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Instrumentelle Methoden
Teil 2: Kapillarelektrophorese
PD Dr. C. Kasper
TCI
Institut für
Technische Chemie
Gliederung
• Prinzip
• Gerätetechnik
Kapillaren
Injektionsmethoden
Detektionsmethoden
• Kapillarelektrophoretische Modi
• Beispielgerät
PD Dr. C. Kasper
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Technische Chemie
Prinzip der Kapillarelektrophorese
• Kapillarelektrophorese:
Trägerfrei in einem
offenen Rohr
(Kapillare)
• CE (capillary
electrophoresis)
• Kapillarlängen:
5-100 cm
• Innendurchmesser der
Kapillare:
20-200 µm
-
+
PD Dr. C. Kasper
5-100 cm
20-200 µm
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Technische Chemie
Prinzip der Kapillarelektrophorese
• Trennmedien: Wäßrige Puffersysteme Æ Stromtransport,
konstanter pH-Wert
• Beispiele:
¾
¾
¾
Phosphat- und Citratpuffer bei saurem pH
Borat- und TRIS-Puffer bei basichen pH
Auch zwitterionische Puffer
• Trennung bei elektrischer Feldstärke von mehreren
hundert V/cm
• Resultierender Strom ist gering (im Bereich von 100 µA)
• Detektion: on-Column Æ UV-Absorption direkt durch die
transparente Kapillare
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Gerätetechnik
• fused-Silica-Kapillare
• Hochspannungsversorgung
• 2 Elektroden
• Pufferreservoirs
• On-Column-Detektor
• Moderne Geräte:
¾
¾
¾
¾
Probengeber
Fraktionssammler
Hydrodynamischen
Injektionssystem
Kapillarthermostatisierungseinheit
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Kapillaren
• UV transparente Materialien:
¾
¾
¾
fused-Silica Æ amorpher Quarz
Borsilikatglas
Teflon
• Geringer Durchmesser: Effiziente Wärmeableitung
• Mechanische Stabilität: Außenoberfläche der Kapillare
mit Polyimidschicht geschützt Æ Entfernen für Detektion
nötig (Skalpell oder Flamme)
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Injektionsmethoden
• Hydrodynamische
Injektion
¾
¾
¾
Vakuum auf der
Detektionsseite
Druck auf der
Einlassseite
Gravitationskraft
durch Anheben
der Einlassseite
• Elektrokinetische
Injektion
PD Dr. C. Kasper
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Injektionsmethoden
• Trenneffizienz der Kapillarelektrophorese
¾
Geringes Injektionsvolumen Æ keine Bandenverbreiterung
• Gesamtvolumen der Kapillare Æ wenige µl
¾
Probenvolumen Æ einige nl
• Reproduzierbare Injektionsvolumina wichtig Æ
Routineanalytik
• Probenvolumen Vi bei der hydrodynamischen Injektion
Δp ⋅ Π ⋅ r 4 ⋅ t
Vi =
8 ⋅ η⋅L
¾
Abhängig von: Druckdifferenz Δp, Injektionszeit t, Kapillarlänge L,
Viskosität η, Kapillarradius r
PD Dr. C. Kasper
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Injektionsmethoden
• Elektrokinetische
Injektion
¾
¾
Electrode
Electrode
Aufgebrachtes
Probenmenge nimmt
mit der Mobilität der
Proben-Ionen zu
Injizierte Probenmenge
hängt von der
Probenmatrix ab
• Hydrodynamische
Injektion
¾
Unhabhängig von der
Mobilität der
Probenmatrix
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Detektionsmethoden
• Absorptions-Detektor
¾
¾
¾
¾
¾
¾
Lambert-Beersche-Gesetz A = log⎛⎜ II ⎞⎟ = ε ⋅ c ⋅ d
⎝ ⎠
UV-Detektor
Diodenarray-Detektor (DAD)
Photodiodenarray-Detektor (PDA)
Empfindlichkeit: 10-15 - 10-13 mol
Anwendungen: Proteine, aromatische
Verbindungen
• Indirekte UV-Detektion (Proben
ohne Absorption im UV-Bereich)
¾
¾
¾
Kapillare
0
Puffer + Elektrolyt mit UV-Absorption
Æ Negatives Signal
Empfindlichkeit: 10-16 - 10-13 mol
Anwendungen: Organische und
anorganische Ionen, Zucker
PD Dr. C. Kasper
UV-Detektion
Detektorzelle
Negatives Signal
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Detektionsmethoden
Fluoreszenz-Detektor
¾
¾
¾
¾
¾
¾
¾
¾
Molekülanregung Æ Abgabe der
Anregungsenergie durch spontane Emission
(Fluoreszenz)
Signalintensität ist direkt proportional der
Intensität der eingestrahlten Anregungsenergie
Lampenanregung:
Empfindlichkeit: 10-18 - 10-13 mol
Anwendungen: derivatisierte Aminosäuren,
DNA, Peptide, Protein
Laserinduzierte Fluoreszenz:
Hohe Empfindlichkeit:
10-21 - 10-17 mol
Anwendungen: DNA-Fragmente, derivatisierte
Aminosäuren
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Kapillare
Fluoreszenz
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Detektionsmethoden
• Massenspektrometrie-Detektor
¾
¾
¾
Empfindlichkeit: 10-17 - 10-8 mol
Anwendungen: Proteine, Peptide, drug-monitoring
z.B. ESI-MS (Electrospray Ionization)
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Detektionsmethoden
Eingesetzt werden auch:
•
•
•
•
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Leitfähigkeitsdetektor
Elektrochemischer Detektor
Brechungsindexdetektor
Detektor für Radioisotope
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Elektrophoretische Wanderung
• Zunehmende Spannung und damit wachsende Feldstärke E führt zu Erhöhung der elektrophoretischen
Wanderungsgeschwindigkeit vEPH der Ionen
LEFF
v EPH = μEPH ⋅ E =
tM
¾
Elektrophoretische Mobilität µEPH, effektive Kapillarlänge LEFF,
Migrationszeit tM
• Wanderndes Ion im elektrischen Feld unterliegt
Kräftegleichgewicht
E
+
KR
KB
+z
KR = Reibungskraft
KB = Beschleunigungskraft
-
vEPH
PD Dr. C. Kasper
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Elektrophoretische Wanderung
Beschleunigungskraft KB
z ⋅F ⋅E
KB =
NA
Reibungskraft KR (Stokesches Gesetz K R = 6 ⋅ π ⋅ η ⋅ r ⋅ v
Wanderungsgeschwindigkeit:
v EPH
z ⋅F ⋅E
=
6 ⋅ π ⋅ η ⋅ r ⋅ NA
z = effektive Ladung des Ions
F = Faraday-Konstante
NA = Avogadrozahl
η = dynamische Viskosität
r = Stokescher Radius des
Ions
Für die elektrophoretische Mobilität µEPH ergibt sich damit:
μEPH
PD Dr. C. Kasper
z ⋅F
=
6 ⋅ π ⋅ η ⋅ r ⋅ NA
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Elektrophoretische Wanderung
• Anlegen von Spannung (10 bis 30 kV) Æ Trennung aufgrund
verschiedener Wanderungsgeschwindigkeiten der Probe im
Trennpuffer
• Berechnung der Mobilität µEPH im elektrischen Feld E
μEPH
¾
¾
LEFF LEFF ⋅ L GES
=
=
tM ⋅ E
tM ⋅ U
Elektrisches Feld fällt über gesamte Länge der Kapillare ab (LGES)
Moleküle durchwandern aber nur effektive Länge (LEFF) (bis zum
Detektor) in der Migrationszeit (tM)
Elektrophoretische Trennungen nur möglich bei unterschiedlicher
Mobilität der Ionen
PD Dr. C. Kasper
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Elektroosmotischer Fluss (EOF)
• Negativ geladene
Kapillarwand (fused silica)
• Hydratisierte Kationen
akkumulieren nahe der
Kapillarwand
• Elektroosmotischen Fluß
(EOF) in Richtung der
Kathode bei Anlegen eines
elektrischen Feldes
PD Dr. C. Kasper
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Elektroosmotischer Fluss (EOF)
• Trennungsprinzip
¾
Interaktionen der Analyten mit dem EOF
• Kationen wandern zur Kathode (negativer Pol)
• Anionen wandern zu Anode (positiver Pol)
PD Dr. C. Kasper
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Elektroosmotischer Fluss (EOF)
• Unbehandelte Kapillaren (uncoated)
¾
¾
Elektrophoretische Geschwindigkeit
Zusätzlich: Elektroosmotischer Fluss (EOF)
• Gesamtgeschwindigkeit:
¾
Vektorielle Summe aus elektrophoretischer (vEPH) und
elektroosmotischer (vEOF)Geschwindigkeit
Diffuse Doppelschicht
Æ Zeta-Potenital
PD Dr. C. Kasper
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Elektroosmotischer Fluss (EOF)
• Ladungsunterschiede an der
Innenseite der Kapillare (diffuse
Doppelschicht) resultieren in ZetaPotential (ζ)
• Zeta-Potential und damit der EOF ist
abhängig von der Dissoziation der
Silanolgruppen und dadurch vom pHWert der Elektrolytlösung
• Basischer pH Æ EOF höher als
Wanderungsgeschwindigkeit der
Ionen
¾ Auch Anionen werden durch den
EOF zur Kathode transportiert
• Saurer pH Æ EOF geringer als
Wanderungsgeschwindigkeit der
Ionen
PD Dr. C. Kasper
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Elektroosmotischer Fluss (EOF)
• Flussprofil des EOF ist stempelförmigen
¾
Bei konstantem Fluss trägt der EOF nicht zu Peakverbreiterung
bei
• Wanderungsgeschwindigkeit (vEOF) des EOF:
ε ⋅E ⋅ ζ
v EOF =
4⋅π⋅η
¾
Dielektrizitätskonstante ε, Zeta-Potential ζ, Viskosität η
PD Dr. C. Kasper
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Elektrischer Stromfluß
Elektrischer Stromfluss führt zu Joulescher
Wärmeentwicklung
¾
¾
Wärmeabfuhr nur über Kapillarwand Æ resultierender
Temperaturgradient
Maximale Trenneffizienz Æ kleiner Temperaturgradient
Verringerung Kapillarinnendurchmesser
Flüssigkühlung der Kapillare
¾
Temperaturgradient verursacht Viskositätsgradienten
Æ Auswirkung aufs Flussprofil
¾
¾
Langsamere Wanderung im Bereich hoher Viskosität
(Kapillarwand)
Schnellere Wanderung im Bereich geringer Viskosität
(Kapillarmitte)
PD Dr. C. Kasper
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Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
• Trennung nach Unterschied in
Größe und Ladung
• Zunächst wird die Probe (AB) in
die Kapillare injiziert
• Unter Einfluss des elektrischen
Feldes wird die Probe in
diskrete Zonen (A und B)
unterteilt, die ihrerseits
Analyten mit der gleichen
elektrophoretische Mobilität
enthalten
• Puffer, pH-Wert, elektrische
Feldstärke bleiben konstant
PD Dr. C. Kasper
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Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
PD Dr. C. Kasper
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Technische Chemie
Peakverbreiterung
• Peakverbreiterung
Æ Verursachung durch longitudinale Diffusion
2
σ
• Eingangsprofil sei unendlich schmal Æ örtliche Varianz z
der Konzentrationsverteilung durch die EinsteinGleichung bestimmt
σ 2z = 2 ⋅ D ⋅ t
Diffusionskoeffizient D; Zeit t
¾
Varianz und damit mit Peakverbreiterung nimmt mit der Zeit t zu
PD Dr. C. Kasper
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Peakshape
Elektrodispersion
Æ zusätzlicher Peakverbreiterung
¾
Elektrische Feldstärke nicht in gesamter Trennkapillare konstant
Æ gestört durch lokale Leitfähigkeitsunterschiede
Æ Mobilität von Analyt-Ion und Puffer-Ion nicht ähnlich
Æ Konzentration Puffer-Ion ist nicht sehr viel größer als AnalytIon (> Faktor 100)
Mobilität des Proben-Ion uA < Puffer-Ion uCE
Æ Peak-Tailing
uA > uCE
Æ Peak-Leading (Fronting)
PD Dr. C. Kasper
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Auflösung
• Auflösung R zweier Peaks
t 2 − t1
R=
4 ⋅ σt
¾
Migrationszeiten t1 und t2 zweier aufeinanderfolgender Peaks;
σ gemittelte Standardabweichung
t
• Einsetzen der entsprechenden Beziehungen liefert:
N ⎛ u2 − u1 ⎞
⋅⎜
R=
⎟
4 ⎝ u ⎠
¾
Theoretische Trennstufen N, Mobilität u
PD Dr. C. Kasper
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Puffersystem
• Anforderungen an den Puffer
¾
¾
¾
¾
¾
¾
¾
Selektivität für die zu trennenden Ionen
pH-Wertstabilität, Pufferkapazität (Reproduzierbarkeit)
Geringe UV-Absorption bei der Detektionswellenlänge
Anpassung der Mobilität zwischen Probe- und Pufferion
Das Gegenion sollte eine geringe Mobilität besitzen (kleine
Ströme)
Reproduzierbare Herstellung des Puffers
Stabilität des Puffers
PD Dr. C. Kasper
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Optimierung
• Trennungsoptimierung
Æ Variation folgender Parameter:
¾
¾
¾
¾
¾
pH-Wert
Ionenstärke
Temperatur
Kapillarbelegung
Pufferzusätze
PD Dr. C. Kasper
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Elektropherogramm
PD Dr. C. Kasper
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Kapillaraffinitätselektrophorese (CAE)
• Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen einem
Rezeptor und Liganden
• Bestimmung von Bindungskonstanten und -stöchiometrie
• Unterschied in der Mobilität zwischen Protein und dem
gebildeten Komplex
¾
¾
Ligand trägt eine Ladung
Molekulargewicht des Komplexes unterscheidet sich wesentlich
von der des Proteins
PD Dr. C. Kasper
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Micellarelektrokinetische Chromatographie
MEKC
• Hybridtechnik aus Elektrophorese und Chromatographie
• Zusatz von Micellenbildnern (Detergenzien) zum
Puffersystem Æ pseudostationäre Phase aus geladenen
Micellen
• Trennung basierend auf Verteilung der Analyte zwischen
Lösung und Micelleninneren
PD Dr. C. Kasper
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Elektropherogramm
• Neutralmoleküle erhalten elektrophoretische Mobilität ui
⎛ k i' ⎞
⎟
ui = uMC ⎜⎜
' ⎟
⎝ 1+ ki ⎠
¾
Abhängig von Mobilität der Micelle uMC und dem Kapazitätsfaktor
k‘i
• Kapazitätsfaktor k‘i ist Verhältnis der Analytaufenthaltszeit in der mobilen zur pseudostationären Phase
ti − t0
k =
⎛
ti ⎞
⎟⎟
t o ⋅ ⎜⎜1 −
⎝ t MC ⎠
'
i
PD Dr. C. Kasper
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Elektropherogramm
• Auflösung R zweier Komponenten
1−
t0
t MC
N α −1
k
R=
⋅
⋅
⋅
'
4
α3 1 + k 2 1 + t 0 ⋅ k '
{
1
2
1
Effizienz Selektivit ät
t MC
144
42444
3
'
2
Re tention
• Verbesserung der Auflösung durch:
¾
¾
¾
¾
Steigende Micellbildnerkonzentration
Vergrößerung des Zeitfensters des Migrationsbereichs
Wahl unterschiedlicher Micellbildner
Änderung in der Zusammensetzung der wässrigen Phase
PD Dr. C. Kasper
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Kapillargelelektrophorese (CGE)
• Trennung nach unterschiedlichen Masse/Ladungsverhältnissen
• DNA-Moleküe und SDS-denaturierte Proteine besitzen
bei unterschiedlichen Massen sehr ähnliche Masse/
Ladungsverhältnissen
• Gelmedium bewirkt einen Siebeffekt und behindert die
elektrophoretische Wanderung der größeren Moleküle
stärker als die der kleineren
• Vergleich mit klassischen Gelelektrophorese
Vorteile
Nachteile
Schnellere Trennzeiten
Keine präparative Probensammlung
Online-Detektion
Keine parallele Trennung mehrerer Proben
Geringer Arbeits- und Geräteaufwand
Nicht zweidimensional durchführbar
PD Dr. C. Kasper
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Isoelektrische Fokussierung (CIEF)
• Trennung der Analyten nach ihrem isoelektrischen Punkt
• Injektion der Probe in einem Ampholytgemisch in die
Kapillare
• Eine starke Säure wird an der Anode platziert (Anolyt),
eine starke Base dient als Kathodenpuffer (Katholyt).
• Anlegen der Spannung Æ pH-Gradient Æ AmpholytIonen wandern entsprechend ihrem pI.
• Bei pI = pH endet die elektrophoretische Wanderung.
Diffusion
E-Feld
Anode
+
+
Ladung des
Analytmoleküls
-
Verd.
H3PO4
Kathode
Verd.
NaOH
pH = pI
PD Dr. C. Kasper
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Isotachophorese (ITP)
• Trennung nach Größe und Ladung
• Zwei Elektrolyte: Leitelektrolyt (LE) und Endelektrolyt
(TE)
¾
¾
¾
¾
¾
Mobilität Leitelektrolyt > Mobilität aller Analyt-Ionen
Mobilität Endelektrolyt < Mobilität aller Analyt-Ionen
Anlegen konstanten Stroms Æ Bildung eines Feldstärkengradients
Probenaufgabe der Proben-Ionen (A, B)
an der Grenzfläche der beiden Elektrolyte
Feldstärkengradient verhindert Diffusion
scharfer Zonengrenzen
PD Dr. C. Kasper
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Gerät schematisch
PD Dr. C. Kasper
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Beckmann PACE
PD Dr. C. Kasper
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Quellen
•
•
•
•
•
F. Lottspeich/H. Zorbas, Bioanalytik
H.Engelhardt, W.Beck, T. Schmitt, Kapillarelektrophorese
Altria, Kevin; http://www.ceandcec.com
Oliver J. Schmitz; www.kapillarelektrophorese.de
P.W. Atkins, Physikalische Chemie
PD Dr. C. Kasper
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