwachen IgG1-Antwort konnten jedoch Th1 Zytokine wie IFNγ und IL12 eine IgG2Antwort steigern. In einigen Fällen verhielten sich die gemessenen Werte diametral gegensätzlich. (CRAWLEY u. WILKIE, 2003).
Bei anderen Tierarten lassen sich die IgG-Isotypen gezielt induzieren. So verursacht Aluminiumhydroxid in Mäusen, Menschen und verschiedenen anderen Spezies eine Typ2-
15
Immunantwort (BREWER et al., 1999). Bei Pferden induziert die Nematodeninfektion einen
starken Anstieg von IgGT (PATTON et al., 1978), während durch eine Infektion mit Streptococcus equi überwiegend IgGa dominiert (SHEORAN et al., 1997). Bei akuter Malaria des
Menschen sind IgG1 und IgG3 effiziente Verstärker einer antikörperabhängigen, zellvermittelten Zytotoxizität, Opsonierung und Phagozytose. Im Gegensatz dazu inhibiert IgG2 diesen
Schutz (NDUNGU et al. 2002). Beim Rind wird die Opsonisierung des Mastitiserregers
Staphylococcus aureus durch IgG2 vermittelt und durch IgG1 inhibiert. Dieses wird in der
Zuchtwertschätzung eingesetzt, wobei der bovine Allotyp IgG2a zu einer Abwertung für das
Merkmal Mastitisanfälligkeit führt, während IgG2b und IgG1 positiv bewertet werden
(KELM et al. 1995).
2.2 Entwicklung der erworbenen humoralen Immunität beim
Schwein
2.2.1 Entwicklung des Immunsystems im Ferkel vor und nach der Geburt
In der Entwicklung des fetalen Immunsystems beim Schwein finden sich bereits ab dem 18.
Trächtigkeitstag (TT) erythroide Zellen und Stammzellen im Dottersack des Fetus. Lymphoide Zellen in Thymus, Leber und Blut ab dem 28. TT differenzieren sich ab dem 40. Tag zu TZellen (CD4 und CD8) und ab dem 55. TT ist eine antigenspezifische Antwort nachweisbar.
PROKESOVA et al. (1981) demonstrierten schon ab dem 38. TT die Existenz Igproduzierender Lymphozyten in Leber- und Milzzellsuspensionen. Der Bildung von Interleukin-2-Rezeptoren auf Lymphozyten am 76. Tag folgt der Nachweis von Natürlichen Killerzellen am 100.Tag.
Der Fetus ist in Abhängigkeit vom jeweiligen Entwicklungsstadium bereits zu eigenen Immunreaktionen im Stande. Für die Fähigkeit zur Abwehr von Infektionen teilt ROUZE (1976)
die fetale Entwicklung in drei Stadien ein: Bei einer Infektion vor dem 45.TT findet demnach
keine Antikörperbildung statt. Zwischen 45. und 60. TT liegt eine Toleranzphase, in der Antigene nicht als fremd erkannt werden und ab dem 60.TT wird der Fetus immunkompetent.
Beim Schwein findet vor der Geburt keine Übertragung maternaler Antikörper statt. In der
Literatur sind zur pränatalen Übertragung jedoch auch widersprechende Angaben zu finden.
Aufgrund der sechslagigen epitheliochorealen Plazenta (Plazentaschranke) werden Schweine
nach Ansicht der meisten Autoren agammaglobulinämisch geboren. CUKROWSKA et al.
(1996) wiesen aber bei 44 Tage alten gnotobiotischen Schweinefeten Serumimmunglobuline
aller Isotypen, vor allem IgM, nach. Diese waren gegen Autoantigene (Thyreoglobulin, Hormone u.a.), aber auch gegen Bakterienbestandteile (O39 von E. coli) gerichtet. Auch eine
transplazentare Übertragung maternaler Immunglobuline wurde von einigen Autoren nach16
gewiesen (PORTER und HILL 1970; FRENYO et al. 1981). Die überwiegende Anzahl der
Autoren geht aber davon aus, dass Ferkel ohne (maternale) Antikörper geboren werden.
Die Fähigkeit der B-Lymphozyten von neugeborenenen Ferkeln zu Plasmazellen zu differenzieren, ist nach HAMMERBERG et al. (1989) zunächst noch eingeschränkt. Als Ursachen
werden die suppressive Aktivität von T-Lymphozyten (SUGANUMA et al. 1986), hohe Serumcorticoidkonzentrationen und eine eingeschränkte Phagozytenaktivität (RICHTER und
URBANEK 1983) angegeben. Diese Einschränkungen verlieren sich aber innerhalb der ersten
vier Wochen und mit 12 Wochen ist die Entwicklung des Immunsystems abgeschlossen
(BLECHA 2001).
Eine Schlüsselfunktion nimmt die Aufnahme von maternalem Kolostrum innerhalb der ersten
Lebensstunden ein, was neben der nutritiven Komponente gleichsam die Funktion einer natürlichen Schluckimpfung für das Ferkel darstellt.
2.2.2 Maternal übertragene Immunität
Unmittelbar nach der Geburt nehmen Sau und Ferkel Kontakt miteinander auf und das Ferkel
sucht sogleich (innerhalb von 10 bis 30 min.) das Gesäuge auf. Der Aufnahme von Kolostrum
in den ersten Lebensstunden kommt auch in Bezug auf die Entwicklung des Immunsystems
eine entscheidende Bedeutung zu, da sich bereits innerhalb der ersten 12 h nach der Geburt
seitens der Sau in der Zusammensetzung des Kolostrums als auch seitens des Ferkels in der
Fähigkeit zur Resorption der enthaltenen Proteine dramatische Veränderungen ergeben.
In der Zusammensetzung von Sauenkolostrum ändert sich neben dem enthaltenen Fett und
Vitamin A der Gehalt von Immunglobulinen rasch. Für IgG werden zum Geburtszeitpunkt
95,6 g IgG/l Kolostrum angegeben, deren Menge sich nach 6 h halbiert und bereits nach 24 h
auf einen Wert von14,2 g/l absinkt (KLOBASA u. WERHAHN 1984). IgM ist zunächst mit
9,1 g/l enthalten und fällt innerhalb des ersten Laktationstages um 75 % dieses Wertes ab
(KLOBASA et al. 1981). Zwischen dem 21. und 28. Laktationstag ist der IgM-Gehalt am
niedrigsten. IgA findet sich zu Laktationsbeginn mit 21,2 g/l Kolostrum (WICHERN 1993),
auch hier kommt es zu einem drastischen Abfall der Werte innerhalb von 24 h. Es folgt dann
aber wieder ein Anstieg, so dass IgA vom dritten Tage an den größten Teil der Immunglobuline im Kolostrum ausmacht (KLOBASA und WERHAHN 1984).
Insgesamt ist also 12 h nach dem Abferkeln nur noch rund 1/3 der anfänglichen Antikörpermenge im Kolostrum vorhanden (KLOBASA et al. 1981). Die Werte unterliegen deutlichen
Schwankungen und der Gehalt an Immunglobulinen in Kolostrum und Milch wird neben individuellen Unterschieden von zahlreichen weiteren Parametern bestimmt. Nach KLOBASA
et al. (1985a) beeinflusst die Wurfzahl den IgG und IgM-Gehalt der Milch. Ab der vierten
17
Laktation steigt danach der IgG-Gehalt signifikant, IgM schon ab der dritten Laktation. Der
Einfluss des Alters ist weniger bedeutend als die Menge an Antigenkontakten der Sau. Bei
älteren Tieren sind höhere Werte nachweisbar. Auch wurden Unterschiede zwischen verschiedenen Schweinerassen beschrieben. RADZIKOWSKI et al. (1974) und INOUE et al.
(1980) stellten einen Einfluss der Jahreszeit (höhere IgG-Werte im Frühjahr, niedrige in den
Sommermonaten) sowie einen Fütterungseinfluss auf den IgG-Gehalt fest. Selbst die Produktionsstruktur des Betriebes, in dem Sauen gehalten werden, verursacht signifikante Änderungen in der Zusammensetzung. In Ställen mit reiner Ferkelaufzucht liegen niedrigere Gehalte
von IgG und IgM vor, während in kombinierten Zucht- und Mastbetrieben höhere Konzentrationen festzustellen sind. Die IgA-Werte zeigten genau umgekehrte Verhältnisse. Für IgG
wurde auch ein Zusammenhang mit der Betriebsgröße festgestellt. Tiere aus kleineren Beständen haben höhere IgG-Werte als Tiere aus größeren Beständen (INOUE et al. 1980,
INOUE 1981 a, b), was möglicherweise mit der durchschnittlich besseren Hygiene in größeren Betrieben zusammenhängen könnte. Ebenso hat auch die Gesundheit der Sau zum Zeitpunkt des Abferkelns einen erheblichen Einfluss. Eine Erkrankung am MMA-Komplex reduziert die Kolostrummenge und vermindert zusätzlich die Aufnahme durch die Ferkel, so dass
diese die Immunglobuline in erheblichem Maße reduziert erhalten. Ebenso sind physiologische Parameter wie Zeitpunkt (termingerecht) und Dauer der Geburt wichtige Faktoren. Für
die Herkunft der kolostralen Immunglobuline geben CURTIS und BOURNE (1973) für das
gesamte IgG, den überwiegenden Anteil IgM und zu 40 % IgA das Serum an, Hingegen sollen die Immunglobuline der Milch lokaler Herkunft sein.
Die Veränderungen von IgG, IgM und IgA im Blutserum der Sauen wurden von KLOBASA
et al. (1985 b) an 3855 Sauen während eines Reproduktionszyklus untersucht. Aufgrund hoher individueller Schwankungen wurde auch hier postuliert, dass „Normalwerte“ für das
Schwein nicht objektivierbar sind; es wurden aber gleichbleibende und gut reproduzierbare
typische Konzentrationsänderungen im Zyklusverlauf um jeweils vergleichbare Prozentsätze
nachgewiesen. Entsprechend wird die Trächtigkeit und Laktation in vier Phasen eingeteilt.
Phase 1: Bis zur 13. Trächtigkeitswoche findet kaum eine Veränderung statt. Phase 2: Gegen
Ende der Trächtigkeit nehmen die IgG- und IgM-Gehalte im Serum deutlich ab, da die Immunglobuline dieser beiden Klassen ins Gesäuge überführt werden. Der IgA-Gehalt im Serum
steigt. Phase 3: Nach der Geburt erhöht sich der IgG-Gehalt wieder rasch, während IgM weiter absinkt. IgA steigt bis zur dritten Laktationswoche stark an und wird ab der zweiten Laktationswoche zum dominierenden Ig in der Milch. Phase 4: Erst in der dritten Laktationswoche
steigt der IgM-Spiegel wieder an, während hier, zum Laktationsende, der IgA-Wert wieder
abfällt. Begründet wird die nahezu gegenläufige Entwicklung des IgA Wertes damit, dass IgG
und IgM aus dem Blut in das Gesäuge überführt werden, wohingegen IgA direkt im Gesäuge
gebildet wird. (BOURNE 1969).
18
Die Aufnahmefähigkeit und Absorption von Immunglobulinen im Darm des Ferkels ist zeitlich begrenzt. Mehrere Autoren geben diesen Zeitraum mit 24 bis 72 h Stunden p.n. an
(LUSTERMANN u. GÜNTHER 1977, BUSH u. STALEY 1980). Die maximalen Ig-Titer im
Ferkelserum sind bereits 12 h p.n. erreicht (KLOBASA et al. 1990). Zu diesem Zeitpunkt (12
h p.n) wird für IgG ein mittlerer Wert von 40,7 g IgG/l Serum, für IgA 8,3 g/l und IgM 3,4 g/l
angegeben (SCHRÖDER 2001). Wenn das Ferkel 24 h alt ist, gleichen die Serumspiegel denen des Sauenserums. Außer Immunglobulinen und Nährstoffen werden auch Leukozyten
(Makrophagen, neutrophile Granulozyten und Lymphozyten) kolostral übertragen und enteral
resorbiert. Diese werden in den ersten Lebensstunden als Ganzes absorbiert und protektive
Funktionen konnten nachgewiesen werden (BAZER et al. 2001).
Die Fütterung beeinflusst den Schluss der Darmschranke in erheblichem Maße. Gibt man
Ferkeln zunächst nur Wasser, ist noch nach 106 h eine Absorptionsfähigkeit für Immunglobuline nachweisbar (PAYNE u. MARSH 1961). Verabreicht man in den ersten 24 h einen
Milchersatz, so besteht überhaupt keine Aufnahmefähigkeit mehr für Ig (VELLENGA et al.
1988).
Im Ferkel beginnt nach der Geburt die Eigensynthese von Immunglobulinen sobald ein Kontakt mit Antigenen stattgefunden hat. IgM übersteigt nach zwei Wochen, IgA nach drei und
IgG nach fünf Wochen diejenige Menge, die kolostral aufgenommen wurde. (HABE 1974).
Ein wichtiger Aspekt hierbei ist, dass der Gesamtimmunglobulinspiegel im Ferkelserum in
der ca. 3. bis 4. Lebenswoche am niedrigsten ist, was in der Praxis mit dem Zeitpunkt des
Absetzens zusammenfällt (immunologische Lücke).
Es ist davon auszugehen, dass die Aufnahme höherer Ig-Mengen mit einer besseren Entwicklung des Ferkels korreliert. Die überwiegende Anzahl der Autoren konnte nachweisen, dass
insbesondere die hohe Aufnahme von IgG, einhergehend mit einer guten Nährstoffversorgung
durch Kolostrum und Milch, einen besseren Schutz vor Infektionen und besseres Wachstum
gewährleistet. HENDRIX et al. (1978) stellten eine höhere Wachstumsrate und eine geringere
Mortalität nach höherer Antikörperkonzentration fest. SCHRÖDER (2001) konnte diesen
signifikant positiven Einfluss für IgG bis zum 21. Lebenstag und für IgA bis zum 63. Lebenstag nachweisen.
2.2.3 Transfer maternaler Immunglobuline über Kolostrum und Milch
Bei Rindern und Mäusen steuert ein Fcγ-Rezeptor die Aufnahme von IgG. Er befindet sich
auf den jejunalen und duodenalen Enterozyten des Neugeborenen. Er erkennt das FcFragment von IgG und bindet bevorzugt IgG2a und IgG2b, welche intakt durch Transzytose
über die Submukosa in das Blut geschleust werden. Ob es beim Schwein vergleichbare Mechanismen gibt, ist bisher nicht bekannt.
19
Hohe maternal übertragene IgG-Titer wirken depressiv auf die endogene IgG-Synthese des
Neonaten, nach dem Absetzen stoppt dieser Mechanismus aber abrupt (BARINGTON u.
PARISH 2001; VAN DE PERRE, 2003).
Beim Menschen findet sich nur eine geringe Beeinflussung durch den Spiegel der mütterlichen Antikörper. Erstens, weil im geringen Umfang Antikörper bereits diaplazentar übertragen werden und zweitens, weil das menschliche Kolostrum und auch die Milch vor allem IgA
enthält (sowie IgM und IgG). Sekretorisches IgA ist bedeutend für die mukosale Abwehr auf
den intestinalen und respiratorischen Schleimhäuten und mit vielfältigen Funktionen, sowohl
der lokalen Abwehr als auch der Immunitätsbildung, verbunden. Über zwei InduktorEffektor-Achsen, die entero-mammäre und die broncho-mammäre, fördern sie die Ausbildung
einer adaptiven Immunantwort des Säuglings: Untersucht wurde das ausführlich in verschiedenen Infektionsmodellen, z. B. für Rotavirusinfektionen. Antirotavirales IgA ist im Stuhl
gestillter Säuglinge, nicht aber in dem flaschenernährter Babys nachweisbar (HANSON
1998).
2.2.4 Interferenz maternaler Antikörper mit Impfantigenen
Über das Kolostrum transferierte maternale Antikörper können die Immunitätsbildung im
Ferkel, auch nach dessen Impfung, beeinflussen. Dieser Einfluss wird bestimmt durch die
Faktoren Menge und Spezifität der maternalen Immunglobuline, die Aufnahme durch die
Ferkel, den Zeitpunkt einer Impfung und der vermutliche Infektionszeitpunkt.
Der positive oder negative Einfluss maternaler Antikörper beim Schwein ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. Diskutiert wird einerseits die Bildung neutralisierender AntigenAntikörper-Komplexe, was die Ausbildung einer humoralen Immunität unterdrücken könnte.
Bei einer dann nur geringen Immunantwort ist nach späterer Erregerexposition sogar eine
noch schwächere Zweitreaktion möglich, als bei nicht immunisierten Tieren, was eine Erregerausbreitung u.U. noch erleichtern könnte. (SHIBATA et al. 1998; KLINKENBERG et al.
2002; LOEFFEN et al. 2003).
Es ist aber andererseits auch denkbar, dass maternale Antikörper ihrerseits die Bildung gegen
sie gerichteter Antikörper, sog. anti-idiotypischer Antikörper, induziert; diese könnten evtl.
immunstimulierende Wirkung haben.
Es ist wichtig, wie hoch zum Impfzeitpunkt der Ferkel der Titer maternaler Antikörper noch
ist, resp. wie früh eine Impfung durchgeführt wird, aber auch die unterschiedlich lange Persistenz maternaler Antikörper im Ferkelserum, deren Depletion von der jeweiligen Halbwertzeit des Antigens abhängt. Ein allgemein starker Rückgang der meisten maternalen Antikörper setzt ab ca. dem achten bis zehnten Lebenstag ein. Maternale Antikörper gegen M. hyopneumoniae haben z.B. jedoch eine Halbwertszeit von 15,8 Tagen. Ferkel mit einer höheren
Aufnahme maternaler Immunglobuline können noch nach 60 Tagen maternale Antikörper
haben, während bei Ferkeln mit einer vergleichsweise geringeren Aufnahme bereits nach 30
20
Tagen keine maternalen Immunglobuline mehr nachzuweisen sind (ROSS 1999). Antikörper
gegen PRRSV sind bis zu 5 Wochen, gegen APP 10, und gegen Influenzaviren bis zu 16 Wochen im Ferkelserum feststellbar. Gegen das porzine Parvovirus wurden sogar bis zu 6 Monate maternale Antikörper nachgewiesen (KIUPEL et al., 1999; GROSSE BEILAGE 1994). Die
Zeiträume, in denen maternale Antikörper nachweisbar sind werden aber nicht nur vom Abbau der Immunglobuline, sondern auch von den jeweiligen Nachweisverfahren bestimmt
(HOUBEN et al. 1995).
Die Persistenz maternaler Antikörper ist für die Festlegung von Impfzeitpunkten von erheblicher Bedeutung. Einerseits möchte man einen frühestmöglichen Schutz erhalten um die immunologische Lücke um den Absetztermin zu schließen, andererseits vergrößert sich bei das
Risiko der Interferenz von maternalen Antikörpern mit Impfantikörpern, je früher der Impftermin gelegt wird. SCHREIBER (2002) konnte für eine späte Impfung gegen
M.hyopneumoniae im Alter von 4 und 8 Wochen eine verbesserte humorale Immunreaktion
gegenüber früh (1. und 3. Woche) geimpften Ferkeln feststellen. Mit der Kombination einer
Sauenimpfung ante partum und der späten Ferkelimpfung konnte erreicht werden, dass die
Saug- und Absetzferkel während der ersten Lebensmonate durchgehend protektive Antikörper
aufwiesen (SCHREIBER 2002; GROSSE BEILAGE u. SCHREIBER 2005). Für Sauen zugelassene Impfstoffe gegen M. hyopneumoniae stehen derzeit nicht zur Verfügung. HODGINS
et al. (2004) untersuchten unterschiedliche Impfzeitpunkte (2, 3 und 4 Wochen) bei Würfen
von 20 Sauen mit verschiedenen definierten Niveaus maternaler Antikörper und konnten ebenfalls den neutralisierenden Effekt persistierender maternaler Antikörper auf die Impfreaktion nachweisen. Die Bildung von Impfantikörpern in den Ferkeln war demnach umso geringer, je höher die Konzentration maternaler Antikörper zum Impfzeitpunkt war. Ein Einfluss
des Impfzeitpunktes der Ferkel konnte hier nicht nachgewiesen werden. THACKER et al.
(2002) verglichen den Einfluss von Sauenalter und Impfzeitpunkt bei Ferkeln von Sauen mit
und ohne maternale Antikörper, die nach Vakzination einer Belastungsinfektion ausgesetzt
wurden. Sie bestätigten die Korrelation zwischen hohen Konzentrationen maternaler Antikörper - verminderter Immunantwort - erhöhten Lungenschäden und entsprechend reziproken
Ergebnissen bei Tieren mit niedrigen Konzentrationen persistierender Antikörper. Ungeimpfte Kontrolltiere zeigten bei einer Belastungsinfektion mit 14 Wochen eine nicht ausreichende
Immunantwort, die zu einem hohen Grad zu Lungenerkrankungen führte. Ferkel mit hohen
Konzentrationen maternaler Antikörper gegen M. hyopneumoniae bildeten eine schwächere
Immunität gegenüber Tieren mit niedrigen Werten maternaler Antikörper aus, jedoch immer
noch deutlich über den Werten der Kontrolltiere liegend. Die Autoren verweisen hier auf eine
ausreichende Menge des Impfantigens sowie die Rolle des Adjuvans (THACKER et al. 2002)
In der Literatur wird in vergleichenden Untersuchungen die Bedeutung der maternalen Antikörper für die Ferkelimmunität auch im Hinblick auf eine mögliche Verbesserung des Schutzes durch die Immunisierung von Muttersauen ante partum geprüft, mit teilweise widersprüchlichen Resultaten. In den Ergebnissen dieser Versuche mit Ferkeln von immunen und
21
nicht-immunen Sauen wird einerseits die protektive Wirkung der maternalen Antikörper postuliert, in anderen Studien andererseits deren immunitätshemmende Wirkung nachgewiesen
(BOUMA et al. 1997; KLINKENBERG et al. 2002; LOEFFEN et al. 2003). Die Resultate
unterscheiden sich im Hinblick auf die Art des Antigens. Vor allem bei viralen Erregern verursacht die maternale Immunität neben einem möglichen Schutz vor klinischer Erkrankung
offenbar auch Risiken, wie Verlängerung der Virusausscheidung und Viruslatenz (BOUMA
et al. 1997; KLINKENBERG et al. 2002; LOEFFEN et al. 2003, s.u.) Dies führt bei Studien
mit viralen Erregern zu einer überwiegend negativen Bewertung dieses maternalen Einflusses,
während bei bakteriellen Erregern viele Autoren positive Effekte auf die Ferkel durch immune Sauen schildern.
Die protektive Bedeutung maternaler Antikörper bei bakteriellen Erregern wie bei einer Infektion mit Haemophilus parasuis, dem weit verbreiteten Erreger der Glässer’schen Krankheit
konnten so auch SOLANO-AGUILAR et al. (1999) in einem Infektionsversuch mit geimpften
Ferkeln immuner bzw. nicht immuner Sauen nachweisen.
Die am 7. und 21. Lebenstag geimpften Ferkel wurden im Alter von vier Wochen mit H. parasuis infiziert; eine ungeimpfte Kontrollgruppe wurde bereits am 21. Tag infiziert. Im Ergebnis war das Ausmaß der Erkrankung abhängig vom Immunstatus der Sau. Eine Schutzwirkung durch maternale Antikörper wurde nachgewiesen. Ferkel immunisierter Sauen erkrankten nicht, und zwar unabhängig davon ob sie selbst geimpft wurden. Einige geimpfte
Ferkel immunologisch naiver Sauen erkrankten nur leicht, während alle ungeimpften Ferkel
von nicht-immunen Sauen erkrankten. Der höchste Grad einer Protektion wurde auch hier,
übereinstimmend mit den Untersuchungen von SCHREIBER (2002) zur Impfung von Sauen
gegen M. hyopneumoniae, erreicht, wenn sowohl die Sauen als auch später deren Ferkel vor
dem Absetzen geimpft werden. Die mittels Impfung induzierten maternalen Antikörper gegen
H. parasuis erwiesen sich bis zum 28. Tag ante partum. als protektiv, eine negative Interferenz maternaler Ak mit einer frühen Impfung der Ferkel (1. und 3. Lebenswoche) konnten die
Autoren nicht feststellen (SOLANO-AGUILAR et al. 1999).
Studien mit viralen Erregern kommen oft zu konträren Ergebnissen. Einen negativen Einfluss
maternaler Antikörper wiesen LOEFFEN et al. (2003) in einem Infektionsversuch mit Ferkeln
immuner und nicht-immuner Sauen nach. Diese wurden zweimal früh mit Influenza H1N1
infiziert und anschließend wurden sie mit unbehandelten 12 Wochen alten Ferkeln gemeinsam gehalten. Der frühen ersten Infektion mit 7 und 15 Tagen folgte eine zweite, „gemeinsame“ im Alter von 15 Wochen,. Es zeigte sich, dass die Ferkel durch maternale Antikörper
nach früher Infektion zwar gegen eine klinische Erkrankung geschützt waren, aber eine
schwächere Immunität ausbildeten als Ferkel immunologisch naiver Sauen. Die Ferkel immuner Sauen reagierten auf die zweite Infektion weniger deutlich, hatten eine längere Phase
der Virusausscheidung, eine höhere Virusübertragungsrate und eine Wachstumsdepression
über die gesamte Mastdauer. Aufgrund von sehr hohen Seroprävalenzen von Influenza22
Antikörpern in vielen, auch klinisch gesunden Herden, gehen die Autoren von einer Protektion der Ferkel durch maternale Antikörper bei früher Infektion aus, hinterfragen aber kritisch
die Muttertierimpfung gegen Influenza im Hinblick auf eine Verminderung der Immunantwort bei späterer/wiederholter Impfung oder Infektion. Auch eine mögliche Förderung des
antigenic drift, der mutagenen Entstehung neuer Influenza-Serovare, in mAk-positiven Ferkeln ist Gegenstand der Diskussion, da die Virusausscheidung und -replikation in Gegenwart
maternaler Antikörper nicht unterdrückt wird. (BOUMA et al. 1997; LOEFFEN 2003).
Eine ähnliche Beziehung zwischen maternalen Antikörpern und Virusübertragung wurde von
KLINKENBERG et al. (2002) für die Übertragung von KSP bei geimpften Schweinen mit
bzw. ohne maternale Antikörper nach einer experimentellen Infektion festgestellt. Die Überprüfung der Virusübertragung nach früher Impfung (14 Tage) vor dem Hintergrund einer
möglichen Notimpfung schon sehr junger Ferkel im Seuchenfall ergab, dass. Ferkel mit maternalen Antikörpern, analog zu den Resultaten von LOEFFEN et al. (2003), eine verlängerte
Phase der Virusausscheidung und eine höhere Übertragungsrate nach Infektion zeigten. Für
eine Kontrollstrategie schlagen die Autoren daher eine möglichst späte und wiederholte Impfung der Ferkel vor, während die Sauen nicht geimpft werden sollten (diese hätten bei Geburt
persistent infizierter Ferkel dann durch klinische Erkrankung gleichzeitig eine „Signalfunktion“ für die Überwachung). VANDEPUTTE et al. (2000) bestätigten in einem ähnlichen Versuch zwar den negativen Einfluss maternaler Antikörper auf eine frühe Impfung der Ferkel
gegen KSP, sie schlagen aber im Gegensatz zu LOEFFEN et al. (2003) eine Kombination der
Sauenimpfung a.p. mit einer späten Impfung (7.Woche) der Ferkel vor.
Für die Pathogenese von PRRS (Porzines Respiratorisches Reproduktives Syndrom) wird
nicht nur eine passive Interferenz maternaler Antikörper angenommen, sondern sogar eine
Steigerung der Infektion durch höhere Antikörpertiter.
YOON et al. (1997) injizierten einer Gruppe Schweine subneutralisierende, PRRS-spezifische
IgG, einer anderen Gruppe unspezifisches IgG vor der Infektion mit PRRSV. Dabei konnte
nachgewiesen werden, dass die nachfolgende PRRSV-Infektion der Alveolarmarophagen bei
der ersten Gruppe höher war, ebenso die Dauer der Virämie. Dieser Effekt konnte entsprechend auch in vitro nachvollzogen werden. Für die PRRSV-Infektion wird daher eine antikörperabhängige Steigerung der Infektion (ADE = antibody dependent enhancement) postuliert, die eine ähnliche Pathogenese wie die FIP (feline infektiöse Peritonitis) bei Katzen haben soll. (YOON et al., 1997) Die verzögerte Immunitätsbildung bei Schweinen mit maternalen Antikörpern konnten auch SHIBATA et al. (1998) anhand der PRRS-Infektion von SPFFerkeln mit bzw. ohne maternale Antikörper nachweisen. Weiterhin scheinen in der Immunreaktion auf das PRRSV anti-idiotypische Antikörper eine herausragende Bedeutung zu haben
Es wird von vielen Autoren einschränkend angemerkt, dass für vergleichende Versuche meistens SPF-Ferkel Verwendung finden. Es stellt sich bei Interpretation der Ergebnisse die Frage
23
der Übertragbarkeit auf die tatsächlichen Verhältnisse bei konventionell gehaltenen Schweinen. Im Falle des Schutzes vor der Aujeszkyschen Krankheit (AK) kann retrospektiv aufgrund der staatlichen Bekämpfungsmaßnahmen jedoch eine viel bessere Bewertung des Impferfolgs vorgenommen werden, da hier nicht nur Ergebnisse von wenigen SPF-Tieren, wie z.b.
von BOUMA et al. (1997, s ob.), der zu vergleichbaren Ergebnissen wie den genannten kam,
sondern aus repräsentativen Feldstudien vorliegen.. Durch die Verwendung eines g1deletierten Impfstoffes in der staatlichen Bekämpfung war es möglich, einen Unterschied zwischen Impftitern und Infektionsantikörpern festzustellen. GROSSE BEILAGE et al. (1994)
führten anhand serologischer Befunde von 3218 nordwestdeutschen Schlachtschweinen den
Nachweis, dass die latente Infektion mit dem Virus der AK durch flächendeckende Impfungen zurückgedrängt werden konnte. Die negative Interferenz maternaler Antikörper mit der
Impfung konnte hier zwar auch festgestellt werden, denn Schweine, die zu Mastbeginn keine
maternalen Ak (mAk) aufwiesen zeigten eine deutlich bessere Immunreaktion nach Impfung
als mAk-positive Schweine. Dennoch war diese Beeinflussung nicht in der Lage, den Aufbau
einer Populationsimmunität soweit zu behindern, dass die Eradikation grundsätzlich in Frage
gestellt wurde.
2.3 Immunisierung von Schweinen
2.3.1 Schutzimpfung von Sauen
Die Schutzimpfungen tragender Sauen stellen eine wichtige Säule in der Weitergabe einer
gesunden Bestandsimmunität an die Ferkel dar. Übliche Impfungen richten sich jeweils gegen
spezifische, meist verbreitete Erreger von typischen Aufzuchtkrankheiten, gegen welche die
Ferkel eine belastbare Immunität in den ersten Lebenswochen erhalten sollen. Vakzinen für
tragende Sauen stehen gegen Erreger von Atemwegserkrankungen (z.B. Pasteurella ssp, Bordetella bronchiseptica u.a.) als auch von Durchfallerkrankungen (E.coli, Clostridien) zur Verfügung. Hierbei wird die Grundimmunisierung in der Regel zweimal, in der 5. und 2. Woche
vor dem Abferkeltermin, die Boosterung dann jeweils zwei Wochen vor weiteren Abferkelterminen fortlaufend durchgeführt. Die Impfungen induzieren einen Anstieg der jeweiligen
spezifischen Serumantikörper, die dann in das Kolostrum überführt werden und dem Ferkel
zur Verfügung stehen (ISAACSON 1994).
2.3.2 Schutzimpfung von Ferkeln
Die Impfung von Ferkeln während der Säugeperiode stellt aufgrund der Dominanz passiv
erworbener maternaler Antikörper eine besondere Schwierigkeit dar. In der Praxis hat vor
allem die Impfung gegen Mycoplasma (M.) hyopneumoniae Bedeutung, die inzwischen nahe24
zu immunprophylaktischer Standard ist. Eine Infektion mit M. hyopneumoniae, dem Verursacher der Enzootischen Pneumonie, gilt der späteren Infektion mit Sekundärerregern von Atemwegserkrankungen als Wegbereiter, da durch die Schädigung des Flimmerepithels die
Erregerabwehr auf der Schleimhautoberfläche des Respirationstraktes vermindert wird. Die
Gewichtszunahmen und Lungengesundheit sind bei geimpften Ferkeln signifikant höher als
bei ungeimpften Ferkeln. Zur Verfügung stehen Vakzinen für eine zweimalige Impfung der
Ferkel („Two-shot“), die praxisüblich in der 1. und 3. Lebenswoche Anwendung finden, als
auch „One-shot“ – Vakzinen für eine einmalige Applikation ab der ersten oder dritten Lebenswoche. Letztere unterscheidet sich v.a. durch ein anderes Adjuvans, i.d.R. auf O/W (Ölin-Wasser) oder Mineralölbasis, was eine protrahierte Gegenwart des Antigens bewirken soll
(MARTINON et al.1998).
Eine bedeutende Infektion im Saugferkelalter ist die mit dem porzinen Circovirus-Typ 2, die
das Postweaning Multisystemic Wasting Syndrom (PMWS) auslöst, welches mit Kümmern,
Dyspnoe, Schwellung der Lymphknoten, Blässe, Ikterus und Durchfall einhergehen kann. Die
Schweine infizieren sich als Saugferkel und erkranken nach dem Absetzen, meist im Alter
von 4-14 Wochen. Aufgrund der Interferenz mit maternalen Antikörpern ist eine Impfung in
diesem Alter derzeit nicht möglich. Die Entwicklung neuer Impfstofftypen wie DNAVakzinen könnte hier von praktischer Bedeutung sein (KAMSTRUP et al. 2004).
2.3.3 Adjuvantien
In Vakzinen für Schweine üblicherweise eingesetzte Adjuvantien sind Aluminiumhydroxid
(AlOH), Tocopherol (Vit.A), Levamisol, Carbopol und verschiedene Öle.bzw. Öl-in-WasserEmulsionen. Bei den Einmal-Vakzinen werden zwei neuartige Adjuvantien angewendet. In
zwei zugelassenen „One-Shot“-Vakzinen gegen M.hyopneumoniae wird zum einen eine spezielle Wasser-in-Öl-Emulsion, die über hundert Stunden stabil bleiben und eine lange Antigenpräsentation ermöglichen soll, eingesetzt. Zum anderen kommt ein mizellenförmiges Molekül zum Einsatz, bei dem sowohl im wässrigen äußeren Anteil Antigen als auch später in
der durch eine Lecithinschicht davon getrennten inneren öligen Phase Antigen freigesetzt
wird.
2.3.4 Die Bedeutung anti-idiotypischer Antikörper
Passiv transferierte Antikörper können immunsuppressiv wirken, sogar, wenn sie einige Zeit
nach dem Antigen verabreicht werden (UHR und MÖLLER, 1968). Die immunregulatorische
Funktion von Antigen-Antikörper-Komplexen wird nicht nur durch die Antigenbindungsstellen des Ig-Moleküls, sondern auch durch sein Fc-Fragment bedingt. KÖLSCH et al. (1980)
wiesen nach, dass Immunkomplexe in der B-Zelle über Fc-Rezeptoren ein negatives Signal
induzieren können. Passiv transferierte Antikörper binden an Determinanten des Antigens.
25
Der Fc-Teil dieser Antikörper interagiert nun mit dem Fc-Rezeptor auf der B-Zelle, was zur
Induktion eines Negativsignals führt. Dabei zeigen die verschiedenen IgG-Isotypen Unterschiede in ihrem Suppressionsvermögen (VOISIN, 1980; VUAGNANT et al. 1973, s.u.). In
vivo spielt sowohl eine Fc-abhängige als auch eine -unabhängige Suppression eine Rolle, letztere jedoch nur mit hohen Antikörperdosen (HOFFMANN u. BILKEI 1980). Studien unter
Verwendung von Hapten-Carrier-Konjugaten zeigten, dass anti-Carrier-Antikörper die Antwort auf das Hapten unterdrücken können, wie auch umgekehrt anti-Hapten-Antikörper die
anti-Carrier-Antwort supprimieren können (BRÜGGEMANN und RAJEWSKY, 1982). In
Studien mit zwei Haptenen auf einem Carrier zeigte sich eine determinantenspezifische Suppression (PEARLMAN, 1967).
Überlegungen von VUAGNAT et al. (1973) zur Bildung von Immunkomplexen diskutieren
einen peripheren und/oder zentralen Effekt. 1. Peripherer Effekt: Der an das Antigen bindende
Antikörper führt zur ‚Maskierung’ von Determinanten und/oder zur Antigenbeseitigung. Der
Wettbewerb zwischen Zellen und Antikörpern selektiert stark avide Zellen. 2., Zentraler Effekt: Die Antikörper oder Antigen-Antikörper-Komplexe induzieren eine verringerte Aktivität
kompetenter Zellen. Die Inaktivierung geschieht durch den Fc-tragenden Teil des Immunkomlexes. Bei einem Versuch mit Meerschweinchen untersuchten VUAGNAT et al. (1973)
den Einfluss passiv verabreichter IgG1 und IgG2 anti-Haptenantikörper auf deren aktive Bildung. Hierzu immunisierten sie Gruppen von Meerschweinchen vier Mal mit IgG1-DNP
und/oder mit IgG2-DNP-Komplexen sowie eine Gruppe mit Fab`-Fragmenten von antiDNPAntikörpern.
Bei der folgenden Immunreaktion hemmten passive IgG2, IgG1 und Fab`-Fragmente streng
die aktive IgG2-Antwort auf DNP. Die aktive IgG1-Antwort wurde zunächst in gleichem
Maße von passiven IgG2 und Fab`Fragmenten gehemmt, nach der Boosterung erfolgte aber
eine normale Immunreaktion. Auf der anderen Seite führten passiv verabreichte IgG1Antikörper zu einer verzögerten Steigerung der aktiven IgG1-Antwort. Die Autoren erwähnen
auch die Notwendigkeit der häufigen (4x) Boosterung, da sich in Vorversuchen eine zweimalige Immunisierung als ungenügend erwiesen hat.
Die Beobachtung, dass passive Antikörper immunsupprimierend wirken, wenn sie nach dem
Antigen verabreicht werden, führte zuvor schon zu der Annahme, dass auch aktiv gebildete
Antikörper einen solchen Effekt während der normalen Immunantwort haben könnten
(BYSTRYN et al., 1970).
Als Idiotypen werden die antigenen Eigenschaften der antigenen Determinanten (Epitope,
Bindungsstellen) auf variablen Regionen der leichten und schweren Ketten eines Antikörpers.
bezeichnet. Sie bestehen aus 15 bis 20 Aminosäuren. Jedes Individuum hat eine große Anzahl
individuell verschiedener Idiotypen.
26
Die Idiotypen auf den Antikörpern können wiederum zur Bildung von gegen diese (bestimmten Sequenzvarianten) gerichteten Antikörper führen, sog. anti-idiotypischer Antikörper.
Auch diese sich neu gebildeten Antikörper besitzen wieder charakteristische Idiotypen, welche die Bildung von anti-anti-idiotypischen Antikörper provozieren können. Der Körper hat
aber regulierende Mechanismen, um diese sich theoretisch fortsetzende Kaskade zu kontrollieren. So unterdrückt jede anti-idiotypische Antwort die vorherige Antikörperantwort, so dass
netto die gesamte Antikörperantwort begrenzt wird. Unter bestimmten Umständen können
anti-idiotypische Antikörper auch die Antikörperantwort stimulieren.
Anti-idiotypische Antikörper haben eine erhebliche Bedeutung für die Entstehung von Autoimmunerkrankungen, sie regulieren aber auch physiologische Vorgänge. Im Serum sind viele
verschiedene anti-idiotypische Antikörper gegen Immunglobuline nachweisbar. Z.B. wird die
Elimination gealterter Zellen aus dem Blut darüber gesteuert. Hierbei wird auf gealterten Zellen ein Protein abgespalten, was von IgG-Autoantikörpern als „neues“ Epitop erkannt und
markiert wird. Diese Markierung löst den phagozytotischen Abbau durch Makrophagen in der
Milz aus (TIZARD 2000). Anti-idiotypische Antikörper können sich auch gegen „neue“ Epitope richten, die erst durch die Bindung eines Ig’s an ein Protein entstanden sind. Ein Beispiel
sind Rheumafaktoren die aus Autoantikörpern gegen in Immunkomplexen gebundenen Antikörpern bestehen, welche ihre Fc-Region durch die stabilisierte Bindung als ‚neues’ Epitop
exponieren.
JERNE (1974) führte grundlegende Arbeiten zu den anti-idiotypischen Antikörpern durch.
Nach seiner idiotypischen Netzwerktheorie fungieren die individuell produzierten antiidiotypischen Antikörper, um die spezifische Immunantwort gegen das originale Antigen zu
modulieren.
Zwei experimentelle Studien mit Mäusen zeigen, dass anti-idiotypische Antikörper in der
Milch, die gegen E.coli und das respiratorische Synzytial-Virus (RSV) gerichtet sind, das Immunsystem der Nachkommen gegen diese Antigene wirksam stimulieren können (HANSON,
1998). In menschlichem Serum von Schwangeren, sowie in deren Kolostrum und Milch wurden anti-idiotypische Antikörper gegen das Poliovirus gefunden. Dabei ist auch ein diaplazentarer Transport dieser anti-idiotypischen Antikörper in den Fetus und eine Induktion der fetalen Immunreaktion nachgewiesen worden. es konnte jedoch keine Stimulierung einer effektiven Immunantwort bei den Nachkommen nachgewiesen werden (HAHN-ZORIC et al.,
1993).
27
2.3.5 Idiotypvakzinen
Das Prinzip der Idiotypvakzinierung wird in der Humanmedizin bei der Behandlung von BZell Lymphomen seit etwa Anfang der 1980er Jahre verfolgt. Da Lymphomzellen klonalen
Ursprungs sind, besitzen alle Lymphomzellen im Gegensatz zu normalen B-Zellen denselben
Antikörper-Idiotyp. Dieser ist daher ein ideales Zielmolekül für immuntherapeutische Behandlungsansätze (RÖHNISCH et al., 2002). Werden Patienten damit immunisiert, bilden
etwa die Hälfte anti-idiotypische Antikörper. Diese Patienten weisen eine deutlich erhöhte
Lebenserwartung und eine geringere Rezidivrate auf (DERMIME et al., 2004).
In jüngerer Zeit werden auch beim Schwein Untersuchungen zur Bedeutung der antiidiotypischen Antikörper durchgeführt. In der komplexen Immunreaktion eines Schweins auf
eine Infektion mit dem PRRS-Virus wird den anti-idiotypischen Antikörpern erhebliche Bedeutung zugeschrieben, die in der Erkennung aber auch für den Schutz vor dieser Krankheit
Möglichkeiten eröffnet. JIANG et al. (2003) gelang die Identifizierung und Charakterisierung
von anti-idiotypischen Antikörpern, die gegen einen monoklonalen anti-PRRS-Antikörper
gerichtet sind. Als primäres Ziel fungiert in der Immunantwort ein bestimmtes Protein der
Virushülle, das Glykoprotein (GP)-5, so dass die Immunantwort zunächst aus Anti-GP5Antikörpern besteht. JIANG et al. (2003) konnten in 10 von 12 Schweinen nach experimenteller PRRS-Infektion anti-idiotypischer Antikörper spezifisch gegen GP-5-Antikörper zu
verschieden Zeitpunkten nach der Infektion nachweisen und konnten so die Bedeutung der
anti-idiotypischen Antikörper in der Immunreaktion gegen PRRSV belegen.
ZHOU et al. (2004) gelang es, diese anti-idiotypischen Antikörper (gegen anti-GP-5Antikörper gerichtet) monoklonal in Mäusen zu produzieren. Sie stellten fünf Klone her, um
Schweine zu inokulieren. Davon applizierten sie 5 mg intranasal bzw. 50 mg intraperitoneal
und infizierten die Schweine 24 h später mit PRRSV. Serumproben wurden entnommen und
die Schweine nach 30 Tagen euthanasiert. Es zeigte sich, dass die anti-idiotypischen Antikörper mit monoklonalen und polyklonalen anti-PRRSV-Antikörpern reagierten und die Bindung
dieser Antikörper an das Virus inhibiert wurde. Ein Klon dieser fünf monoklonalen antiidiotypischen Antikörper bindet direkt an MARC-145-Zellen. Durch Reaktion mit löslichen
Proteinen dieser Zellen wurde so die Virusinfektion blockiert. Im Ergebnis waren die mit diesem Klon inokulierten Tiere 14 Tage (bei intranasaler Route) bzw. 21 Tage (bei intraperitonealer Route) serologisch negativ. In der immunhistologischen Untersuchung waren sie ebenfalls negativ in allen untersuchten Geweben (Lunge, Tonsillen, tracheobronchiale Lymphknoten).
Die Autoren sehen in dieser Neutralisierung der PRRS-Virusinfektion eine Möglichkeit,
durch eine Idiotypvakzine das Infektionsgeschehen von PRRS zu kontrollieren. An der Neuentwicklung von Impfstoffen gegen das PRRSV besteht besonderes Interesse, da sich die Infektion mit den derzeit verfügbaren Impfstoffen nur unzureichend verhindern lässt.
28
Fraglich bleibt dabei die Terminierung des Impfzeitpunktes. Eine Vakzinierung mit Antiidiotyp-Vakzinen müsste demnach nahe vor der mutmaßlichen Infektion stattfinden, um einen
protektiven Effekt zu induzieren. Weitere Möglichkeiten zur effektiven Immunisierung von
Schweinen in Anwesenheit maternaler Antikörper werden untersucht.
Studien bei Mäusen (SIEGRIST et al. 1998) und Rindern (BRAR et al.; 1978; ELLISet al.
1996) haben gezeigt, dass maternale Antikörper zwar die serologische Antwort hemmen,
nicht aber die T-Zell-Antwort. Das erlaubt den Schluss, dass eine Gedächtnisantwort auch in
Gegenwart hoher maternaler Antikörper induziert werden kann.
Zur Überwindung der Interferenz mit maternalen Antikörpern und zum Erreichen eines frühestmöglichen Krankheitsschutzes durch eine frühe Impfung werden seit den 90er Jahren
Versuche mit Plasmid DNA-Vakzinen, auch als genetische Immunisation bezeichnet, durchgeführt. Dabei wird ein spezifisches Immunogen kodierendes Plasmid in den Wirt intramuskulär oder intradermal injiziert. Die Immunogene werden dann, durch einen Promoter verstärkt, de novo innerhalb DNA-transferierender Zellen synthetisiert, damit das Antigen sowohl von MHC-Klasse-I- als auch von MHC-Klasse-II-Molekülen präsentiert werden kann.
Der Vorgang stimuliert sowohl die humorale als auch die zelluläre Immunantwort. (TANG et
al. 1992, YANKAUCKA et al.1993). Gegen die Aujeszkysche Krankheit wurden mehrere
derartige Studien, allerdings ohne bedeutende Immunisierungserfolge, durchgeführt
(MONTEIL et al. 1996, 1997, SOMASUNDARAM et al.1999).
FISCHER et al. (2003) setzten dagegen eine DNA-Vakzine erfolgreich gegen AK ein, die
ein- oder zweimal Ferkeln verschiedenen Alters appliziert wurde. Diese hatten sehr hohe Titer
maternaler Antikörper. Hierzu wurden 8 Wochen alte Ferkel entweder einmal oder ein zweites Mal (mit 11 Wochen) geimpft; in einem weiteren Versuch wurden erst 5 Tage alte Ferkel
einmalig geimpft. Der Erfolg wurde nach einer experimentellen AK-Infektion bei Mastende,
mit 5 Monaten, bewertet. Es zeigte sich, dass bereits eine einzige Impfung im Alter von 8
Wochen ausreichte, eine belastbare Immunität zu induzieren. Diese konnte auch durch eine
Boosterung mit 11 Wochen nicht weiter verstärkt werden. Weiterhin wurden sogar neugeborene Ferkel einmalig erfolgreich geimpft. In diesem Falle konnten die Ferkel aber nur serokonvertieren, wenn der ELISA-Titer der maternalen Antikörper nicht über 5,510log lag, was
eine gewisse Einschränkung darstellt, da zu diesem Zeitpunkt unter Feldbedingungen noch
von sehr hohen Titern maternaler Antikörper auszugehen ist. Mit der Impfung konnte zwar
eine klinische Erkrankung, nicht aber die postexpositionelle Virusausscheidung verhindert
werden (MONTEIL et al. 2000).
Zum Schutz vor Diarrhoe bei Absatzferkeln durch E.-coli-Infektionen prüften VERFAILLE
et al. (2004) eine DNA-Vakzine bei 6 Wochen alten Ferkeln, die drei Mal über zwei verschiedene Inokulationsrouten immunisiert wurden. Die Vakzine mit einem F4-Fimbrienantigen
wurde intramuskulär oder intradermal appliziert. Letztere führte zu einer überwiegenden TZell-Antwort, während nach intramuskulärer Injektion, eine humorale Antwort induziert werden konnte. Insgesamt ließ sich jedoch keine ausreichend protektive Immunantwort induzie29
ren. Nach Versuchen mit einer Kombination mit konventionellen Vakzinen schlagen die Autoren zur Überwindung der kritischen Phase um den Absetztermin eine kombinierte Impfung
aus einem Priming mit einer DNA-Vakzine vor dem Absetzen und einer Boosterung mit einer
konventionellen Proteinvakzine vor.
2.4 Experimentelle Immunisierung mit Hapten-CarrierKonjugaten
Hapten-Protein-Konjugate werden seit langem für Untersuchungen der adaptiven Immunantwort und der Antigen-Antikörper (Ag-Ak-) Interaktion genutzt.
Moleküle, die zur Bindung von Antikörpern führen aber keine Immunantwort auslösen, definierte LANDSTEINER (1921) als Haptene. Erst nach Bindung an ein Trägerprotein kann eine
Immunantwort gegen das Hapten induziert werden. Als Haptene eignen sich niedermolekulare Substanzen wie Arsanilinsäure, aliphatische Säuren, kleine Aminosäuren oder DNP (2,4
Dinitrophenyl), die kovalent oder über Salzbrücken mit dem Carrier verbunden sind.
LANDSTEINER und SIMMS (1923) vertieften die Experimente und stellten fest, dass nach
einer Immunisierung mit einem Hapten-Carrier-Konjugat drei Arten von Antikörpern gebildet
werden. 1) Antikörper gegen das Hapten, 2) Antikörper gegen den Carrier, 3) Antikörper gegen das Konjugat. Die Bindung der anti-Haptenantikörper war dabei viel spezifischer und
fester, als die der anti-Carrierantikörper. Die Bedeutung des Carriers wurde folgendermaßen
bewertet: 1.: Der Carrier ist notwendig für eine anti-Haptenantwort, in dem er T-Helferzellen
aktiviert. 2.: Die Konzentration produzierter Antikörper hängt von der Immunogenität des
Carriers ab. Konjugiert man das Hapten mit einem Tier-eigenen Protein fällt die antiHaptenantwort geringer aus, als nach Konjugation mit einem fremdem Protein
(LANDSTEINER 1945).
In der Folge wurden in der experimentellen Immunologie häufig Versuche mit HaptenCarrierkonjugaten durchgeführt, da die so erzeugten Antikörper sehr spezifisch sind und sich
so ein besseres Verständnis für die beteiligten Mechanismen der Immunitätsinduktion bildete.
Die heute verwendeten Hapten-Protein-Konjugate werden charakterisiert durch die durchschnittliche Anzahl von Haptenen pro Carriermolekül (Haptenvalenz).
Für eine erfolgreiche Signalübertragung nach Erkennung durch Hapten-spezifische B-Zellen
ist ein unteres Limit von 2-10 % kreuzvernetzter Oberflächen-Immunglobuline nötig. Große
Carrier-Moleküle haben ein höheres Vermögen zur Quervernetzung von Membranrezeptoren.
Um den Einfluss der Haptenwertigkeit und Epitopdichte zu überprüfen, setzten WOODARD
et al. (1995) zwei Modellantigene ein. Ein DNP- (Dinitrophenyl)-polymerisiertes Flagellin ,
DNP-pol sowie konjugiertes Dextran, DNP-dex. Diese wurden mit TRITC (Tetramethyl30
Rhodamin-Isothiocyanat) konjugiert zu TRITC-DNP-pol und TRITC-DNP-dex. Die Moleküle
unterscheiden sich in ihrer Größe und Struktur. Ein flexibleres, längeres TRITC-DNP-dex
gegenüber einem starrem, kürzeren und leichteren TRITC-DNP-pol. Die Autoren konnten
zeigen, dass die Fähigkeit eines Hapten-Carrierkonjugats eine produktive Immunantwort auszulösen oder Toleranz dagegen zu induzieren sehr stark von der Epitopdichte und der Flexibilität des Hapten-Carrierkomplexes abhängt.
2.4.1 Verwendung von NP und FITC als Haptene
FITC (Fluoreszeinisothiocyanat) und NP (4-hydroxy-3-Nitrophenylsäure) stellen geeignete
Haptenmoleküle für die Konjugation mit Carriermolekülen dar.
Das die Immunantwort auf FITC von der Immunogenität des Carriers abhängt, wiesen
SIVOLAPENKO et al (1996) in einem Versuch mit zwei Gruppen a fünf Kaninchen nach. Sie
konjugierten FITC an einen hochaffinen monoklonalen Antikörper (MR6), der spezifisch gegen ein IL4-assoziertes Rezeptormolekül (gp200-MR6) gerichtet ist. Gleichzeitig wurden
zwei verschiedene FITC-gekoppelte IgG1-Antikörper als Kontrolle verwendet. Eine erste
Injektion der FITC-gekoppelten Kontrollantikörper führte nicht zu einer Immunantwort. Nach
dem zweiten Challenge reagierten zwei Tiere mit einer schwachen anti-FITC-Antwort. Im
Falle des FITC gekoppelten hochaffinen MR6-Antikörpers reagierten jedoch vier Tiere bereits nach erster Injektion, und nach der Boosterung bildeten alle Tiere hohe anti-FITCAntikörper.
Andererseits fiel die Immunantwort auf den FITC-konjugierten Antikörper MR6 um 30 %
niedriger gegenüber unkonjugiertem MR6 aus. Dieses Ergebnis ließ sich auch mit den anderen Kontrollantikörpern reproduzieren. Die Autoren erklären dies mit einer teilweisen ‚Maskierung’ bestimmter Epitope auf dem Ig-Molekül durch FITC, wodurch diese für Oberflächenrezeptoren auf B-Zellen nicht mehr zugänglich sind. Zusätzlich erniedrigt die FITCKopplung möglicherweise die Affinität von MR6 für sein Zielantigen.
Interessanterweise konnte andererseits die Immunantwort in Kaninchen auf ein unabhängiges,
nichtkonjugiertes Kontrollantigen (humanes Hb) durch MR6 gesteigert werden. Die sekundäre Immunantwort auf humanes Hb war generell höher, wenn es gleichzeitig mit MR6 injiziert
wurde, als nach Ko-Injektion mit den beiden IgG1-Kontrollantikörpern. Eine mögliche Erklärung hierfür sehen die Autoren darin, dass dieses spezielle ‚zielen’ auf MR6 und FITC-MR6 antigenpräsentierende Zellen (APC, z.B. MR6-positive B-Zellen und Makrophagen) die antiFITC und anti-MR6-Antwort steigern könnte. Aufgrund dieser immunpotenzierenden Wirkung des MR6-Antikörpers wird seine klinische Verwendung als in vivo - Adjuvans diskutiert.
Um die determinantenspezifische antikörpervermittelte Unterdrückung der Immunantwort zu
demonstrieren, verwendete MÖLLER (1985) FITC-konjugierte Schaferythrozyten als Antigen zur Immunisierung von Inzuchtmäusen. Sowohl gegen FITC als auch gegen die Schafe31
rythrozyten gebildete Antikörper wurden in einem weiteren Versuch 1-3 h nach Immunisierung mit dem o.g. Antigen verabreicht. Die Messung wurde mit einem hämolytischen Plaquetest mit Plaque-forming cells (PLC) durchgeführt. Es kam zu einer Suppression der Immunantwort auf die korrespondierende Determinante, aber zu einer Steigerung der antiHaptenantwort nach Applikation von anti-Carrier-Antikörpern.
Molekulare Untersuchungen von NP als Hapten, an den Carrier BSA oder HEL (Hühnereiweisslysozym) konjugiert, führten ODA et al. (2004) durch. Sie wiesen nach, dass die apparente Bindungsavidität durch die Valenz und Dichte des Haptens sowie der Größe des Carriermoleküls bedingt wird. Sie überprüften den Einfluss verschiedener Haptenwertigkeiten
und Konzentrationen auf die Affinität und Avidität der Ag-Ak-Interaktion und beobachteten
mit durchschnittlich 17,8 NP-Moleküle pro BSA das stärkste Komplexbildungsverhalten.
Es existieren nur wenige Studien, welche die experimentell Immunisierung von Schweinen
mit Hapten-Carrier-Konjugaten zum Gegenstand haben. KRÄUSSLICH et al. (1983) immunisierten im Rahmen eines züchterischen Selektionsexperimentes über vier Generationen Ferkel mit 60 mg DNP-BSA (mit Adjuvans), nach 14 Tagen noch einmal mit 100 mg DNP-BSA
(ohne Adjuvans) und konnten eine ansteigende Fähigkeit der Antikörperbildung nachweisen.
Das belegt, dass eine züchterische Selektion auf das Antikörperbildungsvermögen möglich
ist.
Bei ihren immunologischen Experimenten erwähnen KRÄUSSLICH et al. (1983) die spezifischen Probleme der Spezies Schwein. Schweine sind im Allgemeinen schlechte Antikörperbildner und tolerieren z.T. erstaunliche Mengen Fremdantigen ohne nachweisbare Antikörperantwort. Andererseits sind Überempfindlichkeitsreaktionen nicht selten. Im Experiment
von KRÄUSSLICH et al. (1983) starben vier Schweine 10-12 Stunden nach Zweitinjektion
von DNP-BSA. Bei der Sektion fand sich eine Nierenrindennekrose, die zur Urämie führte.
Die im Serum gemessenen Antikörpertiter korrelieren dabei nicht mit dem Grad der Krankheitssymptome, die bei solchen Schweinen auftreten.
2.5 ELISA (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay)
Bei Untersuchungen zur Antikörperbildung und zur Isotyp-spezifischen Differenzierung einer
humoralen Immunantwort wird heute wegen seiner Vorzüge fast ausschließlich der ELISA
(Enzymimmunoassay) angewandt.
Der ELISA ist eine quantitative analytische Methode, bei der ein Reaktionspartner enzymatisch markiert ist. Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte werden mit dem zum ermittelnden
Antikörper korrespondierenden Antigen beschichtet. Antikörper in der Probe (Serum, Kolostrum u.a.) binden dann an das Antigen. Im nächsten Reaktionsschritt bindet ein enzymmarkierter Sekundärantikörper (z.B. Ziege-anti-Schwein) an die gesuchten Antikörper. Durch
32
das Enzym wird in der folgenden Farbreaktion Substrat umgewandelt. Anhand eines auf jeder
Platte mitlaufenden Standards kann dann, nach Erstellung einer Eichkurve, die Farbreaktion
mit der Antikörperkonzentration korreliert werden.
Seit der Verfügbarkeit Isotyp-spezifischer Antikörper (Maus-anti-Schwein, nach VAN
ZAANE und HULST 1987) für porzine IgG’s wird in Versuchen mit porzinen Isotypen überwiegend der ELISA verwendet. Hinsichtlich Spezifität, Sensibilität und Reproduzierbarkeit
erwies sich der ELISA anderen Verfahren gegenüber (Virusneutralisationstest, Immunfluoreszenztest, Hämagglutinationshemmungstest u.a.) als überlegen, da weniger unspezifische
Bindungen und meist höhere Titer ermittelt werden können, als mit anderen Verfahren
(KIMMAN et al. 1992; FURESZ et al. 1998, u.a.). Vergleichende Untersuchungen des
ELISA mit dem Hämagglutinationshemmungstest ergaben im Serum von Ferkeln mit residualen maternalen Antikörpern viel höhere ELISA-Titer an spezifischen Antikörpern gegen das
Influenzavirus (LOEFFEN et al. 2003). Begründet wird dies mit der Hemmung der IgGAntwort durch maternale Antikörper, die auf Hämagglutinine, nicht aber auf Virusproteine
wirken. Demnach neutralisieren die maternalen Antikörper die in die Virusmembran eingebetteten gut zugänglichen Hämagglutinine, bevor sie dem Immunsystem präsentiert werden. Der
Respons auf Virusprotein ist dagegen nicht inhibiert, da die Antikörper wenig Zugang zu
dem, durch eine virale Lipidmembran oder eine Wirtszelle geschütztes Protein haben
(LOEFFEN et al. 2003; PERTMER et al. 2000).
Für den nachweis porziner IgG-Isotypen stehen Antikörper gegen IgG1 und IgG2 zur Verfügung. Als Variante des ELISA verwenden viele Autoren, so KIMMAN et al. (1992) in ihren
Untersuchungen zur isotypspezifischen Antwort auf PHV-1 den Capture- oder indirektenSandwich-ELISA (IDAS), bei dem das Coating der Platten mit antigenspezifischen Antikörpern erfolgt. Auch SERRANO et al. (2001) und andere erwähnen die Vorteile des SandwichELISA, da der Anteil von unspezifisch gebundenem IgG1 oder IgG2 besonders niedrig sein
soll.
33
3 Material und Methoden
3.1 Versuchstiere und Versuchsbetriebe
Die Versuche wurden in einem Mastbetrieb und einem Zuchtbetrieb im Landkreis Uelzen
durchgeführt.
Mastschweine
Für die Immunisierung von Mastschweinen wurde ein Mastbetrieb mit ca. 500 Mastplätzen
ausgewählt. Die zwei Stallabteile mit Teilspaltenböden werden im Rein-Raus-Verfahren belegt, nach einem Mastdurchlauf erfolgt die Neubelegung nach Reinigung und Desinfektion.
Die Mastläufer aus einem Herkunftsbetrieb werden mit 25-30 kg Lebendgewicht, also ca. im
Alter von zehn Wochen, eingestallt, es werden etwa 10 Tieren je Bucht gehalten. Die Fütterung erfolgt automatisch, die Ration enthält z.T. wirtschaftseigenes Futtergetreide. Immunprophylaktische Maßnahmen werden im Bestand nicht durchgeführt, die Ferkel sind im Herkunftsbetrieb praxisüblich in der ersten und dritten Lebenswoche gegen M. hyopneumoniae
geimpft worden.
Auswahl der Versuchstiere
Die 63 für den Vorversuch verwendeten Tiere waren gesunde Mastläufer von ca. 30 kg Lebendgewicht beiderlei Geschlechts, die ca. seit zehn Tagen in dem Bestand aufgestallt waren.
Unter zehn bis zwölf Tieren einer Bucht erfolgte die Auswahl von jeweils sieben Versuchstieren per Zufall.
Tragende Sauen und Ferkel
Der Ferkelerzeugerbetrieb für den Hauptversuch verfügt über eine Herde von ca. 290 Sauen
(BHZP-Genetik). Es befinden sich fünf Abferkelabteile, ein geteiltes Deckzentrum, ein Bereich für niedertragende Sauen und vier Flatdeck-Abteile in einem Gebäudekomplex des Betriebes, sowie ein weiterer Gebäudeteil für hochtragende Sauen und ein separater Quarantänestall für Jungsauen. Die Sauen werden überwiegend künstlich besamt, zusätzlich sind zwei
Deckeber vorhanden. Die Abferkelungen erfolgen im 14-Tage-Rhythmus. Die Abferkelboxen
haben Kunststoff-Spaltenböden und verfügen über offene Ferkelnester mit einer Heizplatte.
Im Alter von drei Wochen werden die Ferkel abgesetzt. Die Flatdeck-Abteile werden ebenfalls im Rein-Raus-Verfahren belegt, die Fütterung erfolgt automatisch. Mit etwa zehn Wochen wird ein kleinerer Teil der Nachkommen in einen betriebseigenen Maststall (800 Mastplätze) verbracht, der größere Teil wird verkauft. Als immunprophylaktische Maßnahme wird
34
im Sauenbestand eine praxisübliche Bestandsimpfungen gegen Parvovirose dreimal jährlich
durchgeführt. Die tragenden Sauen werden ante partum gegen E.coli/Clostridium ssp. geimpft. Die Ferkel werden in der ersten und dritten Lebenswoche gegen M. hyopneumoniae
geimpft. In der zweiten Lebenswoche werden Kastrationen durchgeführt, Schwänze gekürzt
und die Tiere mit Ohrmarken versehen.
Auswahl der Sauen
Unter den tragenden Jung- und Altsauen einer Abferkelgruppe des Bestandes neun Wochen
ante partum wurden per Los die Versuchssauen festgelegt. Ausgewählt wurden Tiere, die
bereits mindestens einmal geworfen hatten und bei denen vor Versuchsbeginn mehrfach per
transkutaner Ultraschalluntersuchung eine bestehende Trächtigkeit diagnostiziert wurde. Deren Betriebsohrmarkennummern wurden protokolliert und die Tiere nach Gruppenzugehörigkeit farbig gekennzeichnet. Der Versuch wurde mit 24 Sauen und deren Würfen (251 Ferkel)
durchgeführt.
Ferkel
Die zu erwartende Geburt von Ferkeln der immunisierten Sauen wurde überwacht. Den Ferkeln der immunisierten Sauen wurde nach Möglichkeit unmittelbar nach der Geburt, (d.h. vor
erster Kolostrumaufnahme), spätestens jedoch 12 h p.n. eine Blutprobe entnommen, nachdem
sie mit einer Ohrmarke gekennzeichnet und im Versuchsprotokoll registriert wurden.
Anschließend wurde wöchentlich eine Blutprobe entnommen und sie wurden mit zwei Immunisierungsvarianten zu verschiedenen Zeitpunkten immunisiert (siehe Abbildung 5: Immunisierungsschema der Ferkel Hapten-Carrier-immunisierter Sauen).
3.2 Immunisierungen und Probenentnahmen
3.2.1 Hapten-Carrier-Konjugate
Bovines Serumalbumin (BSA), Ovalbumin (OVA) und Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH,
Hemocyanin aus Concholepas concholepas) dienten als Carrierproteine. Sie wurden entweder
mit einem Hapten (FITC, Fluorescein-5(6)-isothiocyanat oder NP, 4-Hydroxy-3-nitrophenylaceytl) oder gleichzeitig mit 2 Haptenen konjugiert. Darurch entstanden die Modellantigene
FITC-BSA, NP-BSA, FITC-NP-BSA, FITC-OVA, NP-OVA, FITC-NP-OVA, FITC-KLH,
NP-KLH und FITC-NP-KLH zur Verfügung. Die Kopplung der Haptene erfolgte freundlicherweise durch Dr. Ralf Lösel, Institut für klinische Pharmakologie, Klinisch-Medizinische
Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg. Die Hapten-Carrrier-Konjugate wurden in
einer Stock-Konzentration von 5 mg/ml in PBS bei -80ºC gelagert. Zur Immunisierung wur35
den sog. ‚ISCOMs’ (Immun-stimulierende Complexe) erzeugt. Iscoms sind adjuvante Fomulierungen bestehend aus Quil A, einem wässrigen Extrakt der Rinde des Seifenrindenbaums
(Quillaja saponaria), Cholesterol, Phospholipiden und den zur Immunisierung verwendeten
Proteinen (Hapten-Carrierkonjugate). Der Komplex besitzt eine Käfig-artige Struktur und
wird durch starke Interaktionen zwischen Cholesterol und den Quil A- Komponenten sowie
über hydrophobe Interaktionen zusammengehalten (VILLACRES-ERIKSSON, 1993). Die
ISCOM-Matrices wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. med. vet.
Bror Morein, Fa. ISCONOVA, Universität Uppsala, Schweden.
Für die Impfung von Mastschweinen und Sauen wurde pro Tier und Immunisierung jeweils
400 µg ISCOM-Matrix mit 3 µg, 30 µg oder 300 µg der jeweiligen Hapten-Carrier-Konjugate
in 2 ml sterilem PBS vermischt. Für die Impfung von Ferkeln wurde pro Tier 80 µg ISCOMMatrix mit 200 µg Hapten-Carrier-Komplexen in 1 ml sterilem PBS aufgenommen.
3.2.2 Immunisierung der Versuchstiere
Die zur Immunisierung hergestellten Lösungen wurden bei - 18 C° portioniert eingefroren
und nach Bedarf ca. acht Stunden vor Gebrauch aufgetaut. Die Lösungen wurden für jedes
Tier vor dem jeweiligen Besuch der Versuchsbetriebe in farblich gekennzeichnete und beschriftete sterile 2 ml-Einwegspritzen aufgezogen und in identisch markierten farbigen Behältern transportiert. Die Ferkel wurden mittels einer „Muto“ Impfspritze (Fa. Hauptner) immunisiert. Die Applikation erfolgte durch eine subcutane Injektion im Bereich des Ohrgrundes.
Die verwendeten Injektionsvolumina waren bei Mastschweinen und Sauen 2 ml, bei Ferkeln 1
ml. Immunisierte Tiere wurden markiert. Jede Immunisierung wurde in einem Versuchsprotokoll vermerkt.
3.2.3 Probenentnahme und Aufbereitung
Für die Entnahme von Blutproben wurden Serummonovetten mit einer der Tiergröße entsprechenden Einmalkanüle verwendet, die Kolostrum- bzw. Milchproben der Sauen wurden in
Kunststoffröhrchen ermolken.
Die Blutentnahme bei den Mastschweinen im Vorversuch erfolgte durch Punktion der Vena
jugularis externa am mittels Oberkieferschlinge stehend fixierten Tier.
In gleicher Weise erfolgte die Blutentnahme bei den Sauen im Hauptversuch. Die Blutentnahme der Ferkel wurde durch Punktion der Vena cava cranialis des in Rückenlage fixierten
Tieres durchgeführt, bei neugeborenen Ferkeln wurden maximal 5 ml Blut entnommen. Die
Blutproben, die sicher vor erstmaliger Kolostrumaufnahme des Ferkels gewonnen werden
konnten (also unmittelbar nach der Geburt), wurden zusätzlich markiert.
Die Kolostrum- bzw. Milchproben der Sauen wurden zur Geburt und dann wöchentlich bis
zum Absetzen der Ferkel in der dritten Woche entnommen. Wenn die Sauen diese Maßnahme
36
gelegentlich nicht gut tolerierten, wurde der Milchejektionsreflex nach i.m. Applikation von
10 IE Oxitocin ausgelöst, was das anschließende Abmelken einiger ml Sekrets ermöglichte.
Die gewonnenen Proben wurden mit der Tierohrmarkennummer beschriftet, stehend transportiert, und am Tage der Entnahme 10 min. bei 3000g zentrifugiert. Anschließend wurde das
Serum vierfach aliquotiert und in beschriftete Eppendorf-Cups pipettiert. Das Kolostrum bzw.
die Milch wurde zentrifugiert und anschließend die mittlere Fraktion sorgfältig in Cups pipettiert, ggf. nach wiederholtem zentrifugieren. Die Cups wurden nach Würfen, Sauengruppen
und Entnahmedatum sortiert, getrennt in Folienbeutel verpackt und zunächst bei –18°C, dann
bei – 80°C eingefroren.
3.2.4 Kennzeichnung der Versuchstiere und des Probenmaterials
Mastschweine und Sauen wurden zur Identifizierung mit Ohrmarken gekennzeichnet. Neben
der Nummerierung wurden die Gruppen zusätzlich farblich eingeteilt.
Die Einteilung in die verschiedenen Mastschweine-, Sauen- und Ferkelgruppen wurde durch
eine farbliche Kennzeichnung der Gruppen festgelegt, welche durchgängig verwendet wurde
(Immunisierung, Protokollierung, Probenbeschriftung, Laborauswertungen usw.) um, neben
der individuellen Beschriftung mit Ohrmarkennummer und Datum, eine rasche Zuordnung zu
ermöglichen.
Bei der Immunisierung von Mastschweinen wurden den Tieren zu Versuchsbeginn nummerierte und farblich unterschiedliche Ohrmarken eingezogen, (rot – Immunisierung mit FITCNP-BSA, gelb – Immunisierung mit FITC-NP-OVA, blau – Immunisierung mit FITC-NPKLH) und die beiden Kontrollgruppen (grün) festgelegt. Immunisierte Sauen wurden über
ihre vierstellige Betriebsohrmarkennummer identifiziert und ebenfalls farblich eingeteilt (grün
– Immunisierung mit FITC-BSA; blau – Immunisierung mit NP-BSA; rot – Immunisierung
mit FITC-NP-BSA). Nach dem Abferkeln wurden auch die Kastenstände mit entspr. Schildern versehen.
Den Ferkeln der immunisierten Sauen wurden nach der Geburt weiße (OVA-Gruppe) und
gelbe (F+N- OVA-Gruppe) nummerierte Ohrmarken eingezogen, die Vergabe der Nummern
erfolgte dabei in drei Gruppen, nach Sauenimmunisierung eingeteilt (Nr. 1 – 50 FITC-BSA
Sauen, Nr. 51 – 100 NP-BSA-Sauen, Nr. 101 – 150 FITC-NP-BSA-Sauen). Den Ferkeln der
OVA-immunisierten Gruppe (die Hälfte jeden Wurfes) wurde die Ziffer 0 der OhrmarkenNummer vorangestellt.
Das Probenmaterial wurde entsprechend mit Ohrmarkennummern und Datum beschriftet,
präkolostral entnommene Ferkelblutproben zusätzlich mit „x“ gekennzeichnet. Die Serumproben der Ferkel wurden in weiße (OVA-Gruppe) und gelbe (FITC-NP-Gruppe) 1,5 ml Reaktionsgefäße, analog der Ohrmarkenfarbe, pipettiert. Die Einzelproben wurden zu Gruppen
(Würfen) zusammengefasst und in farblich markierten und beschrifteten Folienbeuteln verpackt.
37
3.3 Geräte und Material
3.3.1 Geräte
Aqua dest. Aufbereitungsanlage Umkehr-Osmose
Anlage, „Typ RO 50/14SMB TypI“
(Wasser und Regenerierstation,
Barsbüttel)
Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG
(Wasser und Regenerierstation,
Reinstwasser System Typ SG-RS90-4 UF“
Barsbüttel)
Kühlschrank mit Gefrierfach (-20°C)
(Einzelhandel)
Laborfeinwaage „B6“
(Mettler, Zürich/Schweiz)
Labor-pH-Meter „766 Calimatic“
(Knick, Berlin)
Laborwaage „BL310“
(Sartorius GmbH, Göttingen)
Magnetrührer mit Heizplatte
(Janke und Kunkel, Staufen)
Mikrotiterplatten-Filterphotometer ELISA-Reader
Dynatech MR 5000
(Dynatech, Denkendorf
Kontakt: Dynex Technologies, USA)
Pipetten, einstellbar „pipetman“ (1-20 µL, 10-100 µL, (Gilson, Villers Le Bel/Frankreich)
20-200 µL, 100-1000 µL)
Plastikbox mit Gittereinsatz
(Einzelhandel)
Plattenzentrifuge mit Plattenrotor (UJ II KS)
(Heraeus-Christ. Osterode)
Rüttler für Mikrotiterplatten „AM69 Microshaker“
(Dynatec, Zug/Schweiz)
Tischzentrifuge „Hermle Z230M“
(Hermle, Gosheim)
Zentrifuge „Megafuge 1.0R“
(Heraeus instruments, Osterode)
3.3.2 Material
Klinikbedarf
Einmalspritzen Luer steril 2 ml
(AMEFA (302010), Limburg)
Einmalspritzen Luer steril 5 ml
(AMEFA (302010), Limburg)
Kanülen 1,20 x 100 mm, steril „TSK STERIJECT“
(TSK-Supra, Tochigi/Japan)
Kanülen 1,2 x 40 mm, steril
(Becton Dickinson, Heidelberg)
Kanülen Terumo Neolus 0,9 x 40 mm, steril
(Terumo, Belgien)
Kanülen Terumo Neolus 0,8 x 40 mm, steril
(Terumo, Belgien)
Serummonovetten
(Sarstedt
Injektionsspritze Hauptner MUTO
(Hauptner-Herberholz)
38
Laborbedarf
Combitips 1,25 ml
(Eppendorf (0030069.420), Hamburg)
Combitips 2,5 ml
(Eppendorf (0030069.447), Hamburg)
Einmal-Pasteurpipetten aus Pe-Ld
(Merck (612F1767), Darmstadt)
Eppendorf-Reaktionsgefäß 0,5 ml
(Sarstedt (72699), Nürnbrecht)
Eppendorf-Reaktionsgefäß 1,5 ml
(Greiner (616201), Frickenhausen)
Flachboden–Mikrotiterplatten mit Abdeckung,
(Biochrom (P92960), Berlin)
96 Vertiefungen
Laborflaschen mit Gewinde, 500 ml
(VWR international (215L1516), Hannover)
Pasteurpipetten, 22,5 mm aus Glas
(Brand (747720), Wertheim)
Pipettenspitzen, gelb und blau
(Sarstedt (70/762002) (70/760002),
Frickenhausen)
Zentrifugenröhrchen, 15 ml aus Polypropylen
(Corning (430XXX), Wiesbaden)
(Falcons, steril)
Zentrifugenröhrchen, 50 ml aus Polypropylen
(Corning (430829), Wiesbaden)
(Falcons, steril)
3.3.3 Reagenzien
Dimethylsulfoxid (DMSO) p.a.
(J.T. Baker (7033), Groß-Gerau)
Ethanol 641, absolut, vergällt
(CG Chemikalien, Laatzen)
Ethanol absolut
(Baker (8228), Deventer/Holland)
Ethylendiamine-Tetraacetic Acid (EDTA)
(Sigma-Aldrich (ED2SS), Steinheim)
Fluoreszein Isothiocyanate (FITC)
(Sigma-Aldrich (F7250), Steinheim)
Natriumchlorid (NaCl)
(Roth (9265.2), Karlsruhe)
Natriumcarbonat (Na2CO3 x 0 H2O)
(Sigma (S-2127) Deisenhofen)
Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4 x 2 H2O)
(Riedel-DeHaen AG (04269))
Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3)
(Merck (6329) Darmstadt)
Salzsäure (HCl), konzentriert (37 %)
(Baker (6081), Deventer/Holland)
Tetramethylbenzidin (TMB)
(Sigma-Aldrich (T-2885), Steinheim)
Tri-Natriumcitrat (2xH2O)
(Sigma-Aldrich (S-4641), Steinheim)
Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat)
(Sigma-Aldrich (P-1379), Steinheim)
39
3.3.4 Puffer und Lösungen
Coating-Puffer (‚A-Puffer’)
Puffer zum Beschichten von ELISA-Platten mit Antigen
Na2CO3
NaHCO3
15 mmol/l
35 mmol/l
pH 9,6
Waschpuffer und Verdünnungspuffer (‚B-Puffer’)
Puffer zum Waschen von ELISA-Platten und zum Verdünnen von Antikörpern
NaH2PO4
Na2HPO4
NaCl
Tween 20
2,5 mmol/l
7,5 mmol/l
145 mmol/l
0,1% (v/v)
pH 7,2
Substratpuffer (‚C-Puffer’)
Citrat
Na2HPO4
33,3 mmol/l
66,6 mmol/l
pH 5,0
3.3.5 Isotyp-spezifische Antikörper
Zum Nachweis porziner IgG-Antikörper wurden ein polyklonales Ziege-anti-Schwein IgG –
Fc-Antiserum eingesetzt (Bethyl Lab. Inc., Texas, USA). Zum Nachweis porziner IgGIsotypen wurden folgende Antikörper eingesetzt: Maus-anti-Schwein IgG1, Maus-antiSchwein IgG2 (Serotec, Oxford, UK). Als Nachweisantikörper für die murinen Antikörper
diente ein Ziege-anti-Maus-IgG, Peroxidase-konjugiert (Dianova, Hamburg).
Die Detektionsantikörper wurden zunächst in Wasch- und Verdünnungspuffer 1:100 verdünnt. Diese Vorverdünnungen wurden bei 4°C aufbewahrt und nach Bedarf dann für die
entsprechenden Gebrauchsverdünnungen (siehe 3.6.1) in Wasch- und Verdünnungspuffer
verdünnt.
40
3.4 Immunisierung von Mastschweinen
Der Vorversuch wurde mit 63 Mastschweinen durchgeführt, die immunisiert und denen Blutproben entnommen wurden. Die Tiere wurden einer von drei Gruppen zugeordnet, die nach
unterschiedlich verwendeten Carriern eingeteilt wurden; BSA, OVA.
Die immunisierten Tiere wurden durchgehend mit je einer von drei Dosisvarianten des jeweiligen Hapten-Carrier-Komplexes immunisiert. Die Gruppen waren demnach weiter unterteilt
in Tiere die mit 3 µg, 30 µg oder 300 µg des Hapten-Carrier-Komplexes immunisiert wurden.
Jeweils sieben Tiere einer Gruppe wurden identisch immunisiert.
Ziel dieses Ansatzes war es herauszufinden,
1.
2.
3.
ob und in welcher Höhe IgG1 und IgG2-Antikörper gegen die eingesetzten Carrier
und/oder die Haptene gebildet werden
welche Carrier-Variante, BSA oder OVA die stärkste Immunantwort auslöst
welche Dosis die stärkste Antikörperantwort induziert.
Einteilung der Gruppen
Es wurden drei Hapten-Carrier-Varianten in jeweils drei verschiedenen Dosierungen eingesetzt. Hierzu wurden drei Tiergruppen (n=21) gebildet, die ihrerseits in drei mal sieben Tiere
unterteilt wurden. Einzelheiten zur Gruppeneinteilung und den verwendeten HC-Komplexen
sind in Tabelle 2 aufgeführt. Zusätzlich erhielt eine Kontrollgruppe (n=7) nur das verwendete
Adjuvans (ohne HC-Komponente), eine weitere Kontrollgruppe (n=5) wurde ohne Immunisierungen im gleichen Rhythmus beprobt.
Tabelle 2 Immunisierung von Mastschweinen mit Hapten-Carrier-Konjugaten
Hapten-Carrier:
FITC-NP-BSA
FITC-NP-KLH
FITC-NP-OVA
µg/Tier:
3
30
300
3
30
300
3
30
300
Tiere (n):
7
7
7
7
7
7
7
7
7
0
21
Immunisierungen (Tag):
28
35
41
Blutproben zur Serumgewinnung wurden vor Immunisierung (d0) und zu vier weiteren Zeitpunkten im Verlauf der Immunisierung bis zum Tag 70 nach erster Immunisierung gewonnen
Abbildung 2).
Immunisierung (4x)
Blutentnahme zur Serumgewinnung (5x)
|
Tag 0
|
7
|
14
|
21
|
28
|
35
|
42
|
49
|
56
|
70
Abbildung 2: Immunisierungsschema von Mastschweinen mit Hapten-CarrierKonjugaten und Zeitpunkte der Blutentnahme zur Serumgewinnung
Insgesamt wurden 63 Mastschweinen immunisiert. Die Tiere wurden in 3 Hauptgruppen (verwendeter
Carrier, BSA, OVA oder KLH) eingeteilt und innerhalb jeder Hauptgruppe 3 Untergruppen (Dosis pro
Immunisierung; 3 µg, 30 µg oder 300 µg) zugeordnet. Pro Untergruppe wurden 7 Tiere auf identische
Weise immunisiert.
3.5 Immunisierung von tragenden Sauen und deren Ferkeln
Nach Ermittlung geeigneter Hapten-Carriervarianten (nach Immunisierung von Mastschweinen) wurden im Hauptversuch 24 trächtige Sauen und später deren Ferkel dem Versuchsschema entsprechend mehrfach immunisiert und beprobt. Diese Immunisierungen fanden im
Zeitraum von September 2002 bis Ende März 2003 statt. Das grundlegende Prinzip ist in
Abbildung 3 dargestellt.
42
A
Immunisierung mit
Hapten 1-Carrier 1
anti-Hapten 1
anti-Carrier 1
Immunisierung mit
Hapten 1-Carrier 2
Muttersau
kolostraler Transfer
Ferkel
B
Analyse der anti-HaptenImmunantwort
Immunisierung mit
Hapten 2-Carrier 1
anti-Hapten 1
anti-Carrier 1
Immunisierung mit
Hapten 1-Carrier 2
Muttersau
kolostraler Transfer
Ferkel
Analyse der anti-HaptenImmunantwort
Abbildung 3: Grundlegendes Konzept der Sauen-/Ferkelimmunisierung mit HaptenCarrier-Komplexen.
Nach Immunisierung mit definierten Hapten-Carrier-Komplexen sollten Antikörper gegen Carrierproteine und Hapten(e) via Kolostrum in das Ferkel übertragen werden. Die Immunisierung der Ferkel
unter Verwendung eines anderen Carrierproteins und gleicher (A) oder unterschiedlicher (B) Haptene
erlaubt sodann die Analyse der Hapten-spezifischen Antikörperantwort in An- oder Abwesenheit maternaler, Hapten-spezifischer Antikörper.
3.5.1 Sauen
Die Immunisierung der Sauen und die Analyse der Seren/Kolostrumproben diente der Beantwortung folgender Fragen:
1.
2.
3.
4.
kann bei trächtigen Sauen eine vergleichbare Hapten-/Carrier-spezifische Immunantwort wie bei den Mastschweinen induziert werden?
Welcher IgG-Isotyp gegen den Carrier / die Haptene überwiegt bei den Sauen?
welche der gewählten Hapten-Carrier-Varianten induziert die stärkste Immunantwort?
Wie stellt sich der Verlauf der Antikörperbildung während der Trächtigkeit dar?
43
5.
In welchem Verhältnis (IgG1/IgG2) werden Carrier und vor allem Hapten-spezifische
Antiköper auf die Ferkel übertragen ?
Gruppeneinteilung
Basierend auf den serologischen Daten, die nach Durchführung und Auswertung der Immunisierung von Mastschweinen vorlagen, wurde für die Immunisierung von Sauen ein Carrierprotein (BSA) und eine bestimmte Dosis (300 µg) des/der Hapten-Carrier-Konjugate festgelegt.
Drei Gruppen á 12 Sauen wurden jeweils mit einem Hapten-Carrier-Konjugat nach dem
Schema in Abbildung 4 immunisiert:
Gruppe I (n=12)
Gruppe II (n=12)
Gruppe III (n=12)
FITC-BSA-immunisierte Sauen (FITC-BSA-Sau)
NP-BSA -immunisierte Sauen (NP-BSA-Sau)
FITC+NP-BSA-immunisierte Sauen (FITC-NP-BSA-Sau)
In die spätere Analyse gingen nur solche Sauen ein, die eine ausreichende Zahl Ferkel geworfen haben und nicht im Verlauf der Immunisierungs- und Probennahmephase durch Krankheit
oder Abort ausscheiden mussten.
Die Immunisierungen wurden 9, 7, 5 und 3 Wochen vor dem errechneten Wurftag durchgeführt. Nach der Geburt der Ferkel wurden von den Sauen eine Kolostrum- sowie wöchentlich
eine Milchprobe gewonnen.
Immunisierung und Probenentnahme
Die Sauen jeder Gruppe wurden im identischen Rhythmus immunisiert und beprobt. Beginnend mit dem Wurftag wurde jeder Sau neben der Blutprobe zusätzlich eine Kolostrumprobe
und dann wöchentlich eine Milchprobe entnommen.
Eine weitere Gruppeneinteilung erfolgte nach der Geburt hinsichtlich der unterschiedlichen
Immunisierung der Ferkel. Um die Entwicklung der Antikörperbildung verfolgen zu können,
ohne die Trächtigkeit der Tiere durch Stress während der Blutprobenentnahme zu beeinträchtigen, wurde den Sauen zu drei Zeitpunkten Blut entnommen. Vor erster Immunisierung sowie am 37. und 49. Tag nach erster Immunisierung (ca. 14 Tage vor dem Wurftermin).
44
Im m unisierung (4x)
P r o b e n a h m e (6x)
a.p.
|
63
|
49
|
35
|
|
26 21
|
14
|
P artu s
|
7
|
|
14 21 p.p.
Abbildung 4: Immunisierung und Probenahme bei Sauen
3.5.2 Ferkel
Die Analyse der Seren immunisierter Ferkel sollte folgende Fragestellungen beantworten:
1.
2.
3.
4.
5.
ob das Verhältnis der im Ferkelserum gemessenen relativen Gehalte von Antigenspezifischem IgG1und IgG2 den maternalen Werten vergleichbar ist
ob maternal übertragene Antikörper gegen Haptene die Ferkel-eigene Immunantwort
nach Immunisierung mit entsprechenden Hapten-Carrier-Komplexen beeinflusst
wie die humorale Immunreaktion nach Immunisierung der Ferkel mit zwei bekannten
Haptenen, die an einen unbekannten Carrier gebunden sind, erfolgt
wie die humorale Immunreaktion nach Immunisierung der Ferkel mit einem unbekannten Carrier (ohne Haptenkonjugation) erfolgt
welchen Einfluss der Immunisierungszeitpunkt (früh, spät) der Ferkel hat
Einteilung der Gruppen
Für die Immunisierung der Ferkel wurde entweder ein Carrierprotein allein (OVA) oder ein
Hapten-Carrierkomplex (FITC-NP-OVA) eingesetzt. Die gekennzeichneten Tiere eines Wurfes wurden zu je 50 % einer Immunisierungsgruppe zugeordnet.
Die Ferkel wurden in vier Gruppen eingeteilt und ihrerseits unterschiedlich wöchentlich immunisiert: Ab dem 7. Lebenstag 5x, ab dem 14. Tag 4x, ab dem 21. Tag 3x, oder 2x am 28.
und 35. Tag. Für die Immunisierung wurde jeder Wurf hälftig geteilt. Eine Hälfte erhielt ein
Hapten-Carrierkonjugat (FITC-NP-OVA), die andere Hälfte nur den Carrier (OVA)
45
Immunisierung und Probenentnahme
Zur eindeutigen Kennzeichnung waren die Tiere bereits nach der Geburt abwechselnd mit
verschieden farbigen Ohrmarken versehen worden.
Ferkelgruppe I
Ferkelgruppe II
FITC-NP-OVA-immunisierte Ferkel
OVA -immunisierte Ferkel
Nach der Häufigkeit der Immunisierung wurden die Würfe weiter in vier Gruppen unterteilt:
Ferkelgruppe IA, IIA
Ferkelgruppe IB, IIB
Ferkelgruppe IC, IIC
Ferkelgruppe ID, IID
Immunisierungen am 7., 14., 21., 28. und 35. Lebenstag
Immunisierungen am
14., 21., 28. und 35. Lebenstag
Immunisierungen am
21., 28. und 35. Lebenstag
Immunisierungen am
28. und 35. Lebenstag
Hierfür wurden die Würfe von jeweils zwei Sauen einer der Ferkelgruppen A-D zugeordnet.
Die Einteilung wurde so festgelegt, dass dem Schema entsprechend jeweils die Würfe zweier
Sauen einer Gruppe (4 x 2) identisch immunisiert wurden. Die Zuordnung ist Abbildung 5 zu
entnehmen. Beginnend mit der Geburt wurde den Ferkeln der immunisierten Sauen bis zum
42. Lebenstag wöchentlich Blut zur Serumgewinnung entnommen.
46
Abbildung 5: Immunisierungsschema der Ferkel Hapten-Carrier-immunisierter Sauen
3.6 Serologische Untersuchungen
3.6.1 ELISA
Zum Nachweis von Antigen-spezifischen Antikörpern im Serum und Kolostrum wurde das
ELISA (enzyme-linked Immunosorbent Assay)–Testverfahren angewendet, welches heute
aufgrund hoher Genauigkeit und Sensitivität neben der relativ einfachen Durchführbarkeit
allgemein eine breite Anwendung als serologisches Nachweisverfahren findet. Hierbei binden
Antigen-spezifische Serumantikörper des Versuchsserums an zuvor in die Vertiefungen einer
Mikrotiterplatte (wells) fest gebundene Antigene und lassen sich dann nach Abwaschen ungebundener Anteile und Zugabe eines Enzym-markierten Nachweisantikörpers und Substratzugabe durch kolorimetrische Messung spezifisch nachweisen.
Beschichtung von Mikrotiterplatten
Die verwendeten Flachboden-Mikrotiterplatten haben 96 Vertiefungen (wells), die im ersten
Arbeitsschritt mit dem spezifischen Antigen beschichtet wurden (coating). Die hierfür verwendete Beschichtungslösung wurde hergestellt aus Beschichtungspuffer (Coating-Puffer)
47
und dem jeweiligen Protein (Hapten-Carrier-Konjugat oder Carrier), die als Lösungen
(1mg/ml) in kleinen Mengen aliquotiert eingefroren vorrätig waren und nach Bedarf aufgetaut
wurden. Unmittelbar vor Gebrauch wurde mit Coating-Puffer eine 1:250 verdünnte Lösung
hergestellt (4 µg/ml). Pro Platte wurden 30 μl der jeweiligen Antigenlösungen in 7,5 ml Coating-Puffer verwendet.
Von dieser Lösung wurden 75μl in jede Vertiefung pipettiert. Die so beschickte Platte wurde
mit einer Klebefolie abgedeckt und bei Raumtemperatur 1 h auf einem rotierenden Plattenschüttler (Mikrotiterplattenschüttler, Fa IKA Labortechnik, Stauffen), danach über Nacht bei
4ºC inkubiert. Anschließend wurden die Platten bei – 18°C eingefroren oder zur direkten
Weiterverwendung fünf Mal mit Waschpuffer gewaschen und auf Vliespapier trocken geschlagen.
Inkubation der Platten mit Serumverdünnungen
Pro Bestimmung wurden von jedem Serum vier Verdünnungen in B-Puffer (Waschpuffer,
siehe 3.3.4) hergestellt. Ziel war es, nach doppelt logarithmischer Darstellung der Verdünnungen gegen die optischen Dichten (OD) eine lineare Titrationskurve zu erhalten. Die Verdünnungen der Mastschwein- Sauen und Ferkelseren (je nach Immunisierungszeitpunkt) wurden daher in Vorversuchen über weite Konzentrationsbereiche geprüft, bevor 4 Verdünnungen, die den Kriterien entsprachen ausgewählt wurden. Hierfür wurden Seren eingesetzt, die
bei Mastschweinen nach 3maliger Immunisierung (Tag 28 nach erstmaliger Immunisierung)
gewonnen wurden.
Der Gehalt der Seren an Antigen-spezifischen Antikörpern wurde mittels sog. ELISA Units
quantifiziert. Da für eingesetzten Antigene kein standardisiertes Referenzserum zur Verfügung stand, wurde das Serum zweier immunisierter Mastschweine, die relativ hohe ODs im
Antigen-spezifischen ELISA aufwiesen, als Referenzseren mit einem fiktiven Gehalt an 100
ELISA Units bestimmt und auf jeder Platte in vier Verdünnungsstufen mitgeführt (Serum von
Tier 740 und Tier 191).
Jeder Ansatz erfolgte im Duplikat. Für den Nachweis einer Anti-Carrierantwort wurden die
Seren i.d.R. in 2er Schritten von 1:4 000 bis 1:32 000 verdünnt; für den Nachweis einer AntiHaptenantwort von 1:2 000 bis 1:16 000.
Nach Herstellen der Serumverdünnungen wurden die zuvor mit dem Antigen beschichtete
Mikrotiterplatte in einem Plattenwaschgerät fünf Mal (mit Waschpufferlösung) gewaschen
und anschließend auf Vliespapier trocken geschlagen, um Flüssigkeitsreste zu entfernen. Danach wurden pro Verdünnung in je zwei Vertiefungen einer Platte jeweils 75 μl pipettiert. Die
Mikrotiterplatte wurde sodann für 1 h bei Raumtemperatur auf dem Plattenrüttelgerät inkubiert, anschließend fünf Mal gewaschen und trocken geschlagen.
48
Beschicken der Mikrotiterplatten mit Detektionsantikörpern
Zum Nachweis gebundener Antikörper wurden 75 µl Detektionsantikörperlösung in jedes
well pipettiert. Zum Nachweis porcinen IgG’s wurde ein Ziege-anti-Schwein IgG-Fc eingesetzt (1: 2000 in Waschpuffer). Zum Nachweis porziner IgG-Isotypen (IgG1, IgG2) wurden
Maus-anti-Schwein-IgG1 oder Maus-anti-Schwein-IgG2 (jeweils 1:20000 in Waschpuffer)
eingesetzt. Nach Zugabe der Detektionsantikörper wurden die Mikrotiterplatten 45 min bei
RT inkubiert und anschließend gewaschen. Anschließend erfolgte eine 45 minütige Inkubation bei RT mit nachfolgendem Waschen der Platten.
Die monoklonalen Detektionsantikörper sind mit einer Peroxidase konjugiert. Sie reagiert mit
dem Substrat Wasserstoffperoxid. Diese Enzym-Substrat-Reaktion wird durch den Indikator
Tetramethyl-Benzidin (TMB) als blauer Farbumschlag sichtbar gemacht. Hierzu wurde in jede
Vertiefung 75μl Wasserstoffperoxid und TMB als TMB in DMSO (Dimethylsulfoxid)Lösung pipettiert und die Platten lichtgeschützt bei RT aufbewahrt Nach 10-20 Minuten wurde ein Farbumschlag deutlich sichtbar. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µl 1N
Schwefelsäure pro Vertiefung gestoppt, welche den blauen in einen gelben Farbumschlag
ändert.
Messung der optischen Dichten und Bestimmung von ELISA Units
Die Extinktionen der Lösungen in den wells der Mikrotiterplatten wurden in einem Photometer (ELISA-Reader, Mikrotiterplatten-Flterphotometer, Dynatech MR 5000, Fa. Dynatech,
Denkendorf) bei einer Wellenlänge von 450 nm (Testfilter) und 630 nm (Referenzfilter) als
optische Dichten (OD) erfasst. Im Personal Computer wurden die Werte der Duplikate gemittelt und die logarithmierte Serumverdünnung (X-Achse) gegen die logarthmierten ODs aufgetragen. Für das mitgeführte Referenzserum wurde im linearen Bereich der Titrationskurve
deren Steigung (‚slope’) und der extrapolierte Schnittpunkt (‚intercept’) mit der X-Achse ermittelt. Dieses Serum enthielt definitionsgemäß 100 ELISA Units. Die ELISA Units unbekannter Seren wurden mittels nachstehender Formel berechnet.
Serum (ELISA Units) =
100 * Serumverdünnung
10log(ODSerum ) - intercept
slope
49
berechnete ELISA-Unit für das unbekannte Serum
493
2,8
2,6
573
2,4
log(OD)
Mittelwert: 558 Units
526
641
2,2
2,0
1,8
1,6
1,4
3,2 3,4 3,6 3,8 4,0 4,2
-1
log (Verdünnung )
Referenzserum
unbekanntes Serum
lineare Fitting Kurve
Steigung: -0,91
Intercept: 5,47
Abbildung 6: Beispiel für die Berechnung von ELISA Units eines unbekannten Serums
anhand von Steigung und Schnittpunkt mit der X-Achse der Titrationskurve des Referenzserums (definiert als 100 ELISA Units)
3.6.2 Nachweis Carrier- und Hapten-spezifischer Antikörper
Mastschweineseren
In den Seren von Mastschweinen wurden zu den in
Abbildung 2 (s.S. 42) gezeigten Zeitpunkten Antikörper gegen den verwendeten Carrier BSA
und OVA, sowie gegen die Haptene FITC und NP nachgewiesen.
Da für diese Untersuchungen keine standardisierten Referenzseren erhältlich waren, wurden
die Seren jeweils eines OVA- und eines BSA-immunisierten Mastschweines vom Tag 28
nach Erst-Immunisierung ausgewählt, die im ELISA hohe optische Dichten aufwiesen. Diese
Seren (von Tier 740 und 191) wurden zu Referenzseren bestimmt und deren Reaktivität (optische Dichte) auf jeder Platte gleich 100 ELISA Units gesetzt. Die Seren wurden 1:10 mit
Waschpuffer verdünnt, zu 1 ml in Eppendorf-Cups aliquotiert und bei -80°C eingefroren.
50
Für die Bestimmungen von IgG-anti-Carrier-Antikörpern wurden Seren vor Immunisierung in
2er-Schritten von 1:100 bis 1:800 verdünnt. Seren, die nach Immunisierung gewonnen wurden, wurden in 2er-Schritten von 1:4000 bis 1:32000 verdünnt.
Der Detektionsantikörper (Ziege-anti-Schwein IgG) wurde in einer Konzentration von
1:100000 in Wasch- und Verdünnungspuffer eingesetzt.
Zur Erfassung der Isotyp-spezifischen Immunantwort gegen die verwendeten Proteine und
Haptene wurden die relativen Gehalte von IgG1 und IgG2 untersucht. Verwendet wurden
hierfür Maus-anti-Schwein IgG1 und Maus-anti-Schwein IgG2-Antikörper in einer Verdünnung von 1:2000. Anschließend wurde ein Peroxidase-konjugierter Ziege-anti-Maus-Ig in
einer Verdünnung von 1: 20000 eingesetzt.
Hierzu wurden aus jeder Mastschweine-Gruppe vier Tiere ausgewählt, deren Seren von drei
Entnahmezeitpunkten (Tag 28, Tag 49 und Tag 70 nach Erst-Immunisierung), untersucht
wurden.
Die Seren von Tag 0 wurden hierfür in 2er-Schritten von 1:2000 bis 1:16000 verdünnt; Seren
von allen weiteren Zeitpunkten von 1:3000 bis 1:24000.
Sauenseren, Kolostren
Die Messungen erfolgten an Seren die an Tag 37 und 49 ante partum sowie sub partu gewonnen wurden. Zudem wurden partal entnommene Kolostrumproben der Sauen analysiert.
Die Proben wurden auf BSA-reaktive Antikörper des Isotyps IgG1 und IgG2 untersucht und
hierfür in 2er-Schritten von 1:4000 bis 1:32000 verdünnt. Das Serum von Tier 740 (d28, siehe
oben) diente als Referenzserum und wurde in den Verdünnungen (2er-Schritte) von 1:2000 –
1:16000 eingesetzt. Zum Nachweis Hapten-spezifischer Antikörper (IgG1, IgG2) wurden die
Sauenseren von 1:500 bis 1:4000 (2er-Schritte) verdünnt.
Für die Analyse der Kolostralseren auf Hapten-spezifische IgG1- und IgG2-Antikörper wurden diese in 2er-Schritten von 1:500 bis 1:8000 verdünnt. Der Maus-anti-Schwein-IgG1- und
Maus-anti-Schwein-IgG2-Antikörper wurden in einer Verdünnung von 1:2000 und der Peroxidasekonjugierte Ziege-anti-Maus-Ig in einer Verdünnung von 1: 20000 eingesetzt.
Ferkelseren
Zur Beantwortung der Fragestellung (s. 3.5.2) wurden 93 Proben von 31 Ferkeln ausgewählt,
die zu einem frühen Zeitpunkt, beginnend mit Tag 7 p.n. (Gruppe A), und einem späten Zeitpunkt (Gruppe D) immunisiert wurden (Abbildung 7). Die Auswahl der Ferkel orientierte sich
nach den Ergebnissen der Sauenimmunisierung (s. 4.3) Es wurden Proben von Tieren ausgewählt, die in Vorversuchen im ELISA optische Dichten im mittleren Reaktionsbereich aufwiesen. Um den Verlauf der Antikörperbildung darstellen zu können, wurden pro Tier Se51
rumproben von drei Zeitpunkten untersucht, beginnend vor der ersten Immunisierung (Tag 0)
sowie 7 und 14 Tage später.
A) "Frühe" Impfung
Ferkel 5x immunisiert
(ab d 7 wöchentlich)
Immunisierung
der Sau
geprüfte Antikörper
FITC-NP-BSA
FITC-BSA
4 Ferkel
Sau 3264
4 Ferkel
4 Ferkel
Sau 6567
4 Ferkel
B) "Späte" Impfung
α Carrier (OVA)
α Hapten (FITC, NP)
d7, d 14, d 21
α Carrier (OVA)
d7, d14, d 21
d7, d 14, d 21
Ferkel 2x immunisiert
(d 28, d 35)
4 Ferkel
FITC-NP-BSA
FITC-BSA
Sau 3992
3 Ferkel
α Carrier (OVA)
α Hapten (FITC, NP)
d 28, d35, d 42
4 Ferkel
Sau 6722
4 Ferkel
α Carrier (OVA)
d 28, d35, d 42
d 28, d35, d 42
Abbildung 7: Schematische Darstellung untersuchter Ferkelseren
Ferkel wurden zu zwei verschiedenen Zeiten immunisiert ("frühe" und "späte" Immunisierung). Die
Würfe wurden in 2 Gruppen geteilt, von denen eine (je 4 Ferkel) nur mit einem Carrierprotein (OVA,
hellgrau unterlegt) immunisiert wurde, während die zweite Gruppe mit einem Hapten-Carrier-Komplex
(FITC-NP-OVA, dunkelgrau unterlegt) immunisiert wurde. Die Ferkel stammten aus Sauen, die entweder mit FITC-NP-BSA oder mit FITC-BSA immunisiert wurden.
Für den Nachweis Carrier-spezifischer Antikörper (BSA, OVA) vom Isotyp IgG1 oder IgG2
wurden die Ferkelseren in 2er-Schritten von 1:1000 bis 1:8000 verdünnt. Für den Nachweis
Hapten-spezifischer Antikörper (anti-FITC, anti-NP, IgG1, IgG2) wurden die Seren von
1:500 bis 1:4000 verdünnt (2er-Schritte).
52
4 Ergebnisse
Die Darstellung relativer ELISA-Units der spezifischen humoralen Immunantwort von
Schweinen, die mit Hapten-Carrier-Konjugaten immunisiert wurden, ist Gegenstand dieser
Arbeit. Besondere Schwerpunkte liegen dabei auf der Eignung als Modellcharakter der verwendeten Methode sowie auf der Isotyp-spezifischen Darstellung der maternal-neonatalen
Interaktion über transferierte kolostrale Antikörper.
4.1 Methodische Vorarbeiten
In den zu verschiedenen Zeitpunkten gewonnenen Seren der immunisierten Schweine wurde
mithilfe des ELISA der Gehalt an spezifischem IgG, IgG1 und IgG2 untersucht (siehe 3.6)
Zunächst war der positive Nachweis zur Prüfung des Vorhandenseins von spezifischen Antikörpern und der negative Nachweis zum Ausschluss von Kreuzreaktivitäten notwendig. Da
für die hier beschriebenen Untersuchungen keine etablierten Referenzseren als Standard existieren, musste zunächst in Vorversuchen ein Referenzserum bestimmt werden. Für die verwendeten Nachweisantikörper Ziege-anti-Schwein-IgG und Maus-anti-Schwein- IgG1 und IgG2 mussten geeignete Verdünnungen ermittelt werden Ebenso wurden vor jeder seriellen
Untersuchung die geeigneten Serumverdünnungen in Vorversuchen ermittelt.
Ermittlung geeigneter Serumverdünnungen
Einige Seren aus der mit 300 µg BSA-FITC und BSA-NP immunisierten Mastschweinegruppe wurden in einer Titrationsreihe in acht Verdünnungen von 1:100 bis 1:32 000 gegen BSA
geprüft. Ebenso wurde mit Seren von Tieren verfahren die mit FITC-OVA und NP-OVA immunisiert wurden. (Ergebnisse nicht gezeigt).
Die Reaktivität gegen die Haptene ist dabei insgesamt schwächer als gegen die Carrierproteine, daher wurde für den Hapten-Nachweis eine geringere Verdünnung gewählt. Nach den
Reaktivitäten wurden jene vier Verdünnungsstufen ermittelt, zwischen denen sich eine deutliche Abstufung der gemessenen OD’s zeigte. Diese wurden für die Reihenuntersuchung der
Carrier und Haptene verwendet (siehe Tabelle 4).
Verdünnung der Detektionsantikörper
Zur Ermittlung geeigneter Verdünnungen der Detektionsantikörper wurde goat-α-pig IgG in
fünf Verdünnungsschritten, von 1: 25 000 bis 1: 300 000 auf je einem reaktiven BSA- und
OVA- Serum getestet, das 1:2000 verdünnt war. Nach den ermittelten Optimalbereichen wur-
53
de für die Detektionsantikörper IgG eine Verdünnung von 1:100 000 festgelegt. Nach gleichem Verfahren wurde für IgG1 und IgG2 eine Verdünnung von 1:20 000 bestimmt.
Validierung der Referenzseren
Zur vergleichenden Untersuchungen relativer ELISA Units mussten zunächst unter den Seren
immunisierter Mastschweine geeignete Referenzseren für jedes untersuchte Antigen/Hapten
bestimmt werden. Kriterium hierfür war eine gleichmäßig ansteigende Reaktivität im Verlauf
der Immunisierung, die bei ersten vergleichenden Übersichtsprüfungen zwar im oberen Reaktionsbereich jedoch noch unterhalb maximaler OD’s liegt. Exemplarisch ist dies für ein ausgewähltes Referenzserum gegen BSA in Tabelle 3 dargestellt. In diesem Fall wurde das Serum von Tag 28 als Referenzserum bestimmt, da die optischen Dichten an Tag 49 noch zunahmen.
Prüfung auf Kreuzreaktivitäten
Seren mit deutlichen Gehalten an Antikörpern gegen den einen Carrier wurden im ELISA
ebenfalls auf Reaktivität mit dem anderen Carrier untersucht. Schwache Kreuzreaktivitäten,
individuell verschieden, zwischen Carriern konnten festgestellt werden. Die optischen Dichten der Seren FITC-NP-BSA-immunisierter Mastschweine im OVA-spezifischen ELISA lagen zwischen 0,009 (1:32.000) und 0,428 (1:100). Die optischen Dichten der Seren OVAimmunisierter Mastschweine im BSA-spezifischen ELISA lagen zwischen 0,013 (1:32.000)
und 0,069 (1:100).
Aus jeder Versuchsgruppe wurden ebenfalls Seren von nicht immunisierten Tieren oder Tieren vor erster Immunisierung (‚Nullseren’) untersucht. Reaktivitäten mit den verwendeten
Haptenen und Carrierproteinen wurden, variabel, nur in geringem Maß festgestellt. Dies betraf im Wesentlichen niedrig verdünnte Seren/Kolostralseren und äußerte sich in geringen
berechneten ELISA Units.
54
Tabelle 3: Reaktivitäten des Serums eines Tieres (740) im Verlauf der Immunisierung
mit 300 µg BSA
Tage nach erster Immunisierung
Serum-Verdünnung-1
0
14
28
49
- optische Dichten 100
0.224
0.551
1.619
1.703
500
0.060
0.127
1.192
1.659
1000
0.033
0.067
0.825
1.508
2000
0.023
0.035
0.495
1.276
4000
0.017
0.024
0.259
0.834
8000
0.014
0.020
0.128
0.449
16000
0.013
0.012
0.067
0.173
32000
0.011
0.014
0.042
0.096
Dargestellt sind die optischen Dichten (Mittelwert von Duplikaten) nach einem BSA-spezifischen
ELISA mit Maus anti-Schwein-IgG als Nachweisweisantikörper. Das Serum dieses Tieres wurde als
Referenzserum für BSA definiert (100 Units). Die berechneten ELISA Units für die Tage 0-14-28-49
waren in diesem Fall: 3-6-100-315
Kreuzreaktivität Hapten-spezifischer Antikörper
Die Hintergrundreaktivität von Seren mit Hapten-spezifischen Antikörpern mit einem irrelevanten Carrier musste geprüft werden, um Hapten-spezifischen ELISA Units berechnen zu
können. Hierzu wurden 3 Seren aus der Gruppe FITC-NP-BSA-immunisierter Mastschweine
(300 µg/Tier) vergleichend im OVA-spezifischen und FITC-OVA-spezifischen ELISA geprüft (Tabelle 4).
55
Tabelle 4: Gegenüberstellung der Reaktivitäten (OD) von 3 Seren FITC-NP-BSAimmunisierter Mastschweine im FITC-OVA- und OVA-ELISA
A) Original-ODs
Serum:
743-B300-49
745-B300-49
744-B300-49
- Antigen FITC-OVA
OVA
FITC-OVA
OVA
FITC-OVA
OVA
100
1.940
0.428
1.596
0.337
1.810
0.236
200
1.632
0.283
1.432
0.291
1.769
0.177
400
1.419
0.181
1.627
0.211
1.449
0.119
800
1.308
0.116
1.425
0.138
0.995
0.077
1600
0.536
0.070
0.920
0.085
0.585
0.053
3200
0.455
0.052
0.528
0.054
0.322
0.035
6400
0.243
0.043
0.300
0.035
0.178
0.025
12800
0.144
0.026
0.160
0.024
0.097
0.015
Serum-Verdünnung-1
B) ODs nach Abzug der Reaktivität mit dem Carrierprotein (OVA)
Serum:
743-B300-49
745-B300-49
744-B300-49
- Antigen FITC-OVA
FITC-OVA
FITC-OVA
100
1.512
1.259
1.574
200
1.349
1.141
1.592
400
1.239
1.416
1.330
800
1.192
1.287
0.918
1600
0.466
0.835
0.533
3200
0.403
0.474
0.288
6400
0.200
0.265
0.153
12800
0.118
0.136
0.082
Serum-Verdünnung-1
Tabelle 4A zeigt die individuell unterschiedliche Hintergrundreaktivität mit dem irrelevanten
Carrier (OVA). Hier bestand die Frage, ob für die Berechung von ELISA Units (anti-FITC)
diese Hintergrundreaktivität abgezogen werden muss (Tabelle 4B). Hierfür wurden verglei56
chend, basierend auf den Titrationskurven der Seren, die ELISA-Units aus den Werten (FITCOVA) vor (Tabelle 4A) und nach Abzug der Hintergrundreaktivität (Tabelle 4B) berechnet.
Für das Serum 743-B300-49 wurde ein fiktiver Gehalt von 100 ELISA-Units (anti-FITC) angenommen. nach beiden Berechnungsverfahren ergaben sich nahezu identische ELISAUNITS für die beiden anderen geprüften Seren.
Damit war für Prüfung auf Hapten-spezifische Antikörper ein Carrier-spezifischer ELISA zur
Prüfung und Korrektur der Hintergrundreaktivität nicht nötig.
Tabelle 5: Berechnung von FITC-spezifischen ELISA Units vor und nach Abzug der
Hintergrundreaktivität mit dem irrelevanten Carrierprotein
Serum
ELISA Units vor Abzug
ELISA Units nach
der Hintergrundreaktivität
mit OVA
Abzug der Hintergrundreaktivität mit OVA
743-B300-49
100
100
745-B300-49
120
121
744-B300-49
66
70
Die ELISA Units wurden basierend auf den optischen Dichten berechnet, die in Tabelle 4A, B dargestellt sind. Das Serum 743-B300-49 wurde in beiden Fällen als Referenzserum mit einem fiktiven Gehalt von 100 ELISA Units definiert.
Das Beschichten der ELISA-Platten für die Untersuchung von Ferkelseren, die aus OVAimmunisierten Ferkeln von BSA-immunisierten Sauen stammten, wurde mit dem Protein
KLH sowie dem jeweiligen Hapten durchgeführt. Hier wurden sämtliche Ferkelseren auf
Kreuzreaktivitäten mit KLH geprüft, indem sie zusätzlich auf nur mit KLH beschichteten
Kontrollplatten getestet wurden. Diese Kontrollen verliefen ohne Reaktivitäten gegen KLH
(Daten nicht gezeigt).
Die Immunogenität verwendeter Proteine in Abhängigkeit von der Lagerung
Die verwendeten Hapten-Carrier-Konjugate wurden generell bei –21°C gelagert und erst unmittelbar vor Gebrauch aufgetaut und in Einmalinjektionsspritzen aufgezogen. Durch einen
Vorversuch wurde ermittelt, ob das Einfrieren einen Einfluss auf die Immunogenität der verwendeten Hapten-Carrier-Konjugate haben kann.
Hierzu wurden 5 Ferkel eines Wurfes mit frischem, bei 4°C gelagertem Konjugat (FITC-NPBSA) und weitere 5 Ferkel mit vorher tiefgefrorenem (-21°C) Hapten-Carrier-Konjugat immunisiert. Die Dosis betrug jeweils 300 µg/Tier. Die Tiere wurden drei Mal immunisiert, jeweils Tag 0,14 und 28. Am Tag 37 wurde einmalig eine Blutprobe entnommen und die Seren
auf vergleichende IgG1/IgG2 Gehalte gegen BSA, FITC und NP geprüft. Beide Gruppen
57
zeigten hohe optische Dichten. Hierbei konnten keinerlei Unterschiede zwischen gefrorenen
und nicht gefrorenen Konjugaten oder zwischen den Geschlechtern festgestellt werden (Daten
nicht gezeigt)
4.2 Die Immunantwort experimentell immunisierter
Mastschweine gegen Modell-Proteine (Carrier-Proteine) und
Haptene
In einem Immunisierungsexperiment mit Mastschweinen wurden drei verschiedene Dosierungen von zwei Hapten-Carrier-Konjugate verwendet. Die Immunisierung erfolgte dabei mit
einem Gemisch aus FITC-BSA und NP-BSA (Gruppe 1) oder FITC-OVA und NP-OVA
(Gruppe 2).
Ziel war es eine Dosis zu finden, die einen ausreichend hohen Antikörpertiter gegen die Epitope induziert, da bei der Immunisierung von Sauen (siehe unten) gewährleistet werden sollte
dass die Antikörper in ausreichender Menge in das Kolostrum transferiert werden.
Ziel war dabei einen möglichst homogenen, deutlichen Titeranstieg von spezifischen Serumantikörpern gegen Carrier und Haptene zu erhalten, um einen späteren ausreichenden Transfer über das Kolostrum auf die Ferkel erreichen zu können.
4.2.1 Carrier-spezifische Immunantwort immunisierter Mastschweine
Zunächst wurden, wie unter Kap. 3.6.1 beschrieben, unter Verwendung entsprechender Referenzseren für jedes Serum die BSA- und OVA-spezifischen ELISA-Units berechnet. Da für
die Bestimmung OVA-spezifischer Antikörper und BSA-spezifischer Antikörper unterschiedliche Referenzseren eingesetzt wurden, wurde auf die Reaktivität solcher Seren normiert, die
bei identischen Serumverdünnungen eine vergleichbare optische Dichte im ELISA aufwiesen.
So enthielt das Serum eines mit 300 µg FITC-BSA/NP-BSA immunisierten Tieres (742BSA300-49) 378 anti-BSA ELISA Units, das Serum eines mit FITC-OVA/NP-OVAimmunisierten Tieres (194-O300-49) 248 ELISA-Units. Beide Seren wiesen jedoch im BSAbzw. OVA-ELISA vergleichbare optische Dichten auf. Daher wurden die Seren der BSAimmunisierten Tiere (alle Gruppen) auf die Reaktivität des Serums 742-BSA300-49 (= 100
relative anti-BSA ELISA Units) normiert. Die Seren der OVA-immunisierten Tiere wurden
analog auf die Reaktivität des Serums 194-O300-49 (= 100 relative anti-OVA ELISA Units)
normiert. Damit konnte die Entwicklung von Antikörpern gegen die beiden Carrierproteine
vergleichbar dargestellt werden.
58
anti-OVA-Antikörper
relative ELISA Units
anti-BSA-Antikörper
100
100
10
10
BSA-FITC-NP (µg/Tier)
3
30
300
1
0,1
FITC-NP-OVA (µg/Tier)
3
30
300
1
0,1
0
10 20 30 40 50 60 70
0
10 20 30 40 50 60 70
Tage nach 1. Immunisierung
Abbildung 8: Relative, Carrier-spezifische Antikörpergehalte (IgG, ELISA-Units) in den
Seren von Mastschweinen, die mit unterschiedlichen Carriern verschiedener Dosierungen 3 mal immunisiert wurden (vgl. Abbildung 9) (Mittelwerte±SEM, pro Zeitpunkt
n=7 Tiere).
Normierte man auf den Gehalt an Antikörpern an Tag 49 nach Erst-Immunisierung zeigte
sich, dass vor Erst-Immunisierung nahezu keine unspezifischen oder kreuzreaktiven Antikörper gegen BSA oder OVA vorhanden waren (normiert ELISA Units ≤ 1). Mit 110±26 normierten ELISA Units hatten BSA-immunisierte Tiere an Tag 49 einen höheren Antikörperspiegel als OVA-immunisierte Tiere (74±16) (Abbildung 8). Nach Immunisierung mit beiden
Carriern erfolgte ein Anstieg der spezifischen IgG-Antikörper nach der 2. Immunisierung
(d28). Er erreichte in beiden Fällen ca. 14 Tage nach letzter Immunisierung sein Maximum
um danach wieder abzufallen. Der Anstieg der Antikörpergehalte gegen den Carrier war bei
BSA-immunisierten Tieren früher zu verzeichnen als bei OVA-immunisierten Mastschweinen. Zwischen 30 µg/Tier und 300 µg/Tier bestand bei den BSA-immunisierten Tieren kein
Unterschied, während die OVA-Dosis deutlicher Einfluss auf die Entwicklungskinetik und
die Höhe der Antikörperspiegel nahm (Abbildung 8).
Basierend auf diesen Daten wurde für die Immunisierung von tragenden Sauen (siehe
Abbildung 4) der Carrier BSA in einer Dosierung von 300 µg/Tier ausgewählt.
59
4.2.2 Hapten-spezifische Immunantwort immunisierter Mastschweine
Die Abhängigkeit der Hapten-spezifischen Immunantwort von der eingesetzten Dosis und
dem Carrierprotein ist in Abbildung 9 dargestellt.
relative ELISA-Units
anti-FITC-Antikörper
100
anti-NP-Antikörper
10
10
1
1
0 10 20 30 40 50 60 70
relative ELISA Units
BSA-immunisierte Tiere
100
100
FITC-NP-BSA/Tier
3µg
30µg
300µg
0 10 20 30 40 50 60 70
OVA-immunisierte Tiere
100
10
10
1
1
0 10 20 30 40 50 60 70
FITC-NP-OVA/Tier
3µg
30µg
300µg
0 10 20 30 40 50 60 70
Tage nach 1. Immunisierung
Abbildung 9: Relative, Hapten-spezifische Antikörpergehalte (IgG, ELISA-Units) in den
Seren von Mastschweinen, die mit unterschiedlichen Hapten-Carrier-Konjugaten verschiedener Dosierungen 3 mal immunisiert wurden (vgl. Abbildung 8) (Mittelwerte±SEM, pro Zeitpunkt n=7 Tiere).
Hierbei zeigte sich eine Beeinflussung der anti-Haptenantwort in Abhängigkeit vom verwendeten Carrierprotein. So wurden höhere normierte anti-NP ELISA Units in der FITC-NPOVA immunisierten Gruppe (200±50 SEM) als in der FITC-NP-BSA immunisierten Gruppe
(84±19 SEM) ermittelt. Ebenso unterschied sich die Antikörperbildungskinetik gegen das
Hapten FITC in Abhängigkeit vom verwendeten Carrier. In FITC-NP-OVA immunisierten
Tieren erreichten die Spiegel bereits an Tag 28 nach Erst-Immunisierung ihr Maximum
(285±75 SEM), während dieses in der FITC-NP-BSA erst nach 49 Tagen der Fall war
(196±64 SEM).
Vergleicht man die relativen Antworten auf die Haptene, so war die Immunantwort auf FITC
in der FITC-NP-BSA immunisierten Gruppe stärker ausgeprägt als die Immunantwort auf NP.
60
Wurde OVA als Carrier gewählt konnte eine gleichmäßig hohe Immunantwort auf beide Haptene verzeichnet werden.
Um statistisch zu prüfen, ob die Antikörperantwort gegen die Haptene und die Carrier gleichsinnig erfolgt wurden die FITC-, NP-, und Carrier-ELISA Units innerhalb der Tiergruppen
miteinander korreliert. Die Korrelationskoeffizienten sind in Tabelle 6 dargestellt.
Tabelle 6: Korrelationen zwischen IgG-Antikörper-ELISA-Units gegen Carrier und
Haptene nach Immunisierung von Mastschweinen zu zwei verschiedenen Zeitpunkten
nach Erst-Immunisierung
anti-BSA/anti-FITC
anti-BSA/anti-NP
anti-FITC/anti-NP
- Tage nach Erst-Immunisierung 28
49
28
49
28
49
3 µg/Tier
0,69
0,90
0,55
0,39
0,78
0,13
30 µg/Tier
0,42
0,51
0,05
-0,03
0,56
0,84
300 µg/Tier
0,31
-0,03
0,49
0,88
0,60
0,28
3 µg/Tier
0,85
1,00
0,95
0,49
0,86
0,32
30 µg/Tier
-0,05
0,90
0,26
0,89
0,77
0,88
300 µg/Tier
0,11
0,65
0,28
0,84
0,73
0,78
FITC-NP-BSA
FITC-NP-OVA
Korrelationskoeffizienten ≥ 0,75 wurden zur Verdeutlichung fett ausgezeichnet. Die Daten basieren
auf den normierte ELISA Units von jeweils 7 Tieren pro Tag und Dosis.
Hier zeigte sich, dass die gleichzeitige Ausbildung von Antikörpern gegen Haptene und Carrier-Epitopen sehr von der verwendeten Dosis und dem eingesetzten Carrier selbst abhängig
ist. So bestand beispielsweise an Tag 49 nach Immunisierung mit FITC-NP-BSA zwischen
den Antikörperspiegeln gegen BSA und FITC eine hohe Korrelation (r=0,9) wenn mit 3
µg/Tier immunisiert wurde, während keine Beziehung nachgewiesen werden konnte wenn mit
300 µg/Tier immunisiert wurde (r=-0,03). Die höchste Rate an positiven Korrelationen zwischen Hapten-Antikörperspiegeln (FITC versus NP) oder zwischen Hapten- und CarrierAntikörpern fanden sich unter den mit FITC-NP-OVA-immunisierten Tieren (Tabelle 6).
61
4.2.3 Bildung unterschiedlicher IgG-Isotypen gegen Haptene und Carrierproteine immunisierter Mastschweine
Hier sollte geprüft werden ob die sich Antikörperantworten gegen Haptene und Carrier qualitativ unterscheiden. Dafür wurden die Seren der immunisierten Mastschweine zu drei Zeitpunkten nach Erst-Immunisierung auf den Gehalt Antigen-spezifische Antikörper der Isotypen IgG1 und IgG2 untersucht. Die Analysen wurden an einem Subset der immunisierten
Schweine durchgeführt (jeweils vier Tiere pro Hapten-Carrier und Dosis-Gruppe). Nach Bestimmung der ELISA Units wurden die Verhältnisse der IgG2:IgG1 ELISA Units bestimmt
(siehe Tabelle 7, Tabelle 8, Tabelle 9).
Tabelle 7: Verhältnisse von Carrier-spezifischen IgG2- zu IgG1-Antikörpern nach Immunisierung von Mastschweinen mit Hapten-Carrier-Konjugaten
Immunisierungs-Antigen
Tage nach Erstimmunisierung
FITC-NP-BSA
28
49
70
3 µg/Tier
0,9±0,2
1,9±1,3
1,1±0,2
30 µg/Tier
0,7±0,3
nd
0,5±0,3
300 µg/Tier
0,8±0,2
1,5±0,7
0,3±0,3
3 µg/Tier
2,2±1,0
1,9±0,4
3,9±0,9
30 µg/Tier
1,3±0,3
2,8±0,8
5,9±1,6
300 µg/Tier
2,6±1,2
3,0±0,8
6,9±1,1
FITC-NP-OVA
62
Tabelle 8: Verhältnisse von FITC-spezifischen IgG2- zu IgG1-Antikörpern nach Immunisierung von Mastschweinen mit Hapten-Carrier-Konjugaten
Immunisierungs-Antigen
Tage nach Erstimmunisierung
FITC-NP-BSA
28
49
70
3 µg/Tier
1,3±0,7
1,6±0,6
3,0±1,9
30 µg/Tier
0,6±0,2
0,9±0,4
1,1±0,5
300 µg/Tier
0,4±0,1
0,6±0,2
1,4±0,5
3 µg/Tier
1,4±0,3
3,3±1,3
6,1±1,8
30 µg/Tier
1,3±0,2
3,0±0,5
5,6±1,2
300 µg/Tier
1,5±0,4
3,8±0,7
13,4±2,3
FITC-NP-OVA
Tabelle 9: Verhältnisse von NP-spezifischen IgG2- zu IgG1-Antikörpern nach Immunisierung von Mastschweinen mit Hapten-Carrier-Konjugaten
Immunisierungs-Antigen
Tage nach Erstimmunisierung
FITC-NP-BSA
28
49
70
3 µg/Tier
2,7±1,5
1,7±0,7
4,6±6,0
30 µg/Tier
1,1±0,4
2,8±3,2
2,4±2,1
300 µg/Tier
0,6±0,2
1,2±0,6
2,7±1,5
3 µg/Tier
0,5±0,4
1,8±1,4
2,7±1,5
30 µg/Tier
0,8±0,6
2,9±1,8
9,8±5,0
300 µg/Tier
0,6±0,8
3,7±1,2
5,6±1,5
FITC-NP-OVA
Das Verhältnis von IgG2 zu IgG1 betrug im Mittel zu Beginn des Antikörper-Anstiegs (Tag
28) 1,2±0,5, während es 33 Tage nach letzter Immunisierung 4,3±1,7 betrug.
In der Summe dominieren im Gegensatz zu BSA-immunisierten Mastschweinen Antigenspezifische IgG2-Antikörper bei OVA-immunisierten Mastschweinen. Generell entwickeln
sich im Verlauf einer Immunisierung IgG2-Antikörper stärker als IgG1-Antikörper.
63
4.3 Immunisierung tragender Sauen mit Hapten-CarrierKonjugaten
Für die Immunisierung tragender Sauen wurde BSA als Carrier eingesetzt. Die Dosis pro
Hapten-Carrier-Variante betrug einheitlich 300µg/Tier. Bei Sauen, die mit FITC-BSA immunisiert wurden und Sauen, die mit NP-BSA immunisiert wurden, wurde exemplarisch an Tag
49 nach Erstimmunisierung geprüft, ob Antikörper gegen BSA gebildet wurden (Tabelle 10).
Beide Gruppen bildeten, statistisch nicht unterschiedlich anti-BSA-Antikörper. Unter den
IgG-Antikörpern gegen BSA dominierten in beiden Gruppen Antikörper des Isotyps IgG2
(IgG2/IgG1 = 2,2 bis 2,4, Tabelle 10).
Tabelle 10: Antikörperbildung und IgG-Isotypenverhältnis unter den anti-BSAAntikörpern von immunisierten tragenden Sauen in Abhängigkeit vom verwendeten
Hapten-Carrier-Konjugat
Hapten-Carrier-Konjugat
FITC-BSA (n=8)
FITC-NP-BSA (n=3)
IgG1-anti-BSA
122±29
(54-291)
181±46
(119-270)
IgG2-anti-BSA
296±99
(72-937)
464±245
(172-951)
IgG2/IgG1
2,4±0,5
(0,2-3,0)
2,2+0,6
(1,4-3,5)
Dargestellt sind ELISA Units (Mittelwerte ± SEM); und die Verhältnisse zwischen IgG2-anti-BSA/IgG1anti-BSA (in Klammern der Wertebereich) am Tag 49 nach Erstimmunisierung. Unterschiede zwischen IgG1- oder IgG2- ELISA-Units und IgG2/IgG1-Verhältnissen waren nicht signifikant (p>0,3).
Eine Bestimmung der anti-BSA-Antikörper in der FITC-NP-BSA immunisierten Sauengruppe wurde
nicht durchgeführt.
64
4.3.1 Hapten-spezifische Immunantwort immunisierter Sauen
Tabelle 11: Antikörperbildung und IgG-Isotypenverhältnis unter den anti-FITCAntikörpern von immunisierten tragenden Sauen in Abhängigkeit vom verwendeten
Hapten-Carrier-Konjugat
Hapten-Carrier-Konjugat
Probe, Tag der
Probennahme
Serum, Tag d49
Serum, sub partu
Kolostrum
FITC-BSA
FITC-NP-BSA
IgG1-anti-FITC
97±31
33±8
IgG2-anti-FITC
236±99
65±22
IgG2/IgG1
2,4±0,6
1,9±0,4
n=8
n=8
IgG1-anti-FITC
57±14
22±4
IgG2-anti-FITC
114±43
36±9
IgG2/IgG1
1,9±0,6
1,5±0,2
n=8
n=8
IgG1-anti-FITC
610±229
121±27
IgG2-anti-FITC
1555±616
2008±914
2,8±0,7
23±12
n=8
n=7
IgG2/IgG1
65
Tabelle 12: Antikörperbildung und IgG-Isotypenverhältnis unter den anti-NPAntikörpern von immunisierten tragenden Sauen in Abhängigkeit vom verwendeten
Hapten-Carrier-Konjugat
Hapten-Carrier-Konjugat
Probe, Tag der
Probennahme
Serum, Tag d49
NP-BSA
FITC-NP-BSA
IgG1-anti-NP
6+1
4+1
IgG2-anti-NP
34+5
37+8
5,5+0,6
10+3
n=8
n=6
IgG1-anti-NP
9+1
6+1
IgG2-anti-NP
22+5
21+4
2,4+0,3
4+1
n=8
n=7
IgG1-anti-NP
24+4
28+9
IgG2-anti-NP
116+36
5168+2186
5+1
159+73
n=8
n=7
IgG2/IgG1
Serum, sub partu
IgG2/IgG1
Kolostrum
IgG2/IgG1
In Abhängigkeit vom verwendeten Hapten-Konjugat wurden unterschiedlich hohe Antikörpertiter gegen identische Haptene gebildet. Dies konnte für das Hapten FITC beobachtet werden; Sauen, die mit FITC-BSA immunisiert wurden, wiesen durchweg höhere ELISA Units
auf als Sauen, die mit FITC-NP-BSA immunisiert wurden (Tabelle 11). Dies galt für die Seren, die 49 Tage nach Erstimmunisierung gewonnen wurden, als auch für das sub partu gewonnene Serum und das Kolostrum. Aufgrund der hohen Varianz innerhalb der Gruppen,
erwiesen sich die Unterschiede als nicht signifikant.
Für das Hapten NP ergaben sich im Gegensatz zu FITC vergleichbare ELISA Units in den
Sauenseren die an Tag 49 und sub partu gewonnen wurden (Tabelle 12), während in den Kolostren der Sauen aus der FITC-NP-BSA-Gruppe deutlich höhere ELISA Units für NPspezifisches IgG2 ermittelt wurden als in der mit NP-BSA-immunisierten Sauengruppe. Trotz
erheblicher Unterschiede in den Mittelwerten (Tabelle 12, Kolostrum), erwiesen sich diese im
Rangsummentest als nicht signifikant.
66
Generell dominierten Antigen-spezifische Antikörper des Isotyps IgG2. Die mittleren Verhältnisse in den Seren der Sauen (IgG2/IgG1) lagen für FITC-spezifische Antikörper zwischen 1,5 und 2,4; für NP-spezifische Antikörper zwischen 2,4 und 10. In den Kolostren fanden sich z.T. höhere Verhältnisse (für anti-FITC-Antikörper: 2,8 und 23, Tabelle 11; für antiNP-Antiköper 5 und 159, Tabelle 12).
4.3.2 Individuelle Antikörperbildung von Hapten-Carrier-immunisierten
Sauen
Die individuell sehr unterschiedlichen Bildungskinetik Haptenspezifischer Antikörper ist in
Abbildung 10 für zwei mit FITC-NP-BSA immunisierte Sauen dargestellt.
67
anti-NP
anti-FITC
40
ELISA Units
300
250
30
200
Sau
1610
20
150
100
10
50
su
b 49
Ko pa
lo rtu
st
ru
m
37
0
su
b 49
Ko pa
lo rtu
st
ru
m
3200
3000
2800
2600
10000
8000
6000
4000
Sau
3264
40
150
100
50
0
20
IgG1
su
b 49
Ko pa
lo rtu
st
ru
m
37
0
su
b 49
Ko pa
lo rtu
st
ru
m
37
0
0
ELISA Units
37
0
0
0
IgG2
Abbildung 10: Nachweis von Antikörpern gegen zwei Haptene in den Seren und dem
Kolostrum zweier Sauen, die mit dem Hapten-Carrier-Konjugat FITC-NP-BSA immunisiert wurden.
Die z.T. sehr geringe Antikörperbildung in manchen immunisierten Sauen und vor allem der
geringe Gehalt an Antigen-spezifischen Antikörpern im Kolostrum, schloss deren Ferkel von
68
den folgenden Immunisierungsversuchen aus. Nur solche Ferkel von Sauen wurden verwendet, die im Kolostrum ausreichend hohe Antikörperspiegel an haptenreaktiven Antikörpern
besaßen. Diese Sauen mit den Antikörpergehalten sind in Tabelle 13 aufgelistet.
Tabelle 13: Gehalte an Hapten-spezifischen Antikörpern in den Seren und Kolostren
von Sauen, deren Ferkel nach Kolostrumaufnahme mit Hapten-Carrier-Komplexen
immunisiert wurden.
Immunisiert:
FITC-NP-BSA
FITC-BSA
3264
anti-FITC
3992
anti-NP
6567
6772
anti-FITC anti-NP anti-FITC anti-FITC
Probe
IgG1
Serum d491
23
3
65
3
191
124
Serum s.p.2
15
3
45
3
66
109
Kolostrum
45
22
175
30
401
1158
IgG2
Serum d49
60
35
156
71
800
109
Serum s.p.
29
22
92
39
295
54
Kolostrum
2985
10590
3335
11046
2550
1036
IgG2/IgG1
Serum d49
2,6
11,7
2,4
23,7
4,2
0,9
Serum s.p.
1,9
7,3
2,0
13,0
4,5
0,5
Kolostrum
66,3
481,4
19,1
368,2
6,4
0,9
1) Serum von Tag 49 nach Erst-Immunisierung; 2) s.p., sub partu gewonnenes Serum
Die beiden Sauen, die mit FITC-NP-BSA immunisiert wurden, wiesen gleichmäßig hohe
IgG2/IgG1 Verhältnisse (anti-NP) in den Kolostren auf, während die Verhältnisse für antiFITC-Antikörper mit 66 und 19 deutlich niedriger lagen. Obgleich relativ hohe ELISA Units
für anti-FITC-Antikörper in den Kolostren FITC-BSA immunisierter Sauen ermittelt wurden,
lagen die IgG2/IgG1-Verhältnisse mit 6 und 1 um eine Zehnerpotenz niedriger als in den Kolostren FITC-NP-BSA immunisierter Sauen.
69
4.4 Hapten-spezifische Immunantwort immunisierter Ferkel
Jeweils 4 Ferkel einer Sau, die entweder mit FITC-NP-BSA oder mit FITC-BSA immunisiert
wurde, wurden mit FITC-NP-OVA oder nur mit dem Carrier OVA immunisiert (s. S.52,
Abbildung 7). Eine Ferkelgruppe wurde ab Tag 7 post natum immunisiert während die andere
Gruppe ab Tag 28 post natum immunisiert wurde.
Die Ferkel der Sauen können somit in solche unterteilt werden, die nach Kolostrumaufnahme
maternale Antikörper gegen die beiden Haptene in der Zirkulation besaßen, und in solche, die
nur maternale Antikörper gegen ein Hapten aufwiesen.
4.4.1 Ferkel mit maternalen Antikörpern gegen beide Haptene
Tabelle 14:
‚Frühe’ Impfung ab Tag 7;
Ferkel der Sau 3264 mit maternalen Antikörpern gegen FITC, NP und BSA
A) ‚Frühe’ Impfung ab Tag 7; geimpft mit FITC-NP-OVA
IgG1
IgG2
- Tag post natum -
7
14
21
7
14
21
anti-FITC
0±0
0±0
12±3
80±12
35±19
16±1
anti-NP
37±2
19±1
11±2
31±1
28±5
30±4
anti-OVA
4±4
0±0
0±0
146±11
66±17
43±10
anti-BSA1
52±5
n.d.2
12±2
479±98
n.d.
69±15
0±0
0±0
0±0
39±2
8±3
0±0
geimpft mit OVA
anti-OVA
70
‚späte’ Impfung ab Tag 28
Ferkel der Sau 3992 mit maternalen Antikörpern gegen FITC, NP und BSA
B) geimpft mit FITC-NP-OVA
IgG1
IgG2
- Tag post natum -
28
35
42
28
35
42
anti-FITC
55±55
0±0
27±21
0±0
0±0
28±21
anti-NP
16±6
17±2
24±9
0±0
0±0
18±7
anti-OVA
5±5
0±0
0±0
0±0
0±0
0±0
anti-BSA1
12±12
n.d.
23±2
91±39
n.d.
23±5
B) geimpft mit OVA
anti-OVA
0±0
0±0
0±0
0±0
0±0
0±0
Für Antikörper gegen FITC, NP, OVA und BSA sind ELISA Units (Mittelwerte ± SEM, n=4) dargestellt.
1) maternale Antikörper gegen den Carrier, der bei der Immunisierung tragender Sauen verwendet
wurde. 2) n.d., nicht durchgeführt
71
4.4.2 Ferkel mit maternalen Antikörpern gegen ein Hapten
Tabelle 15:
‚Frühe’ Impfung ab Tag 7;
Ferkel der Sau 6567 mit maternalen Antikörpern gegen FITC und BSA
A) geimpft mit FITC-NP-OVA
IgG1
IgG2
- Tag post natum -
7
14
21
7
14
21
0±0
124±7
85±10
47±17
191±39
102±11
29±10
0±0
3±1
45±15
24±8
22±8
anti-OVA
0±0
0±0
0±0
79±28
9±9
6±6
anti-BSA1
198±55
n.d.2
13±4
587±138
n.d.
41±6
0±0
0±0
42±4
2±2
0±0
anti-FITC
anti-NP
geimpft mit OVA
0±0
anti-OVA
‚späte’ Impfung ab Tag 28
Ferkel der Sau 6722 mit maternalen Antikörpern gegen FITC und BSA
B) geimpft mit FITC-NP-OVA
IgG1
IgG2
- Tag post natum -
28
35
42
28
35
42
138±18
76±8
55±21
25±8
25±1
7±1
anti-NP
40±6
22±7
175±83
0±0
0±0
16±1
anti-OVA
0±0
0±0
5±5
0±0
0±0
0±0
anti-BSA1
22±13
n.d.
37±13
36±20
n.d.
46±5
anti-FITC
B) geimpft mit OVA
anti-OVA
0±0
0±0
0±0
0±0
0±0
0±0
Für Antikörper gegen FITC, NP, OVA und BSA sind ELISA Units (Mittelwerte±SEM, n=4) dargestellt.
1) maternale Antikörper gegen den Carrier, der bei der Immunisierung tragender Sauen verwendet
wurde. 2) n.d., nicht durchgeführt.
72
Vergleicht man die Immunantwort der mit FITC-NP-OVA immunisierten Ferkel, so fällt auf,
dass ‚früh’ geimpfte Tiere im Mittel höhere Werte für IgG2 ELISA Units aufweisen als IgG1
ELISA-Units. Dies galt für alle Hapten-reaktiven Antikörper und, zumindest an Tag 7 für
Carrier-spezifische Antikörper (Tabelle 14A, Tabelle 15A).
Der zeitliche Verlauf der Antikörperbildung war heterogen. Er konnte von Tag 7 nach Tag 14
und 21 steigen (Tabelle 15A, anti-FITC), etwa gleich bleiben (Tabelle 14A, anti-NP, IgG2)
oder fallen (Tabelle 15A, anti-OVA, IgG2). Eine einheitliche Tendenz war nicht zu erkennen.
Eine vergleichbare Heterogenität des zeitlichen Verlaufs der Antikörpergehalte konnte bei
den ‚spät’ immunisierten Ferkeln beobachtet werden. Der Abfall Hapten-spezifischer Antikörper im Beobachtungszeitraum betrug bspw. bei IgG2-Antikörpern gegen NP bei früh geimpften Tieren (von 45±15 auf 22±8, Tabelle 15A) etwa 51 %. Bei spät geimpften Tieren
betrug der Abfall von IgG1-Antikörpern gegen FITC (von 138±18 auf 55±21, Tabelle 15B)
etwa 60 %. BSA-reaktive Antikörper, die nur von der Sau stammen konnten fielen bei früh
immunisierten Ferkeln um 77 % (IgG1, Tabelle 14A) und 86 % (IgG2, Tabelle 14A), bzw.
um 93 % (IgG1, Tabelle 15A) und 93 % (IgG2, Tabelle 15A) ab. In Seren spät immunisierter
Ferkel konnten ebenfalls noch BSA-reaktive Antikörper nachgewiesen werden, deren ELISA
Units sich von Tab 28 zu Tag 48 nach Erst-Immunisierung nicht so stark veränderten wie in
der früh immunisierten Ferkelgruppe.
Ein Unterschied in der NP-spezifischen Immunantwort zwischen Ferkeln mit maternalen Antikörpern gegen NP und solchen ohne maternale Antikörper gegen NP bestand nicht. Beispielsweise lagen die ELISA Units für anti-NP Antikörper vom Isotyp IgG2 bei früh geimpften Ferkeln mit maternalen Antikörpern zwischen 28und 31, die von Ferkeln ohne maternalen
Antikörper zwischen 22 und 45.
Bei den ‚spät’ geimpften Tieren dominierten im Mittel die IgG1 ELISA Units über die IgG2
ELISA Units. Dies galt insbesondere für die Hapten-reaktiven Antikörper.
Während in früh geimpften Tieren eine nahzu ausschließlich IgG2-dominierte Immunantwort
gegen den Impf-Carrier OVA nachgewiesen werden konnte, fehlte diese komplett bei den
spät geimpften Tieren.
Zudem konnten bei Ferkeln, die nur mit OVA immunisiert wurde - sowohl von FITC-NPBSA geimpften Sauen, wie auch von den FITC-BSA geimpften Sauen, keine Antikörper gegen OVA nachgewiesen werden. Dies war unabhängig davon ob die Ferkel zu einem frühen
oder späten Zeitpunkt geimpft wurden (Tabelle 14B, Tabelle 15B).
73
5 Diskussion
Ziel dieser Arbeit war die Prüfung von Modellantigenen zur Darstellung einer Isotypspezifischen Immunantwort bei Schweinen nach Immunisierung unter Feldbedingungen. Zudem sollte geprüft werden ob die von Sauen über das Kolostrum transferierten Antikörper
gegen einzelne Epitope der Modellantigene die aktive Immunantwort von Ferkeln gegen diese
Modellantigene positiv oder negativ beeinflussen. Der Schwerpunkt lag hierbei auf IgGIsotypen.
Um die Beeinflussung der Immunantwort von Ferkeln möglichst auf Epitop-Ebene eines Antigens darstellen zu können wurde auf Hapten-Carrier-Komplexe zurückgegriffen, bei denen
die definierten Epitope (Haptene) den immunisierten Tieren mit ausreichender Sicherheit
fremd waren und die in variabler Kombination mit Carrierproteinen kombiniert werden konnten. Dies ermöglichte beispielsweise die Sau mit einer Kombination zu impfen und gegen
Carrierprotein und Hapten(e) Antikörper zu induzieren, das Ferkel der Sau aber mit einer anderen Kombination aus Carrier und Hapten. Somit war zumindest theoretisch gewährleistet,
dass Einflüsse maternaler Antikörper sehr differenziert beleuchtet werden konnten.
5.1 Methodische Aspekte
5.1.1 Verwendung von Hapten-Carrier Komplexen als Modellantigene
Modellantigene wurden beim Schwein in vivo bisher nicht eingesetzt. Die meisten veröffentlichten Studien zur Immunantwort von Schweinen wurden hauptsächlich mit populationsrelevanten pathogenen viralen, bakteriellen oder parasitären Organismen durchgeführt.
(KLINKENBERG et al. 2002; LOEFFEN et al. 2003; SOLANO-AGUILAR et al. 1999;
BOUMA et al. 1997).
Um die Immunantwort einer Tiergruppe qualitativ untersuchen zu können erschienen Infektionsversuche mit Erregern jedoch weniger geeignet. Erstens wird die Erregeraufnahme und
Verteilung im Versuchstier unter Feldbedingungen von zahlreichen nur schwer zu kontrollierenden Faktoren beeinflusst. Zweitens besteht ein Erreger aus zahlreichen Antigenen mit einer
Vielzahl unterschiedlicher Epitope, was differenzierte Analysen der Bedeutung einzelner Antikörper gegen definierte Epitope zumindest erschwert und die Ergebnisinterpretation nicht
erleichtert. Drittens sind Kreuzreaktivitäten im vorhandenen Antikörperrepertoire gegen das
gewählte Antigen möglich, die ebenfalls das Ergebnis schwer interpretierbar gestalten können. Nicht zuletzt sind experimentelle Infektionen häufig mit negativen Folgen für die Gesundheit und Leistung der Versuchstiere verbunden und damit in Feldbeständen nicht durchführbar oder vertretbar.
74
Unter Berücksichtigung dieser Aspekte erschien der Einsatz von Modellantigenen, bestehend
aus einem Carrierprotein mit daran gekoppelten, definierten Haptenen geeigneter zu sein.
Dies wurde in vielfachen Studien, hauptsächlich mit Nagern, erfolgreich belegt. (ODA et al.,
2004; SIVOLAPENKO et al.,1996; LANDSTEINER, 1945)
Die Hapten-Carrier-Komplexe (HC-Komplex) sind im Idealfall klein, löslich, nicht kreuzreaktiv und apathogen. Es existieren derzeit nur wenige Veröffentlichungen, die Versuche mit
Hapten-Carrier-Komplexen beim Schwein beschreiben (KRÄUSSLICH et al., 1983).
In der vorliegenden Arbeit wurden als Carrier die Proteine bovines Serumalbumin (BSA),
Ovalbumin (OVA) und Keyhole Limpet Hemocyanin gewählt. Zum einen war aus der Literatur bekannt, dass sich die verwendeten Haptene FITC und NP sehr gut an diese Proteine koppeln lassen. Zum Anderen wurden diese Proteine bereits vielfach im Nagersystem als immunogene Modellantigene erfolgreich eingesetzt.
5.1.2 Auswahl der Versuchstiere
Für die vorliegende Arbeit und um Verhältnisse unter realen Bedingungen zu untersuchen
wurden konventionell gehaltene Schweine aus zwei Feldbeständen verwendet; einem Mastbetrieb sowie einem kombinierten Zucht- und Mastbetrieb.
Bei Verwendung konventionell gehaltener Versuchstiere waren zwar größere individuelle
Unterschiede der Immunantworten zu erwarten (bei identisch immunisierten Tieren), die sich
aber ebenso in der Praxis, nach Vakzinierungen gegen Erreger zeigen und somit ein realitätsnäheres Ergebnis bieten.
Zumindest wurden Tiere jeweils eines Bestandes immunisiert, sodass identische Bedingungen
(für das Alter, die Herkunft, die Haltung und das verwendete Futter usw.) gewährleistet waren.
Veröffentlichte Untersuchungen zur humoralen Immunantwort in Infektionsversuchen oder
Untersuchungen der Prävalenzen populationsrelevanter Erreger werden ebenso in Feldbeständen, häufig auch in größerer Tierzahl durchgeführt. Der verwendete Parameter zur Darstellung der Ergebnisse ist meistens die Ermittlung von Serum-IgG mittels standardisierter
ELISA-Verfahren. (GROSSE BEILAGE et al., 1994; HODGINS et al. 2004; GROSSE
BEILAGE u. SCHREIBER 2005). So kann ein großes Kollektiv in einem quantitativen
Merkmal (Serum-IgG) charakterisiert werden, z.B. hinsichtlich der klinischen Wirksamkeit
einer Impfung. Aussagen darüber warum z.B. ein gemessener Antikörpertiter protektiv ist,
sind so jedoch nur eingeschränkt möglich.
In Studien die sich der Isotyp-spezifischen Analyse der porzinen humoralen Immunantwort
näherten wurden meistens nur wenige, unter kontrollierten Laborbedingungen gehaltene
Schweine untersucht (FRONTERA et al., 2003; SOLANO-AGUILAR et al., 1999). Oder es
wurden gnotobiotische bzw. SPF-Ferkel in geringer Zahl verwendet. (HEINEN et al. 2000;
KIMMAN et al., 1992).
75
Durch das Fehlen von Antikörper-Kreuzreaktivitäten und definierte Umweltbedingungen eignen sich diese Tiere natürlich besonders für solche Studien. Allerdings weisen auch die Autoren solcher Studien darauf hin, dass eine Übertragung von Erkenntnissen an relativ wenigen
SPF-Ferkeln auf Verhältnisse in Feldbeständen kaum möglich ist (VERFAILLIE et al., 2004;
FURESZ et al., 1998).
Um zeitliche Faktoren, wie Jahreszeit und unterschiedliche Futterchargen, die einen Einfluss
auf das Antikörperbildungsvermögen haben können (KLOBASA et al. 1985a) möglichst zu
minimieren, war die gleichzeitige Immunisierung mehrerer Sauen nötig. Diese Bedingung
entsprechend großer synchronisierter Abferkelgruppen konnten nur Bestände mit mehreren
hundert Sauen erfüllen. So wurden die Versuche in drei Zyklen mit jeweils acht Sauen gemischter Immunisierungsgruppen durchgeführt. Als Vorteil erwies sich die Möglichkeit, nur
die per Ultraschalluntersuchung als tragend diagnostizierten Tiere für den Versuch auswählen
zu können. Dennoch waren nicht alle Faktoren steuerbar. So warf eine Sau z. B. nur vier Ferkel, von denen zwei verstarben.
Generell wurden die Immunisierungen der Schweine (Mastschweine, Sauen, Ferkel) mit Hapten-Carrier-Konjugaten gut vertragen. Auch nach mehrfacher Applikation zeigte sich keine
Beeinträchtigung des Verhaltens und der Futteraufnahme. Lokale Nebenwirkungen (Injektionsstelle) oder Veränderungen der Körpertemperatur wurden bei den Mastschweinen nicht
beobachtet. Ebenso konnte keinerlei Symptomatik bei immunisierten Ferkeln beobachtet werden. Bei tragenden Sauen hingegen reagierten etwa zehn Tiere nach erstmaliger Immunisierung mit einer vorübergehenden Erhöhung der Körpertemperatur und Inappetenz, die sich
nach einer Injektion eines antipyretisch wirksamen Medikamentes folgenlos wieder normalisierte. Ein Einfluss auf die Reproduktionsleistung wurde nicht beobachtet. Worauf dieser Unterschied zwischen Mastschweinen/Ferkeln und Sauen beruhte ist nicht klar. Denkbar wäre
eine gesteigerte Reaktivität der Antigen-präsentierenden Zellen nach Antigenaufnahme mit
nachfolgend erhöhter Produktion pro-inflammatorischer und pyrogener Zytokine (IL-1,
TNFα, IL-6).
Die Blutentnahme verlief bei den Mastschweinen ohne Komplikationen, es verstarb nur eines
von 63 Tieren während der Versuchsphase. Die Blutentnahme bei tragenden Sauen stellt eine
größere Stressbelastung für die Tiere dar. Aus diesem Grund, auch zur Vermeidung eines
hierdurch erhöhten Abortrisikos, wurden bei den Sauen nur wenige Blutprobenentnahmen
ante partum durchgeführt. Ebenso stellte die Überwachung der Geburten eine Beeinträchtigung der Tiere dar. Durch das Ziel, den Ferkeln bereits vor erster Kolostrumaufnahme eine
Blutprobe zu entnehmen, war eine permanente Geburtsüberwachung notwendig, da die Ferkel
unmittelbar nach dem Austritt aus dem Gebärkanal das Gesäuge der Sau aufsuchen. Durch die
länger dauernde Anwesenheit im Rahmen der Geburtsüberwachung und Probenentnahmen
76
von Sauen und Ferkeln zeigten die Tiere deutliche Unruhe und Stresssymptome, was ebenfalls zum Erdrücken einiger Ferkeln durch die Sau führte. Die Entnahme von Kolostrumproben zur Geburt war einfacher als spätere Milchprobenentnahmen, für diesen Zweck wurde
den Tieren Oxitocin i. m. injiziert. Die saubere Entnahme von Kolostrumproben gestaltete
sich allerdings durch Abwehrbewegungen und nur bedingt durchführbare Vorbereitung des
Gesäuges (Reinigung, Desinfektion) schwierig. Ein Teil der Sauen wies überdies eine Erkrankung am MMA-Komplex auf, was u.a. zu Milchmangel und zusätzlichen Entzündungsprodukten in den Gemelken führte. Die Blutentnahme bei den Ferkeln war unterschiedlich gut
verträglich. Während die Blutentnahme bei Ferkeln unmittelbar nach der Geburt sehr gut toleriert wurde, zeigte sich bei der Beprobung eine Woche später eine Beeinträchtigung der Tiere.
Hier traten teilweise anschließend eine längere Erschöpfungsphase und eine Hämatombildung
an der Punktionsstelle auf. Daher wurde die für Tag sieben vorgesehene Blutentnahme auf
den dritten Lebenstag vorverlegt, wo eine bessere Verträglichkeit gegeben war. Spätere Immunisierungen und Blutentnahmen wurden besser vertragen, vermutlich, weil die Tiere dann
schon besser an die Umwelt adaptiert waren. Insgesamt lag die Mortalitätsrate bei den Ferkeln
bis zum Versuchsende (42. Lebenstag der Ferkel) bei ca. 10 %, was leicht oberhalb der durchschnittlichen Rate in diesem Betrieb war.
5.1.3 Der Antigen-spezifische und Isotyp-spezifische ELISA
Generell wurden in dieser Arbeit relative Gehalte an Antigen- oder Epitop-spezifischen Antikörpern gemessen. Das bedeutet, das die absolute Höhe der ermittelten Werte (ELISA-Units)
vom der verwendeten Referenz abhängig war. Dies galt auch für den Vergleich von IgG1
ELISA Units mit IgG2 ELISA Units. Da für die verwendeten Carrierproteine und die Haptene
keine porzinen Antikörper mit bekannten Gehalten zur Verfügung standen mussten eigene,
nach Immunisierungen gewonnene Seren, als sog. Referenzseren definiert werden. Die Reaktivität der Seren gegen FITC, NP, BSA oder OVA wurde sodann gleich 100 ELISA Units
gesetzt. Dies galt ebenso für die Gehalte an Antigen-spezifischem IgG1 und IgG2. Da die
Seren allerdings aller Voraussicht nach unterschiedliche (unbekannte) Mengen an Antigenreaktiven Antikörpern gegen die Haptene FITC und NP sowie gegen die Carrierproteine BSA
und OVA enthielten, sind absolute ELISA Units für verschiedene Carrierproteine oder verschiedene Haptene nicht immer vergleichbar. So können bei Verwendung eines Referenzserums mit einem hohen Antikörpergehalt gegen ein Antigen ‚X’ die ELISA Units für anti-‚X’
Antikörper in den Seren anderer Tiere relativ gering ausfallen. Umgekehrt sind ELISA Units
gegen Antigen ‚Z’ dann hoch wenn das Referenzserum für Antigen ‚Z’ vergleichweise geringere Antikörpergehalte dafür aufweist.
Viele Autoren berichten von vergleichbaren Problemen in der Darstellung einer Isotypspezifischen Immunantwort. Da Seren mit verschiedenen Antikörpern und unterschiedlichem
Isotypspektrum kein uniformes Reaktivitätsmuster zeigten, verwendeten KIMMAN et al.
77
(1992) für die Darstellung der porzinen Immunantwort gegen das Virus der Aujeszkyschen
Krankheit für die Messung von IgG1 und IgG2 sowie für die Messung von IgA und IgM zwei
verschiedene Capture-ELISA.
Nach Immunisierung von Mastschweinen mit BSA und OVA als Carrier wurde versucht dies
zu normalisieren. Hierfür wurden Seren unterschiedlicher ELISA Units für anti-OVA und
anti-BSA Antikörper nach der Analyse auf Seren normiert (anti-BSA oder anti-OVA) die
ähnlich hohe optische Dichten im ELISA aufwiesen. Ein solches Vorgehen setzt allerdings
voraus, dass Antikörper gegen verschiedene Epitope der beiden Antigene im Mittel eine gleiche Affinität und Avidität aufweisen. Nach Vergleich der Titrationskurven der anti-BSA mit
den anti-OVA-Seren (Serumverdünnung gegen optische Dichten) ergaben sich weitgehend
parallele Kurven, sodass dieses Vorgehens des Normierens für die Mastschweine gerechtfertigt erschien.
Weitere Vergleiche zwischen den Gehalten an Antigen-spezifischen Antikörpern in den Seren
von Tieren, die unterschiedlich immunisiert wurden, erfolgten in der Hauptsache anhand der
Verhältnisse zwischen Antigen-spezifischem IgG1 und –IgG2. Da die relativen ELISA Units
für IgG2-Antikörper in der Regel höher waren als für IgG1-Antikörper, wurde in der Arbeit
generell das IgG2/IgG1-Verhältnis angegeben.
Insgesamt wurde der Berechnung von ELISA Units der Vorzug vor der Darstellung von optischen Dichten gegeben, weil letztere trotz weitgehender Standardisierung im Labor doch z.T.
eine erhebliche Inter-assay-Varianz aufwiesen, während aus Titrationskurven berechnete
ELISA Units davon nicht beeinträchtigt wurden.
Ein weiterer Vorteil dieses Bestimmungsverfahrens ist es, dass relativ hohe optische Dichten
in Seren, die nur gering verdünnt wurden kaum ins Gewicht fallen. Im Falle zu erwartender
geringer Gehalte an Antigen-spezifischen Antikörpern musste Seren teilweise konzentrierter
eingesetzt werden, was die Hintergrundreaktivität deutlich anhob. Das Problem der Hintergrundreaktivität im Fall von konzentrierten Serumproben betraf beispielsweise auch die Kolostren. Diese Hintergrundreaktivität einer Serumprobe von einer echten Reaktion mit dem
Antigen zu unterscheiden fiel anhand der optischen Dichten schwer, während wiederum die
berechneten ELISA-Units davon nicht beeinträchtigt wurden (Tabelle 4).
5.2 Antikörperbildung immunisierter Schweine
5.2.1 Mastschweine
Vor Beginn der Sauen- und Ferkel-Immunisierungen musste zunächst ein Carrier gefunden
werden, der bei Schweinen eine ausreichend hohe Immunantwort induziert. Hierfür gab es in
der Literatur keine Belege. Hierzu wurden Mastschweine mit verschiedenen Hapten-CarrierKomplexen in unterschiedlichen Dosen immunisiert und die Seren auf Gehalte an Hapten78
und Carrier-spezifischen Antikörpern untersucht. Diese Versuche dienten auch dafür zu prüfen, ob Schweine kreuzreaktive Antikörper gegen die Carrierproteine BSA und OVA aufweisen. Dass dies nicht der Fall war zeigt Tabelle 4A und die Abbildungen 8 und 9.
Die Mastschweine produzierten Antikörper gegen beide eingesetzten Carrierproteine, beide
erwiesen sich somit als immunogen für das Schwein. Für die nachfolgenden Sauen-/FerkelImmunisierungen wurde dem BSA als Carrier der Vorzug vor OVA gegeben, weil zum Einen
die Abhängigkeit der Immunantwort von der gewählten Antigendosis nicht so stark wie bei
OVA gegeben war. Ab Tag 14 nach Erstimmunisierung lief die Entwicklung der ELISA
UNITS für anti-BSA-Antikörper zwischen Tiere die mit 30 µg oder 300 µg immunisiert wurden nahezu parallel (bei gleicher Höhe der ELISA-Units, Abbbildung 8). Bei OVAimmunisierten Tieren hingegen zeigten sich deutliche Unterschiede, besonders zwischen Tag
28 und Tag 49 nach Erstimmunisierung zwischen Tieren, die mit 30 µg oder 300 µg OVA
immunisiert wurden. Zum Anderen entwickelten sich Antikörper gegen den Carrier BSA früher als gegen OVA (Abbildung 8).
Die zwischen 30 µg und 300 µg relativ gleichmäßige Antikörperbildung zeigte sich ebenfalls
bei Hapten-spezifischen Antikörpern, wenn BSA als Carrier verwendet wurde (Abbildung 9)
die einen ausreichend hohen Antikörpertiter gegen die Epitope induziert, welche bei der nachfolgend geplanten Immunisierung von Sauen eine ausreichende Bildung kolostraler Antikörper gewährleisten soll.
Die Immunantwort der Haptene war abhängig vom verwendeten Carrier. Dies betraf sowohl
die Höhe der normierten ELISA Units als auch die Antikörperbildungskinetik (s. 4.2.2, Abbildung 9). So war bspw. die Immunantwort auf FITC in der FITC-NP-BSA-immunisierten
Gruppe stärker als die Immunantwort auf NP. Wurde hingegen OVA als Carrier gewählt
konnte eine gleichmäßig hohe Immunantwort auf beide Haptene verzeichnet werden. Dies
könnte damit zusammenhängen, dass der ELISA unter Verwendung von anderen als zur Immunisierung verwendeten Hapten-Carrier-Konjugaten zum Nachweis (oder zum fehlenden
Nachweis) von Antikörpern führt, die gegen ein Epitope gerichtet sind die sowohl vom Hapten als von von Carrierbestandteilen gemeinsam gebildet werden. Eine unterschiedliche Immunogenität des Haptens FITC in Abhängigkeit vom Carrier konnten auch SIVOLAPENKO
et al. (1996) demonstrieren.
Nach ODA et al. (2004) ist die Haptenvalenz ein kritischer Faktor, der die AntigenAntikörper Wechselwirkung und den Umfang der B-Zell-Signalisierung bestimmt. Die Valenz und Dichte des Haptens sowie die Größe des Carriers bestimmen die Signaltransduktion
in der B-Zelle. VILEN et al. (1998) konnten mit NP7-BSA, nicht jedoch mit NP2-BSA eine
B-Zell-Rezeptordesensibilisierung auslösen. Dies wird durch Quervernetzung gebundener
Oberflächenrezeptoren eingeleitet. ODA et al. (2004) konnten diese Quervernetzung (cross79
linking) mit NP2-HEL (Hühnereiweiss-Lysozym) als Carrier demonstrieren, mit NP1- HEL
gelang dies nicht.
Es mag demnach so sein, dass bei der Konjugation von FITC und NP an BSA und OVA,
Hapten-Carrier-Komplexe erzeugt wurden, die unterschiedliche Haptenvalenzen aufwiesen.
Auf Tierseite besteht die Möglichkeit, dass die immunisierten Schweine mehr naive FITCspezifische B-Zellen als naive NP-reaktive B-Zellen besaßen und das sich die Frequenz von
OVA- und BSA-spezifischen T-Helferzellen bei den Mastschweinen deutlich unterschied. In
beiden Fällen ist von einer zwischen Tieren oder Tiergruppen unterschiedlich starken Immunantwort auszugehen. Dies wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht näher untersucht.
Es bleibt das Faktum einer unterschiedlichen starken Immunantwort bei Mastschweinen auf
zwei Modell-Haptene bei gleichem Carrier. Verkompliziert wird die Analyse dadurch, dass es
offensichtlich nicht immer eine Korrelation zwischen der Antikörperbildung gegen den Carrier und die daran gekoppelten Haptene gibt (Tabelle 5). Man sieht diese Beziehung nur für
bestimmte HC-Konjugat-Konzentrationen an bestimmten Tagen nach Erst-Immunisierung.
Bisweilen sind überhaupt keine Korrelationen zu erkennen. Dies bedeutet, dass sich die Immunantwort gegen ein komplexes Antigen schwerlich an der Antikörperbildung gegen ein
Epitop ablesen lässt und dass die Immunantwort gegen verschiedene Epitope eines Antigens
unterschiedlichen Gesetzen unterworfen ist. Dies könnte bei der Entwicklung von Vakzinen
in Zukunft eine wichtige Rolle spielen.
Von ebenso großer Bedeutung könnten die Befunde zu den IgG-Isotypen unter den induzierten Antikörpern sein. Die Tabellen 6 bis 8 belegen, dass es nach wiederholter Immunisierung
der Mastschweine im Mittel zu einer Zunahme des Verhältnisses zwischen IgG2 und IgG1
Antikörpern unter den Antigen-spezifischen Antikörpern kommt. D.h., mit zunehmender
Dauer der Immunisierungen dominieren immer mehr Antikörper eines Isotyps (IgG2). Allerdings hatte der Carrier darauf einen großen Einfluss. Der Anstieg des IgG2/IgG1Verhältnisses war bei OVA-immunisierten Mastschweinen deutlich stärker als bei den BSAimmunisierten Tieren.
Nimmt man die unterschiedlichen IgG-Isotypen, die im Rahmen einer Immunantwort gebildet
werden als Ausdruck einer bestimmten Richtung oder Polarisierung der Immunantwort (im
Sinne von TH1- oder TH2-Polarisierung) so belegen diese Daten, dass die Richtung einer
Immunantwort bereits durch den Carrier oder die verwendeten Proteine bei einer Vakzinierung mitbestimmt werden kann. Dies hat man bisher im Wesentlichen auf die bei der Immunisierung verwendeten Adjuvanzien zurückgeführt.
Vor der Immunisierung von Sauen war noch nicht bekannt ob und welche porzinen IgGIsotypen in das Kolostrum transferiert werden. Käme hier ein ähnlich selektiver Prozess wie
80
beim Rind zum Tragen, bei dem hauptsächlich ein Isotyp (bovines IgG1) im Kolostrum erscheint, und würde das im vorliegenden Fall das porzine IgG1 betreffen, so erschien die Wahl
von OVA als Carrier für die Sauenimmunisierung ebenfalls nicht opportun. Deshalb, und weil
sich die Antigen-spezifischen IgG2/IgG1-Verhältnisse nach BSA-Immunisierung von Mastschweinen ausgewogener darstellten, wurde für die Immunisierung von Sauen dem BSA der
Vorzug vor OVA gegeben.
5.2.2 Sauen
Immunisierte, tragende Sauen zeigten eine erstaunlich heterogene Immunantwort auf die Modellantigene. Dies betraf sowohl Antikörper gegen den Carrier BSA als auch gegen die Hapten FITC und NP. Die Heterogenität bezog sich nicht nur auf die Höhe der Antikörpergehalte
(ELISA Units), sondern auch auf die Bildungskinetik unterschiedlicher IgG-Isotypen gegen
Carrier und Haptene (vgl. Abbildung 10). Das in Abbildung 10 gezeigte Muster der IgGIsotypenbildung zeigt ein Überwiegen der IgG2-Antwort bei Sauen. Dies ist jedoch beispielsweise nicht bei der Sau 1610 für das Hapten FITC der Fall. Dieses Tier steht für 3 von
24 untersuchten Sauen. Die höheren IgG1-Werte stellen somit eher eine Ausnahme dar und
betrafen besonders solche Tiere, deren Immunantwort generell eher schwach ausfiel (niedrige
ELISA Units). Dies deckt sich mit Literaturangaben, wonach Schweine mit einem insgesamt
niedrigeren Antikörpergehalt im Serum einen höheren IgG1-Anteil aufweisen. Der Verlauf
der Antikörperbildung während der Trächtigkeit deckt sich hier ebenfalls mit den Angaben
aus der Literatur und verläuft bei allen Sauen nach einem typischen Muster. Nach KLOBASA
et al. (1985 b) erfolgt dabei ein Absinken der Plasma-Antikörper zur Geburt hin, da diese ins
Kolostrum überführt werden. Die kolostralen IgG stammen beim Schwein überwiegend aus
dem Serum. Dieses charakteristische Absinken der Antikörper zur Geburt hin war bei allen 24
Sauen zu erkennen.
Aufgrund der hier ermittelten Heterogenität der Immunantworten sind summarische und gemittelte Werte wie sie in den Tabellen 10 bis 11 dargestellt sind, mit Einschränkung zu werten. Der Grund für die im Vergleich zu Mastschweinen doch erheblich stärkere Variabilität
der Immunantwort ist unklar und bedarf weiterer Analysen mit größeren Tierzahlen.
Zumindest führte die Immunisierung bei allen Sauen zur Antikörperbildung gegen den Carrier
BSA und die Haptene FITC und NP. Statistisch war es hierfür unerheblich, ob die Sauen mit
einem Monohapten-Carrier-Konjugat (FITC-BSA) oder mit einem Konjugat aus Carrier und
zwei Haptenen (FITC-NP-BSA) immunisiert wurden. In beiden Fällen war die Antwort gegen
den Carrier vergleichbar (Tabelle 9).
Für das Hapten FITC wurden im Mittel dreifach höhere Werte bei FITC-BSA- immunisierten
Tiere im Vergleich zu FITC-NP-BSA-immunisierten Sauen gemessen. Dies könnte bedeuten,
dass das Hapten FITC durch ein gleichzeitig an den Carrier konjugiertes weiteres Hapten
81
(NP) ‚maskiert’ wurde, wie es von SIVOLAPENKO et al. (1996) diskutiert wird. Für NP
scheint es keine Rolle zu spielen, ob ein weiteres Hapten konjugiert ist oder nicht, denn die
NP-Reaktivität in Seren der FITC-NP-BSA Gruppe ist identisch mit der der NP-BSA Gruppe
(Tabelle 11).
Ebenso vergleichbar war die Tendenz zur Bildung von IgG2-Antikörpern gegen BSA, während dies bei Mastschweinen nicht so ausgeprägt war (vgl. Tabelle 6). Dies könnte als Hinweis darauf gewertet werden, dass das Immunsystem tragender Schweine in einer gewissen
Weise polarisiert ist und zur präferentiellen Bildung bestimmter Antikörper-Isotypen führt.
Dies konnte auch für FITC- und NP-spezifische Antikörper beobachtet werden (Tabellen 10
und 11). Waren die in den Seren der Sauen ermittelten ELISA Units auch relativ niedrig, so
konnten in den Kolostren z.T. deutlich (Faktor 10-1000) höhere ELISA Units für Antikörper
gegen die Haptene ermittelt werden (Tabelle 10, Tabelle 11). Interessanterweise stiegen im
Kolostrum ebenfalls die IgG2/IgG1 Verhältnisse. Sie erreichten im Einzelfall bis zu 159 und
waren bei allen Vergleichen mit den Verhältnissen in den Seren sub partu höher als diese.
Dies deutet möglicherweise darauf hin, dass bei der Sau ein präferentieller Transport von
IgG2 Antikörpern vom Plasma in das Kolostrum existiert. In jedem Fall ist er nicht so dominant wie beim Rind wo dezidiert und nahezu selektiv ein IgG-Isotyp (IgG1) im Kolostrum
erscheint und dominiert (BUTLER 1983; BESSER und GAY, 1994).
Zwar gaben bereits BOKHOUT et al. (1986) für das Kolostrum von 10 Sauen einen Anteil
des IgG2 von 75 % am Gesamt-IgG an, doch kann dies zumindest für Antigen-spezifische
IgG2 – wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt - deutlich darüber liegen.
Es sei aber nochmals auf die erhebliche, inter-individuelle Varianz bei den untersuchten Sauen verwiesen. Aus den 7-8 untersuchten Sauen mussten nun Tiere ausgewählt werden, die im
Kolostrum vergleichbare Antikörpergehalte und IgG2/IgG1-Verhältnisse aufwiesen, damit die
nachfolgend immunisierten Ferkel vergleichbar blieben. Dies gelang nur bedingt. So differierten die Größenordnungen der per Kolostrum hypothetisch auf die nachfolgend immunisierten
Ferkel übertragenen Antigen-spezifischen Antikörpermengen (Tabelle 12) als auch die Verhältnisse zwischen den IgG-Isotypen je nach untersuchtem Hapten (siehe z.B. die beiden mit
FITC-BSA-immunisierten Sauen, Tabelle 12).
5.2.3 Ferkel
Die Immunisierung der Ferkel von Hapten-Carrier-immunisierten Sauen sollte letztlich prüfen, ob maternale, über das Kolostrum übertragene Antikörper die Quantität und Qualität der
Ferkel-Immunantwort beeinflussen. Dies bezog sich in dieser Studie nur auf Haptenspezifische Antikörper. Dafür wurden Ferkel mit Hapten-Carrier-Komplexen immunisiert, in
denen ein Carrier verwendet wurde der sich von dem bei der Sauenimmunisierung verwende-
82
ten unterschied. Damit konnten nur Hapten-spezifische maternale Antikörper die Immunantwort der Ferkel beeinflussen.
Ein Weg, diese Beeinflussung zu demonstrieren war die zeitlich unterschiedliche Immunisierung von Ferkeln: Maternale Antikörper im Ferkelplasma haben eine gewisse Halbwertszeit.
Ein hemmender oder fördernder Einfluss auf die eigene, aktive Immunisierung würde demnach immer schwächer, je später ein Ferkel geimpft wird. Um dies zu prüfen wurden die Ferkel in zwei Hauptgruppen geteilt (‚früh’ und ‚spät’), die entweder zu einem recht frühen Zeitpunkt nach Kolostrumaufnahme geimpft wurden (7 Tage p.n.) oder zu einem weiter entfernt
liegenden Zeitpunkt (21 Tage p.n.).
Die Ferkel wurden wurfweise geteilt. Eine andere Form der Einteilung hätte ungleiche Vorraussetzungen geschaffen, denn die in den Ferkelseren gemessenen Antikörperkonzentrationen korrelieren eng mit denen im Kolostrum der entsprechenden Mütter. Neben den SerumReaktivitäten der Sauen war die Wurfgröße ein weiteres Kriterium. Die Würfe wurden je zur
Hälfte einer Immunisierungsgruppe zugeteilt. Um die Fragestellung auch vergleichend beantworten zu können, sollten pro Wurf acht (zweimal vier) Ferkel untersucht werden, in gleicher Zahl aus der jeweiligen Immunisierungsgruppe (FITC-NP-OVA bzw. OVA). Nicht alle
Würfe erfüllten diese Anforderung, bis zum letzten Blutentnahmetag der Ferkel (Tag 42).
Um exemplarisch zu prüfen in welchem Zeitraum und in welchem Umfang irrelevante maternale Antikörper aus der Zirkulation der Ferkel verschwinden, wurden anti-BSA-Antikörper in
den Ferkelseren gemessen. Je nach IgG-Isotyp fielen Sie von Tag 7 bis Tag 21 um 77 % bis
93 % ab (frühe Ferkelgruppe). In der späten Ferkelgruppe blieben die Werte dann auf dem an
Tag 21 ermittelten niedrigen Niveau. Dieses Verhalten erlaubte die Bewertung der antiHapten-Antikörperspiegel.
Die Entwicklung dieser Antikörper verhielt sich sehr heterogen: Antikörper ELISA Units
konnten steigen und z.T. fallen (Tabelle 13, Tabelle 14). Das Fallen der Antikörperspiegel
war jedoch deutlich weniger ausgeprägt als das Fallen der anti-BSA-Antikörper, sodass gefolgert werden kann daß maternale Antikörper der Sau gegen die Haptene, die eigene aktive
Immunantwort der Ferkel nicht oder nur schwach behindert haben. Dies gilt umso mehr, als in
der frühen Ferkelgruppe – also bei Ferkeln in denen man noch höhere maternale Antikörperspiegel erwarten konnte (siehe anti-BSA-Antikörper) – die anti-Hapten-Antikörperspiegel
höher waren als in der spät immunisierten Ferkelgruppe (vgl. Tabelle 13 und Tabelle 14).
Insofern kann hier von einem positiven, unterstützenden Effekt maternaler Antikörper auf die
aktive Immunantwort der Ferkel gesprochen werden.
Ein überraschendes Ergebnis unterstützt diese These: die nur mit OVA immunisierten Ferkel,
sowohl die früh als auch die spät geimpften Tiere, entwickelten nahezu keine Antikörper ge83
gen dieses bei Mastschweinen nachgewiesenermaßen immunogene Protein; Ein Protein, gegen das von der Sau keinerlei maternale Antikörper über das Kolostrum übertragen wurden.
Das Argument, in den beiden Gruppen der Ferkel, die mit FITC-NP-OVA immunisiert wurden, müssten - da sie z.T. von Sauen stammten, die nur mit FITC-BSA immunisiert wurden ebenfalls keine oder deutlich weniger anti-NP-Antikörper nachweisbar sein, stimmt nur eingeschränkt. In diesem Fall richtete sich die aktive Immunantwort der Ferkel gegen ein Epitop
auf einem Antigen, auf dem andere maternale Antikörper (anti-FITC) gleichzeitig ein Epitop
erkannten.
In der Summe stützen diese Befunde die These, dass das Vorhandensein maternaler Antikörper gegen ein oder mehrere Epitope auf einem Antigen die aktive Immunisierung der Ferkel
gegen ebendiese Epitope unterstützen kann.
Dies müsste in der Folge exakter untersucht werden. In der vorliegenden Studie wurde nur
davon ausgegangen, dass die Ferkel gleichmäßig viel der Antikörper über das Kolostrum aufnehmen. Bei Unterschieden in der Aufnahmemenge und der individuell unterschiedlichen
Resorptionsrate könnte es zu erheblichen Differenzen im Plasmagehalt an maternalen Antikörpern gegen einzelne Haptene gekommen sein. So betrug beispielweise die Wurfgröße der
Sau 3992 15 Ferkel und bei der Sau 6722 nur neun Ferkel, was eine geringere Kolostrumaufnahme pro Tier im Wurf der Sau 3992 bedeuten kann.
Zur Beantwortung der Fragestellung wäre es hilfreich gewesen, auch nicht immunisierte Ferkel als Kontrolltiere zu untersuchen. Diese müssten allerdings auch Wurfgeschwister sein,
woraus sich eine weitere praktische Schwierigkeit bezüglich der Wurfgrößen ergeben würde.
Vergleicht man die Immunantwort der mit FITC-NP-OVA immunisierten Ferkel, so fällt auf,
dass ‚früh’ geimpfte Tiere im Mittel höhere Werte für IgG2 ELISA Units aufweisen als IgG1
ELISA-Units. Dies galt für alle Hapten-reaktiven Antikörper (Tabelle 13A, Tabelle 14A).
Dies mag damit zusammenhängen, dass auch im Kolostrum der Sau präferentiell IgG2Antikörper übertragen wurden, welche die Immunantwort der Ferkel in diese Richtung beeinflussen könnten (vgl. Tabelle 13). Es mag so sein, dass IgG2-Antikörper – wenn an das immunisierende Antigen gebunden – nach dualer Interaktion mit B-Zellen über den Antigenrezeptor (Antigenbindung) und Bindung des immunkomplexierten maternalen IgG2Antikörpers an Fcγ-Rezeptoren der B-Zelle eine eher stimulierende und den Wechsel von IgM
zu IgG2 fördernde Wirkung eintritt.
In jedem Fall führt jedoch die Anwesenheit maternaler, Antigen-spezifischer Antikörper des
Isotyps IgG2 nicht zu einer übermäßigen Hemmung der Ferkel-Immunantwort, wie sich auch
aus dem im Vergleich zu BSA-Antikörpern geringeren Anfall der ELISA-Units ablesen läßt.
84
Bei den ‚spät’ geimpften Tieren dominierten im Mittel die IgG1 ELISA Units über die IgG2
ELISA Units. Dies galt insbesondere für die Hapten-reaktiven Antikörper.
Interessanterweise galt dies insbesondere für die Ferkel der Sau 6722, die im Kolostrum ein
sehr ausgewogenes IgG2/IgG1-Verhältnis für anti-FITC-Antikörper von 0,9 aufwies und im
Vergleich aller vier Sauen die höchsten IgG1-ELISA Units für anti-FITC-Antikörper zeigte
(Tabelle 12). Auch dies kann wiederum als Hinweis auf die positive Wirkung maternaler Antikörper für die adaptive Immunantwort von Ferkeln gewertet werden.
Letztlich ist nicht exakt zu differenzieren, welcher Anteil der gemessenen Antikörper im Ferkelserum noch passiv erhaltene, kolostrale Antikörper sind und welcher Anteil aktiv induziert
wurde. Die Messung von anti-BSA-Reaktivitäten im Ferkelserum ließ hier nur teilweise
Rückschlüsse zu (s.o.).
5.3 Das IgG2/IgG1 Verhältnis in der Immunantwort auf HaptenCarrier-Konjugate beim Schwein
Die hier beschriebenen isotypspezifischen Immunantworten auf verschiedene Hapten-CarrierKonjugate wurden bei Schweinen aller Altersgruppen vergleichend gemessen: Ferkel, Mastschweine von der Vormast (Läufer) bis in das Endmastalter sowie bei Sauen unterschiedlichen Alters. Beim Vergleich des IgG2/IgG1-Verhältnisses sind charakteristische Verläufe
gemessen worden, wonach jüngere Schweine eine höhere IgG1 als IgG2 Antwort auf eine
Immunisierung ausbilden, während es bei den. Sauen umgekehrt ist. Dies deckt sich mit den
mehrheitlichen Angaben aus der Literatur (BOKHOUT et al. 1986; FURESZ et al. 1998).
Junge Ferkel bilden mehr IgG1, das Verhältnis liegt bei durchschnittlich 0,47 in Proben von
Tag 42. Zu einem früheren Zeitpunkt überwiegen bei Ferkeln noch IgG2, welche aber noch
passiv aufgenommene maternalen Antikörper repräsentieren. Mit zunehmendem Alter verschiebt sich das Verhältnis.
So zeigen junge, ca. 13 Wochen alte Mastschweine am Tag 28 nach erster Immunisierung im
Durchschnitt ein gleiches Verhältnis dieser beiden Isotypen (Tabellen 6, 7, 8). Im Durchschnitt aller Gruppen liegt das IgG2/IgG1-Verhältnis an Tag 28 bei 1,2±0,5. Ein auffallend
höheres IgG2/IgG1-Verhältnis zeigt sich zu diesem Zeitpunkt in vier von sechs mit 3 µg immunisierten Gruppen, bei der Carrierantwort in der FITC-NP-OVA-Gruppe ebenso wie in der
Antwort auf das Hapten FITC bei beiden Carriern und auf NP in der mit 3 µg immunisierten
FITC-NP-BSA Gruppe.
Am Tag 70 nach erster Immunisierung überwiegt dann die IgG2-Antwort bei immunisierten
Mastschweinen. Lediglich die Carrierantwort in der FITC-NP-BSA-Gruppe mit 30 und 300
µg wurde durch Antigen-spezifische IgG1-Antikörper dominiert. Im Durchschnitt aller im85
munisierter Mastschweinegruppen liegt das IgG2/IgG1-Verhältnis am Tag 70 nach erster
Immunisierung bei 4,3±1,7. Die hier beobachtete Dominanz von IgG2 über IgG1 kann mit
dem verwendeten Antigen (Hapten-Carrier-Konjugat) zusammenhängen. Nach PHV-1 Infektion vakzinierter und nicht vakzinierter, vier Monate alter Schweine ermittelte KIMMAN et
al. (1992) ein IgG2 zu IgG1-Verhältnis von 0,8 (nach Infektion ungeschützter Tiere) bis 1,0
(bei vakzinierten Tieren). Im Serum liegt das Verhältnis Gesamt-IgG2/Gesamt-IgG1 bei etwa
0,8 (bei 44 % IgG2, BOKHOUT et al. 1986).
Nach Angaben der Literatur ist die Bildung eines höheren IgG1-Titers im Rahmen experimenteller Infektionen mit einer höheren Protektion verbunden (KIMMAN et al., 1992;
FURESZ et al., 1998; SERRANO et al., 2001; FRONTERA et al., 2003). Die Bildung von
IgG1 scheint stark von bestimmten Zytokinen gesteuert zu sein. So sind nach Immunisierung
mit Lebendvakzinen stets höhere IgG1-Werte ermittelt worden, was auf die Bedeutung von
pro-inflammatorischen Zytokinen für den Isotyp-switch von IgM zu IgG1 beim Schwein hindeutet. Der niedrige Anteil von IgG1 bei den Sauen in diesem Versuch könnte demnach darauf beruhen, dass relativ wenige pro-inflammatorische Zytokine nach Immunisierung induziert wurden. Dies könnte auch ein Grund für die nicht stattgefundene negative Interferenz
maternaler Antikörper in den Ferkeln darstellen. Die klare Zuordnung von IgG1 zu einem
klassischen TH1 oder TH2-Immunglobulin ist noch fraglich, da bspw. FRONTERA et al.
(2003) das protektive IgG1 nach einer Ascaris suum Infektion einer TH2-Antwort zurechnen,
während nach intranasaler Infektion mit APP 12 Wochen alter Schweine ebenfalls erhöhte
Antigen-spezifische IgG1-Titer mit Protektion korrelierten (FURESZ et al. 1998). In vitro
konnten pro-inflammatorische TH1-Zytokine (IFNγ und IL12) eine IgG2-Antwort steigern. In
einigen Fällen verhielten sich die gemessenen Werte jedoch diametral gegensätzlich
(CRAWLEY u. WILKIE 2003).
Die hier gemessenen Immunantworten der Sauen zeigten eine große Varianz in der Höhe der
gemessenen Antikörpergehalte aber ein gemeinsames Muster der Bildungskinetik. Für die
Isotyp-spezifische Immunreaktion tragender Sauen sind bisher nur wenige Daten veröffentlicht worden. Für die Bildung von IgG geben KLOBASA u. WERHAHN (1984) einen Anstieg bis zur elften Trächtigkeitswoche an, mit einem nachfolgenden Absinken der Serumwerte bis zur Geburt. Diese Verläufe waren in der vorliegenden Untersuchung vergleichbar.
86
6 Zusammenfassung
Maria Gellermann
Immunisierung von Muttersauen mit definierten Hapten-Carrier-Komplexen zur Prüfung des
Konzeptes der Idiotyp-Vakzinierung von Ferkeln nach Kolostrumaufnahme
Die zunehmende Intensivierung der Schweinhaltung hat zu hohen Tierkonzentration und damit zwangsläufig zu günstigen Bedingungen für die Ausbreitung von Infektionskrankheiten
geführt. Für die Bekämpfung vieler Schweinekrankheiten haben Impfungen einen erheblichen
Stellenwert erreicht. Die gezielte Applikation eines Antigens induziert eine Immunreaktion
die bei einer späteren Erregerexposition eine Infektion vermeiden oder wenigsten die klinischen Folgen reduzieren soll. Bei der Impfung von Schweinen ergeben sich besondere Probleme, da sich einige Erreger verlustreicher Erkrankungen direkt nach dem Absetzen in der
vierten bis zehnten Lebenswoche ausbreiten. Da zwischen der Impfung und der Bildung ausreichend hoher Antikörperspiegel in Abhängigkeit vom Antigen zwischen zwei und vier Wochen vergehen können, werden in der Praxis Impfungen vermehrt während der Säugezeit
durchgeführt. Da die Sauenherden mit den in der Herde vorkommenden Erregern ebenfalls
infiziert sind und Antikörper über das Kolostrum an die Ferkel übertragen, haben letztere in
der Regel noch maternale Antikörper gegen die Erreger, gegen die sie während der ersten
Lebenswochen immunisiert werden. Die Bedeutung der Persistenz maternaler Antikörper für
aktive Immunantwort der Ferkel wird kontrovers diskutiert.
Die Diskussion bezieht sich dabei fast ausschließlich auf Impfversuche, bei denen die Qualität
der Immunantwort aus der Menge der Serumantikörper abgeleitet wird. Grundsätzliche Erkenntnisse zu qualitativen Effekten maternaler Antikörper auf die Ferkelimmunität und die
Bedeutung der Hauptisotypen des IgG, IgG1 und IgG2, auf Mechanismen der maternalneonatalen Immunregulation beim Schwein liegen bisher nur wenig vor.
Die vorliegenden Untersuchungen wurden mit dem Ziel durchgeführt, die Immunantwort
nach Vakzination mit Modellantigenen qualitativ darzustellen. Die Modellantigene bestanden
aus Carrierproteinen (bovines Serumalbumin, BSA; Ovalbumin, OVA; Keyhole Limpet hemocyanin, KLH) mit daran gekoppelten Haptenen (Fluoresceinisothiocyanat, FITC; 4hydroxy-3-Nitrophenylsäure, NP). Zur Beantwortung der Fragestellung wurden Mastschweine, Sauen und Ferkel mit verschiedenen Hapten-Carrier-Konjugaten immunisiert und relative
ELISA-Einheiten von IgG, IgG1 und IgG2 im Serum gemessen. Für die Bestimmung relativer
ELISA-Einheiten wurden Seren immunisierter Mastschweine im mittleren Reaktionsbereich
als Referenzseren für alle nachfolgenden Untersuchungen ausgewählt.
Um für die Sauen- und Ferkelimmunisierungen ein passendes Carrierprotein auszuwählen
wurden drei Gruppen von Mastschweinen (n=7) zunächst mit Haptenen, die an 3 verschiedene Carrrierproteine gekoppelt wurden, in 3 Dosisvarianten (3 µg, 30 µg und 300 µg) jeweils
drei Mal immunisiert. Analysiert wurden die Gruppen die mit OVA und BSA als Carrier immunisiert wurden. Für alle Dosierungen konnte eine messbare Immunantwort auf die Hapten87
Carrier-Komplexe nachgewiesen werden. Die Immunantworten zeigten ein Maximum am 49.
Tag nach der Erstimmunisierung; die IgG-Reaktion gegen BSA als Carrier fiel mit 110 relativen ELISA-Einheiten höher aus, als die gegen OVA mit 74 ELISA-Einheiten.
Die Höhe der Antikörperspiegel gegen die gekoppelten Haptene war vom verwendeten Carrierprotein abhängig. So zeigte sich eine höhere Antwort auf NP und ein schnellerer Anstieg
von Antikörpern gegen FITC, wenn diese Haptene an OVA konjugiert waren. Die dominierende Isotypantwort war ebenso vom Carrierprotein abhängig. Gegen den Carrier OVA wurden überwiegend Antikörper des Typs IgG2 gebildet.
Basierend auf dem zeitlichen Verlauf der Antikörperbildung, dem Verhältnis von IgG2/IgG1Antikörpern unter den Hapten-reaktiven Antikörpern und der vergleichbaren Immunantwort
auf 30 µg und 300 µg Hapten-Carrier-Komplex, wurde für die Immunisierung von Sauen und
Ferkeln das BSA (300 µg/Tier) als Carrierprotein gewählt.
Tragende Sauen (n=24; drei Gruppen zu je acht Tieren) wurden mit FITC-BSA, NP-BSA
oder FITC-NP-BSA zu vier Zeitpunkten ante partum immunisiert und Serumproben vorbzw. Serum- und Kolostrumproben sub partu entnommen. Die Seren der Sauen wiesen dominant Hapten- und Carrier-spezifische Antikörper des Isotyps IgG2 auf. Ebenso dominierten in
den Kolostren, bei individuellen Unterschieden, Antigen-spezifische IgG2-Antikörper. Die
mit FITC-BSA-immunisierten Sauen bildeten am Tag 49. p. vacc. mehr Antikörper gegen
FITC (97 Einheiten IgG1, 236 Einheiten IgG2) als die FITC-NP-BSA-immunisierten Sauen
(33 Einheiten IgG1, 65 Einheiten IgG2). Im Kolostrum wies letztere Gruppe aber deutlich
mehr Antikörper gegen NP auf (121 Einheiten IgG1, 2008 Einheiten IgG2) als die Gruppe der
NP-BSA-immunisierten Tiere (24 Einheiten IgG1, 116 Einheiten IgG2).
Die Ferkel von 4 Sauen mit deutlichen Kolostrum- und Serum-Antikörpergehalten wurden je
zur Hälfte eines Wurfes einer Immunisierungsgruppe zugeteilt, die mit FITC-NP-OVA oder
nur mit OVA immunisiert wurden. Um Einflüsse des Alters der Tiere festzustellen wurden die
Ferkel teils ab dem Tag 7 post natum, teils ab dem Tag 28 post natum immunisiert.
Früh immunisierte Tiere zeigten höhere IgG2- als IgG1-Antikörpergehalte gegen die Haptene.
Bei spät immunisierten Ferkeln lag das Verhältnis zugunsten von IgG1-Antikörpern.
Die Anti-Hapten-Antwort der Ferkel (von Sauen mit maternalen Antikörpern gegen das oder
die Haptene) war deutlich stärker als die Antwort gegen ein Carrierprotein (OVA) gegen das
keinen maternalen Antikörper über das Kolostrum übertragen wurden. Die Anti-HaptenAntikörperspiegel in den Seren der Ferkel konnten über die Zeit um etwa 50 % fallen. Der
Abfall kolostral übertragener anti-BSA-Antikörpern lag mit ca. 90 % jedoch deutlich höher.
Damit führen maternal übertragene Antiköper generell nicht zu einer Hemmung der Ferkeleigenen adaptiven Immunantwort.
88
Ob hier Immunmechanismen eine Rolle spielen, die über die duale Erkennung von Antigen
und Antigen-gebundenen Antikörpern eines bestimmten Isotyps (IgG2) über Fc-Rezeptoren
zur Aktivierung von B-Zellen der Ferkel führen, oder ob die Induktion von anti-idiotypischen
und anti-anti-idiotypischen Antikörpern dabei eine Rolle spielte, konnte in der Arbeit nicht
abschließend geklärt werden.
In der Arbeit ist es gelungen ein Modell zur Untersuchung der Carrier- und Haptenspezifischen Immunantwort bei Schweinen zu etablieren, um auf Epitopebene die Isotypspezifische, humorale Immunantwort zu charakterisieren.
Die Ergebnisse der Arbeit belegen, das die Qualität und Quantität einer porzinen Immunantwort sowohl von den Carrierproteinen als auch von den verwendeten Haptenen abhängt und
deuten auf eine z.T. unterstützende, positive Wirkung von maternalen Antikörpern für die
Induktion einer adaptiven Immunantwort bei Ferkeln hin. Dies könnte für zukünftige Vakzine-Entwicklungen eine Rolle spielen und bedeutet nicht zuletzt, dass das Dogma einer nahezu
ausschließlich hemmenden, interferierenden Wirkung maternaler Antikörper auf dem Impferfolg nach Vakzinierungen neu überdacht werden sollte.
89
7 Summary
Maria Gellermann
Immunisation of sows with defined Hapten-Carrier complexes to analyze the idiotype vaccination concept after colostrum uptake by piglets
The increasing intensification of pig keeping has led to high animal concentrations which favour the spreading of infectious diseases. Vaccinations against many pig diseases have gained
enormous relevance.
The specific application of an antigen prior to infection induces an immune response which
avoids an infectious disease after pathogen contact or reduces at least the clinical consequences. Vaccination problems arise since some pathogens of loss-causing diseases spread in
the fourth till tenth life week after weaning. Since the time between vaccination and the generation of sufficient antibody levels can take between two and four weeks, vaccinations are
more and more performed during the suckling time.
Sows are usually also infected by the pathogens, generate antibodies and transfer them into
the colostrum. Thus, piglets which took up colostrum still have maternal antibodies against
the pathogen or vaccine at the time of immunization during their first weeks of life. The significance of persistent maternal antibodies for an active immune response of the piglets is still
a matter of discussions. They are based almost exclusively on investigations in which the
quality of the immune response is derived from the amount of serum antibodies. There is still
a lack of fundamental knowledge about qualitative effects of maternal antibodies for the immunity in piglets and the relevance of the major IgG isotypes (IgG1 and IgG2) for mechanisms of porcine maternal-neonatal immune regulation.
The present study aimed at the demonstration of the immune response after vaccination with
model antigens. The model antigens consisted of carrier proteins (bovine serum albumin,
BSA; ovalbumin, OVA; keyhole limpet hemocyanin, KLH) to which haptens (fluorescein
isothiocyanat, FITC; 4-hydroxy 3-nitrophenyl acetyl, NP) were coupled. Fattening pigs, sows
and piglets were immunized with different hapten carrier conjugates and relative ELISA units
of antigen-specific IgG, IgG1 and IgG2 were determined in the sera. For the determination of
relative ELISA units, sera of immunized porkers with an intermediate reaction were selected
as reference sera for all subsequent measurements.
To select a suitable carrier protein for the immunizations of sows and piglets, porker groups
(n=7 per group) were immunized three times with 3 doses (3 µg, 30 µg and 300 µg) of haptens which were coupled to 3 different carrier proteins. Sera of animals which were immunized with OVA or BSA as carrier were analysed further.
90
For all dosages a measurable immune response could be demonstrated against haptens and
carrier proteins. The responses showed a maximum at day 49 after first immunization. The
reaction against BSA was higher (110 ELISA units) than against OVA (74 ELISA units).
The level of hapten-specific antibodies was dependent on the used carrier protein: e.g. a
higher level of NP-specific antibodies and a faster rise in antibodies against FITC could be
noted when OVA was used as the carrier protein. Also, the dominating isotype response depended on the carrier protein. Antibodies against the carrier OVA were predominantly of the
IgG2 isotype.
Based on the temporal course of antibody formation, the ratio between IgG2 and IgG1 among
the hapten-reactive antibodies and the comparable immune response towards 30 µg and 300
µg of the hapten carrier complex, BSA (300 µg/animal) was chosen as the carrier protein for
the immunization of sows and piglets.
Pregnant sows (n=24, 3 groups with 8 animals each) were immunized with FITC-BSA, NPBSA or FITC-NP-BSA four times ante partum. Serum samples were taken before or sub partu
together with colostrum samples. Although individually different, antigen-specific antibodies
in the sera of sows and in the colostrum samples were predominantly IgG2. Sows immunized
with FITC-BSA produced more FITC-reactive antibodies (97 units IgG1, 236 units IgG2) as
FITC-NP-BSA immunized animals (33 units IgG1, 65 units IgG2). The colostrum samples of
the latter group however contained considerably more NP-specific antibodies (121 units IgG1,
2008 units IgG2) compared to NP-BSA immunized animals (24 units IgG1, 116 units IgG2).
The piglets of 4 sows with reasonable colostrum and serum levels of antibodies against haptens were partly immunized with FITC-NP-OVA or only with OVA. To analyse the influence
of the animal’s age, piglets were partly immunized beginning with day 7 or day 28 post
natum.
Early immunized animals showed up with higher hapten-specific IgG2 levels compared to
IgG1 levels. In contrast, the later immunization of piglets favoured the development of hapten-specific IgG1. The anti-hapten response of piglets with maternal antibodies against haptens was considerably stronger than the response towards OVA (where no maternal antibodies
were transferred via the colostrum). Piglet antibody levels against haptens reamined constant
or declined by 50 % over time. However, the decline of colostrally transferred anti-BSA antibodies (about 90 %) was considerably higher. Hence, maternal antibodies do not generally
inhibit the piglet’s own adaptive immune response.
The positive role of maternal antibodies could be due to the activation of piglet B cells after
antigen receptor engagement and Fc receptor engagement with antigen-bound IgG2. Whether
91
this mechanism or the induction of anti-idiotypic and anti-anti-idiotypic antibodies participates in this phenomenon could not be shown in this study.
In this work, a model system has been established to investigate the carrier- and haptenspecific immune responses in pigs. This permits the characterization of the humoral immune
response at the epitope and immunoglobulin isotype level.
The results obtained so far demonstrate that the quality and quantity of a porcine immune response both depends on the nature of the carrier protein and of the used haptens. Moreover,
they suggest a partially positive or supportive role of antigen-specific maternal antibodies for
the piglets own adaptive immune response. This could be important for future vaccine developments and last but not least suggests that the dogma of a nearly exclusive inhibitory and
negative interfering effect of maternal antibodies should be reconsidered.
92
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110
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel Immunisierung von Muttersauen
mit definierten Hapten-Carrier-Komplexen zur Prüfung des Konzeptes der IdiotypVakzinierung von Ferkeln nach Kolostrumaufnahme selbstständig verfasst habe.
Zur Anfertigung dieser Dissertation wurden folgende Hilfsmittel und Hilfen Dritter in Anspruch genommen:
-
-
Materialien und Geräte wurden von der Arbeitsgruppe Immunologie sowie der
Außenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.
Die ISCOM-Matrices wurden von Prof. Dr. med. vet. Bror Morein, Fa.
ISCONOVA, Universität Uppsala, Schweden, zur Verfügung gestellt.
Die Kopplung der Haptene erfolgte durch Dr. Ralf Lösel, Institut für klinische
Pharmakologie, Klinisch-Medizinische Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg
Ich habe die Dissertation an folgenden wissenschaftlichen Einrichtungen angefertigt:
Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover und Außenstelle für
Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die Dissertation wurde bisher nicht
für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der
Wahrheit entsprechend gemacht habe.
__________________________
(Maria Gellermann)
Wichtenbeck, Februar 2006
111
5
Danksagung
Apl. Prof. Dr. H.-J. Schuberth danke ich für die Überlassung des Themas und die hervorragende Betreuung. Seine Kompetenz und Zuverlässigkeit schlugen während der gesamten Zeit
auf manchen mir bisher unbekannten Pfaden stets humorvoll die Brücke zwischen Labor und
Computer.
PD Dr. E. große Beilage danke ich herzlich für die Initiierung dieser Arbeit und der umfassenden Unterstützung, besonders des klinischen Teils. Ihr unerschütterlicher investigativer
Elan trug mich dynamisch über so manche Durststrecke hinweg. So lösten sich Probleme
manchmal schon vor ihrer Entstehung.
Prof. Dr. W. Leibold danke ich für die Erstellung des Konzepts, für die Bereitstellung eines
Arbeitsplatzes in der AG Immunologie sowie die herzliche Atmosphäre während der Zeit in
Hannover.
Dem Landwirt Thorsten Riggert und Familie, aus Kl. Süstedt, danke ich für die Erlaubnis
zur Durchführung des Versuchs in seinem Sauenbestand.
Ohne die verständnisvolle, monatelange Unterstützung und Bereitstellung von Personal wäre
diese Arbeit nicht zustande gekommen (einschließlich der Hilfe bei Geburtsüberwachungen
und Probenentnahmen auch an Sonn- und Feiertagen sowie nächtlicher Butterbrotspenden
und wirksamer Durchhalteparolen).
Herrn Landwirt Werner Holst und Familie aus Dreilingen, danke ich für die Erlaubnis zur
Versuchsdurchführung in seinem Mastbestand – und für die tatkräftige Unterstützung dabei
bzw. die kulinarische danach.
Von den Mitarbeitern und Angehörigen der AG Immunologie in Hannover wurde mir stets
freundliche Unterstützung in einer hervorragenden Atmosphäre zuteil. Besonders danke ich
Frau Silke Schöneberg und Herrn Udo Rabe für die Einführung in die Geheimnisse des
ELISA und die jederzeit prompte, freundliche und kompetente Hilfestellung in sämtlichen
Belangen der Serologie.
Dr. Hartmut Krollpfeiffer, Uelzen, danke ich für die großzügige Freistellung sowie für Hilfe in der medizinischen Versorgung meiner Probanden.
Meinen Eltern Dorle und Heinrich danke ich von Herzen für ihre Unterstützung.
Meinem Mann Jürgen in Liebe.
5