Aktive Immunisierung mit GD2-Peptidmimotopen und anti

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Aus der Klinik und Poliklinik für Kinder- und Jugendmedizin
(Gf. Direktor Univ.- Prof. Dr. med. Holger N. Lode)
der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Aktive Immunisierung mit GD2-Peptidmimotopen und anti-Idiotypen zur
Immuntherapie beim Neuroblastom
Inaugural - Dissertation
zur
Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Medizin
(Dr. med.)
der
Universitätsmedizin
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald
vorgelegt von:
Matthias Bleeke
geb. am: 19.11.1980
in: Bremen
Dekan:
Prof. Dr. med. dent. Reiner Biffar
1. Gutachter:
Prof. Dr. med. Holger N. Lode
2. Gutachter:
PD Dr. rer. nat. Alexander Schramm, Univ.-Klinikum Essen
Ort, Raum:
Seminarraum der Kinderklinik, P01.37
Tag der Disputation: 23. Oktober 2013
ii
Inhaltsverzeichnis
Vorwort .................................................................................................................................... iv 1. Einleitung.............................................................................................................................. 1 1.1. Das Neuroblastom ......................................................................................................... 1 1.2. Das Disialogangliosid GD2 ............................................................................................ 2 1.3. GD2-gerichtete Immuntherapie beim Neuroblastom ..................................................... 3 2. Methoden ............................................................................................................................. 9 2.1. Generierung und Charakterisierung von GD2-Peptidmimotopen .................................. 9 2.2. Optimierung der GD2-Peptidmimotope ......................................................................... 9 2.3. Herstellung von DNA- und Peptidimpfstoffen .............................................................. 10 2.4. Testung der Mimotop-Vakzine in vivo ......................................................................... 10 2.5. Generierung und Charakterisierung eines neues GD2-Anti-Idiotypen ........................ 12 2.6. Impfung mit Ganglidiomab im Tiermodell .................................................................... 13 3. Ergebnisse ......................................................................................................................... 14 3.1. Charakterisierung von GD2-Peptidmimotopen ............................................................. 14 3.2. Affinitätssteigerung durch optimierte Peptidmimotope ................................................ 15 3.3. Nachweis der Wirksamkeit von Peptidmimotop-Vakzinen in vivo ............................... 15 3.4. Generierung und Charakterisierung von Ganglidiomab .............................................. 16 3.5. Induktion einer GD2-spezifischen Immunantwort durch Ganglidiomab ....................... 17 4. Diskussion .......................................................................................................................... 17 4.1. Anti-Idiotypen als Impfstoff bei Tumorerkrankungen ................................................... 18 4.2. Weitere tumorassoziierte Antigene zur aktiven Immunisierung beim Neuroblastom .. 18 4.3. „Tumor Immunoediting“ als Hürde für eine erfolgreiche Immunisierung ..................... 20 4.4. Induktion von protektiver Immunität vs. Immuntoleranz .............................................. 22 4.5. Peptid- vs. DNA-basierte Impfstoffe ............................................................................ 23 4.6. Potentielle Nebenwirkungen einer aktiven GD2-gerichteten Impfung ......................... 24 5. Literatur .............................................................................................................................. 26 5.1. Eigene Publikationen ................................................................................................... 26 5.2. Ergänzende Literatur ................................................................................................... 26 6. Zusammenfassung ............................................................................................................. 35 7. Danksagung ....................................................................................................................... 36 8. Eidesstattliche Erklärung .................................................................................................... 37 9. Anteilserklärung.................................................................................................................. 38 10. Lebenslauf ........................................................................................................................ 39 11. Anhang ............................................................................................................................. 40 iii
Vorwort
Die vorliegende kumulative Dissertationsarbeit beschreibt präklinische Ansätze zur GD2gerichteten aktiven Immunisierung beim Neuroblastom durch Verwendung von MimotopImpfstoffen und anti-Idiotypen. Die eigenen Beiträge sind in drei publizierten Originalarbeiten
dokumentiert. Im Text sind Verweise auf diese Publikationen durch eckige Klammern und
Unterstreichung, z.B. [Bleeke, 2009], hervorgehoben. Zitate von Publikationen anderer
Autoren sind durch eckige Klammern ohne Unterstreichung, z.B. [Maris, 2007], markiert.
Diese Schrift stellt eine Zusammenfassung der geleisteten Arbeiten dar. Für die ausführliche
Darstellung insbesondere von Methoden und Ergebnissen wird auf die im Anhang
angefügten Originalarbeiten verwiesen.
iv
1. Einleitung
1.1. Das Neuroblastom
Das Neuroblastom ist mit einem Anteil von 7,2 % unter allen pädiatrischen Neoplasien der
häufigste solide, extrakranielle Tumor im Kindesalter [Deutsches Kinderkrebsregister, 2010].
Die Erkrankung manifestiert sich typischerweise im Säuglings- und Kleinkindalter mit einem
Inzidenzgipfel im 1. Lebensjahr. Die dem neuroektodermalen Gewebe der Neuralleiste
entstammenden Tumoren wachsen häufig ausgehend von den Nebennieren oder den
abdominalen
oder
thorakalen
Grenzstrangganglien,
können
jedoch
in
sämtlichen
sympathischen Geweben entstehen. Entsprechend vielfältig sind die Symptome der
Erkrankung: Sie reichen vom symptomlosen Zufallsbefund bei der Abdomenpalpation über
neurologische Ausfälle wie ein Horner-Syndrom bei zervikaler Lokalisation oder eine
Querschnittssymptomatik bei Myelonkompression durch nach intraspinal wachsende
Tumoren bis zu Knochen- und Gelenkschmerzen durch eine Knochenmarksmetastasierung.
Paraneoplastische Syndrome sind selten und können in Form von wässriger Diarrhoe durch
eine tumorbedingte Sekretion von Vasoaktivem Intestinalen Peptid (VIP) oder als
Opsoklonus-Myoklonus-Syndrom
mit
unwillkürlichen
Augenbewegungen,
Ataxie
und
Myoklonien auftreten. Aufgrund der unspezifischen klinischen Symptomatik erfolgt die
Diagnosestellung in mehr als 50 % der Fälle erst in fortgeschrittenen, metastasierten Stadien
[Maris, 2007].
Ein Screening im Säuglingsalter zur frühzeitigen Diagnose eines Neuroblastoms durch
Bestimmung der Katecholaminmetabolite Homovanillinsäure und Vanillinmandelsäure im
Urin, den wichtigsten laborchemischen Tumormarkern für das Neuroblastom, führte zwar zu
einem Anstieg der Inzidenz aller Neuroblastomerkrankungen, die Prognose insbesondere für
Hochrisiko-Patienten besserte sich jedoch nicht. Die Screening-Programme wurden daher
eingestellt [Schilling, 2002].
Der natürliche Verlauf der Erkrankung reicht vom rasch progredienten, in Knochenmark,
Knochen und Leber metastasierenden Tumor über Differenzierung zu weniger aggressiven
Entitäten wie dem Ganglioneuroblastom oder Ganglioneurom, bis zur spontanen Regression.
Einen Sonderstatus nehmen die in Haut, Leber und/oder Knochenmark metastasierten
Tumoren bei Säuglingen ein, welche eine hohe Tendenz zur spontanen Regression
aufweisen [Maris, 2007].
Die große Variabilität im klinischen Verlauf und die damit verbundene Gefahr einer Überbzw.
Untertherapie
differenzierter
des
Modelle
zur
einzelnen
Neuroblastompatienten
Risikostratifizierung.
Die
2009
führte
zur
Entwicklung
vorgestellte
International
Neuroblastoma Risk Group- (INRG-) Klassifikation berücksichtigt neben dem Ausmaß von
Primärtumor
und
Metastasierung,
histopathologischem
Grading
und
Befunden
der
bildgebenden Diagnostik (Image Defined Risk Factors, IDRFs) auch das Alter des Patienten
1
bei Diagnosestellung und molekularbiologische Veränderungen der Tumorzellen wie die
Amplifikation des proto-Onkogens n-myc, chromosomale Aberrationen wie Deletionen im
langen Arm des Chromosom 1 (del1q36) und die Ploidie der Tumorzellen [Cohn, 2009].
Abhängig vom individuellen Risiko des Patienten reicht die Behandlung von engmaschigen
klinischen und radiologischen Verlaufskontrollen ohne spezifische Therapie bei niedrigem
Risiko und hoher Regressionswahrscheinlichkeit über eine moderate Chemotherapie bei
intermediärem Risiko bis zur Hochrisiko-Therapie mit Tumorchirurgie, Polychemotherapie,
Radiotherapie,
myeloablativer
Radionuklidtherapie
Megatherapie
mit
mit
131
Jod-MIBG
anschließendem
(Metajodbenzylguanidin),
autologem
Stammzellrescue
und
Differenzierungstherapie mit 13-cis-Retinsäure [Matthay, 1999; Hero, 2008].
Obwohl die Gesamtüberlebensrate für alle Neuroblastompatienten durch Anpassung der
Therapieregime an das individuelle Risiko bei über 80 % liegt, ist die Prognose für
Hochrisiko-Patienten mit einer Überlebensrate von etwa 40 % noch immer schlecht
[Berthold,
2003;
Matthay,
2009].
Die
Entwicklung
neuer
Therapiemodalitäten
zur
Verbesserung der Prognose von Hochrisiko-Neuroblastompatienten ist daher eines der
bedeutsamsten Forschungsziele auf dem Gebiet der pädiatrischen Onkologie. Die GD2gerichtete Immuntherapie stellt dabei einen vielversprechenden Ansatz dar.
1.2. Das Disialogangliosid GD2
Ganglioside sind komplexe Glykosphingolipide, welche sich in gesundem Gewebe vor allem
im zentralen Nervensystem finden und dort bis zu 6 % aller Phospholipide ausmachen. Sie
bestehen
aus
einem
Ceramidgerüst,
einer
unterschiedlichen
Anzahl
an
Oligosaccharidresten, N-Acetylneuraminsäure (Sialinsäure) und langkettigen Fettsäuren.
Abhängig von der Anzahl der vorhandenen Sialinsäurereste werden Mono-, Di-, Tri- und
Quatrosialoganglioside unterschieden. Die Ganglioside sind Bestandteil der äußeren
Zellmembran, wobei die langkettigen Fettsäuren das Glykolipid in der Zellmembran
verankern während die Saccharid- und Sialinsäurereste in den Extrazellulärraum weisen.
Während
der
neuronalen
Entwicklung
lassen
sich
erhebliche
Veränderungen
im
Expressionsprofil der Ganglioside beobachten. So finden sich im embryonalen Gehirn wie
auch auf neuronalen Stammzellen vornehmlich einfache Ganglioside wie GM3, während in
späteren Entwicklungsphasen komplexe Ganglioside wie GM1 oder GD1b überwiegen [Yu,
2012]. Im Allgemeinen sind die Ganglioside beteiligt an interzellulärem Kontakt, Adhäsion
und Signaltransduktion [Cheresh, 1986; Allende, 2002], die biologische Funktion der
einzelnen Ganglioside ist jedoch bislang nicht vollständig bekannt. Eine wichtige Rolle
scheinen die Ganglioside jedoch beim Erhalt neuronaler Strukturen zu spielen. Im
Tierexperiment führt die Störung der Gangliosidbiosynthese durch knock-out spezifischer
Glykosyltransferasen
beispielsweise
zu
Myelinisierungsstörungen
und
axonaler
2
Degeneration sensorischer und motorischer Nerven bei fehlender GM2/GD2-Synthase
[Sheikh, 1999; Sugiura, 2005] oder funktionalen Veränderungen an der neuromuskulären
Synapse bei zusätzlichem Fehlen der GD3-Synthase [Zitman, 2008]. Es bleibt jedoch
fraglich, ob diese beobachteten Störungen durch das Fehlen der jeweiligen Ganglioside zu
erklären ist oder ob insbesondere die degenerativen Veränderungen Folge einer
unphysiologischen Anreicherung von Gangliosid-Vorstufen im Sinne einer Gangliosidose
sind.
Das Disialogangliosid GD2 wird in hohem Maße von Tumoren der Neuralleiste wie dem
Neuroblastom und dem Melanom sowie in geringerem Maße von Weichteilsarkomen und
dem kleinzelligen Lungenkarzinom exprimiert [Schulz, 1984]. In gesundem Gewebe findet
sich GD2 auf Oligodendrozyten und Myelinscheiden des zentralen Nervensystems sowie auf
peripheren sensorischen Nerven und Melanozyten [Svennerholm, 1994; Marconi, 2005].
GD2 wurde zudem als Oberflächenmarker für mesenchymale Stromazellen im Knochenmark
[Martinez,
2007]
und
Tumorstammzellen
des
Mamma-Karzinoms
[Battula,
2012]
beschrieben.
Im Rahmen der Tumorgenese fungieren Disialoganglioside wie GD2 als Rezeptor für
Proteine der Extrazellulärmatrix wie z.B. Fibronectin und Integrine und fördern so
Tumorwachstum und Metastasierung [Cheresh, 1986]. Zudem haben sie immunsuppressive
Wirkung auf Lymphozyten und antigenpräsentierende Zellen und helfen bei der tumor
immune evasion [Potapenko, 2007].
Die
bei
pädiatrischen
Patienten
nahezu
exklusive
Expression
von
GD2
als
tumorassoziiertem Antigen (TAA) auf Neuroblastomzellen macht GD2 nicht nur zu einem
wertvollen diagnostischen Marker, z.B. bei der Detektion von minimaler Resterkrankung
(minimal residual disease, MRD), sondern bildet zudem die Grundlage zur Entwicklung
spezifischer, GD2-gerichteter Therapieoptionen für Neuroblastompatienten.
1.3. GD2-gerichtete Immuntherapie beim Neuroblastom
Passive Immunisierung
„Passive Immunisierung“ beschreibt die Applikation präformierter, gegen tumorassoziierte
Antigene gerichtete immunologische Mediatoren wie monoklonale Antikörper (mAb) oder
adoptiv transferierte Effektorzellen.
Passive Immunisierung durch GD2-spezifische monoklonale Antikörper
Die passive Immunisierung mit monoklonalen Antikörpern ist bereits fester Bestandteil der
Therapie verschiedener Tumorentitäten. Zu den etablierten monoklonalen Antikörpern
gehören Trastuzumab (anti-Her2/neu) beim Mamma-Karzinom, Rituximab (anti-CD20) beim
B-Zell-Lymphom oder Cetuximab (anti-EGFR) beim kolorektalen Karzinom. Ihre Wirkung
3
entfalten die Antikörper durch direkte immunologisch vermittelte Zytotoxizität (Rituximab)
oder durch Interferenz mit für das Tumorwachstum wichtigen Signalwegen (Trastuzumab,
Cetuximab).
Seit Beschreibung von GD2 als TAA für das Neuroblastom wurden eine Reihe monoklonaler
Antikörper gegen das Disialogangliosid entwickelt und erfolgreich im Rahmen klinischer
Studien bei Neuroblastompatienten eingesetzt. 1992 berichteten Handgretinger et al. über
den Einsatz des GD2-spezifischen murinen (IgG2-)Antikörper 14G2a bei 9 Patienten mit
metastasiertem Neuroblastom im Rahmen einer Phase I-Studie [Handgretinger, 1992]. Zwar
zeigte ein Teil der Patienten ein Ansprechen auf die Immuntherapie im Sinne einer
Remission, jedoch bildeten alle 9 Patienten während der Therapie eine humorale
Immunantwort gegen das murine Immunglobulin (humane anti-Maus-IgG, HAMA). Durch den
Austausch des murinen gegen ein humanes Fc-Fragment unter Beibehaltung des murinen
Fab-Fragments wurde die weniger immunogene chimäre Variante ch14.18 entwickelt und in
klinischen Studien eingesetzt [Handgretinger, 1995; Yu, 1998]. Zwar zeigten Simon et al.
eine geringere Rezidivrate von Hochrisikoneuroblastom-Patienten nach einer ch14.18Immuntherapie im Anschluss an die Erstlinien-Therapie mit einer Gesamtüberlebensrate
nach 9 Jahren von 46±4 % mit Immuntherapie gegenüber 35±6 % ohne Immuntherapie
[Simon, 2011], allerdings trat die erhoffte deutliche Besserung der Prognose von HochrisikoPatienten zunächst nicht ein. Dies änderte sich nach Optimierung der Therapieprotokolle
durch adjuvante Gabe von immunstimulatorischen Zytokinen.
Die Wirkung des Antikörpers auf GD2-exprimierende Tumorzellen beruht überwiegend auf
einer antikörperabhängigen zellulären Zytotoxizität (antibody dependent cellular cytotoxicity,
ADCC). Im Neuroblastom-Mausmodell konnte durch Depletion von natürlichen Killerzellen
die therapeutische Wirkung einer ch14.18-Therapie vollständig aufgehoben werden, was die
Bedeutung dieser Zellpopulation für die Effektivität der Antikörpertherapie unterstreicht
[Zeng, 2005]. Eine gezielte Expansion der ADCC-Effektorzellen konnte daher die
Wirksamkeit der ch14.18-Immuntherapie deutlich verbessern. Die Children’s Oncology
Group in den USA berichtete 2010 über eine randomisierte Studie mit HochrisikoNeuroblastompatienten, welche nach autologer Stammzelltransplantation entweder die
Standard-Konsolidierungstherapie mit 13-cis-Retinsäure oder zusätzlich eine Immuntherapie
mit ch14.18, GM-CSF (granulocyte macrophage colony-stimulating factor) und Interleukin-2
(IL-2) erhielten. Eine Interimsanalyse ergab ein ereignisfreies Überleben 2 Jahre nach
Therapieende von 46±5 % für Patienten ohne gegenüber 66±5 % für Patienten mit
Immuntherapie. Die Randomisierung wurde daraufhin vorzeitig beendet [Yu, 2010].
Ein weiterer GD2-spezifischer Antikörper, der murine Antikörper 3F8, zeigte ebenfalls in
Kombination mit GM-CSF und 13-cis-Retinsäure einen ähnlichen Überlebensvorteil der auf
diese Weise therapierten Neuroblastompatienten [Cheung, 2012].
4
Die wesentlichen Nebenwirkungen der Immuntherapie mit GD2-Antikörpern und Zytokinen
sind neuropathische Schmerzen durch eine Interaktion des Antikörpers mit GD2 auf
sensorischen freien Nervenendigungen und ein Kapillarlecksyndrom mit Ausbildung von
Ödemen und arterieller Hypotension im Rahmen der vor allem durch die Zytokingabe
induzierten systemischen Inflammationsreaktion. Aktuelle Studien verfolgen daher das Ziel,
die passive GD2-gerichtete Immuntherapie effektiver und verträglicher zu gestalten. In einer
kürzlich an der Klinik für Kinder– und Jugendmedizin der Universitätsmedizin Greifswald
begonnenen multizentrischen Studie wird die Gabe von ch14.18 als Dauer- statt
Bolusinfusion in Kombination mit subkutaner statt intravenöser Gabe von Interleukin-2
untersucht. Ziel ist, ein Therapieprotokoll zu etablieren, welches bei vergleichbarer
Pharmakokinetik und Immunmodulation ein geringeres Nebenwirkungsprofil insbesondere
hinsichtlich der bei Bolusinfusion von ch14.18 regelhaft auftretenden und morphinpflichtigen
neuropathischen Schmerzen aufweist (EU Clinical Trials Register, EudraCT-Nummer 2009018077-31). Weitere Ansätze bestehen in der Modifizierung des Antikörpers wie der
Humanisierung des chimären Antikörpers ch14.18 (hu14.18). Als „Immunzytokin“ im Verbund
mit Interleukin-2 (hu14.18-IL2) ist eine gezielte Anreichung dieses Zytokins im Tumormilieu
und die Reduktion systemischer IL-2 bezogener Nebenwirkungen möglich. Auch hu14.18-IL2
wurde bereits im Rahmen klinischer Studien bei Neuroblastompatienten eingesetzt
[Shusterman, 2010].
Passive Immunisierung durch adoptiven Zelltransfer
Der adoptive Transfer GD2-spezifischer T-Zellen stellt einen weiteren Ansatz zur passiven
Immunisierung beim fortgeschrittenen Neuroblastom dar. Autologe T-Zellen können ex vivo
durch genetisches Engineering zur Expression GD2-spezifischer chimärer Antigenrezeptoren
(chimeric antigen receptors, CARs) modifiziert werden. Diese bestehen aus einer dem
ch14.18 entsprechenden, nach extrazellulär weisenden antigenbindenen Domäne sowie der
intrazellulären ζ-Kette des T-Zell-Rezeptors und verbinden so die Spezifität des Antikörpers
mit der Zytotoxizität einer T-Zelle [Rossig, 2001]. Die Selektion EBV-spezifischer T-Zellen
ermöglicht dabei die Nutzung einer vorbestehenden EBV-Infektion als für die Zellproliferation
notwendiges endogenes Ko-Stimulans, erreicht eine verlängerte Persistenz der modifizierten
Lymphozyten in vivo [Pule, 2008] und führt zu einem längeren Überleben der so behandelten
Patienten [Louis, 2011].
Während die passive Immunisierung mit GD2-gerichteten monoklonalen Antikörpern als
etablierter Bestandteil der Therapie fortgeschrittener Neuroblastomerkrankungen betrachtet
werden kann, beschränken sich die Ansätze zum adoptiven Zelltransfer noch größtenteils
auf präklinische Studien und ein breiter Einsatz dieser Therapien findet, auch aufgrund des
hierzu erforderlichen erheblichen technischen Aufwands, aktuell noch nicht statt.
5
Aktive Immunisierung
Ziel der aktiven Immunisierung ist die Erzeugung einer gegen tumorassoziierte Antigene
gerichteten humoralen und/oder zellulären Immunität. Die aktive Immunisierung weist
gegenüber der passiven Immunisierung, z.B. mit monoklonalen Antikörpern, einige Vorteile
auf.
Hierzu
zählen
antigenspezifischer
die
Erzeugung
Memory-B- und
einer
dauerhaften
T-Zellen, ein
Immunität
geringeres
durch
Risiko
Induktion
der Induktion
neutralisierender Antikörper, das Ausbleiben akuter antikörperbezogener Nebenwirkungen
durch hohe Spitzenspiegel (wie das Auftreten von Schmerzen während der Bolusinfusion
von ch14.18) sowie schließlich geringere Therapiekosten. Dagegen steht das Risiko der
Erzeugung von Autoimmunität durch eine Impfung gegen die in der Regel körpereigenen
tumorassoziierten Antigene.
Verschiedene Ansätze zur aktiven Immunisierung beim Neuroblastom erwiesen sich im
Rahmen
klinischer
Studien
bereits
als
wirksam
bei
der
Induktion
einer
neuroblastomspezifischen Immunität. Die Immunisierungen können spezifisch für ein
bestimmtes Antigen, z.B. GD2, erfolgen oder eine Mischung aus verschiedenen
Tumorantigenen enthalten. Zum Letzteren zählt die ex vivo-Stimulation dendritischer Zellen
und deren Beladung mit Tumorzelllysat [Chang, 2002] oder die Modifikation von Tumorzellen
zur Expression lymphotaktisch wirkender Zytokine wie IL-2 [Russell, 2008]. Zu den GD2spezifischen
Vakzinierungen
gehören
die
Impfung
mit
Peptidmimotopen
und
die
Immunisierung mit anti-Idiotypen.
Aktive Immunisierung durch GD2-Peptidmimotope
Als Glykolipid gehört GD2 zu den T-Zell-unabhängigen Antigenen [Mond, 1995] und seine
immunologische Verarbeitung unterliegt nicht der proteasomalen Degradation und MHC(major histocompatibility complex) gebundener Antigenpräsentation. Immunisierungen von
Melanom-Patienten mit dem Glykolipid GD2 im Verbund mit keyhole limpet hemocyanin
(KLH) und dem Saponin QS-21 als Adjuvans erbrachten ein nur mäßiges humorales
Ansprechen mit Bildung von anti-GD2-IgM bzw. –IgG bei lediglich 45 % der geimpften
Patienten [Chapman, 2000]. Zudem ist die Herstellung bzw. Aufreinigung von Glykolipiden
sehr aufwendig und kostenintensiv.
Mimotope sind Peptidstrukturen, welche eine immunologische Ähnlichkeit (molecular
mimikry) mit einem Nicht-Peptidantigen haben und über die Bildung kreuzreaktiver
Antikörper eine Immunität gegen das Nicht-Peptidantigen erzeugen. Im Gegensatz zu
Glykolipidantigenen unterliegen sie einer effektiveren immunologischen Prozessierung mit
MHC-gebundener Präsentation und Aktivierung kostimulatorischer Signale über Rezeptoren
wie CD40 oder Zytokine (Abb. 1). Die Verwendung von Peptidmimotopen als SurrogatAntigen ist somit ein eleganter Weg, die geringe Immunogenität von Glykolipid-Antigenen zu
6
umgehen und eine wirksame Vakzinierung zu erzielen. Dies konnte in präklinischen Studien
bereits für mehrere Glykolipidantigene, wie z.B. das mit dem Mamma-Karzinom assoziierte
Lewis Y [Kieber-Emmons, 1999], das N-Acetylglucosamin (GlcNAc) [Monzavi-Karbassi,
2004] und das High-Molecular-Weight Melanoma-Associated-Antigen (HMW-MAA) [Riemer,
2005] gezeigt werden.
Für das Disialogangliosid GD2 wurden bereits Peptidmimotope durch Screening von Dekabzw.
15mer-Peptide
exprimierenden
Phagenbibliotheken
mit
anti-GD2-Antikörpern
identifiziert [Förster-Waldl, 2004; Bolesta, 2005] und erwiesen sich als wirksam bei der
Induktion GD2-spezifischer Antikörper [Riemer, 2006, Bolesta 2005].
Mimotop
BCR
CD 40L CD 40
B-Lymphozyt
TCR MHC-II
CD 4
T-Lymphozyt
IL-4
Abb. 1: T-Zellabhängige Aktivierung von B-Zellen durch Peptidmimotope.
Im Gegensatz zu Glykolipidantigenen werden Peptidantigene nach Bindung an spezifische BZell-Rezeptoren (BCR) durch die B-Zelle prozessiert und MHC-II-gebunden präsentiert. Die
Bindung spezifischer T-Zellrezeptoren (TCR) an den Mimotop-MHC-II-Komplex und die
Bereitstellung kostimulatorischer Signale wie die Bindung von CD40-Ligand (CD40L) an CD40
oder die Sekretion von Zytokinen, z.B. Interleukin-4 (IL-4), bewirkt die effiziente Aktivierung der
B-Zelle und Differenzierung in antikörpersezernierende Plasmazellen und Gedächtnis-B-Zellen.
Aktive Immunisierung durch anti-Idiotypen
Der dänische Mediziner Niels Kaj Jerne, der für seine Arbeiten zu Aufbau und Steuerung des
Immunsystems 1984 den Nobelpreis für Medizin erhielt, vermutete bereits in den 1970er
Jahren in seiner „Netzwerktheorie des Immunsystems“, dass die antigenbindende variable
Region eines Antikörpers (Ab’1) als Epitop zur Bildung eines gegen diese antigenbindende
Region gerichteten anti-Idiotypen-Antikörpers (Ab’2) dienen kann. Das Paratop des antiIdiotypen bzw. Ab’2 besitzt also eine immunologische „Ähnlichkeit“ mit dem nominalen
Antigen und kann wiederum die Bildung eines anti-anti-Idiotypen-Antikörpers (Ab’3)
induzieren. Dieser weist die gleiche Antigenspezifität wie Ab’1 auf [Jerne, 1974]. Der Ab’2
7
wirkt also wie ein endogenes Vakzin und führt zur Induktion einer entsprechenden
humoralen Immunität (Abb. 2).
Bei Hochrisiko-Neuroblastompatienten, die mit dem murinen GD2-spezifischen Antikörper
3F8 behandelt wurden, konnte in einem Teil der Fälle die Induktion von anti-Idiotypen und
auch GD2-spezifischem Ab’3 nachgewiesen werden. Interessanterweise war die Entstehung
von anti-Idiotypen und Ab’3 mit einem signifikant besseren Langzeit-Überleben der
behandelten Patienten assoziiert, während die Bildung von humanen anti-Maus-Antikörpern
(HAMA) ohne Eigenschaften von anti-Idiotypen keinen Einfluss auf das Überleben der
Patienten hatte [Cheung, 2000].
Abb. 2: Theorie des anti-Idiotypen-Netzwerks am Beispiel von GD2-anti-Idiotypen.
Die Immunisierung mit dem neuroblastomassoziierten Antigen GD2 führt zur Ausbildung einer
humoralen Immunität durch Induktion GD2-spezifischer Antikörper (Ab‘1). Die variable Region (VR)
des GD2-Antikörpers dient als Epitop zur Bildung von anti-Idiotypen (Ab‘2). Diese beinhalten in ihrer
variablen Region ein internes Abbild der GD2-bindenden variablen Region des Ab‘1. Eine
Immunisierung gegen die variable Region des anti-Idiotypen erzeugt wiederum anti-anti-Idiotypen
(Ab‘3), welche wie Ab‘1 GD2-spezifisch sind.
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Charakterisierung sowie Optimierung von GD2Peptidmimotopen sowie die Generierung eines neuen GD2-anti-Idiotypen zur aktiven
Immuntherapie des Neuroblastoms.
8
2. Methoden
2.1. Generierung und Charakterisierung von GD2-Peptidmimotopen
Die Identifizierung geeigneter GD2-Peptidmimitope erfolgte in Kooperation mit der
Arbeitsgruppe um Frau Prof. Jensen-Jarolim in Wien. Hierfür wurde eine auf dem
filamentösen
Phagen
M13
basierende,
zirkuläre
Dekapeptide
exprimierende
Phagenbibliothek [Mazzucchelli, 1999] eingesetzt, die durch Screening mit dem GD2spezifischen Antikörper ch14.18 auf die Expression von Peptiden mit GD2-Mimikry geprüft
wurde. Nach Isolierung und Sequenzierung positiv getesteter Klone konnten 13 Peptide
identifiziert werden, die den GD2-Antikörper ch14.18 binden [Förster-Waldl, 2005].
Zwei dieser Peptide mit hoher Spezifität und guter GD2-Mimikry wurden zur weiteren
Charakterisierung ausgewählt: Das Peptid „MD“ (Aminosäuresequenz c-DGGWLSKGSW-c)
und das Peptid „MA“ (Aminosäuresequenz c-GRLKMVPDLE-c). Über die endständigen
Cysteinreste dieser Peptide erfolgt die Ausbildung von Disulfidbrücken, um eine zirkuläre
Tertiärstruktur der Peptide zu erhalten. Zur Beurteilung der Bindungsstärke zwischen den
Mimotopen
und
GD2-spezifischen
Antikörpern
wurden
anschließend
die
Dissoziationskonstanten (KD) bestimmt. Die KD zwischen löslichem Liganden (ch14.18,
Konzentration 90 µM bis 1,4 µM) und immobilisiertem Rezeptor (Peptide MD bzw. MA)
wurde nach dem Prinzip der Oberflächenplasmonresonanz (SPR) im System BiacoreX
(BiaCore, Uppsala, Schweden) nach Standardprotokoll durchgeführt. Als Referenz diente ein
nicht ch14.18-bindendes Peptid (Aminosäuresequenz SATPWDLKTSL). Die Auswertung
erfolgte nach der Equilibrium-Methode in der Software BiaEvaluation 3.0 [Fest, 2006; Bleeke,
2009].
Zusätzlich wurde die Bindung zwischen ch14.18 und MA bzw. MD im Computermodell
analysiert. Nach dreidimensionaler Modellierung der variablen Domäne von ch14.18 anhand
passender „Schablonen“-Strukturen aus der Protein Data Base (PDB) (Struktur 1f3d für die
variable schwere Kette und Struktur 1jgu für die variable leichte Kette) [Berman, 2000] sowie
Strukturen
aus
der
Loops-in-Proteins
(LIP)-Datenbank
[Michalsky,
2003]
wurden
computergestützte Docking-Versuche mit Hilfe des Programms GRAMM [Tovigrechko, 2005]
mit Modellen der Mimotope MA und MD durchgeführt. Die Bindungsstärke wurde anhand der
berechneten freien Bindungsenergie zwischen Mimotop und ch14.18 bestimmt [Fest, 2006].
2.2. Optimierung der GD2-Peptidmimotope
Zur Verbesserung der ch14.18-Affinität von MA und MD wurden beide Peptidsequenzen
einer gezielten Mutationsanalyse unterzogen. Hierzu wurde jede einzelne Aminosäure der
Peptidsequenzen gegen jede der 19 übrigen natürlich vorkommenden Aminosäuren
ausgetauscht. Die entsprechenden Peptidarrays wurden computerunterstützt generiert und
mit
Hilfe
eines
semiautomatischen
Pipettierroboters
unter
Verwendung
von
9
Fluoromethoxycarbonyl (fmoc)-geschützen Aminosäureestern auf eine mit β-Alanin als Basis
der Peptidsynthese beschichteten Zellulosemembran synthetisiert [Wenschuh, 2000]. Nach
Abschluss der Synthese wurde die Bindung von ch14.18 an die einzelnen Peptid-Spots
überprüft und die Mutationsanalyse mit den Peptiden mit der besten ch14.18-Bindung
wiederholt. Nach Austausch von zwei Aminosäuren wurden schließlich zehn neu
entstandene Peptide einer Affinitätsanalyse durch Bestimmung der KD im BiaCore-Assay
unterzogen. Das Peptid mit der geringsten Dissoziationskonstante und damit höchsten
Affinität zu ch14.18 (Peptid „C3“) wurde zur Erstellung einer Peptidvakzine ausgewählt
[Bleeke, 2009].
2.3. Herstellung von DNA- und Peptidimpfstoffen
Mittels überlappender PCR wurden DNA-Sequenzen, welche für die Primärstruktur von MA
bzw. MD kodieren, hergestellt, sequenziert und in den Expressionsvektor pSecTag2A (pSA,
Fa. Invitrogen) kloniert. Der Vektor enthält zur Verbesserung der immunologischen
Verarbeitung des Translationsproduktes den sekretorischen Signalteil der murinen Ig-κ-Kette
sowie ein mit dem Mimotop durch einen flexiblen Glycin-Serin-Linker verbundenes T-ZellHelferepitop T1 des HIV1-gp120 als Stimulans zur Verbesserung der Bindung an MHC-1 und
MHC-2 [Fest, 2006].
Die Funktion der DNA-Vakzine wurde zunächst durch Nachweis der Proteinexpression nach
transienter Transfektion in Ovarienzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-1) und
Nachweis der im Expressionsvektor enthaltenen myc- und 6xhis-Sequenzen im Western-Blot
überprüft. Die GD2-Mimikry des exprimierten Proteins wurde nach Blot der Zelllysate auf
eine Nitrozellulosemembran durch Bindung des murinen anti-GD2-Antikörpers 14G2a
analysiert.
Zur oralen Applikation der Impfplasmide wurden diese durch Elektroporation in attenuierte
Salmonella typhimurium (SL7207) transformiert.
Die Peptidimpfstoffe wurden durch Konjugation der synthetisch hergestellten Mimotope MA,
MD und C3 an keyhole limpet hemocyanin (KLH) als immunogenes Trägermolekül konjugiert
und die Mimotop-KLH-Konjugate an Aluminiumhydroxid als Adjuvans adsorbiert [Fest, 2006;
Bleeke, 2009].
2.4. Testung der Mimotop-Vakzine in vivo
Die Tierversuche wurden im gut etablierten syngenen, GD2-exprimierenden NXS2Mausmodell [Lode, 1997] in A/J-Mäusen sowie nach den Vorgaben des Deutschen
Tierschutzgesetzes in der Tierexperimentellen Einrichtung der Charité – Universitätsmedizin
Berlin am Campus Virchow Klinikum, durchgeführt.
10
Die DNA-Vakzine wurden als insgesamt drei intraösophageale Gaben von 1 x 108 mit
Impfplasmid transformierten SL7207 im Abstand von 2 Wochen verabreicht. Nach oraler
Gabe gelangen die Bakterien über die Darmwand in Kontakt mit der großen immunologisch
aktiven Fläche des mucosa-assoziierten lymphatischen Gewebes (MALT), werden in den
Peyer’schen Plaques von antigenpräsentierenden Zellen (APC) aufgenommen und bewirken
durch die auf der Bakterienwand lokalisierten Lipopolysaccharide über den Toll-like Rezeptor
(TLR) 4 eine effiziente Aktivierung der APC. Die auxotrophen Salmonella typhimurium
SL7207 sind aufgrund einer Mutation des Gens für Aromatase (aroA) auf die exogene Zufuhr
von Paraaminobenzoesäure angewiesen, welche in Säugerorganismen nur in geringen
Mengen vorkommt. Aus diesem Grund sind die Bakterien nach Phagozytose nicht
replikationsfähig, sterben innerhalb der Phagosomen ab und setzen das Impfplasmid frei,
welches dann zur Transkription zur Verfügung steht [Darji, 1997] (Abb. 3).
Impfplasmid
Salmonella typhimurium
SL 7207
Phagosom
ER
Proteasom
B
A
Nukleus
MHC-II
Abb. 3: Orale DNA-Vakzinierung durch attenuierte Salmonella typhimurium.
Nach Invasion des Darmepithels werden die mit Impfplasmid transduzierten Salmonellen von
antigenpräsentierenden Zellen innerhalb der Peyer-Plaques phagozytiert und gehen innerhalb
der Phagosomen zugrunde. Das Impfplasmid wird in das Zytosol freigesetzt und innerhalb des
Nukleus transkribiert. Das im endoplasmatischen Retikulum (ER) synthetisierte Genprodukt
kann nach proteasomaler Prozessierung MHC-gebunden präsentiert (A) oder durch
entsprechende posttranslationale Modifikation, z.B. durch Expression sekretorischer Signale
wie Igκ-Kette, in den Extrazellulärraum sezerniert werden (B).
11
Die Peptid-KLH-Konjugate wurden, adsorbiert an Aluminiumhydroxid, ebenfalls dreimal in 2wöchigem Abstand subkutan oder intraperitoneal (jeweils 10µg Peptid-KLH-Konjugat pro
Injektion) injiziert. In einzelnen Versuchen wurde als zusätzlicher immunologischer Stimulus
zur Peptid-KLH-Injektion eine orale Gabe von 1 x 108 Salmonella typhimurium (SL7207),
welche mit dem (leeren) Expressionsvektor pSecTag2A transformiert waren, gegeben.
Vor der ersten Impfung sowie im Verlauf des Tierversuchs wurden mehrfach Serumproben
entnommen und im GD2-ELISA auf die Ausbildung GD2-gerichteter IgG-Antikörper
untersucht.
Die Immunisierungen wurden prophylaktisch durchgeführt. Zwei Wochen nach der letzten
Impfung
erfolgte
die
Applikation
von
syngenen,
GD2-exprimierenden
NXS2
Neuroblastomzellen, entweder als intravenöse Gabe von 1 x 105 NXS2 oder als subkutane
Gabe von 2 x 106 NXS2. Nach subkutaner Tumorzellapplikation wurde das Wachstum des
Primärtumors mittels Mikrokaliper-Messung verfolgt und die Tumoren 12-14 Tage nach
Implantation chirurgisch in Narkose entfernt. Im weiteren Verlauf wurden die Tiere auf
Anzeichen für das Vorliegen von Metastasen beobachtet. Zeigten sich Anzeichen für eine
metastasierte Tumorerkrankung (wie reduziertes Aktivitätsniveau, rauhes Fell oder durch die
rasierte Bauchhaut sichtbare Lebermetastasen), wurden die Tiere durch Asphyxie in einer
CO2-Atmosphäre getötet und das Ausmaß der abdominalen Metastasierung bestimmt.
Die Milzen der Tiere wurden entnommen und durchflusszytometrisch hinsichtlich der Anteile
an CD4- bzw. CD8-positiven T-Lymphozyten und die Ausbildung der pro- bzw.
antiinflammatorisch wirksamen Zytokine Tumornekrosefaktor (TNF)-α bzw. Interleukin-10
sowie durch ELISA auf die Bildung von Interferon-γ in Anwesenheit von bestrahlten NXS2Zellen untersucht. Die zytotoxische Aktivität von T- bzw. NK-Zellen wurde in einem
51
Chrom-
Freisetzungsassay an NXS2 sowie an murinen Lymphomzellen (YAC-1) mit hoher
Sensibilität für NK-Zell-vermittelte Lyse untersucht [Fest 2006; Bleeke, 2009].
2.5. Generierung und Charakterisierung eines neues GD2-anti-Idiotypen
Zur Generierung eines neuen GD2-anti-Idiotypen wurden Balb/c-Mäuse mit dem GD2Antikörper 14G2a immunisiert und auf die Ausbildung einer gegen 14G2a gerichteten
humoralen Immunantwort getestet. Zur Erstellung einer anti-14G2a sezernierenden
Hybridomzelllinie wurden die Milzzellen von serologisch positiv getesteten Tieren mit
murinen Myelomzellen (SP2/0) fusioniert und über eine Limiting-Dilution-Klonierung weiter
selektioniert. Hierbei wurde durch Screening mit dem humanisiertem GD2-Antikörper
hu14.18 sichergestellt, dass das Screening auf Antikörper gegen die antigenbindende
Region (complementarity defining region, CDR) der auf 14G2a basierenden Antikörperfamilie
beschränkt ist.
12
Der so generierte Antikörper („Ganglidiomab“) wurde hinsichtlich typischer Eigenschaften
von anti-Idiotypen charakterisiert. Im ELISA wurde die Bindung von Ganglidiomab an die
GD2-Antikörper 14G2a, ch14.18 und hu14.18 sowie die Immunzytokine ch14.18-IL2 und
hu14.18-IL2 sowie in einem zweiten Schritt die kompetitive Hemmung der Bindung zwischen
dem Glykolipid GD2 und den o.g. GD2-Antikörpern nach Hinzugabe von Ganglidiomab
untersucht. Da alle verwendeten GD2-Antikörper trotz struktureller Unterschiede in Fab- und
Fc-Fragment die gleiche CDR aufweisen, konnte so die Spezifität von Ganglidiomab für die
GD2-spezifische
Bindungsstelle
als
wesentliche
Eigenschaft
eines
anti-Idiotypen
sichergestellt werden. Die weitere Charakterisierung bestand in der Bestimmung der KD
zwischen
Ganglidiomab
und
den
o.g.
GD2-Antikörpern
nach
dem
Prinzip
der
Oberflächenplasmonresonanz im System BiaCoreX100. Dies erfolgte auch im Vergleich zum
bereits etablierten murinen GD2-anti-Idiotypen 1A7.
Die weitere Charakterisierung erfolgte durch den Nachweis einer kompetitiven Inhibition der
Zytotoxizität einer humanen NK-Zelllinie (NK-92 scFv(ch14.18)-zeta), welche einen
chimären, auf ch14.18 basierenden NK-Rezeptor exprimiert, gegenüber der GD2exprimierenden Neuroblastomzelllinie LAN-1 im
51
Chrom-Freisetzungsassay sowie durch
molekulare Sequenzierung der variablen schweren und leichten Kette von Ganglidiomab
nach PCR-Amplifikation mittels degenerierter Primer [Lode, 2013].
2.6. Impfung mit Ganglidiomab im Tiermodell
Die Tierversuche erfolgten an A/J-Mäusen (jeweils 7 Tiere pro Versuchsgruppe), welche
entsprechend dem Deutschen Tierschutzgesetz in der Tierexperimentellen Einrichtung der
Universitätsmedizin Greifswald gehalten wurden, vorgenommen.
Nach
Adsorption
von
Ganglidiomab
an
Aluminiumhydroxid
(AlOH)
erfolgte
die
intraperitoneale Injektion von jeweils 100 µg Ganglidiomab-AlOH bzw. Ganglidiomab bzw.
AlOH insgesamt viermal in zweiwöchigem Abstand. Serum wurde vor der ersten und nach
jeder weiteren Immunisierung entnommen und auf die Bildung GD2-spezifischer IgGAntikörper im GD2-ELISA untersucht.
Die Bestimmung einer komplementabhängigen GD2-spezifischen Zytotoxizität (CDC) wurde
mit Serum geimpfter Mäuse und syngenen NXS2-Neuroblastomzellen im nichtradioaktiven
Calceinfreisetzungsassay
antikörperabhängigen
untersucht.
zellulären
Entsprechend
Zytotoxizität
erfolgte
(ADCC)
mit
die
den
Bestimmung
nach
einer
Versuchsende
entnommenen Milzzellen und hitzeinaktiviertem Serum der Versuchstiere [Lode, 2013].
13
3. Ergebnisse
3.1. Charakterisierung von GD2-Peptidmimotopen
Die Bestimmung der Dissoziationskonstanten KD ergab für die Bindung von MA an ch14.18
eine KD von 12,3 µM und für die Bindung von MD an ch14.18 eine KD von 5,3 µM. MD zeigte
sich damit als affiner gegenüber ch14.18 als MA.
Die Interaktion zwischen den GD2-Peptidmimotopen MA bzw. MD und der variablen Kette
des ch14.18 wurde zudem in computerassistierten Docking-Experimenten untersucht (Abb.
4). Für die Bindung von MA und MD wurde eine freie Bindungsenergie von -41,23 kJ/mol
bzw. -48,06 kJ/mol berechnet. Die berechnete freie Bindungsenergie bei der Bindung des
Glykolipids GD2 an ch14.18 lag bei -0,17 kJ/mol. Die Analyse der an der Bindung zwischen
Mimotop und Antikörper beteiligten Aminosäuren ergab für die Peptidmimotope eine
Übereinstimmung von acht potentiellen Bindungsstellen, welche sowohl auf der schweren als
auch auf der leichten Kette des Antikörpers lokalisiert sind. Im Gegensatz hierzu befinden
sich die mit GD2 interagierenden Bindungsstellen vorwiegend auf der leichten Kette des
Antikörpers.
Abb. 4: Computermodell der Bindung von Mimotopen an ch14.18
Anhand von Schablonenstrukturen wurde ein dreidimensionales Homologiemodell der variablen
Regionen des GD2-Antikörpers ch14.18 generiert (blau) und die Bindung der GD2-Peptidmimotope
MA (gelb) und MD (rot) untersucht. Mit freundlicher Unterstützung von Elke Michalsky und Ines
Jäger.
Die im Vergleich zu MA höhere Affinität von MD zu ch14.18 bestätigte sich in der
Proteinexpressionsanalyse
nach
Transfektion
des
für
MA
bzw.
MD
kodierenden
Impfplasmids (pSA-MA bzw. pSA-MD) in CHO-1-Zellen. Im Dot-Blot zeigte sich im Lysat von
14
pSA-MD transfizierten Zellen eine im Vergleich zu Lysat aus pSA-MA transfizierten Zellen
eine höhere Bindung von anti-GD2 Antikörpern.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Peptide MA und MD im Sinne einer
molekularen Mimikry den GD2-spezifischen Antikörper ch14.18 binden. Zudem zeigte sich
eine in allen Experimenten nachweisbare im Vergleich zu MA höhere Affinität von MD zu
ch14.18. Es konnte außerdem die erfolgreiche Transfektion und Translation der für MA und
MD kodierenden Impfplasmide pSA-MA und pSA-MD nachgewiesen werden [Fest, 2006].
3.2. Affinitätssteigerung durch optimierte Peptidmimotope
Zur Optimierung der GD2-Peptidmimtope erfolgte eine Aminosäuresubstitutionsanalyse mit
gezieltem Austausch jeder einzelnen Aminosäure der Mimotop-Dekapeptide gegen jede
andere der 19 weiteren natürlichen Aminosäuren und nachfolgender Testung des so
generierten Peptids auf Bindung von ch14.18. Die Peptide wurden in Form von Proteinarrays
auf eine Cellulosemembran synthetisiert. Nach Austausch einer Aminosäure in der MASequenz (Austausch von Methionin gegen Leucin an Position 5) zeigte sich eine um den
Faktor 23,5 höhere Bindung von ch14.18 durch das neue Peptid. Zur weiteren Verbesserung
der Antikörperbindung wurde dieses Peptid einer weiteren Aminosäuresubstitutionsanalyse
unterzogen. Nach Austausch von Lysin durch Histidin an Position 4 der Aminosäuresequenz
zeigte sich ein weiterer Anstieg der anti-GD2-Bindung um den Faktor 1,6. Die höhere
Affinität dieses zweifach veränderten Peptidmimotops (Peptidmimotop „C3“) zu ch14.18
konnte sowohl durch Bestimmung der Dissoziationskonstanten KD als auch nach Konjugation
an KLH im Dot-Blot nachgewiesen werden. Es ist also gelungen, durch gezielte Veränderung
der Aminosäuresequenz eines durch Phage-Display identifizierten Peptidmimotops dessen
Affinität zum Antikörper zu erhöhen.
3.3. Nachweis der Wirksamkeit von Peptidmimotop-Vakzinen in vivo
Die Peptidmimotope MA und MD wurden in Form von DNA- bzw. Peptidimpfstoffen als
prophylaktische Vakzierung im gut etablierten syngenen NXS2-Neuroblastom-Mausmodell
getestet. Während die mit DNA-Impfstoff behandelten Tiere eine deutliche Suppression der
spontanen Lebermetastasierung von subkutan applizierten Tumoren zeigten, führte die
intraperitoneale Impfung mit MA- bzw. MD-KLH-Konjugaten zunächst zu einer deutlich
stärkeren
Metastasierung.
Wir
führten
dies
auf
das
Fehlen
eines
suffizienten
immunologischen Ko-Stimulans, wie es bei der DNA-Vakzinierung in Form unmethylierter
CpG-Motive im Impfplasmid sowie Lipopolysaccharide (LPS) auf der Membran der als
Impfvehikel genutzten attenuierten Salmonella typhimurium appliziert wird, zurück [Krieg,
1998].
15
Durch Zugabe von mit dem pSA-Leervektor transformierten Salmonella typhimurium sowie
Änderung der Applikationsroute auf subkutane Injektion des Mimotop-KLH-Konjugats konnte
der protektive Effekt in Bezug auf die Ausbildung von Lebermetastasen wiederhergestellt
werden. Ebenso kam es nach diesem Impfschema zu einem messbaren Anstieg des GD2spezifischen IgG im Serum geimpfter Tiere.
Die Untersuchungen an den nach Versuchsende isolierten Milzzellen der geimpften Tiere
ergaben einen deutlichen Anstieg sowohl der CD4+ als auch der CD8+ T-Lymphozyten mit
erhöhter Produktion von TNFα und verminderter Produktion von IL-10. Dies legt eine eher
Th1-gewichtete zelluläre Immunreaktion auf den Impfstoff nahe. Zudem fanden wir nach
Mimotop-DNA-Impfung eine erhöhte Sekretion von IFN-γ sowie eine stärkere Lyse von
YAC1-Zellen durch die Milzzellen geimpfter Tiere als Hinweis auf eine Beteiligung von NKZellen an der zellulären Immunantwort [Fest, 2006].
Das optimierte GD2-Peptidmimotop C3 wurde als Peptid-KLH-Konjugat ebenfalls im
prophylaktischen Impfversuch getestet. Es zeigte sich ein im Vergleich zum ursprünglichen
Mimotop MA vermindertes Wachstum der subkutanen Lokaltumoren sowie eine geringere
Lebermetastasierung bei C3-KLH geimpften Tieren. Als Parameter des serologischen
Impfansprechens zeigte sich ein deutlich höherer Anstieg der GD2-spezifischen IgG nach
Impfung mit C3 im Vergleich zu MA mit einem Überwiegen von IgG-Subklasse IgG1 [Bleeke,
2009].
3.4. Generierung und Charakterisierung von Ganglidiomab
Die nach Impfung von Balb/c-Mäusen mit 14G2a isolierten und mit SP2/0-Zellen fusionierten
Milzzellen zeigten im ELISA eine Sekretion von Antiköpern, welche sowohl ch14.18 als auch
hu14.18 binden konnten. Im Rahmen einer Limiting-Dilution-Klonierung wurde nach
insgesamt 5 Klonierungsschritten eine Hybridomzelllinie („Klon 17“) zur Produktion von GD2anti-Idiotypen der IgG-Subklasse IgG1 („Ganglidiomab“) selektiert. Im ELISA zeigte sich eine
konzentrationsabhängige Bindung von Ganglidiomab an die GD2-Antikörper 14G2a,
ch14.18, hu14.18, ch14.18-IL2 und hu14.18-IL2, nicht jedoch an Rituximab- oder IgGIsotypkontrollen. Im kompetitiven ELISA konnte eine ebenfalls konzentrationsabhängige
Inhibition der Bindung von GD2 an die o.g. Antikörper durch Ganglidiomab nachgewiesen
werden. Dies wiederum im Gegensatz zu Rituximab- und Isotypkontrollen.
Entsprechend der erwarteten anti-Idiotypen-Eigenschaften von Ganglidiomab konnte
durchflusszytometrisch eine konzentrationsabhängige Bindung von Ganglidiomab an NK92scFv(ch14.18)-zeta, nicht jedoch an native NK92, gezeigt werden. Diese Bindung konnte
kompetitiv durch den GD2-anti-Idiotypen 1A7 teilweise, jedoch nicht vollständig inhibiert
werden, was auf unterschiedliche Bindungstellen der beiden anti-Idiotypen an die variablen
Regionen von ch14.18 hinweist. Außerdem konnten wir nachweisen, dass die Lyse von
16
GD2-positiven LAN-1 durch NK92-scFv(ch14.18)-zeta durch Zugabe von Ganglidiomab um
bis zu 80% reduziert werden konnte.
Die Amplifikation von framework- (FR) und complementarity determining regions (CDR) aus
der kodierenden DNA von Ganglidiomab-Hybridomzellen ergab im Vergleich zu den
entsprechenden Sequenzen des GD2-anti-Idiotypen 1A7 deutliche Unterschiede in DNAbzw. Proeinsequenz. Es handelt sich bei Ganglidiomab und 1A7 somit um zwei
unterschiedliche GD2-anti-Idiotypen.
Zusammenfassend konnte mit Ganglidiomab ein neuer monoklonaler Antikörper generiert
werden, welcher die typischen Eigenschaften eines GD2-anti-Idiotypen besitzt [Lode, 2013].
3.5. Induktion einer GD2-spezifischen Immunantwort durch Ganglidiomab
Ganglidiomab wurde als Surrogat-Antigen zur Induktion einer GD2-spezifischen humoralen
Immunantwort in A/J-Mäusen getestet. Nach intraperitonealer Injektion von Ganglidiomab mit
oder ohne Aluminiumhydroxid als Adjuvans zeigten die geimpften Tiere einen signifikanten
Anstieg GD2-spezifischer IgG im Verlauf. Die funktionale Aktivität dieser humoralen
Immunreaktion
konnte
als
komplementvermittelte
Zytotoxizität
(CDC)
sowie
antikörperabhängige Zytotoxizität (ADCC) an NXS2-Zellen nachgewiesen werden [Lode,
2013]. Mit Ganglidiomab steht daher ein neuer GD2-anti-Idiotyp zur aktiven GD2-gerichteten
Immunisierung zur Verfügung.
4. Diskussion
Die unverändert schlechte Prognose von Patienten mit fortgeschrittenem Neuroblastom
unterstreicht die Dringlichkeit, neue Therapieoptionen für diese Patienten zu entwickeln. Die
Immuntherapie stellt hier einen viel versprechenden Ansatz dar. Die passive Immunisierung
mit anti-GD2-Antikörpern kann mittlerweile als etablierte Therapieform für HochrisikoNeuroblastompatienten betrachtet werden, wobei jedoch einige Nachteile wie das
Ausbleiben eines dauerhaften immunologischen Schutzes und damit die Notwendigkeit
repetitiver Antikörpergaben verbunden mit akuten antikörperbezogenen Nebenwirkungen
und dem Risiko der Induktion einer gegen den Antikörper gerichteten humoralen
Immunantwort bestehen. Diese Nachteile könnten durch die Entwicklung einer wirksamen
und sicheren aktiven neuroblastomspezifischen Immunisierung überwunden werden. Die
dieser
Dissertation
zugrunde
liegenden
Arbeiten
beschreiben
die
Generierung,
Charakterisierung und durch gezielten Aminosäurenaustausch erreichte Optimierung von
GD2-Peptidmimotopen sowie deren erfolgreiche Anwendung als Vakzine in einem syngenen
GD2-exprimierenden Neuroblastom-Mausmodell. Darüberhinaus wird die Generierung und
Charakterisierung eines neuen GD2-anti-Idiotypen, Ganglidiomab, sowie dessen erfolgreiche
17
Anwendung als Impfung zur Induktion einer humoralen, GD2-gerichteten Immunität
beschrieben.
4.1. Anti-Idiotypen als Impfstoff bei Tumorerkrankungen
Die Generierung und Impfung von bzw. mit anti-Idiotypen gegen tumorassoziierte Antigene
wurde bereits für eine Vielzahl onkologischer Erkrankungen im Rahmen klinischer Studien
beschrieben. Beispiele sind das karzinoembryonale Antigen (CEA) beim kolorektalen
Karzinom [Chong, 2006] und CA125 beim Ovarialkarzinom [Grisham, 2011].
Auch für die Anwendung von GD2-anti-Idiotypen konnten bereits klinische Erfahrungen
gesammelt werden. Foon et al. publizierten 1998 eine Studie an 12 Melanompatienten,
welche mit dem GD2-anti-Idiotypen 1A7 und dem Saponin QS-21 als Adjvans subkutan
geimpft wurden. Alle geimpften Patienten bildeten Antikörper gegen 1A7, vornehmlich vom
Subtyp IgG1, welche eine Kreuzreaktion mit GD2 zeigten. Klinisch zeigte ein Patient eine
Komplettremission, sechs weitere eine stabile Erkrankung ohne Progredienz über einen
Beobachtungszeitraum zwischen 9 und 23 Monaten [Foon, 1998]. In einer Folgestudie
bildeten 40 von 47 Melanompatienten nach Impfung mit 1A7 und QS-21 GD2-reaktive
Antikörper, klinisch zeigte ein Patient eine Remission und zwölf Patienten eine stabile
Erkrankung über einen Beobachtungszeitraum von bis zu 37 Monaten [Foon, 2000]. Die
beobachteten Nebenwirkungen beschränkten sich auf kutane Lokalreaktionen an der
Impfstelle sowie Fieber. Leider wurde die Weiterentwicklung von 1A7 (Produktname
„TriGem“) als GD2-spezifischer Impfstoff seitdem nicht fortgeführt und der Antikörper ist aus
patentrechtlichen Gründen nicht für die freie Forschung verfügbar. Mit Ganglidiomab steht
nun ein neuer GD2-anti-Idiotyp zur Weiterführung dieses vielversprechenden Ansatzes
insbesondere für Neuroblastompatienten zur Verfügung.
4.2. Weitere tumorassoziierte Antigene zur aktiven Immunisierung beim Neuroblastom
Ansätze zur aktiven Immuntherapie des Neuroblastoms umfassen neben GD2 weitere
neuroblastomspezifische Antigene. Es sind bereits erfolgreiche Immunisierungen gegen
Tyrosinhydroxylase, das Schrittmacherenzym der Katecholaminbiosynthese, sowohl im
murinen [Huebener, 2008] als auch im xenogenen humanen Mausmodell [Huebener, 2009]
mit
Induktion
einer
starken
zellulären,
neuroblastomgerichteten
Immunität
ohne
Autoimmunität gelungen. Durch DNA-Vakzinierung gegen das inhibitor of apoptosis-Protein
Survivin
konnte
ebenfalls
eine
starke
zelluläre
Immunantwort
mit
supprimiertem
Tumorwachstum im syngenen A/J-Mausmodell erreicht werden [Fest, 2009]. In beiden Fällen
gelang die Immunisierung durch DNA-Impfung mit Minigenen, welche nur für einen kleinen
Teil des Gesamtproteins kodieren. Die Gefahr, durch die Impfung ein potentiell gefährliches
Onkogen zu transferieren, besteht somit nicht. Durch Epitop-Vorhersagealgorithmen wie
18
SYFPEITHI oder BIMAS ist es außerdem möglich, diese Abschnitte gezielt nach ihrer
Affinität zum MHC-1 auszuwählen und so eine optimale Präsentation des Antigens für CD8+
T-Lymphozyten zu ermöglichen [Rammensee, 1999].
Ein
weiteres
attraktives
tumorassoziiertes
Antigen
ist
das
häufig
in
Hochrisiko-
Neuroblastomen amplifizierte Onkogen n-myc. Eine erfolgreiche in vitro-Kultivierung n-mycspezifischer, zytotoxischer CD8+ T-Zellen durch Stimulation mit n-myc-Epitope wurde bereits
beschrieben [Sarkar, 2000; Himoudi, 2008]. Ein DNA-Impfstoff, welcher n-myc-Epitope
exprimiert, zeigte Wirksamkeit in einem n-myc überexprimierenden syngenen NeuroblastomMausmodell [Stermann, 2012].
Aktivierende Mutationen der Anaplastisches-Lymphom-Kinase ALK werden in ca. 8-10% der
Neuroblastome gefunden, vor allem bei den seltenen familiären Formen. Die Therapie von
ALK-positiven Neuroblastompatienten mit dem Kinaseinhibitor Crizotinib ist derzeit
Gegenstand einer klinischen Phase I/II-Studie [National Cancer Institute (NCI), 2012].
Aufgrund seiner in gesundem Gewebe nur geringen Expression ist es jedoch auch für
immuntherapeutische Ansätze durch passive [Carpenter, 2012] oder aktive Immunisierung
[Chiarle, 2008] interessant.
Das Preferentially Expressed Antigen in Melanoma (PRAME) gehört zu den Tumor-HodenAntigenen (cancer-testis antigens) und wird von einer Reihe maligner Erkrankungen wie dem
Melanom, Prostatakarzinom oder Nierenzellkarzinom sowie im gesundem Gewebe der
Hoden exprimiert. Beim Neuroblastom findet sich eine nahezu regelhafte Expression, die mit
einer schlechten Prognose assoziiert ist [Oberthuer, 2004]. Als tumorassoziiertes Antigen ist
es daher ebenfalls Kandidat für eine PRAME-gerichtete Immuntherapie. In einer Phase-IStudie wurde ein aus PRAME-Epitopen bestehender Minigen-DNA- bzw. Peptid-Impfstoff
bereits bei Patienten mit Melanom, Protatakarzinom und Nierenzellkarzinom eingesetzt und
bewirkte eine Induktion sowie anhaltende Persistenz PRAME-spezifischer T-Zellen [Weber,
2011].
Die Antigene GD2, Tyrosinhydroxylase, Survivin, n-myc, ALK und PRAME sind nur einige
Beispiele bekannter tumorassoziierter Antigene beim Neuroblastom. Die Vielfalt an
potentiellen Zielen einer aktiven Immunisierung für Neuroblastompatienten wird es in Zukunft
ermöglichen, Impfstoffe durch Kombination verschiedener Epitope auf das biologische bzw.
zytogenetische Profil der Tumoren einzelner Patienten abzustimmen und sp die Therapie
individueller zu gestalten. Dies vermindert nicht nur das Risiko einer immune escape des
Tumors durch reduzierte Expression einzelner Antigene sondern minimiert auch die mit der
Therapie assoziierten Risiken und Nebenwirkungen.
19
4.3. „Tumor Immunoediting“ als Hürde für eine erfolgreiche Immunisierung
Die zum Teil sehr guten Erfolge bei der aktiven Immunisierung mit tumorspezifischen
Antigenen in präklinischen (Maus-)Modellen lassen sich im Rahmen klinischer Studien oder
individueller Heilversuche nur selten erreichen. Der Grund hierfür liegt in der immune
evasion, dem „immunologischen Entkommen“, das viele maligne Tumoren auszeichnet.
Insbesondere das Neuroblastom interagiert auf vielfältige Weise mit dem Immunsystem und
die sehr unterschiedlichen klinischen Verlaufsformen können als Ausdruck dieser Interaktion
angesehen werden.
Entsprechend dem Konzept des „cancer immunoediting“ [Dunn, 2004] können in der
Interaktion zwischen Tumor und Immunsystem drei Phasen unterschieden werden: In der
ersten Phase („Elimination“) erkennt das Immunsystem entartete Zellen und zerstört diese.
Die häufig beobachtete spontane Regression auch metastasierter Neuroblastome wurde
dieser immunologischen Elimination zugeschrieben [Pritchard, 1994]. In der zweiten Phase
(„Äquilibirum“) befinden sich Tumorzellproliferation und Elimination im Gleichgewicht, die
Erkrankung ist klinisch stabil. Unter dem fortdauernden Selektionsdruck bilden sich jedoch im
weiteren Verlauf Tumorzellklone mit veränderter Antigenstruktur, reduzierter Immunogenität
oder immunsuppressiven Eigenschaften, was schließlich zur dritten Phase („Escape“) mit
ungehinderter Proliferation des Tumors und klinischem Fortschreiten der Erkrankung führt.
Neuroblastomzellen nutzen eine Reihe von immunologischen escape-Mechanismen. Durch
die typischerweise geringe oder fehlende Expression von MHC- 1 auf der Zelloberfläche ist
die
immunologische
Präsentation
von
Peptidantigenen
und
damit die
Aktivierung
zytotoxischer T-Zellen erheblich gestört [Wölfl, 2005]. Eine fehlende CD1d-Expression
verhindert zudem die Präsentation von Glykolipidantigenen an NKT-Zellen [Metelitsa, 2001].
Störungen
der
Antigenprozessierung
durch
verminderte
Aktivitäten
der
immunoproteasomalen low molecular weight proteins (LMP)-1 und -7 oder des transporter
associated with antigen processing (TAP)-1 und -2 verhindern zusätzliche eine effektive
Antigenpräsentation [Raffaghello, 2005]. Durch membrangebundene Expression von z.B.
Fas-Ligand [Shurin, 1998] und die Sekretion löslicher Faktoren wie sHLA-G, sMICA oder
Galektin-1 [Morandi, 2007; Raffaghello, 2004; Soldati, 2012] durch Neuroblastomzellen bzw.
tumorassoziierte „M2“-Makrophagen entsteht ein immunsuppressives Tumormikromilieu,
welches die Aktivierung von T-Lymphozyten, NK-Zellen und dendritischen Zellen hemmt
bzw. Apoptoseprogramme in diesen Zellen induziert. Diese nur beispielhaft genannten
Mechanismen
der
immune
evasion
erschweren
die
Entwicklung
einer
effektiven
Immuntherapie beim Neuroblastom.
GD2 ist ein attraktives Zielantigen für die Immuntherapie beim Neuroblastom, da seine
Expression
MHC-unabhängig
und
auch
unter
dem
Selektionsdruck
einer
GD2-
Immuntherapie sehr stabil erfolgt. Der Verlust der GD2-Expression wurde lediglich in
20
Einzelfällen beobachtet: In einer Serie von 62 Patienten mit Hochrisiko-Neuroblastom
zeigten die Tumoren nach einer Immuntherapie mit dem murinen GD2-Antikörper 3F8 bei 61
Patienten (98%) weiterhin eine stabile GD2-Expression. Interessanterweise wies der Tumor
bei dem einzigen Patienten mit GD2-Verlust histologisch einen veränderten Phänotyp im
Sinne eines phäochromozytomähnlichen Tumors ohne Überreste von Neuroblastomzellen
auf. Die Autoren vermuteten, dass durch die Immuntherapie die GD2-positiven Neuroblasten
eliminiert wurden, die Therapie jedoch auf die sich entwickelnden und in der Regel GD2negativen Phäochromozytomzellen keinen Einfluss hatte [Kramer, 1998]. In einer weiteren
Serie von insgesamt 191 Patienten mit GD2-positivem Neuroblastom konnte bei nur zwei
Patienten im Rezidiv nach vorangegangener Chemotherapie sowie einem bzw. zwei Zyklen
Immuntherapie mit dem GD2-Antikörper ch14.18 immunzytologisch keine GD2-Expression
mehr nachgewiesen werden [Schumacher-Kuckelkorn, 2005].
Der Verlust der GD2-Expression beim Neuroblastom ist also ein seltenes Ereignis und die
GD2-Expression lässt sich pharmakologisch sogar steigern. Das synthetisch hergestellte
Retinsäureanalogon Fenretinid erzeugt in Neuroblastomzellen durch Akkumulation toxischer
Ceramide oxidativen Stress, welcher die Zelle in die Apoptose führt. Eine Reihe von
Neuroblastomzelllinien weist jedoch im Rahmen einer Multidrug-Resistenz auch eine
Resistenz gegenüber Fenretinid durch enzymatischen Abbau der fenretinidinduzierten
Ceramide, u.a. zu Gangliosiden wie GD2, auf. Shibina et al. konnten zeigen, dass eine
Behandlung von fenretinidresistenten Neuroblastomzellen mit Fenretinid zu einer erhöhten
GD2-Expression führt, welche in vitro mit einer erhöhten GD2-antikörperabhängigen
zellulären sowie komplementvermittelten Zytotoxizität verbunden ist [Shibina, 2012].
Durch die Zusammensetzung des Impfstoffs, insbesondere durch den Einsatz potenter
Adjuvantien, kann ebenfalls ein günstiger Einfluss auf den Impferfolg genommen werden.
Aluminiumsalze wie Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat sind gängige Adjuvantien,
welche ihre Wirkung vor allem durch eine Aktivierung von antigenpräsentierenden Zellen
entfalten [Flach, 2011]. Sie werden in der medizinischen Praxis breit angewendet, unter
anderem in den Impfstoffen Infanrix hexa© (Fa. GlaxoSmithKline) und Prevenar 13© (Fa.
Pfizer), und gelten insbesondere bei der Anwendung an pädiatrischen Patienten als sicher.
Obwohl für präklinische Versuche vermeintlich potentere Adjuvantien wie z.B. Freund’sches
Adjuvans zu Verfügung stehen, sind diese für die Anwendung beim Menschen aufgrund ihrer
erheblichen
Toxizität
nicht
geeignet
bzw.
zugelassen.
Die
Verwendung
von
Aluminiumhydroxid als Adjuvans im Tierversuch erleichtert somit die Übertragbarkeit der
Ergebnisse auf die Anwendung beim Menschen.
21
4.4. Induktion von protektiver Immunität vs. Immuntoleranz
Ein interessantes Ergebnis unserer Vakzinierungsversuche war das starke Wachstum der
Tumoren nach intraperitonealer Peptidvakzinierung [Fest, 2006]. Es ist beschrieben, dass
eine Impfung mit Peptidantigenen sowohl eine protektive Immunität als auch eine
Immuntoleranz induzieren kann. Dies ist abhängig von Antigendosis, Applikationsweg und
Applikationsfrequenz sowie dem verwendetem Adjuvans. Aichele et al. konnten am Beispiel
einer Peptidimpfung gegen das Lymphozytäre-Choriomeningitis-Virus (LCMV) im C57BL/6Mausmodell nachweisen, dass die repetitive, intraperitoneale Injektion hoher Dosen des
Peptidimpfstoffs eine zeitlich begrenzte Anergie LCMV-spezifischer T-Zellen induzieren,
während die subkutane Gabe geringerer Dosen eine protektive Immunität erzeugt [Aichele,
1996]. Als Ursache dieses Phänomens wird vermutet, dass es nach rascher Anflutung von
Antigen im gesamten Organismus nach intraperitonealer Injektion zur praktisch zeitgleichen
Aktivierung aller antigenspezifischen CTL kommt. Durch das Fehlen kostimulatorischer
Signale, z.B. durch antigenpräsentierende Zellen, folgt eine klonale Deletion und
buchstäbliches „Ausbrennen“ dieser peripheren Zellpopulation, was eine vorübergehende
Immuntoleranz zur Folge hat. Demgegenüber erfolgt die Antigenfreisetzung aus subkutanen
Depots langsamer, was eine effektivere Immunkostimulation durch antigenpräsentierende
Zellen
ermöglicht.
Unterstützt
wird
diese
These
durch
das
Wiederkehren
der
antigenspezifischen CTL ca. sieben Wochen nach Antigeninjektion in euthymen Mäusen
[Aichele,
1996].
Diese
diametral
gegensätzlichen
Effekte
der
subkutanen
und
intraperitonealen Peptidinjektion sind jedoch nicht grundsätzlicher Natur. In anderen Arbeiten
bewirkte die subkutane Impfung geringer Dosen synthetischer Peptide ebenfalls eine
Immuntoleranz durch klonale Deletion tumorspezifischer CTL gegenüber einer Adenovirustransformierten Tumorzelllinie in C57BL/6-Mäusen [Toes, 1996]. Riemer et al. konnten
wiederum bei Balb/c-Mäusen durch intraperitoneale Impfung der GD2-Peptidmimotope MA
und MD eine stabile, GD2-gerichtete humorale Immunantwort erzeugen [Riemer, 2006],
Brämswig et al. berichteten über die erfolgreiche intraperitoneale Peptidvakzinierung mit
Mimotopen des karzinoembryonalen Antigens (CEA), ebenfalls in BALB/c-Mäusen
[Brämswig, 2007]. Diese Unterschiede bei der Vakzinierung mit Peptiden können zum Teil
durch die verwendeten unterschiedlichen immunkompetenten Mausstämme (A/J, C57BL/6,
Balb/c) erklärt werden. Interessanterweise konnten wir nach intraperitonealer Impfung mit
Ganglidiomab in A/J-Mäusen eine humorale GD2-spezifische Immunantwort nachweisen, so
dass auch die Art des applizierten Antigens einen Einfluss auf die Erzeugung einer
entsprechenden Immunantwort zu haben scheint. Eine Aussage über eine antiTumorwirkung der durch Ganglidiomab induzierten humoralen Immunität ließ sich anhand
dieser Versuche jedoch nicht ableiten, da aktuell keine Tumoren appliziert wurden.
22
Die unterschiedlichen Ergebnisse bei der aktiven Immunisierung in Mausmodellen
unterstreichen die Schwierigkeit bei der Übertragung von Ergebnissen präklinischer Studien
auf die Anwendung beim Menschen. Zudem können Unterschiede bei der Verimpfung
viraler, also immunologisch „fremder“ Antigene, bzw. tumorassoziierter, also „körpereigener“
Antigene, und Unterschiede in der Vakzinformulierung durch Verwendung unterschiedlicher
Adjuvantien die voneinander abweichenden Ergebnisse erklären. In unseren Versuchen
konnten wir nach Änderung der Applikationsroute für die Peptidmimotop-KLH-Konjugate von
intraperitoneal auf subkutan sowie Verwendung von oral appliziertem bakteriellen Antigen als
zusätzlichem
immunologisches
Stimulans
eine
protektive
GD2-gerichtete
Immunität
erzeugen.
4.5. Peptid- vs. DNA-basierte Impfstoffe
Die Impfung mit DNA-Impfstoffen bietet gegenüber der Peptid- oder Proteinvakzinierung
besondere Vorteile. DNA ist zum Beispiel sehr stabil und lässt sich unkompliziert
transportieren und lagern. Der größte Vorteil von DNA-basierten Vakzinen ist jedoch ihre
Vielseitigkeit. In Expressionsvektoren mit multiplen cloning sites lassen sich verschiedene
Antigene, welche z.B. dem Expressionsmuster individueller Tumoren entsprechen können,
oder zusätzliche immunologische Stimulantien, wie z.B. Gene für Interleukine oder CD40Ligand, exprimieren. Die Applikationswege für DNA-Impfstoffe sind ebenso vielseitig. Die
intradermale oder intramuskuläre Injektion „nackter“ DNA stellt hier den einfachsten Weg
dar, erfordert jedoch erheblich Mengen des Impfplasmids. Wirksam ist auch die transdermale
Applikation von an Goldpartikel gebundener DNA mittels einer „gene gun“, was die Impfung
jedoch aufwendig und teuer macht. Die Verwendung attenuierter Salmonella typhimurium als
Vehikel für DNA-Impfstoffe bietet neben dem einfachen oralen Applikationsweg den Vorteil
einer
effizienten
Bakterienoberfläche
immunologischen
aktivieren
über
Ko-Stimulation.
Bindung
an
toll
Lipopolysaccharide
like-Rezeptor
auf
(TLR)
4
der
die
antigenpräsentierende Zelle, durch die im Impfplasmid enthaltenen unmethylierten CpGInseln erfolgt eine weitere immunologische Stimulation der APC über den TLR 9. Die so
aktivierte APC ist nun in der Lage, das translatierte Antigen MHC-gebunden zu präsentieren
und bietet zusätzlich die für eine effektive zelluläre Immunantwort erforderlichen
kostimulatorischen Signale. Im syngenen NXS2-Neuroblastommausmodell konnte gezeigt
werden, dass die Applikation von Survivin-gerichteten DNA-Vakzinen mittels attenuierter
Salmonella typhimurium (SL7207) der Applikation durch ex vivo kultivierte dendritische
Zellen oder gene gun im Hinblick auf die tumorsupprimierende Wirkung überlegen ist
[Berger, 2013].
Während attenuierte Salmonellen als Schluckimpfung gegen Typhus, z.B. als Salmonella
typhi Ty21a (Vivotif®, Fa. Berna Biotech), bereits für die Anwendung am Menschen
23
zugelassen sind [Engels, 1998; WHO, 2008], bestehen für die Anwendung als Impfvektor für
onkologische Patienten bislang keine Erfahrungen. Die weitere Erforschung dieser Art der
Applikation von DNA-Impfstoffen ist daher zur Entwicklung eines sicheren, auch für die
besonderen
Anforderungen
pädiatrisch-onkologischer
Patienten
geeigneten
Vektors
dringend erforderlich, um die Vorteile dieser Applikationsmethode nicht nur im präklinischen
sondern auch im klinischen Kontext nutzbar zu machen.
4.6. Potentielle Nebenwirkungen einer aktiven GD2-gerichteten Impfung
Die aktive Impfung mit dem Ziel, eine anhaltende Immunität gegen ein tumorassoziiertes und
damit „körpereigenes“ Antigen zu erzeugen, birgt auch das Risiko der Induktion von
Autoimmunität. Obwohl die Expression von GD2 in gesundem Gewebe nur sehr gering
ausgeprägt ist, findet sich GD2 zum Beispiel in der weißen Substanz des zentralen
Nervensystems. Zwar ist dieser Raum durch eine intakte Blut-Hirn-Schranke immunologisch
privilegiert, dennoch müssen bei der Entwicklung einer GD2-gerichteten Immuntherapie auch
potentielle autoimmunologische Wirkungen einkalkuliert werden. Typische Nebenwirkungen
der passiven Immunisierung mit GD2-Antikörpern wie das transiente Auftreten neurogener
Schmerzen, Sehstörungen oder EEG-Veränderungen sind direkter Ausdruck einer
Interaktion von Antikörper und GD2 auf Nerven des peripheren bzw. zentralen
Nervensystems.
Gangliosid-Antikörper lassen sich jedoch häufig auch im Serum gesunder Probanden
nachweisen. Mizutamari et al. fanden in einer Untersuchung in den Seren von 40 klinisch
gesunden Menschen in allen analysierten Proben IgM-Antikörper gegen GM1, in 85% bzw.
80% auch IgM-Antikörper gegen GD1b und GM2 [Mizutamari, 1994]. Die Entwicklung von
anti-GM1 kann Folge einer Infektion mit bestimmten Serotypen von Campylobacter jejuni,
zwischen
deren
oberflächengebundenen
Lipopolysacchariden
(LPS)
und
dem
Monosialogangliosid GM1 ein molekulares Mimikry besteht, sein [Prendergast, 1998].
Ebenfalls assoziiert mit einer Campylobacter jejuni-Infektion sowie dem Vorhandensein von
GM1-spezifischen
Antikörpern
ist
jedoch
auch
das
Auftreten
akut
verlaufender
inflammatorischer Neuropathien. Der Nachweis von Gangliosid-Antikörpern wie anti-GM1,
anti-GM3 oder anti-GQ1b ist ein etablierter Bestandteil in der Diagnostik verschiedener
neuroinflammatorischer Erkrankungen wie dem Guillan-Barré-Syndrom, dem Miller-FisherSyndrom
oder
der
multifokalen
motorischen
Neuropathie.
Zwar
gehören
disialogangliosidspezifische Antikörper nicht zu den typischen und in der Routinediagnostik
dieser Erkrankungen untersuchten Autoantikörper, jedoch ist auch der Nachweis von GD2spezifischen
Antikörpern
bei
Patienten
mit
neuroinflammatorischen
Erkrankungen
beschrieben. In einer Studie von Marconi et al. an 100 Patienten mit Multipler Sklerose (MS)
wurde bei 30% der Patienten eine serologische Aktivität von anti-GD2-IgM nachgewiesen.
24
Unter den ebenfalls untersuchten 106 gesunden bzw. nicht an MS erkrankten Patienten war
anti-GD2-IgM nur bei einem Patienten nachweisbar [Marconi, 2006]. Ob zwischen dem
Nachweis von GD2-Antikörpern und dem Auftreten einer MS jedoch ein ursächlicher
Zusammenhang besteht, ist umstritten. Die Bildung von gangliosidspezifischen Antikörpern
kann auch eine Folge des aufgrund der inflammatorischen Erkrankung ausgelösten
Gewebsschadens sein. Durch die Freisetzung von damage associated molecular patterns
(DAMPs) wie beispielsweise freigesetzter DNA oder Harnsäure aus geschädigten Zellen
erfolgt die Bereitsstellung von „Danger Signals“, welche die Aktivierung von T-Lymphozyten
und dendritischen Zellen unterstützen und so die immunologische Verarbeitung eigentlich
tolerogener Autoantigene fördern [Matzinger, 1994; Shi, 2003].
Tatsächlich wurden in den oben genannten klinischen Studien zur Induktion GD2spezifischer
Antikörper
durch
Impfung
mit
dem
GD2-anti-Idiotypen
1A7
lediglich
Lokalreaktionen und Fieber als Nebenwirkungen beobachtet. Klinische Anzeichen von
Autoimmunität ergaben sich auch nach einer Nachbeobachtungszeit von mehr als 3 Jahren
nicht. Die Auslösung von insbesondere das ZNS betreffenden Autoimmunphänomenen
erscheint also eher eine theoretische als eine praktische Gefahr der GD2-gerichteten
Vakzinierung zu sein.
Bis zu einem breiten klinischen Einsatz von neuroblastomspezifischen Impfstoffen ist jedoch
weiterhin
eine
intensive
Forschungsarbeit
zur
Optimierung
von
Antigenen,
Impfstoffzubereitung und –applikation sowie Untersuchungen zu unerwünschten Wirkungen
erforderlich. Die vorliegende Arbeit beschreibt daher nur einen Schritt auf dem Weg zu einer
effektiven und sicheren aktiven Immuntherapie des Neuroblastoms, des noch immer
tödlichsten Tumors im Kindesalters.
25
5. Literatur
5.1. Eigene Publikationen
Lode HN, Schmidt M, Seidel D, Huebener N, Brackrock D, Bleeke M, Reker D, Brandt S,
Mueller HP, Helm C, Siebert N. Vaccination with anti-idiotype antibody ganglidiomab
mediates a GD2 specific anti-neuroblastoma immune response. Cancer Immunol
Immunother. 2013; DOI: 10.1007/s00262-013-1413-y.
Bleeke M, Fest S, Huebener N, Landgraf C, Schraven B, Gaedicke G, Volkmer R, Lode HN.
Systematic amino acid substitutions improved efficiency of GD2-peptide mimotope
vaccination against neuroblastoma. Eur J Cancer. 2009; 45(16):2914-21.
Fest S, Huebener N, Bleeke M, Durmus T, Stermann A, Woehler A, Baykan B, Zenclussen
AC, Michalsky E, Jaeger IS, Preissner R, Hohn O, Weixler S, Gaedicke G, Lode HN.
Survivin minigene DNA vaccination is effective against neuroblastoma. Int J Cancer.
2009; 125(1):104-14.
Huebener N, Fest S, Hilt K, Schramm A, Eggert A, Durmus T, Woehler A, Stermann A,
Bleeke M, Baykan B, Weixler S, Gaedicke G, Lode HN. Xenogeneic immunization with
human tyrosine hydroxylase DNA vaccines suppresses growth of established
neuroblastoma. Mol Cancer Ther. 2009; 8(8):2392-401.
Lode HN, Fest S, Bleeke M, Gaedicke G, Volkmer R. GD2 peptide mimotopes for anticancer
vaccination. Europäisches Patentamt, EP1916257. Publikationsdatum 30.04.2008.
Fest S, Huebener N, Weixler, S, Bleeke M, Zeng Y, Strandsby A, Volkmer-Engert R,
Landgraf C, Gaedicke G, Riemer AB, Michalsky E, Jaeger IS, Preissner R, FörsterWaldl E, Jensen-Jarolim E, Lode HN. Characterization of GD2 peptide mimotope DNA
vaccines effective against sponateous neuroblastoma metastases. Cancer Res. 2006;
66(21):10567-75.
5.3. Ergänzende Literatur
Aichele P, Brduscha-Riem K, Zinkernagel RM, Hengartner H, Pircher H. T Cell Priming
Versus T Cell Tolerance by Synthetic Peptides. J Exp Med. 1995; 182(1):261-6.
Allende ML, Proia RL. Lubricating cell signaling pathways with gangliosides. Curr Opin Struct
Biol. 2002; 12(5):587-92.
Battula VL, Shi Y, Evans KW, Wang RY, Spaeth EL, Jacamo RO, Guerra R, Sahin AA,
Marini FC, Hortobagyi G, Mani SA, Andreef M. Ganglioside GD2 identifies breast
cancer stem cells and promotes tumorigenesis. J Clin Invest. 2012; 122(6):2066-78.
Berger E, Soldati R, Huebener N, Hohn O, Stermann A, Durmus T, Lobitz S, Zenclussen AC,
Christiansen H, Lode HN, Fest S. Salmonella SL7207 application is the most effective
DNA vaccine delivery method for successful tumor eradication in a murine model for
neuroblastoma. Cancer Lett. 2013; http://dx.doi.org/doi:10.1016/j.canlet.2012.12.026.
26
Berman HM, Bourne PE, Feng Z, Gilliland G, Bhat TN, Weissig H. The Protein Data Bank.
Nucleic Acids Res. 2000; 28(1):235-42.
Berthold F, Hero B, Kremens B, Handgretinger R, Henze G, Schilling FH, Schrappe M,
Simon T, Spix C. Long-term results and risk profiles of patients in five consecutive trials
(1979-1997) with stage 4 neuroblastoma over 1 year of age. Cancer Lett. 2003; 197(12):11-7.
Bolesta E, Kowalczyk A, Wierzbicki A, Rotkiewicz P, Bambach B, Tsao CY, Howacik I,
Kolinski A, Rokita H, Brecher M, Wang X, Ferrone S, Kozbor D. DNA vaccine
expressing the mimotope of GD2 ganglioside induces protective GD2 cross-reactive
antibody responses. Cancer Res. 2005; 65(8):3410-8.
Brämswig KH, Knittelfelder R, Gruber S, Untersmayr E, Riemer AB, Szalai K, Horvat R,
Kammerer R, Zimmermann W, Zielinski W, Zielinski CC, Scheiner O, Jensen-Jarolim E.
Immunization with mimotopes prevents growth of carcinoembryonic antigen positive
tumors in BALB/c mice. Clin Cancer Res. 2007; 13(21):6501-8.
Carpenter EL, Haglund EA, Mace EM, Deng D, Martinez D, Wood AC, Chow AK, Weiser DA,
Belcastro LT, Winter C, Bresler SC, Asgharzadeh S, Seeger RC, Zhao H, Guo R,
Christensen JG, Orange JS, Pawel BR, Lemmon MA, Mossé YP. Antibody targeting of
anaplastic lymphoma kinase induces cytoxicity of human neuroblastoma. Oncogene.
2012; doi: 10.1038/onc.2011.647.
Chang AE, Redman BG Whitfield JR, Nickoloff BJ, Braun TM, Lee PP, Geiger JD, Mulé JJ. A
phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.
Clin Cancer Res. 2002; 8(4):1021-32.
Chapman PB, Morrisey D, Panageas KS, Williams L, Lewis JJ, Israel RJ, Hamilton WB,
Livingston PO. Vaccination with a bivalent G(M2) and G(D2) ganglioside conjugate
vaccine: a trial comparing doses of G(D2)-keyhole limpet hemocyanin. Clin Cancer Res
2000; 6(12):4658-62.
Cheresh DA, Pierschbacher MD, Herzig MA, Mujoo K. Disialogangliosides GD2 and GD3 are
involved in the attachment of human melanoma and neuroblastoma cells to
extracellular matrix proteins. J Cell Biol 1986; 102(2):688-96.
Cheung NK, Guo HF, Heller G, Cheung IY. Induction of Ab3 and Ab3’ antibody was
associated with long-term survival after anti-G(D2) antibody therapy of stage 4
neuroblastoma. Clin Cancer Res. 2000; 6(7):2653-60.
Cheung NK, Cheung IY, Kushner BH, Ostrovnaya I, Chamberlain E, Kramer J, Modak S.
Murine Anti-GD2 Monoclonal Antibody 3F8 Combined With Granulocyte-Macrophage
Colony-Stimulating Factor and 13-Cis-Retinoic Acid in High-Risk Patients With Stage 4
Neuroblastoma in First Remission. J Clin Oncol. 2012; 30(26):3264-70.
27
Chiarle R, Martinengo C, Mastini C, Ambrogio C, D’Escamard V, Forni G, Inghirami G. The
anaplastic lymphoma kinase is an effective oncoantigen for lymphoma vaccination. Nat
Med. 2008; 14(6):676-80.
Chong G, Bhatnagar A, Cunningham D, Cosgriff TM, Harper PG, Steward W, Bridgewater J,
Moore M, Cassidy J, Coleman R, Coxon F, Redfern CH, Jones JJ, Hawkins R, Northfelt
D, Sreedharan S, Valone F, Carmichael J. Phase III trial of 5-fluorouracil and leucovorin
plus either 3H1 anti-idiotype monoclonal antibody or placebo in patients with advanced
colorectal cancer. Ann Oncol. 2006; 17(3):437-42.
Cohn SL, Pearson AD, London WB, Monclair T, Ambros PF, Brodeur GM, Faldum A, Hero B,
Iehara T, Machin D, Mosseri V, Simon T, Garaventa A, Castel V, Matthay KK; INRG
Task Force. The International Neuroblastoms Risk Group (INRG) classification system:
an INRG Task Force report. J Clin Oncol. 2009; 27(2):289-97.
Darji A, Guzmán CA, Gerstel B, Wachholz P, Timmis KN, Wehland J, Chakraborty T, Weiss
S. Oral somatic transgene vaccination using attenuated S. typhimurium. Cell. 1997;
91(6):765-75.
Deutsches Kinderkrebsregister. Jahresbericht 2010. Online-Zugriff am 01.11.2011.
http://www.kinderkrebsregister.de/extern/veroeffentlichungen/jahresberichte/aktuellerjahresbericht/index.html.
Dunn GP, Old LJ, Schreiber RD. The Three Es of Cancer Immunoediting. Ann Rev Immunol.
2004; 22:329-60.
Engels EA, Falagas ME, Lau J, Bennish ML. Typhoid fever vaccines: a meta-analysis of
studies on efficacy an toxicity. BMJ. 1998; 316(7125):110-6.
Flach TL, Ng G, Hari A, Desrosiers MD, Zhang P, Ward SM, Seamone ME, Vilaysane A,
Mucsi AD, Fong Y, Prenner E, Ling CC, Tschopp J, Muruve DA, Amrein MW, Shi Y.
Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity. Nat
Med. 2011; 17(4):479-87.
Förster-Waldl E, Riemer AB, Dehof AK, Neumann D, Brämswig K, Boltz-Nitulescu G,
Pehamberger H, Zielinski CC, Scheiner O, Pollak A, Lode HN, Jensen-Jarolim E.
Isolation and structural analysis of peptide mimotopes for the disialoganglioside GD2, a
neuroblastoma tumor antigen. Mol Immunol. 2005; 42(3):319-25.
Foon KA, Sen G, Hutchins L, Kashala OL, Baral R, Banerjee M, Chakraborty M, Garrison J,
Reisfeld RA, Bhattacharya-Chatterjee M. Antibody responses in melanoma patients
immunized with an anti-idiotype antibody mimicking disialoganglioside GD2. Clin Can
Res. 1998; 4(5):1117-24.
Foon KA, Lutzky J, Baral RN, Yannelli JR, Hutchins L, Teitelbaum A, Kashala OL, Das R,
Garrison J, Reisfeld RA, Bhattacharya-Chatterjee M. Clinical and immune responses in
28
advanced melanoma patients immunized with an anti-idiotype antibody mimicking
disialoganglioside GD2. J Clin Oncol. 2000; 18(2):376-84.
Grisham RN, Berek J, Pfisterer J, Sabbatini P. Abagovomab: an anti-idiotypiv CA-125
targeted immunotherpeutic agent for ovarian cancer. Immunotherapy. 2011; 3(2):15362.
Handgretinger R, Baader P, Dopfer R, Klingebiel T, Reuland P, Treuner J, Reisfeld RA,
Niethammer D. A phase I study of neuroblastoma with the anti-ganglioside GD2
antibody 14.G2a. Cancer Immunol Immunother. 1992; 35(3):199-204.
Handgretinger R, Anderson K, Lang P, Dopfer R, Klingebiel T, Schrappe M, Reuland P,
Gillies SD, Reisfeld RA, Niethammer D. A phase I study of human/mouse chimeric
antiganglioside GD2 antibody ch14.18 in patients with neuroblastoma. Eur J Cancer.
1995; 31A(2):261-7.
Hero B, Simon T, Spitz R, Ernestus K, Gnekow AK, Scheel-Walter HG, Schwabe D, Schilling
FH, Benz-Bohm G, Berthold F. Localized infant neuroblastomas often show
spontaneous regression: results of the prospective trials NB95-S and NB97. J Clin
Oncol. 2008; 26(9):1504-10.
Himoudi N, Yan M, Papanastiasiou A, Anderson J. MYCN as a target for cancer
immunotherapy. Cancer Immunol Immunother. 2008; 57(5):693-700.
Huebener N, Fest S, Strandsby A, Michalsky E, Preissner R, Zeng Y, Gaedicke G, Lode HN.
A rationally designed tyrosine hydroxylase DNA vaccine induces specific
antineuroblastoma immunity. Mol Cancer Ther. 2008:7(7):2241-51.
Jerne NK. Towards a network theory of the immune system. Ann Immunol (Paris).
1974;125C(1-2):373-89.
Kieber-Emmons T, Luo P, Qiu J, Chang TY, O I, Blaszczyk-Thurin M, Steplewski Z.
Vaccination with carbohydrate peptide mimotopes promotes anti-tumor responses. Nat
Biotechnol. 1999; 17(7):660-5.
Kramer K, Gerald WL, Kushner BH, Larson SM, Hameed M, Cheung NK. Disialoganglioside
G(D2) loss following monoclonal antibody therapy is rare in neuroblastoma. Clin
Cancer Res. 1998; 4(9):2135-9.
Krieg AM, Yi AK, Schorr J, Davis HL. The role of CpG dinucleotides in DNA vaccines. Trends
Microbiol. 1998; 6(1):23-7.
Lode HN, Xiang R, Varki NM, Dolman CS, Gillies SD, Reisfeld RA. Targeted interleukin-2
therapy for spontaneous neuroblastoma metastases to bone marrow. J Natl Cancer
Inst. 1997; 89(21):1586-94.
Louis CU, Savoldo B, Dotti G, Pule M, Yvon E, Myers GD, Rossig C, Russell HV, Diouf O,
Liu E, Liu H, Wu MF, Gee AP, Mei Z, Rooney CM, Heslop HE, Brenner MK. Antitumor
29
activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with
neuroblastoma. Blood. 2011; 118(23):6050-6.
Marconi S, De Toni L, Lovato L, Tedeschi E, Gaetti L, Acler M, Bonetti B. Expression of
gangliosides on glial and neuronal cells in normal and pathological adult human brain. J
Neuroimmunol 2005; 170:115-21.
Marconi S, Acler M, Lovato L, De Toni L, Tedeschi E, Anghileri E, Romito S, Cordioli C,
Bonetti B. Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients. Mult Scler.
2006; 12(3):302-8.
Maris JM, Hogarty MD, Bagatell R, Cohn SL. Neuroblastoma. Lancet 2007; 369(9579):210620.
Martinez C, Hofmann TJ, Marino R, Dominici M, Horwitz EM. Human bone marrow
mesenchymal stroma cells express the neural ganglioside GD2: a novel surface
marker for the identification of MSCs. Blood. 2007; 109(10):4245-8.
Matthay KK, Villablanca JG, Seeger RC, Stram DO, Harris RE, Ramsay NK, Swift P,
Shimada H, Black CT, Brodeur GM, Gerbing RB, Reynolds CP. Treatment of high-risk
neuroblastoma with intensive chemotherapy, radiotherapy, autologous bone marrow
transplantation, and 13-cis-retinoic acid. Children’s Cancer Group. N Engl J Med 1999;
341(16):1165-73.
Matthay KK, Reynolds CP, Seeger RC, Shimada H, Adkins ES, Haas-Kogan D, Gerbing RB,
London WB, Villablanca JG. Long-term results for children with high-risk neuroblastoma
treated on a randomized trial of myeloablative therapy followed by 13-cis-retinoic acid:
a children’s oncology group study. J Clin Oncol 2009; 27(7):1007-13.
Matzinger P. Tolerance, danger, and the extended family. Annu Rev Immunol. 1994; 12:9911045.
Mazzucchelli L, Burritt JB, Jesaitis AJ, Nusrat A, Liang TW, Gewitz AT, Schnell FH, Parkos
CA. Cell-specific peptide binding by human neutrophils. Blood. 1999; 93(5):1738-48.
Metelitsa LS, Naidenko OV, Kant A, Wu HW, Loza MJ, Perussia B, Kronenberg M, Seeger
RC. Human NKT cells mediate antitumor cytotoxicity directly by recognizing target cell
CD1d with bound ligand or indirectly by producing IL-2 to activate NK cells. J Immunol.
2001; 167(6):3114-22.
Michalsky E, Goede A, Preissner R. Loops in Proteins (LIP) - a comprehensive loop
database for homology modeling. Protein Eng. 2003; 16:979-85.
Mizutamari RK, Wiegandt H, Nores GA. Characterization of anti-ganglioside antibodies
present in normal human plasma. J Neuroimmunol. 1994; 50(2):215-20.
Mond JJ, Vos Q, Lees A, Snapper CM. T cell independent antigens. Curr Opin Immunol.
1995; 7(3):349-54.
30
Monzavi-Karbassi B, Luo P, Jousheghany F, Torres-Quiñones M, Cunto-Amesty G, Artaud
C, Kieber-Emmons T. A mimic of tumor rejection antigen-associated carbohydrates
mediates and antitumor cellular response. Cancer Res. 2004; 64(6):2162-6.
Morandi F, Levreri I, Bocca P, Galleni B, Raffaghello L, Ferrone S, Prigione I, Pistoia V.
Human neuroblastoma cells trigger an immunoevasive program in monocytes by
stimulating soluble HLA-G release. Cancer Res. 2007; 67(13):6433-41.
National Cancer Insitute (NCI). Crizotinib in Treating Young Patients With Relapsed or
Refractory Solid Tumors or Anaplastic Large Cell Lymphoma. ClinicalTrials.govIdentifier: NCT00939770. http://clinicaltrials.gov/show/NCT00939770. Online-Zugriff am
14.11.2012.
Oberthuer A, Hero B, Spitz R, Berthold F, Fischer M. The tumor-associated antigen PRAME
is universally expressed in high-stage neuroblastoma and associated with poor
outcome. Clin Cancer Res. 2004; 10(13):4307-13.
Potapenko M, Shurin GV, de León J. Gangliosides as immunomodulators. Adv Exp Med Biol.
2007; 601:195-203.
Prendergast MM, Lastovica AJ, Moran AP. Lipopolysaccharides from Campylobacter jejuni
O:41 strains associated with Guillain-Barré syndrome exhibit mimicry of GM1
ganglioside. Infect Immun. 1998; 66(8):3649-55.
Pritchard J, Hickman JA. Why does stage 4s neuroblastoma regress spontaneously? Lancet.
1994; 344(8926):869-70.
Pule MA, Savoldo B, Myers GD, Rossig C, Dotti G, Huls MH, Liu E, Gee AP, Mei Z, Yvon E,
Weiss HL, Liu H, Rooney CM, Heslop HE, Brenner MK. Virus-specific T cells
engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in
individuals with neuroblastoma. Nat Med. 2008; 14(11):1264-70.
Raffaghello L, Prigione I, Airoldi I, Camoriano M, Levreri I, Gambini C, Pende D, Steinle A,
Ferrone S, Pistoia V. Downregulation and/or release of NKG2D ligands as immune
evasion strategy of human neuroblastoma. Neoplasia. 2004; 6(5):558-68.
Raffaghello L, Prigione I, Bocca P, Morandi F, Camoriano M, Gambini C, Wang X, Ferrone
S, Pistoia V. Multiple defects of the antigen-processing machinery components in
human neuroblastoma: immunotherapeutic implications. Oncogene. 2005; 24(29):463444.
Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI:
database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics. 1999; 50(3-4):213-9.
Riemer AB, Hantusch B, Sponer B, Kraml G, Hafner C, Zielinski CC, Scheiner O,
Pehamberger H, Jensen-Jarolim E. High-molecular-weight melanoma-associated
antigen mimotope immunizations induce antibodies recognizing melanoma cells.
Cancer Immunol Immunother. 2005; 54(7):677-84.
31
Riemer AB, Förster-Waldl E, Brämswig KH, Pollak A, Zielinski CC, Pehamberger H, Lode
HN, Scheiner O, Jensen-Jarolim E. Induction of IgG antibodies against GD2
carbohydrate tumor antigen by vaccination with peptide mimotopes. Eur J Immunol.
2006; 36(5):1267-74.
Rossig C, Bollard CM, Nuchtern JG, Merchant DA, Brenner MK. Targeting of G(D2)-positive
tumor cells by human T lymphocytes engineered to express chimeric T-cell receptor
genes. Int J Cancer. 2001; 94(2):228-36.
Russell HV, Strother D, Mei Z, Rill D, Popek E, Biagi E, Yvon E, Brenner M, Rousseau R. A
phase 1/2 study of autologous neuroblastoma tumor cells genetically modified to
secrete IL-2 in patients with high-risk neuroblastoma. J Immunther. 2008; 31(9):812-9.
Sarkar AK, Nuchtern JG. Lysis of MYCN-amplified neuroblastoma cells by MYCN peptidespecific cytotoxic T lymphocytes. Cancer Res. 2000; 60(7):1908-13.
Schilling FH, Spix C, Berthold F, Erttmann R, Fehse N, Hero B, Klein G, Sander J, Schwarz
K, Treuner J, Zorn U, Michaelis J. Neuroblastoma screening at one year of age. N Engl
J Med. 2002; 346(14):1047-53.
Schulz G, Cheresh DA, Varki NM, Yu A, Staffileno LK, Reisfeld RA. Detection of ganglioside
GD2 in tumor tissues and sera of neuroblastoma patients. Cancer Res 1984;
44(12):5914-20.
Schumacher-Kuckelkorn R, Hero B, Ernestus K, Berthold F. Lacking immunocytological GD2
expression in neuroblastoma: report of 3 cases. Pediatr Blood Cancer. 2005;
45(2):195-201.
Sheikh KA, Sun J, Liu Y, Kawai H, Crawford TO, Proia RL, Griffin JW, Schnaar RL. Mice
lacking complex gangliosides develop Wallerian degeneration and myelination deficits.
Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96(13):7532-7.
Shi Y, Evans JE, Rock KL. Molecular identification of a danger signal that alerts the immune
system to dying cells. Nature. 2003; 425(6957):516-21.
Shibina A, Seidel D, Somanchi SS, Lee DA, Stermann A, Maurer BJ, Lode HN, Reynolds
CP, Huebener N. Fenretinide sensitizes multidrug-resistant human neuroblastoma cells
to antibody-independent and ch14.18 mediated cell cytotoxicity. J Mol Med. 2012; DOI:
10.1007/s00109-012-0958-0.
Shusterman S, London WB, Gillies SD, Hank JA, Voss SD, Seeger RC, Reynolds CP,
Kimball J, Albertini MR, Wagner B, Gan J, Eickhoff J, DeSantes KB, Cohn, SL, Hecht
T, Gadbaw B, Reisfeld RA, Maris JM, Sondel PM. Antitumor activity of hu14.18-IL2 in
patients with relapsed/refractory neuroblastoma: a Children’s Oncology Group (COG)
phase II study. J Clin Oncol. 2010; 28(33):4969-75.
Shurin GV, Gerein V, Lotze MT, Barksdale EM Jr. Apoptosis induced in T cells by human
neuroblastoma cells: role of Fas ligand. Nat Immun. 1998; 16(5-6):263-74.
32
Simon T, Hero B, Faldum A, Handgretinger R, Schrappe M, Klingebiel T, Berthold F. Long
term outcome of high-risk neuroblastoma patients after immunotherapy with antibody
ch14.18 or oral metronomic chemotherapy. BMC Cancer 2011; 11:21.
Soldati R, Berger E, Zenclussen AC, Jorch G, Lode HN, Salatino M, Rabinovich GA, Fest S.
Neuroblastoma triggers an immunoevasive program involving galectin-1 modulation of
T cell an dendritic cell compartments. Int J Cancer. 2012; 131(5):1131-41.
Stermann A, Huebener N, Seidel D, Reker D, Lode HN. MYCN-DNA vaccination suppresses
growth of MYCN overexpressing neuroblastoma in a syngeneic mouse model. Abstract
ANR Meeting 2012, 18.-21. Juni 2012, Toronto, Kanada.
Sugiura Y, Furukawa K, Tajima O, Mii S, Honda T, Furukawa K. Sensory nerve-dominant
nerve degeneration und remodeling in the mutant mice lacking compex gangliosides.
Neuroscience. 2005; 135(4):1167-78.
Svennerholm L, Boström K, Fredman P, Jungbier B, Lekman A, Månsson JE, Rynmark BM.
Gangliosides and allied glycosphingolipids in human peripheral nerve and spinal cord.
Biochim Biophys Acta. 1994; 1214(2):115-23.
Toes RE, Blom RJ, Offringa R, Kast WM, Melief CJ. Enhanced tumor outgrowth after peptide
vaccination. Functional deletion of tumor-specific CTL induced by peptide vaccination
can lead to inability to reject tumors. J Immunol. 1996; 156(10):3911-8.
Tovigrechko A, Vakser IA. Development and testing of an automated approach to protein
docking. Proteins. 2005; 60(2):296-301.
Weber JS, Vogelzang NJ, Ernstoff MS, Goodman OB, Cranmer LD, Marshall JL, Miles S,
Rosario D, Diamond DC, Qiu Z, Obrocea M, Bot A. A phase 1 study of a vaccine
targeting preferentially expressed antigen in melanoma and prostate-specific
membrane antigen in patients with advanced solid tumors. J Immunother. 2011;
34(7):556-67.
Wenschuh H, Volkmer-Engert R, Schmidt M, Schulz M, Schneider-Mergener J, Reineke U.
Coherent membrane supports for parallel microsynthesis and screening of bioactive
peptides. Biopolymers. 2000; 55(3):188-206.
Wölfl M, Jungbluth AA, Garrido F, Cabrera T, Meyen-Southard S, Spitz R, Ernestus K,
Berthold F. Expression of MHC class I, MHC class II, and cancer germline antigens in
neuroblastoma. Cancer Immunol Immunother. 2005; 54(4):400-6.
World Health Organization. Typhoid vaccines: WHO position paper. Wkly Epidemiol Rec.
2008; 83(6):49-59.
Yu AL, Uttenreuther-Fischer MM, Huang CS, Tsui CC, Gillies SD, Reisfeld RA, Kung FH.
Phase I trial of a human-mouse chimeric anti-disialoganglioside monoclonal antibody
ch14.18 in patients with refractory neuroblastoma and osteosarcoma. J Clin Oncol.
1998; 16(6):2169-80.
33
Yu AL, Gilman AL, Ozkaynak MF, London WB, Kreissman SG, Chen HX, Smith M, Anderson
B, Villablanca JG, Matthay KK, Shimada H, Grupp SA, Seeger R, Reynolds CP, Buxton
A, Reisfeld RA, Gillies SD, Cohn SL, Maris JM, Sondes PM; Children’s Oncology
Group. Anti-GD2 antibody with GM-CSF, interleukin-2, and isotretinoin for
neuroblastoma. N Engl J Med 2010; 363(14):1324-34.
Yu RK, Tsai YT, Ariga T. Functional roles of gangliosides in neurodevelopment: an overview
of recent advances. Neurochem Res. 2012; 37(6):1230-44.
Zeng Y, Fest S, Kunert R, Katinger H, Pistoia V, Michon J, Lewis G, Ladenstein R, Lode HN.
Anti-neuroblastoma effect of ch14.18 antibody produced in CHO cells is mediated by
NK-cells in mice. Mol Immunol. 2005; 42(11):1311-9.
Zitman FM, Todorov B, Jacobs BC, Verschuuren JJ,Furukawa K, Furukawa K, Willison HJ,
Plomp JJ. Neuromuscular synaptic function in mice lacking major subsets of
gangliosides. Neuroscience. 2008; 156(4):885-97.
34
6. Zusammenfassung
Das Neuroblastom ist der häufigste solide, extrakranielle Tumor des Kindesalters. Die
schlechte Prognose von Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung macht die Entwicklung
neuer Therapiemodalitäten zu einem der wichtigsten Forschungsziele auf dem Gebiet der
pädiatrischen Onkologie. Durch die passive Immuntherapie mit Antikörpern gegen das
Glykolipidantigen Disialogangliosid GD2, welches von Neuroblastomen hoch exprimiert wird,
konnte die Überlebensrate von Hochrisiko-Neuroblastompatienten zuletzt deutlich verbessert
werden. Dennoch ist die passive Immuntherapie mit Nachteilen verbunden: Das Ausbleiben
einer
langfristigen
Immunität
erfordert
repetitive
Antikörpergaben
mit
akuten
antikörperbezogenen Nebenwirkungen und dem Risiko, eine humorale Immunreaktion gegen
den applizierten Antikörper zu entwickeln. Eine aktive GD2-gerichtete Immunisierung
erscheint daher vorteilhaft. Die schwache Immunogenität des Glykolipids ist hierbei ein
wesentliches Hindernis bei der Induktion einer effektiven GD2-gerichteten Immunität. Dieses
Problem kann durch die Verwendung von Proteinantigenen wie GD2-Peptidmimotopen oder
anti-Idiotyp-Antikörpern umgangen werden.
Zunächst beschreibt diese Arbeit die Charakterisierung von zwei GD2-Peptidmimotopen
(„MA“ und „MD“), welche durch Screening von Phagenbibliotheken identifiziert wurden, sowie
den Nachweis der erfolgreichen Induktion einer neuroblastomspezifischen Immunität im
syngenen Mausmodell. In einem zweiten Schritt wurden die Peptidmimotope durch
Austausch einzelner Aminosäuren in ihrer Affinität zu GD2-Antikörpern optimiert und das so
geschaffene neue Peptidmimotop („C3“) im Hinblick auf die Induktion einer humoralen GD2spezifischen Immunität erfolgreich im Mausmodell getestet.
Zudem gelang es, einen neuen monoklonalen GD2-anti-Idiotyp-Antikörper („Ganglidiomab“)
zu erzeugen. Ganglidiomab weist typische Eigenschaften eines anti-Idiotypen wie die
kompetitive Inhibition der Bindung von GD2 an GD2-Antikörper auf und erwies sich im
Mausmodell als wirksam bei der Induktion einer GD2-spezifischen humoralen Immunantwort.
Das optimierte GD2-Peptidmimotop C3 und der neue monoklonale GD2-Anti-Idiotyp
Ganglidiomab bilden somit eine Basis zur weiteren Entwicklung einer wirksamen und
sicheren Vakzine zur Behandlung von Hochrisiko-Neuroblastompatienten.
35
7. Danksagung
Ich hatte in den vergangenen Jahren das Glück, mit sehr vielen großartigen Menschen aus
unterschiedlichen Arbeitsgruppen und Fachgebieten zusammenarbeiten zu können. Mein
Dank gilt allen Freunden und Kollegen, die mich mit ihrem Enthusiasmus und ihrer Geduld
begleitet und unterstützt haben. Durch sie wurde diese Arbeit für mich weit mehr als die
Summe von Laborzeit und bedrucktem Papier.
Prof. Dr. Holger N. Lode danke ich für die stets unkomplizierte und über die Jahre sehr
großzügige und geduldige Betreuung dieser Promotionsarbeit sowie für die unschätzbare
Starthilfe für mein Berufsleben als Kinderarzt.
Dr. Nicole Hübener danke ich für ihr stets offenes Ohr und die vielen guten Ratschläge in der
täglichen Arbeit sowie für die Durchsicht dieses Manuskripts.
Bianca Baykan danke ich für die niemals abreißende gute Laune und die ständigen
Motivationsschübe bei der zum Teil leider auch frustrierenden Arbeit in Labor und Klinik. Ich
werde unsere Zusammenarbeit vermissen.
Dr. Rudolf Volkmer-Engert und Christiane Landgraf aus der Abteilung Molekulare
Bibliotheken am Institut für Immunologie der Charité sowie Elke Michalsky und Ines Jäger
von der Structural Bioinformatics Group am Institut für Physiologie der Charité danke ich ihre
unschätzbare Hilfe und ihren großen Einsatz bei der Analyse von Antikörpern und
Mimotopen auf Cellulosemembranen und Computerplatinen.
Manuela Schmidt, Diana Brackrock und Diana Seidel danke ich für ihre tolle Arbeit und
Ausdauer bei der Fortführung des Ganglidiomab-Projekts.
Ich danke außerdem allen anderen Mitarbeitern der Arbeitsgruppen in Berlin und Greifswald
für die immer unkomplizierte gegenseitige Hilfe und die schöne Zusammenarbeit: Alex, Silke,
Rike, Björn, Catha, Stefanie, Lena, Anja und Niko. Danke auch allen!
Mein besonderer Dank gilt PD Dr. Stefan Fest, der mich mit seiner ansteckend
enthusiastischen Art für das Thema und das experimentelle Arbeiten begeistern konnte und
der - trotz zeitweise mehreren tausend Kilometern Distanz – immer zu Diskussionen,
Ratschlägen und tatkräftiger Hilfe bereit war. Einen engagierteren Betreuer kann sich ein
Doktorand nicht wünschen.
36
8. Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig verfasst und keine
anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.
Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät, keiner anderen wissenschaftlichen
Einrichtung vorgelegt worden.
Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass eine
Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.
Hamburg im April 2013
Matthias Bleeke
37
9. Anteilserklärung
Dieser kumulativen Dissertationsarbeit liegen drei publizierte Originalarbeiten unter Mitarbeit
von Herrn Bleeke zugrunde:
1. Fest S, Huebener N, Weixler, S, Bleeke M, Zeng Y, Strandsby A, Volkmer-Engert R,
Landgraf C, Gaedicke G, Riemer AB, Michalsky E, Jaeger IS, Preissner R, Förster-Waldl
E, Jensen-Jarolim E, Lode HN. Characterization of GD2 peptide mimotope DNA vaccines
effective against sponateous neuroblastoma metastases. Cancer Research 2006;
66(21):10567-75.
Herr Bleeke war im Rahmen dieser Arbeit an der Planung und Durchführung der
tierexperimentellen Arbeiten sowie der Untersuchung der humoralen und zellulären
Immunantworten beteiligt. Sein Anteil an der veröffentlichten Arbeit betrug 20 %.
2. Bleeke M, Fest S, Huebener N, Landgraf C, Schraven B, Gaedicke G, Volkmer R, Lode
HN. Systematic amino acid substitutions improved efficiency of GD2-peptide mimotope
vaccination against neuroblastoma. Eur J Cancer. 2009; 45(16):2914-21.
Herr Bleeke war maßgeblich an der Planung und Durchführung der Mutationsanalysen,
Charakterisierung der Peptidmimotope, tierexperimentellen Arbeiten, der Auswertung der
Immunantworten sowie der Erstellung des Manuskripts beteiligt. Sein Anteil an der
veröffentlichten Arbeit betrug 80 %.
3. Lode HN, Schmidt M, Seidel D, Huebener N, Brackrock D, Bleeke M, Reker D, Brandt S,
Müller HP, Helm C, Siebert N. Vaccination with anti-idiotype antibody ganglidiomab
mediates a GD2 specific anti-neuroblastoma immune response. Cancer Immunology
Immunotherapy. 2013; DOI: 10.1007/s00262-013-1413-y.
Herr Bleeke war an der Erstellung des Hybridoms sowie der Etablierung von Methoden
zur Charakterisierung des anti-Idiotypen beteiligt. Sein Anteil an der veröffentlichten Arbeit
betrug 10%.
Prof. Dr. Holger N. Lode
Matthias Bleeke
38
10. Lebenslauf
Der Lebenslauf ist aus Datenschutzgründen in der online-Dissertation nicht enthalten.
39
11. Anhang
Fest S, Huebener N, Weixler, S, Bleeke M, Zeng Y, Strandsby A, Volkmer-Engert R,
Landgraf C, Gaedicke G, Riemer AB, Michalsky E, Jaeger IS, Preissner R, Förster-Waldl E,
Jensen-Jarolim E, Lode HN.
Characterization of GD2 peptide mimotope DNA vaccines effective against sponateous
neuroblastoma metastases.
Cancer Research. 2006; 66(21):10567-75.
Der Originalartikel ist online verfügbar unter:
http://cancerres.aacrjournals.org/content/66/21/10567.full?sid=e5c64cd0-b7ca-43a1-a6b4d30a8350df3b
40
Bleeke M, Fest S, Huebener N, Landgraf C, Schraven B, Gaedicke G, Volkmer R, Lode HN.
Systematic amino acid substitutions improved efficiency of GD2-peptide mimotope
vaccination against neuroblastoma.
European Journal of Cancer. 2009; 45(16):2914-21.
Der Originalartikel ist online verfügbar unter:
http://www.ejcancer.com/article/S0959-8049%2809%2900580-2
41
Lode HN, Schmidt M, Seidel D, Huebener N, Brackrock D, Bleeke M, Reker D, Brandt S,
Mueller HP, Helm C, Siebert N.
Vaccination with anti-idiotype antibody ganglidiomab mediates a GD2 specific antineuroblastoma immune response.
Cancer Immunology, Immunotherapy. 2013; 62(6):999-1010.
Der Originalartikel ist online verfügbar unter:
http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00262-013-1413-y
42
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