Kein Folientitel - TCI @ Uni

Elektrophoretische Methoden
Teil 2: Kapillarelektrophorese
Dr. Cornelia Kasper
Universität Hannover
Institut für Technische Chemie
Callinstr. 3
30167 Hannover
Germany
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Gliederung
Prinzip der Kapillarelektrophorese
Gerätetechnik
Kapillaren, Injektionsmethoden, Detektionsmethoden
Elektrophoretische Wanderung
Elektroosmotischer Fluss (EOF)
Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
Kapillaraffinitätselektrophorese (CAE)
Micellarelektrokinetische Chromatographie (MEKC)
Kapillargelelektrophorese (CGE)
Isoelektrische Fokussierung (CIEF)
Isotachophorese (ITP)
Beispielgerät für die Kapillarelektrophorese
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Prinzip der Kapillarelektrophorese
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Prinzip der Kapillarelektrophorese
• Kapillarelektrophorese:
Trägerfrei in einem
offenen Rohr
(Kapillare)
• CE (capillary
electrophoresis)
• Kapillarlängen:
5-100 cm
• Innendurchmesser der
Kapillare:
20-200 µm
-
+
Dr. C. Kasper
5-100 cm
20-200 µm
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Trennmedien: Wäßrige Puffersysteme Æ Stromtransport,
konstanter pH-Wert
• Beispiele:
¾
¾
¾
Phosphat- und Citratpuffer bei saurem pH
Borat- und TRIS-Puffer bei basichen pH
Auch zwitterionische Puffer
• Trennung bei elektrischer Feldstärke von mehreren
hundert V/cm
• Resultierender Strom ist gering (im Bereich von 100 µA)
• Detektion: on-Column Æ UV-Absorption direkt durch die
transparente Kapillare
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Gerätetechnik
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Gerätetechnik
• fused-Silica-Kapillare
• Hochspannungsversorgung
• 2 Elektroden
• Pufferreservoirs
• On-Column-Detektor
• Moderne Geräte:
¾
¾
¾
¾
Dr. C. Kasper
Probengeber
Fraktionssammler
Hydrodynamischen
Injektionssystem
Kapillarthermostatisierungseinheit
TCI
Institut für
Technische Chemie
Kapillaren
• UV transparente Materialien:
¾
¾
¾
fused-Silica Æ amorpher Quarz
Borsilikatglas
Teflon
• Geringer Durchmesser: Effiziente Wärmeableitung
• Mechanische Stabilität: Außenoberfläche der Kapillare
mit Polyimidschicht geschützt Æ Entfernen für Detektion
nötig (Skalpell oder Flamme)
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Injektionsmethoden
• Hydrodynamische
Injektion
¾
¾
¾
Vakuum auf der
Detektionsseite
Druck auf der
Einlassseite
Gravitationskraft
durch Anheben
der Einlassseite
• Elektrokinetische
Injektion
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Trenneffizienz der Kapillarelektrophorese
¾
Geringes Injektionsvolumen Æ keine Bandenverbreiterung
• Gesamtvolumen der Kapillare Æ wenige µl
¾
Probenvolumen Æ einige nl
• Reproduzierbare Injektionsvolumina wichtig Æ
Routineanalytik
• Probenvolumen Vi bei der hydrodynamischen Injektion
∆p ⋅ Π ⋅ r 4 ⋅ t
Vi =
8 ⋅ η⋅L
¾
Dr. C. Kasper
Abhängig von: Druckdifferenz ∆p, Injektionszeit t, Kapillarlänge L,
Viskosität η, Kapillarradius r
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Elektrokinetische
Injektion
¾
¾
Aufgebrachtes
Electrode
Probenmenge
nimmt mit der
Mobilität der
Proben-Ionen zu
Injizierte Probenmenge hängt von
der Probenmatrix
ab
Electrode
• Hydrodynamische
Injektion
¾
Dr. C. Kasper
Unhabhängig von
der Mobilität der
Probenmatrix
TCI
Institut für
Technische Chemie
Detektionsmethoden
• Absorptions-Detektor
¾
¾
¾
¾
¾
¾
Lambert-Beersche-Gesetz A = log⎛⎜ II ⎞⎟ = ε ⋅ c ⋅ d
⎝ ⎠
UV-Detektor
Diodenarray-Detektor (DAD)
Photodiodenarray-Detektor (PDA)
Empfindlichkeit: 10-15 - 10-13 mol
Anwendungen: Proteine, aromatische
Verbindungen
• Indirekte UV-Detektion (Proben
ohne Absorption im UV-Bereich)
¾
¾
¾
Dr. C. Kasper
Kapillare
0
Puffer + Elektrolyt mit UV-Absorption
Æ Negatives Signal
Empfindlichkeit: 10-16 - 10-13 mol
Anwendungen: Organische und
anorganische Ionen, Zucker
UV-Detektion
Detektorzelle
Negatives Signal
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Fluoreszenz-Detektor
¾
¾
¾
¾
¾
¾
¾
¾
Dr. C. Kasper
Molekülanregung Æ Abgabe der
Anregungsenergie durch spontane
Emission (Fluoreszenz)
Signalintensität ist direkt proportional
der Intensität der eingestrahlten
Anregungsenergie
Lampenanregung:
Empfindlichkeit: 10-18 - 10-13 mol
Anwendungen: derivatisierte
Aminosäuren, DNA, Peptide, Protein
Laserinduzierte Fluoreszenz:
Hohe Empfindlichkeit:
10-21 - 10-17 mol
Anwendungen: DNA-Fragmente,
derivatisierte Aminosäuren
Kapillare
Fluoreszenz
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Massenspektrometrie-Detektor
¾
¾
¾
Dr. C. Kasper
Empfindlichkeit: 10-17 - 10-8 mol
Anwendungen: Proteine, Peptide, drug-monitoring
z.B. ESI-MS (Electrospray Ionization)
TCI
Institut für
Technische Chemie
Elektrophoretische Wanderung
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Elektrophoretische Wanderung
• Zunehmende Spannung und damit wachsende Feldstärke E führt zu Erhöhung der elektrophoretischen
Wanderungsgeschwindigkeit vEPH der Ionen
LEFF
v EPH = µEPH ⋅ E =
tM
¾
Elektrophoretische Mobilität µEPH, effektive Kapillarlänge LEFF,
Migrationszeit tM
• Wanderndes Ion im elektrischen Feld unterliegt
Kräftegleichgewicht
E
+
KR
KB
+z
KR = Reibungskraft
KB = Beschleunigungskraft
-
vEPH
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
¾
¾
Beschleunigungskraft KB
Reibungskraft KR (Stokesches Gesetz)
• Wanderungsgeschwindigkeit
v EPH
z ⋅F ⋅E
=
6 ⋅ π ⋅ η ⋅ r ⋅ NA
KB =
z ⋅F ⋅E
NA
KR = 6 ⋅ π ⋅ η ⋅ r ⋅ v
z = effektive Ladung des Ions
F = Faraday-Konstante
NA = Avogadrozahl
η = dynamische Viskosität
r = Stokescher Radius des
Ions
• Für die elektrophoretische Mobilität µEPH ergibt sich
damit:
z ⋅F
µEPH =
6 ⋅ π ⋅ η ⋅ r ⋅ NA
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Anlegen von Spannung (10 bis 30 kV) Æ Trennung
aufgrund verschiedener Wanderungsgeschwindigkeiten
der Probe im Trennpuffer
• Berechnung der Mobilität µEPH im elektrischen Feld E
µEPH
¾
¾
LEFF LEFF ⋅ L GES
=
=
tM ⋅ E
tM ⋅ U
Elektrisches Feld fällt über gesamte Länge der Kapillare ab
(LGES)
Moleküle durchwandern aber nur effektive Länge (LEFF) (bis zum
Detektor) in der Migrationszeit (tM)
• Elektrophoretische Trennungen nur möglich bei
unterschiedlicher Mobilität der Ionen
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Elektroosmotischer Fluss
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Elektroosmotischer Fluss (EOF)
• Negativ geladene
Kapillarwand (fused silica)
• Hydratisierte Kationen
akkumulieren nahe der
Kapillarwand
• Elektroosmotischen Fluß
(EOF) in Richtung der
Kathode bei Anlegen eines
elektrischen Feldes
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Trennungsprinzip
¾
Interaktionen der Analyten mit dem EOF
• Kationen wandern zur Kathode (negativer Pol)
• Anionen wandern zu Anode (positiver Pol)
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Unbehandelte Kapillaren (uncoated)
¾
¾
Elektrophoretische Geschwindigkeit
Zusätzlich: Elektroosmotischer Fluss (EOF)
• Gesamtgeschwindigkeit:
¾
Vektorielle Summe aus elektrophoretischer (vEPH) und
elektroosmotischer (vEOF)Geschwindigkeit
Diffuse Doppelschicht
Æ Zeta-Potenital
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Ladungsunterschiede an der Innenseite der Kapillare
(diffuse Doppelschicht) resultieren in Zeta-Potential (ζ)
• Zeta-Potential und damit der EOF ist abhängig von der
Dissoziation der Silanolgruppen und dadurch vom pHWert der Elektrolytlösung
• Basischer pH Æ EOF höher als
Wanderungsgeschwindigkeit der Ionen
¾
Auch Anionen werden durch den EOF zur Kathode transportiert
• Saurer pH Æ EOF geringer als
Wanderungsgeschwindigkeit der Ionen
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Flussprofil des EOF ist stempelförmigen
¾
Bei konstantem Fluss trägt der EOF nicht zu Peakverbreiterung
bei
• Wanderungsgeschwindigkeit (vEOF) des EOF:
v EOF
¾
Dr. C. Kasper
ε ⋅E ⋅ ζ
=
4⋅π⋅η
Dielektrizitätskonstante ε, Zeta-Potential ζ, Viskosität η
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Elektrischer Stromfluss führt zu Joulescher Wärmeentwicklung
¾
¾
Wärmeabfuhr nur über Kapillarwand Æ resultierender
Temperaturgradient
Maximale Trenneffizienz Æ kleiner Temperaturgradient
Verringerung Kapillarinnendurchmesser
Flüssigkühlung der Kapillare
¾
Temperaturgradient verursacht Viskositätsgradienten Æ
Auswirkung aufs Flussprofil
¾
¾
Dr. C. Kasper
Langsamere Wanderung im Bereich hoher Viskosität (Kapillarwand)
Schnellere Wanderung im Bereich geringer Viskosität (Kapillarmitte)
TCI
Institut für
Technische Chemie
Kapillarzonenelektrophorese
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
• Trennung nach Unterschied in
Größe und Ladung
• Zunächst wird die Probe (AB) in
die Kapillare injiziert
• Unter Einfluss des elektrischen
Feldes wird die Probe in
diskrete Zonen (A und B)
unterteilt, die ihrerseits
Analyten mit der gleichen
elektrophoretische Mobilität
enthalten
• Puffer, pH-Wert, elektrische
Feldstärke bleiben konstant
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Peakverbreiterung
Æ Verursachung durch longitudinale Diffusion
2
• Eingangsprofil sei unendlich schmal Æ örtliche Varianz σ z
der Konzentrationsverteilung durch die EinsteinGleichung bestimmt
σ 2z = 2 ⋅ D ⋅ t
¾
¾
Dr. C. Kasper
Diffusionskoeffizient D; Zeit t
Varianz und damit mit Peakverbreiterung nimmt mit der Zeit t zu
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Elektrodispersion
Æ zusätzlicher Peakverbreiterung
¾
Elektrische Feldstärke nicht in gesamter Trennkapillare konstant
Æ gestört durch lokale Leitfähigkeitsunterschiede
Æ Mobilität von Analyt-Ion und Puffer-Ion nicht ähnlich
Æ Konzentration Puffer-Ion ist nicht sehr viel größer als AnalytIon (> Faktor 100)
Mobilität des Proben-Ion uA < Puffer-Ion uCE
ÆPeak-Tailing
uA > uCE
ÆPeak-Leading (Fronting)
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Auflösung R zweier Peaks
t 2 − t1
R=
4 ⋅ σt
¾
Migrationszeiten t1 und t2 zweier aufeinanderfolgender Peaks;
σ t gemittelte Standardabweichung
• Einsetzen der entsprechenden Beziehungen liefert:
N ⎛ u2 − u1 ⎞
⋅⎜
R=
⎟
4 ⎝ u ⎠
¾
Dr. C. Kasper
Theoretische Trennstufen N, Mobilität u
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Anforderungen an den Puffer
¾
¾
¾
¾
¾
¾
¾
Dr. C. Kasper
Selektivität für die zu trennenden Ionen
pH-Wertstabilität, Pufferkapazität (Reproduzierbarkeit)
Geringe UV-Absorption bei der Detektionswellenlänge
Anpassung der Mobilität zwischen Probe- und Pufferion
Das Gegenion sollte eine geringe Mobilität besitzen (kleine
Ströme)
Reproduzierbare Herstellung des Puffers
Stabilität des Puffers
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Trennungsoptimierung
Æ Variation folgender Parameter:
¾
¾
¾
¾
¾
Dr. C. Kasper
pH-Wert
Ionenstärke
Temperatur
Kapillarbelegung
Pufferzusätze
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Beispiel-Electropherogramm
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Kapillaraffinitätselektrophorese
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Kapillaraffinitätselektrophorese (CAE)
• Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen einem
Rezeptor und Liganden
• Bestimmung von Bindungskonstanten und -stöchiometrie
• Unterschied in der Mobilität zwischen Protein und dem
gebildeten Komplex
¾
¾
Dr. C. Kasper
Ligand trägt eine Ladung
Molekulargewicht des Komplexes unterscheidet sich wesentlich
von der des Proteins
TCI
Institut für
Technische Chemie
Micellarelektrokinetische
Chromatographie
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Micellarelektrokinetische
Chromatographie (MEKC)
• Hybridtechnik aus Elektrophorese und Chromatographie
• Zusatz von Micellenbildnern (Detergenzien) zum
Puffersystem Æ pseudostationäre Phase aus geladenen
Micellen
• Trennung basierend auf Verteilung der Analyte zwischen
Lösung und Micelleninneren
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Neutralmoleküle erhalten elektrophoretische Mobilität ui
⎛ k i' ⎞
⎟
ui = uMC ⎜⎜
' ⎟
⎝ 1+ ki ⎠
¾
Abhängig von Mobilität der Mizelle uMC und dem Kapazitätsfaktor
k‘i
• Kapazitätsfaktor k‘i ist Verhältnis der Analytaufenthaltszeit in der mobilen zur pseudostationären Phase
k i' =
Dr. C. Kasper
ti − t0
⎛
ti ⎞
⎟⎟
t o ⋅ ⎜⎜1 −
⎝ t MC ⎠
TCI
Institut für
Technische Chemie
• Auflösung R zweier Komponenten
t0
−
1
t MC
N α −1
k '2
⋅
⋅
⋅
R=
'
α3 1 + k 2 1 + t 0 ⋅ k '
4
{
1
2
1
Effizienz Selektivit ät
t MC
144
42444
3
Re tention
• Verbesserung der Auflösung durch:
¾
¾
¾
¾
Dr. C. Kasper
Steigende Micellbildnerkonzentration
Vergrößerung des Zeitfensters des Migrationsbereichs
Wahl unterschiedlicher Micellbildner
Änderung in der Zusammensetzung der wässrigen Phase
TCI
Institut für
Technische Chemie
Kapillargelelektrophorese
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Kapillargelelektrophorese (CGE)
• Trennung nach unterschiedlichen Masse/Ladungsverhältnissen
• DNA-Moleküe und SDS-denaturierte Proteine besitzen
bei unterschiedlichen Massen sehr ähnliche Masse/
Ladungsverhältnissen
• Gelmedium bewirkt einen Siebeffekt und behindert die
elektrophoretische Wanderung der größeren Moleküle
stärker als die der kleineren
• Vergleich mit klassischen Gelelektrophorese
Vorteile
Nachteile
Schneller Trennzeiten
Keine präparative Probensammlung
Online-Detektion
Keine parallele Trennung mehrerer Proben
Geringer Arbeits- und Geräteaufwand Nicht zweidimensional durchführbar
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Isoelektrische Fokussierung
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Isoelektrische Fokussierung (CIEF)
• Trennung der Analyten nach ihrem isoelektrischen Punkt
• Injektion der Probe in einem Ampholytgemisch in die
Kapillare
• Eine starke Säure wird an der Anode platziert (Anolyt),
eine starke Base dient als Kathodenpuffer (Katholyt).
• Anlegen der Spannung Æ pH-Gradient Æ AmpholytIonen wandern entsprechend ihrem pI.
• Bei pI = pH endet die elektrophoretische Wanderung.
Diffusion
E-Feld
Anode
+
+
Ladung des
Analytmoleküls
-
Verd.
H3PO4
ient
d
a
r
pH-G
Kathode
Verd.
NaOH
pH = pI
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Isotachophorese
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Isotachophorese (ITP)
• Trennung nach Größe und Ladung
• Zwei Elektrolyte: Leitelektrolyt (LE) und Endelektrolyt
(TE)
¾
¾
¾
¾
¾
Dr. C. Kasper
Mobilität Leitelektrolyt > Mobilität aller Analyt-Ionen
Mobilität Endelektrolyt < Mobilität aller Analyt-Ionen
Anlegen konstanten Stroms Æ Bildung eines Feldstärkengradients
Probenaufgabe der Proben-Ionen (A, B)
an der Grenzfläche der beiden Elektrolyte
Feldstärkengradient verhindert Diffusion
scharfer Zonengrenzen
TCI
Institut für
Technische Chemie
Beispielgerät für die
Kapillarelektrophorese
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Quellen
•
•
•
•
•
F. Lottspeich/H. Zorbas, Bioanalytik
H.Engelhardt, W.Beck, T. Schmitt, Kapillarelektrophorese
Altria, Kevin; http://www.ceandcec.com
Oliver J. Schmitz; www.kapillarelektrophorese.de
P.W. Atkins, Physikalische Chemie
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Vielen Dank für die
Aufmerksamkeit !
Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie