Aus der Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung des Zentrums
Werbung
Aus der Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung des Zentrums für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover und dem Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Untersuchungen zur Übertragung von Koi-HerpesvirusInfektionen durch symptomlose Carrierfische INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Kirsten Meyer aus Eutin Hannover 2007 Wissenschaftliche Betreuung: A. pl .-Prof. Dr. Dieter Steinhagen Dr. Sven Michael Bergmann 1. Gutachter: A. pl.-Prof. Dr. Dieter Steinhagen 2. Gutachter: PD Dr. Martin Runge Tag der mündlichen Prüfung: 22.05.2007 Die Studie wurde durch die Wirtschaftsgemeinschaft des Zentralverbandes Zoologischer Fachbetriebe, Langen, finanziell unterstützt. Meiner Familie gewidmet Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG...................................................................................... 11 2 LITERATURÜBERSICHT................................................................ 13 2.1 Ätiologie................................................................................................................... 13 2.2 Vorkommen und Verbreitung des Koi Herpesvirus und anderer Herpesviren16 2.3 Wirtsspektrum........................................................................................................ 27 2.4 Epidemiologie ......................................................................................................... 29 2.5 Klinik ....................................................................................................................... 31 2.6 Pathogenese............................................................................................................. 33 2.7 Histologie................................................................................................................. 39 2.8 Immunologie ........................................................................................................... 41 2.9 Diagnose .................................................................................................................. 42 2.10 Differentialdiagnose ............................................................................................... 46 2.11 Bekämpfung und Impfung .................................................................................... 47 3 MATERIAL UND METHODEN....................................................... 51 3.1 Virus ........................................................................................................................ 51 3.1.1 Herkunft................................................................................................................... 51 3.1.2 Zellkultur ................................................................................................................. 51 3.1.3 Virusvermehrung ..................................................................................................... 51 3.1.4 Virustitration............................................................................................................ 52 3.1.5 Inaktivierung............................................................................................................ 52 3.1.6 Virusnachweis.......................................................................................................... 53 3.1.6.1 DNA-Extraktion ............................................................................................... 53 3.1.6.2 Spektroskopische Bestimmung der DNA-Konzentration ................................ 55 3.1.6.3 PCR .................................................................................................................. 56 3.1.6.4 Agarosegelelektrophorese der PCR-Produkte.................................................. 58 3.2 Trypanoplasma borreli ............................................................................................ 59 3.3 Versuchstiere .......................................................................................................... 60 3.3.1 Fische....................................................................................................................... 60 3.3.2 Aufzucht und Haltung.............................................................................................. 61 3.3.3 Handling .................................................................................................................. 61 3.3.4 Narkose und Töten................................................................................................... 61 3.3.5 Organentnahme........................................................................................................ 62 3.3.5.1 Entnahme von Gewebepoolproben .................................................................. 62 3.3.5.2 Entnahme von Kiemenbiopsien ....................................................................... 62 3.3.5.3 Entnahme und Separation von Leukozyten...................................................... 62 3.4 Stressversuche......................................................................................................... 63 3.4.1 Versuchsreihe 1 ....................................................................................................... 65 3.4.2 Versuchsreihe 2 ....................................................................................................... 65 3.4.3 Versuchsreihe 3 ....................................................................................................... 65 3.5 Untersuchung zum Wirtsspektrum des KHV ..................................................... 66 3.5.1 Untersuchung der Empfänglichkeit von Graskarpfen und Schleien für das KHV und der Rolle als Überträger........................................................................................... 66 3.5.2 Untersuchung der Rolle von Goldfischen und Silberkarpfen als symptomlose Überträger des KHV ................................................................................................ 67 3.6 Versuche zur Vakzinierung................................................................................... 67 3.6.1 Impfversuch 1 .......................................................................................................... 68 3.6.2 Impfversuch 2 .......................................................................................................... 68 3.6.3 Impfversuch 3 .......................................................................................................... 69 3.7 Validierung der PCR-gestützten Nachweismethode........................................... 70 4 ERGEBNISSE...................................................................................... 71 4.1 Validierung der PCR-gestützten Nachweismethode........................................... 71 4.2 Stressversuch .......................................................................................................... 77 4.2.1 Versuchsreihe 1 ....................................................................................................... 77 4.2.2 Versuchsreihe 2 ....................................................................................................... 78 4.2.3 Versuchsreihe 3 ....................................................................................................... 79 4.3 Untersuchung zum Wirtsspektrum des KHV ..................................................... 83 4.3.1 Untersuchung der Empfänglichkeit von Graskarpfen und Schleien für das KHV und ihrer Rolle als Überträger ........................................................................................ 83 4.2.2 Untersuchung der Rolle von Goldfischen und Silberkarpfen als symptomlose Überträger des KHV ................................................................................................ 84 4.4 Versuche zur Vakzinierung................................................................................... 85 4.4.1 Impfversuch 1 .......................................................................................................... 85 4.4.2 Impfversuch 2 .......................................................................................................... 86 4.4.3 Impfversuch 3 .......................................................................................................... 86 5 DISKUSSION....................................................................................... 90 5.1 Validierung der PCR-gestützten Nachweismethode........................................... 91 5.2 Stressversuch .......................................................................................................... 96 5.3 Untersuchung zum Wirtsspektrum des KHV ................................................... 102 5.4 Versuche zur Vakzinierung................................................................................. 105 6 ZUSAMMENFASSUNG................................................................... 108 7 SUMMARY ........................................................................................ 110 8 LITERATURVERZEICHNIS ......................................................... 112 9 DANKSAGUNG ................................................................................ 131 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS A. dest. Aqua destillatum °C Grad Celsius bp Basenpaare bzw. beziehungsweise ca. circa CCB common carp brain Zelllinie CCG common carp gill Zelllinie CCV channel catfish virus cm Zentimeter CPE cytopathogener Effekt CyHV-1 cyprinides Herpesvirus-1, Herpesvirus cyprini, Virus der Karpfenpocken CyHV-2 cyprinides Herpesvirus-2, Virus der hämatopoetischen Nekrose der Goldfische CyHV-3 cyprinides Herpesvirus-3, Koi Herpesvirus DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat EBV Epstein-Barr-Virus, Virus des Pfeifferschen Drüsenfiebers EDTA Ethylendiamintetraacetat EHV-1 equines Herpesvirus-1 EK-1 eel kidney-1 Zelllinie EPC epithelioma papulosum cyprini, Karpfenepithelzelllinie FHM fatheadminnow, Zelllinie der Dickkopfelritze HCL Hydrogenchlorid HHV-6 humanes Herpesvirus-6, Virus des Dreitagefiebers HSV-1 Herpes simplex Virus-1 HVA Herpesvirus anguillae IcHV-1 ictalurid herpesvirus-1, CCV IE internationale Einheiten i.p. intraperitoneal kbp Kilobasenpaare KF-1 Koi-Flossen-1-Zelllinie KHV Koi Herpesvirus KID50 Zellkultur-infektiöse Dosen l Liter M Mol min Minuten mg Milligramm MgCl2 Magnesiumchlorid MgSO4 Magnesiumsulfat ml Milliliter mM millimolar mRNA messenger ribonucleic acid, Überbringer-Ribonukleinsäure NaCl Natriumchlorid NeVTA Nerkavirus des Towada lake nm Nanometer OD optische Dichte OMV Oncorhynchus masou virus, Herpesvirus des Kirschenlachses PBS phosphate buffered saline (Phosphatpuffer) PCR Polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) p. i. nach der Infektion, post infectionem pmol Pikomol RNA ribonucleic acid, Ribonukleinsäure RTG-2 rainbow trout gonad-2-Zelllinie s Sekunden SHV steelhead virus, Herpesvirus der anadromen Regenbogenforelle SPF spezifisch-pathogen-frei TBE Trisborsäureethylendiamintetraacetat Tris Trishydroxymethylaminomethanpuffer u und U Unit UV Ultraviolett µg Mikrogramm µl Mikroliter µWs Mikrowattsekunde YTV Yamame Tumor Virus, onkogenes Herpesvirus des Kirschenlachses Einleitung 1 EINLEITUNG Die Koi-Herpesvirusinfektion zählt derzeit weltweit zu den wirtschaftlich bedeutendsten Infektionskrankheiten der Cypriniden. Infektionen mit dem Koi Herpesvirus (KHV) haben in den letzten Jahren bei Koi und Speisekarpfen wiederholt zu schweren Erkrankungen mit Mortalitäten zwischen 80 und 100% geführt (WALSTER 1999, BRETZINGER et al. 1999). Das Koi Herpesvirus stellt zunehmend einen Risikofaktor für die Nutz- und Wildkarpfenbestände dar. Es wurde in der Vergangenheit häufig durch Carrierfische, die als solche nicht erkannt wurden, in Bestände eingeschleppt (WALSTER 1999). Die Erkrankung äußert sich in Kiemen- und Nierenschäden, Verlust der Schleimhaut und zentralnervösen Störungen (WALSTER 1999). Sie tritt bei Temperaturen zwischen 16 und 28°C auf. Bei Temperaturveränderungen in den nicht permissiven Bereich wird der Verlauf der Erkrankung abgeschwächt, es überleben zahlreiche infizierte Fische als vermutliche Virusträger. In einigen Erzeugerländern von Koi sind viele Zuchtanlagen mit dem Virus durchseucht, so dass während der Aufzucht ein Kontakt mit dem KHV unvermeidbar ist. In einigen dieser Länder wird zur Herstellung ,,natürlich immuner Fische“ eine kontrollierte Durchseuchung angewendet, wobei junge Koi durch Kohabitation mit infizierten Koi angesteckt werden und eine Abschwächung des Krankheitsverlaufes durch eine Temperaturerhöhung erreicht wird. Bei Carrierfischen kann das KHV nach Abklingen der Krankheitssymptome mit den bisher gängigen Methoden nur selten nachgewiesen werden. Herpesviren etablieren häufig eine Latenz in ihrem Wirt (FRASER et al. 1981, ROCK u. FRASER 1983). Die virale Genexpression ist in diesem latenten Stadium stark heruntergeregelt (GALLOWAY et al. 1982), was den Nachweis des latenten Herpesvirus erheblich erschweren kann. Es ist wahrscheinlich, dass sich das KHV im Carrierfisch - wie es von anderen Herpesviren der Menschen und Tiere inklusive der Fische bekannt ist (ROIZMANN 1996)- nach belastenden Situationen, wie einem Transport, der Winterung oder der Infektion mit zusätzlichen Krankheitserregern erneut vermehrt und als infektionsfähiges Virus ausgeschieden wird. Werden diese Carrierfische in Teiche eingesetzt, in denen sich Fische befinden, die noch keinen Kontakt mit dem Virus hatten, besteht die Gefahr, dass die naiven Fische erkranken und im Verlauf der Erkrankung verenden. Da die Koi Herpesvirusinfektion erst seit ca. zehn Jahren bekannt ist (ARIAV et al. 1999), ist eine Aussage über die Dauer der Persistenz des Virus und die Dauer der Ausscheidung von infektiösem Virus schwierig. Ob durch Karpfen 11 Einleitung nach überstandener Infektion mit dem KHV eine Gefährdung für gesunde Karpfenbestände auch dann ausgeht, wenn bei diesen Fischen das Virus nicht mehr nachgewiesen werden kann, soll in dieser Dissertation untersucht werden. Dazu erfolgt eine Belastung symptomloser, durchseuchter Karpfen mit verschiedenen Stressoren, wie einem simulierten Transport, einem simulierten Abfischen, einer kortikosteroidinduzierten Immunsuppression und einer Exposition mit einem zusätzlichen Krankheitserreger, dem Blutparasiten Trypanoplasma borreli. Die Untersuchung der Ausscheidung von infektionsfähigem Virus wird durch Infektionsversuche vorgenommen. Carrierfische sollen dem KHV reexponiert werden, um zu prüfen, ob es bei ihnen zu einer erneuten Infektion verbunden mit dem Ausscheiden von Virus kommen kann, ohne dass Krankheitssymptome sichtbar werden. Zur Erkennung weiterer Risikofaktoren für die Verschleppung des Virus durch symptomlose Carrierfische soll die Empfänglichkeit verschiedener anderer Fischspezies für das KHV geprüft werden. Zusätzlich sollen Vakzinationsversuche mit einem inaktivierten Impfstoff an Karpfen durchgeführt werden. Da derzeit in den Untersuchungseinrichtungen keine einheitliche PCR-Methode verwendet wird, soll geprüft werden, ob eine Vergleichbarkeit von mit verschiedenen PCR-Methoden gewonnenen Untersuchungsergebnissen gegeben ist. Die Ergebnisse, die Gewebeproben von KHV-infizierten Fischen bei Verwendung unterschiedlicher DNA-Extraktionsverfahren, Primer und Polymerasen liefern, sollen miteinander verglichen werden. 12 Literaturübersicht 2 2.1 LITERATURÜBERSICHT Ätiologie Das Koi Herpesvirus (KHV) gehört der Familie der Herpesviridae an. Die Zuordnung zu der Familie der Herpesviridae erfolgte anfangs anhand der Virusmorphologie. Seit 1980 wurden die Herpesviren aufgrund ihrer Biologie in vier Unterfamilien eingeteilt, die Alpha-, Beta- und Gammaherpesvirinae und die „nicht klassifizierten Herpesvirinae“. In letztgenannter Subfamilie wurden die Herpesviren zusammengefaßt, die noch nicht so weit charakterisiert waren, dass sie in eine der anderen Subfamilien eingeordnet werden konnten. Zu den Alphaherpesvirinae gehören die menschlichen Herpes-Simplex-Viren, das VarizellaZoster-Virus und das Virus der equinen Rhinopneumonitis, der bovinen infektiösen Rhinotracheitis, pustulösen Vulvovaginitis und Balanoposthitis sowie das Aujetzky-Virus. Sie lassen sich in Zellkulturen unter Ausbildung eines CPE anzüchten. Das Wirtsspektrum variiert von breit bis eng. Affinitäten bestehen zu Respirations- und Genitaltrakt, Zentralnervensystem und Haut (ROLLE u. MAYR 1993). Obwohl bei Alphaherpesviren die Latenz hauptsächlich in den ganglionären Neuronen etabliert wird, treten latente oder persistierende Infektionen auch in anderen Geweben wie Tonsillen, Lymphknoten, Milz und peripheren Blutzellen auf (JONES et al. 2006). Die Betaherpesvirinae umfassen die Zytomegalie-Viren der Säuger. In Zellkultur entwickeln sie einen langsam fortschreitenden CPE. Das Wirtsspektrum ist in der Regel auf eine Spezies beschränkt, die Organmanifestation variabel. Häufig lösen sie Allgemeinerkrankungen mit besonderer Beteiligung von Niere und Leber aus. Latente Infektionen werden in Speicheldrüsen, Lymphgewebe, Zentralnervensystem und Niere etabliert (ROLLE u. MAYR 1993). Die Gammaherpesvirinae, zu denen das menschliche Epstein-Barr-Virus, der Erreger des Pfeifferschen Drüsenfiebers, und das Virus der Marekschen Krankheit der Hühner gehört, lassen sich in Lymphozytenkulturen oder Monolayern bestimmter Gewebe der jeweiligen Wirtsspezies züchten. Die Virusvermehrung geht nicht regelmäßig mit einem CPE einher. Das Wirtsspektrum beschränkt sich in der Regel auf eine Spezies. Es besteht eine Affinität für 13 Literaturübersicht B- und T-Lymphozyten. Dort und in anderen lymphatischen Geweben persistiert das Virus mit keiner oder minimaler Expression des Genoms (ROLLE u. MAYR 1993). Mittlerweile sind viele vollständige Genomsequenzen und Teilsequenzen der Herpesviren bekannt (MC GEOCH et al. 2006). Dabei fiel anhand von zur Untersuchung von phylogenetischen und taxonomischen Verwandtschaften zwischen Herpesviren der Säugetiere und Vögel und für die Zuordnung von neu charakterisierten Viren in die Familie der Herpesviren durchgeführten Sequenzvergleichen auf, dass die Herpesviren der Säugetiere und Vögel von einem gemeinsamen Ursprung abzustammen scheinen. Die Herpesviren der Säugetiere findet man in allen drei Subfamilien, während die charakterisierten Herpesviren der Vögel und Reptilien nur in der Subfamilie der Alphaherpesvirinae zu finden sind. Die Herpesviren der Fische und Amphibien dagegen scheinen nicht mit den Herpesviren der Säugetiere, Vögel und Reptilien verwandt zu sein, sie bilden eine eigene Gruppe. Ähnlich verhält es sich mit den Herpesviren der Wirbellosen, die mit keiner der genannten Gruppen verwandt zu sein scheinen (DAVISON 2002). MC GEOCH et al. (2006) schlugen deshalb eine neue Taxonomie der Herpesviren vor. Die Zugehörigkeit zu den Herpesviridae erhalten nur noch die Herpesviren der Säugetiere, Vögel und Reptilien. Diese werden weiterhin in die Alpha-, Beta- oder Gammaherpesvirinae eingeteilt. Die Familie der Herpesviren der Fische und Amphibien wird als Alloherpesviridae bezeichnet, die der Wirbellosen als Malacoherpesviridae. Diese drei Familien werden in der Ordnung der Herpesvirales zusammengefasst. Das Koi Herpesvirus wurde nach dem Wirt der Erstisolation benannt. Bei systematischer Einordnung handelt es sich um das cyprinide Herpesvirus-3 (CyHV-3, WALTZEK et al. 2005). Nach den Krankheitserscheinungen wird es als ,,carp nephritis and gill necrosis virus“ (Ronen et al. 2003) bezeichnet. Im Kern des 100-110 nm im Durchmesser großen Nukleokapsids liegt das sich aus 277 kbp zusammensetzende Genom. Reife Virionen besitzen eine lockere Hülle aus einer Lipoproteindoppelmembran, die ihnen eine Größe von 170-230 nm im Durchmesser verleiht (POKOROVA et al. 2005). Vor der Entdeckung des KHV sind bereits zwei Herpesvirusinfektionen der Cypriniden beschrieben worden. Die seit dem Mittelalter bekannten Karpfenpocken werden durch das 14 Literaturübersicht erste cyprinide Herpesvirus (CyHV-1) hervorgerufen. Eine Herpesvirusinfektion bei Goldfischen, das Virus der hämatopoetischen Nekrose der Goldfische, stellt das zweite cyprinide Herpesvirus (CyHV-2) dar (WALTZEK et al. 2005) Das am gründlichsten erforschte Herpesvirus der Fische, das erste Herpesvirus der Ictaluridae (IcHV-1), kommt beim getüpfelten Gabelwels vor (DAVISON 2002). Das KHV besteht aus 31 viralen Polypeptiden, von denen zwölf ähnliche Molekulargewichte wie das CyHV-1 haben und zehn denen des IcHV-1 ähneln (GILAD et al. 2002). Einige der bereits identifizierten putativen Gene zeigen eine signifikante Homologie zu Genen des IcHV-1 und denen anderer Herpesviren (WAY et al. 2004). Das KHV ist eng mit dem CyHV-1 und -2 verwandt, zu deren Nukleotiden es eine 80%-ige Homologie aufweist, und etwas entfernter mit dem IcHV-1 und anderen Herpesviren von Nichtcypriniden und Fröschen (WALTZEK et al. 2005). Es unterscheidet sich in Klinik, Wirtsspektrum, Antigen- und Wachstumseigenschaften sowie im Typ des in der Zellkultur auftretenden CPE von diesen Herpesviren (HEDRICK et al. 2005). Vier komplette Gene von substantieller Größe sind in Herpesviren der niederen Vertebraten konserviert (WALTZEK et al. 2005). Die zur Zeit gängige Einordnung von Viren in die Familie der Herpesviren basiert auf der Anwesenheit einer linearen, doppelsträngigen DNA in einem ikosaedrischen Kapsid, das von einer Proteinhülle und einer vom Wirt gebildeten Lipidhülle umgeben ist (MINSON et al. 2000). Die Tatsache, dass das KHV ein für ein Herpesvirus sehr großes Genom besitzt, wurde mehrfach als Grund diskutiert, dieses Virus trotz seiner Morphologie nicht den Herpesviridae zuzuordnen (RONEN et al. 2003). Die Herpesviren der Cypriniden besitzen das größte Genom in der Familie der Herpesviridae, beispielsweise ist das Genom des CyHV-1 295 kbp groß. Die Genomgröße wird jedoch nicht als Kriterium zum Ein- oder Ausschluß in eine Virusfamilie angesehen (MINSON et al. 2000). 15 Literaturübersicht 2.2 Vorkommen und Verbreitung des Koi Herpesvirus und anderer Herpesviren Momentan stellt das Koi Herpesvirus eine der größten Gefahren der Karpfenaquakultur dar. Die durch das KHV hervorgerufene Krankheit wurde 1998 nach unkontrollierten Einfuhren von Koi aus Europa in Israel und den USA sowohl bei Koi, der farbigen Fariante des Karpfen, als auch bei gewöhnlichen Karpfen, das erste Mal diagnostiziert (ARIAV et al. 1999). In einigen Ländern breitete sich das KHV durch intensiven Fischverkehr rasant aus, so waren zum Beispiel bis Ende 2000 bis zu 90% der israelischen Fischfarmen infiziert. Der israelischen Aquakultur entstanden jährliche Verluste von 300 Millionen US $ (PERELBERG et al. 2003). BLOOM (1998), WALSTER (1999), BRETZINGER et al. (1999) und HOFFMANN (2001) vermuteten, dass die Erkrankung bereits seit einigen Jahren bei Koi auftrat. Mittlerweile ist das KHV weltweit verbreitet, Krankheitsausbrüche wurden beispielsweise in Deutschland, Österreich, Belgien, Dänemark, Frankreich, Italien, den Niederlanden, der Schweiz, dem Vereinigten Königreich, Polen, Indonesien, Japan, Südafrika, Taiwan, den USA und Thailand beobachtet (HAENEN et al. 2004). Histologische (ARIAV et al. 1999), elektronenmikroskopische (BRETZINGER et al. 1999) und virologische Befunde (HEDRICK et al. 2000) zeigten, dass es sich bei dem Erreger um ein bisher noch unbekanntes Herpesvirus handelt. Die Erstisolation erfolgte 1998 in den USA durch HEDRICK und Mitarbeiter. Ein molekularer Vergleich von sechs verschiedenen KHVIsolaten offenbarte eine starke Übereinstimmung. Deshalb wurde angenommen, dass es sich um die rapide Verbreitung eines einzigen Virusisolates handelte (GILAD et al. 2003). STHILAIRE et al. (2005) wiesen nach, dass das KHV eine Latenz etablieren kann, in der die Nachweisbarkeit nicht gegeben ist, und das KHV deshalb durch den unreglementierten Handel mit lebenden, symptomlosen Fischen so rasant verbreitet werden konnte. Der Name der Virusfamilie, der das KHV zugeordnet wird, wurde von ,,herpein“, dem griechischen Ausdruck für kriechen abgeleitet, nachdem man erkannt hatte, dass die durch das Herpes simplex-Virus ausgelösten Herpesbläschen immer wiederkehren können (ROLLE u. MAYR 1993). Gemeinsame Merkmale vermutlich aller Herpesviren sind die lebenslange Persistenz im Organismus, die Latenz (FRASER et al. 1981, ROCK u. FRASER 1983, DAVISON 2002) und wiederkehrende Erkrankungen (KIRCHNER 1982). 16 Literaturübersicht Das Genom der Viren kann in das Zellgenom bestimmter Zellen integrieren. Diese okkulten Infektionen lassen sich durch Stressoren oder eine Immunsuppression aktivieren, das Provirus wird erneut exprimiert (ROLLE u. MAYR 1993). Herpesviren konnten von fast allen diesbezüglich untersuchten Tierarten als Erreger sowohl seuchenhafter Krankheiten als auch latenter Infektionen isoliert werden. Die Vielzahl der Virusarten mit über 100 Spezies macht die Familie der Herpesviren zu einer der zahlenmäßig größten im System der Viren. Nur der betriebene Aufwand der Suche nach Herpesviren und der Stand der Technik scheint die Zahl der bekannten Spezies zu begrenzen. Auffällig ist die Vielfalt der von den verschiedenen Herpesviren bevorzugt befallenen Zell- und Organsystemen und der resultierenden Krankheitsbilder. Neben Haut und Schleimhäuten von Respirations- und Genitaltrakt sind häufig Nieren und Zentralnervensystem, lymphatische Organe und Immunzellen betroffen. Folgen sind Allgemeinerkrankungen, Aborte, Tumor- und Autoimmunkrankheiten (ROLLE u. MAYR 1993). Herpesviren stellen einen spektakulären evolutionären Erfolg dar. Jedes Herpesvirus ist eng mit einer einzigen Wirtsspezies verbunden, an die es sehr gut adaptiert ist. In immunkompetenten Individuen werden selten schwere Krankheiten ausgelöst. Einzelne hochpathogene Exemplare der Menschen und Nutztiere sind das Resultat eines durch menschliche Aktivität gestörten ökologischen Gleichgewichtes (DAVISON 2002). Herpesviren sind die am häufigsten vorkommenden DNA-Viren bei den Knochenfischen (HEDRICK et al. 1990). Nur ein kleiner Teil dieser Herpesviren löst ernsthafte Erkrankungen aus (WOLF 1988). Bei den papillomatösen, ulzerativen, hyper- oder neoplastischen Hautveränderungen, die häufig im Verlauf von Herpesvirusinfektionen der Fische auftreten (HEDRICK u. SANO 1989), könnte es sich um Zeichen einer Virusreaktivierung handeln (KIMURA et al. 1981b). Herpesviren konnten bei Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss), Haken- bzw. Nerkalachs (Oncorhynchus nerka), Kirschenlachs (Oncorhynchus masou), Coholachs (Oncorhynchus kisutch), getüpfeltem Gabelwels (Ictalurus punctatus), schwarzem Katzenwels (Ictalurus melas), Karpfen (Cyprinus carpio L.), Goldfisch (Carassius auratus), amerikanischem Zander (Stizostedion vitreum), europäischem Aal (Anguilla anguilla), japanischem Aal 17 Literaturübersicht (Anguilla japonica) und weißem Stör (Acipenser transmontanus) durch Virusisolation nachgewiesen werden (ROBERTS 2001). Ein Nachweis durch elektronenmikroskopische Untersuchungen konnte bei Karpfen, Goldorfe (Leuciscus idus), pazifischen Kabeljau (Gadus macrocephalus), Hecht (Esox lucius), Steinbutt (Scophthalmus maximum L), Waller (Silurus glanis), Katzenhai (Mustelus canis), Stint (Osmerus eperlanus), Seeforelle (Salvelinus namaycush), atlantischem Lachs (Salmo salar), Altumskalar (Pterophyllum altum), japanischer Flunder (Paralichthys olivaceus) und Sardine (Sardinops sagax) geführt werden (ROBERTS 2001). Durch Herpesviren hervorgerufene systemische Erkrankungen wie beim KHV treten bei getüpfeltem Gabelwels, Goldfisch, Salmoniden, Aal, Sardine und Steinbutt auf (ROBERTS 2001). Die Herpesvirusinfektion des getüpfelten Gabelwelses, das „channel catfish virus“ (CCV), tritt vor allem in südamerikanischen Aquakulturen auf. Das CCV verursacht bei Jungfischen innerhalb eines Temperaturfensters von 22-30°C Erkrankungen, die häufig mit Stresssituationen assoziiert sind (PLUMB 1978, GRAY et al. 1999). Die Übertragung erfolgt horizontal und vertikal. Überlebende Gabelwelse bleiben lebenslang Virusträger und – ausscheider. Wie beim KHV ist die Mortalität stark von der Wassertemperatur abhängig. Bei 28°C kann sie bis 100% betragen, bei 19°C wurde eine Mortalität von 24% beobachtet (PLUMB 1973). Erkrankte Fische zeigen Exophthalmus, Orientierungslosigkeit, Apathie und Aszites. Durch hämorrhagische Diathesen in Haut, Flossenansätzen, Serosen, Organen und Muskulatur resultiert häufig eine Anämie. Vor allem in Kopfniere, Milz, Gastrointestinaltrakt, Skelettmuskulatur, Pankreas, Nervengewebe, dem exkretorischen Nierengewebe und Leber, wo massenhaft Viruspartikel nachgewiesen wurden, treten Nekrosen auf. Es kommt zu Elektrolytdysfunktionen und nichteitrigen Enzephalitiden (GRAY et al. 1999a). Bei experimenteller Infektion über das Bad erwies sich drei bis acht Tage alte Welsbrut am resistentesten, danach nahm die Empfänglichkeit zu. Eine schützende Immunität nach dem Überleben einer Infektion erwarb die Brut erst ab einem Alter von 60 Tagen (HANSON et al. 2004). Das CCV tritt durch Kieme oder Darm in den Körper ein und konzentriert sich in Darm, Leber und Niere (PLUMB 1971, NUSBAUM u. GRIZZLE 1987, HEDRICK et al. 1987b). 18 Literaturübersicht KANCHARLA u. HANSON (1996) fanden infektiöses CCV einen Tag nach einer Infektion über das Bad in Kieme, Haut, Vorderniere und Darm. Am zweiten Tag p. i. war es auch in Leber und Milz nachweisbar. Der Virusgehalt der Organe war am dritten Tag am höchsten. Vom zweiten bis vierten Tag befand sich infektiöses Virus im Haltungswasser. CCV-DNA lag während des zwölf Tage dauernden Experimentes im Haltungswasser vor. Nach experimenteller Infektion von Welsbrut über eine Immersion tritt das CCV über die Kieme in den Körper ein und verteilt sich sehr schnell im Körper. Infektiöses Virus und virale DNA kann 24 Stunden p.i. in vielen Geweben, wie Haut, Niere, Leber, Darm und Milz nachgewiesen werden (NUSBAUM u. GRIZZLE 1987). STINGLEY et al. (2003) wiesen eine während der ersten Tage p. i. stattfindende Vermehrung des CCV in Blut, Gehirn, Niere und Leber nach. 24 Tage p.i. konnten sie keine Anhaltspunkte für eine stattfindende Virusvermehrung mehr erhalten. Während bei klinisch erkrankten Gabelwelsen die Isolation des Virus anders als beim KHV nicht schwierig ist, konnte bis 1981 das Virus nicht aus symptomlosen Fischen isoliert werden. Bis dahin wurde der Antikörpernachweis zur Detektion von CCV-exponierten Fischen genutzt. Bei einer drei Wochen vor der Fortpflanzungszeit erfolgten kortikosteroidinduzierten Immunsuppression konnten adulte Virusträger durch einen Immunfluoreszenztest erkannt werden (PLUMB et al. 1981). Dies war der erste Hinweis auf das Vorliegen von CCV-Antigenen in Geweben adulter Welse. 1996 entwickelten BEAK u. BOYLE eine Polymerasekettenreaktion (PCR)-gestützte Nachweismethode zur Detektion von latentem CCV aus Blutproben adulter, symptomloser Welse. GRAY et al. (1999b) gelang bei experimentell mit CCV infizierten Welsen 140 Tage p.i. der Nachweis von CCV-DNA in Blut, Gehirn, Darm, Niere, Leber und peripheren Blutleukozyten. Die Autoren vermuteten, dass das CCV eine latente Infektion in Lymphozyten etablieren kann. Infektiöses CCV konnte aus Leukozyten symptomloser adulter Welse, die mit Dexamethason immunsupprimiert wurden, kultiviert werden. Die immunsupprimierten Fische hatten keine detektierbaren Antikörper gegen das CCV (BOWSER et al. 1985). WISE et al. (1985) detektierten in einer Welspopulation ohne CCV-Vorgeschichte in der Leber von jedem der untersuchten 22 symptomlosen adulten Fische CCV-Nukleinsäuren. Bei der Untersuchung eines zweiten Bestandes, der sich aus Überlebenden eines fünf Jahre zuvor aufgetretenen CCV-Ausbruches 19 Literaturübersicht zusammensetzte, konnte bei elf von 14 Welsen CCV-DNA mit unterschiedlicher Gewebeverteilung gefunden werden. Basierend auf vorigen Untersuchungen an Herpesviren würde man erwarten, latentes Herpesvirus im Nervengewebe zu finden (BASTIAN et al. 1972, FRASER et al. 1981, ROCK u. FRASER 1983). Der Nachweis von CCV-DNA gelang hier aber nur unregelmäßig. Während man den Nachweis von latentem CCV in den Organen so erklären kann, dass das Virus dort nicht in dem Organ per se auftritt, sondern in dem peripheren Nervensystem, durch das das Organ innerviert wird, fehlt eine Erklärung für den Fund von CCV-DNA in roten Blutkörperchen (WISE et al. 1985). DAVIS et al. (2002) untersuchten den Effekt von haltungsbedingtem Stress auf die Empfänglichkeit der Welse für eine Infektion mit dem CCV. Die Mortalität hing von der Infektionsdosis ab, ein Effekt eines vorausgehenden Crowding-Stresses konnte nicht beobachtet werden. Das Fehlen eines Effektes erklären DAVIS und Mitarbeiter mit einem Schutz durch ein induzierbares System, das durch den Stressor nicht beeinflusst wurde, oder damit, dass die letalen Wirkungen des Virus zu schnell voranschritten, um von dem Stressor beeinflusst werden zu können. Ebensowenig konnte eine Fütterung von 100 bzw. 200 mg Kortison/kg Futter die Mortalität einer experimentellen CCV-Infektion nicht beeinflussen (DAVIS et al. 2003). THOMPSON et al. (2005) stellten fest, dass latentes CCV von infizierten Elterntieren vertikal auf den Nachwuchs übertragen wird und subklinische Übertragungen des CCV vorkommen. BIRD et al. (1988) folgerten daraus, dass sie CCV-RNA in Gewebe von latent infizierten Welsen nachweisen konnten, dass das CCV Genom während der Latenz transkribiert wird. Bei Goldfischen traten seit 1992 in Japan Epizootien mit hohen Mortalitäten auf (JUNG u. MIYAZAKI 1995). Das verursachende Herpesvirus wurde als Virus der hämatopoetischen Nekrose der Goldfische bezeichnet, es handelte sich um das zweite beschriebene Herpesvirus der Cypriniden (CyHV-2). Auch in Australien, Taiwan und den USA kam es zu Ausbrüchen (STEPHENS et al. 2004). Erkrankte Goldfische zeigten Apathie, Aszites, Spleno- und Nephromegalie. Krankheitsausbrüche wurden wie beim KHV bei Fischen aller Altersklassen bei Temperaturen zwischen 15 und 25 °C beobachtet. Die Mortalität ist in der Regel hoch (JUNG u. MIYAZAKI 1995). STEPHENS et al. (2004) und JUNG u. MIYAZAKI (1995) berichteten von Nekrosen des hämatopoetischen Gewebes der Milz und der ortsansässigen 20 Literaturübersicht Lymphozyten, des Thymus und der Niere, in Pankreas und Darmschleimhaut sowie Hyperplasien, Hypertrophien und vereinzelten Nekrosen des Kiemenepithels. Zusätzlich traten fokale Hyperplasien des Epithels der Haut mit Verlust der Schleimzellen auf. Die Nekrosen des hämatopoetischen Gewebes lagen regelmäßig vor, während Haut, Kieme und Darm nicht regelmäßig affektiert waren. Die Haut- und Kiemenveränderungen ähnelten denen, die bei der KHV-Infektion zu Tage treten. Auch bei dem CyHV-2 geht man davon aus, dass es latente Infektionen ausbildet und es nach Stresssituationen zu Ausbrüchen kommt (STEPHENS et al. 2004). Das CyHV-2 erwies sich als apathogen für Karpfen (JUNG u. MIYAZAKI 1995). Es zeigte bezüglich der Vermehrungsfähigkeit und des Wachstums in der Zellkultur Ähnlichkeiten mit dem CyHV-1. 2006 wurde von GOODWIN et al. eine quantitative PCR-Methode zur Detektion des CyHV-2 beschrieben, das bis dahin lediglich durch histologische und elektronenmikroskopische Untersuchungen diagnostiziert wurde. Das CyHV-2 läßt sich zwar isolieren, stellt sein Wachstum aber nach der vierten Passage in vitro ein (JUNG u. MIYAZAKI 1995). Bei symptomlosen, infizierten Goldfischen schwankte die Menge an viraler DNA, die die Fische latent in sich trugen, erheblich. Die größte Menge viraler DNA wurde in Milz und Niere nachgewiesen. Häufig lag virale DNA in Leber, Gonaden, Schwimmblase und Gehirn vor (GOODWIN et al. 2006). In Nordamerika kommen zwei Herpesviren bei Salmoniden vor. 1975 wurde das Herpesvirus salmonis (HPS) aus der Ovarialflüssigkeit adulter Regenbogenforellen bei Mortalitäten nach der Fortpflanzungszeit isoliert. Unter Forellenbrut, aber auch der Brut einiger anderer Salmoniden, ruft es hohe Verluste hervor (WOLF et al. 1978). Es schädigt neben einer Reihe von Organsystemen besonders die Leber. Das HPS vermehrte sich auf der Regenbogenforellengonadenzelllinie RTG-2 bei 5 und 10°C, also bei Temperaturen, die tiefer liegen als die routinemäßig für die Virusanzucht bei Kaltwasserfischen eingesetzten. Hier führte es wie das KHV zur Bildung von Synzytien mit intranukleären Einschlußkörperchen (WOLF et al. 1978). 1986 wurde das relativ avirulente steelhead herpesvirus (SHV) aus der Ovarialflüssigkeit von geschlechtsreifen anadromen Regenbogenforellen isoliert. Vier Herpesviren wurden in Japan bei Salmoniden isoliert. 21 Literaturübersicht Das Nerkavirus des Towada lake in der Akita Aomori Prefektur (NeVTA) wurde 1976 aus moribunder Brut des Nerkalachses isoliert. Seit 1970 war es hier jedes Jahr im Sommer zu hohen Mortalitäten gekommen. Betroffene Fische zeigten Dunkelfärbung, Apathie und Anorexie (SANO 1976). Das 1978 aus einem symtomlosen adulten Kirschenlachs isolierte „Oncorhynchus masou virus“ (OMV) (KIMURA et al. 1981a) ruft Mortalitäten unter der Brut des Ketalachses, Kirschenlachses, Nerkalachses, Coholachses und der Regenbogenforelle hervor (TANAKA et al. 1984). Es verursacht bei mehr als 60% der eine experimentelle Infektion überlebenden Fische epitheliale Tumore (KIMURA et al. 1981b). Das aus Basalzellen eines im Maul eines Kirschenlachses vorkommenden Tumors isolierte „Yamame tumor virus“ (YTV) ähnelt serologisch dem NeVTA (SANO et al. 1983). Das YTV wurde danach ebenfalls aus der Ovarialflüssigkeit eines Kirschenlachses isoliert (HAYASHI et al. 1986). 1988 wurde ein Herpesvirus aus Leber, Niere und Neoplasien des Coholachses isoliert, dass die Coholachskultur ökonomisch stark schädigte. Betroffene Fische hatten Hautulzerationen, weiße Punkte auf der Leber und Neoplasien an Maul und Körper. Serologische Vergleiche zeigten, dass das japanische OMV, YTV und NeVTA eng miteinander verwandt sind, sich aber von den sich ähnelnden nordamerikanischen HPS und SHV unterscheiden (HEDRICK et al. 1987). Somit wurde vermutet, dass es sich bei den beiden Virusgruppen nicht um eine Verschleppung durch infizierte Eier oder Fische zwischen den Kontinenten handeln könne (HEDRICK et al. 1987). Beim Stint traten während der Laichzeit in mehreren Seen in New Hampshire mit einer Prävalenz bis zu 30% nichtinvasiv wachsende epidermale Tumore auf (HERMAN et al. 1997). Aufgrund dem Vorkommen bei sexuell aktiven Fischen vermuteten die Autoren, dass Hormone das Virus demaskieren, Immunantworten unterdrücken oder direkt das Epithel zum unkontrollierten Wachstum anregen. Herpesviren besitzen seit einiger Zeit auch für Aalaquakulturen und den Aalbestand in natürlichen Gewässern klinische Relevanz. In Asien wurde das Herpesvirus anguillae (HVA) 1985 bei japanischen und europäischen Aalen mit Haut- und Kiemenblutungen und Nekrosen 22 Literaturübersicht der Haut, Kieme und Leber isoliert (SANO et al. 1990b). Das später in Taiwan bei japanischen Aalen mit Hautveränderungen von UENO et al. (1992) nachgewiesene, dem HVA sehr ähnliche Eel Herpesvirus in Formosa (EHVF) löste auch bei Karpfen nach experimenteller Infektion die typischen Krankheitssymptome aus. 1999 beschrieben LEE et al. das Auftreten einer HVA-bedingten Kiemen- und Hauterkrankung bei japanischen Aalen mit einem für ein Herpesvirus untypischen Tropismus für Fibrozyten und Fibroblasten der Haut und Kieme. Auch in Europa wurde das HVA bei erkrankten und symptomlosen Aalen aller Altersstufen (BEKESI et al. 1986, JOERGENSEN et al. 1994, DAVIDSE et al. 1999) nachgewiesen. Durch den Nachweis einer durch exogenen oder endogenen Stress ausgelösten Virusreaktivierung bei symptomlosen Aalen wurde bestätigt, dass das HVA eine Latenz etablieren kann (VAN NIEUWSTADT et al. 2001). Das HVA vermehrt sich auf der Aalnierenzelllinie „eel-kidney-1“ (EK-1). Die Regenbogenforellengonadenzelllinie „rainbowtrout gonad-2“ (RTG-2)-, die Zelllinie der Dickkopfelritze „fathead minnow“ (FHM)- und die Karpfenepithelzelllinie „Epithelioma papulosum cyprini“ (EPC) sind nur wenig empfänglich (HAENEN et al. 2002). Erkrankte Aale zeigen häufig eine intensive Rötung im Bereich des Kopfes, weshalb die Krankheit auch als ,,Rotkopfkrankheit“ bezeichnet wird. Zusätzlich können Hämorrhagien an Flossenansätzen, Bauch, Fettgewebe und Kiemendeckeln sowie Ulzerationen bestehen (DAVIDSE 1999). Wie an KHV erkrankte Karpfen leiden erkrankte Aale an Freßunlust. Es können Leber-, Milz- und Nierenschwellungen und Aszites bestehen. Die Morbidität ist in der Regel hoch, die Mortalität liegt häufig unter 10% (SANO et al. 1990b, LEE et al. 1999), in Verbindung mit haltungsbedingtem Stress kann sie aber hoch sein (VAN NIEUWSTADT et al. 2001, HAENEN et al. 2002). Die meisten Ausbrüche des HVA treten bei 23-26°C auf. Bei einem Abfallen der Temperatur sinkt die Mortalität in der Regel geringgradig. Da sich das HVA in vitro bei 20°C nicht wesentlich schlechter vermehren lässt als bei 26°C, ging VAN NIEUWSTADT davon aus, dass es sich hierbei um ein immunologisches Phänomen handelt (HAENEN et al. 2002). Beim HAV wird die Kieme als Eintrittspforte des Virus erwogen (HAENEN et al. 2002). Wie beim KHV kommt es bei HVA-infizierten Aalen mit herdförmigen Nekrosen zu den ausgeprägtesten Veränderungen im Kiemengewebe. 23 Die Kiemenlamellen zeigten Literaturübersicht Hämorrhagien und Blutstauungen, die Spitzen der Sekundärlamellen Nekrosen und Entzündungen des Bindegewebes und des zentralen Sinus der Lamellen. An der Haut kam es zu Epithelhyperplasien mit intrazytoplasmatischen Einschlußkörperchen. Das subkutane Bindegewebe der Bauchflossen war nekrotisiert, es bestanden ausgeprägte Hämorrhagien und Entzündungszellinfiltrationen. In der Leber waren Schwellungen und Atrophien der Hepatozyten erkennbar, in der Niere Schwellungen der Tubulusepithelzellen und in der Milz erniedrigte Erythrozytenzahlen, während die Sinusoide leer und dilatiert waren. Makrophagenanhäufungen fanden sich in Leber, Niere und Milz (LEE et al. 1999, CHANG et al. 2002). Bei japanischen Aalen wurden nekrotische Fibrozyten in Haut, subkutanem Fettgewebe und Muskulatur, begleitet von Nekrosen der Melanozyten mit Entzündungszellinfiltration beobachtet. In Fibrozyten und mesenchymalen Zellen konnten Herpesviruspartikel nachgewiesen werden. (KOBAYASHI und MIYAZAKI 1997). Durch in situ Hybridisierung konnten SHIH et al. (2003) HVA-spezifische Nukleinsäuren in Melanomakrophagen der Haut, Leber, Milz und Niere nachweisen. HVA-infizierte Fibrozyten lagen in Kieme und Leberzellen vor. HAENEN et al. (2002) stellten fest, dass sich das HVA aus der Kieme häufiger isolieren ließ als aus einem Pool aus Niere, Milz und Leber. Auch bei Sardinen wurden herpesvirusbedingte Erkrankungen beschrieben. 1995 und 1998 traten im Süden Australiens massenhafte Mortalitäten auf. Sie breiteten sich in dem betroffenen Küstenabschnitt mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 30 Kilometer pro Tag, was ungefähr der maximalen Schwimmgeschwindigkeit der Sardinen entspricht, aus und erreichten auch Neuseeland. Die Mortalität hielt an einzelnen Lokalitäten meistens nur wenige Tage an (MURRAY et al. 2001). Die Erkrankung verbreitete sich sowohl mit als auch entgegen den Strömungen und betraf gewöhnlich Fische ab einer Körperlänge von 11 cm. In der Kieme konnte ein Herpesvirus nachgewiesen werden. Durch die Lyse der Kiemenepithelzellen wurden die sich hier vermehrenden Herpesviren freigesetzt (HYATT et al. 1997). Subklinische stressbedingte Herpesvirusinfektionen bei jungen Steinbutt wurden durch elektronenmikroskopische Untersuchungen nachgewiesen (HELLBERG et al. 2002). Die Virionen waren im Epithel von Haut und Kieme lokalisiert. Erkrankungen, die durch das Herpesvirus scophthalmi verursacht wurden und sich in hoher Lethalität, Lethargie, 24 Literaturübersicht Anorexie, Inkoordinationen, Ödemen, Aszites und einem gelegentlichen Rektalprolaps äußerten, wurden schon 1978 im Vereinigten Königreich von BUCHANAN und MADELY und 1994 in Dänemark von BLOCH und LARSEN bei jungen Steinbutt beschrieben. Onkogene Herpesviren, die einen anderen Zelltropismus besitzen und epidermale Proliferationen verursachen (LEE et al. 1999), sind bei Karpfen, Goldorfe, Steinbutt, amerikanischem Zander, Seeforelle, pazifischem Kabeljau, Waller, Stint, Hecht, Kirschenlachs und japanischen Aal beschrieben worden. Bei den seit dem Mittelalter bekannten Karpfenpocken handelt es sich um wachsartige epidermale Tumore, die saisonabhängig auftreten. SCHUBERT (1964 und 1966) beschrieb die Gewebeveränderungen und die in den Tumoren nachgewiesenen Viruspartikel, die sich ihm durch transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen offenbarten. Erst Anfang der 80-er Jahre gelang die Isolation eines Herpesvirus aus dem papillomatösen Gewebe (SANO et al. 1985). Es wird als Herpesvirus cyprini bzw. cyprinides Herpesvirus-1 (CyHV1) bezeichnet. Erkrankte Karpfenbrut zeigt Koordinationsstörungen, Apathie, Anorexie, Aszites, Exophthalmus, Dunkelfärbung und Hämorrhagien an Bauch und Kiemendeckeln. Die Ausbildung der Karpfenpocken verläuft bei Karpfenbrut schneller als bei über ein Jahr alten Karpfen, die Lokalisation ist aber dieselbe (SANO et al. 1991). Das saisonale Auftreten der Karpfenpocken rührt vermutlich von einer Reaktivierung des latenten Virus im Nervengewebe nach einer Immunsuppression durch niedrige Temperaturen oder andere Stressfaktoren her (MORITA u. SANO 1990, SANO et al. 1993). Das CyHV-1 verursacht bei experimenteller Infektion von Karpfenbrut bis zu einem Alter von einem Monat Mortalitäten, nicht aber bei der Brut von Karauschen, Graskarpfen oder der Rotflossenorfe. Von letztgenannten Fischen konnte kein Virus reisoliert werden und Neoplasien wurden nicht ausgebildet (SANO et al. 1991). Erkrankte Karpfenbrut litt an ausgedehnten Nekrosen des Leberparenchyms mit Bildung von Einschlußkörperchen und ballonierender Degeneration der Hepathozyten, einer Oesophagusschleimhaut. nekrotischen Die Nephritis zellulären und Nekrosen Veränderungen der der Leber Darm- und ähnelten den Leberveränderungen bei Herpes simplex-Virus-1 (SANO et al. 1990). Beim CyHV-1 gelang die Isolation des Virus nur aus den Neoplasien, nie aus inneren Organen oder Blut. Virusantigen allerdings konnte von Tag 2 bis 21 p. i. in Kieme, Leber, Niere und Darm nachgewiesen werden. Zu einem späteren Zeitpunkt konnte Virusantigen häufiger in der Haut 25 Literaturübersicht nachgewiesen werden und nicht mehr in Gehirn, Kieme oder anderen inneren Organen (SANO et al. 1991). STEINHAGEN et al. (1992) beschrieben bei acht Monate alten Goldorfen epidermale Hyperplasien an Haut und Flossen. Während die Virusisolation nicht gelang, konnten durch elektronenmikroskopische Untersuchungen herpesvirusähnliche Partikel in den Neoplasien nachgewiesen werden. Die Neoplasien traten wie beim CyHV-1 bei kalten Wassertemperaturen auf und bildeten sich bei Erwärmung des Wassers zurück. Bei Mortalitäten bis 50% unter jungen weißen Stören, die mit Akanthosen und Nekrosen des Epithels der Haut und der oropharyngealen Schleimhaut und einem flüssigkeitsgefüllten Magendarmtrakt assoziiert waren, wurden durch ein bis dahin unbekanntes Herpesvirus hervorgerufen. Andere Gewebe schienen nicht betroffen zu sein. Das Virus konnte auf einer Hautzelllinie des weißen Störes mit Synzytienbildung isoliert werden (HEDRICK et al. 1991). Auch bei einem Klippenbarsch wurde eine herpesvirusbedingte Erkrankung beschrieben. Der erkrankte Fisch litt an einer Leberschwellung mit Hämorrhagien und massiven histologischen Veränderungen in Form von Synzytien, intranukleären Einschlußkörperchen, Ansammlungen von Monozyten, koagulierender Nekrose, Blutstauung und Thrombose. Die Leberveränderungen hatten einen entzündlichen Charakter. In den Kernen der Hepathozyten wurden herpesvirusähnliche Viruspartikel nachgewiesen (KENT u. MYERS 2000). 26 Literaturübersicht 2.3 Wirtsspektrum Viele Herpesviren besitzen ein enges Wirtsspektrum (ROLLE u. MAYR 1993, DAVISON 2002). Dieses wird von einigen Autoren auch für das KHV vermutet. BLOOM (1998) beschrieb die Erkrankung von Koi israelischer, chinesischer, japanischer und europäischer Herkunft. Bei Goldfischen, Stören und Nerflingen beobachtete er keine Krankheitssymptome. Ebensowenig konnten von anderen Autoren (HOFFMANN et al. 2000) bei Krankheitsausbrüchen in Teichen oder bei experimentellen Infektionen (BRETZINGER et al. 1999) Erkrankungen und Todesfälle unter Goldfischen, Stören, Schleien, Goldorfen, Grasfischen, Hechten oder Zandern beobachtet werden. Auch ARIAV et al. (1999) und WALSTER (1999) bestätigten, das trotz der hohen Kontagiösität und Virulenz der Krankheit Morbiditäten und Mortalitäten auf die Spezies Cyprinus carpio beschränkt waren, wobei die am stärksten betroffenen Fische häufig eine Größe von 25-30 cm hatten (WALSTER 1999). Im Gegensatz dazu beobachteten PERELBERG et al. (2003) bei experimenteller Infektion von Karpfen höhere Morbiditäten bei Fischen zwischen 2,5 und 6 g (92,5%) als bei adulten, durchschnittlich 230 g schweren Karpfen (56%). 99-100% der Fische, die mit Zellkulturvirus per injectionem oder über das Bad infiziert wurden, starben innerhalb von 14 Tagen. Virus, das vier Stunden vor dem Zusetzen von Fischen in das Wasser gegeben wurde, konnte noch Erkrankungen auslösen, Virus, das 21 Stunden vorher in das Wasser gegeben wurde, nicht. In diesen Studien kohabitierten PERELBERG et al. (2003) ebenfalls Tilapien, Silberbarsche, Silberkarpfen, Goldfische, Graskarpfen und Karpfen mit infizierten Karpfen. Um zu überprüfen, ob diese Fische das Virus auf andere Fische übertragen können, wurden einige der Fische nach Kohabitation mit naiven Karpfen zusammen gehalten. Fische aus den obengenannten Arten außer Karpfen überlebten die Kohabitation mit den infizierten Karpfen und lösten bei den naiven Karpfen auch keine Erkrankung aus. Die infizierten Karpfen konnten das Virus auf naive Karpfen übertragen, es kam zu einer Mortalität von 68% unter den naiven Karpfen. Aus diesen Beobachtungen schlossen die Autoren, dass das Koi Herpesvirus ein enges Wirtsspektrum besitzt. Im Gegensatz zu den bisher zitierten Studien, in denen überlebende Fische nicht labordiagnostisch auf mögliche symptomlose Infektionen untersucht wurden, konnte 27 Literaturübersicht BERGMANN bei Karauschen mittels PCR KHV-DNA nachweisen, obwohl die Fische keine klinisch sichtbaren Krankheitsanzeichen oder Mortalitäten zeigten. KHV-DNA war bis zu einem Jahr p.i. in den Leukozyten detektierbar. Bei infizierten Goldfischen wurden KHVDNA, mRNA und spezifische KHV-Proteine nachgewiesen, und es konnte Virus isoliert werden (siehe HAENEN u. HEDRICK 2006). DIXON gab zu bedenken, dass eine Übertragung des KHV auf Goldfische, Orfen und Schleien von ihm nicht bestätigt werden konnte (siehe HAENEN u. HEDRICK 2006). HEDRICK et al. (2006) untersuchten die Empfänglichkeit von Koi, Karpfen, Goldfischen und Goldfisch-Karpfen-Hybriden für Infektionen mit dem CyHV-2 und CyHV-3. Hybride aus einem männlichen Goldfisch und einem weiblichen Karpfen entwickelten keine Mortalität nach experimenteller Infektion mit dem CyHV-2 und eine reduzierte Mortalität nach experimenteller Infektion mit dem CyHV-3. Die Autoren sahen darin eine Möglichkeit, die schweren Folgen der KHV-Infektion zu umgehen. Sie stellten aber auch fest, dass eine, wenn auch geringe, Restempfänglichkeit der Hybriden für das KHV besteht. Auf einer von den Hybriden abgeleiteten Zellkultur war ein Wachstum des KHV möglich. SHAPIRA et al. (2005) führten Versuche durch, um durch Kreuzungen von zwei domestizierten Karpfenlinien mit einem KHV-resistenten Wildtyp des Karpfens KHVresistente Fische zu selektieren. Die beiden domestizierten Karpfenlinien wurden mit dem Sperma des Wildtypkarpfens inokuliert. Die Wachstumsrate und Lebensmittelqualität einerseits und die Überlebensrate im Labor und im Teich nach KHV-Infektion durch Kohabitation mit KHV-infizierten Fischen wurden miteinander verglichen. Die Kreuzung der einen domestizierten Karpfenlinie mit dem Wildtyp bewirkte eine stark reduzierte Mortalität. Die Kreuzung einer zweiten domestizierten Karpfenlinie mit dem Wildtyp und die Kreuzungen der domestizierten Linien untereinander brachten keine Vorteile. 28 Literaturübersicht 2.4 Epidemiologie Die rapide globale Verbreitung des KHV wurde durch Ausstellungen von Koi, einen internationalen Fischhandel ohne Gesundheitsüberprüfungen und die intensive Aquakultur bedingt (GILAD et al. 2003). Besonders symptomlose Carrierfische stellen ein erhebliches Risiko für die weitere Verbreitung des KHV dar (GILAD et al. 2002, GILAD et al. 2003). WALSTER (1999) und NEUKIRCH u. KUNZ (2001) bemerkten, dass die meisten Ausbrüche nach der Einführung neuer Fische in einen Bestand auftraten, dieses aber in einigen Fällen auch Monate oder sogar Jahre her sein konnte. Sie erklärten wie auch BLOOM (1999), dass die Einführung eines einzigen Fisches ausreichen würde. Selbst eine Quarantänehaltung konnte dieses teilweise nicht verhindern. Auch BRETZINGER et al. (1999) konnten bei sieben von acht untersuchten KHV-Ausbrüchen in Koibeständen Neuzugänge als Auslöser ausmachen. WALSTER (1999) argumentierte, dass gemäß israelischen Untersuchungen vermutet wurde, dass Fische, die einen KHV-Ausbruch überlebt haben, die Krankheit nicht auf andere empfängliche Fische übertragen können. Er stufte Kescher, Hände und Aerosole als alleinige mögliche Übertragungswege ein. Einen Befall mit der Karpfenlaus, Argulus sp., bekannt als Überträger viraler Infektionen, konnte er in 17 Fällen vor Ausbrüchen in Hobbyteichhaltungen bestätigen. Expositionen empfänglicher Fische mit dem KHV, die außerhalb des permissiven Temperaturfensters von 16-28°C stattfanden, schienen häufig einen Carrierstatus zu induzieren, der bei einer Temperaturveränderung in den Bereich, der eine Virusvermehrung erlaubt, in einen akuten Ausbruch übergehen konnte (HEDRICK et al. 2000). PERELBERG et al. (2003) vermuteten, dass das KHV über kontaminiertes Wasser übertragen werden könne, wo es mindestens vier Stunden lang infektiös blieb. Bei ihren Experimenten war die Mortalität bei einer Infektion über das Wasser höher als bei einer Infektion per injectionem und die Zeitspanne von der Infektion bis zum Auftreten erster Todesfälle war kürzer. DISHON et al. (2005) wiesen das KHV, virale DNA und virales Antigen im Kot infizierter Fische nach. Die Autoren vermuteten Niere und Darm als vorrangigen Ort der 29 Literaturübersicht Virusvermehrung, was sie zu einer virologischen Untersuchung von Kotproben bewog. Über das Bad infizierte Fische schieden ab dem fünften Tag p.i. KHV-DNA mit dem Kot aus. Bei i.p. infizierten Fischen konnte ab dem vierten Tag p.i. virale DNA im Darm der Fische nachgewiesen werden, virale DNA wurde ab dem fünften Tag mit dem Kot ausgeschieden. Ab dem siebten Tag wurde infektiöses Virus mit dem Kot ausgeschieden. 30 Literaturübersicht 2.5 Klinik Typisch für einen KHV-Ausbruch im Feld ist bei betroffenen Koi oder Karpfen eine Morbidität von 80-100% und eine Mortalität von 70-80% bei einem perakuten bis akuten Verlauf (WALSTER 1999, BRETZINGER et al. 1999). HOFFMANN et al. (2000) nannten gar eine Mortalität bis 100%. BRETZINGER et al. (1999) beschrieben die Eradikation gesamter Bestände innerhalb weniger Tage. Die Inkubationszeit ist stark temperaturabhängig und kann deshalb nicht genau angegeben werden. WALSTER (1999) nannte eine Inkubationszeit von typischerweise zwei bis drei Wochen, bei dem Einsetzen naiver Fische in einen erkrankten Bestand kann es aber bereits innerhalb von drei Tagen zum Auftreten von Krankheitsanzeichen kommen (WALSTER 1999). HOFFMANN (2001) nannte eine Inkubationszeit von wenigen Tagen, nach der innerhalb von ein bis zwei Tagen die Erkrankung auf alle Tiere übergriff. Die meisten Ausbrüche treten laut WALSTER (1999) bei Temperaturen zwischen 20 und 23°C auf, wobei es innerhalb von 48 Stunden nach Ausbildung von Kiemenschäden zu Mortalitäten kommt. Insgesamt gab WALSTER (1999) ein Temperaturfenster von 15-28°C an, in dem es zu Ausbrüchen kommt. Er bemerkte, dass die Krankheit bei niedrigeren Temperaturen langsamer voranschritt und bei außergewöhnlich niedrigen oder hohen Temperaturen latent erschien. Äußerlich erkennbare Symptome können stark variieren und beinhalten einen Enophthalmus, eine vermehrte Schleimproduktion auf Haut und Kiemen, wobei bräunliche Schleimfäden aus den Kiemen heraushängen können, sowie gelegentlich auftretende Hämorrhagien der Haut. Im weiteren Verlauf treten eine verringerte Schleimproduktion mit der Ausbildung einer ,,Sandpapierhaut“ und eine Dyspnoe, die durch eine Kiemenschwellung und fokale oder ausgedehnte Nekrosen des Kiemengewebes hervorgerufen wird, zu Tage. Verhaltensabnormalitäten beinhalten Apathie, Flossenklemmen, Anorexie, ein bevorzugtes Aufhalten in strömungsschwachen Wasserzonen, Koordinationsverlust und eine sporadische Hyperaktivität mit ziellosem Herumschwimmen, wobei letztgenannte Symptome häufig nur von einem Teil der erkrankten Fische ausgebildet werden (BLOOM 1998, ARIAV et al. 1999, WALSTER, 1999). WALSTER (1999) beobachtete, dass eine Anorexie häufig schon bis zu zehn Tage vor dem Gewahrwerden anderer klinischer Symptome auftrat. HOFFMANN et al. (2000) beschrieben ebenfalls 31 Literaturübersicht massive Kiemenschwellungen mit Verschleimung, Dyspnoe und Apathie. Sektionsbefunde waren selten auffällig und bestanden in vereinzelten petechialen Blutungen in Leber und Niere und einem Aszites (WALSTER 1999). Erkrankte Fische waren hochsensibel gegenüber zahlreichen Sekundärinfektionen parasitologischen, bakteriologischen und mykotischen Ursprungs (BLOOM 1998, ARIAV et al. 1999). Auch BRETZINGER et al. (1999) stellten fest, dass erkrankte Karpfen häufig von opportunistischen Parasiten befallen waren, besonders in der Kieme kam es zu hohen Befallsraten. In Verbindung mit der Vielzahl klinischer Symptome vermutete BLOOM (1998) daran den Zusammenbruch des Fischimmunsystems, weshalb er den Namen ,,koi immune system suppressing disease“ für die KHV-Infektion vorschlug. Die auf an dem KHV erkrankten Fischen parasitierenden Protozoen konnten durch Behandlungen mit Malachitgrünoxalat und Formalin nicht therapiert werden (BLOOM 1998, WALSTER 1999). Dasselbe Phänomen beobachteten CHANG et al. (2002) bei an dem Aalherpesvirus erkrankten europäischen Aalen, die eine Vielzahl von Kiemenwürmern in der Kieme trugen. Dass es sich bei der KHV-Infektion um eine hochinfektiöse Krankheit handelte, erkannte BLOOM (1998) an der Tatsache, dass die Einführung eines einzigen betroffenen Fisches in ein jahrelang bestehendes Ökosystem mit gesunden, immunkompetenten Fischen zu einem Krankheitsausbruch führte. WALSTER (1999) beobachtete, dass höhere Besatzdichten und eine mangelhafte Wasserqualität den Erkrankungsverlauf erschwerten. 32 Literaturübersicht 2.6 Pathogenese Die Wassertemperatur bestimmt bei wechselwarmen Tieren über die Zeit bis zum Auftreten und die Schwere des Verlaufs von Virusinfektionen durch Beeinflussung der Virusvermehrung und des humoralen und zellulären Immunsystems des betroffenen Organismus (BLY u. CLEM 1992). Die Wassertemperatur vermochte den Krankheitsverlauf stärker zu beeinflussen als die Viruskonzentration im Wasser (GILAD et al. 2003). Experimentell erwiesen sich Karpfen bereits für geringe Viruskonzentrationen (1,2 KID50/ml) als hochempfänglich. Koi wurden mit 1,2 KID50/ml bzw. 12 KID50/ml über das Bad infiziert und bei 13, 18, 23 und 28°C gehalten. Bei 28°C starben bei beiden Dosierungen 17 von 20 Fischen, die durchschnittliche Zeit von der Infektion bis zum Tod betrug neun bzw. sieben Tage. Bei 23°C starben 39 von 41 Fischen innerhalb von neun Tagen nach der Infektion, ohne dass ein Unterschied zwischen den verschiedenen Dosierungen erkennbar war. Bei 18°C starben 17 von 19 Koi bzw. 20 von 21 Koi innerhalb von 23 bzw. 18 Tagen. Fische, die bei 13°C gehalten wurden, zeigten keine Krankheitssymptome. Jeweils fünf von sechs Koi, die nach der Infektion über 30 Tage bei 13°C gehalten wurden, starben bei einer Anhebung der Wassertemperatur auf 23°C innerhalb von zwölf bzw. sieben Tagen. Koi, die nach der Infektion zwei Monate bei 13°C gehalten wurden, starben nach einer Anhebung der Wassertemperatur auf 23°C nicht. Es bestand bei den Fischen, die bei 23°C gehalten wurden, und den Fischen, deren Haltungstemperatur nach 30 Tagen bei 13°C auf 23°C angehoben wurde, kein signifikanter Unterschied in der Zeit von der Infektion bis zum Tod. Die Untersuchung offenbarte, dass eine im Frühjahr oder Sommer durch das KHV hervorgerufene Mortalität eine Aktivierung einer Virusinfektion darstellen kann, die bei Temperaturen anging, bei denen sich das Virus nicht vermehren konnte, und deshalb klinisch nicht zu Tage trat (GILAD et al. 2003). Eine Infektion über das Bad, bei der bereits am ersten Tag p.i. virale DNA in Niere und Blut gefunden wurde, schien effektiver zu sein als die durch Kohabitation. Die Menge an VirusDNA in der Niere stieg ab dem dritten und im Blut ab dem fünften Tag an. Die Niere schien das Organ zu sein, in dem sich das Virus am effektivsten vermehrte. KHV-DNA wurde regelmäßig in Kieme, Gastrointestinaltrakt und Leber experimentell infizierter Fische gefunden. Im Gegensatz dazu konnte im zentralen Nervensystem dieser Fische nicht 33 Literaturübersicht regelmäßig virale DNA nachgewiesen werden (PIKARSKY et al. 2004). Deshalb vermuteten die Autoren, dass virale DNA hier nur in geringer Menge vorlag. Einige Herpesviren rufen während der Primärinfektion keine pathologischen Veränderungen im Nervengewebe hervor, können aber eine latente Infektion in Neuronen etablieren. Bisher ist unklar, ob dieses auch bei dem KHV zutrifft (GRAY et al. 2002). Es ist bisher ungeklärt, ob das Virus durch Kieme oder Darm in den Körper eintritt (HEDRICK et al. 2000, PERELBERG et al. 2003). PIKARSKY et al. (2004) vermuteten, dass das Virus über die Kieme in den Körper gelangt und hier bei der Vermehrung zu einer Schleimhautschädigung und Nekrose führt, was sich in einer zunehmenden Morbidität des betroffenen Fisches äußert. Das Virus könnte dann von der Kieme ins Wasser freigegeben sowie über den Blutstrom in Leukozyten zur Niere transportiert werden. GILAD et al. (2004) untersuchten die Menge an KHV-DNA bei virusexponierten Koi bei einer Haltung bei 13, 18, 23 und 28°C in Kieme, Niere, Milz, Leber, Gehirn, Darm und Hautschleim. Virale DNA wurde bei allen Temperaturen nachgewiesen. Bei 13°C traten, anders als bei den anderen Temperaturen, keine Mortalitäten auf. Die Zahl der KHVGenomkopien wuchs mit dem Fortschreiten der Infektion und war bei höherer Haltungstemperatur größer. Der Nachweis viraler DNA in vielen Geweben bereits einen Tag p. i. offenbarte eine schnelle systemische Verbreitung im Organismus. Die höchsten DNAKonzentrationen wurden in Kieme, Niere und Milz bei 23°C mit 108 bis 109 Genomäquivalenten pro 106 Wirtszellen gemessen. Auf dem Gipfel der Infektion lagen bei 18, 23 und 28°C 107 bis 109 Genomkopien pro 106 Wirtszellen vor. Große Mengen wurden auch in Hautschleim, Leber, Darm und Gehirn detektiert. Eine sequentielle Gewebeverteilung konnte nicht erkannt werden. Ein bereits einen Tag p.i. erfolgender Nachweis großer Mengen KHV-DNA im Schleim ließ GILAD et al. (2004) vermuten, dass die Haut neben der Kieme in die frühe virale Pathogenese aktiv involviert ist. Eine Virusvermehrung in diesem Gewebe könnte die Hypersekretion von Hautschleim in frühen Infektionsstadien und die sandpapierartige Hauttextur zu späteren Zeitpunkten (BRETZINGER et al. 1999, HEDRICK et al. 2000, PERELBERG et al. 2003) erklären (GILAD et al. 2004). Die Autoren hielten es für möglich, dass von der Haut infektiöses Virus in das Wasser abgegeben wird. Die Rolle der Haut bei 34 Literaturübersicht Herpesvirusinfektionen ist bei vielen Tieren inklusive der Fische bekannt (HEDRICK u. SANO 1989). Eine initiale und auch persistierende Beeinträchtigung von Haut und Kieme konnte bei mit dem IcHV-1 infizierten Welsen, bei an Karpfenpocken leidenden Karpfen und bei an HVA erkrankten Aalen beobachtet werden (WISE et al. 1985, NUSBAUM u. GRIZZLE 1987, SANO et al. 1993b, BAEK u. BOYLE 1996, KOBAYASHI u. MIYAZAKI 1997, LEE et al. 1999, GRAY et al. 1999b). GILAD et al. (2004) vermuteten, dass ein Verlust osmoregulatorischer Funktionen von Kieme, Darm und Niere zu den Mortalitäten beiträgt. 62 Tage p. i. trugen Koi noch geringe Mengen viraler Genomäquivalente in Kieme, Niere und Gehirn. Auch GOODWIN konnte mittels PCR bei 17% der Individuen einer Gruppe von vor vier Monaten infizierten Karpfen noch KHV-DNA nachweisen, während acht Monate p.i. bei keinem der infizierten Fische der KHV-Nachweis gelang (siehe HAENEN u. HEDRICK 2006). Bei Gabelwelsen, die eine Infektion mit dem CCV überlebt hatten, konnte virale DNA vier Monate p.i. in Blut, Gehirn, Darm, Niere, Leber und peripheren Blutleukozyten nachgewiesen werden (SANO et al. 1993, GRAY et al. 1999b). Bei Karpfen, die eine Infektion mit dem CyHV-1, dem die Karpfenpocken auslösenden Virus, überlebt hatten, konnte virale DNA 35 Wochen p.i. in Haut, Kieme, Gehirn, Kopf- und Spinalnerven, Oesophagus, Leber und Niere detektiert werden. Durch den Nachweis der geringen Zahl an Genomkopien, die am 62. Tag p.i. nachgewiesen wurde, vermuteten GILAD et al. (2004), dass die Virusvermehrung eingestellt oder stark reduziert wurde. Der Nachweis viraler DNA in symptomlosen Fischen reicht nicht für den Beweis einer latenten oder persistierenden Infektion. Hierfür wird der Nachweis einer Übertragung des Viruses auf naive Fische oder einer stressinduzierten Virusreaktivierung benötigt (GILAD et al. 2004). Von Koiproduzenten wird eine Exposition von Karpfen mit dem KHV bei nicht permissiven Temperaturen (geringer als 16°C oder höher als 28°C) genutzt, um eine Immunität gegen das Virus zu induzieren (RONEN et al. 2003). Es wird vermutet, dass die bei den hohen nichtpermissiven Temperaturen exponierten Fische eine spezifische Immunität erwerben, die vor einer Belastungsinfektion schützt (RONEN et al. 2003). Andere Autoren (NEUKIRCH 35 Literaturübersicht 2003b) befürchteten, dass durch dieses Vorgehen latent infizierte Virusträger geschaffen werden, die das Virus an naive Karpfen weitergeben können. ST-HILAIRE et al. (2005) untersuchten, ob das KHV latente Infektionen etablieren kann. Bisher war nur wenig über eine mögliche Latenz des KHV bekannt (GRAY et al. 2002, WALSTER 2003). Sie beobachteten eine mehrere Monate p.i. auftretende Virusreaktivierung. Die Fische schieden bei Temperaturen oberhalb von 20°C infektiöses Virus aus und übertrugen das KHV auf naive Karpfen. Damit wiesen sie nach, dass dem KHV exponierte Karpfen persistierende Infektionen etablieren können. Diese Ergebnisse veranlaßten STHILAIRE et al. (2005), von einer Exposition naiver Karpfen mit dem Virus zur Erzeugung natürlich immuner Fische abzuraten, wenn diese Fische abgegeben und mit naiven Fischen zusammengehalten werden werden sollen. Dennoch werden weitere, tiefergreifende Studien zur Latenz des KHV benötigt (HEDRICK et al. 2006). Die Latenz des equinen Herpesvirus-1 (EHV-1), des bovinen Herpesvirus-1 (BHV-1) sowie humaner Herpesviren wurde bereits gründlicher untersucht. Das EHV-1 ruft aus einer lytischen Infektion der Endothelzellen der Blutkapillaren eine nekrotisierende Vaskulitis und Thrombose hervor. Aborte, Paresen und neonatale Fohlenverluste resultieren. Der Ursprung der Infektion scheint reaktiviertes EHV-1 aus latent infizierten Leukozyten zu sein. Die primäre EHV-1-Vermehrung im oberen Respirationstrakt und den lokalen Lymphknoten bewirkt eine leukozytenassoziierte Virämie. Darauf findet eine weitere Vermehrung auch in den Endothelzellen der Blutkapillaren des Zentralnervensystems und des trächtigen Uterus statt (PATEL u. HELDENS 2005). Sowohl vom eqinen Herpesvirus-1 als auch -4, dem Verursacher von respiratorischen Erkrankungen, ist bekannt, dass eine Latenz im Lymph- und Nervengewebe etabliert wird (WELSH et al. 1992, GIBSON et al. 1992, EDINGTON et al. 1994, SLATER et al. 1994). Das EHV-1 konnte bei infizierten SPF- und konventionellen Pferden durch Immunsuppression reaktiviert werden. Infektiöses Virus konnte bei mit Kortikosteroiden behandelten konventionellen Pferden immer in Leukozyten und nur gelegentlich im Nasensekret nachgewiesen werden (EDINGTON et al. 1985). Bei mit Kortikosteroiden oder Zyklophosphamiden behandelten SPF-Pferden wurden beachtliche Virusmengen im Nasensekret gefunden, ohne dass es zur Virämie kam oder 36 Literaturübersicht Krankheitsanzeichen auftraten (SLATER et al. 1994). Eine spontane Virusausscheidung kann nach Krankheit, Kastration, Geburt oder einem Umstellen auftreten (BURROWS et al. 1984). Das BHV-1 etabliert nach der initialen Replikation im Schleimhautepithel eine lebenslange, von T-Lymphozyten kontrollierte (SIMMONS et al. 1992) Latenz in den sensorischen Neuronen des Trigeminalganglions und den Pharyngealtonsillen (JONES et al. 2006). In periodischen Schüben, häufig nach natürlichem oder kortikosteroidinduzierten Stress, reaktiviert das BHV-1 und infektiöses Virus wird ausgeschieden (SHEFFY u. DAVIES 1972, ROCK et al. 1992). Das BHV-1 verursacht wie das KHV eine Immunsuppression, in deren Folge es zu bakteriellen Sekundärinfektionen kommt. Beim BHV-1 korreliert diese erhöhte Anfälligkeit gegenüber Sekundärinfektionen mit einer reduzierten zellvermittelten Immunität (CARTER et al. 1989). Das Varizella-Zoster-Virus bildet nach der Primärinfektion eine Latenz in Ganglien aus. Eine Virusreaktivierung tritt vornehmlich bei älteren Menschen, Organtransplantatempfängern, Krebs- und AIDS-Patienten bei Absinken der zellvermittelten Immunität auf. Bei Untersuchungen an Astronauten wurde beobachtet, dass es während einer Raumfahrt zu einer subklinischen Reaktivierung des Varizella-Zoster-Virus kam (MEHTA et al. 2004). Ähnlich verhielt es sich mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV). Bei Astronauten stieg während und unmittelbar nach Weltraumfahrten die Zahl der EBV-Genomkopien im Speichel und EBVspezifischer Antikörper im Blut (PIERSON et al. 2005). Weitere Beweise für eine durch psychischen Stress hervorgerufene Virusreaktivierung lieferten GLASER et al. (1999). Sie untersuchten an einer Militärakademie den Einfluß von Trainingsstress während einem Basistraining für Kadetten und von dem finalen Prüfungsstress auf die Reaktivierung des EBV, Herpes-simplex-Virus-1 (HSV-1) und des humanen Herpesvirus-6 (HHV-6), dem Erreger des Dreitagefiebers. Weder beim HSV-1 noch beim HHV-6 konnte eine Virusreaktivierung durch das Training oder den Prüfungsstress nachgewiesen werden. Beim EBV kam es nicht durch das Training, aber den Prüfungsstress zu einer Virusreaktivierung. Das HSV-1 kann während der frühen Kindheit eine latente Infektion in sensorischen Neuronen etablieren, die als Virusreservoir für rekurrierende Infektionen dient. Rekurriende Herpesvirusinfektionen resultieren häufiger aus einer Reaktivierung des latenten Virus als aus 37 Literaturübersicht exogenen Reinfektionen. Nach einer Primärinfektion der Haut oder Schleimhaut tritt das HSV-1 in sensorische Neurone ein und gelang durch retrograden axonalen Transport zu den neuronalen Zellen des sensorischen Ganglions. Das Virus vermehrt sich in den sensorischen Neuronen und etabliert eine latente Infektion. Eine Virusreaktivierung kann zu einem anterograden Transport und einer Freisetzung von infektiösen Virionen in die Gewebe, die durch diese Neuronen innerviert werden, führen. Gelegentlich kommt es aber auch zu einem Transport zum zentralen Nervensystem, der zu einer lethalen Enzephalitis führen kann (KHANNA et al. 2004). Hyperthermie-Stress kann bei latent mit dem HSV-1 infizierten Mäusen eine Virusreaktivierung induzieren und die Freisetzung von Kortikosteronen durch die Nebennieren durch Aktivierung der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Axe stimulieren. Wurden vor der Belastung der latent infizierten Mäuse Cyanoketone, Glukokortikoid-Synthesehemmer, verabreicht, wurde der stressinduzierte Anstieg von Kortikosteronen dosisabhängig blockiert. Die Hemmung der Kortikosteronsynthese korrelierte mit reduzierter Reaktivierung des HSV-1 (NOISAKRAN et al. 1998). In Primärzellkulturen von Trigeminalganglienzellen von latent mit HSV-1 infizierten Mäusen konnte innerhalb von 120 Stunden nach Hitzestress in 75% der Kulturüberstände infektiöses Virus nachgewiesen werden. Das HSV-1-Antigen erschien zuerst in den Neuronen, was anzeigte, dass die Neurone die Quelle der Reaktivierung waren. Die Verabreichung von Dexamethason konnte ebenfalls dosisabhängig eine Virusreaktivierung in der Zellkultur induzieren und bei der Verabreichung vor der Belastung mit dem Hitzestress konnte es die stressinduzierte Reaktivierung beschleunigen (HALFORD et al. 1996). 38 Literaturübersicht 2.7 Histologie Histologische Untersuchungen offenbarten in vielen Organen von an KHV erkrankten Fischen unspezifische Entzündungsreaktionen. Das Kiemengewebe zeigte die ausgeprägtesten pathologischen Veränderungen (WALSTER 1999, HEDRICK et al. 2000). Die histologische Untersuchung des Kiemengewebes offenbarte akute Epitheldegenerationen mit hydropischer Schwellung und mittelgradiger entzündlicher Reaktion. Es kam zu Proliferationen des respiratorischen Epithels mit zum Teil ausgedehnten Nekroseherden (HOFFMANN et al. 2000). Die Primärlamellen der Kieme waren massiv mit Lymphozyten infiltriert. In schweren Fällen traten eosinophile Granulozyten im Kiemenepithel auf. Die Spitzen der Primärlamellen unterlagen teilweise einer kompletten Nekrose und massenhaften Bakterienbesiedlung. Häufig wurde in der Kieme eine Ablösung des Epithels von der Basalmembran festgestellt (BRETZINGER et al. 1999, HOFFMANN et al. 2000). HEDRICK et al. (2000) bemerkten Hyperplasien, Hypertrophien und Nekrosen des Epithels und Verschmelzungen der Sekundärlamellen. Das Nierengewebe wies moderate Schäden auf. An KHV erkrankte Fische zeigten eine Nephritis mit Nekrosen des hämatopoetischen Nierengewebes. Bei einigen Fischen konnten in der Niere zwischen den Veränderungen des Interstitiums auch Nekrosen und Synzytien der Tubulusepithelzellen nachgewiesen werden (HEDRICK et al. 2000, HOFFMANN et al. 2000). Es bestanden teilweise massive Lymphozyteninfiltrationen in Leber und Pankreas. Nekrotische Herde traten auch in der Darmschleimhaut auf. Häufig wurde in der Haut zusätzlich zu einer Ablösung des Epithels von der Basalmembran ein Verlust der spezialisierten Zellen wie Schleimzellen und Clubzellen nachgewiesen (BRETZINGER et al. 1999). HEDRICK et al. (2000) diagnostizierten eine Splenitis mit Nekroseherden im Parenchym, die sich über einzelne Zellen oder Zellverbände erstreckten, moderate bis ausgeprägte Nekrosen der Drüsenzellen des Pankreas und eine milde bis schwere Enteritis. Das Epithel der Maulhöhle zeigte Hyperplasien und Nekroseherde. HOFFMANN et al. (2000) beobachteten eine Milzatrophie und submuköse Infiltrate in den vorderen Darmabschnitten. In den makroskopisch unauffälligen inneren Organen wurden von ihnen vereinzelt in Leber und hämatopoetischem Gewebe der Milz einzelne bis zu fünf Zellen umfassende Nekroseherde gefunden. Entzündungsbedingte Veränderungen konnten bei einem Teil der untersuchten Fische auch in Gehirn und Ganglienzellen gefunden werden (WALSTER 1999). 39 Literaturübersicht PIKARSKI et al. (2004) diagnostizierten bereits am zweiten Tag p.i. eine interstitielle Nephritis, die sich innerhalb der nächsten Tage verschlimmerte. Ab Tag sechs kam es zu einer Blutstauung, ab Tag acht zu massiven Entzündungszellinfiltraten. In vielen Nephronen traten Degenerationen des Tubulusepithels auf. Pathologische Kiemenveränderungen in Form von einem Verlust von Sekundärlamellen und Entzündungszellinfiltraten traten ab dem zweiten Tag p.i. auf. Ab Tag sechs p.i. verstärkten sich die Kiemenschäden, es kam zu einem kompletten Zusammenbruch der Kiemenarchitektur und schweren Entzündungsreaktionen in fast allen Organen. Die Leber zeigte schwache Entzündungszeichen, die vor allem im Parenchym auftraten, während die histologische Untersuchung des Zentralnervensystems fokale meningeale und parameningeale Entzündungen offenbarte. Für Herpesviren typische eosinophile intranukleäre Einschlußkörperchen beobachteten BRETZINGER et al. (1999), ARIAV et al. (1999), HOFFMANN et al. (2000) und HEDRICK et al. (2000) in nekrotischem oder degeneriertem Kiemen- und Maulhöhlenepithel, Milzparenchym und hämatopoetischem Nierengewebe. Durch transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen konnten herpesvirusähnliche Partikeln in den Zellkernen und dem Zytoplasma von Kiemenepithelzellen, in Darm, Hepathozyten und zirkulierenden Leukozyten detektiert werden (BRETZINGER 1999, HEDRICK et al. 2000, HOFFMANN et al. 2000, PERELBERG et al. 2003). 40 Literaturübersicht 2.8 Immunologie Die zelluläre Immunität scheint bei Herpesvirusinfektionen gegenüber der humoralen zu dominieren (ROLLE u. MAYR 1993). WALSTER (2000) beschrieb das Vorgehen einiger Fischzüchter, Koi dem Virus zu exponieren und durch eine Manipulation der Wassertemperatur ,,natürlich immune Fische“ zu erzeugen, bei deren Reexposition mit dem KHV die Mortalität von 80% und höher auf Mortalitäten von 5% abgesenkt werden konnte. Bei erneuter Reexposition schienen die Fische sich der Infektion gegenüber resistent zu verhalten. Auch GILAD et al. 2003 und RONEN et al. (2003) gaben an, dass Fische, die eine Infektion mit dem KHV überlebt haben, inklusive der Fische, deren Überleben durch das Anheben der Wassertemperatur gesichert wurde, eine mehr oder weniger stark ausgeprägte Resistenz gegenüber einer Reinfektion entwickelten (GILAD et al. 2003, RONEN et al. 2003). Anti-KHV-Antikörper wurden nach experimenteller und natürlicher Infektion von Koi gebildet. Diese ließen sich mit einem enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) nachweisen (ADKINSON et al. 2005). Die Konzentrationen der Antikörper wurden bei Serumverdünnungen von 1: 62500 in einer Koipopulation, die ein Jahr lang nach einer natürlichen Infektion in virusfreiem Wasser gehalten wurden, gemessen. 42-47 Tage nach dem Ausbruch hatten fast alle untersuchten Fische detektierbare Spiegel an Anti-KHVAntikörpern. Ein Jahr nach dem Ausbruch hatten die Koi ähnlich hohe Antikörpertiter. Es bestand eine geringe Kreuzreaktion mit Antikörpern gegen das CyHV-1. Eine passive Immunisierung durch Gabe von Anti-KHV-Antikörpern schützte naive Koi nur teilweise vor einer Belastungsinfektion über das Bad. Der teilweise Schutz war nur von kurzer Dauer, die Inkubationszeit in einigen Fällen etwas länger. ADKINSON et al. (2005) gehen davon aus, dass Koi, die nach Ablauf des Jahres immer noch hohe Antikörpertiter gegen das KHV hatten, Carrier waren und dass eine Resistenz gegen das KHV großteils durch eine zellvermittelte Immunität hervorgerufen wurde. 41 Literaturübersicht 2.9 Diagnose Nach dem ersten Auftreten des Krankheitsbildes bei Koi stand noch keine Untersuchungsmethode zur weitergehenden Labordiagnostik zur Verfügung. Durch Ausschluß von Wasserqualitätsmängeln und anderen, bei Cypriniden vorkommenden Krankheitserregern parasitologischen, bakteriologischen, mykotischen und virologischen Ursprungs als Primärursache wurde in Verbindung mit einer histologischen Untersuchung auf eine neuartige Erkrankung viraler Genese geschlossen (ARIAV et al. 1999, WALSTER 1999, BODY et al 2000). Bereits seit 1999 wurden durch transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen herpesvirusähnliche Partikel in den Kernen und im Zytoplasma des Kiemenepithels nachgewiesen (BRETZINGER et al. 1999, HOFFMANN et al. 2000). Für transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen wird eine Mindestmenge von 106 Viruspartikeln bei einem guten Gewebezustand benötigt. Dies erfordert eine Probenentnahme zum optimalen Zeitpunkt. NEUKIRCH et al. (1999) isolierten von einem an Kiemennekrose leidenden Koi ein Virusisolat, das sich auf der Karpfenkiemenzelllinie „ common carp gill“ (CCG), der Karpfengehirnzelllinie „common carp brain“ (CCB) und der Epithelzelllinie „epithelioma papulosum cyprini“ (EPC) unter Bildung von Synzytien anzüchten ließ. Auf CCB-Zellen wurde der CPE, der sich durch die Bildung von Riesenzellen auszeichnete, am fünften Tag sichtbar. Die Synzytien breiteten sich innerhalb der folgenden vier bis fünf Tage in der Zellkultur aus. Auf CCG-Zellen entwickelte sich ab dem sechsten Tag ein CPE. Auf EPC-Zellen kam es erst am elften Tag zur Bildung von Synzytien. Kein CPE konnte auf einer Chinooklachsembryozelllinie und einer Zelllinie der Fettkopfelritze „fathead minnow“ (FHM) beobachtet werden. HEDRICK (2000) isolierte das für den initialen KHV-Ausbruch verantwortliche Virusisolat auf einer Koiflossen-(KF-1)-Zelllinie und charakterisierte es als Herpesvirus. Als Untersuchungsmaterial für die Anzucht auf Zellkultur eigneten sich besonders Niere, Milz und Kieme erkrankter Karpfen, aber auch aus Leber und Darm konnte Virus isoliert werden (HEDRICK et al. 2000). In der KF-1-Zellkultur bildeten sich innerhalb von fünf Tagen Synzytien und intrazytoplasmatische Vakuolen. Der CPE wurde darauf deutlicher und war am 14. Tag vollständig (HEDRICK et al. 2000). 42 Literaturübersicht NEUKIRCH u. KUNZ (2001) konnten ebenfalls von Koi, die aus einem erkrankten Bestand mit hohen Verlusten stammten, ein Virus, das sich auf CCB-Zellen und einer Karpfenflossenzelllinie mit einem CPE vermehrte, isolieren und als Herpesvirus klassifizieren. Von BODY et al. (2000) und OH et al. (2001) wurde eine Empfänglichkeit auch der FHMZellen für das KHV beschrieben. Die RTG-2-Zelllinie erwies sich als unempfänglich. Als optimale Wachstumstemperatur wurde von BODY et al. 21°C genannt, ein Wachstum konnte aber auch bei 14°C und 28°C beobachtet werden. GILAD et al. (2003) beobachteten den höchsten Virustiter am siebten Tag bei einer Bebrütung bei 20°C. Bei einer Inkubationstemperatur von 4°C und 10°C war der Titer mit 42 KID50/ml am siebten und 13. Tag gerade oberhalb der Nachweisgrenze. Bei 30°C und bei 37°C schien keine Virusvermehrung stattzufinden. Bei infizierten, bei 13°C gehaltenen Koi gelang der Nachweis auf Zellkultur nicht (GILAD et al. 2003). Der Virusnachweis durch Anzucht auf CCB- oder KF-1-Zellen kann bei klinisch erkrankten Fischen erfolgen, er ist jedoch nicht so zuverlässig, besonders wenn das Gewebe eingefroren wurde (POKOROVA et al. 2005). Eine andere Möglichkeit des Infektionsnachweises besteht darin, nach antiviralen Antikörpern zu suchen. ADKINSON et al. (2005) beschrieben einen Nachweis von AntiKHV-Antikörpern durch einen ELISA, der die KHV-spezifischen Immunglobuline noch ein Jahr p. i. nachweisen konnte. Es bestand allerding eine geringe Kreuzreaktion mit Antikörpern, die gegen das CyHV-1 gerichtet waren. Bei Fischen variiert die Persistenz detektierbarer Antikörpertiter gegen spezifische Pathogene erheblich (VESTERGAARD u. JOERGENSEN 1982, EGGSET et al. 1997). Eine zusätzliche Fehlerquelle stellen Fische dar, die noch keine Antikörper gebildet haben, weil sie sich in der Inkubationsphase befinden. Das KHV kann nach einer Infektion eine latente Infektion etablieren (ST-HILAIRE et al. 2005). Der Nachweis des Carrierstatus der Herpesviren ist schwierig, weil latent infizierte Tiere das virale Genom in sich tragen, ohne infektiöse Viruspartikel zu produzieren, die durch Zellkulturverfahren oder serologische Methoden erfasst werden könnten (COHRS u. GILDEN 2001, KHANNA et al. 2004) und die virale Genexpression stark heruntergeregelt ist (GALLOWAY et al. 1982), was den Nachweis der viralen Antigene erheblich erschweren 43 Literaturübersicht kann. Doch besonders die Detektion der symptomlos infizierten Fische ist wichtig, da sie in der Vergangenheit häufig Bestände von Koi oder Karpfen mit dem KHV infiziert haben (WALSTER 1999, NEUKIRCH u. KUNZ 2001) und die größte Gefahr für Bestände, die zuvor noch keinen Kontakt mit dem KHV hatten, darstellen (GILAD et al. 2002, GILAD et al. 2003). Wegen dieser Einschränkungen bei Zellkultur- und serologischen Verfahren eignen sich bei latenten Herpesvirusinfektionen molekularbiologische Untersuchungsmethoden zum Nachweis des viralen Genoms, wie die PCR (BOYLE u. BLACKWELL 1991, BEAK u. BOYLE 1996, GRAY et al. 1999b, SHIH et al. 2003, GILAD et al. 2004, GOODWIN et al. 2006). Die Nachweismöglichkeiten verbesserten sich erheblich, als PCR-gestützte, sensitivere Nachweismethoden entwickelt wurden (GILAD et al. 2002, GRAY et al. 2002). GILAD et al. (2002) und GRAY et al. (2002) veröffentlichten Methoden zur Untersuchung von Kiemenmaterial und einem Organpool aus Gehirn, Milz und Niere. GILAD et al. (2002) beschrieben eine PCR-Methode, die es ermöglichte, 1 Pikogramm KHVDNA in 100 ng Wirts-DNA nachzuweisen. Das von ihnen entworfene Primerpaar KHV-F und KHV-R amplifizierte ein Fragment von 484 bp. Die Methode eignete sich zum Nachweis bei akuten Ausbrüchen. Zum Nachweis symptomloser Virusträger, den Fischen, die hauptsächlich zu einer Verbreitung des KHV beitragen, eignete sie sich nicht unbedingt (GILAD et al. 2002). GRAY et al. (2002) verglichen zwei verschiedene Primerpaare miteinander, das BamHI-6Primerpaar, das ein 365 bp großes Fragment amplifizierte, und das SphI-5-Primerpaar (GRAY-2F und GRAY-2R), bei dem das amplifizierte Fragment eine Größe von 290 bp hatte. Mit beiden Primerpaaren konnte in Kieme, Darm, Niere und Leber KHV-DNA nachgewiesen werden, aber nur letztgenanntes Primerpaar detektierte auch im Gehirn KHVDNA. Die Methode eignete sich zur Detektion von 100 Femtogramm oder ca. 600 DNAKopien von genomischer DNA des KHV. Ein auf dem Thymidinkinase-Gen basierendes Primerpaar wurde von BERCOVIER et al. (2005) beschrieben. Es amplifizierte ein Fragment von 409 bp. Die beschriebene PCR eignete sich zur Detektion von 10 Femtogramm KHV-DNA oder 30 Virionen. Verglichen mit der Virusisolation auf Zellkultur und den von GILAD et al. (2002) und GRAY et al. (2002) 44 Literaturübersicht beschriebenen PCR-Methoden erwies sich die PCR mit den Thymidinkinaseprimern zehn bis 1000-mal sensitiver (BERCOVIER et al. 2005). Die Methode eignete sich zum Nachweis der Infektion bei zwei Monate zuvor infizierten Fische, die mit der Methode von GILAD et al. (2002) und GRAY et al. (2002) nicht detektiert wurden. Eine auf einer zufällig gewählten DNA-Sequenz basierende PCR-Methode ist anfälliger für das Vorkommen von falsch negativen Ergebnissen durch zufällige Mutationen oder Deletionen als eine auf die Struktur oder Virulenz festlegenden Genen basierende Methode (BERCOVIER et al. 2005). Die Thymidinkinase ist essentiell für die Virulenz der Herpesviren (BOIVIN et al. 2002) und daher gut geeignet für die Entwicklung einer PCR-Methode (BERCOVIER et al. 2005). DIXON hielt Primerpaare, die ein kürzeres DNA-Fragment amplifizieren, für zuverlässiger im Nachweis von KHV-DNA (siehe HAENEN u. HEDRICK 2006). Er erachtete das von BERCOVIER et al. (2005) entwickelte Primerpaar als das sensitivste. Neuere Entwicklungen bestehen in der Etablierung einer zeitsparenden real-time TaqMan PCR (GILAD et al. 2004) und der hochspezifischen, Temperaturwechsel hochsensiblen, verzichtenden und loop-mediated dennoch zeitsparenden, isothermal amplification da auf (LAMP) (GUNIMALADEVI et al. 2004). Die LAMP-Methode erfordert keinen Thermocycler. Der Einsatz von zwei Primerpaaren, die sechs verschiedene Regionen der template DNA erkennen, bedingt eine erhöhte Ausbeute an amplifizierter DNA. Die Gefahr von unspezifischen Produkten ist geringer als bei der herkömmlichen PCR. Die real-time TaqMan PCR (GILAD et al. 2004) konnte KHV-DNA nicht nur detektieren, sondern in einem Bereich von 101 bis 107 Genomkopien auch quantifizieren. Die TaqMan PCR ist ebenso sensitiv oder noch sensitiver als die konventionelle PCR, und sie besitzt durch eine Automatisierung verschiedener Arbeitsschritte ein geringeres Kontaminationsrisiko (GILAD et al. 2004). Das amplifizierte Fragment hatte eine Größe von 78 bp. Eine Einigung auf eine einheitliche PCR-Methode für die Diagnostik erscheint notwenig. PCR-Untersuchungen in verschiedenen Untersuchungseinrichtungen ergeben häufig unterschiedliche Ergebnisse. Andererseits ist die PCR so sensibel gegenüber Veränderungen der Reaktionbedingungen, das sie schwer zu standardisieren ist (siehe HAENEN u. HEDRICK 2006). 45 Literaturübersicht 2.10 Differentialdiagnose Bei hohen Morbiditäten und Mortalitäten, wie sie häufig im Zusammenhang mit KHVInfektionen auftreten, sind zuerst Wasserqualitätsmängel auszuschließen (ARIAV et al. 1999). Haut- und Kiemenschäden, Dyspnoe, Verhaltensveränderungen wie Apathie, Anorexie und zentralnervöse Ausfallerscheinungen können auch bei einer hohen Ammonium- oder Nitritkonzentration im Wasser beobachtet werden (BAUR u. RAPP 2003). Aufgrund der akuten Krankheitserscheinungen wie Kiemennekrose und Dermatitis sind bakterielle, mykotische und parasitologische Primärinfektionen auszuschließen. Der Nachweis fakultativ pathogener Bakterien oder Pilze vermag häufig das rasante Krankheitsgeschehen nicht zu erklären. 46 Literaturübersicht 2.11 Bekämpfung und Impfung Kontinuierliche Wasserwechsel, das tägliche Absammeln toter Fische und Veränderungen der Wassertemperatur können die Mortalität senken. Bei Erreichen der ursprünglichen Temperatur kann die Krankheit aber erneut ausbrechen (WALSTER 1999). 2000 nennt WALSTER die Zugabe von Salz zu dem Haltungswasser als geeignete Maßnahme, um Sekundärinfektionen zu reduzieren. Er empfahl außerdem, die Haltungstemperatur auf über 26°C anzuheben, bis die Mortalität zurückgeht, und sie dann auf Temperaturen unterhalb von 18°C zu senken. Im Falle von gefährdeten Großbeständen riet WALSTER (2000) zur Inbetrachtnahme einer Virusexposition mit folgender Temperaturmanipulation. Dieses Vorgehen vermochte die Mortalität allerdings nur geringfügig zu reduzieren (WALSTER 2000). Auch beim AHV ließ sich die Mortalität durch eine Senkung der Wassertemperatur auf 22°C reduzieren (HAENEN et al. 2002). KASAI et al. (2005) evaluierten mittels Zellkulturverfahren die viruziden Effekte ultravioletten Lichtes, Hitzebehandlung und chemischer Desinfektionsmittel auf das KHV. Das auf KF-1-Zellen vermehrte KHV-I, das durch HEDRICK (2000) von Fischen eines Ausbruches in Israel isoliert wurde, wurde durch eine UV-Bestrahlung mit einer Dosis von 4000µWs/cm2 oder Erhitzung auf 50°C für eine Minute komplett inaktiviert. Bei einer Erhitzung der Viruslösung auf 40°C für 0,5 bis 5 min blieb eine Restinfektiösität von 71,4 bzw. 26,8% verglichen mit der unbehandelten Viruslösung erhalten. Ebenfalls eigneten sich bei einer Temperatur von 15°C eine Iodophorlösung mit einer Konzentration von 200 mg/l Iodophor, eine Benzalkoniumchloridlösung mit 60 mg/l und eine 30%-ige Ethanollösung für 20 min zur Virusinaktivierung. Bei einer halb- bzw. zwanzigminütigen Einwirkung einer Chlorkonzentration von 0,3 mg/l, die nach dem Mischen einer Natriumhypochloridlösung mit dem Zellkulturüberstand vorlag, konnte eine 97,5%-ige bzw. 98,5%-ige Reduktion der Infektiosität verglichen mit der unbehandelten Viruslösung gemessen werden. Bei einer Desinfektion mit halogenhaltigen Mitteln muß beachtet werden, dass organisches Material die Wirkung sehr stark reduziert, deshalb muß die Halogenkonzentration nach dem Zusatz des Desinfektionsmittels zu der zu desinfizierenden Flüssigkeit bestimmt werden. Häufig muß das zehn- bis hundertfache der empfohlenen Endkonzentration zugegeben werden. Empfohlen 47 Literaturübersicht wird deshalb eine Chlorkonzentration von 3 mg/l, um das KHV komplett zu inaktivieren (KASAI et al. 2005). Aufgrund ihrer Lipidhülle sind freie Herpesviren vergleichsweise labil gegenüber Umwelteinflüssen und Desinfektionsmitteln. In der Natur, wo die Viren meist zell- bzw. gewebegebunden vorliegen, kann die Infektiösität innerhalb eines pH-Bereiches von 5 bis 8 bis zu einem Monat stabil bleiben. Bei Temperaturen von über 25°C werden freie Herpesviren innerhalb von Tagen, ab 55°C in Minuten inaktiviert. Kälte stabilisiert die Infektiösität. Der Virusgehalt geht bei 4°C allmählich, bei -20°C sehr langsam zurück (ROLLE u. MAYR 1993). NEUKIRCH (2003a und b) untersuchte mittels Zellkulturverfahren den Einfluß von Temperatur und pH-Wert auf die Vermehrungsfähigkeit des KHV. Bei 4°C und 10°C kam es zu keiner Virusvermehrung. Bei 15°C erreichte das Virus am 27. Tag den höchsten Titer, bei 20°C am achten und bei 25°C am sechsten Tag. Bei 20°C und 25°C vermehrtes Virus war gleich infektiös und nur unwesentlich infektiöser als das bei 15°C vermehrte. Bei einer Vermehrung bei 30°C trat in der Zellkultur am sechsten Tag ein CPE auf, eine Quantifizierung der Infektiösität gelang nicht. Bei 35°C trat keine detektierbare Virusvermehrung auf. NEUKIRCH (2003a und b) vermutete, dass im Fischorganismus bei 30°C unter ungünstigen Bedingungen eine Virusvermehrung stattfinden könne, die bei einem nicht mehr ganz so effektiv arbeitenden Immunsystem zwar nicht zu einer Erkrankung, aber zu einer Integration des Virusgenoms in das Genom infizierter Fischzellen führen könnte. Nicht mehr nachweisbares Virus wäre dann zeitlebens im Wirtsorganismus präsent und reaktionsfähig, gleichbedeutend mit der Entstehung einer latenten Infektion. Nach einem zweistündigen Einwirken eines pH-Wertes von über 11 oder unter 4 verlor das KHV seine Infektiosität. Bei einer Lagerung bei 15°C verlor das KHV am 42. Tag seine Infektiösität, bei 20°C am 22. Tag, bei 25°C am 13. Tag, bei 30°C am sechsten Tag und bei 35°C am zweiten Tag. Nach zehnmaligem Einfrieren und Auftauen nahm die Infektiösität nur wenig ab (NEUKIRCH 2003a und b). Untersuchungen zur Persistenz des KHV in Wasser und Sediment liegen von SHIMIZU et al. (2006) vor. Eine signifikante Reduktion der Infektiösität in Wasser und Sediment trat innerhalb von drei Tagen auf. In autoklaviertem oder filtrierten Wasser blieb das KHV 48 Literaturübersicht hingegen länger als sieben Tage infektiös. In autoklaviertem, Sediment enthaltenden Wasser fiel die Infektiösität innerhalb von sieben Tagen unter die Nachweisgrenze. Forschung zum Zweck der Impfstoffherstellung wurde an der hebräischen Universität in Jerusalem betrieben. RONEN et al. (2003) beschrieben eine Vakzinierung mit einem attenuierten Lebendimpfstoff, der unter experimentellen Bedingungen die Mortalität von 82% auf 39% zu reduzieren vermochte. Bei der Immunisierung mit einem attenuierten Virus besteht jedoch die Gefahr einer Virulenzsteigerung durch Rückmutation des Impfvirus infolge der Übertragung von Tier zu Tier (NEUKIRCH 2003c). Das Impfvirus kann in das Wirtszellgenom aufgenommen werden, unter starker Belastung könnten die Impflinge zu Ausscheidern werden. Ein inaktivierter Impfstoff ist nicht mit dieser Gefahr verbunden. Ein solcher konnte jedoch noch nicht entwickelt werden (NEUKIRCH 2003c). YASUMOTO et al. (2006) entwickelten aufgrund der Dringlichkeit, Karpfen durch eine Vakzine gegen eine Erkrankung an dem KHV schützen zu können, eine in Liposomen verpackte orale Vakzine, die formalininaktiviertes KHV enthielt und täglich über drei Tage verabreicht wurde. Auch sie hielten eine Lebendvakzine wegen der Möglichkeit einer Rückmutation für zu gefährlich und inaktivierten das KHV mit 0,3% Formalin für 48 Stunden bei 24°C. Es wurden zwei sich in der Herkunft unterscheidende formalininaktivierte Virusstämme eingesetzt. Durch einen Immunfluoreszenztest detektierten sie markiertes KHVAntigen in den Epithelzellen des Enddarmes. Die in Liposomen verpackten KHV-Antigene wurden also im Enddarm absorbiert und führten dort zu einer Stimulation des Immunsystems und Ausbildung einer protektiven Immunität. Die Titer an neutralisierenden Antikörpern waren 22 Tage nach der Immunisierung bei den Impflingen signifikant höher als bei nicht geimpften Kontrollfischen. Zu diesem Zeitpunkt erfolgte eine Belastungsinfektion, bei der den Karpfen Virus auf die Kiemen geträufelt wurde. Die Immunisierung reduzierte die Mortalität von 90% auf 23% bei dem einen und von 67% auf 23% bei der anderen Viruspräparation. Bei sechs von 23 überlebenden Impflingen konnte KHV-DNA in Kieme und/oder Niere nachgewiesen werden. In der Kieme eines Fisches konnte infektiöses KHV detektiert werden. PERELBERG et al. (2005) dagegen attenuierten das KHV durch 26 Zellkulturpassagen auf KF-1-Zellen und setzten es als Lebendvakzine ein. Eine vierzigminütige Immersion der 49 Literaturübersicht Karpfen in virushaltigem Wasser reichte für eine Infektion aus. Die Zeit, während der die Fische dem Virus über das Bad exponiert waren, beeinflußte die Überlebensrate signifikant. Bei einer Exposition für fünf min überlebten 30% der exponierten Fische, bei 40 min nur 10%. Eine Immunität konnte nur ausgebildet werden, wenn die Impflinge bei einer Temperatur gehalten wurden, die die Virusvermehrung im Fisch erlaubte. Bei einer Haltung bei 30°C für 30 Tage nach der Impfung konnte keine Ausbildung einer Immunität beobachtet werden. Bei einer Haltung bei 27°C waren die Fische nur wenig geschützt gegenüber einer Belastungsinfektion. Bei einer Haltung bei 23°C trat nach einer Belastungsinfektion eine stark reduzierte Mortalität auf, es überlebten mehr als 95% der Karpfen. Die Belastungsinfektion erfolgte durch intraperitoneale Injektion von ca. 200 PFU oder über das Bad mit 10-40 PFU/ml. Eine zehnminütige Immunisierung über das Bad reichte, um Karpfen zu infizieren und eine Immunität auszubilden. Das attenuierte und klonierte Virus war instabiler als das Wildtypvirus. Derart immunisierte Fische zeigten über einen Beobachtungszeitraum von sechs Monaten keine Krankheitsanzeichen. Eine Kohabitation mit naiven Karpfen löste innerhalb von 21 Tagen keine Erkrankung aus. Das attenuierte Virus blieb mindestens zwei Stunden lang im Wasser infektiös (PERELBERG et al. 2005). Obwohl der durch Zellkulturpassagen attenuierte Lebendimpfstoff keine Pathogenität für die Impflinge zu besitzen schien, entwickelten PERELBERG et al. (2005) ihn anschließend weiter, indem sie ihn 30 Sekunden lang mit UV-Licht bestrahlten, um die Gefahr einer Rückmutation und Virulenzsteigerung zu verringern. Ein Großteil der derart immunisierten Fische überstand eine Belastungsinfektion. Auch bei der Impfung von Welsbrütlingen gegen das CCV wurde ein durch mehrere Passagen auf Zellkulturen nahe verwandter Arten attenuiertes Virus, das über das Wasser appliziert wurde, eingesetzt. Eine einzige Vakzination über das Bad verlieh einen nur ungenügenden Schutz vor einer Infektion mit einem virulenten Stamm. Bei zweimaliger Vakzination über das Bad war der Schutz wesentlich größer (WALCZAK et al. 1981). NOGA et al. (1981) hatten kurz zuvor die selbe Erfahrung bei der Injektion des attenuierten Virus gemacht. 50 Material und Methoden 3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 Virus 3.1.1 Herkunft Für Infektionsversuche wurde in Zellkultur vermehrtes Virus des KHV-I-Isolates verwendet, das von HEDRICK et al. (2000) bei einem Ausbruch in Israel isoliert wurde. Es wurde vom Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesinstitut für Tiergesundheit, bezogen. Es ist dort unter der Nummer KHV 182 gelistet. Bei dem in den Versuchen verwendeten Virus handelte es sich um die 14. Passage auf CCB-Zellen. Es hatte einen Titer von 5000 KID50/ml. 3.1.2 Zellkultur Zur Virusvermehrung und –titration wurde die von NEUKIRCH et al. (1999) entwickelte Karpfengehirnzelllinie CCB verwendet. Die Zellen wurden in einem Medium aus Minimum Essential Medium (MEM) mit Earle´s Salz und L-Glutamin (PAA, Pasching), 3,5 g D(+)Glukose/l (Applichem, Darmstadt), 10% fötalem Kälberserum (Biochrom, Berlin), 79,6 mg/l nichtessentiellen Amonosäuren (PAA, Pasching), 200 000 U/l Penicillin und 200 mg/l Streptomycin (PAA, Pasching) kultiviert. Sie wurden bei 20°C bebrütet und alle fünf bis sieben Tage subkultiviert. Hierfür wurden konfluente Monolayer in einer 75 cm2 Zellkulturflasche (Nunc, Wiesbaden) durch 5 ml einer Lösung aus Dulbecco´s PBS (PAA, Pasching), 0,05% Trypsin (PAA, Pasching) und 0,02 % EDTA (PAA, Pasching) gelöst. Zur Neutralisation des Trypsins wurde anschließend die gleiche Menge Zellkulturmedium zugegeben und die Zellen durch Hoch- und Runterpipettieren in einer 15-ml-Einmalpipette (Nunc, Wiesbaden) vereinzelt. Die Zellen wurden dann in einem Verhältnis von 1:2 auf zwei 75 cm2 Zellkulturflaschen aufgeteilt, in die jeweils 10 ml Zellkulturmedium vorgelegt wurde. 3.1.3 Virusvermehrung Zur Virusvermehrung wurden 5 ml Zellkulturmedium mit Virus auf konfluente, einen Tag alte CCB-Monolayer in einer 75 cm2 Zellkulturflasche gegeben. Der Zellrasen wurde eine 51 Material und Methoden Stunde bei 25°C mit dem Virus inkubiert. Dabei wurden die Zellkulturflaschen alle 15 min vorsichtig bewegt, um eine optimale Verteilung des Virus auf dem Zellrasen zu gewährleisten. Anschließend wurden 10 ml Zellkulturmedium zugegeben. Die Zellkulturen wurden täglich mikroskopisch untersucht und Veränderungen protokolliert. Am sechsten Tag wurden die Zellkulturflaschen bei –70°C eingefroren. Zur weiteren Virusvermehrung oder zur Bestimmung der Infektiösität des Virus wurde die zellhaltige Viruslösung aufgetaut und unmittelbar verwendet. Nach Abschluß des Vermehrungsvorganges wurde das Virus aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei -70°C gelagert. 3.1.4 Die Virustitration Infektiösität des Virus wurde durch Titration mit der logarithmischen Endpunktverdünnungsmethode auf einer Mikrotiterplatte anhand einer nach KÄRBER (1931) modifizierten Methode kalkuliert. Auf eine Mikrotiterpatte mit 96 Vertiefungen (Nunc, Wiesbaden), die mit einem Tag alten CCB-Zellen konfluent bewachsen waren, wurden pro Vertiefung 0,2 ml einer zehnfachen Verdünnungsreihe der Viruslösung gegeben. Pro Verdünnungsstufe wurden Zellen in vier Vertiefungen infiziert. Auf jeder Mikrotiterplatte wurde in vier Vertiefungen eine Zellkontrolle durchgeführt, bei der der Zellrasen mit 0,2 ml Zellkulturmedium inokuliert wurde. Die beimpfte Mikrotiterplatte wurde 14 Tage bei 25°C und 2% CO2 bebrütet. Täglich wurde der Zellrasen mikroskopisch untersucht. Dabei wurde insbesondere auf Verfärbungen des Zellkulturüberstandes, abgelöste Zellen, Riesenzellbildung und mottenfraßähnliche Löcher im Zellrasen geachtet. 3.1.5 Inaktivierung Für Versuche zur Vakzinierung wurde sowohl hitzeinaktiviertes als auch formalininaktiviertes Virus hergestellt. Zur Hitzeinaktivierung wurde die Viruslösung für 5 Stunden bei 80°C inkubiert. In einem weiteren Versuch erfolgte die Hitzeinaktivierung, angelehnt an KASAI et al. (2005), 30 min lang bei 50°C. Die hitzebehandelte Viruslösung wurde danach zur Bestimmung der Infektiösität titriert und zur Immunisierung von Karpfen eingesetzt. 52 Material und Methoden Die Formalininaktivierung erfolgte mit einer Konzentration von 0,025 % Formalin (Merck, Darmstadt) für 72 Stunden bei 4°C. Die formalininaktivierte Viruslösung wurde danach zur Bestimmung der Infektiösität titriert und für die Immunsierung von Karpfen verwendet. 3.1.6 Virusnachweis Der Virusnachweis erfolgte mit molekularbiologischen Methoden. 3.1.6.1 DNA-Extraktion Die DNA aus Zellkulturen oder Leukozyten wurde mittels DNAzol (Invitrogen, Karlsruhe) extrahiert. Die DNA aus Gewebeproben wurde mittels DNAzol, dem QIAamp DNA Mini-Kit (Qiagen, Hilden) oder dem High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Mannheim) extrahiert. Für die Zentrifugationsschritte bei der Leukozytenseparation wurde die Megafuge 1.0 R (Haraeus, Hanau), bei der Extraktion die Biofuge A (Haraeus, Hanau) verwendet. 3.1.6.1.1 Extraktion der DNA aus Zellkulturen oder separierten Leukozyten mit DNAzol Zellkulturen wurden nach abschließender mikroskopischer Beurteilung bei –70°C eingefroren. Nach dem Auftauen wurden die in 5 ml des Zellkulturmediums enthaltenen Zellen 20 min bei 3023 g pelletiert. Das Pellet wurde in 200 µl des Zellkulturüberstandes resuspendiert. Nach der Zugabe von 1 ml DNAzol zu der Zelllösung bzw. zu der Lösung der separierten Leukozyten wurde 10 min bei 10062 g zentrifugiert. Der Überstand, in dem sich die DNA befand, wurde in ein steriles 1,5-ml-Reaktionsgefäß, in das 0,5 ml eiskaltes 99%iger Ethanol (Omnichem, Bremen) vorgelegt wurde, überführt. Es wurde vorsichtig gemischt und 3 min inkubiert. Dann erfolgte eine Zentrifugation für 15 min bei 10062 g. Das Pellet wurde getrocknet und zweimal mit 1 ml eiskaltem 75%igen Ethanol gewaschen. Das Ethanol wurde jeweils durch fünfminütige Zentrifugation bei 2515,5 g nach dem ersten Waschvorgang und 1609,92 g nach dem zweiten Waschvorgang entfernt. Das Pellet wurde getrocknet und in DNAse- und RNAse-freiem destillierten Wasser (Invitrogen, Karlsruhe) resuspendiert. 53 Material und Methoden 3.1.6.1.2 Extraktion der DNA aus Gewebeproben mit DNAzol Nach dem Auftauen wurden die Gewebeproben mit einer Schere und Homogenisatoren (Roth, Karlsruhe) zerkleinert. Zu 50 mg einer Gewebeprobe wurden in einem 1,5-ml-Reaktionsgefäß 150 µl TES- Puffer (20 mM Tris-HCl mit pH 8 (Invitrogen, Karlsruhe), 1 mM EDTA mit pH 8 (Applichem, Darmstadt), 50 mM NaCl (Applichem, Darmstadt), 8% Saccharose (Merck, Darmstadt) und 20 000 U Lysozym (Sigma-Aldrich, Taufkirchen) zugegeben, gemischt und 15 min geschüttelt. 1 ml DNAzol wurde zugegeben und gemischt. Dann wurden die Proben 10 min mit 10062 g zentrifugiert. Zur Präzipitation der DNA wurde der klare, die DNA enthaltende Überstand in ein neues 1,5-ml-Reaktionsgefäß überführt, in das 0,5 ml eiskalter 99%-iger Alkohol vorgelegt wurde. Nach einer Zentrifugation für 15 min bei 10062 g wurde das Pellet getrocknet. Dann wurde das Pellet mit 1 ml eiskaltem 75%-igen Alkohol gewaschen. Die anschließende Zentrifugation erfolgte für 5 min bei 2515,5. Das Pellet wurde getrocknet und erneut mit 1 ml eiskaltem 75%-igen Alkohol gewaschen. Dann wurde 5 min bei 1609,92 zentrifugiert. Das Pellet wurde getrocknet und in 50 µl DNAse- und RNAsefreiem destillierten Wasser resuspendiert. 3.1.6.1.3 Extraktion der DNA aus Gewebeproben mit dem QIAamp DNA Mini-Kit (Qiagen, Hilden) Die KHV-Virus-DNA-Isolierung mit dem Qiagen Kit wurde nach Herstellerangaben durchgeführt. Dabei wurden 25 mg einer aufgetauten, mit einer Schere und Homogenisatoren zerkleinerten Gewebeprobe in ein 1,5-ml-Reaktionsgefäß überführt und 180 µl ATL-Puffer (Qiagen, Hilden) und 20 µl Proteinase K (Qiagen, Hilden) zugegeben. Nach einer dreistündigen Inkubation bei 56°C wurden 200µl AL-Puffer (Qiagen, Hilden) zugegeben und 10 min bei 70°C inkubiert. Dann wurde die DNA durch Zugabe von 200 µl 99%-igem Ethanol ausgefällt. Die Probe wurde auf eine Silicagel-Säule (Qiagen, Hilden) in einem Sammelgefäß (Qiagen, Hilden) gegeben und bei 6439,68 g 1 min zentrifugiert. Dann wurde in der Säule befindliche DNA mit 500 µl AW1-Puffer (Qiagen, Hilden) gewaschen, bei 6439,68 g 1 min zentrifugiert und mit 500 µl AW2-Puffer (Qiagen, Hilden) gewaschen und bei 19721,52 g 3 min lang zentrifugiert. Um zurückgebliebene Waschlösung zu beseitigen, 54 Material und Methoden erfolgte eine weitere Zentrifugation bei 19721,52 g für 1 min. Durch Auftragen von 200 µl AE-Puffer (Qiagen, Hilden) und fünfminütige Inkubation wurde die in der Säule gebundene DNA resuspendiert und durch Zentrifugieren für 1 min bei 6439,68 g ausgewaschen. Die Virus-DNA wurde bei –20°C gelagert. 3.1.6.1.4 Extraktion der DNA aus Gewebeproben mit dem High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Mannheim) Die KHV-Virus-DNA-Isolierung mit dem Kit von Roche wurde nach Herstellerangaben durchgeführt. Dabei wurden 25 mg einer aufgetauten, mit einer Schere und Homogenisatoren zerkleinerten Gewebeprobe in ein 1,5-ml-Reaktionsgefäß überführt und 200 µl Gewebelysierungspuffer (Roche, Mannheim) und 40 µl Proteinase K (Roche, Mannheim) zugegeben. Nach einer einstündigen Inkubation bis zur kompletten Lyse bei 55°C wurden 200µl ,,Binding Buffer“ (Roche, Mannheim) zugegeben und 10 min bei 70°C inkubiert. Dann wurde die DNA durch Zugabe von 100 µl Isopropanol (Roth, Karlsruhe) ausgefällt. Die Probe wurde auf eine Säule (Roche, Mannheim) in einem Sammelgefäß (Roche, Mannheim) gegeben und bei 6439,68 g 1 min zentrifugiert. Zur Beseitigung des im ,,Binding Buffer“ enthaltenen Guanidinhydrochlorids wurde die auf der Säule befindliche DNA mit 500µl eines ,,Inhibitor Removal Buffers“ (Roche, Mannheim) gewaschen. Dann wurde die DNA zweimal mit 500 µl Waschpuffer (Roche, Mannheim) gewaschen und bei 6439,68 g 1 min zentrifugiert. Um zurückgebliebene Waschlösung zu beseitigen, erfolgte eine weitere Zentrifugation bei 19721,52 g für 10 s. Durch Auftragen von 200 µl 70°C warmem Elutionspuffer (Roche, Mannheim) auf die Säule wurde die in der Säule gebundene DNA resuspendiert und durch Zentrifugieren für 1 min bei 6439,68 g ausgewaschen. Die VirusDNA wurde bei –20°C gelagert. 3.1.6.2 Spektroskopische Bestimmung der DNA-Konzentration Im Anschluss an die Extraktion der DNA aus den für die Evaluierung der Methode eingesetzten Organpools wurde die DNA-Konzentration spektroskopisch ermittelt. Dazu wurde die optische Dichte mit dem Spektralphotometer Genequant pro (GE Health Care, 55 Material und Methoden München) bei einer Wellenlänge von 260 und 280 nm gemessen. Die Messung wurde mit einem Probenvolumen von 100 µl in einer Einmal-Küvette (GE Health Care, München) mit einem Zentimeter Durchmesser durchgeführt. Dafür wurde die DNA-Lösung in einem Verhältnis von 1: 50 mit dem entsprechenden Elutionspuffer verdünnt. Es fand eine Eichung mit den verwendeten Elutionspuffern statt. Für DNA liegt das Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 260 nm. Zuverlässige Ergebnisse erhält man bei OD-Werten zwischen 0,1 und 1. Ein OD-Wert von 1 entspricht einer DNA-Konzentration von 50 µg/ml. 3.1.6.3 PCR Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine enzymvermittelte in vitro-Technik zur Amplifikation eines definierten DNA-Abschnitts, welcher sich zwischen zwei Regionen mit bekannter Nukleotidsequenz befindet. Eine PCR besteht aus einer Wiederholung von Zyklen, die sich jeweils aus drei Schritten, die in der Temperatur differieren, zusammensetzen. Man unterscheidet Denaturierung, Annealing und Polymerisation. Bei der Denaturierung kommt es durch einen Erhitzungsvorgang zu einem Auseinanderweichen der beiden Doppelstränge der DNA-Helix. Es resultiert eine denaturierte, in zwei Einzelsträngen vorliegende DNA. Annealing bedeutet Anlagerung zweier Oligonukleotidprimer an die DNA. Primer sind ca. 18-30 Basen lange synthetische Oligonukleotide. Die Primer werden so entworfen, dass ein Primer an eine bestimmte Sequenz des einen Stranges bindet und der andere an eine in einiger Entfernung, meist 100-1000 Basen entfernt liegende Sequenz des komplementären Stranges. Die beiden Primer umschliessen den DNA-Abschnitt, der vermehrt werden soll. Die Bindung der Primer an die DNA erfolgt im wesentlichen über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Basen. Die Temperatur wird anschließend auf etwa 40-60°C abgesenkt, um die Bindung (Annealing) zu ermöglichen. Die erforderliche Temperatur ist abhängig von der Basenzusammensetzung der Primer. Während der anschließenden Polymerisation synthetisiert eine DNA-Polymerase von den Startpunkten, die die Primer darstellen, jeweils einen komplementären DNA-Abschnitt. Die Reaktionstemperatur beträgt in Abhängigkeit von der Art der Polymerase ca. 72°C. Dieser Zyklus aus Denaturierung, Annealing und Polymerisation wird 30-40mal wiederholt. Nach jedem Zyklus verdoppelt sich theoretisch die Zahl der amplifizierten Fragmente. 56 Material und Methoden Die PCR wurde mit einem Gesamtvolumen von 25 µl durchgeführt. Bei jedem Durchlauf wurden eine Positiv- und eine Negativkontrolle durchgeführt. Die DNA der Positivkontrolle stammte aus mit Zellkulturvirus infizierten CCB-Zellen, die Negativkontrolle aus einem Organpool eines SPF-Karpfens. Es wurden drei verschiedene Primerpaare (synthetisiert von MWG Biotech AG, Ebersberg) eingesetzt. Dabei handelte es sich um das von GILAD et al. (2002) entworfene Primerpaar KHV-F und KHV-R. Die Größe des amplifizierten Produktes betrug 484 bp. Weiterhin wurde das von BERCOVIER et al. (2005) entwickelte Thymidinkinaseprimerpaar KHV-TKf und KHV-TKr, das ein DNA-Fragment von einer Größe von 409 bp amplifizierte, verwendet. Zur Validierung der PCR-gestützten Nachweismethode wurde zusätzlich das Primerpaar KHVGray-2F und KHV-Gray-2R von GRAY et al. (2002) eingesetzt. Die Größe des amplifizierten Fragmentes betrug 290 bp. Tabelle 1 : Für den Nachweis des KHV-Genoms verwendete Primerpaare, Tm: Schmelzpunkt Designer Primer Sequenz Tm GILAD et al. KHV-F 5´-GACGACGCCGGAGACCTTGTG-3´ 65,7°C KHV-R 5´-CACAAGTTCAGTCTGTTCCTCAAC-3´ 61,0°C KHV-TKf 5´-GGGTTACCTGTACGAG -3´ 51,7°C KHV-TKr 5´-CACCCAGTAGATTATGC-3´ 50,4°C KHV-Gray-2F 5´-GACACCACATCTGCAAGGAG-3´ 59,4°C KHV-Gray-2R 5´-GACACATGTTACAATGGTGGC-3´ 57,9°C (2002) BERCOVIER et al. (2005) GRAY et al. (2002) Die PCR mit der Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Karlsruhe) wurde nach Gilad et al. (2002) mit 1x Amplifikationspuffer zur Verwendung mit MgCl2 (Invitrogen, Karlsruhe), 2 mM MgCl2 (Invitrogen, Karlsruhe), 0,03 µM Primern, 400 µM dNTP (Roth, Karlsruhe) und 1 U Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Karlsruhe) angesetzt. Die DNA wurde 5 min bei 95°C denaturiert. Dann folgten 39 Zyklen von 94°C für 1 min, 68°C für 1 min und 72°C für 30 s. Die finale Elongation fand bei 72°C für 7 min statt. Bei Verwendung der Primern von GRAY 57 Material und Methoden et al. (2002) und BERVOVIER et al. (2005) in dem oben beschriebenen PCR-Protokoll wurde die Annealingtemperatur geändert. Wie von den entsprechenden Autoren empfohlen, wurde für die Primer nach BERCOVIER eine Annealingtemperatur von 52°C gewählt, für die Primer von GRAY eine Annealingtemperatur von 55°C. Die PCR mit der Platinum Taq Polymerase (Invitrogen, Karlsruhe) wurde mit 1x Amplifikationspuffer zur Verwendung mit MgCl2 (Invitrogen, Karlsruhe), 1,8 mM MgCl2, 0,15 µM Primern , 800 µM dNTPs und 0,5 U Platinum Taq Polymerase angesetzt. Die initiale DNA-Denaturierung wurde bei 95°C für 5 min vorgenommen, daran schlossen sich 35 Zyklen von 94°C für 30 s, 55°C für 45 s und 72°C für 1 min an. Die finale Elongation bei 72°C lief 10 min lang. Bei Verwendung der Primer nach BERCOVIER et al. (2005) wurde die Annealingtemperatur von 55°C auf 52°C reduziert. Die PCR mit der Platinum Pfx Polymerase (Invitrogen, Karlsruhe) wurde mit 1x Amplifikationspuffer für die Pfx-Polymerase (Invitrogen, Karlsruhe), 2,5µl Enhancer, 1 mM MgS04, 0,02 µM Primern , 1,2 mM dNTPs und 0,5 U Platinum Pfx Polymerase angesetzt. Die DNA wurde 5 min bei 95°C denaturiert, dann folgten 35 Zyklen von 94°C für 30 s, 55°C für 45 s und 68°C für 1 min. Zur finalen Elongation wurde eine Temperatur von 68°C für 10 min eingestellt. Bei Verwendung der Tymidinkinaseprimer änderte sich die Annealingtemperatur, die statt 55°C nur 52°C betrug. Zur Amplifikation der Proben wurde ein Thermocycler Eppendorf Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg) verwendet. 3.1.6.4 Agarosegelelektrophorese der PCR-Produkte Bei der Gelektrophorese trennen sich die in der PCR amplifizierten DNA-Fragmente aufgrund der unterschiedlichen Wandergeschwindigkeit im elektrischen Feld entsprechend ihrer Größe. Die DNA-Banden wurden durch Zufügung des Farbstoffes Ethidiumbromid (Roth, Karlsruhe) zum Gel unter UV-Licht sichtbar gemacht. Bei der verwendeten Elektrophoresekammer handelte es sich um eine horizontale Mini-Elektrophoresekammer SubSystem 70 (Axon, Kaiserslautern). Es wurden je 9 µl PCR-Produkt mit 1,5 µl Ladepuffer (Roth, Karsruhe) gemischt und in die Taschen eines 1%igen Agarosegels (Invitrogen, 58 Material und Methoden Karlsruhe) pipettiert. Auf jedes Gel wurde sowohl eine Negativ- als auch eine Positivkontrolle aufgetragen. Als Größenstandard diente eine 100 bp DNA-Leiter (Roth, Karlsruhe). Als Stromquelle wurde das Power Supply EV243 (Roth, Karlsruhe) verwendet. Bei 30 min Laufzeit wurde eine Stromstärke von 90 Volt gewählt. Als Lauf- und Gelpuffer wurde ein TBE-Puffer (5,4 g Tris (Roth, Karlsruhe), 2,75 g Borsäure (Roth, Karlsruhe) und 2 ml 0,5 M EDTA (Applichem, Darmstadt), auf 1000 ml aufgefüllt mit A. dest.) benutzt. Das Gel wurde auf einen UV-Transilluminator (Biometra, Tl 1, Göttingen) gelegt und unter UVLicht abgelesen. Als positiv wurden die Proben bezeichnet, deren Banden auf Höhe der Bande der Positivkontrolle lagen und die anhand des Größenstandards die richtige, von den verwendeten Primern abhängige Größe des DNA-Fragmentes aufwiesen. 3.2 Trypanoplasma borreli Um latent mit KHV infizierte Karpfen der Belastung mit einem weiteren Infektionserreger auszusetzen, wurden sie mit einem klonierten Stamm des Blutflagellaten Trypanoplasma borreli (STEINHAGEN et al. 1989) infiziert. Dazu wurde infizierten Karpfen mit hoher Parasitämie mit einer 2-ml-Einwegspritze (WDT, Hannover) Blut aus der caudalen Hohlvene entnommen. In die Einwegspritze wurde zur Agglutinationshemmung eine mit LithiumHeparin bedampfte Kugel aus einem 1,3-ml-Mikro-Probengefäß LH (Sarstedt, Nürmbrecht) gegeben. In der Blutprobe enthaltene Trypanoplasmen wurden in einer NeubauerZählkammer ausgezählt. Dazu wurde das entnommene heparinisierte Blut mit PBS 1:50 verdünnt. In acht Großquadraten, die jeweils aus 16 Kleinquadraten bestehen, wurden alle Trypanoplasmen unter dem Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung gezählt und die Trypanoplasmenzahl je µl Blut mit Hilfe der entsprechenden Kammerformel errechnet. Kammerformel für die Berechnung der Trypanoplasmen: Trypanoplasmengesamtzahl/µl Blut = X*V*10/4 X: gezählte Trypanoplasmen V: Verdünnungsfaktor (=50) 59 Material und Methoden 3.3 Versuchstiere 3.3.1 Fische Für Infektionsversuche mit KHV verwendete SPF-Karpfen (Cyprinus carpio) waren Geschwistertiere der Linie R8F8*R3F8 (Agricultural University Wageningen, The Netherlands). Die dreijährigen Karpfen hatten ein Gewicht von ca. 100 g. Bei den in den Versuchen zur Vakzinierung eingesetzten SPF-Karpfen handelte es sich um bis zu 16 Monate alte Geschwistertiere der Linie R8*R3 (Agricultural University Wageningen, The Netherlands). Sie hatten ein Gewicht von bis zu ca. 10 g. In Experimenten zur Reaktivierung latenter Infektionen mit KHV wurden sowohl Koi mit latenten Feldinfektionen eingesetzt, als auch Karpfen nach überstandener Laborinfektion. Die Koi entstammten dem Patientengut der Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung. Zwei Koi mit einem Körpergewicht von ca. 500 g waren acht Wochen vor Versuchsbeginn durch Kontakt mit klinisch an KHV erkrankten Koi infiziert worden. Beide Fische zeigten keine Krankheitssymptome. Vier weitere Koi mit einem Gewicht von ca. 500 g entstammten einem Bestand von Koi und Goldfischen (Carassius auratus), in dem es drei Jahre zuvor zu einem KHV-Ausbruch gekommen war. Die überlebenden Koi und die Goldfische wurden in einer Außenhälterung bei natürlichen Temperaturverhältnissen gehalten, bevor sie der Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung übergeben wurden. Zur Untersuchung des Wirtsspektrums des KHV wurden Graskarpfen (Ctenopharyngeon idella), Schleien (Tinca tinca), Goldfische und Silberkarpfen (Hypophthalmichthys molitrix) verwendet. Schleien und Graskarpfen mit einem Gewicht von ca. 20 g wurden im Handel bezogen, ein früherer Kontakt mit dem Koi Herpes Virus war nicht bekannt. Die Goldfische entstammten dem Patientengut der Abteilung. Einige Goldfische mit einem Körpergewicht von ca. 100 g stammten aus oben genanntem Bestand mit klinisch apparenten Ausbruch einer KHV-Infektion unter den Koi vor drei Jahren. Sechs Monate vor Beginn des Versuches wurden die Goldfische von den Koi separiert. Ca. 20 g schwere Tiere einer zweiten Gruppe und ca. 10 g schwere Silberkarpfen kamen aus einem Bestand, in dem bei einer Routinekontrolle bei diesen Fischen Teile des KHV-Genoms nachgewiesen wurden, ohne dass eine KHV-Klinik auftrat. 60 Material und Methoden Zur Validierung der PCR-gestützten Nachweismethode wurden positiv auf KHV getestete Fischproben verwendet, die im Rahmen der Diagnostik im Institut eingegangen waren. In den Versuch gingen Proben von einem Goldfisch, einem Karpfen und drei Koi ein. Als negative Kontrolle dienten Proben von einem SPF-Karpfen. 3.3.2 Aufzucht und Haltung Die SPF-Karpfen wurden als befruchtete Eier von der Universität Wageningen (Niederlande) bezogen. Die Karpfen wurden dazu im Labor unter spezifisch parasiten- und virusfreien Bedingungen in einer mit rezirkulierendem Leitungswasser befüllten Kreislaufanlage bei 1523°C gehalten. Einmal täglich erfolgte eine Fütterung mit pelletiertem Karpfenfutter. Die Versuchsfische wurden in belüfteten Plastikaquarien gehalten. Täglich wurde restriktiv gefüttert, das Allgemeinbefinden und die Temperatur kontrolliert und in regelmäßigen Abständen ein Teilwasserwechsel durchgeführt. 3.3.3 Handling Bei der Manipulation der Fische wurden Einmalhandschuhe getragen. Für jedes Becken wurden separate Kescher, Schläuche und Narkosebecken verwendet. Vor dem Umsetzen von Versuchsfischen in andere Becken oder vor dem Zurücksetzen der Fische nach Stresssituationen in die Becken wurden diese mit 0,5 M Natronlauge (Applichem, Darmstadt) desinfiziert. 3.3.4 Narkose und Töten Für die Narkose wurden die Fische in mit Leitungswasser befüllte 1,5-l-Plastikaquarien (Rebie, Bielefeld) umgesetzt. Das Narkosemittel MS 222 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen) wurde mit ca. 0,15 g/l Wasser dosiert, bis der Augendrehreflex erloschen war. 61 Material und Methoden Um Fische zu töten, wurden diese in mit Leitungswasser befüllte 1,5-l-Plastikaquarien umgesetzt und ca. 0,5 g MS 222/l Wasser zugegeben, bis keine Atembewegungen mehr festgestellt werden konnten. 3.3.5 Organentnahme Zu Versuchsende wurden den Versuchsfischen Gewebepoolproben entnommen, um diese mittels PCR auf Teile des KHV-Genoms zu untersuchen. Kiemenproben und Blutproben wurden in der dritten Versuchsreihe des Stressversuches entnommen, um bei lebenden Fischen eine molekularbiologische Untersuchung durchführen zu können. 3.3.5.1 Entnahme von Gewebepoolproben Den Fischen wurden Teile der Organe Kieme, Niere, Milz, Gehirn und Leber entnommen und in einem sterilisierten 1,5-ml-Reaktionsgefäß (Sarstedt, Nürmbrecht) gepoolt. Für jeden Fisch wurde eine eigene sterilisierte Schere und Pinzette verwendet. Die Proben wurden bis zur weiteren Verarbeitung bei –20°C gelagert. 3.3.5.2 Entnahme von Kiemenbiopsien In Narkose wurde jedem Fisch mit einer sterilisierten Schere aus dem äußersten Kiemenbogen ein etwa hirsekorngroßes Stück herausgeschnitten und in ein sterilisiertes 1,5ml-Reaktionsgefäß überführt. Die Proben wurden bis zur weiteren Verarbeitung bei –20°C gelagert. 3.3.5.3 Entnahme und Separation von Leukozyten Periphere Blutleukozyten wurden durch Zentrifugation von agglutinationsgehemmtem Vollblut auf dem Trennmedium Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Norwegen) isoliert. Die Fische wurden zur Blutentnahme narkotisiert. Die Blutentnahme erfolgte aus der caudalen 62 Material und Methoden Hohlvene. Blutentnahmemedium (RPMI 1640 (PAA, Pasching) mit 10% A. dest. und 50 IE Natrium Heparin/ml (Serva, Heidelberg)) wurde im Volumenverhältnis 1:1 zur erwarteten Blutmenge in einer 5-ml-Einmalspritze (WDT, Hannover) vorgelegt. Das entnommene Blut wurde in der Spritze geschwenkt und bis zur zeitnahen Verarbeitung bei 4°C aufbewahrt. Alle anschließenden Zentrifugationen erfolgten bei 4°C. Die mit dem Blutentnahmemedium versetzten Blutproben wurden in Zentrifugenröhrchen (WDT, Hannover) gefüllt und zur Beschleunigung der Sedimentation 5 min bei 153 g zentrifugiert. Danach erfolgte eine zehnminütige Zentrifugation bei 425 g. Mit einer Pasteurpipette (Brandt, Wertheim) wurde die weiße Schicht, die sich zwischen Zellpellet und Überstand befand, abgenommen und in einem neuen Zentrifugenröhrchen auf 5 ml Lymphoprep aufgeschichtet. Es folgte eine Zentrifugation für 30 min bei 755 g. Die weiße Bande wurde wieder mit einer Pasteurpipette abgenommen und mit 5 ml Waschmedium (RPMI 1640 mit 10 % destilliertem Wasser und 10 IE Heparin/ml) gewaschen. Dann wurde 10 min bei 755 g zentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit 5 ml Waschmedium gewaschen und das Waschmedium jeweils durch zehnminütiges Zentrifugieren bei 425 g wieder entfernt. Das gewaschene Pellet wurde abschließend in 1 ml RPMI 1640 mit 1 % Karpfenserum resuspendiert. 3.4 Stressversuche Während zweier Versuchsreihen wurden unter natürlichen Bedingungen infizierte, symptomlose Koi mit verschiedenen Stresssituationen belastet. In einer weiteren Versuchsreihe erfolgte die Belastung von im Labor induzierten latenten Infektionen. Ein Teil der Virusträger wurde zu Versuchsende mit Zellkulturvirus reinfiziert, um zu untersuchen, ob duch eine erneute Virusexposition eine Erkrankung ausgelöst werden kann. Zudem sollte geprüft werden, ob die Fische nach erneutem Viruskontakt infektiöses Virus ausscheiden, ohne Krankheitsanzeichen zu zeigen. Die Auswirkung der Stresssituationen auf die Ausscheidung von infektiösem Virus wurde untersucht, um zu erkennen, ob sich das KHV so verhält, wie es typisch für Herpesviren ist -also belastende Situationen bewirken können, dass das Virus vom latenten in den aktiven Zustand zurückversetzt wird (ROIZMANN 1996)- und welche der Stresssituationen eine Virusreaktivierung induzieren kann. Zuvor erfolgte eine Kontrolle der spontanen Virusausscheidung durch die symptomlosen Viruscarrier. Hierfür 63 Material und Methoden wurden die Virusträger zwei Wochen bei 23°C ohne vorausgehende Belastung mit jeweils sechs nicht infizierten Karpfen kohabitiert. Als Stressmodelle wurden verschiedene Stressmodelle verwendet. Dabei handelte es sich um - ein simuliertes Abfischen - einen simulierten Transport - eine Exposition mit einem opportunistischen Krankheitserreger - eine Immunsuppression durch Verabreichung eines Kortikosteroids - eine Reinfektion der Virusträger Für das simulierte Abfischen wurde der Virusträger dreimal für jeweils 30 Sekunden im Kescher über dem Becken zappeln gelassen. Dazwischen wurde er zur Erholung jeweils eine Minute mit dem Kescher im Becken fixiert. Um den Transport zu simulieren, wurde der Virusträger im Haltungsbecken auf 6°C abgekühlt. Nach 48 Stunden wurde er wieder auf 23°C aufgeheizt. Um den Virusträger mit einem opportunistischen Krankheitserreger zu exponieren, wurde er per injectionem mit dem Blutparasiten Trypanoplasma borreli infiziert. Jeweils 10 000 Trypanoplasmen, die in 0,08 ml heparinisiertem Blut vorlagen, wurden hierfür in die Rückenmuskulatur injiziert. Zur Immunsuppression wurde dem Virusträger zweimal im Abstand von drei Tagen Prednisolon-Injektionssuspension (cp-pharma, Burgdorf) mit einer Dosierung von 10 mg/kg Körpergewicht in die Rückenmuskulatur injiziert. Ein Teil der Viruscarrier wurde mit dem KHV-I-Isolat reinfiziert. Mit einer Magensonde (WDT, Hannover) wurde den Fischen eine Virusdosis von 2500 KID50 in den Vorderdarm eingegeben. Nach zehn Tagen wurden jeweils sechs naive Karpfen zugesetzt und zwei Wochen lang bei 23°C kohabitiert. Ob eine Virusreaktivierung und erneute Virusvermehrung und -ausscheidung erfolgte, wurde in allen Versuchsreihen durch eine im Anschluß an die Belastung erfolgende Kohabitation des Virusträgers mit jeweils sechs naiven Karpfen untersucht. Die Kohabitation dauerte jeweils zwei Wochen und wurde bei einer Haltungstemperatur von 23°C durchgeführt. Die 64 Material und Methoden naiven Karpfen wurden bei dem simulierten Abfischen und dem simulierten Transport unmittelbar danach zugesetzt, bei der Immunsuppression im Anschluß an die zweite Injektion und bei der Exposition mit einem opportunistischen Krankheitserreger drei Wochen nach der Infektion mit den Blutparasiten. Nach der Kohabitation wurden die zugesetzten Karpfen getötet und einzeln mittels PCR untersucht. 3.4.1 Versuchsreihe 1 Die beiden Koi wurden unmittelbar nach ihrer Ankunft im Institut separiert und die spontane Virusausscheidung der Fische geprüft. Darauf wurden die beiden Koi mit dem simulierten Abfischen belastet. 3.4.2 Versuchsreihe 2 Die vier Koi wurden nach der Kontrolle der spontanen Virusausscheidung in unterschiedlicher Reihenfolge mit dem simulierten Abfischen, dem simulierten Transport und der Immunsuppression durch Kortikosteroidapplikation belastet. 3.4.3 Versuchsreihe 3 Für die Erzeugung von symptomlosen Virusträgern wurden naive Karpfen mit dem KHV infiziert. Hierfür wurden zwölf SPF-Karpfen drei Wochen lang bei 23°C mit einem an KHV erkrankten Koi kohabitiert. Zum Nachweis der erfolgten Infektion wurden die Karpfen danach narkotisiert und Kiemenbiopsien und Blutproben für die Leukozytenseparation entnommen. Die Karpfen wurden danach in neue Aquarien umgesetzt. Zur Bekämpfung der Infektion und Induktion des Carrierstatus wurde die Haltungstemperatur schrittweise mit einer Temperaturänderung von 2-3°C/Tag auf 30-32°C angehoben. Diese Temperatur wurde für vier Wochen aufrecht erhalten. Dann erfolgte eine schrittweise Temperaturabsenkung mit einer Temperaturdifferenz von 2-3°C/Tag bis zu einer Temperatur von 23°C. Diese Temperatur wurde für vier Wochen gehalten. Die Karpfen wurden anschließend erneut narkotisiert und eine weitere Kiemenbiopsie entnommen. 65 Material und Methoden Drei Monate nach der Infektion wurden die Karpfen als Virusträger verwendet. Sie wurden separiert und bei jedem Virusträger wurde die spontane Virusausscheidung überprüft. Darauf wurden die Virusträger in unterschiedlicher Reihenfolge mit dem simulierten Abfischen, dem simulierten Transport und der Immunsuppression durch Kortikosteroidapplikation belastet. Abschließend wurden vier der neun Virusträger mit dem Blutparasiten Trypanoplasma borreli infiziert. Die anderen fünf Virusträger wurden mit Zellkulturvirus reinfiziert. 3.5 Untersuchung zum Wirtsspektrum des KHV Im Rahmen dieser Untersuchung wurde die Empfänglichkeit von Goldfischen, Graskarpfen, Schleien und von Silberkarpfen für das KHV überprüft. Zusätzlich wurde untersucht, ob diese Fischarten das Virus auf naive Karpfen übertragen können, auch wenn sie keine Anzeichen einer Erkrankung zeigen. Die Haltungstemperatur während der Versuche betrug 23°C. Die Versuchsfische wurden zu bestimmten Zeitpunkten des Versuches oder zu Versuchsende getötet und einzeln mittels PCR auf das Vorhandensein von Teilen des KHV-Genoms untersucht. Vor und nach den Versuchen wurden vier Karpfen aus der SPF-Haltung getötet, beprobt und untersucht. 3.5.1 Untersuchung der Empfänglichkeit von Graskarpfen und Schleien für das KHV und der Rolle als Überträger 25 Graskarpfen wurden durch zehntägige Kohabitation mit einem Virusausscheider dem Virus exponiert. Danach wurden die Graskarpfen in ein anderes Becken umgesetzt. Am 15. und 22. Tag nach dem Erstkontakt mit dem Virusausscheider wurden fünf Graskarpfen dem Haltungsbecken entnommen, getötet und untersucht. Am 15., 22. und 29. Tag nach dem Erstkontakt mit dem Virusausscheider wurden weitere fünf Graskarpfen dem Becken entnommen und mit jeweils vier SPF-Karpfen zwei Wochen lang kohabitiert. Nach der zweiwöchigen Kohabitation wurden die Graskarpfen und die Karpfen getötet, beprobt und untersucht. Vor Versuchsbeginn und am Ende wurden fünf Graskarpfen, die dem Virus nicht exponiert worden waren, getötet, beprobt und untersucht. 66 Material und Methoden 16 Schleien wurden zehn Tage lang mit einem Virusausscheider kohabitiert. Danach wurden die Schleien umgesetzt. Am 15. und 22. Tag nach dem Erstkontakt mit dem Virusausscheider wurden jeweils vier Schleien getötet und untersucht. Ebenfalls am 15. und 22. Tag nach dem Erstkontakt mit dem Virusausscheider wurden weitere vier Schleien dem Becken entnommen und zwei Wochen mit jeweils vier SPF-Karpfen kohabitiert. Vor und nach dem Versuch wurden vier Schleien aus dem ursprünglichen Haltungsbecken getötet und untersucht. 3.5.2 Untersuchung der Rolle von Goldfischen und Silberkarpfen als symptomlose Überträger des KHV Für die Untersuchung wurden bereits infizierte Goldfische und Silberkarpfen eingesetzt. Für den ersten Goldfischversuch wurden vier Goldfische mit sieben SPF-Karpfen über vier Wochen kohabitiert. Anschließend wurden alle Versuchsfische getötet, beprobt und untersucht. Im zweiten Goldfischversuch wurden fünf Goldfische zwei Wochen mit fünf SPF-Karpfen kohabitiert. Anschließend wurden die Karpfen in sterilisierte Aquarien umgesetzt. Nach einer Woche wurden sie erneut in sterilisierte Aquarien umgesetzt und mit fünf weiteren SPFKarpfen zwei Wochen kohabitiert. Danach wurden alle Fische getötet und untersucht. Für die Untersuchung der Silberkarpfen wurden fünf Fische dieser Art zwei Wochen lang mit fünf SPF-Karpfen kohabitiert. Anschließend wurden die Silberkarpfen und Karpfen getötet und untersucht. 3.6 Versuche zur Vakzinierung Zur Immunisierung wurden eine formalininaktivierte und eine hitzeinaktivierte Viruslösung eingesetzt und die Immunitätsbildung miteinander verglichen. Die Versuche wurden bei 23°C durchgeführt. Verstorbene Fische wurden täglich abgesammelt und beprobt. Überlebende Fische wurden zu Versuchsende getötet, beprobt und untersucht. Es erfolgte eine in vitro Kontrolle der Viruslösungen auf den Gehalt an vermehrungsfähigem Virus. Als negative Kontrolle wurde Zellkulturmedium, zur Bestimmung des Wachstumsverhaltens und der 67 Material und Methoden Nachweisbarkeit des Virus das hitzeinaktivierte und das formalininaktivierte und als positive Kontrolle das nicht inaktivierte Virus auf je eine konfluent mit einem Tag alten CCB-Zellen bewachsene Zellkulturflaschen gegeben. Die Zellkulturen wurde sieben Tage bei 25°C inkubiert und täglich mikroskopisch untersucht. Dann wurden die Zellkulturen mittels PCR getestet. Zusätzlich wurde die Infektiösität der Viruslösungen durch Titration bestimmt. 3.6.1 Impfversuch 1 Mit sechs Monate alten SPF-Karpfen wurden vier Gruppen von je zehn Karpfen gebildet. Zur in vivo Kontrolle der Infektiösität der nicht inaktivierten Viruslösung wurde eine Gruppe mit der unbehandelten Viruslösung mit 10 KID50/ml im Bad inkubiert. Eine Gruppe wurde mit der formalininaktivierten Viruslösung inkubiert, eine weitere Gruppe mit der hitzeinaktivierten Viruslösung, jeweils mit einer Konzentration von ursprünglich 10 KID50/ml. Eine weitere Kontrollgruppe wurde nur mit Zellkulturmedium in entsprechender Menge inkubiert. Es wurde eine Stunde lang inkubiert. Danach wurden die Fische in desinfizierte Becken umgesetzt. Nach drei Wochen wurden vier Fische pro Gruppe getötet und mittels PCR getestet. Die übrigen sechs Fische pro Gruppe wurden einer Belastungsinfektion über das Bad mit 1 KID50/ml für eine Stunde unterzogen. Darauf wurden die Fische in desinfizierte Becken umgesetzt. Nach drei Wochen wurden alle überlebenden Fische getötet und mittels PCR getestet. Da es durch die Belastungsinfektion in keiner der Gruppen zu Krankheitsanzeichen oder Todesfällen kam, wurde der Versuch mit einigen Änderungen wiederholt. Bei den Fischen des ersten Versuches wurde versucht, durch eine Belastung mit dem simulierten Abfischen eine Erkrankung auszulösen. 3.6.2 Impfversuch 2 Es wurden vier Gruppen aus je sechs zehn Monate alten SPF-Karpfen zusammengestellt. Diese wurden wie im vorhergehenden Versuch mit der hitze- und der formalininaktivierten Viruslösung immunisiert. Die wiederum nach drei Wochen erfolgende Belastungsinfektion wurde mit 10 KID50/ml vorgenommen. Die Fische wurden erneut über einen Zeitraum von drei Wochen gehalten. Da nach der Belastungsinfektion kein Unterschied in der Mortalität 68 Material und Methoden zwischen den geimpften und den nicht geimpften Fischen beobachtet werden konnte, wurde in einem dritten Versuch das Immunisierungsverfahren geändert. 3.6.3 Impfversuch 3 Aus 16 Monate alten SPF-Karpfen wurden acht Gruppen mit einer Gruppengröße von jeweils sechs Tieren und 8 Kontrollgruppen aus je vier Fischen zusammengestellt. Es wurde mit dem hitze- oder formalininaktivierten Virus über eine einstündige Badinkubation, i.p., rektal oder oral immunisiert. Für die rektale Immunisierung wurde die Viruslösung mittels einer Einmalspritze mit aufgesetztem dünnen Schlauch in den Enddarm appliziert. Die orale Immunisierung erfolgte durch Eingabe der Viruslösung mittels Magensonde in den Vorderdarm Bei der Badinkubation wurde eine Konzentration von ursprünglich 1000 KID50/ml eingestellt. Den Karpfen der anderen Gruppen wurde jeweils eine Menge an Viruslösung appliziert, in der sich vor der Inaktivierung 1000 KID50 befunden hatten. Zur Kontrolle der Infektiösität des verwendeten Virus wurde eine Gruppe mit unbehandelter Viruslösung über das Bad mit 10 KID50 infiziert, den Karpfen der anderen Gruppen wurde eine Dosis von 1000 KID50 i.p., in den Enddarm bzw. in den Vorderdarm appliziert. Als negative Kontrolle wurde eine Gruppe einer einstündigen Badinkubation mit Zellkulturmedium in der Menge, wie Viruslösung zur Immunisierung eingesetzt wurde, unterzogen. Die Karpfen der übrigen Gruppen erhielten die entsprechende Menge Zellkulturmedium i.p., in den Enddarm oder in den Vorderdarm. Nach drei Wochen wurden die überlebenden Fische einer Belastungsinfektion als einstündige Badinkubation mit einer Viruskonzentration von 10 KID50/ml. unterzogen. Die Fische wurden in desinfizierte Becken umgesetzt und weitere drei Wochen gehalten. Danach wurden alle überlebenden Versuchsfische getötet und untersucht. 69 Material und Methoden 3.7 Validierung der PCR-gestützten Nachweismethode Für den Vergleich verschiedener PCR-Methoden wurde für jeden der sechs Fische ein homogenisierter Organpool hergestellt. Von jedem Fisch wurde die DNA mittels drei verschiedener Extraktionsmethoden im Doppelansatz extrahiert. Die Ausbeute der extrahierten DNA wurde photometrisch bestimmt. Von jedem Fisch und jeder Extraktionsmethode wurde die DNA-Lösung mit der höheren DNA-Konzentration mittels PCR auf das Vorhandensein von Teilen des KHV-Genoms untersucht. Es wurden drei verschiedene Primerpaare und drei verschiedene Polymerasen eingesetzt und die Sensitivität der verschieden kombinierten Methoden miteinander verglichen. 70 Ergebnisse 4 ERGEBNISSE 4.1 Validierung der PCR-gestützten Nachweismethode Es wurde die Extraktion von genomischer DNA aus Gewebeproben mittels QIAamp DNA Mini Kit von Qiagen, High Pure PCR Template Preparation-Kit von Roche und DNAzol von Invitrogen miteinander verglichen. Da bei letztgenannter Methode die DNA aus 50 statt 25 mg Gewebe extrahiert wurde und die erhaltene DNA in 50 statt in 200 µl resuspendiert wurde, erfolgte eine Umrechnung der nach der DNAzol-Extraktion gemessenen DNAGehalte auf die Konzentrationsverhältnisse der beiden anderen benutzten Methoden. Die Tabelle 2 zeigt die Gehalte an DNA, die mit den unterschiedlichen Extraktionsmethoden gewonnen werden konnte, und die Proteinverunreinigung, die Tabellen 3, 4 und 5 fassen die Sensitivität, die mit unterschiedlichen Kombinationen aus Primerpaar und Polymerase erzielt werden konnten, zusammen. Die DNA-Lösung, die nach Anwendung sowohl des Roche- als auch des Qiagen-Kits gewonnen werden konnte, erschien bei der grobsinnlichen Untersuchung homogen. Bei der durch die DNAzol-Extraktion gewonnenen DNA-Lösung hatte sich am Boden des Reaktionsgefäßes ein mit bloßem Auge sichtbares Pellet abgesetzt, das sich nicht auflösen ließ. Aus den Geweben frischtoter Fische (IG 8 und SPF, Tabelle 2) bzw. nach dem Versterben direkt gekühlter und zeitnah eingebrachter Fische (LA) ließ sich aus den Geweben mehr DNA extrahieren als aus Geweben, die fortgeschritten autolytisch waren. Bei allen Extraktionsmethoden traten vereinzelt DNA-Lösungen auf, in denen so geringe DNAKonzentrationen vorlagen, dass die Konzentration photometrisch nicht bestimmt werden konnte. Dieses Problem trat mehrfach bei den autolytischen Proben der Fische HA und BE auf. Die Extraktion mit dem Qiagen-Kit lieferte die höchste Ausbeute an extrahierter DNA, die Extraktion mit DNAzol wiederum war nicht ganz so effektiv wie die Roche-Extraktion. Die Abweichung zwischen den Doppelansätzen war bei allen Extraktionsverfahren gering, die größten Abweichungen lagen bei der mit DNAzol extrahierten DNA vor. Proteinverunreinigungen traten bei der Extraktion von autolytischen Geweben häufig, ansonsten nur unregelmäßig auf. 71 Ergebnisse Tabelle 2: Proteinverunreinigung und DNA-Konzentration der im Doppelansatz in drei verschiedenen Extraktionsmethoden eingesetzten Gewebeproben, n.m.: nicht meßbar Qiagen- Roche-Extraktion Extraktion Probe DNAzolExtraktion OD260/ DNA- OD260/ DNA- OD260/ DNA- OD280 Konzen- OD280 Konzen- OD280 Konzen- tration tration tration SPF 1,89 430 1,83 248 1,80 72 SPF 2,02 430 2,10 268 1,53 152 BE 1,90 n.m. 2,14 n.m. 1,58 22 BE 1,75 53 1,90 53 1,65 21 HA 0,80 133 1,44 58 1,71 n.m. HA 1,50 n.m. 1,70 n.m. 1,78 n.m. LA 2,06 485 1,87 173 1,95 200 LA 2,10 468 1,97 143 1,84 247 MÜ 2,10 383 1,79 108 1,92 110 MÜ 2,90 310 1,93 140 1,92 71 IG 8 1,88 348 1,89 260 1,90 121 IG 8 1,17 n.m. 1,92 251 1,90 151 OD260/OD280: Verhältnis von der optischen Dichte, die bei 260 nm gemessen wurde, zu der optischen Dichte, die bei 280 nm gemessen wurde, Maß für die Proteinverunreinigung der DNA-Lösung SPF: Gewebepool eines frischtoten SPF-Karpfens, der der negativen Kontrolle diente BE: Gewebepool eines hochgradig autolytischen Koi HA: Gewebepool eines hochgradig autolytischen Karpfens LA: Gewebepool eines geringgradig autolytischen Koi MÜ: Gewebepool eines mittelgradig autolytischen Koi IG 8: Gewebepool eines frischtoten Goldfisches 72 Ergebnisse Sowohl die Wahl des Primerpaares als auch der Polymerase bestimmte wesentlich das Ergebnis der molekularbiologischen Untersuchung. Eine Primerpaar-Polymerase- Kombination konnte bei unterschiedlicher Extraktionsmethode zu stark differierenden Ergebnissen führen (siehe Tabelle 3 und 4 bei Gray/Pl. Pfx bei den verschiedenen Extraktionsmethoden). Der Vergleich der verschiedenen Primerpaare zeigte die vom Pimerpaar abhängige Sensitivität der PCR-Methode. Die mit allen Extraktionsverfahren gewonnene, in der PCR nach GILAD et al. (2002) eingesetzte DNA ließ sich mit den Primern von BERCOVIER et al. (2005) bis zu einer höheren Verdünnungsstufe nachweisen als mit den Primern von GILAD et al. (2002). Bei der Goldfischprobe IG 8 machte diese höhere Sensitivität bei allen Extraktionsverfahren den Unterschied von nicht nachgewiesen zu nachgewiesen aus. Die Sensitivität stieg bei jeder in der PCR nach GILAD et al. (2002) eingesetzten Probe um das zehn- bis hundertfache. Die Verbindung der PCR nach GILAD et al. (2002) mit dem von GRAY et al. (2002) entwickelten Primerpaar konnte nur bei der DNAzol-Extraktionsmethoden den infizierten Goldfisch detektieren. Bei den beiden anderen Extraktionsmethoden gelang der Nachweis bei dem infizierten Goldfisch nicht. Ansonsten ließen sich mit dieser Kombination ähnlich hohe Sensitivitäten erzielen wie mit dem Primerpaar von BERCOVIER et al. (2005). In vier Fällen waren die Primer von BERCOVIER et al. (2002) in Verbindung mit der Taq DNA Polymerase zehnmal sensitiver als die Primer nach GRAY et al. (2002). Einmal waren die Primer von Gray zehnmal sensitiver als die Primer von BERCOVIER et al. (2005), einmal hundertmal und einmal tausendmal. Wurde statt der Taq DNA Polymerase die Platinum Taq DNA Polymerase eingesetzt, war dieser Unterschied nicht mehr so deutlich. Die positiven Proben wurden dann mit allen Primerpaaren erfaßt. In zwei Fällen war mit den Primern von GILAD et al. (2002) eine um das zehnfach höhere Sensitivität zu errreichen als mit den Primern von BERCOVIER et al. (2005). In einem Fall wurde sogar eine um das tausendfach höhere Sensitivität beobachtet. Bei fünf Proben war die Sensitivität gleich. Bei sechs Proben war die Sensitivität mit den Primern von BERCOVIER et al. (2005) um das zehn- bis hundertfache größer als mit den Primern von GILAD et al. (2002). Die Primer von GRAY et al. (2002) ergaben mit dieser Polymerase eine ähnliche Sensitivität wie die von GILAD et al. (2002) entwickelten. Bei Verwendung der Platinum Pfx Polymerase war die Sensitivität mit den Primern von BERCOVIER et al. (2005) in sechs Fällen um das zehnfache und in einem um das 73 Ergebnisse hundertfache größer als mit den Primern von GILAD et al. (2002). Bei sechs weiteren Proben war die Sensitivität gleich. Bei der mit dem Qiagen-Kit extrahierten Goldfischprobe konnte mit dieser Polymerase die virale DNA nicht detektiert werden, bei der mit DNAzol extrahierten Goldfischprobe gelang bei Verwendung dieser Polymerase der Nachweis nur mit den Primern von BERCOVIER et al. (2005), nicht aber mit den von GILAD et al. (2002) und GRAY et al. (2002) entworfenen Primern. Die Verwendung der Platinum Pfx Polymerase in Verbindung mit den Primern von GRAY et al. (2002) erschien weniger geeignet, da die mit der DNAzol-Extraktion extrahierte DNA des Goldfischs und die mit dem Roche-Kit extrahierte DNA des Goldfisches und eines positiven Kois nicht detektiert wurde. Die Kombination aus Roche-Extraktion, Platinum Pfx Polymerase und Primerpaar von GRAY et al. (2002) detektierte die übrigen infizierten Fische nur bei unverdünntem Einsatz des DNA-Lösung. Bei Verwendung der Platinum Taq DNA Polymerase und den Primern nach GILAD et al. (2002) oder nach BERCOVIER et al. (2005) wurden alle positiven Proben detektiert. Zusätzlich zu dieser höheren Zuverlässigkeit im Nachweis wies die Platinum Taq DNA Polymerase die positiven Proben bis zu höheren Verdünnungsstufen nach als die Taq DNA Polymerase. Die Platinum Pfx Polymerase brachte kaum Vorteile gegenüber der Platinum Taq Polymerase. Die Sensitivität war nur unwesentlich höher, dafür wurde die Goldfischprobe nicht sicher als positiv erkannt. Besonders schlecht schnitt die Platinum Pfx Polymerase in Verbindung mit der DNAzol-Extraktion und den Primern von GILAD et al. (2002) ab im Gegensatz zu den Ergebnissen, die für diese Proben mit der Platinum Taq DNA Polymerase erzielt wurden. 74 Ergebnisse Tabelle 3: Nachweisgrenzen der verschiedenen Kombinationen aus Primerpaaren und Polymerasen nach DNA-Extraktion aus Fischgewebe mit dem High Pure PCR Template Preparation Kit von Roche Probe F+R/ TK/ Taq Taq Be 10-2 10-3 Ha 10-2 La Gray/Taq F+R/Pl. TK/Pl. Gray/Pl. F+R/Pl. TK/Pl. Gray/Pl. Taq Taq Taq Pfx Pfx Pfx 10-5 10-3 10-5 10-3 10-4 10-5 neg 10-3 10-6 10-3 10-4 10-3 10-4 10-5 100 10-3 10-4 10-3 10-4 10-4 10-4 10-5 10-5 100 Mü 10-1 10-4 10-3 10-4 10-5 10-4 10-5 10-5 100 IG 8 neg 100 neg 100 100 10-0 10-1 10-1 neg SPF neg neg neg neg neg neg neg neg neg SPF: Gewebepool eines frischtoten SPF-Karpfens, der der negativen Kontrolle diente BE: Gewebepool eines hochgradig autolytischen Koi HA: Gewebepool eines hochgradig autolytischen Karpfens LA: Gewebepool eines geringgradig autolytischen Koi MÜ: Gewebepool eines mittelgradig autolytischen Koi IG 8: Gewebepool eines frischtoten Goldfisches F+R/Taq: PCR mit den Primern nach GILAD et al. (2002) und der Taq DNA Polymerase TK/Taq: PCR mit den Primern nach BERCOVIER et al. (2005) und der Taq DNA Polymerase Gray/Taq: PCR mit den Primern nach GRAY et al. (2002) und der Taq DNA Polymerase F+R/Pl. Taq: PCR mit den Primern nach GILAD et al. (2002) und der Platinum Taq DNA Polymerase TK/Pl. Taq: PCR mit den Primern nach BERCOVIER et al. (2005) und der Platinum Taq DNA Polymerase Gray/Pl. Taq: PCR mit den Primern nach GRAY et al. (2002) und der Platinum Taq DNA Polymerase F+R/Pl. Pfx: PCR mit den Primern nach GILAD et al. (2002) und der Platinum Pfx Polymerase TK/Pl. Pfx: PCR mit den Primern nach BERCOVIER et al. (2005) und der Platinum Pfx Polymerase Gray/Pl. Pfx: PCR mit den Primern nach GRAY et al. (2002) und der Platinum Pfx Polymerase neg: es konnten keine Teile des KHV-Genoms nachgewiesen werden 75 Ergebnisse Tabelle 4: Nachweisgrenzen der verschiedenen Kombinationen aus Primerpaaren und Polymerasen nach DNA-Extraktion aus Fischgewebe mit dem QIAamp DNA Mini-Kit von Qiagen Probe F+R/ TK/ Taq Taq Be 10-2 10-3 Ha 10-2 La Gray/Taq F+R/Pl. TK/Pl. Gray/Pl. F+R/Pl. TK/Pl. Gray/Pl. Taq Taq Taq Pfx Pfx Pfx 10-3 10-3 10-5 10-4 10-3 10-3 10-2 10-3 10-3 10-4 10-4 10-4 10-4 10-4 10-3 10-2 10-4 10-4 10-4 10-5 10-4 10-4 10-4 10-3 Mü 10-3 10-4 10-5 10-6 10-5 10-5 10-4 10-5 10-5 IG 8 neg 100 neg 10-1 10-1 100 neg neg neg SPF neg neg neg neg neg neg neg neg neg Legende siehe Tabelle 3, Seite 75 Tabelle 5: Nachweisgrenzen der verschiedenen Kombinationen aus Primerpaaren und Polymerasen nach DNA-Extraktion aus Fischgewebe mit DNAzol Probe F+R/ TK/ Taq Taq Be 10-2 10-3 Ha 100 La Gray/Taq F+R/Pl. TK/Pl. Gray/Pl. F+R/Pl. TK/Pl. Gray/Pl. Taq Taq Taq Pfx Pfx Pfx 10-3 10-5 10-2 10-4 10-2 10-4 10-3 10-2 10-1 10-1 10-1 10-2 10-1 10-2 100 10-3 10-5 10-4 10-4 10-4 10-5 10-3 10-4 10-5 Mü 10-3 10-4 10-4 10-6 10-5 10-6 10-4 10-5 10-5 IG 8 neg 10-1 100 10-1 10-2 10-2 neg 10-1 neg SPF neg neg neg neg neg neg neg neg neg Legende siehe Tabelle 3, Seite 75 76 Ergebnisse 4.2 Stressversuch 4.2.1 Versuchsreihe 1 In der ersten Versuchsreihe wurde bei zwei symptomlosen, acht Wochen zuvor mit dem KHV infizierten Koi die spontane Virusausscheidung und die Virusausscheidung nach einem simulierten Abfischen untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefaßt. Während der zum Monitoring einer spontanen Ausscheidung des Virus dienenden Kohabitation latent infizierter Koi mit virusfreien Karpfen ohne vorhergehendes Einwirken eines Stressors konnten weder bei den Koi noch bei den zugesetzten Karpfen Zeichen einer Erkrankung festgestellt werden. Einer der beiden Koi schied bereits spontan infektiöses Virus aus. Teile des KHV-Genoms konnten bei einem der sechs zugesetzten Karpfen nachgewiesen werden. Bei den anderen zu diesem Koi zugesetzten Karpfen und allen mit dem anderen Koi kohabitierten Karpfen konnte mittels PCR kein positiver Nachweis geführt werden. Während der Kohabitation von naiven Karpfen mit einem latent infizierten Koi nach dem simulierten Abfischen kam es in beiden Becken am zweiten Tag nach der Belastung zu Todesfällen unter den zugesetzten SPF-Karpfen. In einem der Becken waren drei, in dem anderen vier der sechs Karpfen verstorben. Äußerlich sichtbare Symptome fehlten. Nur bei einem der sieben verstorbenen Karpfen konnten Teile des KHV-Genoms nachgewiesen werden. Bei den anderen verstorbenen Karpfen gelang kein Nachweis von KHV-DNA. Die übrigen Karpfen durchliefen den Rest der zweiwöchigen Kohabitation ohne Auffälligkeiten, wurden allerdings dann mittels PCR positiv getestet. Einer der beiden latent infizierten Koi verstarb am neunten Tag nach der Belastung. Er hatte mit einer Kiemennekrose und einem Enophthalmus deutliche KHV-Symptome. Der andere Koi zeigte sich während des Versuchs symptomlos. Bei beiden Koi konnten Teile der viralen DNA nachgewiesen werden. 77 Ergebnisse Tabelle 6: Spontanes Ausscheiden von Virus und Reaktivierung der Infektion bei latent infizierten Koi, Versuchsreihe 1. Angegeben ist die Anzahl KHV-positiver (und verstorbener) Karpfen. Stressmodell: simuliertes Abfischen Spontane Ausscheidung Kohabitation nach Stress erneute Erkrankung des Carriers Koi 1 1/6 (0/6) 4/6 (3/6, 2.Tag) nein Koi 2 0/6 (0/6) 2/6 (4/6, 2. Tag) ja (9.Tag) 4.2.2 Versuchsreihe 2 In der zweiten Versuchsreihe wurde bei vier symptomlosen, vor vier Jahren infizierten Koi die spontane Ausscheidung von infektiösem KHV und die Virusausscheidung nach einem simulierten Abfischen, einem simulierten Transport und einer kortikosteroidinduzierten Immunsuppression untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 zusammengefaßt. Während der Kohabitation ohne vorausgehenden Stressor traten bei den vier latent infizierten Koi und den zugesetzten naiven Karpfen keine Krankheitsanzeichen auf. Für keinen der vier Koi konnte eine Übertragung des KHV auf naive Karpfen nachgewiesen werden. Bei drei der vier Koi konnte nach der Belastung mit verschiedenen Stressoren eine Übertragung des KHV auf naive Karpfen nachgewiesen werden. Bei Koi 3 (siehe Tabelle 7), wo unter zugesetzten naiven Karpfen kein KHV-Nachweis geführt werden konnte, verstarb einer der zugesetzten Karpfen unter ähnlichen Bedingungen wie in der ersten Versuchsreihe. Bei Koi 1 (siehe Tabelle 7) konnte durch das simulierte Abfischen eine Ausscheidung von infektiösem Virus induziert werden. Während der Kohabitation nach dem simulierten Transport wurde bei keinem der zugesetzten Karpfen ein positiver PCR-Nachweis geführt. Nach Immunsuppression durch die Verabreichung des Kortikosteroids konnte eine Ausscheidung erneut nachgewiesen werden. Bei Koi 2 (siehe Tabelle 7) wurden bei einem der nach dem simulierten Transport zugesetzten Karpfen Teile des KHV-Genoms nachgewiesen werden. Bei Koi 3 (siehe Tabelle 7) gelang bei keinem der zugesetzten Karpfen ein positiver PCRNachweis. Allerdings war zwei Tage nach dem Zusetzen der Karpfen zu dem Koi, der mit dem simulierten Abfischen gestresst worden war, einer der sechs Karpfen verstorben. Koi 4 (siehe Tabelle 7) schied nur nach der Immunsuppression infektiöses Virus aus. 78 Ergebnisse Tabelle 7: Ausscheidung des KHV durch latent infizierte Koi, Versuchsreihe 2. Angegeben ist die Anzahl positiver (und verstorbener) Karpfen, Reihenfolge der Stressmodelle aus Übersichtsgründen geändert dargestellt Spontane simuliertes Abfischen Ausscheidung simulierter Immunsuppression Transport Koi 1 0/6 (0/6) 1/6 (0/6) 0/6 (0/6) 1/6 (0/6) Koi 2 0/6 (0/6) 0/6 (0/6) 1/6 (0/6) 0/6 (0/6) Koi 3 0/6 (0/6) 0/6 (1/6, 2. Tag) 0/6 (0/6) 0/6 (0/6) Koi 4 0/6 (0/6) 0/6 (0/6) 0/6 (0/6) 1/6 (0/6) 4.2.3 Versuchsreihe 3 Der Ablauf der Erzeugung von latent infizierten Virusträgern für die dritte Versuchsreihe ist in Tabelle 8, die Untersuchungsergebnisse während der Erzeugung der Virusträger in Tabelle 9 zusammengefaßt. Tabelle 10 zeigt die KHV-Untersuchungsergebnisse der zugesetzten Karpfen und die aufgetretenen Todesfälle, Tabelle 11 faßt die Wirkung der angewendeten Stressmodelle zusammen. Während der zur Erzeugung von Virusträgern dienenden Infektion der Karpfen zeigten die Fische keine Krankheitssymptome. Einer der zwölf dem Virus exponierten Karpfen verstarb bei der der Infektionsphase unmittelbar folgenden Probenentnahme. Zwei weitere verstarben während der vierwöchigen Haltung bei 30-32°C. Die Proben dieser Fische wurden aus der Untersuchung herausgenommen. Von den direkt nach der Kohabitation entnommenen Proben wurde bei einem der neun Karpfen in den Leukozyten KHV-DNA gefunden und bei zwei anderen Karpfen in der Kieme. Insgesamt konnten bei drei der neun Karpfen mit den nichtletalen Untersuchungsmethoden Teile des KHV-Genoms nachgewiesen werden. Bei der zweiten KHV-Untersuchung nach der einmonatigen Haltung bei 30-32°C und der einmonatigen Haltung bei 23°C konnten bei keinem der neun Karpfen Teile der viralen DNA in den entnommenen Kiemenbiopsien nachgewiesen werden. 79 Ergebnisse Tabelle 8 : Induktion von latent infizierten Virusträgern, Ablaufschema, Versuchsreihe 3 Vorgehensweise zur Erzeugung von Virusträgern Anzahl Fische SPF-Karpfen, dreiwöchige Kohabitation mit erkranktem Koi 12 Separation der Karpfen, Entnahme und Untersuchung von Kiemenbiopsien und Blutproben 12 verstorben bei 1. Beprobung 1 4 w Haltung bei 30-32°C 11 verstorben während der 4 w bei 30-32°C 2 4 w Haltung bei 23°C 9 Entnahme und Untersuchung von Kiemenbiopsien 9 Tabelle 9 : Untersuchungsergebnisse während der Erzeugung von Virusträgern, Versuchsreihe 3 Durchgeführte Untersuchung Positiver Nachweis/ geteste Proben Nachweis des KHV bei überlebenden Karpfen, 1. Untersuchung 3/9 Nachweis in der Kieme 2/9 Nachweis in den Leukozyten 1/9 Nachweis in der Kieme nach dem Aufheizen 0/9 Spontan schieden fünf der neun Virusträger infektiöses Virus aus. Von den sechs zugesetzten Karpfen konnte bei drei Virusträgern jeweils ein Karpfen mittels PCR positiv getestet werden, bei zwei Virusträgern konnten jeweils bei zwei Karpfen Teile des KHV-Genoms nachgewiesen werden. Nach Belastung der Virusträger durch die oben beschriebenen Stressmodelle schieden alle Virusträger infektiöses Virus aus. 80 Ergebnisse Tabelle 10 : Ausscheidung von KHV durch latent infizierte Virusträger, Versuchsreihe 3. Angegeben ist die Anzahl positiver (und verstorbener) Karpfen. Reihenfolge der angewendeten Stressmodelle aus Übersichtsgründen geändert dargestellt Virus- Spontane träger Ausscheidung Simulierter Simuliertes Transport Abfischen Immun- Infektion mit Reinfektion suppression Trypano- mit KHV-I plasma borreli 1 2/6 (0/6) 0/6 (0/6) 0/6 (0/6) 0/6 (0/6) 2/6 (0/6) n.d. 2 0/6 (0/6) 0/6 (0/6) 1/6 (0/6) 1/6 (0/6) n.d. 1/6 (0/6) 3 0/6 (0/6) 0/6 (0/6) 2/6 (5/6) 0/6 (0/6) 0/6 (0/6) n.d. 4 1/6 (0/6) 1/6 (0/6) 1/6 (0/6) 0/6 (0/6) 3/6 (0/6) n.d. 5 2/6 (0/6) 0/6 (0/6) 0/6 (0/6) 0/6 (0/6) n.d. 6/6 (0/6) 6 1/6 (0/6) 0/6 (0/6) 0/6 (0/6) 0/6 (0/6) n.d. 5/6 (0/6) 7 0/6 (0/6) 1/6 (0/6) 0/6 (0/6) 0/6 (0/6) 1/6 (0/6) n.d. 8 1/6 (0/6) 0/6 (0/6) 1/6 (2/6) 0/6 (0/6) n.d. 1/6 (0/6) 9 0/6 (0/6) 1/6 (0/6) 0/6 (0/6) 0/6 (0/6) n.d. 6/6 (0/6) Die Belastung durch den simulierten Transport führte bei einem Drittel der Virusträger zu einer Induktion der Virusausscheidung. Bei einem Drittel konnte keine Ausscheidung von infektionsfähigem Virus induziert werden. Das übrige Drittel der Virusträger hatte vor der Belastung mit dem simulierten Transport ausgeschieden und tat dies nach der Belastung nicht mehr oder nicht in ausreichendem Maße, um es mit den Untersuchungsmethoden detektierten zu können. Nach dem simulierten Abfischen kam es wie in den ersten beiden Versuchsreihen zu Todesfällen, die am ersten Tag nach der Belastung auftraten. Bei nur einem der verstorbenen sieben Karpfen gelang mittels PCR ein positiver Nachweis. Bei einem Drittel der Virusträger konnte eine Ausscheidung von infektiösem Virus induziert werden. Bei einem Drittel konnte keine Ausscheidung ausgelöst werden. Ein Virusträger schied vor und nach der Belastung unverändert aus. Bei zwei Virusträgern konnte keine erneute Ausscheidung nachgewiesen werden. 81 Ergebnisse Die kortikosteroidinduzierte Immunsuppression führte bei einem der neun Virusträger zu einer Induktion der Virusausscheidung, bei einem Drittel gelang keine Induktion der Ausscheidung. Fünf Carrier hatten nur vor der Belastung nachweisbar ausgeschieden. Die Infektion mit einem opportunistischen Krankheitserreger führte bei zwei der vier parasitämischen Virusträger zu einer Induktion der Virusausscheidung. Bei einem Virusträger kam es zu einer Erhöhung der Ausscheidung. Nur bei einem der vier Virusträger konnte keine Wirkung auf die Virusausscheidung festgestellt werden. Bei zwei der fünf mit dem KHV reinfizierten Virusträgern kam es zu Todesfällen. Virusträger 9 (siehe Tabelle 6) verstarb am zehnten Tag und Virusträger 5 (siehe Tabelle 6) am 15. Tag post infektionem. Die übrigen drei Virusträger und alle zugesetzten Karpfen verhielten sich klinisch unauffällig. Ein Virusträger schied vor und nach der Reinfektion in scheinbar gleichem Maße aus; bei vier Virusträgern vermochte die Reinfektion eine erneute Ausscheidung von infektionsfähigem Virus zu induzieren. Bei den beiden durch die Reinfektion verstorbenen Virusträgern wurden jeweils alle kohabitierten Karpfen KHVpositiv getestet. Tabelle 11 : Wirkung der Stressmodelle auf die Virusausscheidung von latent infizierten Virusträgern, Versuchsreihe 3 Wirkung auf Virusausscheidung Simulierter Simuliertes Immun- Infektion mit Transport Abfischen suppression Trypanoplasma Reinfektion borreli Induktion 3/9 3/9 1/9 2/4 4/5 keine Induktion 3/9 3/9 3/9 1/4 0/5 Erhöhung 0/9 0/9 0/9 1/4 0/5 unverändert 0/9 1/9 0/9 0/4 1/5 keine erneute 3/9 2/9 5/9 0/4 0/5 Mortalität 0/9 0/9 0/9 0/4 2/5 0/54 7/54 (1. Tag) 0/54 0/24 0/30 Virusträger Mortalität Karpfen 82 Ergebnisse 4.3 Untersuchung zum Wirtsspektrum des KHV 4.3.1 Untersuchung der Empfänglichkeit von Graskarpfen und Schleien für das KHV und ihrer Rolle als Überträger Durch Kohabitation dem KHV exponierte Graskarpfen waren zu unterschiedlichen Infektionszeitpunkten mittels PCR untersucht worden. Die Ausscheidung von infektiösem KHV durch die Graskarpfen zu unterschiedlichen Infektionszeitpunkten war mittels Kohabitation mit naiven Karpfen kontrolliert worden. Die Graskarpfen waren während des Versuchs klinisch unauffällig, es kam unter ihnen zu keinen Todesfällen. Bei vier der 30 dem KHV exponierten Graskarpfen wurde KHV-DNA nachgewiesen. Dabei handelte es sich um drei am 22. Tag nach dem Erstkontakt mit dem Virusausscheider getötete Graskarpfen, und einen am 29. Tag getöteten Graskarpfen. Dieser Graskarpfen war vom 15. bis zum 29. Tag mit vier Karpfen kohabitiert worden, bei denen kein positiver KHV-Nachweis geführt werden konnte. Am 22. Tag nach dem Erstkontakt mit einem latent infizierten Koi wurden fünf Graskarpfen und vier naive Karpfen in ein neues Becken umgesetzt. Zwei der vier naiven Karpfen starben zwei Tage später. Äußere Symptome waren nicht zu erkennen. Bei einem der beiden verstorbenen Karpfen wurden Teile des KHV-Genoms nachgewiesen. Bei allen Graskarpfen, die mit diesen Karpfen kohabitiert worden waren und die infektiöses Virus ausgeschieden hatten, gelang der KHVNachweis nicht. Die übrigen Karpfen zeigten keine Krankheitssymptome und konnten mittels PCR nicht KHV-positiv getestet werden. Bei den vor Versuchsbeginn und zu Versuchsende untersuchten Karfen aus der SPF-Haltung und den Graskarpfen aus dem ursprünglichen Haltungsbecken konnte keine KHV-DNA nachgewiesen werden. Durch Kohabitation dem KHV exponierte Schleien wurden zu unterschiedlichen Infektionszeitpunkten mittels PCR untersucht. Zusätzlich wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion durch Kohabitation von Schleien mit naiven Karpfen geprüft, ob eine Ausscheidung von infektiösem KHV durch Schleien erfolgte. Nach Kohabitation mit einem latent mit KHV infizierten Koi kam es weder unter den Schleien noch unter den zugesetzten Karpfen zu klinisch in Erscheinung tretenden Infektionen. Organpoolproben aus Kieme, Niere, Milz, Leber und Gehirn von drei der vier 83 Ergebnisse vor Versuchsbeginn beprobten, nicht experimentell infizierten Schleien wurden mittels PCR positiv getestet. Bei drei der 16 mit dem Virusausscheider kohabitierten Schleien konnten im Organpool Teile des KHV-Genoms nachgewiesen werden. Eine positiv getestete Schleie war am 22. Tag nach dem Erstkontakt mit dem Virusausscheider beprobt worden, eine am 29. und eine am 36. Tag. Bei einem der zugesetzten Karpfen wurde das KHV-Genom nachgewiesen. Dieser Karpfen war mit vier Schleien kohabitiert worden, bei denen der Erstkontakt mit dem Virusausscheider 22 Tage zurück lag. Unter diesen vier Schleien befand sich eine der positiv getesteten Schleien. Bei den übrigen mit Schleien kohabitierten Karpfen gelang der KHVNachweis mittels PCR nicht. Die KHV-Untersuchung der vor Versuchsbeginn und zu Versuchsende untersuchten Karpfen aus der SPF-Haltung sowie der vier zu Versuchsende untersuchten, aus dem ursprünglichen Becken stammenden Schleien verlief negativ. 4.2.2 Untersuchung der Rolle von Goldfischen und Silberkarpfen als symptomlose Überträger des KHV Im ersten Goldfischversuch waren Goldfische, deren letzte KHV-Exposition sechs Monaten zurück lag, zur Kontrolle der Ausscheidung von infektiösem KHV mit naiven Karpfen kohabitiert worden. Die Goldfische und die zugesetzten Karpfen zeigten während der Kohabitation keine Krankheitssymptome. Es kam zu keinen Todesfällen. Bei zwei der vier Goldfische und einem der sieben Karpfen wurden Bruchstücke des KHV-Genoms nachgewiesen. Im zweiten Goldfischversuch waren infizierte Goldfische mit naiven Karpfen kohabitiert worden. Eine Woche, nachdem die Karpfen von den infizierten Goldfischen wieder separiert worden waren, wurden diese Karpfen mit naiven Karpfen kohabitiert. Keiner der Versuchsfische zeigte während des Versuchs Krankheitssymptome. Bei zwei der fünf Goldfische wurden Teile der KHV-DNA nachgewiesen. Zwei der fünf mit den Goldfischen kohabitierten Karpfen wurden KHV-positiv getestet. Bei einem der fünf mit diesen Karpfen kohabitierten Karpfen konnte ein positiver KHV-Nachweis geführt werden. Bei der Kohabitation infizierter Silberkarpfen mit naiven Karpfen zeigten weder die Silberkarpfen noch die zugesetzten Karpfen Zeichen einer Infektion oder Erkrankung. Bei 84 Ergebnisse einem der fünf Silberkarpfen und einem der fünf mit den Silberkarpfen kohabitierten Karpfen konnten KHV-Genombruchstücke nachgewiesen werden. Bei allen übrigen Silberkarpfen und Karpfen konnten keine Teile des KHV-Genoms nachgewiesen werden 4.4 Versuche zur Vakzinierung Im ersten und zweiten Impfversuch wurde die Vakzination von Karpfen mittels einer hitzeund einer formalininaktivierten Viruslösung über das Bad miteinander verglichen. Im dritten Impfversuch wurde die Vakzinierung von Karpfen mittels einer hitze- und einer formalininaktivierten Viruslösung, die über das Bad, intraperitoneal, rektal oder oral verabreicht wurde, miteinander verglichen. Die Mortalitäten, der Zeitraum der auftretenden Mortalitäten und KHV-Nachweise sind in Tabelle 12 zusammengefaßt. 4.4.1 Impfversuch 1 Bei der in vitro Kontrolle der Viruslösungen wurde bei dem unbehandelten Virus ein Titer von 5000 KID50/ml bestimmt. Das für fünf Stunden bei 80°C und das 30 min bei 50°C hitzeinaktivierte Virus zeigte keine Anzeichen einer Virusvermehrung. Das formalininaktivierte Virus zeigte bis zu einer Verdünnung von 1:100 zytopathische Effekte, der sich deutlich von dem virusinduzierten CPE unterschieden und sich durch eine innerhalb eines Tages manifestierende Ablösung des gesamten Zellrasens auszeichnete. Bei Karpfen, die einer unbehandelten Viruslösung im Wasser exponiert wurden, kam es zu einer Mortalität von 100 %. Der erste Fisch war am sechsten Tag verstorben, ein weiterer am siebten Tag., die nächsten beiden am achten Tag., drei am zehnten Tag einer am 14. Tag, einer am 16. Tag und einer am 17. Tag. Alle Fische dieser Gruppe wurden KHV-positiv getestet. Bei Karpfen, die mit der formalininaktivierten oder hitzeinaktivierten Viruslösung oder mit Zellkulturmedium ohne Virus inkubiert wurden, kam es in den folgenden drei Wochen zu keinen Krankheitsanzeichen. Die vor der Belastungsinfektion untersuchten mit der formalininaktivierten und der hitzeinaktivierten Viruslösung immunisierten Karpfen wurden KHV-positiv getestet. Bei den Karpfen, die nur mit Zellkulturmedium behandelt 85 Ergebnisse wurden, konnten vor der Belastungsinfektion keine Teile des KHV-Genoms nachgewiesen werden. Durch die Belastungsinfektion mit 1 KID50/ml konnte in keiner der drei Gruppen eine Erkrankung ausgelöst werden. Die anschließend durchgeführte Belastung der Karpfen aus allen drei Gruppen durch das simulierte Abfischen löste innerhalb von zwei Wochen ebenfalls keine Erkrankung aus. Alle Karpfen, die für die Belastungsinfektion dem KHV exponiert worden waren, wurden KHV-positiv getestet. 4.4.2 Impfversuch 2 Die Karpfen, die zur in vivo Kontrolle der Infektiösität der unbehandelten Viruslösung mit der nicht inaktivierten Viruslösung mit 10 KID50/ml im Bad inkubiert worden waren, verstarben innerhalb von drei Wochen. Ein Karpfen wurde am sechsten Tag tot aufgefunden, einer am achten Tag, zwei am zehnten Tag, einer am 16. Tag und der letzte am 17. Tag. Alle Karpfen dieser Gruppe wurden KHV-positiv getestet. Bei den Karpfen, die mit der formalininaktivierten oder hitzeinaktivierten Viruslösung oder mit Zellkulturmedium inkubiert wurden, kam es in den drei darauf folgenden Wochen zu keinen Krankheitsanzeichen. Nach der Belastungsinfektion mit 10 KID50/ml kam es in allen drei Gruppen zu einer Mortalität von 100% innerhalb von drei Wochen. Von den mit der formalininaktivierten Viruslösung immunisierten Karpfen starben jeweils zwei am sechsten, siebten und am achten Tag. Von den mit dem hitzeinaktivierten Virus immunisierten Karpfen waren jeweils zwei am sechten, achten und zehnten Tag verstorben. Von den Karpfen, die nicht immunisiert worden waren, verstarben zwei am sechsten, einer am siebten, zwei am achten und der letzte am neunten Tag. Alle Karpfen, die während der Belastungsinfektion dem KHV exponiert worden waren, wurden KHV-positiv getestet. 4.4.3 Impfversuch 3 Alle Karpfen, die zur in vivo Kontrolle der Infektiösität der unbehandelten Viruslösung mit der nicht inaktivierten Viruslösung über das Bad, i.p., rektal oder oral infiziert worden waren, verstarben innerhalb von drei Wochen. Von den vier Karpfen, die über das Bad infiziert wurden, verstarben zwei am siebten und zwei am achten Tag. Die vier Karpfen, die i.p. 86 Ergebnisse infiziert wurden, verstarben am siebten Tag. Von den rektal infizierten Karpfen verstarb jeweils einer am achten, neunten, zehnten und elften Tag. Von den vier Karpfen, denen die Viruslösung per Magensonde eingegeben wurde, verstarben zwei am zehnten Tag, einer am elften und einer am 13. Tag. Bei allen Karpfen dieser Kontrollgruppe konnten Teile des KHV Genoms nachgewiesen werden. Die Karpfen, die nur mit Zellkulturmedium behandelt wurden, zeigten vor der Belastungsinfektion keine Krankheitsanzeichen. 15 der 16 Karpfen verstarben innerhalb von 19 Tagen nach der Belastungsinfektion. Der erste Fisch dieser Gruppe verstarb am 13. Tag, fünf am 15. Tag, drei am 16. Tag, drei am 18. Tag und drei am 19. Tag. Der letzte Karpfen dieser Gruppe wurde am 29. Tag getötet. Alle Karpfen der Gruppe wurden mittels PCR KHVpositiv getestet. Unter Karpfen, die mit der hitzeinaktivierten Viruslösung immunisiert wurden, kam es nach der Immunisierung zu Mortalitäten. Zwei Karpfen, die über das Bad mit der hitzeinaktivierten Viruslösung immunisiert worden waren, verstarben, einer am achten und einer am 14. Tag. Zwei Karpfen, denen die hitzeinaktivierte Viruslösung rektal eingegeben worden war, starben ebenfalls. Der erste Todesfall trat am zweiten Tag nach der Immunisierung auf, der zweite am siebten Tag. Ein zusätzlicher Karpfen dieser Gruppe war am zehnten Tag aus dem Becken gesprungen und konnte nur noch tot geborgen werden. Zwei der 24 mit hitzeinaktiviertem Virus immunisierten Karpfen überlebten die Belastungsinfektion. Von den sechs i.p. immunisierten Karpfen verstarb jeweils einer am 16., 21., 22. und 26. Tag. Die zwei übrigen Karpfen dieser Gruppe waren am 18. Tag tot aufgefunden worden. Von den vier über das Bad immunisierten, noch übrigen Karpfen starben zwei am 18. Tag und jeweils einer am 21. und 23. Tag nach der Belastungsinfektion. Von den drei noch übrigen Karpfen, die rektal mit dem hitzeinaktivierten Virus immunisiert worden waren, starb einer am 16. Tag und einer am 20. Tag. Der überlebende Karpfen litt an einer Kiemennekrose. Von den sechs oral mit dem hitzeinaktivierten Virus immunisierten Karpfen überlebte nur einer die Belastungsinfektion. Ein Karpfen der Gruppe wurde am 15. Tag tot aufgefunden, einer am 16., einer am 17., einer am 18. und einer am 19. Tag. Alle mit der hitzeinaktivierten Viruslösung immunisierten Karpfen außer dem am zweiten und dem am siebten Tag nach der Immunisierung verstorbenen Karpfen, denen hitzeinaktiviertes Virus in den Enddarm appliziert worden war, wurden KHV-positiv getestet. 87 Ergebnisse Unter den Karpfen, die mit der formalininaktivierten Viruslösung immunsiert wurden, traten keine Krankheitsanzeichen vor der Belastungsinfektion auf. Drei der 24 mit formalininaktiviertem Virus immunisierten Karpfen überlebten die Belastungsinfektion. Von den sechs i.p. immunisierten Karpfen starb einer am 13. und einer am 14. Tag. Drei wurden am 19. Tag tot aufgefunden und einer starb am 27. Tag unter Ausbildung einer deutlichen Kiemennekrose. Von den sechs der formalininaktivierten Viruslösung über das Bad exponierten Karpfen starben drei am 17. Tag, einer am 18. und einer am 23. Tag. Karpfen, denen das formalininaktivierte Virus rektal eingegeben worden war, starben alle innerhalb von 22 Tagen. Einer wurde am 14. Tag tot aufgefunden, einer am 15. Tag, zwei am 16. Tag, einer am 18. und einer am 22. Tag. Von den sechs oral mit formalininaktiviertem Virus immunisierten Karpfen starben vier. Zwei wurden am 15. Tag tot aufgefunden und zwei am 18. Tag. Alle Karpfen der Gruppe wurden nach der Belastungsinfektion KHV-positiv getestet. Alle überlebenden Fische waren apathisch, anorektisch und hatte starke zentralnervöse Ausfallerscheinungen. Bei allen überlebendenKarpfen, die zu Versuchsende getötet wurden, gelang der KHV-Nachweis mittels PCR. 88 Ergebnisse Tabelle 12: Mortalität, Zeitraum der auftretenden Mortalitäten und KHV-Nachweis der Karpfen im Impfversuch 3 Impfvirus hitzeinakti viert formalinin aktiviert Zellkultur Applikation Mortalitäten nach der Anzahl KHV-Nachweis Belastungsinfektion Überlebende mittels PCR Anzahl Zeitraum: Tage nach Todesfälle der Infektion Bad 4/4 18-23 0/6 6/6 i.p. 4/6 16-26 0/6 6/6 rektal 2/3 16-20 1/6 4/6 oral 5/6 15-19 1/6 6/6 Bad 5/6 17-23 1/6 6/6 i.p. 6/6 13-27 0/6 6/6 rektal 6/6 14-22 0/6 6/6 oral 4/6 15-18 2/6 6/6 15/16 13-19 1/16 16/16 -medium ohne Virus 89 Diskussion 5 DISKUSSION Von vielen Herpesvirusinfektionen bei Tieren und auch bei Fischen ist bekannt, dass sie latente Infektionen etablieren (FRASER et al. 1981, ROCK u. FRASER 1983, VAN NIEUWSTADT et al. 2001). Die Virusgenome integrieren dabei in das Zellgenom bestimmter Wirtszellen. Diese okkulten Infektionen lassen sich durch Stressoren oder eine Immunsuppression aktivieren (ROIZMANN 1996), das Provirus wird dabei erneut exprimiert. Gleichzeitig mit verbesserten Nachweismethoden kam es auch beim Koi Herpesvirus zu Nachweisen der KHV-DNA bei smptomlosen Koi und Karpfen (GILAD et al. 2004). Der Nachweis viraler DNA in symptomlosen Fischen allein reicht allerdings nicht, um eine Aussage darüber zu treffen, ob eine latente Infektion besteht. Nur der Nachweis einer Übertragung dieses Viruses auf naive Fische oder einer stressinduzierten Virusreaktivierung kann beweisen, dass ein Fisch ein Carrierfisch ist (GILAD et al. 2004). ST-HILAIRE et al. (2005) lieferten durch den Nachweis einer Virusausscheidung bei symptomlosen, vor mehreren Monaten infizierten Koi den ersten Beweis hierfür. In der vorliegenden Studie wurde bestätigt, dass das KHV latente Infektionen etablieren kann, indem gezeigt wurde, dass es bei symptomlos mit dem KHV infizierten Fischen sowohl zu einer stressbedingten Virusreaktivierung als auch einer Übertragung des KHV auf naive Karpfen kam. Die Studie offenbarte zudem, dass das Koi Herpesvirus vermutlich ein weiteres Wirtsspektrum hat als es für ein Herpesvirus typisch ist (DAVISON 2002). Die natürliche Empfänglichkeit von Schleien, Graskarpfen, Silberkarpfen und Goldfischen für das KHV wurde nachgewiesen. Alle genannten Arten konnten das KHV auf naive Karpfen übertragen, wobei es nur in einem Einzelfall, bei mit infizierten Graskarpfen kohabitierten Karpfen, zu Erkrankungen kam. Die subklinische Ansteckung von empfänglichen Arten kann besonders zur weiteren Verbreitung des KHV beitragen. Es wurden Vakzinierungsversuche durchgeführt, jedoch ließ sich mit inaktivierten Viruspräparationen keine protektive Immunität gegenüber einer Belastungsinfektion erzielen. Ein Vergleich verschiedener konventioneller PCR-Methoden veranschaulichte, dass die Sensitivität der PCR-gestützten Nachweismethode stark von dem verwendeten Primerpaar und der Polymerase abhing und eine Einigung auf eine einheitliche Nachweismethode unumgänglich ist. 90 Diskussion 5.1 Validierung der PCR-gestützten Nachweismethode Herpesviren etablieren häufig eine Latenz in ihrem Wirt (FRASER et al. 1981, ROCK u. FRASER 1983). Auch beim KHV geht man davon aus, dass das Virusgenom in das Genom bestimmter Wirtszellen integrieren und dort lebenslang persistieren kann (NEUKIRCH 2003). Besonders symptomlose Carrierfische stellen ein erhebliches Risiko für die weitere Verbreitung des KHV dar (GILAD et al. 2002, GILAD et al. 2003). Im latenten Stadium werden keine infektiösen Viruspartikel produziert, die durch Zellkulturverfahren oder serologische Methoden erfasst werden können (COHRS u. GILDEN 2001, KAMAL et al. 2004) und die virale Genexpression ist stark heruntergeregelt (GALLOWAY et al. 1982), was den Nachweis des latenten Herpesvirus erheblich erschweren kann. Wegen dieser Einschränkungen bei Zellkultur- und serologischen Verfahren eignen sich bei latenten Herpesvirusinfektionen molekularbiologische Untersuchungsmethoden wie die PCR zum Nachweis des viralen Genoms (GRAY et al. 1999, GILAD et al. 2004). Bei dem Nachweis des KHV besteht zusätzlich das Problem, dass eine Isolation des KHV aus Organen erkrankter Fische in der Zellkultur anders als beispielsweise beim IcHV-1 nicht regelmäßig gelingt. Ein Nachweis mittels elektronenmikroskopischer Untersuchung ist aufwendig und erfordert eine hohe Dichte von Viruspartikeln in einem zeitnah nach dem Tod des Fisches fixierten Gewebe. Die Validierung der zur Verfügung stehenden PCR-gestützten Nachweismethode wurde durchgeführt, da wiederholt auffiel, dass mit unterschiedlichen Kombinationen aus Primerpaar und Polymerase unterschiedliche Untersuchungsergebnisse bei Versuchsfischen und Fischen aus dem Patientengut der Abteilung Fischkrankheiten erzielt wurden. Für den für jeden Versuchsfisch separat zusammengestellten Organpool wurden Teile der Organe Kieme, Niere, Milz, Gehirn und Leber zusammengefügt, da eine Aussage über den Sitz der nachgewiesenen KHV-Genombruchstücke nicht zur vorrangigen Fragestellung gehörte. Es kann nicht gänzlich ausgeschlossen werden, dass nachgewiesene virale DNA aus dem Wasser aufgenommen wurde und nicht durch den Blutkreislauf in der Folge einer Virämie in die im Organpool enthaltene Kieme gelangt ist. Allerdings wären dann vergleichbarere Untersuchungsergebnisse unter Fischen eines Beckens zu erwarten. 91 Diskussion Die Organteile wurden stets durch die selbe Person an derselben Lokalität entnommen, so dass eine Vergleichbarkeit gegeben war. Als Ausgangsmaterial für einen KHV-Nachweis wurden die Organe Kieme, Niere, Milz, Gehirn und Leber gewählt, weil in diesen Organen durch elektronenmikroskopische Untersuchungen Viruspartikel nachgewiesen wurden und diese Organe die stärksten histopathologischen Veränderungen aufwiesen (HEDRICK et al. 2000, BRETZINGER 1999), was vermuten läßt, dass das Virus hier in großer Menge vorliegt. HEDRICK et al. (2000) konnten aus Kieme, Niere, Leber, Milz, Darm und Gehirn von an KHV verstorbenen Koi regelmäßig das KHV isolieren. GILAD et al. (2004) konnten in diesen Organen KHV-DNA nachweisen. Bei Überlebenden einer experimentellen Infektion konnte nach Abklingen der Krankheitssymptome noch virale DNA in Niere, Kieme und Milz nachgewiesen werden. Die größte Menge an KHV-DNA konnte in der Kieme vorgefunden werden (GILAD et al. 2004). Auch für die Untersuchung von Goldfischen auf das CyHV-2 mittels PCR wird besonders die Milz und Niere eingesetzt (GOODWIN et al. 2006). Eine PCR dient der Detektion von Bruchstücken genetischen Materials und nicht eines ganzen Organismus. Die PCR kann somit auch die Reste von Organismen nachweisen, lange nachdem diese den Organismus verlassen haben. Bei einem KHV-Nachweis bei einem symptomlosen Fisch kann es sich um latent vorhandenes Virus handeln oder die viralen Reste einer früheren Infektion. Durch Kontamination hervorgerufene falsch-positive Ergebnisse verursachen Schäden durch Gewinnausfälle und unnötig getötete Bestände. Durch mangelnde Sensitivität der Methode, ungeeignetes Untersuchungsmaterial oder einen nicht geeigneten Untersuchungszeitpunkt hervorgerufene falsch-negative Ergebnisse entstehen Schäden durch vermeidbare Krankheitsausbrüche oder eine unerkannte Verbreitung des Virus. Ein negatives PCR-Ergebnis besagt, dass keine Genombruchstücke nachgewiesen werden konnten. Es besagt nicht, dass ein Fisch frei vom Virus oder der von ihm hervorgerufenen Krankheit ist. Ein positives PCR-Untersuchungsergebnis hat eine viel größere Aussagekraft. Es besagt, dass eine nachweisbare, also notwenigerweise große Menge an KHV-DNA in dem untersuchten Gewebe vorlag. Bei allen angewendeten Extraktionsmethoden fielen zwischen den einzelnen Gewebeproben differierende Ausbeuten an gewonnener genomischer DNA auf. Bei den für die Validierung der Nachweismethode eingesetzten Gewebeproben handelte es sich um Gewebe von Fischen, bei denen das Gewebe in einem unterschiedlich gut erhaltenen Zustand war. Besonders 92 Diskussion niedrige DNA-Gehalte wurden aus dem Gewebe der Fische HA und BE gewonnen werden. Wesentlich höhere DNA-Gehalte wurden aus nicht oder geringgradig autolytischen Gewebeproben isoliert. Hierbei war die Frische des Materials ausschlaggebend für den DNAGehalt. Die unterschiedliche Ausbeute an extrahierter DNA spiegelt die unterschiedlichen Erhaltungszustände der Gewebe gut wider. Die verschiedenen Extraktionsmethoden führten schon bei grobsinnlicher Untersuchung zu unterschiedlichen Resultaten. Die mittels der DNAzol-Extraktion gewonnene DNA-Lösung wich erheblich von der Idealvorstellung ab. Am Boden des Reaktionsgefäßes befand sich ein mit bloßem Auge sichtbares, unlösliches Pellet. Da eine Homogenität der DNA-Lösung nicht gegeben war, konnte nicht mit reproduzierbaren Ergebnissen gerechnet werden. In die PCR wird eine bestimmte Menge der DNA-Lösung eingesetzt. Wenn in dieser Volumeneinheit wechselnde Mengen an DNA vorliegen, kann es zu unterschiedlichen PCR-Ergebnissen kommen. Im schlimmsten Falle kann es so in einer Reaktion zu einem positiven Ergebnis kommen und bei der Nachuntersuchung zu einem negativen. Das verwendete Primerpaar bestimmte ganz wesentlich die Sensitivität des PCR-Nachweises. Das von GILAD et al. (2002) entworfene Primerpaar KHV-F und KHV-R lag in seiner Sensitivität hinter dem von GRAY et al. (2002) entwickelten Primerpaar und dem von BERCOVIER et al. (2004) kreierten Primerpaar KHV-TKf und KHV-TKr zurück. Dennoch wird gegenwärtig das GILAD-Primerpaar in zahlreichen Untersuchungslaboren für die KHVDiagnostik eingesetzt (persönliche Mitteilungen). GRAY et al. (2002) stellten bei einem Vergleich von zwei verschiedenen, von ihnen entwickelten Primerpaaren, dem BamHI-6-Primerpaar, das ein 365 pb großes Fragment amplifizierte, und dem SphI-5-Primerpaar (GRAY-2F und GRAY-2R), bei dem das amplifizierte Fragment eine Größe von 290 bp hatte, fest, dass letztgenanntes Primerpaar dem erstgenannten in der Sensitivität überlegen war. Mit beiden Primerpaaren konnte in Kieme, Darm, Niere und Leber von infizierten Koi KHV-DNA nachgewiesen werden, aber nur das letztgenannte Primerpaar detektierte auch im Gehirn KHV-DNA. DIXON vermutete, dass Primerpaare, die ein kürzeres DNA-Fragment amplifizieren, zuverlässiger KHV-DNA detektieren. Er hielt das von BERCOVIER et al. (2005) entwickelte Primerpaar KHV-TKf und KHV-TKr für das sensitivste (siehe HAENEN u. HEDRICK 2006). Dieses Primerpaar 93 Diskussion schien dem SphI-5-Primerpaar von GRAY et al. (2002) in der Sensitivität überlegen, obwohl das SphI-5-Primerpaar ein kürzeres DNA-Fragment amplifiziert. Das von BERCOVIER et al. (2005) kreierte Primerpaar wies auch in der vorliegenden Studie mit den angewendeten Methoden KHV-DNA in den unterschiedlichsten Gewebeproben am zuverlässigsten nach. Das auf dem Thymidinkinase-Gen basierende Primerpaar detektiert 10 Femtogramm KHVDNA oder 30 Virionen (BERCOVIER et al. 2005). BERCOVIER et al. (2005) beschreiben die PCR mit diesem Primerpaar als die sensitivste im Vergleich mit den von GILAD et al. (2002) und GRAY et al. (2002) beschriebenen PCR-Methoden. Diese Beobachtung konnte durch die der Validierung der eigenen PCR dienenden hier vorliegenden Untersuchungen bestätigt werden. Neben den Primern besaß außerdem die eingesetzte Polymerase einen großen Einfluß auf das Ergebnis der PCR-Untersuchung. Bei der verwendeten Taq DNA Polymerase handelt es sich um ein thermostabiles Enzym, das aus einem einzigen Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 94 kDa besteht. Es hat eine 5´→3´ DNA-Polymeraseaktivität und eine 5´→3´ Exonukleaseaktivität. Bei Verwendung der Taq DNA Polymerase muß eine Kühlung der Proben und des Mastermixes erfolgen. Die Platinum Taq DNA Polymerase, eine “hot-start“ Polymerase, besitzt laut Herstellerangaben eine höhere Spezifität als die Taq DNA Polymerase und verspricht eine höhere Ausbeute. Bei diesem Enzym handelt es sich um eine Verbindung der Taq DNA Polymerase mit einem thermolabilen Inhibitor, der monoklonale Antikörper gegen die Taq DNA Polymerase enthält. Während der initialen Denaturierungsphase der PCR wird der Inhibitor denaturiert. Erst dadurch wird aktive Taq DNA Polymerase freigegeben. Die Platinum Pfx DNA Polymerase, ebenfalls eine „hot-start“ Polymerase, besitzt durch eine eigene Enzymzubereitung, die rekombinante DNA Polymerase von Thermococcus spezies KOD enthält, eine Fehlerleseaktivität (3´→5´Exonukleaseaktivität). Die Antikörpertechnologie entspricht der der Platinum Taq Polymerase. Sie ist laut Herstellerangaben bis zu 26-mal spezifischer als die Taq DNA Polymerase. Bei der Verwendung der Platinum Pfx Polymerase wird ein Enhancer genutzt, der eine höhere Primerspezifität, eine höhere Toleranz gegenüber Änderungen der Magnesiumkonzentration oder Annealingtemperatur und eine verbesserte Thermostabilität bewirkt. Beide letztgenannten Enzyme erlauben das Arbeiten bei Raumtemperatur. 94 Diskussion In den eigenen Studien erwies sich die Platinum Taq DNA Polymerase am geeignetsten für den molekularbiologischen Nachweis des KHV-Genoms. Sie detektierte in Verbindung mit jedem Primerpaar und jeder Extraktionsmethode jeden KHV-infizierten Fisch. Die Platinum Pfx Polymerase zeigte bei einigen Proben eine höhere Sensitivität als die Platinum Taq Polymerase, es konnte aber in einigen Proben, besonders nach Extraktionen mit dem RocheKit, mit dieser Polymerase keine KHV-DNA nachgewiesen werden. Diese Proben waren jedoch in anderen Versuchsansätzen KHV-positiv. Die Taq DNA Polymerase detektierte KHV-infizierte Koi bzw. Karpfen zuverlässig und erwies sich bei einigen Proben sogar als sensitiver als die Platinum Pfx Polymerase. Allerdings wurde der infizierte Goldfisch IG8 nur mit den Thymidinkinaseprimern und unregelmäßig mit den von GRAY et al. (2002) entwickeltem Primerpaar erkannt. In Verbindung mit dem Primerpaar von BERCOVIER et al. (2005) lieferte die preisgünstige Taq DNA Polymerase keine falsch negative Ergebnisse. Falsch positive Ergebnisse traten während der Untersuchung nicht auf. GILAD et al. (2002) hielten ihre Methode für den Nachweis symptomloser Virusträger, den Fischen, die hauptsächlich zu einer Verbreitung des KHV beitragen, als nicht unbedingt geeignet. Dies kann durch die eigenen Studien bestätigt werden, da beispielsweise der KHVinfizierte Goldfisch unabhängig von der gewählten Extraktionsmethode mit der von GILAD et al. (2002) beschriebenen PCR-Methode nicht detektiert werden konnte. Die Vermutung von DIXON (siehe HAENEN u. HEDRICK 2006), dass sich Primer, die ein kurzes DNA-Fragment amplifizieren, besser für einen Nachweis des KHV eignen, kann durch die eigenen Studien nicht unterlegt werden. Es bestanden allerdings keine erheblichen Größenunterschiede zwischen den durch die verschiedenen Primerpaare amplifizierten DNAFragmenten. BERCOVIER et al. (2005), die ihre PCR-Methode für die geeigneteste unter den drei miteinander verglichenen hielten, kann zugestimmt werden. 95 Diskussion 5.2 Stressversuch Im Stressversuch wurden als Empfängertiere Karpfen verwendet, die als Geschwistertiere eng miteinander verwandt waren. Sie wuchsen unter identischen Bedingungen auf, so dass eine ähnliche Empfänglichkeit für Infektionen mit dem KHV angenommen werden konnte. Eine ähnliche Empfänglichkeit für parasitologische Infektionen wurde bereits nachgewiesen (WIEGERTJES 1995). Momentan stellt das KHV eine der größten Gefahren für die Karpfenaquakultur dar. Das KHV wurde in der Vergangenheit häufig durch Carrierfische, die als solche nicht erkannt wurden, in KHV-freie Bestände eingeschleppt. Doch selbst in Beständen, in die seit einigen Jahren keine neuen Fische eingesetzt wurden, kam es zu Krankheitsausbrüchen, deren Auslöser nicht bekannt wurden (WALSTER 1999). WALSTER riet deshalb bereits 1999 zur diesbezüglichen Untersuchung von möglichen Carrierfischen. Einige Koiproduzenten exponieren Karpfen bei nicht permissiven Temperaturen dem KHV, um eine Immunität gegen das Virus zu induzieren (RONEN et al. 2003). Es wird vermutet, dass bei hohen nichtpermissiven Temperaturen ab 29°C die exponierten Fische eine spezifische Immunität erwerben, die vor einer Belastungsinfektion schützt (RONEN et al. 2003). Andere Autoren (NEUKIRCH 2003c) vermuteten, dass durch dieses Vorgehen latent infizierte Virusträger geschaffen werden, die das Virus an naive Karpfen weitergeben können. In den eigenen Versuchen wurden latent infizierte Virusträger deshalb zunächst drei Wochen lang bei permissiven Temperaturen gehalten, bevor die Temperatur in den nichtpermissiven Bereich angehoben wurde. Nach Reinfektion der so behandelten Fische mit infektösem Virus waren zwei der fünf reinfizierten Virusträger nicht ausreichend vor einer erneuten Infektion geschützt und erkrankten erneut. Bei den übrigen drei Virusträgern kam es zwar zu keinem erneuten Krankheitsausbruch, aber zu einer symptomlosen, scheinbar massiven Ausscheidung von infektiösem Virus. ST-HILAIRE et al. (2005) vermuteten, dass das KHV nach Infektion eines Fisches eine Latenz etabliert, bei der die Nachweisbarkeit nicht gegeben ist, und dass so das KHV durch den unbeschränkten Handel mit lebenden Fischen so rasant weltweit verbreitet werden konnte. Lange war wenig über eine mögliche Latenz des KHV bekannt (GRAY et al. 2002, WALSTER 2003). ST-HILAIRE führten Kohabitationsstudien durch, um zu überprüfen, ob 96 Diskussion das KHV latente Infektionen etablieren kann. In dieser Studie trat eine Reaktivierung latenter Infektionen, die durch eine Temperaturreglementierung erlangt wurde, noch mehrere Monate nach der Infektion auf. ST-HILAIRE et al. (2005) bestätigten somit, dass dem KHV exponierte Karpfen persistierende Infektionen etablieren können. Diese Fische schieden bei Temperaturen oberhalb von 20°C infektiöses Virus aus und übertrugen das KHV auf naive Karpfen. Diese Ergebnisse veranlaßten ST-HILAIRE, von einer Exposition naiver Karpfen mit dem Virus zur Erzeugung natürlich immuner Fische abzuraten, wenn diese Fische abgegeben und mit naiven Fischen zusammengehalten werden werden sollen (ST-HILAIRE et al. 2005). Weitere, tiefergreifende Studien eines möglichen Carrierstatus werden weiterhin benötigt (HEDRICK et al. 2006). Die eigenen Versuche sollten diese Fragestellung untersuchen. In einer ersten Versuchsreihe wurde untersucht, ob Koi nach einer überstandenen Infektion infektiöses Virus ausscheiden oder dieses provoziert werden kann, auch wenn die Fische keine KHV-Symptome zeigen. Hierfür wurde die spontane Virusausscheidung von wenige Wochen zuvor infizierten Koi überprüft. Anschließend wurde untersucht, ob die Koi nach einer Stresssituation infektiöses Virus ausschieden. Dass nur einer der beiden Koi spontan infektiöses Virus ausschied, zeigte, dass eine Virusausscheidung durch Koi, die vor kurzem eine symptomlose Infektion durchlaufen haben, nur gelegentlich erfolgte. Bei beiden Koi wurde die spontane Virusausscheidung unmittelbar nach dem Transport von dem Fischgroßhändler in das Labor überprüft, die Koi waren also vor Versuchsbeginn schon einer Belastung ausgesetzt. Die auftretenden Todesfälle und KHV-Nachweise unter den zugesetzten Karpfen weisen darauf hin, dass eine stressbedingte Virusreaktivierung möglich ist und durch die Belastung des Virusträgers die Virusausscheidung induziert werden kann. Der unter Ausbildung der typischen KHV-Symptome auftretende Tod eines Virusträgers zeigte, dass eine Virusreaktivierung auch zu einer Erkrankung des Virusträgers führen kann. In einer zweiten Versuchsreihe wurde die Eignung verschiedener Stressmodelle als Provokateur einer Virusausscheidung geprüft. Die Stärke der Wirkung der angewendeten Stressmodelle auf eine mögliche Ausscheidung von infektiösem Virus sollte evaluiert werden, um eine geeignete Reihenfolge der Anwendung der Stressmodelle für die dritte Versuchsreihe festlegen zu können. Stressmodelle mit großer Wirkung sollten dort an den Schluß der Untersuchungsreihe gestellt werden. Eine spontane Virusausscheidung war bei keinem der 97 Diskussion vier Koi, bei denen die Infektion vier Jahre zurück lag, nachweisbar. Allerdings ließ sich eine Virusausscheidung bei drei von vier Koi durch das Einwirken von Stress reaktivieren. Im vierten Fall, bei dem keiner der zugesetzten Karpfen KHV-positiv getestet werden konnte, aber einer der nach dem simulierten Abfischen zugesetzten Karpfen am zweiten Tag nach der Belastung verstorben war, war es sehr wahrscheinlich, dass ebenfalls eine Virusreaktivierung stattfand. Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe bestätigten insofern die Schlußfolgerungen aus den vorhergehenden Versuchen, indem sich durch das Einwirken von Stress bei einem großen Anteil der geprüften Koi eine Virusreaktivierung und erneute Virusausscheidung auslösen ließ. Auch das Auftreten von Todesfällen unter naiven Karpfen zwei Tage nach dem Zusetzen zu durch simuliertes Abfischen belasteten Virusträger wurde in beiden Versuchsreihen beobachtet. Im übrigen unterschieden sich jedoch die gewählten Stressmodelle in ihrer Wirkung nicht deutlich voneinander. Bei latent mit dem KHV infizierten Koi trat noch vier Jahre nach der Infektion eine stressbedingte Virusreaktivierung mit einer erneuten Ausscheidung von infektiösem Virus auf. Für eine dritte Versuchsreihe wurden Virusträger erzeugt, indem Karpfen durch Kohabitation infiziert und diese nach der Infektion vier Wochen lang bei 30-32°C gehalten wurden. Bei allen mit dem als Infektionsquelle dienenden erkrankten Koi kohabitierten Karpfen gelang die Infektion. Der Infektionsweg durch Kohabitation wurde gewählt, weil sie dem natürlichen Infektionsweg nahe kommt. Sie ermöglichte allerdings keine Quantifizierung der infektiösen Dosis, der die Fische ausgesetzt waren. Für diese Untersuchungen war es jedoch wichtig, das natürliche Infektionsgeschehen so gut wie möglich nachzustellen. Dass nach der Kohabitation mit dem an KHV erkrankten Koi nur bei einem von neun infizierten Karpfen KHV-DNA in den peripheren Blutleukozyten und nur bei zwei der neun Karpfen in Kiemenbiopsien KHVDNA nachgewiesen werden konnte, unterstreicht die große Unsicherheit der Untersuchung von Kiemenbiopsien oder Blutproben auf KHV mittels PCR. Diese Verfahren werden als nicht letale Methoden zur Probengewinnung diskutiert. Feldbeobachtungen und Infektionsexperimente zeigten, dass die Haltungstemperatur den Infektionsverlauf beeinflußt und dazu führen kann, dass die Ausbildung einer Latenz begünstigt wird. Zudem fand bei Temperaturen oberhalb von 32°C in vitro keine Virusvermehrung mehr statt (NEUKIRCH 2002). NEUKIRCH (2002) hielt es aber für möglich, dass bei diesen Temperaturen das Virusgenom in infizierten Wirtszellen persistieren kann. Die eigenen Untersuchungen stützen 98 Diskussion diese Vermutung. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass sich bei allen infizierten Karpfen latente Infektionen rekurrierenden etablierten. Erkrankungen Latente Infektionen sind neben chronischen und ein wichtiges Kriterium wahrscheinlich aller Herpesvirusinfektionen (FRASER et al. 1981, ROCK u. FRASER 1983, DAVISON 2002, KIRCHNER 1982). GALLOWAY (1982) erläuterte, dass die virale Genexpression der Herpesviren im latenten Stadium stark heruntergeregelt und der Nachweis schwierig ist. Auch die Zahl der Kopien der viralen DNA beim KHV sank in der Zeit nach der Infektion bis unter einen mit einer quantitativen PCR detektierbaren Spiegel (GILAD et al. 2004). GRAY et al. (1999) und THOMPSON et al. (2005) hielten die PCR für geeignet zur Detektion von latenten Infektionen mit dem CCV, da diese Methode nicht auf eine Virusvermehrung angewiesen und sehr sensitiv ist. Herpesviren scheinen nur in geringer Menge in symptomlosen Fischen vorzuliegen. Lediglich das CyHV-2 scheint in einer größeren Menge in symptomlosen Fischen vorzuliegen als dies bei anderen Herpesviren der Fische der Fall ist, da der Nachweis dieses Virus bei symptomlosen Fischen aller Altersklassen mit hoher Inzidenz gelang (GOODWIN et al. 2006). Molekularbiologische Untersuchungen von Gewebeproben mittels PCR eignen sich zum Nachweis des viralen Genoms. Hierbei wird mit den meisten Methoden eine Ja/ Nein Antwort erzielt. Dabei besteht kein Unterschied zwischen einer akuten Infektion, an der der Fisch sterben könnte, oder einer latenten Infektion. Die Unterscheidung kann durch eine quantitative PCR erfolgen, da hier anhand der Virusmenge auf das Vorliegen einer aktiven oder latenten Infektion geschlossen werden kann (GOODWIN et al. 2006). Wurden in der vorliegenden Studie naive Karpfen mit an KHV erkrankten Koi oder latent infizierten Virusträgern kohabitiert, verliefen die Infektionen in den meisten Fällen symptomlos. Dieses zeigte, dass es nach einer Exposition von naiven Karpfen mit dem Virus nicht regelmäßig und zwangsläufig zu einer klinisch in Erscheinung tretenden Erkrankung kam. Die Virusreaktivierung und erneute Virusausscheidung verlief in der Regel subklinisch, wie schon 1999 von GLASER et al. und 2004 von METHA et al. postuliert wurde. Die Belastung von latent infizierten Karpfen durch simulierten Transport und durch Hydrocortison schien einen geringeren Einfluß auf eine Virusreaktivierung zu haben als das simulierte Abfischen oder eine Infektion mit dem Blutparasiten Trypanoplasma borreli. Diese 99 Diskussion beiden Belastungsmodelle vermochten bei einem Großteil der Virusträger ein erneutes Ausscheiden oder eine Erhöhung der Ausscheidung von infektionsfähigem Virus zu induzieren. Die Belastung von latenten Virusträgern durch simuliertes Abfischen schien eine massive Virusausscheidung auszulösen und erwies sich somit als einziges der gewählten Stressmodelle, in derem Verlauf es zu Erkrankungen unter zugesetzten Karpfen kam. Bei den im Laufe der Untersuchungen am ersten bzw. zweiten Tag nach der Belastung mit dem simulierten Abfischen verstorbenen Karpfen konnte nur bei drei von fünfzehn Fällen ein positiver PCR-Nachweis geführt werden. Dies kann als mangelnde Zuverlässigkeit der Nachweismethode bei perakuten Geschehen interpretiert werden. Die Dauer der Virusausscheidung nach einer stressbedingten Virusreaktivierung war zeitlich beschränkt. Das Handling von Fischen ruft Stress hervor, der durch hormonale Veränderungen und metabolische und osmotische Imbalancen charakterisiert ist (DAVIS et al. 1993, PORTZ et al. 2006). Eine Vielzahl physiologischer Reaktionen, wie ein Anstieg des Plasmakortisol- und Glukosespiegels sowie ein Absinken der Plasmaelektrolytkonzentrationen können genutzt werden, um die Stärke des Stresses, die ein Tier erfuhr, einzuschätzen (DAVIS 2002). Der Anstieg der Plasmakortisolgehalte durch Aktivierung des Sympathikus wird für besonders bedeutend erachtet, da dieses Hormon immunsuppressive Eigenschaften besitzt (TRIPP et al. 1987; MAULE et al. 1989). Cortisol hat im Organismus eine Vielzahl von Auswirkungen und bewirkt unter anderem eine Induktion der Glukoneogenese und Immunsuppression. Letztgenannte Wirkung wird als Grund erachtet, warum Krankheitsausbrüche häufig nach Stresssituationen ausbrechen (DAVIS et al. 2003). Sowohl physiologischer Stress als auch exogen zugeführtes Kortisol konnten beispielsweise bakterielle und mykotische Infektionen bei Welsen (WALTERS u. PLUMB 1980; WISE et al. 1993) oder Bachforellen (PICKERING u. DUSTON 1983) verschlimmern. Die Ergebnisse der Stressversuche veranschaulichten, dass Stresssituationen auch bei der Verbreitung des Koi Herpesvirus eine bedeutende Rolle spielen können, indem sie zu einer Virusreaktivierung und erneuten, in der Regel symptomlos erfolgenden Virusausscheidung führen konnten. Es konnte bestätigt werden, dass das KHV eine Latenz zu etablieren vermag. 100 Diskussion Das KHV verhielt sich somit nach dem Einwirken von Stress auf das latent infizierte Individuum wie ein typisches Herpesvirus und ließ sich durch Stress reaktivieren, was mit einer erneuten Virusausscheidung verbunden war (PADGETT et al. 1998, SAINZ et al. 2001). Ebenso wurde offensichtlich, dass in den untersuchten natürlich und experimentell durch Kohabitation infizierten Fischbeständen der Prozentsatz infizierter Fische in der Population hoch war. Von fünf oral mit Zellkulturvirus reinfizierten Virusträgern verstarben zwei Individuen innerhalb kurzer Zeit nach der Infektion. Dies unterstreicht, dass Karpfen, die eine KHVInfektion überlebt hatten, nicht ausreichend vor einer erneuten Infektion mit dem KHV geschützt waren. Da alle infizierten Karpfen im Laufe der Versuche mehrmals Virus ausgeschieden hatten, waren sie dem KHV vor der Reinfektion mehrfach exponiert gewesen. Ein Immunität gegenüber einer erneuten Infektion bestand dennoch nicht. Eine für die weitere Verbreitung des KHV wichtigere Beobachtung war, dass drei der fünf reinfizierten Virusträger infektiöses Virus ausschieden, ohne selbst Krankheitsanzeichen zu zeigen oder zu klinisch in Erscheinung tretenden Erkrankungen der zugesetzten Karpfen zu führen. Die Virusmenge war jedoch ausreichend, um einen Großteil der zugesetzten Karpfen zu infizieren, auch wenn bei diesen Fischen die Infektion klinisch nicht in Erscheinung trat. 101 Diskussion 5.3 Untersuchung zum Wirtsspektrum des KHV Auch für die Untersuchung des Wirtsspektrums des KHV wurden unter identischen Bedingungen aufgezogene Geschwistertiere von Karpfen verwendet, um eine ähnliche Empfänglichkeit für das KHV zu gewährleisten. DAVISON (2002) postulierte, dass jedes Herpesvirus eng mit einer bestimmten Wirtsspezies verbunden ist, an die es sehr gut adaptiert ist. So konnten ARIAV et al. (1999) und WALSTER (1999) trotz der hohen Kontagiösität und Virulenz des KHV keine Morbiditäten und Mortalitäten bei nicht zu der Spezies Cyprinus carpio gehörenden Fischen beobachten. Bei Schleien, Goldorfen, Grasfischen, Hechten und Zandern traten während eines Ausbruches einer KHV-Infektion in einem Karpfenteich keine Krankheitserscheinungen auf (HOFFMANN et al. 2000). Das Fehlen von Krankheitssymptomen konnte bei Fischen aus einigen der genannten Arten durch die vorliegende Studie bestätigt werden. PERELBERG et al. (2003) kohabitierten Goldfische, Silberkarpfen und Graskarpfen mit infizierten Karpfen und setzten dann zu Fischen dieser Arten naive Karpfen. Auch sie beobachteten weder bei Goldfischen, Silberkarpfen und Graskarpfen noch bei den anschließend exponierten Karpfen klinische Symptome einer KHV-Infektion oder Mortalitäten. Sie postulierten deshalb, dass eben genannte Arten die zugesetzten naiven Karpfen nicht mit dem KHV infizieren konnten. Weitergehende Untersuchungen zum Virusnachweis wurden von PERELBERG et al. (2003) nicht unternommen. Auch in der vorliegenden Studie kam es bei naiven Karpfen, die zu KHV-exponierten Goldfischen und Silberkarpfen zugesetzt wurden, zu keinen Krankheitssymptomen. Bei einigen Goldfischen und Silberkarpfen sowie bei einigen mit Fischen dieser Arten kohabitierten naiven Karpfen konnte jedoch mittels PCR ein positiver KHV-Nachweis geführt werden. Auch bei Graskarpfen, die mit infizierten Koi zusammen gehalten wurden, wurden einige Fische mittels PCR-basierenden Methoden als KHV-positiv befunden. Bei mit diesen Fischen kohabitierten Karpfen kam es sogar zu einzelnen Todesfällen. Bereits BERGMANN berichtete über Nachweise von Teilen des KHV-Genoms bei Goldfischen und Karauschen (Carassius carassius) mittels PCR. Teile der viralen DNA waren bei diesen Fischen bis zu einem Jahr p.i. in Leukozyten detektierbar. Bei infizierten Goldfischen wurden nach einer Infektion mittels Kohabitation KHV-DNA, mRNA und 102 Diskussion spezifische KHV-Proteine nachgewiesen, und es konnte Virus in der Zellkultur isoliert werden (siehe HAENEN u. HEDRICK 2006). DIXON gab zu bedenken, dass eine Übertragung des KHV auf Goldfische, Orfen und Schleien von ihm nicht bestätigt werden kann (siehe HAENEN u. HEDRICK 2006). Bedeutsam für die Kontroverse um das Wirtsspektrum des Koi Herpesvirus erscheint die Frage zu sein, wie untersucht wurde, ob eine Infektion mit dem Virus erfolgte. In zahlreichen Studien (ARIAV 1999, WALSTER 1999, HOFFMANN et al. 2000, PERELBERG et al. 2003) wurde aus dem Fehlen von Krankheitssymptomen geschlossen, dass eine Infektion mit dem KHV nicht erfolgte. Auch DIXON bezweifelte eine Infektion von Fischen, die nicht zur Spezies Cyprinus carpio gehörten, an aufgrund fehlender Epizootiologie (HAENEN u. HEDRICK 2006). In den eigenen Versuchen sowie in der Studie von BERGMANN (HAENEN u. HEDRICK 2006) wurden bei Fischen, die nicht zur Spezies Cyprinus carpio gehörten, keine Krankheitsanzeichen beobachtet. In beiden Studien wurden jedoch in Geweben anderer Fischarten sowie in Geweben von Karpfen nach Kohabitation mit KHVexponierten Fischen aus anderen Arten mittels PCR positive KHV-Nachweise befundet. Die eigenen Versuche zur Validierung der PCR-basierenden Nachweismethode dokumentierte darüber hinaus die großen Unsicherheiten, mit denen diese Nachweismethode verbunden sein kann. Die Verwendung bestimmter Kombinationen von Primerpaar und Polymerase führten bei einigen Geweben, auch bei Geweben von Goldfischen, zu einem negativen Nachweisergebnis. Eine eindeutige Klärung der Frage, welche Rolle Fische, die nicht der Spezies Cyprinus carpio angehören, im Wirtsspektrum des KHV spielen, könnten Versuche zur Anzucht des Virus aus den Geweben der fraglichen Fischarten geben. Derartige Studien stehen, auch aufgrund des Fehlens eines sicheren Zellkultursystems für dieses Virus, noch aus. Die Versuche von HEDRICK et al. (2006) könnten Aufschluß über die epidemiologische Bedeutung von Golfischen geben. HEDRICK et al. (2006) untersuchten die Empfänglichkeit von Goldfischen und Goldfisch-Karpfen-Hybriden für das CyHV-3. Goldfische zeigten bei experimenteller Infektion mit dem CyHV-3 keine Mortalität. Hybride aus einem männlichen Goldfisch und einem weiblichen Karpfen entwickelten eine reduzierte Mortalität. Auf einer von den Hybriden abgeleiteten Zellkultur war ein Wachstum des KHV möglich. Möglich wäre eine Verbreitung des KHV durch Goldfische, die schwach empfänglich für das KHV 103 Diskussion sind und deshalb keine Krankheitsanzeichen zeigen, aber das Virus in sich vermehren und wieder ausscheiden können. 104 Diskussion 5.4 Versuche zur Vakzinierung Im ersten Impfversuch wurde die Vakzination von Karpfen mittels einer hitze- und einer formalininaktivierten Viruslösung über das Bad miteinander verglichen. Da es durch die Belastungsinfektion mit 1 KID50/ml weder unter nicht immunisierten noch unter immunisierten Karpfen zu Mortalitäten kam, konnte keine Aussage zu einer möglicherweise bestehenden Immunität getroffen werden. Die Nachweise von KHV-DNA bei den Karpfen, die mit der hitze- oder formalininaktivierten Viruspräparation immunisiert und vor der Belastungsinfektion untersucht wurden, lassen sich durch eine Aufnahme der Totimpfstoffe über Haut oder Kieme erklären. Bei der von YASUMOTO et al. (2006) entwickelten in Liposomen verpackten orale Vakzine, die mit 0,3 % Formalin für 48 Stunden bei 24°C inaktiviertem KHV enthielt und täglich über drei Tage oral verabreicht wurde, konnte durch einen Immunfluoreszenztest markiertes KHV-Antigen in den Epithelzellen des Enddarmes detektiert werden. Es kam also zu einer Absorption der in Liposomen verpackten KHVAntigene im Enddarm. Die in der eigenen Studie eingesetzte hitze- und formalininaktivierte Viruslösung besaß auf der Zellkultur keine Infektiösität, deshalb ist eine Infektion der Karpfen sehr unwahrscheinlich. Dass alle Fische, die die Belastungsinfektion durchlaufen hatten, mittels PCR KHV-positiv getestet wurden, spricht für eine subklinische Infektion durch die geringe Infektionsdosis der Belastungsinfektion. Auch GILAD et al. (2002) konnten bei Überlebenden einer Badeinfektion mit 102 KID50/ml nach zwei Wochen alle Fische mittels der von ihnen entwickelten PCR-Methode KHV-DNA nachweisen. Im zweiten Impfversuch wurde die Vakzination von Karpfen wie im ersten Impfversuch durchgeführt, aber die Belastungsinfektion mit 10 KID50/ml durchgeführt, in deren Verlauf es zu Totalausfällen in allen Gruppen kam. Die Ergebnisse des zweiten Impfversuches zeigen, dass mit den gewählten Methoden –einer Exposition von Karpfen mit inaktivierter Viruslösung über das Bad- keine Immunität erworben wurde. Im dritten Impfversuch wurde die Vakzinierung von Karpfen mittels einer hitze- und einer formalininaktivierten Viruslösung, die über das Bad, intraperitoneal, rektal oder oral verabreicht wurde, miteinander verglichen. Es wurde augenscheinlich, dass weder durch eine Erhöhung der Dosis der inaktivierten Viruspartikel noch durch eine Änderung der Inokulationsroute eine protektive Immunität gegenüber einer Belastungsinfektion aufgebaut 105 Diskussion werden konnte. Die Mortalitäten der Karpfen, die zur in vivo Kontrolle der Infektiösität der unbehandelten Viruslösung i. p., über das Bad, rektal oder oral infiziert wurden, offenbarten den Einfluß der Infektionsroute auf die Zeit von der Infektion bis zum Auftreten der ersten Todesfälle. Diese war bei intraperitonealer Applikation des Virus am kürzesten, gefolgt von der Infektion über das Bad. Die orale Infektion ging am langsamsten an. Auch HEDRICK et al. (2000) stellten fest, dass es während einer experimentellen Infektion bei einer intraperitonealen Applikation ein bis zwei Tage früher zu Krankheitssymptomen und Todesfällen kam als bei einer Infektion über das Bad. Dass alle überlebenden Karpfen deutliche Krankheitssymptome in Form zentralnervöser Ausfallerscheinungen zeigten, läßt auf eine Schädigung des Zentralnervensystems schließen. Studien zur Pathogenese, die dieses näher beleuchten, wurden noch nicht durchgeführt. Eine schützende Immunität gegenüber einer Belastungsinfektion über das Bad konnte mittels einmaliger Applikation einer hitze- oder formalininaktivierten Viruslösung nicht erzielt werden. YASUMOTO et al. (2006) entwickelten, da sie eine Lebendvakzine wegen der Möglichkeit einer Rückmutation auch für zu gefährlich hielten, eine mit 0,3 % Formalin inaktivierte, in Liposomen verpackte orale Vakzine, die täglich über drei Tage verabreicht wurde. Die Immunisierung reduzierte die Mortalität nach einer Belastungsinfektion von 90% auf 23%. PERELBERG et al. (2005) dagegen entwickelten einen durch 26 Zellkulturpassagen attenuierten Lebendimpfstoff. Dieser erforderte zur Ausbildung einer Immunität die Haltung der Impflinge bei Temperaturen, die die Virusvermehrung im Fisch erlaubten. Bei einer Haltung bei 23°C trat nach der Belastungsinfektion eine stark reduzierte Mortalität auf, es überlebten mehr als 95% der Karpfen. Auf diese Weise immunisierte Fische zeigten über einen Beobachtungszeitraum von sechs Monaten keine Krankheitsanzeichen. Eine Kohabitation mit naiven Karpfen löste innerhalb von 21 Tagen keine Erkrankung aus, eine Untersuchung, ob diese Fische subklinisch infiziert wurden, erfolgte jedoch nicht. Eine Unterscheidung von geimpften und mit dem Feldvirus infizierten Fischen ist derzeit in der Routinediagnostik noch nicht möglich. 106 Diskussion Schlußfolgerungen: In der vorliegenden Studie wurde nachgewiesen, dass das Koi Herpesvirus eine Latenz ausbilden kann. Spontane und durch Stress oder eine kortikosteroidvermittelte Immunsuppression bedingte Virusreaktivierungen führten zu einer erneuten Ausscheidung von infektiösem Virus durch die latent infizierten Virusträger. Unter zugesetzten Karpfen kam es häufig zu subklinischen Infektionen. Die untersuchten, nicht der Spezies Cyprinus carpio angehörenden Fische waren vermutlich infiziert, ohne dass die Infektion bei ihnen klinisch in Erscheinung trat. Bei der Validierung der PCR-basierenden Nachweismethode fiel der große Einfluß der Qualität des Ausgangsmaterials und der Wahl des Primerpaares und der Polymerase auf das Untersuchungsergebnis auf. 107 Zusammenfassung 6 ZUSAMMENFASSUNG Kirsten Meyer (2007): Untersuchungen zur Übertragung von Koi Herpesvirusinfektionen durch symptomlose Carrierfische Karpfenbestände wurden in der Vergangenheit häufig über den Zukauf von symptomlosen Virusträgern mit dem Koi Herpesvirus (KHV) infiziert. Das KHV verursacht bei Karpfen eine verlustreiche Erkrankung, die hohe wirtschaftliche Verluste nach sich zieht und die Versorgung der Bevölkerung mit Lebensmitteln tierischen Ursprungs beeinträchtigt. Besonders nach Streßsituationen, wie längeren Transporten, dem Umsetzen oder der Erkrankung an opportunistischen Krankheitserregern kam es in diesen Beständen zu einem Ausbruch der Erkrankung. Mit der vorliegenden Studie wurde geprüft, ob das Koi Herpesvirus wie es für Herpesviren typisch ist, in einer inaktiven Form über einen längeren Zeitraum im Organismus persistieren kann und es nach Stresssituationen oder einer Immunsuppression zu einer Virusreaktivierung kommen kann. Es wurde untersucht, ob eine gezielte Belastung von Koi nach natürlicher Infektion und Karpfen nach überstandener Laborinfektion eine Ausscheidung von infektiösem Virus zu induzieren oder zu erhöhen vermag, auch wenn bei diesen Fischen das Virus mittels molekularbiologischer Methoden nicht mehr nachgewiesen werden kann. Virusfrei aufgezogene Karpfen wurden im Labor durch Kohabitation mit einem an KHV erkrankten Koi infiziert, dann wurde die Temperatur für vier Wochen auf 30-32°C erhöht. Danach wurden die Fische weitere vier Wochen bei 23°C gehalten. Zu Versuchsbeginn erfolgte eine Kohabitation ohne die Einwirkung eines Stressors, um zu überprüfen, ob spontan infektionsfähiges Virus ausgeschieden wurde. Anschließend wurden die latent infizierten Virusträger mit einem simulierten Transport, einem simulierten Abfischen, einer Infektion mit dem Blutparasiten Trypanoplasma borreli, einer kortikosteroidinduzierten Immunsuppression und einer oralen Reinfektion mit dem KHV ausgesetzt und die Wirkung auf die Ausscheidung von infektiösem Virus durch Kohabitation mit naiven Karpfen und Untersuchung der Karpfen mittels PCR kontrolliert. 108 Zusammenfassung Die Ergebnisse zeigten, dass Stresssituationen und eine Reinfektion mit dem KHV bei latent mit dem KHV infizierten Fischen zu einer Virusreaktivierung und Ausscheidung von infektiösem Virus führen können. Es war weitgehend ungeklärt, ob andere Fischarten ebenfalls unerkannt zu einer weiteren Verbreitung des Virus beitragen können. Dem KHV exponierte Graskarpfen, Schleien, Goldfische und Silberkarpfen wurden mit naiven Karpfen kohabitiert und mittels PCR untersucht. Bei allen untersuchten Fischarten ließ sich DNA des Koi Herpesvirus nachweisen, ebenso in Geweben von naiven Karpfen, die mit Fischen aus diesen Arten vergesellschaftet wurden. Es wurden Versuche zur Vakzinierung von Karpfen mit einer formalininaktivierten und einer hitzeinaktivierten Viruslösung durchgeführt. Weder über das Bad, noch bei intraperitonealer, rektaler oder oraler Applikation der Impflösungen konnte ein wirksamer Schutz vor einer Erkrankung an dem KHV aufgebaut werden. Da derzeit keine einheitliche PCR-Methode für den KHV-Nachweis in den verschiedenen Untersuchungseinrichtungen angewandt wird, sollte untersucht werden, ob die Untersuchung von Gewebeproben mit verschiedenen PCR-Methoden zu vergleichbaren Ergebnissen führt. Die aus Gewebeproben eines infizierten Goldfisches, eines infizierten Karpfens und von drei infizierten Koi mittels verschiedener Extraktionsmethoden gewonnene DNA wurde mit verschiedenen Kombinationen aus Primerpaaren und Polymerasen untersucht. Der Vergleich der verschiedenen PCR-Methoden zeigte, dass die Untersuchung identischer Organproben mit unterschiedlichen Untersuchungsmethoden zu unterschiedlichen Ergebnissen führen kann. Die Studie unterstreicht die Bedeutung der Validierung der Nachweismethode, da der Vergleich der PCR-Methoden große Unterschiede in der Sensitivität offenbarte. Die Stressversuche zeigten, dass es bei Infektionen mit dem Koi Herpesvirus zur Ausbildung von latent infizierten Virusträgern kommen kann und dass durch Stress eine erneute Virusausscheidung induziert werden kann. Die in den Versuchen nur unregelmäßig auftretenden Krankheitssymptome und Mortalitäten stehen im Gegensatz zu Feldbeobachtungen. Die Studie unterstreicht, dass die Pathogenese der Erkrankung weitgehend ungeklärt ist. Dieses zeigen auch die Vakzinierungsversuche. Mit abgetöteten Viruspräparationen ließ sich kein Schutz errreichen. 109 Summary 7 SUMMARY Kirsten Meyer (2007): Asymptomatic carriers as spreader of koi herpesvirus In the past, carp populations were frequently infected through the acquisition of symptomless virus carriers that were infected with the koi herpesvirus (KHV). KHV induces disease which can lead to high mortalities, and therefore to high economic losses and impairs the human food supply. Outbreaks of the disease were observed especially in carp populations after stressful situations, such as long transport times, shifts of keeping conditions or infections with additional pathogenic agents. In this study it was examined if KHV, like other herpesviruses, can persist in an inactive form over a long period of time in the organism, and if situations of stress or immunosuppression can reactivate virus shedding. It was examined whether a specific exposure to KHV could induce or increase the excretion of infectious virus in koi after a natural infection and in carp that had survived a laboratory infection, even when the virus could not be detected anymore through molecular biological methods in these fish. Fish that were raised under virus-free conditions were infected in the laboratory by cohabitation with a KHV-infected koi showing infection symptoms. Then the temperature was raised to 30-32°C for four weeks. The fish were then kept for an additional four weeks at 23°C. At the beginning of the experiment fish were co-habitated without any stressor to examine if infectious virus was spontaneously excreted. Subsequently, latently infected carriers were exposed to a simulated capture, a simulated transport, an infection with the blood parasite Trypanoplasma borreli, an immune suppressing corticosteroid and an oral reinfection with KHV. The influence of the stressors on the excretion of infectious virus was examined through cohabitation of the stressed fish with naive carp and subsequent PCRexamination of the co-habitated naïve carp. Results show that stress situations and a reinfection with KHV can induce a virus-reactivation and can lead to excretion of infectious virus in fish that were latently infected with KHV. It was to an extent unclear if other fish species can also contribute to further spreading of the virus. Therefore grass carp, tench, goldfish and silver carp that were exposed to KHV and cohabitated with naive carp, were examined for KHV by means of PCR. In the tissue of all 110 Summary examined fish species KHV-specific DNA could be detected, and also in the tissue of naive carp which were cohabitated with individuals from the examined species. Experiments to vaccinate carp with a formal-inactivated and a heat-inactivated virus suspension were conducted. A good protection against KHV was not obtained, neither through bath treatment, nor through intraperitoneal, rectal or oral application of the vaccine. At present no uniform PCR-method for KHV-detection is used in different research laboratories. Therefore it was tested if the examination of tissue samples by different PCR methods leads to uniform results. DNA was isolated from tissue samples of an infected goldfish, an infected carp and three infected koi with several different extraction methods. This DNA was used to examine different combinations of primer pares and polymerases. The comparison of the different PCR methods showed that examination of identical tissues samples with different research methods can lead to different diagnosis. This study underlines the vales of the validation of the method, since the comparison of the PCR methods revealed large difference in sensitivity. The stress experiments showed, that infection with KHV can lead to latently infected virus carriers and that stress is able to induce a new virus excretion. In contrast to field observations, disease symptoms and mortalities seldomly occurred in the laboratory infection experiments. This study emphasises that the pathogenesis of the disease remains unexplained. The vaccination experiments also confirm this. No protection was obtained with killed-virus preparations. 111 Literaturverzeichnis 8 LITERATURVERZEICHNIS ADKISON, M. A., O. GILAD u. R. P. HEDRICK (2005): An enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antibodies to the koi herpesvirus (KHV) in the serum of koi Cyprinus carpio. Fish Path. 40 (2), 53-62 ARIAV, R., S. TINMAN, I. PAPERNA, u. I. BEJERANO (1999): First report of newly emerging viral disease of Cyprinus carpio species in Israel. Proceedings of EAFP 9th International Conference. Diseases of Fish and Shellfish, Rhodes, Greece BAEK, Y. S., J. A. BOYLE (1996): Detection of channel catfish virus in adult channel catfish by use of polymerase chain reaction. J. Aquat. Anim. Health 8, 97-103 BASTIAN, F. D., A. S. RABSON, C. L. YEE u. T. S. TRALKA (1972): Herpesvirus hominus: Isolation from human trigeminal ganglia. Science 178, 306-307 BAUR, W. H. u. J. RAPP (2003): Das Ammonium und das Ammoniak. In: W. H. BAUR u. J. RAPP (Hrsg): Gesunde Fische-Praktische Anleitung zum Vorbeugen, Erkennen und Behandeln von Fischkrankheiten. 2. Auflage. Blackwell Verlag, Berlin, Wien, S.9-12 BAUR, W. H. u. J. RAPP (2003): Das Nitrit. In: W. H. BAUR u. J. RAPP (Hrsg): Gesunde Fische-Praktische Anleitung zum Vorbeugen, Erkennen und Behandeln von Fischkrankheiten. 2. Auflage. Blackwell Verlag, Berlin, Wien, S.12-14 BEKESI, L., I. HORVATH, E. KOVACSGAYER u. G. CSABA (1986): Demonstration of herpesvirus-like particles in skin lesions of european eel (Anguilla anguilla). J. Appl. Ichthyol. 4, 190-192 112 Literaturverzeichnis BERCOVIER, H., Y. FISHMAN, R. NAHARY, S. SINAI, A. ZLOTKIN, M. EYNGOR, O. GILAD, A. ELDAR u. P. HEDRICK (2005): Cloning of the koi herpesvirus (KHV) gene encoding thymidine kinase and ist use for a highly sensitive PCR based diagnosis. BMC Microbiology 5 (13), 1-9 BIRD, R. C., K. E. NUSBAUM, E. A. SCREWS, R. R. YOUNG-WHITE, J. M. GRIZZLE u. M. TOIVIO-KINNUCAN (1988): Molecular cloning of fragments of the channel catfish virus (Herpesviridae) genome and expression of the encoded mRNA during infection. Am. J. Vet. Res. 49, 1850-1855 BLOCH, B. u. J. L. LARSEN (1994): A case of severe general oedema in young farmed turbot associated with a herpes virus infection. Bull. Eur. Assoc. Fish Path. 14, 130-132 BLOOM, M. (1998): Koi immune system suppressing disease (KISS). Tagungsband der VII. Tagung der deutschen Sektion der European Association of Fish Pathologists (EAFP) , Schmallenberg-Grafschaft BLY, J. E. u. L. W. CLEM (1992): Temperature and teleost immune functions. Fish Shellfish Immunol. 2, 159-171 BODY, A., F. LIEFFRIG, G. CHARLIER, u. A. COLLARD (2000): Isolation of virus-like particles from koi (Cyprinus carpio) suffering gill necrosis. Bull. Eur. Assoc. Fish Path. 20 (2), 87-88 BOIVIN, G., Z. COULOMBE u. S. RIVEST (2002): Intranasal herpes simplex virus type 2 inoculation causes a profound thymidine kinase dependent cerebral inflammatory response in the mouse hindbrain. Eur. J. Neurosci. 16, 29-43 BOWSER, P. R., A. D. MUNSON, H. H. HARBOE, R. FRANCIS-FLOYD, P. R. WATERSTRAT (1985): Isolation of channel catfish virus from channel catfish (Ictalurus punctatus) Rafinesque, broodstock. J. Fish Dis. 8, 557-561 113 Literaturverzeichnis BOYLE, J. u. B. S. BLACKWELL (1991): Use of the polymerase chain reaction to detect latent channel catfish virus. Am. J. Vet. Res. 52, 1965-1968 BRETZINGER, A., T. FISCHER-SCHERL, M. OUMOUNA, R. HOFFMAN, u. U. TRUYEN (1999): Mass mortalities in koi, Cyprinus carpio, associated with gill and skin disease. Bull. Eur. Assoc. Fish Path. 19 (5), 182-185 BUCHANAN, J. S. u. C. R. MADELY (1978): Studies on herpesvirus scophthalmi infection of turbot Scophthalmus maximus (L.) ultrastructural observations. J. Fish Dis. 1, 283-295 BURROWS, R., D. GOODRIDGE u. M. S. DENYER (1984): Trials of an inactivated equid herpesvirus-1 vaccine: challenge with a subtype 1 virus. Vet. Record 114, 369-374 CARTER, J. J., A. D. WEINBERG, A. POLLARD, R. REEVES, J. A. MAGNUSON u. N. S. MAGNUSON (1989): Inhibition of T-lymphocyte mitogenic responses and effects on cell functions by bovine herpesvirus-1. J. Virol. 63, 1525-1530 CHANG, P. H, Y. H. PAN, C. M. WU, S. T. KUO, H. Y. CHUNG (2002): Isolation and molecular characterisation of herpesvirus from culture european eels Anguilla anguilla in Taiwan. Dis. Aquat. Org. 50, 111-118 COHRS, R. J., D. H. GILDEN (2001): Human herpesvirus latency. Brain Path. 11, 465-74 114 Literaturverzeichnis DAVIDSE, A., O. HAENEN, S. G. DIJKSTRA, A. P. VAN NIEUWSTADT, T. J. K. VAN DER FORST, F. WAGENAAR u. G. J. WELLENBERG (1999): First isolation of herpesvirus of eel (Herpesvirus anguillae) in diseased european eel (Anguilla anguilla L.). Bull. Eur. Ass. Fish Path. 19 (4), 137-141 DAVIS, K. B., B. R. GRIFFIN u. W. L. GRAY (2002) : Effect of handling stress on susceptibility of channel catfish Ictalurus punctatus to Ichthyophthirius multifiliis and channel catfish virus infection. Auqaculture 214, 55-66 DAVIS, K. B., B. R. GRIFFIN u. W. L. GRAY (2003) : Effect of dietary cortisol on resistance of channel catfish to Ichthyophthirius multifiliis and channel catfish virus disease. Aquaculture 218, 121-130 DAVISON, A. J. (2002): Evolution of the herpesviruses. Vet. Microbiol. 86, 69-88 DISHON, A., A. PERELBERG, J. BISHARA-SHIEBAN, M. ILOUZE, M. DAVIDOVICH, S. WERKER u. M. KOTLER (2005): Detection of carp interstitial nephritis and gill necrosis virus in fish droppings. Appl. Environ. Microbiol. 71 (11), 7285-7291 EDINGTON, N., C. G. BRDIGES u. A. HUCKLE (1985): Experimental reactivation of equid herpesvirus 1 (EHV-1) following the administration of corticosteroids. Equine Vet. J. 17, 369-372 EDINGTON, N., H. M. WELCH u. L. GRIFFITHS (1994): The prevalence of latent equid herpesviruses in the tissues of 40 abattoir horses. Equine Vet. J. 26, 140-142 EGGSET, G., H. MIKKELSEN u. J. E. A. KILLIE (1997): Immunocompetence and duration of immunity against Vibrio salmonicida and Aeromonas salmonicida after vaccination of atlantic salmon (Salmo salar L.) at low and high temperatures. Fish Shellfish Immunol. 7, 247-260 115 Literaturverzeichnis FRASER, W. W., W. C. LAWRANCE, Z. WROBLEWSKA , D. GILDEN u. H. KOPROWSKI (1981): Herpes simplex type 1 in human brain tissue. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78, 6461-6465 GALLOWAY, D. A., C. M. FENOGLIO, J. D. Mc DOUGALL (1982): Limited transcription of the herpes simplex virus genome when latent in human sensory ganglia. J. Virol. 41, 686-691 GIBSON, J. S., J. D. SLATER, A. R. AWAN u. H. J. FIELD (1992): Pathogenesis of equine herpesvirus-1 in specific pathogen-free foals: primary and secondary infection and reactivation. Archives Virol.123, 351-366 GILAD, O., S. YUN, K. B. ANDREE, M. A. ADKINSON, A. ZLOTKIN, H. BERCOVIER, A. ELDAR, u. R. P. HEDRICK (2002): Initial characteristics of koi herpesvirus and development of a polymerase chain reaction assay to detect the virus in koi, Cyprinus carpio koi. Dis. Aquat. Org. 48, 101-108 GILAD, O., S. YUN, M. A. ADKINSON, K. WAY, N. H. WILLITS, H. BERCOVIER, u. R. P. HEDRICK (2003): Molecular comparison of isolates of an emerging fish pathogen, koi herpesvirus, and the effect of water temperature on mortality of experimentally infected koi. J. Gen. Virol. 84, 2661-2668 GILAD, O., S. YUN, F. J. ZAGMUTT-VERGARA, C. M. LEUTENEGGER, H. BERCOVIER, R. HEDRICK (2004): Concentrations of a koi herpesvirus (KHV) in tissues of experimentally infected Cyprinus carpio koi as assessed by real-time TaqMan PCR. Dis. Aquat. Org. 60, 179-187 GLASER, R., S. B. FRIEDMAN, J. SMYTH, R. ADER, P. BIJUR, P. BRUNELL, N. COHEN, L. R. KRILOV, S. T. LIFRAK, A. STONE u. P. TOFFLER (1999): The differential impact of training stress and final examination stress on herpesvirus latency at the United States Military Academy at West Point. Brain Behav. Immunol. 13 (3), 240-251 116 Literaturverzeichnis GOODWIN, A. E., G. E. MERRY u. J. SADLER (2006): Detection of the herpesviral hematopoietic necrosis disease agent (Cyprinid herpesvirus-2) in moribund and healthy goldfish: validation of a quantitative PCR diagnostic method. Dis. Aquat. Org. 69, 137-143 GRAY, W. L., R. J. WILLIAMS u. B. R. GRIFFIN (1999): Detection of channel catfish virus DNA in acutely infected catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque), using the polymerase chain reaction. J. Fish Dis. 22, 111-116 GRAY, W. L., R. J. WILLIAMS u. R. L. JORDAN (1999b): Detection of channel catfish virus DNA in lately infected catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque), using the polymerase chain reaction. J. Gen. Virol. 80, 1817-1822 GRAY, W. L., L. MULLIS, S. E. LA PATRA, J. M. GROFF, u. A. GOODWIN (2002): Detection of koi herpesvirus DNA in tissues of infected fish. J. Fish Dis. 25, 171-178 GUNIMALADEVI, I., M. N. VENUGOPAL u. M. SAKAI (2004): Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. J. Fish Dis. 27, 583-589 HAENEN, O. L. M., S. G. DIJKSTRA, P. W. VAN TULDEN, A. DAVIDSE, A. P. VAN NIEUWSTADT, F. WAGENAAR u. G. J. WELLENBERG (2002): Herpesvirus anguillae (HVA) isolations from disease outbrakes in cultured european eel, Anguilla anguilla in the netherlands since 1996. Bull. Eur. Assoc. Fish Path. 22 (4), 247-257 HAENEN, O. L. M., K. WAY, S. M. BERGMANN u. E. ARIEL (2004): The emergence of koi herpesvirus and its significance to european aquaculture. Bull. Eur. Assoc. Fish Path. 24 (6), 293-307 HAENEN, O. u. R. HEDRICK (2006): Koi herpesvirus workshop. Bull. Eur. Assoc. Fish Path. 26 (1), 26-37 117 Literaturverzeichnis HALFORD, W. P., B. M. GEBHARDT u. D. J. CARR (1996): Mechanisms of herpes simplex virus type 1 reactivation. J. Virol. 70 (8), 5051-5060 HANSON, L. A., M. R. RUDIS u. L. PETRIE-HANSON (2004): Susceptibility of channel catfish fry to channel catfish virus (CCV) challenge increases with age. Dis. Aquat. Org. 62 (1-2), 27-34 HAYASHI, Y., H. KODAMA, K. ISHIGAKI, T. MIKAMI, H. IZAWA u. D. K. SAKAI (1986): Characteristics of a new herpesviral isolate from salmonid fish. Jpn. J. Vet. Sci. 48, 915-924 HEDRICK, R. P., T. MC DOWELL, W. D. EATON, T. KIMURA u. T. SANO (1987): Serological relationships of five herpesviruses isolated from salmonid fishes. J. Appl. Ichthyol. 3, 87-92 HEDRICK, R. P., J. M. GROFF u. T. MC DOWELL (1987b): Response of adult channel catfish to waterborne exposures of catfish virus. The Progressive Fish-Culturist 49, 181-187 HEDRICK, R. P. u. T. SANO (1989): Herpesviruses of fishes. In: W. AHNE u. E. KURSTAK (Hrsg): Viruses of Lower Vertebrates. Springer-Verlag, Berlin, S. 161-170 HEDRICK, R. P., J. M. GROFF, M. S. OKIHIRO, u. T. S. McDOWELL (1990): Herpesviruses detected in papillomatous skin growths of koi carp (Cyprinus carpio). J. Wildlife Dis. 26, 578-581 HEDRICK, R. P., T. S. MC DOWELL, J. M. GROFF, S. YUN u. W. H. WINGFIELD (1991): Isolation of an epitheliotropic herpesvirus from white sturgeon Acipenser transmontanus. Dis. Aquat. Org. 11, 49-56 118 Literaturverzeichnis HEDRICK, R. P., O. GILAD, S. YUN, J. SPANGENBERG, G. MARTY, R. NORDHAUSEN, M. KEBUS, H. BERCOVIER, u. A. ELDAR (2000): A herpesvirus associated with mass mortality of juvenile and adult koi, a strain of common carp. J. Aquat. Animal Health 12, 44-55 HEDRICK, R. P., O. GILAD, S. C. YUN, T. S. MC DOWELL, T. B. WALTZEK, G. O. KELLEY u. M. A. ADKISON (2005): Initial isolation and characterization of a herpes-like virus (KHV) from koi and common carp. Bull. Fish Res. Agency 2, 1-7 HEDRICK, R. P., T. B. WALTZEK u. T. S. MC DOWELL (2006): Susceptibility of koi carp, common carp, goldfish, and goldfish x common carp hybrids to cyprinid herpesvirus-2 and herpesvirus-3. J. Aquat. Animal Health 18, 26-34 HELLBERG, H., E. O. KOPPANG, B. TORUD u. I. BJERKAS (2002): Subclinical herpesvirus infection in farmed turbot Scophthalmus maximus. Dis. Aquat. Org. 49, 27-31 HERMAN, R. L., C. N. BURKE u. S. PERRY (1997): Epidermal tumors of rainbow smelt with associated virus. J. Wildlife Dis. 33 (4), 925-929 HOFFMANN, R., M. EL-MATBOULI, S. ESSBAUER u. TH. FISCHER-SCHERL (2000): Ausbruch der ,,Koi-Seuche“ bei Teichkarpfen. 8. Tagung der Deutschen Sektion der EAFP,Potsdam HOFFMANN, R. (2001). Herpesviren bei Koi. KLAN Koi-Magazin 2, 61-65 HYATT, A. D., P. M. HINE, J. B. JONES, R. J. WHITTINGTON, C. KEARNS, T. G. WISE, M. S. CRANE u. L. M. WILLIAMS (1997): Epizootic mortality in the pilchard Sardinops sagax neopilchardus in Australia and New Zealand in 1995. II. Identification of a herpesvirus within the gill epithelium. Dis. Aquat. Org. 28, 17-29 119 Literaturverzeichnis JONES, C., V. GEISER, G. HENDERSON, Y. JIANG, F. MEYER, S. PEREZ u. Y. ZHANG (2006): Functional analysis of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) genes expressed during latency. Vet. Microbiol. 113, 199-210 JUNG, S. J. u. T. MIYAZAKI (1995): Herpesviral haematopoietic necrosis of goldfish, Carassius auratus (L.). J. Fish Dis. 18, 211-220 KANCHARLA, S. R. u. L. A. HANSON (1996): Production and shedding of channel catfish virus (CCV) and thymidine kinase negative CCV in immersion exposed channel catfish fingerlings. Dis. Aquat. Org. 27, 25-34 KASAI, H., Y. MUTO u. M. YOSHIMIZU (2005): Virucidal effects of ultraviolet, heat treatment and disinfectants against koi herpesvirus (KHV). Fish Path. 40 (3), 137-138 KENT, M. L. u. M. S. MYERS (2000): Hepatic lesions in a redstriped rockfish (Sebastes proriger) suggestive of a herpesvirus infection. Dis. Aquat. Org. 41, 237-239 KHANNA, K. M., A. J. LEPISTO, R. L. HENDRICKS (2004): Immunity to latent viral infection: many skirmishes but new fatalities. Trends Immunol. 25, 5230-5234 KIMURA, T., M. YOSHIMIZU, M. TANAKA u. H. SANNOHE (1981a): Studies on an new virus (OMV) from Oncorhynchus masou I. Characteristics and pathogenicity. Fish Path. 15, 143-147 KIMURA, T., M. YOSHIMIZU, M. TANAKA (1981b): Studies on an new virus (OMV) from Oncorhynchus masou. II. Oncogenic nature. Fish Path. 15, 149-153 120 Literaturverzeichnis KIRCHNER, H. (1982): Immunobiology of infection with herpes simplex virus. Monogr. Virol. 13, 10-12 KIEFF, E. (1996): Epstein-Barr virus and its replication. Fields Virology 3, 2343-2496 KOBAYASHI, T. u. T. MIYAZAKI (1997): Characterization and pathogenicity of a herpesvirus isolated from cutaneous lesion in japanese eel, Anguilla japonica. Fish Path. 32 (2), 89-95 KONDO, K., T. KONDO, T. OKUNO u. M. TAKAHASHI (1991): Latent human herpesvirus 6 infection of human monocytes/macrophages. J. Gen. Virol. 72, 1401-1408 KONDO, K. u. E. S. MOCARSKI (1995): Cytomegalovirus latency ans latency-specific transcription in hematopoietic progenitors. Scand. J. Infect. Dis. 99, 63-67 LEE, N. S., J. KOBAYASHI u. T. MIKAZAKI (1999): Gill filament necrosis in farmed japanese eel, Anguilla japonica, infected with herpesvirus anguilla. J. Fish Dis. 22, 457-463 MAULE, R. A., R. A. TRIPP, S. L. KAATTARI u. C. B. SCHRECK (1989): Stress alters immune function and disease resistance in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha). J. Endocrinol. 120, 135-142 MC GEOCH, D. J., F. J. RIXON u. A. J. DAVISON (2006): Topics in herpesvirus genomics and evolution. Virus Res. 117, 90-104 MEHTA, S. K., R. J. COHRS, B. FORGHANI, G. ZERBE, D. H. GILDEN u. D. L. PIERSON (2004): Stress-induced subclinical reactivation of varicella zoster virus in astronauts. J. Med. Virol. 72 (1), 174-179 121 Literaturverzeichnis MINSON, A. C, A. DAVISON, R. EBERLE, R. C. DESROSIERS, B. FLECKENSTEIN, D. J. MC GEOCH, P. E. PELLET, B. ROIZMANN u. M. J. STUDDERT (2000): Family Herpesviridae. In: Virus taxonomy: Seventh report of the international commitee on taxonomy of viruses, Academic Press, San Diego, S. 203-225 MURRAY, A. G., M. O` CALLAGHAN u. B. JONES (2001): Simple models of massive epidemics of herpesvirus in Australian (and New Zealand) pilchards. Environ. Int. 27, 243-248 NEUKIRCH, M., K. BOETTCHER, u. S. BUNNAJIRAKUL (1999): Isolation of a virus from koi with altered gills. Bull. Eur. Assoc. Fish Path. 19 (5), 221-224 NEUKIRCH, M., U. KUNZ (2001): Isolation and preliminary characterization of several viruses from koi (Cyprinus carpio) suffering gill necrosis and mortality. Bull. Eur. Assoc. Fish Path. 21 (4), 125-135 NEUKIRCH, M. (2001): Virusinfektionen bei Koi. KLAN Koi-Magazin 9 (3), 47-53 NEUKIRCH, M. (2003a): Untersuchungen zur Stabilität von Koi-Virusisolaten. 1. Mitteilung: Einfluß der Temperatur auf die Vermehrungsfähigkeit. KLAN Koi-Magazin 11 (1) , 41-47 NEUKIRCH, M. (2003b): Untersuchungen zur Stabilität von Koi-Virusisolaten. 2. Mitteilung: Einfluß verschiedener pH-Werte auf die Vermehrungfähigkeit. KLAN Koi-Magazin 11 (2), 59-62 NEUKIRCH, M. (2003c): Herpesvirus bedingte Koi-Seuche. KLAN Koi-Magazin 11 (4) , 49-57 122 Literaturverzeichnis NOGA, E. J. u. J. X. HARTMANN (1981): Establishment of walking catfish (Clarias batrachus) cell lines and development of a channel catfish (Ictalurus punctatus) virus vaccine. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 38, 925-930 NOISAKRAN, S., W. P. HALFORD, L. VERESS u. D. J. CARR (1998): Role of the hypothalamic pituitary adrenal axis and IL-6 in stress-induced reactivation of latent herpes simplex virus type 1. J. Immunol. 160 (11), 5441-5447 NUSBAUM, K. E. u. J. M. GRIZZLE (1987): Uptake of channel catfish virus from water by channel catfish and bluegills. Am. J. Vet. Res. 48, 375-377 OH M. J., S. J.JUNG, T. J. CHOI, H. R. KIM, K. V. RAJENDRAN, Y. J. KIM, M.-A. PARK u. S. K. CHUN (2001): A viral disease occuring in cultured carp Cyprinus carpio in Korea. Fish Path. 36, 147-151 PADGETT, D. A., J. F. SHERIDAN, J. DORNE, G. G. BERNTSON, J. CANDELORA u. R. GLASER (1998): Social stress and the reactivation of latent herpes simplex virus type 1. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95, 7231-7235 PATEL, J. R. u. J. HELDENS (2005): Equine herpesviruses 1 (EHV-1) and 4 (EHV-4) –Epidemiology, disease and immunoprophylaxis: a brief review. Vet. J. 170, 14-23 PERELBERG, A., M. SMIRNOV, M. HUTORAN, A. DIAMANT, Y. BEJERANO, u. M. KOTLER (2003): Epidemiological description of an new viral disease afflicting cultured Cyprinus carpio in Israel. Israeli J. Aquaculture-Bamidgeh 55 (1), 5-12 PERELBERG, A., A. RONEN, M. HUTORAN, Y. SMITH und M. KOTLER (2005): Protection of cultured Cyprinus carpio against a lethal viral disease by an attenuated virus vaccine. Vaccine 23, 3396-3403 123 Literaturverzeichnis PICKERING, A. D. u. J. DUSTON (1983): Administration of cortisol to brown trout, Salmo trutta L., and its effects on the susceptibility to Saproneglia infection and furunculosis. J. Fish Biol. 23, 163-175 PIERSON, D. L., R. P. STOWE, T. M. PHILLIPS, D. J. LUGG u. S. K. MEHTA (2005): Epstein-barr virus shedding by astronauts during space flight. Brain Behav. Immunol. 19 (3), 235-242 PIKARSKY, E., A. RONEN, J. ABRAMOWITZ, B. LEVAVI-SIVAN, M. HUTORAN, Y. SHAPIRA, M. STEINITZ, A. PERELBERG, D. SOFFER, u. M. KOTLER (2004): The pathogenesis of the acute viral disease in fish induced by the carp interstitial nephritis and gill necrosis virus (CNGV). J. Virol. 78, 9544-51 PLUMB, J. A. (1971): Tissue distribution of channel catfish virus. J. Wildlife Dis. 7, 213-216 PLUMB, J. A. (1973): Effects of temperature on mortality of fingerlings of channel catfish (Ictalurus punctatus) experimentally infected with channel catfish virus. J. Fish Res. Board Ca. 30, 568-570 PLUMB, J. A. (1978): Epizootiology of channel catfish virus disease. Mar. Fish Rev. 40, 26-29 PLUMB, J. A., R. L. THUNE u. P. H. KLESIUS (1981): Detection of channel catfish virus in adult fish. Int. Symp. Fish Biol.: Serodiagnostics and vaccines, Leetown,USA Develop. Biol. Standard. 49, 29-34 PORTZ, D. E., C. M. WOODLEY u. J. J. CECH (2006): Stress-associated impacts of short-term holding on fishes. Rev. Fish Biol. Fisheries 16, 125-170 124 Literaturverzeichnis ROBERTS, R. J. (2001): Fish Pathology. 3. Auflage Bailliere Tindall, London ROCK, D. L., N. W. FRASER (1983): Detection of HSV-1 genome in central nervous system of latently infected mice. Nature 302, 523-525 ROCK, D., J. LOKENSGARD, T. LEWIS u. G. KUTISH (1992): Characterization of dexamethasone-induced reactivation of latent bovine herpesvirus 1. J. Virol. 66, 2484-2490 ROIZMANN, B. (1996): Herpesviridae. In: B. F. FIELD, D. m. KNIPE u. P. M. HOWLEY (Hrsg.): Field virology, 2. Auflage Lippincott-Raven, Philadelphia, S. 2221-2230 ROLLE, M. u. A. MAYR (1993): Medizinische Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenlehre. 6. Auflage. Ferdinand Enke Verlag, Stuttgart RONEN, A., A. PERELBERG, J. ABRAMOWITZ, M. HUTORAN, S. TINMAN, I. BEJERANO, M. STEINITZ, u. M. KOTLER (2003): Efficient vaccine against the virus causing a lethal disease in cultured Cyprinus carpio. Vaccine 21, 4677-4684 SAINZ, B., J. M. LOUTSCH, M. E. MARQUART u. J. M. HILL (2001): Stress-associated immunomodulation and herpes simplex virus infections. Med. Hypotheses 56, 348-356 SANO, T. (1976): Viral diseases of cultured fishes in Japan. Fish Path. 10, 221-226 SANO, T., H. FUKUDA, N. OKAMATO u. F. KANEKO (1983): Yamame tumor virus: lethality and oncogenicity. Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish 49, 1159-1163 125 Literaturverzeichnis SANO, T., H. FUKUDA, M. FURUKAWA, H. HOSOYA u. Y. MORIYA (1985): A herpesvirus isolated from carp papilloma in Japan. Fish Shellfish Path. 32, 307-311 SANO, T., N. MORITA, N. SHIMA u. M. AKIMOTO (1990): A preliminary report on pathogenicity and oncogenicity of cyprinid herpesvirus. Bull. Eur. Assoc. Fish Path. 10 (1), 11-13 SANO, M., H. FUKUDA u. T. SANO (1990): Isolation and characterization of a new herpesvirus from eel. Pathology in marine Science 3rd : 1988, 15-31 SANO, T., N. MORITA, N. SHIMA, u. M. AKIMOTO (1991): Herpesvirus cyprini: lethality and oncogenity. J. Fish Dis. 14, 533-543 SANO, N., M. MORIWAKE, R. HONDO u. T. SANO (1993): Herpesvirus cyprini: a search for viral genome in infected fish by in situ hybridization. J. Fish Dis 16, 495-499 SANO, N., M. MORIWAKE u. T. SANO (1993): Herpesvirus cyprini: thermal effects on pathogenicity and oncogenicity. Fish Path. 28, 171-175 SCHUBERT, G. (1964): Elektronenmikroskopische Untersuchungen zur Pockenkrankheit des Karpfens. Z. Naturforsch. 19b, 675-682 SCHUBERT, G. (1966): The infective agent in carp pox. Bull. Off. Int. Epizoot. 65, 1011-1022 SHAPIRA, Y., Y. MAGEN, T. ZAK, M. KOTLER, G. HULATA und B. LEVAVI-SIVAN (2005): Differential resistance to koi herpes virus (KHV)/carp interstitial nephritis and gill necrosis virus (CNGV) among common carp (Cyprinus carpio L.) strains and crossbreds. Aquaculture 245, 1-11 126 Literaturverzeichnis SHEFFY, B. E. u. D. H. DAVIES (1972): Reactivation of a bovine herpesvirus after corticosteroid treatment. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 140, 974-976 SHIH, H. H., C. W. HU u. C. S. WANG (2003): Detection of Herpesvirus anguillae infection in eel using in situ hybridization. J. Appl. Ichthyol.19 (2), 99-103 SHIMIZU, T., N. YOSHIDA, H. KASAI u. M. YOSHIMIZU (2006): Survival of koi herpesvirus (KHV) in environmental water. Fish Path. 41 (4), 153-157 SIMMONS, A., D. TSCHARKE u. P. SPECK (1992): The role of immune mechanisms in control of herpes simplex virus infection of the peripheral nervous system. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 179, 31-56 SLATER, J. D., K. BORCHERS, A. M. THACKERY u. H. FIELD (1994): The trigeminal ganglion is a location for equine herpesvirus 1 (EHV-1) latency and reactivation in the horse. J. Gen. Virol. 75, 2007-2016 STEINHAGEN, D., P. KRUSE u. W. KÖRTING (1989): The parasitemia of cloned Trypanoplasma borreli Laveran & Mesnil, 1901 in laboratory infected carp (Cyprinus carpio). J. Parasitol. 75, 685-689 STEINHAGEN, D., P. KRUSE u. M. NEUKIRCH (1992): Virus-associated epidermal hyperplasia in golden die Leuciscus idus melanotus. Dis. Aquat. Org. 13, 225-229 ST-HILAIRE, S., N. BEEVERS, K. WAY, R. M. LE DEUFF, P. MARTIN u. C. JOINER (2005): Reactivation of koi herpesvirus infections in common carp Cyprinus carpio. Dis. Aquat. Org. 67, 15-23 127 Literaturverzeichnis STEVENS, J. G., (1987): RNA complementary to a herpesvirus alpha gene mRNA is prominent in latently infected neurons. Science 235, 1056-1059 STEPHENS, F. J., S. R. RAIDAL u. B. JONES (2004): Haematopoietic necrosis in goldfish (Carassius auratus) associated with an agent morphologically similar to herpesvirus. Australian Veterinary Journal 82 (3), 167-169 STINGLEY, R. L., B. R. GRIFFIN u. W. L. GRAY (2003): Channel catfish virus gene expression in experimentally infected channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). J. Fish Dis. 26, 487-493 TANAKA, M., M. YOSHIMIZU u. T. KIMURA (1984): Oncorhynchus masou virus: pathological changes in masu salmon (Oncorhynchus masou), chum salmon (O. keta) and coho salmon (O. kisutch) fry infected with OMV by immersion method. Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish 50, 431-437 THOMPSON, D. J., L. H. KHOO, D. J. WISE u. L. A. HANSON (2005): Evaluation of channel catfish virus latency on fingerling production farms in Mississippi. J. Aquat. Animal Health 17, 211-215 TRIPP, R. A., A. G. MAULE, C. B. SCHRECK u. S. L. KAATTARI (1987): Cortisol-mediated suppression of salmonid lymphocyte responses in vitro. Dev. Comp. Immunol. 11, 565-576 UENO, Y., T. KITAO, S. N. CHEN, T. AOKI u. G. H. KOU (1992): Characterisation of a herpes-like virus isolated from cultured japanese eel in Taiwan. Gyobyo Kenkyu 27, 7-17 VAN NIEUWSTADT, A. P., S. G. DIJKSTRA u. O. L. M. HAENEN (2001): Persistence of herpesvirus of eel Herpesvirus anguillae in farmed european eel Anguilla anguilla. Dis. Aquat. Org. 45, 103-107 128 Literaturverzeichnis VESTERGAARD, P. E. u. R. D. JOERGENSEN (1982): Egtved virus. Temperature-dependent immune response of trout to infection with lowvirulence virus. J. Fish Dis. 5, 47-55 WALCZAK, E. M., E. J. NOGA u. J. X. HARTMANN (1981): Properties of a vaccine for channel catfish virus disease and a method of administration. Int. Symp. Fish Biol.: Serodiagnostics and vaccines, Leetown, W. Va.,U. S. A., Develop. Biol. Standard. 49, 419-429 WALSTER, C. I. (1999): Clinical observations of severe mortalities in koi carp, Cyprinus carpio, with gill disease. Fish Vet. J. 3, 54-58 WALSTER, C. I. (2000): Koi carp mortality syndrom: an update. Fish Vet. J. 5, 72-75 WALSTER, C. (2003): A note on koi herpesvirus (KHV): current situation and issues arising. Fish Vet. J. 7, 77-81 WALTERS, G. R. u. J. A. PLUMB (1980): Environmental stress and bacterial infection in channel catfish, Ictalurus punctatus Rafinesque. J. Fish Biol. 17, 177-185 WALTZEK, T. B., G. O. KELLEY, D. M. STONE, K. WAY, L. HANSON, H. FUKUDA, I. HIRONO, T., AOKI, A. J. DAVISON u. R. P. HEDRICK (2005): Koi herpesvirus represents a third cyprinid herpesvirus (CyHV-3) in the family Herpesviridae. J. Gen. Virol. 86, 1659-1667 WAY, K., M. LE DEUFF, D. M. STONE, K. L. DENHAM u. S. ST-HILAIRE (2004): Diagnostics and research at CEFAS Weymouth laboratory 2000-2003. Report of International Workshop on Koi Herpesvirus, 12-13 February 2004, London 129 Literaturverzeichnis WELSH, H. M., C. G. BRIDGES, A. M. LYON, L. GRIIITHS u. L. EDINGTON (1992): Latent equid herpesvirus 1 and 4: detection and distinction using the polymerase chain reaction and cocultivation from lymphoid tissues. J. Gen. Virol. 73, 261-268 WIEGERTJES, G. F. (1995): Immunogenetics of disease resistance in fish. Wageningen, Agricultural University, Diss. WISE, J. E., P. R. BROWSER u. J. A. BOYLE (1985): Detection of channel catfish virus in asymptomatic adult channel catfish, ictalurid punctatus (Rafinesque). J. Fish Dis. 8, 485-493 WISE, D. J., T. E. SCHWEDLER u. D. L. OTIS (1993): Effects of stress on susceptibility of naive channel catfish in immersion challenge with Edwardsiella ictaluri. J. Aquat. Animal. Health 5, 92-97 WOLF, K., u. R. W. DARLINGTON (1971): Channel catfish virus: a new herpesvirus of ictalurid fish. J. Virol. 8, 525-533 WOLF, K., R. W. DARLINGTON, W. G. TAYLOR, M. C. QUIMBY u. T. NAGABAYASHI (1978): Herpesvirus salmonis: Characterization of a new pathogen of rainbow trout. J. Virol. 27 (3), 659-666 WOLF, K. (1988): Fish viruses and viral diseases. Cornell University Press, Ithaca, NY YASUMOTO, S., Y. KUZUYA, M. YASUDA, T. YOSHIMURA u. T. MIYAZAKI (2006): Oral immunization of common carp with a liposome vaccine fusing koi Herpesvirus antigen. Fish Path. 41 (4), 141-145 130 Danksagung 9 DANKSAGUNG An erster Stelle möchte ich Dieter Steinhagen für die Überlassung des Themas, die Bereitstellung der Arbeitsmöglichkeiten und die außerordentlich kompetente und stets hilfsbereite Betreuung danken. Bei dem Zentralverband Zoologischer Fachbetriebe (ZZF) bedanke ich mich für die finanzielle Unterstützung der Studie. Sven Bergmann danke ich für die Einarbeitung in die Nachweismethoden, die vielen Anregungen und die fachliche Unterstützung. Bei Birgit Luckhardt und Feyza Selcuk bedanke ich mich für die tatkräftige Hilfe im Labor und die Untersuchung zahlreicher Proben. Marian van der Marel danke ich für die Hilfestellung bei Laboruntersuchungen und vor allem für ihre Bemühungen um mein Englisch. Meiner ehemaligen Kollegin Nancy Caspari und meinen jetzigen Kollegen und Kolleginnen Henner Neuhaus, Verena Schroers, Patricia Lowles und Uta Reimers danke ich für fachlichen und praktischen Rat und bis zuletzt nicht ermüdende Geduld auf dem Gebiet der EDV. Patric Charge danke ich für die Versorgung meiner Pferde an langen Labortagen und für die seelische Unterstützung. Bei allen Freunden, besonders Nina Ahner, Nadine Bauermann, Arne Jung, Claudia Krezdorn und Carolin Hobler bedanke ich mich für die willkommene Ablenkung von der Arbeit. Lutz Bierwisch danke ich für die Unterstützung in der Finalphase. Bei meinen Eltern möchte ich mich dafür bedanken, dass sie mir das Studium und die Promotion ermöglicht haben und nie aufgehört haben zu glauben, dass ich diese Dissertation zum Abschluß bringen werde. 131
