RIDA Blot Parvovirus B19

RIDA® Blot Parvovirus B19
Immunoblot mit rekombinanten Antigenen zum Nachweis
von Antikörpern (IgM/IgG) gegen das humane Parvovirus B19
Immunoblot with recombinant antigens for the detection
of antibodies (IgM/IgG) against the human parvovirus B19
Art. No.: L 6003
Y
In vitro Test
Lagerung bei 2 - 8 °C
Storage at 2 - 8 °C
R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany
Tel.: +49 (0) 61 51 81 02-0 / Telefax: +49 (0) 61 51 81 02-20
Anschrift:
R-Biopharm AG
Landwehrstr. 54
D-64293 Darmstadt
Für weitere Fragen stehen Ihnen gerne zur Verfügung:
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RIDA® und RIDASCREEN®
sind eingetragene Warenzeichen der R-Biopharm AG
Hersteller: R-Biopharm AG, Darmstadt, Deutschland

RIDA® and RIDASCREEN®
are registered trademarks of R-Biopharm AG
Manufacturer: R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany
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Inhaltsverzeichnis
Seite
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Allgemeines .................................................................................................... 4
Einleitung ........................................................................................................ 4
Testprinzip ...................................................................................................... 6
Packungsinhalt ............................................................................................... 6
Zusätzlich benötigte Reagenzien - erforderliches Zubehör ............................ 7
Vorsichtsmaßnahmen ..................................................................................... 7
Reagenzien und ihre Lagerung ...................................................................... 8
Anzeichen für Reagenzienverfall .................................................................... 8
Sammlung und Lagerung der Proben............................................................. 8
Testdurchführung............................................................................................ 8
Auswertung.................................................................................................... 12
Hinweise zur Testdurchführung und Interpretation ........................................ 15
Klinische Ergebnisse ..................................................................................... 18
Contents
page
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Intended use ..................................................................................................
General ..........................................................................................................
Test principle .................................................................................................
Reagents provided.........................................................................................
Materials required but not provided ...............................................................
Warnings and precautions for the users ........................................................
Storage instructions .......................................................................................
Indication of instability or deterioration of reagents........................................
Specimen collection and storage ...................................................................
Test procedure...............................................................................................
Analysis .........................................................................................................
Remarks about the test procedure and interpretation....................................
Clinical results................................................................................................
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24
24
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30
34
Appendix
Literature ............................................................................................................. 35
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1. Allgemeines
Für die in vitro Diagnostik. Der RIDA® Blot Parvovirus B19 ist ein qualitativer Test
zum Nachweis und zur Identifizierung von Antikörpern (IgM und IgG) gegen das
Parvovirus B19 in humanem Serum oder Plasma. Der Test erlaubt durch die
elektrophoretische Auftrennung rekombinant hergestellter Bestandteile des Virusproteins im Unterschied zu anderen Testverfahren eine Aussage über das Vorhandensein unterschiedlicher Antikörper, die wiederum verschiedenen Krankheitsstadien zugeordnet werden können.
2. Einleitung
Das humane Parvovirus B19 wurde 1975 von Cossart und Mitarbeitern in England
entdeckt. Sie fanden dieses Virus beim Screening von Blutspenderseren auf Hepatitis B. Sie bezeichneten dieses zufällig gefundene Isolat mit B19.
Das Parvovirus B19 ist ein kleines, nicht umhülltes DNA-Virus mit einem Durchmesser von 18 - 26 nm. Das Genom besteht aus Einzelstrang-DNA von 5,4 Kilobasen Länge. Das Kapsid besteht aus 2 Polypeptiden der Größen 84 kD und
58 kD (VP1 und VP2). Beide Strukturproteine sind in einem gemeinsamen Leserahmen auf dem viralen Genom kodiert, wobei das kürzere VP2 einen späteren
Transkriptionsstart im Leserahmen von VP1 besitzt (siehe Pkt. 12). Das bedeutet,
daß beide Proteine bis auf einen zusätzlichen N-terminalen, etwa 26 kD großen
Teil von VP1 identisch sind. Weiterhin ist im Genom noch ein Haupt-Nicht-Strukturprotein (NS-1) kodiert, welches für die Virusreplikation und Vermehrung nötig
ist. Das B19-Virus ist von ikosaedrischer Struktur und sehr hitzestabil. Es kann
eine Temperatur von 60°C bis zu 12 Stunden lang überstehen.
Zur Gattung der Parvoviren gehören neben dem einzigen, bisher bekannten humanpathogenem Parvovirus B19 auch eine Reihe tierpathogener Viren wie das
Hundeparvovirus und das Katzen-Panleukopenievirus. Die Parvoviren bilden zusammen mit den Densoviren und den Dependoviren, deren Vermehrung ein Hilfsvirus (Adeno- oder Herpesviren) benötigt, die Familie der Parvoviridae.
Eine hervorzuhebende Eigenschaft der Parvoviren ist die selektive Replikation in
sich teilenden Zellen wie Knochenmark-, Darm- und Embryonalzellen.
Infektionen mit dem weltweit verbreiteten humanen Parvovirus B19 treten saisonal
gehäuft im Winter und Frühsommer auf und können vor allem in Kindergärten und
Schulen zu Epidemien führen. Die Übertragung erfolgt hauptsächlich über den
Respirationstrakt (Tröpfcheninfektion), kann aber auch über Blut und Blutprodukte
erfolgen. Frische Parvovirus-Infektionen treten in allen Altersstufen auf, am häufigsten in der Altersgruppe zwischen 6 und 15 Jahren. Die Durchseuchungsrate
steigt mit dem Lebensalter und erreicht im Erwachsenenalter einen Wert von etwa
40 - 70%. Frauen zeigen dabei eine höhere Prävalenz als Männer.
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Die Inkubationszeit beträgt 1 - 3 Wochen, wobei sich die virämische Phase, in der
der Patient als infektiös gilt, auf 3 - 7 Tage beschränkt. In dieser Zeit kann der Patient asymptomatisch sein oder über eine geringe Allgemeinsymptomatik wie
Kopfschmerzen, Juckreiz, Myalgien und Fieber klagen. Etwa ab der zweiten Woche nach der Infektion kann das Erythema infectiosum (Ringelröteln) auftreten.
Während bei Kindern überwiegend typische Exantheme auftreten (Wangenrötung,
girlandenförmige febrile Purpura insbesondere an den Streckseiten der Extremitäten), sind sie bei Erwachsenen eher untypisch. Zur weiteren Symptomatik einer
B19-Infektion gehören Arthralgien und Arthritiden (60%), respiratorische Symptome (22%) sowie Durchfälle (15 - 35%). Nur etwa 20% aller Parvovirus B19Infektionen verlaufen symptomlos. Frauen sind dabei von Gelenkbeschwerden
doppelt so häufig betroffen wie Männer. Diese Arthropathien verschwinden in den
meisten Fällen innerhalb von zwei bis vier Wochen. In wenigen Fällen können die
Symptome aber jahrelang intermittierend fortbestehen, so daß bei der Abklärung
chronischer Arthropathien auch an eine persistierende Parvovirus B19-Infektion
gedacht werden muß.
Während die durch Parvovirus B19 bedingte Hemmung der Erythropoese (Dauer
1 - 4 Wochen) beim gesunden Menschen meist subklinisch bleibt, gipfelt sie bei
Patienten mit chronisch hämolytischen Anämien (Sichelzellenanämie, Thalassämie, Pyruvatkinasemangel, Sphärozytose, autoimmun-hämolytische Anämie)
häufig in einer aplastischen Krise. Solche Patienten sind transfusionsbedürftig und
sollten in ein Krankenhaus eingewiesen werden.
Zusätzliche Organmanifestationen wie etwa hepatische Dysfunktionen oder eine
B19-assoziierte Myokarditis sind in jüngster Zeit beschrieben worden.
Zu einer weiteren Komplikation nach einer B19-Infektion kann es bei seronegativen Schwangeren kommen. Das Parvovirus B19 kann transplazentar auf den
Föten übertragen werden. Aufgrund der kurzen Lebensdauer der Erythrozyten bis
zur 20. Schwangerschaftswoche und einer fehlenden effizienten Immunabwehr
kann eine Infektion zu einer schweren akuten oder chronischen Anämie mit nachfolgendem Spontanabort führen. Eine weitere Komplikation nach Infektion während des zweiten Trimenons ist die Ausbildung eines Hydrops fetalis. Über 80%
der Schwangerschaften verlaufen jedoch komplikationslos. Embryopathien sind
bislang nicht beobachtet worden.
Antikörper der Klasse IgM können etwa 10 Tage nach Infektion und damit meist
gleichzeitig mit dem Beginn der Symptome nachgewiesen werden, IgG-Antikörper
sind bereits wenige Tage später zu finden und persistieren in der Regel lebenslang. IgM-Antikörper sind hingegen meist nach 30 bis 60 Tagen nicht mehr nachweisbar. Zum Nachweis von Antikörpern eignen sich Elisasysteme auf der Basis
rekombinanter VP1/VP2-Peptide. Wegen der besseren Aussagekraft über das
mögliche Stadium der Erkrankung durch den Nachweis unterschiedlicher Antikörper sollte immer ein Western Blot, wie der RIDA® Blot Parvovirus B19, der verRIDA® Blot Parvovirus B19
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schiedene rekombinant hergestellte Bestandteile des Virusantigens verwendet,
angeschlossen werden.
3. Testprinzip
Für den vorliegenden Immunoblot werden vier rekombinante Parvovirus B19-Antigene verwendet, die in E. coli erzeugt werden. Es handelt sich dabei um Teile
der beiden Strukturproteine VP1 und VP2 und um das Haupt-Nicht-Strukturprotein
NS-1 (siehe Pkt. 12.).
Die gereinigten (frei von Fusionsproteinen), rekombinanten Antigene wurden elektrophoretisch nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt und anschließend auf eine
Nitrocellulose-Membran geblottet. Die Membran wurde danach in einzelne Blotstreifen zerschnitten. Diese Streifen werden mit der zu untersuchenden Probe
(Serum, Plasma) inkubiert, wobei die darin vorhandenen Antikörper an die spezifischen Proteinbanden binden. Nach Beseitigung ungebundener Antikörper durch
Waschen der Streifen werden in einer zweiten Inkubation mit anti-human IgModer IgG-Konjugat (Peroxidase) und anschließender Farbreaktion spezifisch gebundene Antikörper gegen die vier Antigene des Parvovirus B19 als blaue Banden auf den Streifen sichtbar.
4. Packungsinhalt
Die Reagenzien einer Packung reichen für 20 Bestimmungen.
Jeder Reagenziensatz enthält:
2 x 10 Teststreifen;
beschichtet mit rekombinanten Parvovirus B19-Antigenen
1 x Wasch- / Verdünnungspuffer (100 ml, 5fach konz.);
enthält Tris-Puffer, NaCl, Tween-20 und Protein
1 x schwach positive IgM Kontrolle (80 µl);
rote Verschlußkappe
Humanserum, enthält < 0,1% NaN3
1 x schwach positive IgG Kontrolle (80 µl);
weiße Verschlußkappe
Humanserum, enthält < 0,1% NaN3
1 x Negativkontrolle (80 µl); blaue Verschlußkappe
Humanserum, enthält < 0,1% NaN3
1 x Anti-human IgM-Konjugat (100 µl, 500fach konz.);
lila Verschlußkappe
Kaninchen, Meerrettich-Peroxidase konjugiert,
enthält < 0,1% NaN3
1 x Anti-human IgG-Konjugat (60 µl, 1000fach konz.);
grüne Verschlußkappe
Kaninchen, Meerrettich-Peroxidase konjugiert,
enthält < 0,1% NaN3
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1 x Substrat (45 ml);
gebrauchsfertig, enthält Tetramethylbenzidin (TMB)
2 x Inkubationswannen à 10 Vertiefungen
1 x Kontrollstreifen (entwickelt, kitspezifisch)
1 x Gebrauchsanleitung
2 x Protokollblätter
5. Zusätzlich benötigte Reagenzien - erforderliches Zubehör
5.1. Reagenzien
− Deionisiertes Wasser
5.2. Zubehör
− Vakuumpumpe zum Absaugen der Flüssigkeit aus den Inkubationswannen
− Pipetten für 2 - 10 µl, 10 - 100 µl und 2 ml
− Meßzylinder für 100 ml und 500 ml
− Schüttler
− Plastikpinzette zum Anfassen der Nitrozellulose-Streifen
6. Vorsichtsmaßnahmen
Nur für die in vitro Diagnostik.
Dieser Test ist nur von geschultem Laborpersonal durchzuführen. Die Richtlinien
zur Arbeit in medizinischen Laboratorien sind zu beachten. Die Gebrauchsanweisung zur Durchführung des Tests ist strikt einzuhalten.
Proben oder Reagenzien nicht mit dem Mund pipettieren, Kontakt mit verletzter
Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Während des Umgangs mit Proben EinmalHandschuhe tragen und nach Abschluss des Tests die Hände waschen. In den
Bereichen, in denen mit den Proben oder den Test-Reagenzien gearbeitet wird,
nicht rauchen, essen oder trinken.
Die im Kit befindlichen Kontrollseren (Positiv- und Negativkontrolle) wurden auf
HIV 1+2- und HCV-Ak sowie HBsAg untersucht und für negativ befunden. Dennoch sollten sie, ebenso wie die Patientenproben und alle Materialien, die mit ihnen in Berührung kommen, als potentiell infektiös behandelt und entsprechend
den jeweiligen nationalen Sicherheitsbestimmungen gehandhabt werden.
Die Konjugate und die Kontrollen enthalten Natriumazid. Eine Berührung mit der
Haut oder Schleimhaut ist zu vermeiden. Bei Kontakt mit Blei- oder Kupferrohren
können explosive Metallazide entstehen.
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Sämtliche Reagenzien und Materialien, die mit potentiell infektiösen Proben zusammenkommen, müssen mit geeigneten Desinfektionsmitteln behandelt oder
mindestens eine Stunde bei 121 °C autoklaviert werden.
7. Reagenzien und ihre Lagerung
Alle Reagenzien sind bei 2 – 8 °C zu lagern und bis zu dem auf den Etiketten aufgedruckten Verfalldatum verwendungsfähig. Reagenzien aus Kits verschiedener
Chargen dürfen nicht miteinander kombiniert werden. Mikrobielle Kontamination
ist zu vermeiden. Die konzentrierten Konjugate und Puffer sind jeweils frisch zu
verdünnen.
8. Anzeichen für Reagenzienverfall
Eine fehlende Reaktion der Inkubationskontrolle oder ein Fehlen von Banden bei
den Positivkontrollen, so dass diese die unter Punkt 11. genannten Forderungen
nicht mehr erfüllen, können Hinweise für einen Reagenzienverfall sein. Die Packungen tragen ein Verfallsdatum, nach dessen Erreichen keine Qualitätsgarantie
mehr übernommen werden kann.
9. Sammlung und Lagerung der Proben
Der RIDA® Blot Parvovirus B19 kann mit Serum oder Plasma durchgeführt werden. Hitzeinaktivierte Proben können zu erhöhten Hintergrundreaktionen führen.
Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben ist unbedingt zu vermeiden,
ebenso mikrobielle Kontamination. Die Verwendung von lipämischen, hämolytischen oder trüben Proben kann eine dunkle Hintergrundfärbung der Streifen hervorrufen. Diese Proben können darüber hinaus zu verfälschten Ergebnissen führen und sollten daher nicht verwendet werden.
Sollte die Bestimmung nicht sofort erfolgen, kann das Probenmaterial bis zu zwei
Wochen bei 2 – 8 °C aufbewahrt werden. Eine längere Lagerung der Proben ist
durch Aufbewahrung bei –20 °C oder tiefer möglich.
10. Testdurchführung
10.1. Allgemeines
Vor Testbeginn müssen alle Kitkomponenten für mindestens 30 Minuten auf
Raumtemperatur gebracht werden. Das Röhrchen mit den Teststreifen ist erst anschließend zu öffnen, um eine Kondenswasserbildung zu vermeiden. Die nicht
benötigten Streifen verbleiben im Röhrchen und werden weiterhin bei 2 - 8°C ge8
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lagert (Röhrchen wieder gut verschließen, Teststreifen dürfen vor Versuchsbeginn
nicht feucht werden!).
Es sollte nur soviel Reagenz entnommen werden, wie für die Durchführung des
Tests benötigt wird. Überschüssiges Reagenz darf nicht in die Gefäße zurückgegeben werden, da dies zu einer Kontamination führen kann.
Reagenzien und Streifen dürfen nicht verwendet werden, wenn die Verpackung
beschädigt ist oder die Gefäße undicht sind.
Die Streifen müssen nicht in der Reihenfolge ihrer Nummerierung eingesetzt werden. Es ist aber genau darüber Protokoll zu führen, welcher Streifen mit welcher
Probe inkubiert wird.
Die Reproduzierbarkeit von Western Blot Ergebnissen hängt in starkem Maße
vom gleichmäßigen Waschen der Streifen ab. Die unten beschriebenen Waschsequenzen sollten deshalb immer eingehalten werden.
Achtung!
Die kleinen Reagenzgefäße sollten vor dem Öffnen ganz kurz zentrifugiert
werden, damit sich die Flüssigkeit auf dem Boden des Gefäßes sammelt und
keine Verluste entstehen.
10.2. Herstellung des gebrauchsfertigen Wasch- / Verdünnungspuffers
Das Puffer-Konzentrat enthält eine lösliche Proteinkomponente. Das Konzentrat
sollte vor dem Verdünnen kurz geschüttelt werden, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Der verdünnte Puffer wird zum Waschen, für die Probenverdünnung und die Herstellung der Konjugatlösungen benötigt.
Der Wasch- / Verdünnungspuffer ist stets frisch anzusetzen. Das benötigte Volumen ist für die Anzahl durchzuführender Tests zu bestimmen. Der verdünnte
Wasch- / Verdünnungspuffer ist nicht haltbar. Nicht benötigter Puffer muß verworfen werden.
Ein Teil des Pufferkonzentrats wird mit vier Teilen deionisiertem Wasser
verdünnt (Verdünnung 1:5).
Tabelle 1: Wasch- / Verdünnungspuffer pro eingesetzte Streifen
eingesetzte
Streifen
Wasch- / Verdünnungspuffer-Konzentrat
deionisiertes
Wasser
gebrauchsfertiger
Puffer
2
5
10
15
20
10 ml
25 ml
50 ml
75 ml
100 ml
40 ml
100 ml
200 ml
300 ml
400 ml
50 ml
125 ml
250 ml
375 ml
500 ml
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10.3. Erste Inkubation
Eine der Bestimmungszahl entsprechende Anzahl Vertiefungen der Inkubationswannen wird mit je 2 ml des gebrauchsfertigen Wasch- / Verdünnungspuffers gefüllt. Pro Bestimmung wird ein Blotstreifen mit einer Pinzette dem Röhrchen entnommen (Streifen dabei nur am Ende mit der Nummerierung anfassen) und in
den Puffer eingetaucht. Der Streifen muß vollkommen mit Puffer benetzt sein.
Die Streifennummerierung muss nach oben zeigen.
20 µl der unverdünnten Probe (Serum oder Plasma) oder der jeweiligen schwach
positiven Kontrolle bzw. der Negativkontrolle werden in die entsprechenden Vertiefungen gegeben. Die schwach positiven Kontrollen müssen entsprechend der
Untersuchung (IgM oder IgG) bei jedem Versuchsansatz unabhängig von der Zahl
der zu testenden Seren mit geführt werden. Es ist darauf zu achten, daß es zu
keiner Kontamination benachbarter Vertiefungen und damit zu möglicherweise
falsch positiven Resultaten kommt. Während der Inkubation sollten die Wannen
mit den beigefügten Deckeln abgedeckt werden.
Die Blotstreifen werden mit der Probe unter leichtem Schütteln über Nacht (10 bis
16 Stunden) bei Raumtemperatur (18 – 25 °C) inkubiert.
10.4. Waschen
Die Inkubationslösung wird aus den Vertiefungen abgesaugt, vorzugsweise mit
einer Absaugpumpe mit angeschlossener Desinfektionsfalle. Jeder Streifen wird
dann viermal 5 Minuten mit je 2 ml gebrauchsfertigem Wasch- / Verdünnungspuffer unter leichtem Schütteln gewaschen. Zwischen den einzelnen Waschschritten
wird der Puffer aus den Vertiefungen abgesaugt.
Achtung!
Während des letzten Waschschrittes ist die Konjugatlösung herzustellen.
10.5. Herstellung der Konjugatlösung
Das Konjugat liegt im Kit in konzentrierter Form vor. Für die Verwendung im Test
ist hiervon eine Verdünnung mit dem gebrauchsfertigen Wasch- / Verdünnungspuffer herzustellen. Da das verdünnte Konjugat nur eine begrenzte Stabilität aufweist ist es jeweils unmittelbar vor der Verwendung frisch anzusetzen.
10.5.1. IgM-Konjugat
Für die Bestimmung von IgM-Antikörpern ist von dem im Kit befindlichen Antihuman IgM-Konjugat eine 1:501 Verdünnung herzustellen. Die hierfür benötigten
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Volumina für die entsprechende Anzahl von Streifen sind der Tabelle 2 zu entnehmen.
Tabelle 2: Herstellung der gebrauchsfertigen IgM-Konjugatlösung
eingesetzte
Streifen
Konjugat-Konzentrat
gebrauchsfertiger
Wasch- / Verdünnungspuffer
2
4
8
16
20
10 µl
20 µl
40 µl
80 µl
100 µl
5 ml
10 ml
20 ml
40 ml
50 ml
10.5.2. IgG-Konjugat
Für die Bestimmung von IgG-Antikörpern ist von dem im Kit befindlichen Antihuman IgG-Konjugat eine 1:1001 Verdünnung herzustellen. Die hierfür benötigten
Volumina für die entsprechende Anzahl von Streifen sind der Tabelle 3 zu entnehmen.
Tabelle 3: Herstellung der gebrauchsfertigen IgG-Konjugatlösung
eingesetzte
Streifen
Konjugat-Konzentrat
gebrauchsfertiger
Wasch- / Verdünnungspuffer
2
4
8
16
20
5 µl
10 µl
20 µl
40 µl
50 µl
5 ml
10 ml
20 ml
40 ml
50 ml
10.6. Zweite Inkubation
Zu jedem Streifen werden 2 ml der entsprechenden gebrauchsfertigen Konjugatlösung pipettiert. Danach werden die Streifen eine Stunde unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert.
10.7. Waschen
Waschsequenz gemäß Pkt. 10.4.
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10.8. Dritte Inkubation
Zu jedem Streifen werden 2 ml des gebrauchsfertigen Substrats pipettiert. Die
Streifen werden 5 - 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bis die Intensität
auf den Streifen, die mit den schwach positiven Kontrollen inkubiert wurden, den
unter Punkt 11. genannten Forderungen entspricht. Danach wird das Substrat abgesaugt. Zum Stoppen der Färbereaktion werden die Streifen in den Wannen
dreimal mit deionisiertem Wasser abgespült.
Die Streifen werden vorsichtig mit einer Pinzette den Wannen entnommen und
zum Trocknen zwischen saugfähiges Papier gelegt. Nach dem Trocknen können
die Streifen ausgewertet werden.
Achtung!
Bei hoch positiven Seren kann es zu einer Überreaktion der Färbung kommen. Es wird empfohlen, bei solchen Streifen die Färbung vorzeitig zu beenden.
Zusammenfassung der Testdurchführung
1. Alle Reagenzien werden auf Raumtemperatur gebracht
2. In jede Vertiefung werden 2 ml Verdünnungspuffer pipettiert
3. Pro Vertiefung wird ein Streifen in den Puffer gelegt
4. Zugabe von 20 µl Probe, schwach positiver oder Negativkontrolle
5. Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht (10 - 16 h)
6. 4maliges Waschen mit 2 ml Waschpuffer; Verweildauer je 5 Min.
7. Zugabe von 2 ml frisch hergestellter Konjugatlösung
8. 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur
9. 4maliges Waschen mit 2 ml Waschpuffer; Verweildauer je 5 Min.
10. Zugabe von 2 ml Substrat
11. 5 - 15 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur
12. Spülen der Streifen mit deionisiertem Wasser
13. Trocknen auf Filterpapier
14. Auswertung
11. Auswertung
Zur Überprüfung der Funktion des Testkits dienen die schwach positiven Kontrollen, die bei jeder Testdurchführung mitgeführt werden müssen, die Negativkontrolle sowie die Inkubations-Kontrollbande, die auf jedem Streifen vorhanden ist.
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Die Inkubations-Kontrollbande befindet sich unterhalb der Numerierung; sie besteht aus Protein A, das Globuline bindet, und muß deshalb bei korrekter Durchführung auf jedem Streifen sichtbar werden.
Bei korrekter Durchführung sollte bei der schwach positiven IgG Kontrolle die
Bande VP-N schwach, aber deutlich sichtbar sein; die Bande VP-C erscheint viel
schwächer und relativ breit und diffus. Die Bande VP-1S reagiert mit diesem Serum nur sehr schwach oder gar nicht.
Bei der schwach positiven IgM Kontrolle ist die Bande VP-N relativ deutlich sichtbar und die Bande VP-C nur sehr schwach. Bei der Negativkontrolle sollte neben
der Inkubations-Kontrollbande keine weiter Bande sichtbar sein.
Sollten die vorgegebenen Bedingungen nicht erfüllt sein, ist vor einer Testwiederholung folgendes zu überprüfen:
− Haltbarkeit der verwendeten Reagenzien
− Funktionsfähigkeit der eingesetzten Geräte (z. B. Kalibrierung)
− Korrekte Testdurchführung
− Visuelle Kontrolle der Kitkomponenten auf Kontamination oder Undichtigkeit
Sind nach Testwiederholung die Bedingungen wiederum nicht erfüllt, wenden Sie
sich bitte an den Hersteller.
Zur besseren Dokumentation können die Streifen auf den beigelegten Protokollblättern aufgeklebt und die identifizierten Banden notiert werden. Die Protokollblätter sind mit Datum und Chargen-Nummer zu versehen.
Zur Auswertung der Patientenprobe wird die Inkubations-Kontrollbande der Teststreifen mit der Kontrollbande des Streifens auf der Auswerteschablone in Übereinstimmung gebracht. Anhand der auf der Auswerteschablone vorhandenen
Bandenbezeichnungen können dann die bei den Patientenproben sichtbaren Banden identifiziert werden. Die Intensität der identifizierten Banden wird mit der Intensität der Banden auf den Streifen mit der jeweiligen schwach positiven Kontrolle (IgM oder IgG) verglichen. Aufgrund dieses Vergleiches wird analog zur
nachfolgenden Tabelle die Intensität der einzelnen Banden ermittelt und auf dem
Protokollblatt notiert.
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Tabelle 4: Auswertung der Bandenintensität
Bandenintensität
Bewertung
-
nicht sichtbar
+/-
sehr schwache Intensität
+
schwache Intensität
(ähnlich der schwach positiven Kontrolle)
gut sichtbare Intensität
++
starke Intensität
+++
11.1. Auswertung IgM-Nachweis
Für die Positiv-/Negativ-Bewertung im Falle des IgM-Nachweises wird eine eventuell vorhandene Reaktivität von Antikörpern gegen das NS-1-Protein nicht berücksichtigt.
Tabelle 5: IgM-Auswertung
IgM positiv
und
VP-N mind. +
VP-C mind. +/-
andere Banden können,
müssen aber nicht erscheinen
IgM fraglich
IgM negativ
VP-N mind. +
oder VP-C mind. +
oder VP-N u. VP-C +/-
keine Reaktion oder
andere Konstellationen
andere Banden können,
müssen aber nicht erscheinen
11.2. Auswertung IgG-Nachweis
Für die Positiv-/Negativ-Bewertung im Falle des IgG-Nachweises wird eine vorhandene Reaktivität von Antikörpern gegen das NS-1-Protein nicht berücksichtigt.
Tabelle 6: IgG-Auswertung
IgG positiv
VP-N mind. +
andere Banden können,
müssen aber nicht erscheinen
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IgG fraglich
IgG negativ
VP-C mind. +
oder VP-N u. VP-C +/andere Banden können,
müssen aber nicht erscheinen
keine Reaktion oder
andere Konstellationen,
besonders schwache, isolierte Reaktion gegen
VP-1S
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11.3. Auswertung der Reaktivität gegen NS-1
Da Antikörper gegen dieses Protein nach heutigem Wissensstand nur bei persistierenden Parvovirus B19-Infektionen auftreten, wird eine Reaktivität gegen das
NS-1 nicht für eine positive Bewertung des Western Blots herangezogen. Bisher
wurden nur IgG-Antikörper gegen das NS-1 identifiziert, die frühestens sechs bis
acht Wochen nach einer Infektion gefunden werden.
Ein vorhandene Reaktivität gegen das NS-1 kann somit als ein Hinweis auf eine
möglicherweise persistierende Infektion bewertet werden.
12. Hinweise zur Testdurchführung und Interpretation
12.1. Diagnostische Bedeutung rekombinanter B19 Antigene
Das Parvovirus B19 Genom mit einer Größe von ca. 5,4 kb enthält die genetische
Information für zwei Strukturproteine und ein Nicht-Strukturprotein (siehe Abb. 1).
Aus den beiden Strukturproteinen VP1 und VP2 wird das Kapsid gebildet, das die
DNA umgibt. Die beiden Strukturproteine mit Größen von 84 kD und 58 kD sind in
einem gemeinsamen Leserahmen auf dem viralen Genom kodiert, wobei das
kleinere VP2 einen späteren Transkriptionsstart im Leserahmen von VP1 besitzt.
Das bedeutet, daß beide Proteine bis auf einen zusätzlichen N-terminalen, etwa
26 kD großen Teil von VP1, identisch sind. Das Nicht-Strukturprotein (NS-1) mit
einer Größe von ca. 77 kD ist für die Virusreplikation und Vermehrung nötig.
Die Unterteilung des Strukturproteins VP1 im RIDA® Blot in zwei Segmente erlaubt eine genauere Interpretation einer vorhandenen Immunantwort. Nach Erstinfektion werden zu Beginn der Immunantwort neben IgM-Antikörpern im allgemeinen IgG-Antikörper gegen lineare Epitope der Strukturproteine VP1 und VP2
gebildet. Antikörper gegen die linearen Epitope am N-terminalen Ende der Strukturproteine (VP-N im RIDA® Blot) bleiben in der Regel ein Leben lang erhalten.
Antikörper gegen die linearen Epitope am C-terminalen Ende der Strukturproteine
(VP-C) nehmen im Verlaufe von 6 - 12 Monaten jedoch deutlich ab oder gehen
sogar ganz verloren. Eine starke IgG-Reaktivität gegen das VP-C deutet somit auf
eine frische oder erst kurz zurückliegende Infektion hin.
12.2. Interpretation
Ein negatives Ergebnis im Immunoblot kann eine Infektion mit Parvovirus B19
nicht ausschließen. Zu einem sehr frühen Zeitpunkt der Infektion kann die Immunantwort noch so niedrig ausfallen, daß ein serologischer Nachweis nicht möglich ist. In diesem Fall sollte bei bestehendem klinischen Verdacht ebenso wie bei
einem fraglichen Ergebnis im Immunoblot nach einer Woche ein Folgeserum
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untersucht werden. Ist dann keine deutliche Serokonversion zu sehen, ist eine
Parvovirus B19-Infektion mit großer Wahrscheinlichkeit auszuschließen.
Struktur des Parvovirus-Genoms:
5’
3’
NS-1
VP1
VP2
im RIDA Blot verwendete Antigene:
VP-N
NS-1
VP-1S
VP-C
Abb.1: Struktur des Parvovirus-Genoms und rekombinant hergestellte Antigene
Bei einem positiven oder schwach positiven Befund im IgM-Nachweis sollte
grundsätzlich auch der IgG-Befund zur Interpretation herangezogen werden. Neben den Banden VP-N und VP-1S reagiert bei einer Frischinfektion in der Regel
auch die Bande VP-C stark. Falls keine IgG-Reaktivität gegen VP-C vorhanden
ist, kann eine frische Infektion mit großer Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen
werden. Eine schwache IgM-Reaktivität kann dann durch persistierende IgM-Antikörper einer schon länger zurückliegenden Infektion, durch reaktivierte IgM-Antikörper z. B. bei einer EBV-Infektion oder durch sich unspezifisch anlagernde Antikörper verursacht werden.
Eine deutliche IgG-Reaktivität gegen VP-C bei negativem IgM-Befund deutet auf
einen kurz zurückliegenden (höchstens 6 - 12 Monate) Infektionszeitpunkt hin.
Eine Reaktivität gegen das NS-1 sollte nur bei bestimmten Fragestellungen in die
Interpretation mit einbezogen werden. Bei der Abklärung unklarer Arthropathien
zum Beispiel kann der Nachweis von Antikörpern gegen dieses Protein ein Hinweis auf eine persistierende Parvovirus B19-Infektion sein. Da diese Antikörper
erst sechs bis acht Wochen nach Infektion nachweisbar sind, deuten sie auf ein
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RIDA® Blot Parvovirus B19
03-11-11
persistierendes Krankheitsgeschehen hin und lassen in einem gewissen Rahmen
Rückschlüsse auf den Infektionszeitpunkt zu. Da Antikörper gegen das NS-1 auch
nach überstandener Infektion noch vorhanden sein können (in einer Studie wurde
bei 24,7 % der Seren eine teilweise allerdings sehr schwache Reaktivität gegen
das NS-1 gefunden), ist der Nachweis dieser nicht als Beweis für eine Persistenz
ausreichend. Deshalb sollte bei entsprechendem klinischen Verdacht der Nachweis von Parvovirus-Antigen oder -DNA zur Sicherung der Diagnose herangezogen werden. Hierbei ist zu berücksichtigen, daß eine PCR-Bestimmung nicht zu
jedem Zeitpunkt eines persistierenden Krankheitsverlaufes positiv ausfallen muß.
Bei der Beurteilung der Reaktivität gegen das NS-1 ist zu beachten, daß in Abhängigkeit von der individuellen Immunantwort auch Antikörper gegen das NS-1
verzögert auftreten können.
12.3. Typische Reaktionsprofile im RIDA® Blot Parvovirus B19
Aufgrund bisher durchgeführter Evaluierungen können die folgenden IgM/IgG-Reaktionsmuster einen Hinweis auf einen bestimmten Parvovirus B19-Status geben.
Es muß darauf hingewiesen werden, daß es sich hierbei um typische Reaktionsmuster handelt, von denen es durchaus Abweichungen geben kann.
Tabelle 7: Parvovirus B19-Status und typische Antikörpermuster
IgM
IgG
möglicher B19-Status
negativ
VP-N eindeutig reaktiv,
evtl. auch VP-1S;
VP-C sehr schwach oder
negativ
lange zurückliegende Infektion (Jahre)
negativ, fraglich oder
schwach positiv
VP-N und VP-C stark reaktiv, evtl. auch VP-1S
Status nach Infektion
(Monate)
VP-N und VP-C deutlich
reaktiv
VP-N und VP-C stark reaktiv, evtl. auch VP-1S
Status nach Infektion
(Wochen)
VP-N und VP-C deutlich
reaktiv
negativ, fraglich oder
schwach positiv
Status zu einem frühen
Zeitpunkt der Infektion
VP-N und/oder VP-C
(evtl. VP-1S) schwach
oder fraglich reaktiv
VP-N und VP-C schwach unklarer Status, evtl.
reaktiv
verursacht durch unspezifische Reaktivierung;
Test sollte im zeitlichen
Verlauf wiederholt werden
RIDA® Blot Parvovirus B19
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Achtung!
Die Bewertung von Titern gegen das NS-1 zur Abklärung persistierender
Parvovirus B19-Infektionen, reaktiven Arthropathien, chronischen Anämien
oder anderer Symptomatik mit Verdacht auf eine B19-Persistenz wurde in
der o. a. Tabelle nicht berücksichtigt, da hier abhängig von Dauer, Klinik
und Immunkompetenz eine Vielzahl von Kombinationen möglich ist. Weiterhin kann ein entsprechender Titer nur in Zusammenhang mit der klinischen
Symptomatik beurteilt werden. Die Diagnose muß durch einen positiven
Antigen- oder Genom-Nachweis abgesichert werden.
13. Leistungsmerkmale
13.1. Vergleichsdaten mit einem kommerziell erhältlichen ELISA
Tab. 8: IgG-Vergleich
RIDA® Blot Parvovirus B19 IgG
negativ (%)
fraglich (%)
positiv (%)
gesamt (%)
IgG-ELISA
negativ (%)
7
(7,8)
0
(0,0)
0
(0,0)
7
(7,8)
fraglich (%)
4
(4,4)
0
(0,0)
6
(6,7)
10
(11,1)
positiv (%)
5
(5,6)
1
(1,1)
67
(74,4)
73
(81,1)
gesamt (%)
16
(17,8)
1
(1,1)
73
(81,1)
90 (100,0)
Tab. 9: IgM-Vergleich
RIDA® Blot Parvovirus B19 IgM
negativ (%)
fraglich (%)
positiv (%)
gesamt (%)
IgM-ELISA
18
negativ (%)
34
(37,8)
2
(2,2)
0
(0,0)
73
(81,1)
fraglich (%)
5
(5,6)
1
(1,1)
0
(0,0)
10
(11,1)
positiv (%)
9
(10,0)
4
(4,4)
35
(38,9)
7
(7,8)
gesamt (%)
48
(53,3)
7
(7,8)
35
(38,9)
90 (100,0)
RIDA® Blot Parvovirus B19
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13.2. Zeitpunkt des Auftretens von Antikörpern gegen das NS-1
Für diese Fragestellung wurden 82 Serumproben von Frauen mit einer Parvovirus
B19-Infektion während der Schwangerschaft untersucht. Die Probennahme lag
zwischen zwei Wochen und neun Monaten nach Infektion. In allen Fällen konnte
das typische Reaktionsmuster (VP-N und VP-C im IgG stark reagierend, IgM zeitweise positiv) gefunden werden. IgM-Titer gegen das NS-1 traten in keinem Fall
auf. IgG-Titer gegen das NS-1 wurden frühestens sechs Wochen nach Infektion
gefunden. Diese traten in 32% der untersuchten Fälle auf.
13.3. Häufigkeit von IgG-Titern gegen das NS-1 in der Normalbevölkerung
197 Proben von Blutspendern und 300 Proben von Frauen (getrennt nach Altersgruppen) wurden auf IgG-Titer gegen das NS-1 untersucht.
Tabelle 10: Häufigkeit von IgG-Titern
Blutspender 20 - 29 J. 30 - 39 J. 50 - 59 J.
Anzahl der Seren
gesamt
197
99
101
100
497
B19 positiv
75,1%
64,6%
62,3%
69,0%
69,2%
NS-1 positiv *
27,7%
37,7%
30,1%
2,9%
24,7%
* auch sehr schwache Reaktivitäten wurden in die Auswertung mit einbezogen
RIDA® Blot Parvovirus B19
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RIDA® Blot Parvovirus B19
Immunoblot with recombinant antigens for the detection
of antibodies (IgM/IgG) against the human parvovirus B19
1. Intended use
For in vitro diagnostic use. The RIDA® Blot Parvovirus B19 is a qualitative in-vitro
test for the detection and identification of antibodies (IgM and IgG) against the
parvovirus B19 in human serum or plasma. Due to the electrophoretic separation
of recombinant components of the virus protein, this test procedure, in contrast to
others, allows a statement about the presence of different antibodies which in
return can be correlated to the different stages of the illness.
2. General
The human parvovirus B19 was discovered by Cossart and co-workers in England
in 1975. They discovered the virus while screening the sera of blood donors for
hepatitis B. They named this accidentally found isolate B19.
The parvovirus B19 is a small, non-enveloped DNA virus with a diameter of 18 26 nm. The genome consists of single-stranded DNA with a length of 5.4 kb. The
capsid consists of two polypeptide proteins of about 84 and 58 kD (VP1 and VP2).
Both structural proteins are encoded in a common reading frame on the viral genome, whereby the shorter VP2 has a later transcription start in the reading frame
of the VP1 (see pt. 12). This means that both proteins are identical, except for one
additional N-terminal part of VP1 which has a size of approximately 26 kD. Furthermore, a „main-non-structure protein“ (NS-1) is encoded in the genome; it is
necessary for the virus replication and multiplication. The B19 virus has an icosaedrical structure and is very heat-stable. It can sustain a temperature of 60°C for
up to 12 h.
The genus of the parvoviruses comprises - beside the only known human parvovirus B19 - animal pathogens like the canine parvovirus and the feline panleukopenia virus. Together with the denso viruses and the dependo viruses, that need
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RIDA® Blot Parvovirus B19
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helper viruses (adeno or herpes viruses) for replication, the parvoviruses form the
family of parvoviridae.
One significant characteristic of the parvoviruses is their ability to selectively replicate in self-dividing cells such as bone marrow, intestinal and embryonic cells.
Infections with the worldwide distributed human parvovirus B19 occur more frequently during the winter and early summer seasons. It may arise to epidemic
outbreaks especially in day care and schools. The transmission is mainly caused
via the respiratory system (droplet infection), but it can also be transmitted by
blood and blood products. Parvovirus infections occur in all age groups, but are
most common between the ages of 6 and 15 years. The prevalence increases
with age and reaches a value of 40 - 70% for adults. Women show a higher prevalence than men.
The incubation time lasts 1 - 3 weeks. The viremic phase in which the patient is
considered infectious, is limited to 3 - 7 days. During this time, the patient can be
asymptomatic or he can complain about some prodromal illnesses such as headache, itchiness, myalgia and fever. Approximately two weeks after infection, an
erythema infectiosum (fifth disease) can occur. Children usually show typical exanthemas (redness of cheeks, lattice-like febrile purpura especially along the extensor surfaces of the extremities), but these are rather untypical for adults. Further symptoms of a B19 infection are arthralgias and arthritis (60%), respiratory
symptoms (22%) as well as diarrhea (15 - 35%). Only approximately 20% of all
parvovirus B19 infections are symptomless. Women are affected by joint pain
twice as much as men. In most cases, the arthropathies disappear within two to
four weeks. In a few cases, the symptoms can persist intermittently over years. So
that if chronic arthropathies should be verified, a persistent parvovirus B19 infection must also be considered.
The inhibition of erythropoiesis (duration 1 - 4 weeks), which is caused by parvovirus B19, usually remains subclinical in healthy persons, but it can cause an
aplastic crisis in patients with chronic hemolytic anaemia (sickle cell anaemia,
thalassaemia, pyruvate kinase deficiency, spherocytosis, autoimmune hemolytic
anaemia). Such patients require transfusions and should be submitted to a hospital. Additional organ manifestations such as hepatic dysfunctions or a B19 associated myocarditis have also been reported recently.
A further complication following a B19 infection can occur in sero-negative pregnant women. The parvovirus B19 can be transmitted via the placenta to the fetus.
Due to the short viability of the erythrocytes up to the 20th week of pregnancy and
a missing efficient immune defense, an infection can lead to a severe acute or
chronic anaemia and subsequent spontaneous abortion. A further complication
after infection during the second trimenon, is the development of a hydrops fetalis.
However, more than 80% of the pregnancies course without complications. Embryopathies have not been observed so far.
RIDA® Blot Parvovirus B19
03-11-11
21
Antibodies of the IgM group can be detected approximately 10 days after the infection and usually occur with the beginning of the symptoms. IgG antibodies can
already be found some days later and usually remain for life. However, IgM antibodies cannot be detected after 30 - 60 days. Elisa systems, on the basis of recombinant VP1/VP2 peptides, are suitable for the detection of such antibodies.
Because of a more specific statement regarding the possible stages of the illness,
due to the detection of different antibodies, a Western Blot such as the RIDA®
Blot Parvovirus B19, which uses different recombinantly produced proteins of the
virus antigen, should always be used additionally.
3. Test principle
The RIDA® Blot Parvovirus uses four recombinant parvovirus B19 antigens, which
are produced in E. coli. This involves parts of the two structural proteins, VP1 and
VP2, and the „main-non-structure protein“ NS-1 (see pt. 12.).
The cleaned (free of fusion proteins), recombinant antigens were electrophoretically separated by molecular weight and blotted onto a nitro-cellulose membrane.
Following that, the membrane was cut into individual blot strips. These strips are
incubated with the sample (serum or plasma) that is to be examined. During incubation, the specific antibodies present in the sample will bind to the corresponding
protein bands. After removal of unbound antibodies by a washing step, a second
incubation with anti-human IgM or IgG conjugate (peroxidase) and subsequent
color reaction, specifically bound antibodies against the four antigens of parvovirus B19 become visible as blue bands on the strips.
4. Reagents provided
The reagents are sufficient for 20 determinations.
Each test kit contains:
2 x 10 Teststrips;
coated with recombinant antigens of parvovirus B 19
1 x Washing / Dilution Buffer (100 ml, 5x conc.);
contains Tris buffer, NaCl, Tween-20 and protein
1 x Low Positive IgM Control (80 µl);
red cap
human serum, contains < 0,1 % NaN3
1 x Low Positive IgG Control (80 µl);
white cap
human serum, contains < 0,1 % NaN3
1 x Negative Control (80 µl);
blue cap
human serum, contains < 0,1 % NaN3
22
RIDA® Blot Parvovirus B19
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1 x Anti-human IgM Conjugate (100 µl, 500x conc.);
rabbit, horseradish peroxidase conjugated,
contains < 0,1 % NaN3
1 x Anti-human IgG Conjugate (60 µl, 1000x conc.);
rabbit, horseradish peroxidase conjugated,
contains < 0,1 % NaN3
1 x Substrate (45 ml);
ready to use, contains tetramethylbenzidine (TMB)
2 x Incubation plates with 10 chambers each
1 x Control strip (developed, specific for the kit)
1 x Instructions for use
2 x Protocol sheets
violet cap
green cap
5. Materials required but not provided
5.1. Reagents
− Deionized water
5.2. Accessories
− Vacuum pump to remove liquid out of the incubation chambers
− Pipets for 2 - 10 µl, 10 - 100 µl and 2 ml
− Measuring cylinder for 100 ml and 500 ml
− Shaker
− Plastic tweezers to handle the strips
6. Warnings and precautions for the users
For in vitro diagnostic use only.
The test has to be used only by experienced laboratory staff. Please refer to
guidelines for safety regulations in medical laboratories. The test protocol must be
followed strictly.
Do not mouth pipette samples or reagents. Avoid contact with injured skin or mucous membranes. Wear disposable gloves while handling samples and wash
hands after assay is complete. Do not smoke, eat or drink in areas where specimen or kit reagents are handled.
The control sera (Positive and Negative Control) of the kit have been tested for
HIV 1+2- and HCV-Ab as well as for HBsAg and were found to be negative. How-
RIDA® Blot Parvovirus B19
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ever, the controls as well as the patient samples should be considered potentially
infectious and be treated with respect to the given national safety precautions.
The conjugates and the controls contain NaN3. Contact with skin or mucous membranes should be avoided. Contact with lead or copper pipes can form explosive
metal azides.
All reagents and materials coming in contact with potential infectious specimens
must be treated with disinfectants or autoclaved at 121°C for at least one hour.
7. Storage instructions
All reagents have to be stored at 2 - 8°C and can be used up to the expiry date
printed on the labels. Reagents from kits with different lot numbers should not be
interchanged. Microbial contamination has to be avoided. The concentrated conjugates and the buffer have to be diluted freshly in required amounts.
8. Indication of instability or deterioration of reagents
Deterioration of reagents can be indicated by a missing reaction of the incubation
control or absence of bands with the Positive Controls so that they do not comply
with the criteria shown in point 11. The packages have an expiry date after which
a quality warranty cannot be given.
9. Specimen collection and storage
The RIDA® Blot Parvovirus B19 can be carried out with serum or plasma. Heat
inactivated samples can lead to higher background reactions. Repeated freezing
and thawing of the samples as well as microbial contamination must be avoided.
The application of lipemic, hemolytic or turbid samples can cause a dark background coloration of the strips. Furthermore, these samples can lead to false results and should not be used.
The samples can be stored for up to 2 weeks at 2 - 8°C if the test cannot be carried out immediately. A prolonged storage of samples is possible at -20°C.
10. Test procedure
10.1. Preliminary comments
Bring all kit components to room temperature prior to use for at least 30 minutes.
The vial containing the strips should be opened thereafter to avoid formation of
condensed water. The strips that are not required remain in the vial and continue
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RIDA® Blot Parvovirus B19
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to be stored at 2 - 8°C (vial should be closed tightly, strips have to remain dry prior
to use!).
Remove only the volume of reagents that is needed for test procedure. Do not
pour reagents back into vials as reagent contamination may occur.
Strips and reagents must not be used if pouch is damaged or vials are leaking.
The strips do not have to be used in their order of numeration. But it is important
to keep a record about which strip is incubated with the corresponding sample.
The reproducibility of the Western Blot results depend very strongly on the consistency of washing the strips. The washing steps described below should always
be adhered to.
Attention!
The small test tubes should be centrifuged for a short time before opening,
so that the liquid can collect on the bottom of the tube and nothing is lost.
10.2. Preparation of the ready to use Washing / Dilution Buffer
The concentrated buffer contains soluble protein. Prior to use, it should be shaken
to ensure a homogenous dispersion. The buffer is used for the sample dilution,
and the preparation of conjugate solutions.
The Washing / Dilution Buffer has always to be prepared freshly. The required
volume for the corresponding number of tests must be determined. The diluted
Washing / Dilution Buffer is not stable. Unused buffer must be disposed of.
One part of concentrated buffer is diluted with four parts deionized water
(dilution 1:5).
Table 1: Washing-/Dilution Buffer per applied strip
applied strips
concentrated
Washing / Dilution
Buffer
deionized water
ready to use
buffer
2
5
10
15
20
10 ml
25 ml
50 ml
75 ml
100 ml
40 ml
100 ml
200 ml
300 ml
400 ml
50 ml
125 ml
250 ml
375 ml
500 ml
10.3. First Incubation
For each determination, use one chamber of the incubation plate and fill it with
2 ml diluted Washing / Dilution Buffer. For each determination, one blot strip is
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taken out of the vial with a pair of tweezers (touch the strips at the end with the
numeration only). Dip the strips into the buffer. The strips must be completely
wetted with buffer.
The strip numeration must show upwards.
20 µl of the undiluted sample (serum or plasma) or of the respective Low Positive
Controls and of the Negative Control are added to the corresponding chambers.
The Low Positive Controls must be carried out with each test run, independent on
the number of sera to be tested. It must be taken care that the neighboring chambers are not contaminated since this could lead to false positive results. During
the incubation, the incubation plates should be covered up with the lids that are
enclosed in the test kit.
The blot strips with the sample are placed on a horizontal shaker and are incubated overnight (10 to 16 hours) at room temperature (18 - 25°C).
10.4. Washing
Remove the solution (via suction), preferably with an attached disinfection trap.
Wash the strips for 5 min by addition of 2 ml diluted Washing / Dilution Buffer to
each strip. Place the incubation plate on the shaker. Repeat the procedure three
times. Between the washing steps, the buffer is sucked out of the chambers.
Attention!
The conjugate solution must be prepared during the last washing step.
10.5. Preparation of the conjugate solution
The conjugate enclosed in the kit is provided as a concentrate. For its application
to the test, it must be diluted with the ready to use Washing / Dilution Buffer. Since
the diluted conjugate is stable only for a limited period of time, it must be prepared
freshly prior to its application.
10.5.1. IgM conjugate
For the determination of IgM antibodies, a 1:501 dilution must be prepared with
the Anti-human IgM Conjugate enclosed in the kit. The required volumes for the
corresponding number of strips are listed in Table 2.
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RIDA® Blot Parvovirus B19
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Table 2: Preparation of the ready to use IgM conjugate solution
applied strips
concentrated
Anti-human IgM Conjugate
ready to use
Washing / Dilution Buffer
2
4
8
16
20
10 µl
20 µl
40 µl
80 µl
100 µl
5 ml
10 ml
20 ml
40 ml
50 ml
10.5.2. IgG conjugate
For the determination of IgG antibodies, a 1:1001 dilution must be prepared with
the Anti-human IgG Conjugate enclosed in the kit. The required volumes for the
corresponding number of strips are listed in Table 3.
Table 3: Preparation of the ready to use IgG conjugate solution
applied strips
concentrated
Anti-human IgG Conjugate
ready to use
Washing / Dilution Buffer
2
4
8
16
20
5 µl
10 µl
20 µl
40 µl
50 µl
5 ml
10 ml
20 ml
40 ml
50 ml
10.6. Second incubation
Add 2 ml of the corresponding ready to use conjugate solution to each strip. Incubate the strips for one hour on a horizontal shaker at room temperature.
10.7. Washing
Washing sequence: see point 10.4.
10.8. Third incubation
Add 2 ml of the ready to use Substrate solution to each strip. Incubate the strips
for 5 - 15 min at room temperature, until the intensity of the bands of the Low
Positive Controls is complying to the criteria given in point 11. Thereafter, the
Substrate is removed via suction. Still in their chambers, the strips should be
rinsed three times with deionized water to stop the color reaction.
RIDA® Blot Parvovirus B19
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The strips are carefully taken out of the chambers with tweezers. To dry the strips,
they are placed between filter paper. After drying they can be evaluated.
Attention!
Highly positive sera can induce an overshooting color reaction. It is recommended to stop the reaction prematurely with these sera
Summary of the test procedure
1. Bring all reagents to room temperature
2. Pipet 2 ml Washing / Dilution Buffer into each chamber
3. Place one strip into each chamber
4. Add 20 µl sample, Low Positive or Negative Control
5. Incubate overnight at room temperature (10 - 16 h)
6. Wash 4 times with 2 ml Washing / Dilution Buffer; 5 min each time
7. Add 2 ml freshly prepared conjugate solution
8. Incubate for 1 hour at room temperature
9. Wash 4 times with 2 ml Washing / Dilution Buffer; 5 min each time
10. Add 2 ml Substrate
11. Incubate for 5 - 15 min at room temperature
12. Rinse strips with deionized water
13. Dry on filter paper
14. Analysis
11. Analysis
The function of the testkit is checked by Low Positive Controls which have to be
included in each test procedure, by the Negative Control and by the incubation
control band that is present on each strip.
The incubation control band can be found below the numeration. It consists of
protein A which binds globulins and must, therefore, be visible on each strip if the
test performance is correct.
With correct test performance, the Low Positive IgG Control should show a weak
VP-N band, but clearly visible; VP-C shows a much weaker and relatively wide
and diffuse band. The VP-1S band reacts only very weak or not at all with this serum.
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RIDA® Blot Parvovirus B19
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With the Low Positive IgM Control, the VP-N band is relatively clearly visible and
the VP-C band only very weak. The Negative Control should show no other band
except for the incubation control band.
If the expected conditions are not fulfilled please check the following before repeating the test:
− expiration date of the reagents
− calibration of the used instruments
− exact test procedure
− visual examination of kit components for signs of contamination or leakage
If the conditions are not fulfilled after repeating, please contact your local distributor of R-Biopharm.
For better documentation, the strips can be taped to the enclosed protocol sheets
and the identified bands can be recorded. The protocol sheets should include the
date and the lot number.
To analyze the patient sample, the incubation control band of the test strip has to
be aligned with the control band of the strip on the evaluation template. With the
help of the band descriptions on the evaluation template, the visible bands of the
patient samples can be identified. The intensity of the identified bands is compared to the intensity of the bands on the strips with the corresponding Low Positive Controls (IgM or IgG). With this comparison and with the following table, the
intensity of the individual bands is determined and recorded on the protocol sheet.
Table 4: Analysis of the band intensity
Band intensity
Evaluation
-
invisible
+/-
very weak intensity
+
weak intensity
(comparable to the Low Positive Control)
visible intensity
++
strong intensity
+++
11.1. Analysis of IgM detection
For the positive/negative analysis of the IgM detection, a possibly existing reactivity of antibodies against the NS-1 protein is not taken into consideration.
RIDA® Blot Parvovirus B19
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29
Table 5: IgM-Analysis
IgM positive
and
VP-N at least +
VP-C at least +/-
other bands can, but don’t
have to appear
IgM questionable
or
or
VP-N at least +
VP-C at least +
VP-N and VP-C +/-
IgM negative
no reaction or
other constellations
other bands can, but don’t
have to appear
11.2. Analysis of IgG detection
For the positive/negative analysis of the IgG detection, a possibly existing reactivity of antibodies against the NS-1 protein is not taken into consideration.
Table 6: IgG-Analysis
IgG positive
VP-N at least +
other bands can, but don’t
have to appear
IgG questionable
IgG negative
VP-C at least +
VP-N and VP-C +/-
no reaction or
or
other constellations,
other bands can, but don’t especially weak isolated
reactions against VP-1S
have to appear
11.3. Analysis of reactivity against NS-1
Today’s level of knowledge shows that antibodies against this protein only appear
with persistent parvovirus B19 infections. Therefore, a reactivity against the NS-1
is not considered for a positive evaluation of the Western Blot. So far, only IgG
antibodies against the NS-1 have been identified. At the earliest, they were found
six to eight weeks after infection occurs.
An existing reactivity against the NS-1 can thus be considered as indicative for a
possibly persistent infection.
12. Remarks about the test procedure and interpretation
12.1. Diagnostic significance of recombinant B19 antigens
The parvovirus B19 genome with a size of approximately 5.4 kb contains the genetic information of two structural proteins and one non-structure protein (see
fig.1). The capsid which envelops the DNA is formed with the two structural proteins VP1 and VP2. Both structure proteins with a size of 84 kD and 58 kD are en30
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coded on the common reading frame of the viral genome, whereby the smaller
VP2 has a downstream transcription start on the reading frame of VP1. This
means that both proteins are identical except for an additional N-terminal sequence on VP1 which has a size of 26 kD. The non-structure protein (NS-1) with a
size of approximately 77 kD is necessary for the virus replication and multiplication.
In the RIDA® Blot, the structure protein VP1 is subdivided into two segments
which allow an exact interpretation of an existing immune response. After an initial
infection, at the beginning of the immune response, IgM antibodies and usually
also IgG antibodies are formed against linear epitopes of the structure proteins
VP1 and VP2. Antibodies formed against the linear epitopes at the end of the Ntermini of the structure proteins (VP-N in the RIDA® Blot) usually remain for life.
Antibodies formed against the linear epitopes on the end of the C-termini of the
structural proteins (VP-C) are significantly reduced within 6 - 12 months or disappear altogether. A strong reactivity against the VP-C, therefore, indicates a fresh
or just recently obtained infection.
Structure of the Parvovirus genome:
5’
3’
NS-1
VP1
VP2
Antigens used in the RIDA Blot:
VP-N
NS-1
VP-1S
VP-C
Fig. 1: Structure of the Parvovirus genome and recombinant antigens
12.2. Interpretation
A negative result in the immunoblot does not exclude an infection with parvovirus
B19. Very early, at the beginning of the infection, the immune response can be so
weak, that a serological detection is not possible. In this case, if a clinical suspiRIDA® Blot Parvovirus B19
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cion persists or if the result of the immunoblot is questionable, a consecutive serum should be examined after one week. If a distinct seroconversion is not visible,
a parvovirus B19 infection is not likely.
If the result in the IgM detection is positive or weakly positive, the IgG result
should always also be taken into consideration. In addition to the bands VP-N and
VP-1S, the band VP-C usually also reacts very strongly if infection is fresh. If an
IgG reactivity against VP-C is not present, a fresh infection is not likely. A weak
IgM reactivity can be caused by persistent IgM antibodies of a previous infection
by reactivated IgM antibodies, e.g. after an EBV-infection, or by unspecifically
bound antibodies.
A distinct reactivity against VP-C with negative IgM result indicates a recent infection (6 - 12 months).
A reactivity against the NS-1 should only be included if specific questions need to
be clarified. For example, if uncertain arthropathies have to be clarified, the detection of antibodies against this protein can be indicative for a persistent parvovirus B19 infection. Since these antibodies are only detectable six to eight weeks
after the infection, they indicate a persistent illness and allow some conclusions
about the onset of infection to be drawn. Since antibodies against NS-1 can be
present even when the infection has passed (in a study, 24.7 % of the sera
showed a partially very weak reactivity against NS-1), thus this reaction is not a
sufficient proof of a persistent infection. Therefore, in case of clinical suspicion,
the detection of parvovirus antigens or DNA should be considered for a secure
diagnosis. It must be considered that a PCR-determination is not necessarily
positive at each moment of the development of a persistent illness. When the reactivity of NS-1 is evaluated, it must be considered that with regard to the individual immune response, antibodies against NS-1 can also appear with delay.
12.3. Typical reaction profiles in the RIDA® Blot Parvovirus B19
Due to evaluations that have been carried out so far, the following IgM/IgG reaction patterns can be an indication of a specific parvovirus B19 status. It must be
pointed out that this involves typical reaction patterns, but they can also show deviations.
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RIDA® Blot Parvovirus B19
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Table 7: parvovirus B19 status and typical antibody patterns
IgM
IgG
possible B 19 status
negative
VP-N clearly reactive,
infection occurred long
possibly also VP-1S;
time ago (years)
VP-C very weak or negative
negative, questionable or
weakly positive
VP-N and VP-C strongly
reactive, possibly also
VP-1S
status after infection
(months)
VP-N and VP-C clearly
reactive
VP-N and VP-C strongly
reactive, possibly also
VP-1S
status after infection
(weeks)
VP-N and VP-C clearly
reactive
negative, questionable or status of an early infection
weakly positive
VP-N and/or VP-C
(possibly VP-1S) weak or
questionably reactive
VP-N and VP-C weakly
reactive
unclear status, possibly
caused by unspecific reactivation; test should be
repeated in time
Attention!
The analysis of titers against the NS-1 was not considered in the above table
for the clarification of persistent parvovirus B19 infections, reactive arthropathies, chronic anaemias or other symptoms with suspicion of a B19
persistence, since depending on the duration, the clinic and the immunocompetence, numerous combinations are possible. Furthermore, a corresponding titer can only be evaluated in combination with clinical symptomatic. The diagnosis must be secured with a positive antigen or genome detection.
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13. Clinical results
13.1. Comparative data with a commercial available ELISA
Table 8: IgG data
RIDA® Blot Parvovirus B19 IgG
negative (%) equivocal (%)
positive (%)
total
(%)
IgG-ELISA
negative (%)
7
(7.8)
0
(0.0)
0
(0.0)
7
(7.8)
equivocal (%)
4
(4.4)
0
(0.0)
6
(6.7)
10
(11.1)
positive (%)
5
(5.6)
1
(1.1)
67
(74.4)
73
(81.1)
total (%)
16
(17.8)
1
(1.1)
73
(81.1)
90 (100.0)
Table 9: IgM data
RIDA® Blot Parvovirus B19 IgM
negative (%) equivocal (%)
positive (%)
total
(%)
IgM-ELISA
negative (%)
34
(37.8)
2
(2.2)
0
(0.0)
73
(81.1)
equivocal (%)
5
(5.6)
1
(1.1)
0
(0.0)
10
(11.1)
positive (%)
9
(10.0)
4
(4.4)
35
(38.9)
7
(7.8)
total (%)
48
(53.3)
7
(7.8)
35
(38.9)
90 (100.0)
13.2. Time of occurrence of antibodies against the NS-1
For clarification of this question, 82 serum samples of women with parvovirus B19
infection during pregnancy were examined. Samples were taken between two
weeks and nine months after infection. In all samples, the typical reaction pattern
could be found (VP-N and VP-C in IgG strongly reactive, IgM temporarily positive).
IgM titer against NS-1 did not appear in any sample. IgG titer against the NS-1
were found at the earliest six weeks after infection. These appeared in 32 % of the
examined samples.
13.3. Frequency of IgG titers against the NS-1 in the normal population
197 samples of blood donors and 300 samples of women (separated in age
groups) were examined for IgG titers against NS-1.
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Table 10: Frequency of IgG titers
Blood donors 20-29 yrs. 30-39 yrs. 50-59 yrs.
Number of sera
total
197
99
101
100
497
B19 positive
75.1 %
64.6 %
62.3 %
69.0 %
69.2 %
NS-1 positive *
27.7 %
37.7 %
30.1 %
2.9 %
24.7 %
* also very weak reactivities were included in the analysis
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