Elektrophoretische Grundlagen - TCI @ Uni

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Gliederung
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Instrumentelle Methoden
Teil I: Gelelektrophorese
TCI
PD Dr. Cornelia Kasper
Institut für
Technische Chemie
Definition
Theoretische Grundlagen
Gelmedien
Nachweis/Färbemethoden
Instrumentierung
Elektrophoretische Grundlagen und Durchführung
Präparative Methoden
Hochauflösende zweidimensionale Elektrophorese
TCI
PD Dr. Cornelia Kasper
Institut für
Technische Chemie
Theoretische Grundlagen
Unter Elektrophorese versteht man die Wanderung von
Teilchen im elektrischen Feld.
Eigenschaften der Teilchen (Ladung, Größe) bewirken
eine unterschiedliche elektrophoretische Beweglichkeit.
Die verschiedenen Teilchen werden getrennt und
sammeln sich dabei in einzelnen Zonen.
TCI
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Technische Chemie
Theoretische Grundlagen
In einem elektrischen Feld wirken unterschiedliche Kräfte auf ein
geladenes Teilchen:
Beschleunigende Kraft:
Fe = q ⋅ E
Reibungskraft:
Ftr = fc ⋅ v
q: Ladung
fc: Reibungskoeffizient
mit
q = z ⋅e
E: elektrische Feldstärke
v: Wanderungsgeschwindigkeit
Stehen die Kräfte im Gleichgewicht, bewegen sich Teilchen mit
einer konstanten Geschwindigkeit im elektrischen Feld.
TCI
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Institut für
Technische Chemie
Theoretische Grundlagen
Fe = Ffr → q ⋅ E = fc ⋅ v
v=
E
+
K
R
+z
K
B
-
vEP
• Der Faktor u ist ein Proportionalitätsfaktor zwischen
Wanderungsgeschwindigkeit und Feldstärke.
• Er wird als Mobilität bezeichnet und ist
substanzspezifisch.
H
PD Dr. Cornelia Kasper
q⋅E
=u⋅E
fc
TCI
Institut für
Technische Chemie
PD Dr. Cornelia Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Theoretische Grundlagen
Theoretische Grundlagen
Effekte auf das Teilchen im elektrischen Feld
Fe : Beschleunigungskraft
F RET: Retardationskraft
F REL : Relaxationskraft
Retardationseffekt
Nach der Debye-Hückel Theorie ist um das Zentralion
eine Ionenatmosphäre entgegengesetzter Ladung
aufgebaut. Sie bewirkt, das das Teilchen durch eine
Lösung wandert, die entgegengesetzt fließt. →
Retardationseffekt
F r : Reibungskraft
Relaxationseffekt
Auf Grund beider Effekte nimmt die Mobilität bei zunehmender
Ionenstärke ab.
TCI
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Technische Chemie
Theoretische Grundlagen
• Bei schwachen Basen und Säuren ist nicht die
Mobilität des vollständig dissozierten Teilchens wichtig,
sondern die effektive Mobilität ueff.
• Sie wird über den Dissoziationsgrad α mit der
Ionenmobilität verknüpft:
•
α: Dissoziationsgrad
• Die Wanderungsgeschwindigkeit kann bei schwachen
Säuren und Basen über pH-Werteinstellungen
optimiert werden.
TCI
PD Dr. Cornelia Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Theoretische Grundlagen
Puffersysteme
• Bei Durchführung einer Elektrophorese wandern nicht
nur die Probenionen, sondern auch die dissozierten
Pufferionen.
• An beiden Elektroden müssen daher Pufferreservoirs mit
ausreichend Puffer vorhanden sein.
ueff = ∑ α ⋅ ui
PD Dr. Cornelia Kasper
Durch Anlegen eines elektrischen Feldes wird die
Ionenwolke hinter dem Zentralion her gezogen, das Ion
wird abgebremst. → Relaxation
Institut für
Technische Chemie
• Verwendet werden Säure/ Base- Systeme (z.B. TrisChlorid, Tris-Borid)
PD Dr. Cornelia Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Theoretische Grundlagen
Theoretische Grundlagen
Wärmeabfuhr
• Die Wärmeabfuhr erfolgt über die Wände oder eine Seite
des Systems
• Ein Temperaturgradient entsteht
• Bei trägerfreier Elektrophorese kommt es zur
Durchmischung
Kapillar- oder Gelelektrophorese sollten
• Bei einer Kapillar
geringe Innendurchmesser bzw. dünne Schichten
verwendet werden, damit die Temperaturdifferenz gering
gehalten werden kann.
• Die Materialien sollten eine gute Wärmeleitfähigkeit
haben.
Durch den Einsatz von Strom wird bei
einer Elektrophorese Joul´sche
Wärme entwickelt. Pro Volumeneinheit
entwickelte Wärme W gilt:
W = E² ⋅ λ ⋅ c
c = molare Konzentration des Elektrolyten
λ = Äquivalenzleitfähigkeit
F = Faraday- Konstante
E = elektrische Feldstärke
ui = Mobilität
zi = Anzahl
Für λ gilt:
PD Dr. Cornelia Kasper
λ = ui ⋅ z i ⋅ F
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Institut für
Technische Chemie
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TCI
Institut für
Technische Chemie
Elektrochemische Doppelschicht
Theoretische Grundlagen
Aufbau und Potentialverlauf der
elektrochemischen Doppelschicht
• Auf der Oberfläche vieler Materialien ( Glas, Teflon,
Papier, Agarose) bildet sich bei Kontakt mit
Elektrolytlösungen eine elektrochemische Doppelschicht.
•Bei der Dissoziation von
Silanolgruppen werden negative
Ladungen an der Wand ausgebildet.
• Grund : Oberflächenladungen
• Diese werden durch positive
Gegenladungen aus der Lösung
kompensiert.
• Erläuterungen am Beispiel einer fused Silica–Kapillare
•Die Abbildung zeigt einen
Potentialabfall.
•In der starren Schicht an der
Wandung ist der Abfall linear.
X=Abstand von der Kapillarwand
TCI
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Technische Chemie
Theoretische Grundlagen
Elektroosmotischer Fluß (EOF)
•
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•In diffusen Schicht in der Lösung liegt
ein exponentieller Abfall vor
TCI
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Institut für
Technische Chemie
Theoretische Grundlagen
Durch die Doppelschicht bedingt wird bei Anlegen einer
elektrischen Spannung das Lösungsmittel in einen Fluß (EOF) in
Richtung der Kathode gebracht. Eine Strömung in der flüssigen
Phase tritt auf.
Grund: positive Gegenladungen der Doppelschicht.
Geschwindigkeit des EOF: abhängig vom ζ-Potential
vEOF =
ε ⋅ζ ⋅ E
4 ⋅ ∏ ⋅η
ε: Dielektrizitätskonstante
ζ: Zeta-Potential
E: elektrische Feldstärke
η: Viskosität
In der Gelelektrophorese tritt die Elektroendosmose auf.
Folgen: da der EOF der Richtung der Probenionen
entgegengesetzt ist, sind Verzerrungen und Verdünnungen der
Zonen die Folge.
TCI
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Technische Chemie
Elektroendosmose: Aufgrund fixierter Ladungen an der Matrixoberfläche
entsteht im elektrischen Feld ein der Elektrophoreserichtung entgegengesetzter
osmotischer Fluß.
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Gelmedien
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Technische Chemie
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Technische Chemie
Gelmedien
Agarose
Polyacrylamid
•Einfache Handhabung
•Ungiftig
•Werden eingesetzt zur
Trennung hochmolekularer
Proteine über 500 kDa
•Niedrige Siebwirkung für
kleine Proteine
•Gele sind nicht klar
•Sind nicht Elektroendosmose
frei
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Technische Chemie
Vernetzungsmuster des Polyacrylamids (PA)
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Gelmedien
Gelmedien
• PA ist chemisch inert und stabil (Gele reißen nicht so leicht)
• Geringe Elektroendosmose
• Klare Gele auf Grund Vernetzer N,N
N N´-Methylenbisacrylamid
-Methylenbisacrylamid
• Porengröße der Gele ist von der Konzentration und dem
• Vernetzungsgrad abhängig
Nachteile:
• Monomer ist toxisch
• Proteine über 800 kDa können nicht
getrennt werden
• Eignen sich für viele Färbemethoden
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Institut für
Technische Chemie
Nachweis/Färbemethoden
Quantitativer Nachweis: Densitometrie (Lichtabsorption)
TCI
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Technische Chemie
Nachweis/Färbemethoden
Coomassie-Brilliant Blue
• Einfachste Methode, kurze Färbemethode
• Proteine werden blau angefärbt
• Empfindlichkeit: 100 ng – 1 µg pro Bande
Silberfärbung
• Silberionen werden von Proteinen gebunden und durch
Reduktion in Silber umgewandelt. Mechanismus ähnlich
dem der Fotografie
• Empfindliche Methode, längere Färbezeiten
• Empfindlichkeit: ng-Bereich pro Bande
2
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Technische Chemie
Nachweis/Färbemethoden
Agarosegel
Dargestellt sind PCR-Produkte. Links befindet sich ein
Standard.
3
Die Banden in den Taschen/Spuren 1-3 sind
Markerproteine.
PD Dr. Cornelia Kasper
TCI
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Coomassie
1
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Nachweis/Färbemethoden
Qualitativer Nachweis: Färbung oder radioaktive
Markierung
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Technische Chemie
Die Färbung erfolgte mit Ethidiumbromid und wird unter
UV-Licht (254 nm) fotographiert.
PD Dr. Cornelia Kasper
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Institut für
Technische Chemie
Instrumentierung
Instrumentierung
• Grundsätzlich finden horizontale und vertikale Systeme
Verwendung.
• Vertikale Systeme: Die Gele sind in Kassetten oder auf
Trägermaterial
(Glasplatten,
Polycarbonatplatten)
befestigt und von flüssigem Puffer umgeben.
umgeben Die Proben
werden in Taschen am oberen Ende der Gele
aufgegeben. Die Proben laufen von oben nach unten.
Die schweren und großen Proteine befinden sich im
oberen Teil des Gels.
• Die Wärmeabfuhr wird durch Kühlung mittels der Puffer
geregelt.
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Technische Chemie
Vertikale Elektrophoreseapparatur
TCI
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Instrumentierung
Institut für
Technische Chemie
Instrumentierung
Horizontales Elektrophorese Systeme
•
Horizontale Systeme: Die Gele können auf einem Trägermaterial
aufgetragen sein. Die Versorgung mit Pufferionen erfolgt entweder
durch Filterpapierstreifen, die in Flüssigpuffertanks hängen oder
durch getränkte Filterpapierstreifen.
•
Moderne Systeme verwenden Gelstreifen die mit den Pufferionen
versetzt sind. Das Verfahren ist als semidry anzusehen.
•
Die Probe kann über einen aufliegenden Filterstreifen aufgebracht
werden oder sie werden in eingegossene Taschen pipettiert.
•
Die entstehende Wärme muss abgeführt werden, daher haben
solche Systeme eine Wasserkühlung.
•
Die Elektrophorese wird mit Spannungen von 200V durchgeführt
werden.
PD Dr. Cornelia Kasper
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Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung
B: statt Filterpapierstreifen werden
auch Gelstreifen mit Puffer verwendet
PD Dr. Cornelia Kasper
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Institut für
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung
• Zonenelektrophorese:
Trennprinzip
beruht
auf
unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten der
geladenen Teilchen im Feld. Grundlage jeder
Elektrophorese
• Isotachophorese: Die geladenen Teilchen wandern alle
mit der gleichen Geschwindigkeit im diskontinuierlichen
System.
• Isoelektrische Focussierung: Trennung der Teilchen
nach dem isoelektrischen Punkt innerhalb eines pHGradienten
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Institut für
Technische Chemie
PD Dr. Cornelia Kasper
TCI
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Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung
Grundprinzipien und Durchführung
Zonenelektrophorese
• Grundprinzip der Elektrophorese
• Trennung eines Proteingemisches in Zonen
• Das Trennprinzip beruht auf den unterschiedlichen
Wanderungsgeschwindigkeiten (→Mobilität)
• Beeinflussung
B i fl
d
der L
Ladung
d
d
durch
hT
Temperatur
t und
d pHH
Wert des Puffers
• Unveränderlicher pH-Wert des Gels
• Bestimmung nach Molekulargewicht, Molekülgröße oder
isoelektrischer Punkt
PD Dr. Cornelia Kasper
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Grundprinzipien und Durchführung
• Probenauftrag der gemischten
Proteine
•Auftrennung in Zonen
PD Dr. Cornelia Kasper
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Grundprinzipien und Durchführung
Porengradientengele
Herstellung eines linearen
Porengradientengels
• Dienen zur Ermittlung von Molekülgrößen eines Proteins.
• Durch eine kontinuierliche Veränderung der Vernetzung
eines Gels
G
erhält man einen Gradienten.
G
• Die Proteine bleiben in der enger werdenden Poren des
Gels je nach Größe stecken.
Zwei Polymerisationslösungen mit
unterschiedlicher
Monomerkonzentration werden mit
Hilfe eines Gradientenmischers
vermischt. Dabei wird der
höherkonzentrierten Lösung die
niederkonzentrierte Lösung
zugemischt.
Um ein Vermischen in der
Gelkassette zu verhindern wird die
konzentrierte Lösung Glycerin
überschichtet.
PD Dr. Cornelia Kasper
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Grundprinzipien und Durchführung
PD Dr. Cornelia Kasper
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Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung
Disk-Elektrophorese
• Disk steht für diskontinuierlich
• Gelmatrix ist in zwei Bereiche geteilt:
weitporiges Sammelgel und engporiges
Trenngel
g
• Vorteil : die Aggregation der Proteine wird
verhindert, man erhält schärfere Banden
• Kombination zweier Puffersysteme: Tris-Chlorid/
Tris-Glycin-System
PD Dr. Cornelia Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Sammelgel pH 6,8 und Trenngel pH 8,8
• Glycin hat auf Grund des pH-Wertes eine
niedrige elektrophoretische Mobilität und fungiert
als Folge-Ion,
g
Chlorid hat eine hohe Mobilität
und dient als Leit-Ion.
• Die Mobilitäten der aufzutrennenden Proteine
liegen zwischen denen der Leit- und FolgeIonen.
PD Dr. Cornelia Kasper
TCI
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Grundprinzipien und Durchführung
Grundprinzipien und Durchführung
Prinzip der diskontinuierlichen Elektrophorese
Nach Anlegen des elektrischen Feldes setzt die Isotachophorese ein: alle Ionen
wandern mit der gleichen Geschwindigkeit und bilden einen Proteinstapel in
Reihenfolge ihrer Mobilitäten.
PD Dr. Cornelia Kasper
TCI
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Grundprinzipien und Durchführung
PD Dr. Cornelia Kasper
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Grundprinzipien und Durchführung
SDS-PAGE
Saure Nativelektrophorese
• Methode zur Trennung von basischen Proteinen
(z.B. Getreideproteine)
• Saures Puffersystem
y
((z.B. HEPES –Puffer p
pH 5,5)
, )
• Proteine sind positiv geladen und wandern zur
Kathode
PD Dr. Cornelia Kasper
• Proteinstapel wandert langsam in Richtung
Anode.
• Bei dem Übergang in das engporige Trenngel
bildet sich eine Art „Stau“.
• Proteine erfahren einen Reibungswiderstand
Reibungswiderstand.
• Der Stapel löst sich im homogenen Puffer auf.
• Die einzelnen Komponenten trennen sich nun
nach dem Zonenprinzip auf.
• Die Proteinenfolge ändert sich, da im Trenngel
die Molekülgröße einen großen Einfluß auf die
Mobilität hat.
TCI
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Grundprinzipien und Durchführung
• SDS steht für Sodium dodecyl sulfate
• Anionisches Detergenz
• Überdeckt die Eigenladungen der Proteine →
Entstehung von Micellen mit konstanter negativer
gp
pro Masseneinheit
Ladung
• 1,4 g SDS pro g Aminosäure
• PAGE steht für Polyacrylamidgel-Elektrophorese
• Standardmäßig wird eine diskontnuierliche
Elektrophorese mit SDS-haltigen Tris-HCL/ Tris-Glycin
Puffern nach Laemmli durchgeführt.
PD Dr. Cornelia Kasper
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Grundprinzipien und Durchführung
Probenvorbereitung
Vorteile der SDS-PAGE
• Proben werden mit einem Puffer versetzt, der die nötige
Menge SDS im Überschuß enthält
• Zusätzlich wird Mercaptoethanol frisch dazu gegeben
• → Aufspaltung von Schwefelbrücken zwischen
Cysteinen
• Die Proben werden für 5 min auf 95°C erhitzt
• → es erfolgt eine Streckung des Moleküls, Sekundärund Tertiärstrukturen werden aufgebrochen
• Proben werden nach Erhitzen abzentrifugiert und
können auf das Gel pipettiert werden.
• Proteinaggregation wird verhindert
• Schnelle Trennungen, da die Micellen hohe Ladungen
tragen
• Trennung erfolgt nur nach einem Parameter
(Molekulargewicht)
• Es gehen auch sehr hydrophobe und denaturierte Proteine
in Lösung
PD Dr. Cornelia Kasper
TCI
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Technische Chemie
Nachteile der SDS-PAGE
• Denaturierung ist irreversibel
• SDS ist nicht kompatibel mit nicht-ionischen Detergenzien
PD Dr. Cornelia Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung
Grundprinzipien und Durchführung
silbergefärbtes SDS-Gel
SDS-PAGE
Spur 3 enthält ein
Markergemisch
Rechts Angabe der
Molmassen der
Markerproteine in kDa
PD Dr. Cornelia Kasper
TCI
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Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung
1
2
In den Spuren 1 und 2 sind Markerproteine
PD Dr. Cornelia Kasper
TCI
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Grundprinzipien und Durchführung
Isoelektrische Fokussierung (IEF)
• Protein wandert im elektrischen Feld durch einen pHGradienten
• An dem Punkt, an dem die Nettoladung gleich Null ist
befindet sich sein isoelektrischer Punkt
• Nettoladung eines Protein = Summe aller negativen und
positiven Ladungen an den Aminosäuregruppen
• IEF ist im Gegensatz zu den anderen
elektrophoretischen Methoden eine Endpunktmethode
→ die Proteine können nicht mehr weiter wandern
A: Nettoladungskurven zweier Proteine A und B
B: Fokussierung der Probenproteine A und B im Feld
PD Dr. Cornelia Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung
TCI
TCI
Institut für
Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung
• Bestimmt man die Nettoladungen der Proteine bei
unterschiedlichen pH-Werten erhält man eine
charakteristische Kurve.
• Der Schnittpunkt der Kurve mit der x-Achse gibt den
isoelektrischen Punkt des Proteins an.
• Als Trennmedien dienen auch hier Agarosegele und PAGele
Gele.
• In den Gelen muß der Gradient stabil sein und eine
gleichmäßige Leitfähigkeit vorweisen
• Zwei Konzepte finden Verwendung:
• pH-Gradienten aus freien Trägerampholyten und
immobilisierte pH-Gradienten
PD Dr. Cornelia Kasper
PD Dr. Cornelia Kasper
Institut für
Technische Chemie
Trägerampholyte
Ideale Trägerampholyte weisen folgende Eigenschaften
aus:
• Hohe Pufferkapazität und Löslichkeit am pI
• Gleichmäßige Leitfähigkeit
• Frei
F i von biologischen
bi l i h Eff
Effekten
kt
• Niedriges Molekulargewicht
Trägerampholyte bestehen aus mehreren hundert
unterschiedlichen aliphatischen OligoaminoOligocarbonsäuren mit unterschiedlichen pI-Werten.
PD Dr. Cornelia Kasper
TCI
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Grundprinzipien und Durchführung
Grundprinzipien und Durchführung
• Konzentrationen der Ampholyte muß gleich im Gel sein,
sonst treten Lücken im pH Spektrum auf.
• 2% Ampholyte im Gel
• Nach anlegen des elektrischen Feldes richten sich die
geladenen Teilchen aus und bilden den Gradienten
• Die Trägerampholyte mit dem niedrigsten pI wandern bis
an das anodische Ende des Gels, die Ampholyte mit
dem höchsten pI wandern an das kathodische Ende.
• Der Gradient kann nach langer Focussionszeit anfangen
zu driften (Kathodendrift). Banden werden unscharf,
basische Proteine gehen verloren.
Vorteil: Trägerampholyte wirken als Zwitterionen und
halten Proteine in Lösung
PD Dr. Cornelia Kasper
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Grundprinzipien und Durchführung
Immobilisierte pH-Gradienten (IPG)
• IPG sind in die Gelmatrix einpolymerisiert
• Eingesetzt werden dazu bifunktionelle Immobiline
H2C=CH-C=O (–NHR)
• Immobiline sind Acrylamidderivate und somit schwache
Sä
Säuren
oder
d schwache
h
h B
Basen.
• Definition der Immobiline erfolgt über ihre pK-Werte
• Man benötigt zwei unterschiedliche Immobiline.
• Der zu puffernde pH-Wert ergibt sich aus dem
Mischungsverhältnis.
TCI
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Grundprinzipien und Durchführung
Herstellung immobilisierter pH-Gradienten
Immobilisierte puffernde Gruppen in
einem Polyacrylamidnetzwerk.
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Technische Chemie
Grundprinzipien und Durchführung
• Mischen von unterschiedlichen Polymerisationslösungen
mit Gradientenmischer
• Lösungen enthalten Acrylamidmonomere zur
Polymerisation einer Matrix auf einer Trägerfolie.
• Die Immobiline werden kovalent an das
Polyacrylnetzwerk gebunden.
• Nach der Polymerisation müssen die Katalysatoren mit
Wasser aus der Matrix entfernt werden.
• Gel wird getrocknet und kann bei -20oC gelagert werden.
• Vor Gebrauch wird das Gel in Additiva (Harnstoff,
Dithiothreitol, Detergenzien) wieder gequollen.
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Grundprinzipien und Durchführung
Vorteile:
• Endpunktmethode mit hoher Auflösung
• IP läßt sich dirket ablesen
• Kombination mit SDS-Elektrophorese→ 2D-Elektrophorese
Nachteile:
• Aufwendigere Färbtechniken als bei der
Zonenelektrophorese
• Aufwendiges Herstellungsverfahren
• Aggregierende Proteine (Membranproteine) können nicht in
das Gel einwandern
• Lange Trennzeiten
PD Dr. Cornelia Kasper
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A: IEF im Bereich pH 4,35-4,55
B: IEF im Bereich pH 4-10
Isoelektrische Fokussierung:
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Grundprinzipien und Durchführung
Titrationkurvenanalyse
• Bestimmung von Nettoladungskurven von Proteinen
Durchführung:
• IEF ohne Probe wird auf einem Trägerampholytgel
durchgeführt→ Bildung des pH-Gradienten
90 gedreht
• Gel wird um 90°
• Probe wird in eine Gelrinne pipettiert
• Nach Anlegen eines elektrischen Feldes wandern die
Proteine in Abhängigkeit ihres pH-Wertes mit
unterschiedlichen Mobilitäten.
• Bildung von Titrationskurven mit Schnittpunkt des pI des
Proteins an der Gelrinne
TCI
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Präparative elektrophoretische Verfahren
A: Probenaufgabe auf ein vorfokussiertes Gel
B: Nettoladungskurven nach Anlegen des elektrischen
Feldes
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Präparative elektrophoretische Verfahren
Elektroelution aus Gelen
• Elektroelution aus Gelen
• Dient zur Gewinnung von Proteinen aus PA-Gelen zur
weiteren Analyse
• Methode A: Protein aus einem ausgeschnittenen
Gelstückchen wird in einer Vertikalelektrophorsekammer
in eine Dialysemembran transportiert
transportiert.
• Methode B: Das Protein wird mittels Puffer ohne
Dialysemembran in einer Miniapparatur in ein
Reaktiongefäß hineineluiert.
• Präparative Zonenelektrophorese
• Präparative isoelektrische Focussierung
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Präparative elektrophoretische Verfahren
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Präparative Zonenelektrophorese
• Reinigungsmethode für
mg-Mengen Protein
• Elektrophorese und
Trennung in einzelne
Zonen wird mit
Polyacrylamidgelen in
einem Glasrohr
durchgeführt.
• Ankommende Zonen
werden durch
kontnuierlichen
Pufferstrom abgeführt.
Elektroelution aus Gelen
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Präparative IEF
Präparative IEF
• Aufreinigungsmethode für größere Mengen Protein
• Kein Gel mit immobilisierten pH-Gradienten
• Mehrkammer-Focussierungsapparatur mit gepufferten
isoelektrischen Polyacrylamidmembranen
• Zur
Z Probenauftrennung
P b
ft
gibt
ibt man ein
i Proteingemisch
P t i
i h iin
eine Kammer
• Die Proteine wandern nach Anlegen eines Feldes in die
benachbarten Kammern gemäß ihren isoelektrischen
Werten
• Das aufgereinigte Protein kann der Kammer entnommen
werden
TCI
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2D Gelelektrophorese
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2D Gelelektrophorese
Prinzip
• Sehr großes Auflösungsvermögen
• Auftrennung der Proteine erfolgt nach zwei Kriterien:
isoelektrischer Punkt und Molmasse
• Proteine mit gleicher Molmasse oder gleichem pI-Wert
g
werden.
können durch die zweite Dimension aufgetrennt
• Trenntechnik zur qualitativen und quantitativen
Untersuchung der Proteinexpression von Zellen,
Geweben und Organismen (Proteomics)
• mikropräparative Reinigung von Proteinen aus
komplexen Proteingemischen für deren nachfolgende
Charakterisierung und Identifizierung
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1.Dimension
Durchführen einer isoelektrischen Fokussierung: die
Proteine ordnen sich gemäß ihrem pI-Wert auf dem
Trägerampholyten oder IPG Streifen an
2. Dimension
der Trägerampholyt/Gelstreifen wird um 90% gedreht auf
das SDS-Gel gelegt:
die Proteine werden gemäß ihrer Masse getrennt
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2D Gelelektrophorese
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2D Gelelektrophorese
1.Dimension:
•Rehydrieren der IPG-Streifen
mit Probe
•Durchführen der IEF, Trennung
nach IP
•Umpuffern mit DTT und
anschließend mit IAA
2.Dimension:
•Auflegen des IPG-Streifens,
quer zur Laufrichtung der
Proteine
•Auftrennen nach Molmasse
•Fixierung und Färbung
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Abbildung eines 2-D-SDS-PAGE einer Mäuseleberprobe ( Görg A., Biochem.Soc. Trans., 21 (1993)
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2D-Gel einer Probe mit Standardproteinen
PD Dr. Cornelia Kasper
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