GD2-Mimotop-DNA-Vakzine Das Neuroblastom: Die Entwicklung

GD2-Mimotop-DNA-Vakzine
Das Neuroblastom:
Die Entwicklung und Etablierung eines immuntherapeutischen Ansatzes zur
Behandlung des Neuroblastoms, dem häufigsten soliden, extrakraniellen Tumor im
Kindesalter, ist eines der bedeutsamsten Forschungsziele auf dem Gebiet der pädiatrischen
Onkologie. Die Inzidenz des Neuroblastoms ist mit 1,3 Erkrankungen auf 100.000 Kinder
zwar geringer als die von Leukämien oder Tumoren des zentralen Nervensystems, jedoch
weist das fortgeschrittene, metastasierte Neuroblastom (Stadium 4 nach internationaler
Klassifikation) eine 5-Jahres-Überlebensrate von nur 33 % auf 1. Damit haben Kinder mit
Neuroblastom eine der geringsten Überlebenswahrscheinlichkeiten unter allen pädiatrischen
Neoplasien. Tatsächlich liegen bei ca. 40 % der Neuroblastome zum Zeitpunkt der
Diagnosestellung bereits Fernmetastasen vor 2.
GD2:
Das Glykolipid Disialogangliosid GD2 wird in hohem Maße von neuroektodermalen
Tumoren, wie dem Melanom oder dem Neuroblastom exprimiert 3. Dieses tumorassoziierte
Antigen (TAA) ist bereits etabliertes Zielantigen der passiven Immuntherapie durch
Applikation zweier verschiedener monoklonaler Antikörper (mAb), dem chimären ch14.18
mAb und dem murinen 3F8 mAb 4, 5. Der ch14.18 mAb wird bereits in einer europaweiten
Phase-III-Studie (HR-NBL-1/ESIOP) auf seine Wirksamkeit zur adjuvanten
Neuroblastombehandlung getestet 6.
Die Applikation eines Antikörpers ist jedoch mit einigen Nachteilen verbunden: 1.)
der Erzeugung einer gegen den Impfantikörper gerichteten Immunantwort, 2.) dem Auftreten
von akuten antikörperbezogenen Nebenwirkungen, wie starken abdominalen Schmerzen und
Sehstörungen, und 3.) dem Ausbleiben einer dauerhaften Immunantwort durch das Fehlen von
antigenspezifischen Memory-B- und T-Zellen 7.
Diese Nachteile können mittels einer aktiven Immunisierungsstrategie überwunden
werden. Erste Arbeiten bestätigen das sehr eindrucksvoll. Die Vakzinierung mit GD2-keyhole
limpet hemocyanin (KLH)-Konjugaten oder die Aktivierung des anti-Idiotypen-Netzwerkes
durch die Gabe des anti-Idiotypen-Antikörpers (Id) 1A7 bzw. des entsprechend kodierenden
Impfplasmids, induzierten in tierexperimentellen und klinischen Untersuchungen eine
deutliche anti-GD2-Serumantwort sowie ein unterdrücktes Tumorwachstum. Allerdings
konnte bisher keiner dieser Ansätze zur aktiven Immunisierung in die Klinik übernommen
werden 8 9 10.
Ein wichtiges Hindernis auf dem Weg zu einer effektiven und nebenwirkungsarmen
aktiven Immunisierung gegen das GD2-TAA ist dessen T-Zell-Unabhängigkeit (TI = T-cell
independency). Glykolipide und Kohlenhydrate, wie GD2, sind daher ausgesprochen
schwache Immunogene. TI-Antigene werden nicht wie Proteine über den üblichen Weg der
MHC Klasse I/II Präsentation durch antigenpräsentierende Zellen (APC), sondern direkt und
ohne die Einbeziehung von T-Helfer-Zellen (Th) den Effektorzellen, wie Natural-KillerZellen (NK-Zellen) und B-Zellen, präsentiert. Dies bewirkt eine ineffiziente Aktivierung des
Immunsystems, die zur effektiven Tumorbekämpfung oft nicht ausreichend ist 11.
GD2-Mimotope:
Einen Weg, die T-Zell-Unabhängigkeit von GD2 zu überwinden, stellt die
Übersetzung des Glykolipid-Epitops in ein Peptid-Epitop dar. Das resultierende GD2nachahmende Peptid-Epitop wird Mimotop genannt und kann nun ebenfalls über den
klassischen Weg der MHC Präsentation und unter Einbezug der wichtigen Th Population den
Effektorzellen präsentiert werden. Der bisher favorisierte Weg, Peptid-Mimotope zu
generieren, ist die Technik des Biopannings, bei der die Paratope eines gegen ein Glykolipid
gerichteten Antikörpers in der Festphase mit Hilfe von Phagenbibliotheken dekodiert werden.
In Kooperation mit der Wiener Arbeitsgruppe um Frau Professor Jensen-Jarolim waren wir
die ersten, denen es gelungen ist, auf diese Weise GD2-Mimotope zu generieren. Die von uns
verwendete Phagenbibliothek exprimiert 1,04 x 107 unterschiedliche Dekapeptide 12. Aus
einer Liste von ursprünglich 10 Mimotop-Sequenzen ergaben sich zwei Mimotope (MA und
MD), die im ELISA und in DOT-Blot-Experimenten die besten Mimikry-Eigenschaften zu
GD2 aufwiesen. Dies ergab sich durch die beste Bindung an den anti-GD2-Antikörper
ch14.18. Diese Ergebnisse wurden in Zusammenarbeit mit der AG Preissner, Institut für
Biochemie, anhand von Modellen nachvollzogen. Zuerst wurde ein Modell für den ch14.18
Antikörper berechnet und die freie Bindungsenergie der Mimotope an den ch14.18 Antikörper
bestimmt.
Abbildung 1: Modell der Bindung von GD2 und Peptidmimotop A und D an ch14.18
Computermodell der Bindung des nominalen Antigens GD2 an das Paratop von anti-GD2 Antikörper
ch14.18 (rechts). GD2 ist mit seinen beiden Fettsäureresten in der Zellmembran der
Neuroblastomzelle verankert. Die Bindung der zirkulären Peptide MA (gelb) und MD (rot) mit ch14.18
wurde berechnet. Die berechneten freien Bindungsenergien ergaben -41.23 kJ/mol (MA) und -48.06
kJ/mol (MD).
Das Mimotop MD wurde als Peptidvakzin in unserem syngenen NeuroblastomMausmodell eingesetzt. Da bekannt ist, daß Peptidvakzine toleranzinduzierend wirken können
und in einem unserer ersten Tierversuche genau dieser Fall der Immuntoleranz gegenüber
dem Neuroblastom auftrat, wurde die Applikationsweise verändert: die subkutane Gabe des
KLH-gekoppelten MD-Peptids in Verbindung mit einer gleichzeitigen Stimulation durch eine
orale Gabe des CpG-reichen, leeren Expressionsplasmids pSecTag2A in attenuierten
Salmonellen konnten eine deutliche Antikörperbildung gegen GD2 induzieren. Die
Metastasierung des intravenös applizierten Tumors war bei den auf diese Weise geimpften
Tieren ebenfalls deutlich weniger ausgeprägt als in den anderen Kontrollgruppen.
Abbildung 2: Wirkung der GD2 Peptid Mimotop Vakzinierung beim Neuroblastom
a)
b)
Mäuse (n=6-8) wurden durch Sondierung von attenuierten Salmonella typhimurium Bakterien
immunisiert, die mit pSA-MA und pSA-MD DNA-Vakzinen transfiziert wurden. Ergebnisse wurden mit
Mäusen verglichen, die i.p. Injektionen mit an KLH gekoppelten synthetischen GD2 Peptidmimotopen
(MA, MD) welche an Al(OH)3 adsorbiert wurden, erhalten haben. Alle Mäuse erhielten eine letale
Injektion mit GD2 positiven NXS2 Neuroblastomzellen. A) Spontane Lebermetastasierung wurde
durch Messungen des Lebergewichts quantifiziert. Ergebnisse entsprechen dem Mittelwert ± S.E.M. (*
p ≤ 0.05). Die horizontale Linie zeigt das Lebergewicht gesunder Mäuse an (1.2 g).
B) Photographien von zwei repräsentativen Lebern je Gruppe.
Optimierung der GD2-Mimotope:
Obwohl Phagenbibliotheken eine ungeheure Vielfalt an Aminosäurekombinationsmöglichkeiten abdecken und somit ein sicherer Weg zur Mimotop-Generierung
sind, bleiben die theoretischen Kombinationsmöglichkeiten von Peptiden mit einer Länge von
10 Aminosäuren unerreicht. Bei einer Anzahl von 2 x 1011 theoretischen Möglichkeiten wird
schnell deutlich, dass die mittels Phagenbibliothek gefundenen Mimotope nicht zwangsläufig
die optimalsten Antigeneigenschaften besitzen, um die gewünschte Immunantwort gegen das
nominale Antigen auszulösen. Ein möglicher, noch unveröffentlichter Weg in Richtung einer
Optimierung ist ebenfalls zuerst von uns beschritten worden. Die Optimierung wurde durch
eine SPOT-Synthese der Peptide mit systematischer Mutationsanalyse erreicht. Dabei werden
in vitro bestimmte AS-Positionen in den ursprünglichen Mimotop-Sequenzen (von MD und
MA) mutiert und die veränderte Bindungsaffinität zum Anti-GD2-Antikörper in BIAcoreBindungsstudien untersucht. Auf diese Weise gelang es, die Bindungsaffinität des Mimotops
zum anti-GD2-Antikörper um das beinahe10-fache zu erhöhen, s. Abb. 1.
Abbildung 3: Dissoziationskonstanten von C3 und MD Mimotopen
70
70
a
b
50
30
r eq
[RU]
KD: 1,67 x10-5
r eq
[RU]
50
KD: 9,37 x 10-5
30
10
10
10-09
10-07
10-05
Konzentration[mol/l]
10-03
10-09
10-07
10-05
10-03
Konzentration [mol/l]
Abb. 3: Dissoziationskonstanten von C3 und MA. Die Bindungsaffinität für C3 (a) und MA (b)
zum ch14.18 mAb wurde im BIACore-System bestimmt. Die Kurven zeigen die gemessene
Resonanz bei Erreichen des Fließgleichgewichts (r eq), abhängig von der Konzentration an
ch14.18 mAb in mol/l. Die Dissoziationskonstante (KD) wurde mit dem Auswertungsprogramm
BIAevaluation (BIACore, Schweden) errechnet.
Eine Aufstellung der bisher identifizierten Mimotope MD und MA sowie der neuen,
laut BIAcore-Analysen optimierten Mimotope (C3, C1, C5, D2 und C4) finden sich in
Tabelle 1 (die genauen Sequenzen der optimierten Mimotope werden an dieser Stelle nicht
bekanntgegeben, da sie kurz vor der Veröffentlichung stehen). C3 ergab dabei die besten
Bindungsergebnisse an den Anti-GD2-Antikörper und soll deshalb präferentiell im syngenen
Neuroblastom-Mausmodell untersucht werden.
Tab. 1:GD2-Mimotop-Liste
Platz
Peptidname
Kurzsequenz
1.
C3
CGRL-4H-5LC
2.
C1
CGRL-5LC
3.
C5
CGRL-5L-4NC
4.
D2
GRL-5L-4N
5.
C4
CGRL-4S-5LC
6.
MA
CGRLKMVPDLEC
7.
MD
CDGGWLSKGSWC
Letztlich soll die gestärkte Ähnlichkeit zwischen dem GD2-Mimotop und dem
neuroblastomassoziierten Antigen GD2 zu einer verbesserten Kreuzreaktivität der Antikörper
(„molekulares Mimikry“) und damit zu einer ebenfalls verstärkten Immunantwort gegen das
Neuroblastom führen. Die Verwendung von Mimotopen zur Immuntherapie hat sich bereits
bei einer Reihe von Tumoren in vitro sowie im Mausmodell als effektiv erwiesen, z.B. beim
Melanom und dem Mammakarzinom 13 14.
Durch die Kopplung des Mimotops an ein Trägerprotein wie KLH und in
Kombination mit immunstimulatorischen Signalen („danger signals“) kann das Mimotop
zusätzlich als Peptidkonjugatimpfstoff verwendet werden, um einen Vergleich zum
korrespondierenden DNA-Impfstoff zu erhalten.
DNA-Impfstoffe vs. Peptid-Vakzine:
Bedeutsam in diesem Zusammenhang ist jedoch, dass Peptidimpfstoffe häufig
zusammen mit Adjuvantien verabreicht werden müssen, da sie ansonsten statt einer
antigenspezifischen Zytotoxizität eine Toleranz gegenüber dem Antigen bzw. dem
antigenexprimierenden Tumor auslösen können. Einen sehr einfachen und eleganten Weg, die
peptidinduzierte Toleranz zu umgehen, soll durch die Herstellung von DNA-Impfstoffen
erreicht werden, die für die entsprechenden Peptidsequenzen kodieren.
Die Vorteile von DNA-Impfstoffen gegenüber Peptidvakzinen sind:
1.) Zusätzlich zu den für das Mimotop kodierenden Genen können Gene für
kostimulatorische Signale direkt in das Impfplasmid integriert werden.
2.) Werden die Plasmide in attenuierte Bakterien, z.B. Salmonella typhimurium, SL7207,
transformiert, kann der Impfstoff als Lösung oral verabreicht werden. Der Impfstoff ist so der
enorm großen, immunaktiven Mukosa-Oberfläche des Gastrointestinaltrakts zugänglich. Die
Salmonellen werden von den antigenpräsentierenden Zellen (APCs) im lymphatischen
Gewebe des Gastrointestinaltraktes aufgenommen, sterben aber aufgrund der durch ihre
Mutation bedingten Unfähigkeit, bestimmte Aminosäuren zu verstoffwechseln, ab und setzen
die DNA innerhalb der APCs frei. Das durch die APC synthetisierte Peptid wird exprimiert
und somit Effektorzellen zugänglich.
Sehr erfolgreich ist dieses Impfprinzip bereits von uns gegen ein anderes
Neuroblastomantigen, der Tyrosinhydroxylase, eingesetzt worden15. Zudem bewirken die von
den Salmonellen exprimierten Lipopolysaccharide selbst eine starke Aktivierung des
Immunsystems und fördern somit die Tumorbekämpfung.
3.) Neben einer gezielten Aktivierung der zellulären und humoralen Abwehr erfolgt auch
die Ausbildung von sog. Memory-T-Zellen, der Grundlage des immunologischen
Gedächtnisses.
4.) Durch die Insertion unmethylierter CpG-Motive in das Impfplasmid kann ein starkes
Ko-Stimulans („danger signal“) eingefügt werden. Die CpG-Motive der DNA binden direkt
an Toll-like-Rezeptor 9 (TLR-9) auf der Oberfläche von APCs und Lymphozyten, bewirken
eine starke Ko-Aktivierung dieser Immunzellen und fördern so die Bekämpfung des Tumors
durch zytotoxische Effektorzellen. Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass eine TLRvermittelte Kostimulation unbedingte Voraussetzung für die effiziente Antikörperbildung
durch antigenspezifische B-Zellen ist 16 17.
5.) Mittels PCR lässt sich die DNA beliebig amplifizieren und verändern, was die
Herstellung eines DNA-Impfstoffes sehr kosteneffektiv macht.
Die Fähigkeit von GD2-Mimotop-DNA-Vakzinen, eine gegen das Neuroblastom
gerichtete Immunantwort zu induzieren, ist soll ebenfalls im syngenen in vivo-Modell
untersucht werden. Dabei soll erstens ein DNA-Vakzin eingesetzt werden, das für das
Mimotop MD kodiert, welches aus einer Phagenbibliothek heraus identifiziert wurde (s.
Tab. 1). Desweiteren soll das „neue“ Mimotop mit optimierter AS-Sequenz (BIACore) C3
(s. Tab. 1) als DNA-Vakzin getestet werden. Drittens soll untersucht werden, ob eine
Aneinanderreihung der C3-Mimotope aufgrund einer besseren räumlichen Präsentation des
GD2-Mimikry-vermittelnden Epitops eine Steigerung der Immunantwort vermittelt. Dazu
werden mehrere C3-Moleküle aneinandergereiht, verbunden durch ein starres Linkermolekül
(AS-Sequenz HPPGPPGPPGPPGPPGPPG) = C3-(L-C3)n. Die verschiedenen DNAPlasmide (Vakzine) sollen dann in vivo sowohl allein, d.h. im eukaryotischen
Expressionsplasmid pSecTag2A, als auch zusammen mit verschiedenen Adjuvantien im
bifunktionellen Expressionsplasmid pBUDCE4.1 eingesetzt werden. Als Adjuvantien sollen
dabei die kodierenden Sequenzen vom CD40Ligand (CD40L), vom Tetanus-Toxin (TT), von
Interleukin-12 (IL-12) und Interferon-γ (IFN-γ) getestet werden. Durch Insertion der DNA-
Sequenz des T1-Epitops aus gp120 des HIV soll ferner eine verbesserte Stimulation von
Lymphozyten erreicht werden.
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