Einfluß von Copolymer-1 auf die Apoptoserate und die

IV
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis häufig benutzter Abkürzungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VII
1.
Einleitung
1.1
Das Krankheitsbild der Multiplen Sklerose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
.................................................................. 1
1.1.1 Definition und klinisches Bild . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.2 Geschichte der MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.1.3 Epidemiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.1.4 Vererblichkeit und Genetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2
Ausgesuchte immunologische Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.2.1 Die Rolle von CD4+ αβ T-Zellen in der adaptiven Immunantwort . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.2.1.1
Generierung und Aktivierung von Lymphozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.2.1.2
Das Konzept der Th1/Th2-gewichteten Immunantwort . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.2.1.3
Terminierung und Prävention der zellulären Immunreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.2.1.4
Das Apoptosekonzept für CD4+ T-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.2.2 Die physiologische Rolle von Zytokinen in der Immunantwort . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.3
Die Immunpathogenese der MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.3.1 Die Schlüsselrolle von CD4+ αβ T-Zellen vom Th1-Typ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.3.2 Der neuropathologische Befund . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
1.3.3 Die Transfer-EAE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.3.4 Frequenz autoreaktiver T-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
1.3.5 Ursachen für die Persistenz und Pathogenität autoreaktiver T-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
1.4
1.3.5.1
Sequestration eigener, dennoch unbekannter Peptide:
Die unangebrachte Antigenfreisetzung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
1.3.5.2
Exposition von verborgenen Antigendeterminanten: Das kryptische Selbst . . . . . . . . . 29
1.3.5.3
Existenz von „Zeitbomben”: Die Selbstignoranz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
1.3.5.4
Kreuzreaktive Antigene: Die molekulare Mimikry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
1.3.5.5
Immundysregulation: Die Zerrüttung von Apoptosepfaden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
1.3.5.6
Immundysregulation: Die Alteration des Zytokin-Gleichgewichtes . . . . . . . . . . . . . . . . 31
Copolymer-1 in der Therapie der Multiplen Sklerose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
1.4.1 Darstellung und klinische Wirksamkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
1.4.2 Wirkung in Tiermodellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
1.4.3 Grundlage der COP-Wirkung: Die promisköse Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle . . . . . . . . . . 35
V
1.4.4 Die Immunmodulation durch COP: Vorgeschlagene Wirkprinzipien in EAE und MS . . . . . . . . . . . 35
1.4.4.1
TCR-Agonismus: Überstimulation autoreaktiver T-Zellen mit nachfolgendem AID . . . . 37
1.4.4.2
Partieller TCR-Agonismus: Immunmodulation autoreaktiver T-Zellen . . . . . . . . . . . . . 37
1.4.4.3
TCR-Antagonismus: Hemmung der Proliferation autoreaktiver Zellen . . . . . . . . . . . . . 38
1.5
Fragestellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.
Methodik
2.1
Auswahl der Versuchspersonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.1.1 Auswahl der Patienten: Die offene Phase-III-Studie für Copaxone® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.1.1.1
Einschlußkriterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.1.1.2
Ausschlußkriterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.1.2 Auswahl der Kontrollpersonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.2
Experimentelle Methodik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.2.1 Einführung in die experimentelle Methodik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.2.1.1
Nachweis von Apoptose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.2.1.2
Nachweis von Zytokinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.2.1.3
Prinzip der Durchflußzytometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.2.2 Experimentelles Vorgehen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
2.2.2.1
Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) . . . . . . . . . . . . . 48
2.2.2.2
Spezifische Stimulation der PBMC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.2.2.3
Nachweis von Apoptose nach der Annexin V/Propidiumiodid-Methode . . . . . . . . . . . . 49
2.2.2.4
Intrazellulärer Nachweis von Zytokinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.2.2.5
FACScan®-Auswertungsprozedur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.3
Statistische Datenanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
2.4
Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
2.4.1 Puffer und Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
2.4.1.1
Lösungen zur Zellseparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
2.4.1.2
Puffer zum Nachweis von Apoptose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
2.4.1.3
Puffer und Lösungen zum intrazellulären Nachweis von Zytokinen . . . . . . . . . . . . . . . 55
2.4.2 Medium für die Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
2.4.3 Mitogene zur unspezifischen Stimulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
2.4.4 Substanzen zur spezifischen Stimulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
2.4.5 Proteine und Antikörperkonjugate zum Nachweis von Apoptose/Zytokinen . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.4.6 Verbrauchsmaterialien, Reaktions- und Kulturgefäße . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
VI
3.
Ergebnisse
3.1
Apoptose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
3.2
Intrazellulär synthetisierte Zytokine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
3.2.1 IL-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
3.2.2 TNF-α . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
3.2.3 IFN-γ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.2.4 IL-4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.2.5 IL-10
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
3.2.6 TGF-β . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.3
Durchschnittliche Verteilung CD4+ Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
4.
Diskussion
4.1
Apoptose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
4.2
Zytokinsynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
4.3
Fazit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
5.
Zusammenfassung
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
6.
Literaturverzeichnis
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
Danksagung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VIII
Lebenslauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IX