Instrumentelle Methoden Teil 2 - TCI @ Uni

Gliederung
• Prinzip
• Gerätetechnik
Kapillaren
Injektionsmethoden
Detektionsmethoden
• Kapillarelektrophoretische Modi
Instrumentelle Methoden
Teil 2: Kapillarelektrophorese
• Beispielgerät
TCI
PD Dr. C. Kasper
Institut für
Technische Chemie
-
+
• Trennmedien: Wäßrige Puffersysteme Æ Stromtransport,
konstanter pH-Wert
• Beispiele:
¾
¾
¾
5-100 cm
20-200 µm
TCI
PD Dr. C. Kasper
Institut für
Technische Chemie
Phosphat- und Citratpuffer bei saurem pH
Borat- und TRIS-Puffer bei basichen pH
Auch zwitterionische Puffer
• Trennung bei elektrischer Feldstärke von mehreren
hundert V/cm
• Resultierender Strom ist gering (im Bereich von 100 µA)
• Detektion: on-Column Æ UV-Absorption direkt durch die
transparente Kapillare
¾
¾
• UV transparente Materialien:
¾
¾
¾
fused-Silica Æ amorpher Quarz
Borsilikatglas
Teflon
• Geringer Durchmesser: Effiziente Wärmeableitung
• Mechanische Stabilität: Außenoberfläche der Kapillare
mit Polyimidschicht geschützt Æ Entfernen für Detektion
nötig (Skalpell oder Flamme)
Probengeber
Fraktionssammler
Hydrodynamischen
Injektionssystem
Kapillarthermostatisierungseinheit
PD Dr. C. Kasper
Institut für
Technische Chemie
Kapillaren
• fused-Silica-Kapillare
• Hochspannungsversorgung
• 2 Elektroden
• Pufferreservoirs
• On-Column-Detektor
On Column Detektor
• Moderne Geräte:
¾
TCI
PD Dr. C. Kasper
Gerätetechnik
¾
Institut für
Technische Chemie
Prinzip der Kapillarelektrophorese
Prinzip der Kapillarelektrophorese
• Kapillarelektrophorese:
Trägerfrei in einem
offenen Rohr
(Kapillare)
• CE (capillary
electrophoresis)
• Kapillarlängen:
5-100 cm
• Innendurchmesser der
Kapillare:
20-200 µm
TCI
PD Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
PD Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Injektionsmethoden
Injektionsmethoden
• Trenneffizienz der Kapillarelektrophorese
• Hydrodynamische
Injektion
¾
¾
¾
¾
Geringes Injektionsvolumen Æ keine Bandenverbreiterung
• Gesamtvolumen der Kapillare Æ wenige µl
Vakuum auf der
Detektionsseite
Druck auf der
Einlassseite
Gravitationskraft
durch Anheben
der Einlassseite
¾
Probenvolumen Æ einige nl
• Reproduzierbare Injektionsvolumina wichtig Æ
Routineanalytik
• Probenvolumen Vi bei der hydrodynamischen Injektion
Vi =
• Elektrokinetische
Injektion
¾
TCI
PD Dr. C. Kasper
Institut für
Technische Chemie
Abhängig von: Druckdifferenz Δp, Injektionszeit t, Kapillarlänge L,
Viskosität η, Kapillarradius r
¾
¾
• Absorptions-Detektor
Electrode
¾
Electrode
¾
Aufgebrachtes
Probenmenge nimmt
mit der Mobilität der
Proben-Ionen zu
Injizierte Probenmenge
hängt von der
Probenmatrix ab
¾
¾
¾
¾
Lambert-Beersche-Gesetz A = log⎛⎜ I ⎞⎟ = ε ⋅ c ⋅ d
⎝I⎠
UV-Detektor
Diodenarray-Detektor (DAD)
Photodiodenarray-Detektor (PDA)
Empfindlichkeit: 10-15 - 10-13 mol
Anwendungen:
g
Proteine,, aromatische
Verbindungen
¾
¾
¾
TCI
Institut für
Technische Chemie
¾
¾
¾
¾
¾
¾
¾
PD Dr. C. Kasper
Detektorzelle
Negatives Signal
TCI
PD Dr. C. Kasper
Institut für
Technische Chemie
Detektionsmethoden
Kapillare
• Massenspektrometrie-Detektor
¾
Fluoreszenz
¾
¾
TCI
UV-Detektion
Puffer + Elektrolyt mit UV-Absorption
Æ Negatives Signal
Empfindlichkeit: 10-16 - 10-13 mol
Anwendungen: Organische und
anorganische Ionen, Zucker
Detektionsmethoden
Fluoreszenz-Detektor
Molekülanregung Æ Abgabe der
Anregungsenergie durch spontane Emission
(Fluoreszenz)
Signalintensität ist direkt proportional der
Intensität der eingestrahlten Anregungsenergie
Lampenanregung:
Empfindlichkeit: 10-18 - 10-13 mol
Anwendungen: derivatisierte Aminosäuren,
DNA, Peptide, Protein
Laserinduzierte Fluoreszenz:
Hohe Empfindlichkeit:
10-21 - 10-17 mol
Anwendungen: DNA-Fragmente, derivatisierte
Aminosäuren
Kapillare
0
• Indirekte UV-Detektion (Proben
ohne Absorption im UV-Bereich)
Unhabhängig von der
Mobilität der
Probenmatrix
PD Dr. C. Kasper
¾
Institut für
Technische Chemie
Detektionsmethoden
• Hydrodynamische
Injektion
¾
TCI
PD Dr. C. Kasper
Injektionsmethoden
• Elektrokinetische
Injektion
Δp ⋅ Π ⋅ r 4 ⋅ t
8 ⋅ η ⋅L
Institut für
Technische Chemie
Empfindlichkeit: 10-17 - 10-8 mol
Anwendungen: Proteine, Peptide, drug-monitoring
z.B. ESI-MS (Electrospray Ionization)
PD Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Detektionsmethoden
Elektrophoretische Wanderung
• Zunehmende Spannung und damit wachsende Feld
Feld-stärke E führt zu Erhöhung der elektrophoretischen
Wanderungsgeschwindigkeit vEPH der Ionen
L
v EPH = μEPH ⋅ E = EFF
tM
Eingesetzt werden auch:
•
•
•
•
Leitfähigkeitsdetektor
El kt h i h D
Elektrochemischer
Detektor
t kt
Brechungsindexdetektor
Detektor für Radioisotope
¾
Elektrophoretische
p
Mobilität µEPH, effektive Kapillarlänge
p
g LEFF,
Migrationszeit tM
• Wanderndes Ion im elektrischen Feld unterliegt
Kräftegleichgewicht
E
+
KR
KB
+z
KR = Reibungskraft
KB = Beschleunigungskraft
-
vEPH
TCI
PD Dr. C. Kasper
Institut für
Technische Chemie
Elektrophoretische Wanderung
Beschleunigungskraft KB
KB =
z ⋅F ⋅E
NA
Reibungskraft KR (Stokesches Gesetz K R = 6 ⋅ π ⋅ η ⋅ r ⋅ v
Wanderungsgeschwindigkeit:
v EPH =
z ⋅F ⋅E
6 ⋅ π ⋅ η ⋅ r ⋅ NA
z = effektive Ladung des Ions
F = Faraday-Konstante
NA = Avogadrozahl
η = dynamische Viskosität
r = Stokescher Radius des
Ions
TCI
PD Dr. C. Kasper
Institut für
Technische Chemie
Elektrophoretische Wanderung
• Anlegen von Spannung (10 bis 30 kV) Æ Trennung aufgrund
verschiedener Wanderungsgeschwindigkeiten der Probe im
Trennpuffer
• Berechnung der Mobilität µEPH im elektrischen Feld E
μEPH =
¾
¾
LEFF LEFF ⋅ L GES
=
tM ⋅ E
tM ⋅ U
Elektrisches Feld fällt über gesamte Länge der Kapillare ab (LGES)
Moleküle durchwandern aber nur effektive Länge (LEFF) (bis zum
Detektor) in der Migrationszeit (tM)
Für die elektrophoretische Mobilität µEPH ergibt sich damit:
μEPH =
z ⋅F
6 ⋅ π ⋅ η ⋅ r ⋅ NA
PD Dr. C. Kasper
Elektrophoretische Trennungen nur möglich bei unterschiedlicher
Mobilität der Ionen
TCI
Institut für
Technische Chemie
PD Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Elektroosmotischer Fluss (EOF)
Elektroosmotischer Fluss (EOF)
• Trennungsprinzip
• Negativ geladene
Kapillarwand (fused silica)
¾
Interaktionen der Analyten mit dem EOF
• Kationen wandern zur Kathode (negativer Pol)
• Anionen wandern zu Anode (positiver Pol)
• Hydratisierte Kationen
akkumulieren nahe der
Kapillarwand
• Elektroosmotischen Fluß
(EOF) in Richtung der
Kathode bei Anlegen eines
elektrischen Feldes
PD Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
PD Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Elektroosmotischer Fluss (EOF)
• Unbehandelte Kapillaren (uncoated)
¾
¾
Elektrophoretische Geschwindigkeit
Zusätzlich: Elektroosmotischer Fluss (EOF)
• Gesamtgeschwindigkeit:
¾
Vektorielle Summe aus elektrophoretischer (vEPH) und
elektroosmotischer (vEOF)Geschwindigkeit
Diffuse Doppelschicht
Æ Zeta-Potenital
PD Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Elektroosmotischer Fluss (EOF)
• Ladungsunterschiede an der
Innenseite der Kapillare (diffuse
Doppelschicht) resultieren in ZetaPotential (ζ )
• Zeta-Potential und damit der EOF ist
abhängig von der Dissoziation der
Silanolgruppen und dadurch vom pHWert der Elektrolytlösung
Elektrol tlös ng
• Basischer pH Æ EOF höher als
Wanderungsgeschwindigkeit der
Ionen
¾ Auch Anionen werden durch den
EOF zur Kathode transportiert
• Saurer pH Æ EOF geringer als
Wanderungsgeschwindigkeit der
Ionen
TCI
PD Dr. C. Kasper
Elektroosmotischer Fluss (EOF)
Institut für
Technische Chemie
Elektrischer Stromfluß
• Flussprofil des EOF ist stempelförmigen
¾
Bei konstantem Fluss trägt der EOF nicht zu Peakverbreiterung
bei
Elektrischer Stromfluss führt zu Joulescher
Wärmeentwicklung
¾
¾
Wärmeabfuhr nur über Kapillarwand Æ resultierender
Temperaturgradient
Maximale Trenneffizienz Æ kleiner Temperaturgradient
Verringerung Kapillarinnendurchmesser
Flüssigkühlung der Kapillare
¾
Temperaturgradient
Temperat
rgradient verursacht
er rsacht Viskositätsgradienten
Æ Auswirkung aufs Flussprofil
¾
• Wanderungsgeschwindigkeit (vEOF) des EOF:
ε ⋅E ⋅ ζ
v EOF =
4⋅π⋅η
¾
¾
Langsamere Wanderung im Bereich hoher Viskosität
(Kapillarwand)
Schnellere Wanderung im Bereich geringer Viskosität
(Kapillarmitte)
Dielektrizitätskonstante ε, Zeta-Potential ζ, Viskosität η
PD Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
PD Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
• Trennung nach Unterschied in
Größe und Ladung
• Zunächst wird die Probe (AB) in
die Kapillare injiziert
• Unter Einfluss des elektrischen
Feldes wird die Probe in
diskrete Zonen (A und B)
unterteilt, die ihrerseits
Analyten mit der gleichen
elektrophoretische Mobilität
enthalten
• Puffer, pH-Wert, elektrische
Feldstärke bleiben konstant
PD Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
PD Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Peakverbreiterung
Peakshape
• Peakverbreiterung
Æ Verursachung durch longitudinale Diffusion
2
• Eingangsprofil sei unendlich schmal Æ örtliche Varianz σ z
der Konzentrationsverteilung durch die EinsteinGleichung bestimmt
σ 2z = 2 ⋅ D ⋅ t
Diffusionskoeffizient D; Zeit t
¾
Varianz und damit mit Peakverbreiterung nimmt mit der Zeit t zu
TCI
PD Dr. C. Kasper
Institut für
Technische Chemie
Elektrodispersion
Æ zusätzlicher Peakverbreiterung
¾
Elektrische Feldstärke nicht in gesamter Trennkapillare konstant
Æ gestört durch lokale Leitfähigkeitsunterschiede
Æ Mobilität von Analyt-Ion und Puffer-Ion nicht ähnlich
Æ Konzentration Puffer-Ion ist nicht sehr viel größer als AnalytIon (> Faktor 100)
Mobilität des Proben-Ion uA < Puffer-Ion uCE
Æ Peak-Tailing
uA > uCE
Æ Peak-Leading (Fronting)
Auflösung
• Anforderungen an den Puffer
Migrationszeiten t1 und t2 zweier aufeinanderfolgender Peaks;
σ t gemittelte Standardabweichung
¾
¾
¾
• Einsetzen der entsprechenden Beziehungen liefert:
N ⎛ u2 − u1 ⎞
R=
⋅⎜
⎟
4 ⎝ u ⎠
¾
Institut für
Technische Chemie
Puffersystem
• Auflösung R zweier Peaks
t −t
R= 2 1
4 ⋅ σt
¾
TCI
PD Dr. C. Kasper
¾
¾
¾
¾
Selektivität für die zu trennenden Ionen
pH-Wertstabilität, Pufferkapazität (Reproduzierbarkeit)
Geringe UV-Absorption bei der Detektionswellenlänge
Anpassung der Mobilität zwischen Probe
Probe- und Pufferion
Das Gegenion sollte eine geringe Mobilität besitzen (kleine
Ströme)
Reproduzierbare Herstellung des Puffers
Stabilität des Puffers
Theoretische Trennstufen N, Mobilität u
TCI
PD Dr. C. Kasper
Institut für
Technische Chemie
PD Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
TCI
Institut für
Technische Chemie
Elektropherogramm
Optimierung
• Trennungsoptimierung
Æ Variation folgender Parameter:
¾
¾
¾
¾
¾
pH-Wert
Ionenstärke
Temperatur
Kapillarbelegung
Pufferzusätze
PD Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
PD Dr. C. Kasper
Kapillaraffinitätselektrophorese (CAE)
• Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen einem
Rezeptor und Liganden
• Bestimmung von Bindungskonstanten und -stöchiometrie
• Unterschied in der Mobilität zwischen Protein und dem
gebildeten Komplex
¾
¾
Ligand
g
trägt
g eine Ladung
g
Molekulargewicht des Komplexes unterscheidet sich wesentlich
von der des Proteins
TCI
PD Dr. C. Kasper
Institut für
Technische Chemie
Micellarelektrokinetische Chromatographie
MEKC
• Hybridtechnik aus Elektrophorese und Chromatographie
• Zusatz von Micellenbildnern (Detergenzien) zum
Puffersystem Æ pseudostationäre Phase aus geladenen
Micellen
• Trennung
g basierend auf Verteilung
g der Analyte
y zwischen
Lösung und Micelleninneren
TCI
PD Dr. C. Kasper
Elektropherogramm
Institut für
Technische Chemie
Elektropherogramm
• Neutralmoleküle erhalten elektrophoretische Mobilität ui
• Auflösung R zweier Komponenten
⎛ k' ⎞
ui = uMC ⎜⎜ i ' ⎟⎟
⎝ 1+ ki ⎠
¾
Abhängig von Mobilität der Micelle uMC und dem Kapazitätsfaktor
k‘i
• Kapazitätsfaktor k‘i ist Verhältnis der Analytaufenthaltszeit in der mobilen zur pseudostationären Phase
k i' =
¾
¾
TCI
Institut für
Technische Chemie
Kapillargelelektrophorese (CGE)
• Trennung nach unterschiedlichen Masse/LadungsMasse/Ladungsverhältnissen
• DNA
DNA--Moleküe und SDSSDS-denaturierte Proteine besitzen
bei unterschiedlichen Massen sehr ähnliche Masse/
Ladungsverhältnissen
• Gelmedium bewirkt einen Siebeffekt und behindert die
elektrophoretische Wanderung der größeren Moleküle
stärker als die der kleineren
• Vergleich mit klassischen Gelelektrophorese
Steigende Micellbildnerkonzentration
Vergrößerung des Zeitfensters des Migrationsbereichs
Wahl unterschiedlicher Micellbildner
Änderung in der Zusammensetzung der wässrigen Phase
TCI
PD Dr. C. Kasper
• Trennung der Analyten nach ihrem isoelektrischen Punkt
• Injektion der Probe in einem Ampholytgemisch in die
Kapillare
• Eine starke Säure wird an der Anode platziert (Anolyt),
eine starke Base dient als Kathodenpuffer (Katholyt).
pH--Gradient Æ Ampholyt
Ampholyt-• Anlegen der Spannung Æ pH
Ionen wandern entsprechend ihrem pI.
• Bei pI = pH endet die elektrophoretische Wanderung.
Diffusion
E-Feld
Anode
Keine präparative Probensammlung
Online-Detektion
Keine parallele Trennung mehrerer Proben
Institut für
Technische Chemie
Isoelektrische Fokussierung (CIEF)
Nachteile
Schnellere Trennzeiten
Geringer Arbeits- und Geräteaufwand
Re tention
¾
PD Dr. C. Kasper
t
1− 0
N α −1
k'
t MC
⋅
⋅ 2' ⋅
4
α3 1 + k 2 1 + t 0 ⋅ k '
{
1
2
1
Effizienz Selektivit ät
t
144
424MC
44
3
• Verbesserung der Auflösung durch:
¾
ti − t0
⎛
t ⎞
t o ⋅ ⎜⎜1 − i ⎟⎟
t
MC ⎠
⎝
Vorteile
R=
+
+
Ladung des
Analytmoleküls
-
Verd.
H3PO4
Nicht zweidimensional durchführbar
Kathode
Verd.
NaOH
pH = pI
PD Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
PD Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Isotachophorese (ITP)
Gerät schematisch
• Trennung nach Größe und Ladung
• Zwei Elektrolyte: Leitelektrolyt (LE) und Endelektrolyt
(TE)
¾
¾
¾
¾
¾
Mobilität Leitelektrolyt > Mobilität aller Analyt-Ionen
Mobilität Endelektrolyt < Mobilität aller Analyt-Ionen
Anlegen konstanten Stroms Æ Bildung eines Feldstärkengradients
Probenaufgabe der Proben-Ionen (A, B)
an der Grenzfläche der beiden Elektrolyte
Feldstärkengradient verhindert Diffusion
scharfer Zonengrenzen
TCI
PD Dr. C. Kasper
Institut für
Technische Chemie
TCI
PD Dr. C. Kasper
Beckmann PACE
Institut für
Technische Chemie
Quellen
•
•
•
•
•
PD Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
PD Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
F. Lottspeich/H. Zorbas, Bioanalytik
H.Engelhardt, W.Beck, T. Schmitt, Kapillarelektrophorese
Altria, Kevin; http://www.ceandcec.com
Oliver J. Schmitz; www.kapillarelektrophorese.de
P.W. Atkins, Physikalische Chemie
PD Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie