Selektiver Verlust der Nef-vermittelten CD3- Modulation in
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Institut für Molekulare Virologie Selektiver Verlust der Nef-vermittelten CD3Modulation in SIVsmm-infizierten Rauchgrauen Mangaben mit niedrigen CD4+ T-Zellzahlen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Humanbiologie (Dr. biol. hum.) an der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Jan Schmökel aus Wangen im März 2011 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Frank Kirchhoff 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Barbara Spellerberg Tag der Promotion: 13.05.2011 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ................................................................................................................................ I Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................................................... III 1 Einleitung ................................................................................................................................... 1 1.1 Epidemiologie ..................................................................................................................... 1 1.2 Ursprung von HIV ............................................................................................................... 2 1.3 Morphologie und Genomaufbau ....................................................................................... 2 1.4 Pathogenese von AIDS und Unterschiede zur asymptomatischen Infektion..................... 4 1.5 Das Nef-Protein der Immundefizienzviren ......................................................................... 5 1.6 Unterschiede der Nef-Funktionen zwischen HIV-1 und SIV aus natürlichen Wirten........... ............................................................................................................................................ 7 1.7 2 Aufgabenstellung ............................................................................................................... 8 Material und Methoden ............................................................................................................ 9 2.1 Material .............................................................................................................................. 9 2.1.1 Eukaryotische Zellen .................................................................................................. 9 2.1.2 Bakterien .................................................................................................................... 9 2.1.3 Nukleinsäuren .......................................................................................................... 10 2.1.4 Enzyme ..................................................................................................................... 12 2.1.5 Reagenzien ............................................................................................................... 12 2.1.6 Reagenzsysteme (Kits).............................................................................................. 14 2.1.7 Medien ..................................................................................................................... 14 2.1.8 Lösungen und Puffer ................................................................................................ 15 2.1.9 Antikörper ................................................................................................................ 16 2.2 Methoden......................................................................................................................... 17 2.2.1 DNA-Methoden ........................................................................................................ 17 2.2.2 Eukaryotische Zellen ................................................................................................ 18 2.2.3 Bakterienkultur......................................................................................................... 19 I Inhaltsverzeichnis 3 2.2.4 Klonierung verschiedener nef-Allele in pBR-NL43-nef-IRES-eGFP ........................... 19 2.2.5 Klonierung verschiedener nef-Allele in pCG und pmCherry-N1 .............................. 20 2.2.6 Transfektion eukaryotischer Zellen .......................................................................... 20 2.2.7 Herstellung von Virus-Stocks.................................................................................... 21 2.2.8 HIV-1 p24-Antigen ELISA .......................................................................................... 21 2.2.9 Koimmunpräzipitation.............................................................................................. 22 2.2.10 Western Blot ............................................................................................................ 22 2.2.11 Kolokalisation ........................................................................................................... 22 2.2.12 Infektion eukaryotischer Zellen................................................................................ 23 2.2.13 NFAT-Assay ............................................................................................................... 24 2.2.14 FACS-Analysen .......................................................................................................... 24 2.2.15 Internalisierungs-Assay ............................................................................................ 25 2.2.16 Computerprogramme .............................................................................................. 25 Ergebnisse................................................................................................................................ 27 3.1 Niedrige CD4+ T-Zellzahlen in Rauchgrauen Mangaben führen zum selektiven Verlust der TCR-CD3 Herabregulierung durch Nef ......................................................................................... 27 3.2 I123L und L146F sind in SIVsmm Nef für den selektiven Verlust der TCR-CD3 Herabregulierung verantwortlich ................................................................................................ 33 3.3 Die AS-Substitutionen I123L und L146F verhindern eine effektive Bindung von SIVsmm Nef an die δ-Kette des TCR-CD3-Komplexes ................................................................................ 36 3.4 Selektive Eliminierung der SIVmac239 Nef-vermittelten TCR-CD3 Herabregulierung .... 41 4 Diskussion ................................................................................................................................ 45 5 Zusammenfassung ................................................................................................................... 52 6 Literaturverzeichnis ................................................................................................................. 54 Danksagung ...................................................................................................................................... 61 II Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abb Abbildung AICD engl.: activation induced cell death AIDS engl.: acquired immunodeficiency syndrome AMP Ampicillin AP-2 Adapterprotein-2 APC Antigenpräsentierende Zelle APC Allophycocyanin AS Aminosäure bp Basenpaar ß-Gal ß-Galaktosidase ß-ME ß-Mercaptoethanol BSA Rinderserumalbumin °C Grad Celsius CD engl.: cluster of differentiation DMEM Dulbecco`s modified eagle medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA engl.: deoxyrinonucleicacid (Desoxyribonukleinsäure) dNTP Desoxy-Nukleosidtriphosphate ds doppelsträngig E.coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat eGFP engl.: enhanced green fluorescence protein ELISA engl.: enzyme linked immunosorbent assay env engl.: envelope EtOH Ethanol FACS engl.: fluorescence activated cell sorter FKS fötales Kälberserum FSC engl.: forward scatter g Gramm gag engl.: group specific antigen GFP engl.: green fluorescent protein h Stunde HBS HEPES buffered saline III Abkürzungsverzeichnis HEPES Hydroxyethyl-Piperazin-Ethansulfonsäure HIV Humanes Immundefizienz Virus HLA engl.: human leucozyte antigen HTML engl.: hypertext markup language HRP engl.: horse raddish peroxidase Ig Immunglobulin IL-2 Interleukin-2 IRES engl.: internal ribosomal entry site k Kilo KAN Kanamycin kB Kilobasen kD Kilo Dalton l Liter LTR engl.: long terminal repeat m milli (10-3) µ mikro (10-6) M Molar (mol/l) mac lat.: macaca mulatta MFI engl.: mean fluorescence intensity MHC engl.: major histocompatibility complex min Minute mRNA engl.: messenger ribonucleicacid n nano (10-9) N Normal NFAT engl.: nuclear factor of activated T-cells NF- B engl.: nuclear factor NF- B nef engl.: negative factor NIG nef-IRES-eGFP ORF engl.: open reading frame PAA Polyacrylamid PBMC engl.: peripheral blood mononuclear cell PBS engl.: phosphate buffered saline PCR engl.: polymerase chain reaction PEN Penicillin PE Phycoerythrin IV Abkürzungsverzeichnis PHA Phytohämagglutinin PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid P pico (10-12) pol Polymerase PR Protease Rev engl.: regulator of expression of virion proteins RLU engl.: relative light units RNA Ribonucleicacid (Ribonukleinsäure) rpm Umdrehungen pro Minute RT Reverse Transkriptase sAIDS engl.: simian acquired immunodeficiency syndrome sec Sekunde SGA engl.: single genome amplification SIV engl.: simian immunodeficiency virus (Affenimmundefizienzvirus) smm engl.: sooty mangabey monkey SOE-PCR engl.: splice overlap extension-PCR Strep Streptomycin SSC engl.: sideward scatter Tab Tabelle Tat engl.: transactivator of transcription TCR T-Zellrezeptor Tris Trishydroxymethylaminomethan TM Transmembranprotein U engl.: unit Vif engl.: viral infectiosity factor Vpr engl.: viral protein rapid Vpu engl.: viral protein out Vol Volumen VSV-G engl.: vesicular stomatitis virus glycoprotein (v/v) Volumenanteil an Gesamtvolumen wpi engl.: weeks post infection WT Wildtyp (w/v) Masse pro Volumen www engl.: world wide web V Abkürzungsverzeichnis VI A - Ala - Alanin I - Ile - Isoleucin R - Arg - Arginin C - Cys - Cystein K - Lys - Lysin S - Ser - Serin D - Asp - Asparaginsäure L - Leu - Leucin T - Thr - Threonin E - Glu - Glutaminsäure M - Met - Methionin V - Val - Valin F - Phe - Phenylalanin N - Asn - Asparagin W - Trp - Tryptophan G - Gly - Glycin P - Pro - Prolin Y - Tyr - Tyrosin H - His - Histidin Q - Gln - Glutamin 1 Einleitung 1 1 Einleitung 1.1 Epidemiologie Die erworbene Immunschwäche AIDS (engl.: acquired immunodeficiency syndrome) wurde erstmals im Jahre 1981 als massive Immundefizienz in Kalifornien beobachtet. Daraufhin folgten weitere Berichte von homosexuellen und drogenabhängigen Patienten, die an Lymphadenopathie in Verbindung mit ungewöhnlichen Formen von Krebs, wie dem Non-Hodgkin-Lymphom oder dem Kaposi-Sarkom erkrankten [36]. Innerhalb weniger Monate wurden die Symptome auch bei Empfängern von Bluttransfusionen beschrieben (Center for Disease Control, 1982). Nach intensiver Forschung gelang es den Erreger aus lymphatischem Gewebe von AIDS-Patienten zu isolieren und nannte ihn zunächst „lymphadenopathy associated virus“ (LAV) [7]. Erst später wurde es als „Humanes Immundefizienzvirus Typ 1“ (HIV-1) bezeichnet und der Gattung der Lentiviren zugeordnet [19]. Im gleichen Jahr gelang es aus Lymphozyten eines afrikanischen Patienten ein ähnliches Retrovirus zu isolieren. Man bezeichnete es als „Humanes Immundefizienzvirus Typ 2“ [18]. Seit 1981 sind mehr als 25 Millionen Menschen an AIDS gestorben. Derzeit (www.unaids.org) sind geschätzte 33,4 Millionen Menschen weltweit mit HIV-1 infiziert, wobei der Großteil (ca. 22,4 Mio.) im südlichen Afrika lebt. Jährlich werden etwa 2,7 Millionen Menschen neu infiziert und 2 Millionen erliegen der Krankheit. Somit ist AIDS eine der häufigsten Todesursachen, speziell in Entwicklungsländern. Da sich Retroviren in das Genom der infizierten Zelle integrieren und extrem wandlungsfähig sind, besteht bisher keine Möglichkeit die Krankheit zu heilen [41,42]. Es ist jedoch möglich durch die sogenannte HAART (engl.: highly active antiretroviral therapy), eine Kombinationstherapie, welche mehrere Schritte des viralen Replikationszyklus inhibiert, die Viruslast drastisch zu senken und die Lebenserwartung der Patienten zu verlängern. Allerdings ist die lebenslange Behandlung kostenintensiv und hat beträchtliche Nebenwirkungen. Eine wirksame Impfung wäre langfristig das beste Mittel um die HIV-1 Pandemie zu stoppen, ist jedoch auch nach fast 30-jähriger Forschung nicht in Sicht [6,62]. 1 Einleitung 1.2 Ursprung von HIV Nach der Entdeckung von HIV-1 wurden rasch weitere Lentiviren beschrieben. Affenimmundefizienzviren (SIV engl.: simian immunodeficiency virus) sind denen des Menschen sehr ähnlich. Die Anzahl an Affenarten, in denen man Immundefizienzviren nachwies, stieg in den letzten 20 Jahren kontinuierlich an. So sind heute etwa 40 verschiedene SIV-Typen bekannt [87]. Einige der natürlich infizierten Wirtstiere entwickeln trotz hoher Viruslast im peripheren Blut keine Anzeichen von Immundefizienz [49,79]. Dies deutet auf eine sehr gute Virus-Wirt Adaptation hin [72]. HIV-1 hat seinen Ursprung in Afrika und ist das Ergebnis mehrerer zoonotischer Übertragungen. Daraus entstanden 4 Gruppen: M (major), O (outlier), N (non-M, non-O) und die kürzlich beschriebene Gruppe P [74,98]. Phylogenetische Untersuchungen zeigen, dass jede HIV-1-Untergruppe eine einzelne Zoonose darstellt. HIV-1 M und N stammen aus Schimpansen (Pan troglodytes troglodytes), wohingegen O und P wahrscheinlich von Gorillas (Gorilla gorilla gorilla) auf den Menschen übertragen worden ist. Interessanter Weise hat aber nur HIV-1 M zur Pandemie geführt. Der direkte Vorläufer von HIV-2 ist SIVsmm (engl.: SIV sooty mangabey monkey), dessen natürliche Wirte die Rauchgrauen Mangaben (Cerocebus atys atys) sind [39]. Auch dieses Virus wurde mehrmals auf den Menschen übertragen. Nur zwei dieser Übertragungen, aus denen die Untergruppen A und B entstanden, konnten sich in der menschlichen Population ausbreiten. Weitere 6 Untergruppen (C-H) wurden nur in einzelnen Patienten identifiziert [23]. 1.3 Morphologie und Genomaufbau Immundefizienzvirus-Partikel haben einen Durchmesser von etwa 100 nm. Sie sind von einer Lipiddoppelmembran umschlossen, welche sich von der Zellmembran ableitet und das Kapsid umschließt. Das virale Transmembranprotein gp41 durchspannt die Membran und ist nicht kovalent an das externe Hüllprotein gp120 gekoppelt. Die aktiven Formen dieser Proteinkomplexe liegen als Trimere vor. Beide Hüllproteine sind Produkte des gemeinsamen Vorläufers gp160, das von env kodiert wird. An der Innenseite ist die Hüllmembran mit einer Monolayer aus p17 Matrixproteinen ausgekleidet. Es liegt ebenfalls als Trimer vor und bildet ein Netzwerk, das dem reifen Partikel eine 2 1 Einleitung isometrische Struktur verleiht. Das konische Kapsid besteht aus p24 Kapsidproteinen. Es enthält das virale Genom in Form zweier plus Strang-RNA-Moleküle, mit einer Größe von jeweils ca. 9,5kb, die mit p7 Nukleokapsidproteinen komplexiert sind. Das Linkerprotein p6 verbindet das Kapsid mit der Virushülle. Die letztgenannten werden von gag kodiert (Abb. 1). Das Kapsid enthält außerdem noch die viralen Enzyme Integrase (IN), Protease (PR) und Reverse Transkriptase (RT), die vom pol-Gen exprimiert werden. Des Weiteren sind noch kleinere Mengen an akzessorischen Proteinen wie Nef, Vpr und Vif vorhanden. Das Genom der Immundefizienzviren besteht aus zwei einzelsträngigen RNAs, die mit der 5‘-Cap-Struktur und der 3‘-Polyadenylierung alle Charakteristika einer mRNA aufweisen. An den Enden werden sie von langen Sequenzwiederholungen, der 5‘- und 3‘LTR (engl.: long terminal repeats), flankiert. Die 5’LTR dient als Promoter für die zelluläre RNA-Polymerase II. Wie bei allen Retroviren besteht das Genom aus den typischen Strukturgenen gag, pol und env. Immundefizienzviren gehören den komplexeren Retroviren, weil sie weitere regulatorische (tat und rev) und akzessorischen Gene (vif, vpr, nef, sowie manchmal vpu oder vpx) enthalten. Abb. 1: Genomorganisation von HIV-1. Quelle: http://www.stanford.edu/group/virus/retro/2005gongishmail/HIV-1b.jpg 3 1 Einleitung 4 1.4 Pathogenese von AIDS und Unterschiede zur asymptomatischen Infektion AIDS entsteht erst im späteren Stadium des Infektionsverlaufes als Folge der Hyperaktivierung des Immunsystems und dem massiven Verlust an CD4+ T-Zellen und der daraus resultierenden Schwächung des Immunsystems. So werden eigentlich harmlose opportunistische Pathogene lebensbedrohlich [40,88]. Ohne Behandlung entwickeln HIV-1-Infizierte innerhalb von etwa 7 bis 10 Jahren nach der Infektion das Immundefizienzsyndrom. Warum es dazu kommt und welche Mechanismen dafür verantwortlich sind, ist immer noch nicht vollständig geklärt. Es verdichten sich jedoch die Hinweise, dass diese generelle Dysfunktion des Immunsystems in der chronischen Phase des Krankheitsverlaufes eng mit einer überhöhten Immunaktivierung zusammenhängt [25,34,45]. Es ist mittlerweile anerkannt, dass u.a. die Zerstörung der Darmschleimhaut oder GALT (engl.: gut associated lymphoid tissue) ein kritischer Faktor für die Etablierung des generell erhöhten Aktivierungsstatus des Immunsystems ist. Dadurch können Mikroorganismen aus dem Darmtrakt leichter in das Blutkreislaufsystem eintreten. Die gesteigerte Präsenz an Pathogenen hat die erhöhte Aktivierung von Immunzellen zur Folge, was die virale Replikation fördert. Des Weiteren wird durch die Stimulation die Generierung und Aktivierung von Gedächtnis T-Zellen, den primären Zielzellen von HIV, gefördert. So entwickelt sich ein Teufelskreis, dem das Immunsystem und der Patient am Ende erliegen. Im Gegensatz zum Menschen entwickeln manche natürlichen Affenwirte von SIV, trotz hoher Viruslast, keine Immunschwäche. Die Faktoren, die es den natürlichen SIV-Wirten erlauben die Progression zu AIDS zu vermeiden, sind Gegenstand intensiver Untersuchungen. SIV vermehrt sich effektiv in den natürlichen Affenwirten. Eine effizientere zelluläre und humorale Immunantwort ist ebenfalls nicht Ursache der asymptomatischen SIV-Infektionen [30]. Ein fundamentaler Unterschied zwischen der progressiv verlaufenden HIV-1 und der nichtprogressiven SIV-Infektion ist die Abwesenheit einer überhöhten und schädigenden Immunaktivierung [72]. Dadurch kann das Immunsystem seine Funktionsfähigkeit und Erneuerung des CD4+ T-Zellpools aufrecht erhalten. Die niedrige Immunaktivierung resultiert nicht aus der Toleranz von 1 Einleitung SIV-Antigenen, da spezifische T-Zellen und Selektionsdruck des Immunsystems vorhanden sind. Ein weiterer Unterschied ist die Expression von CCR5, einem wichtigen Korezeptor für Immundefizienzviren, (auf Protein- und mRNA-Ebene) in CD4+ T-Zellen. Natürliche SIV-Wirte haben eine signifikant niedrigere Expression, als Wirte mit pathogenem Phänotyp [73]. Die in vivo Relevanz der niedrigen CCR5-Expression ist noch nicht vollständig geklärt, aber reduziert vermutlich die Anzahl der Zielzellen und schützt den Pool an Gedächtniszellen. Einige Publikationen beschreiben einen Unterschied im Wirtszelltropismus. Während von HIV-1 bevorzugt IL-17 sekretierende CD4+ T-Zellen (Th17 Zellen) im Gastrointestinaltrakt (GI) infiziert und depletiert werden, sind diese in infizierten natürlichen Wirten in normaler Anzahl vorhanden [9,31]. Der Schutz dieser Zellen ist wichtig für die Funktionalität der Mukosa des GI [15,90] und könnte erklären, warum in natürlichen Wirten keine mikrobielle Translokation beobachtet wird. 1.5 Das Nef-Protein der Immundefizienzviren Das akzessorische Nef-Protein (engl.: negative factor) ist ein wichtiger Faktor bei der Entstehung von AIDS im Menschen und in experimentell mit SIV infizierten Rhesusaffen. In allen bisher untersuchten Immundefizienzviren der Primaten ist ein funktioneller nef-Leserahmen vorhanden. Allerdings ist Nef in vielen Zellkulturen nicht essentiell für die Virusreplikation und zählt deshalb zu den akzessorischen Proteinen. In vivo konnte man die Bedeutung dieses Proteins belegen. Kestler et al. zeigten 1991, dass Rhesusaffen, die mit einer nef-defekten Mutante des SIVmac239 infiziert wurden, kein Simian-AIDS entwickelten. Im Vergleich mit Rhesusaffen, die mit nef-intakten Viren infiziert wurden, war die Viruslast in diesen Tieren um das 100- bis 1000-fache geringer. Unter HIV-Infizierten gibt es so genannte „long-term non-progressors“ (LTNPs), die über einen Zeitraum von zehn Jahren oder länger stabile CD4+ T-Zellzahlen und niedrige Viruslasten aufweisen. Die Charakterisierung dieser Virusisolate ergab, dass einige dieser Patienten mit nef-defekten Viren infiziert waren [24,53,61,78]. Diese Ergebnisse belegen die Bedeutung von Nef bei der Progression zu AIDS. Der Leserahmen vom nef-Gen variiert stark und kodiert für das etwa 27-36 kDa große Protein. Die Expression erfolgt unabhängig von der Wirkung des Rev-Proteins durch Translation einer mehrfach gespleißten mRNA. So wird Nef schon sehr früh während des 5 1 Einleitung viralen Replikationszyklus in großer Menge exprimiert. Um seine aktive Form herzustellen wird das erste Methionin entfernt und durch einen Myristylsäurerest ersetzt, mittels dessen Hilfe Nef mit der Zytoplasmamembran assoziiert ist [70]. Diese Verbindung wird durch die N-terminale Myristylierungsstelle vermittelt und ist essentiell für die meisten Funktionen von Nef [10,17]. HIV-1, HIV-2 und SIV Nefs haben oft nur 30%ige Identität der Aminosäuresequenz, aber die Struktur und die meisten Funktionen sind konserviert [54]. Eine der am besten etablierten Nef-Funktionen ist die Entfernung des CD4-Rezeptors von der Oberfläche infizierter T-Zellen. Hierbei wird der Rezeptor durch Nef schneller internalisiert und in Lysosomen degradiert [13]. Die Entfernung von CD4 von der Zelloberfläche steigert die Infektiosität der gebildeten Partikel, da mehr freies und somit funktionelles gp120 in die Virusmembran eingebaut wird [3,22]. Außerdem stehen auch mehr Viren zur Infektion neuer Zellen bereit, da sie nicht wieder an den CD4-Rezeptor der Zelle binden können, in der sie hergestellt wurden [56]. So schützt das Nef-Protein die Zelle auch vor Superinfektionen, die sonst zum vorzeitigen Tod der Zelle führen würden [8,101]. Abb. 2: Nef manipuliert infizierte Zellen auf unterschiedliche Art und Weise. Durch die Herabregulierung von Rezeptoren auf infizierten T-Zellen erreicht das Virus der Immunantwort zu entgehen und so erfolgreich im Wirt zu persistieren. In ihrer Gesamtheit tragen die Eigenschaften von Nef zu einer gesteigerten Replikation [2,64] und Infektiosität [17,64] bei, die es dem Virus erlauben sich effektiv im Körper auszubreiten und hohe Virustiter zu erreichen. Quelle: Kirchhoff, 2009 Die Herabregulierung der MHC-I-Untereinheiten HLA-A und HLA-B von der Oberfläche infizierter Zellen, ist eine weitere konservierte Eigenschaft von Nef [77]. Natürliche Killerzellen (NK) zerstören normalerweise Zellen, die kein MHC-I-Komplex auf ihrer Oberfläche haben. Immundefizienzviren umgehen das, indem sie die Expression der 6 1 Einleitung Untereinheiten HLA-C und HLA-E nicht beeinflussen. Diese binden an inhibitorische Rezeptoren der NK [20]. Den Nutzen, den HIV daraus zieht, ist die verminderte Erkennung und somit Lyse infizierter Zellen durch zytotoxische T-Zellen [21]. Auf ähnliche Art und Weise wie bei der CD4-Modulation ist Nef in die Entfernung des CD28-Rezeptors von der Zelloberfläche involviert. Der kostimulatorische Rezeptor ist für die effektive T-Zellaktivierung notwendig und wird durch direkte Interaktion zwischen Nef, AP-2 (Adapterprotein 2) und CD28, via Endozytose internalisiert und anschließend lysiert [92]. Nef verstärkt die Partikelinfektiosität auch CD4 unabhängig. Die mechanistischen Grundlagen sind bisher ungeklärt. Es gibt jedoch Hinweise, dass Nef dem Virus hilft, die cortikale Aktinbarriere zu überwinden [11]. Diese Fähigkeit ist unter den Lentiviren stark konserviert [68]. Sie korreliert aber nicht mit der Nef-Funktion die virale Replikation zu erhöhen [35,59]. Höchst wahrscheinlich ist die Erhöhung der Replikation die eine Kombination aus diversen Nef-Eigenschaften. 1.6 Unterschiede der Nef-Funktionen zwischen HIV-1 und SIV aus natürlichen Wirten Im Vergleich zu HIV-1 beeinträchtigen die meisten SIV und HIV-2 Nefs die Ausbildung der immunologischen Synapse, zwischen den infizierten CD4+ T-Zellen und Dentritischen Zellen oder Makrophagen, wesentlich stärker [4]. Durch die Herabregulierung des TCR-CD3-Komplexes (engl.: T-Cell Receptor) und die effizientere CD28-Modulation wird die Aktivierung der T-Zellen inhibiert [83,85]. Die CD3-Modulation ist von anderen Funktionen genetisch trennbar und induziert eine kooperative Interaktion zwischen Nef, der δ-Untereinheit (Zeta) von CD3 und dem AP-2 Adapterprotein-Komplex [93]. Überraschender Weise befindet sich der Bereich, der für die Wechselwirkung verantwortlich ist, im Zentrum des Proteins. Obwohl die CD3-Modulation ein AP2-abhängiger endozytotischer Vorgang ist, konnte er nicht mit einem der bekannten endozytotischen Motive in Verbindung gebracht werden [81,93]. Die meisten SIV Nefs sind zudem aktiv in der Herabregulierung des Chemokinrezeptors CXCR4. Dies hemmt die Migration infizierter T-Zellen zu APCs. Nef Proteine der meisten SI-Viren blockieren somit die Aktivierung und den darauffolgenden vorzeitigen programmierten Zelltod der 7 1 Einleitung infizierten Zellen und können so direkt die Fluktuationsrate der T-Zellen herabsetzen. Möglicher Weise spiegeln diese Funktionen eine besser entwickelte Wirt-Virus Adaptation wider und erlauben die effektive Replikation des Virus ohne Zerstörung des Immunsystems. So konnte gezeigt werden, dass die Herabregulierung des T-Zellrezeptors durch SIVsmm Nef mit der Anzahl an CD4+ T-Zellen im Blut der Rauchgrauen Mangaben korreliert und somit wahrscheinlich eine schützende Funktion ausübt [84]. 1.7 Aufgabenstellung Das akzessorische Nef-Protein der Immundefizienzviren ermöglicht eine effektive Virusreplikation und trägt dadurch entscheidend zur Progression zu AIDS in HIV-infizierten und experimentell mit SIVmac infizierten Rhesusaffen bei. Mittlerweile sind aus etwa 40 Affenarten Lentiviren mit nef-Allelen isoliert [87]. Obwohl diese als AffenImmundefizienzviren (SIV, engl.: simian immunodeficiency virus) bezeichnet werden, verursachen zumindest einige davon in ihren natürlichen Wirten, wie z.B. den Rauchgrauen Mangaben, trotz hoher Viruslast keine Immundefizienz. Dieser Phänotyp ist mit der Benutzung des CCR5-Rezptors als Korezeptor und einer konstanten Menge an CD4+ T-Zellen im Blut verbunden. In seltenen Fällen (5-10 %) kommt es jedoch zu einem Verlust der T-Helferzellen, ähnlich wie in HIV-1 Patienten [91]. Wir fanden bereits eine Assoziation zwischen der Nef-vermittelten Herabregulierung des TCR-CD3-Komplexes und der Anzahl an CD4+ T-Zellen in Rauchgrauen Mangaben und postulierten, dass die CD3-Modulation das Immunsystem schützt [83,85]. In einer weiteren Publikation wurden zwei Rauchgrauen Mangaben beschrieben, die fast keine CD4+ T-Zellen mehr haben. Hier wurde die Erweiterung der Korezeptoraffinität dafür verantwortlich gemacht. In dieser Doktorarbeit sollte untersucht werden, ob der vergrößerte Korezeptortropismus alleine für die extrem niedrigen CD4+ T-Zellzahlen verantwortlich ist, oder ob auch in diesen beiden Fällen der Verlust der Nef-vermittelten CD3-Modulation eine Rolle spielt. Um die in vivo Relevanz der Nef-vermittelten CD3-Herabregulierung im Tiermodell zu überprüfen fehlten bislang die nötigen NefMutanten, die selektiv defekt in der CD3-Modulation sind. Mit Hilfe der funktionellen Daten und den nef-Sequenzen sollten die verantwortlichen AS (Aminosäuren) identifiziert werden und geeignete Mutanten für in vivo Experimente generiert werden. 8 2 Material und Methoden 9 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Eukaryotische Zellen 293T: Humane Nierenepithelzellen, die hohe Transfizierbarkeit auszeichnet. Diese wurden mit Adenovirus Typ 5 transformiert und exprimieren das SV40 (simian virus 40) large T-Antigen [29]. HeLa: Humane Epithelzelllinie aus dem Zervixkarzinom einer 31-jährigen Frau. Diese adhärenten Zellen zeichnen sich durch einen besonders großen zytoplasmatischen Bereich aus und werden daher gerne für Fluoreszenzmikroskopie verwendet. Jurkat: humane T-Zelllinie Jurkat-NFAT: Humane T-Zelllinie wurde mit einem Plasmid stabil transfiziert, das Luziferase unter der Kontrolle des NFAT-Promoters exprimiert [32]. P4-CCR5: HeLa-CD4/LTR-lacZ Reporter-Zelllinie, die stabil humanes CD4, CCR5 und CXCR4 exprimiert. Enthält das Gen für ß-Galaktosidase unter der Kontrolle der HIV-1-LTR [12]. THP-1: humane monozytäre Zelllinie [96]. TZM-bl: TZM-bl ist eine HeLa Zelllinie, die große Mengen an CD4, CCR5 und CXCR4 exprimiert. Sie enthält das Luziferase- und β- Galaktosidasegen unter der Kontrolle des HIV-1 Promotors [75]. 2.1.2 Bakterien Escherichia coli XL2-Blue TM: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac F’ proAB lacIqZ M15 Tn10 (Tetr) Amy Camr (Bullock et al., 1987) (Stratagene Agilent Technologies, Waldbronn). 2 Material und Methoden 2.1.3 Nukleinsäuren 2.1.3.1 Oligonukleotide Die aufgelisteten Oligonukleotide wurden von biomers.net GmbH (Ulm) synthetisiert. Tab. 1: Auflistung der verwendeten Primer für PCR-Reaktionen. 1 3SIVmac239-MluI GTCCCTACGCGTCAGCGAGTTTCCTTCTTG 2 5pBRnef-HpaI GCTGTTAACTTGCTCAATGCCACAGCC 3 3SIVsmmFBr-MluI GTCCCTACGCGTCAGCTTGTTTCCTTCTTG 4 3pBRNL43env CTTATAGCAAAATCCTTTCCAAG 5 5smmFBr-XbaI CGTCTAGAATATGGGTGCCGCTGGTTC 6 5pSIVsmmNIG GGATTTTGCTATAAGATGGGTGCCGCTGGTTC 7 5pSmNIG-MGAG GGATTTTGCTATAAGATGGGTGCCGGTGGTTC 8 5pSGA-L123I GACATGTCTCATTTTATAAAAGAAAAGGGGGGAC 9 3pSGA-L123I GTCCCCCCTTTTCTTTTATAAAATGAGACATGTC 10 5pSGA-F146L CTTAGACATATACTTAGAAAAGGAAGAAGGCATC 11 3pSGA-F146L GATGCCTTCTTCCTTTTCTAAGTATATGTCTAAG 12 5pSGA-Q181H GTCCCTGTACATGTGTCAGAGGAGGCAC 13 3pSGA-Q181H GTGCCTCCTCTGACACATGTACAGGGAC 14 5pSGA-I123L GACATGTCTCATTTTTTAAAAGAAAAG 15 3pSGA-I123L CTTTTCTTTTAAAAAATGAGACATGTC 16 5pSGA-L146F CTTAGACATATACTTTGAAAAGGAAGAAGGCATC 17 3pSGA-L146F GATGCCTTCTTCCTTTTCAAAGTATATGTCTAAG 18 5pSGA-H181Q GGAAATTAGTCCCTGTACAGGTGTCAG 19 3pSGA-H181Q CTGACACCTGTACAGGGACTAATTTCC 20 5pSmNIG-MGTA GGATTTTGCTATAAGATGGGTACCGCTGGTTC 21 5pSmNIG-MGAV GGATTTTGCTATAAGATGGGTGCCGTTGGTTC 22 5pSmNIG-MGAT GGATTTTGCTATAAGATGGGTGCCACTGGTTC 23 5pSIVsmmFBr-XbaI CGTCTAGAATATGGGTGCCGCTGGTTCCAAG 24 3pSIVsmmFBr.HA-MluI GCACGCGTCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGCTTGTTTCCTTCTTGTCAGC 25 5phCD3zeta-XbaI CGTCTAGAATatgaagtggaaggcgcttttc 26 3phCD3zeta-MluI GCACGCGttagcgagggggcag 27 5pSIVmac239-XbaI CGTCTAGAATATGGGTGGAGCTATTTCCATG GCACGCGTCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGCGAGTTTCCTTCTTGTCAGCC ATG 28 29 3pSIVmac239.HA-MluI 3pNL4-3.HA-MluI CGTCTAGAATATGGGTGGCAAGTGGTC GCACGCGTCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGCAGTTCTTGAAGTACTCCGGA TGC 31 5pmac239-N181Q TAGTCCCTGTAcagGTATCAGATG 32 3pmac239-N181Q CATCTGATACctgTACAGGGACTA 33 5pmac239-D158N CCAGATTGGCAGaatTACACCTCAGG 34 3pmac239-D158N CCTGAGGTGTAattCTGCCAATCTGG 35 5pNL4-3-NheI CCGGCTAGCATGGGTGGCAAGTGGTC 36 5pSIVsmmFBr-NheI CCGGCTAGCATGGGTGCCGCTGGTTCCAAG 37 5pSIVmac239-NheI CCGGCTAGCATGGGTGGAGCTATTTCC 38 3pNL4-3-AgeI TCGACCGGTGATCCACCTCCACCGCAGTTCTTGAAGTACTCCGGATGC 39 3pSIVsmmFBr-AgeI TCGACCGGTGATCCACCTCCACCGCTTGTTTCCTTCTTGTCAGC 30 5pNL4-3-XbaI 10 2 Material und Methoden 11 40 3pSIVmac239-AgeI TCGACCGGTGATCCACCTCCACCGCGAGTTTCCTTCTTGTC 41 3phCD3zeta.HA-MluI GCACGCGTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAgcgagggggcag 42 5phCD4-NheI CCGGCTAGCCACCATGAACCGGGGAGTCCC TCGACCGGTGATCCACCTCCACCaatggggctacatgtcttctgaaagcgatgagggca c 43 3phCD4-AgeI 2.1.3.2 Plasmide PCR®2.1-TOPO®-TA Vektor: Vektor zum direkten Klonieren von PCR-Produkten (Invitrogen, Karlsruhe) pBR-NL43 nef-IRES-eGFP: pBR322 Vektor, der das HIV-1 NL43 Provirus enthält. Dieses wurde so verändert, dass nef und eGFP mittels eines IRES-Elements von einer bicistronischen mRNA exprimiert werden [83] pHIT/G: Expressionsvektor, der das Hüllprotein des Vesikulären Stomatitis Virus (VSV-G) exprimiert [83]. pCG Auf CMV basierendes Expressionsplasmid [94] pAcGFP-N1 Expressionsvektor, fusioniert an den C-Terminus des gewünschten Proteins AcGFP (Clontech). pmCherry-N1 Expressionsvektor, fusioniert an den C-Terminus des gewünschten Proteins mCherry (Clontech). 2.1.3.3 Längenstandard „1-kb-Leiter“ Invitrogen, Karlsruhe 2.1.3.4 Nukleotide für PCR dNTPs für die Polymerase-Ketten-Reaktion wurden von Invitrogen (Karlsruhe) bezogen. 2.1.3.5 HIV- und SIV-Isolate Die erhaltenen PCR-Produkte stammen aus Rauchgrauen Mangaben, die im Yerkes Primate Center leben. 2 Material und Methoden 12 Tab. 2: Auflistung der analysierten nef-Allele. SIVsmm nef-Allele Bezeichnung Affe Isolat/Klon FBr FBr12w7 FBr12w11 FBr12w12 FBr47w13 FBr47w14 FBr47w15 FBr51w17 FBr51w23 FBr51w28 FBr51w33 FBr75w2 FBr75wL1 FBr75wL2 FBr75wL4 FBr79wK1 FBr79wK3 FBr107wC8 FBr107wC10 FBr225wH1 FBr225wK2 FBr340wA4 FBr365wA2 FFr FJv FFr12w1 FFr12w4 FFr12wB4 FFr47w19 FFr51w2 FFr51wB1 FFr75wJ1 FFr79wG5 FFr79wH1 FFr79wJ4 FFr81w2 FFr81w9 FFrw107wC2 FFrw107wC7 FFrw340wA1 FFrw340wA3 FFrw365wA3 FJv41w3 FJv41w4 FJv41w7 2.1.4 Enzyme Alkalische Phosphatase Roche, Mannheim EDTA-Trypsin Invitrogen/Gibco, Karlsruhe Restriktionsendonukleasen BioLabs, Frankfurt T4-DNA-Ligase Promega, Mannheim 2.1.5 Reagenzien Agarose Invitrogen, Karlsruhe Ampicillin Bayer, Leverkusen Bacto-Trypton BD, Heidelberg DMSO Fluka, Neu-Ulm DMEM Invitrogen, Karlsruhe Ethanol Sigma, München EtBr Sigma, München FTv FTv11w1 FTv11w24 FTv41w1 FTv41w3 FTv41w5 2 Material und Methoden 13 F-96-Nunclon-delta white microwell plates Nunc™, Langenselbold FACS-Röhrchen BD, Heidelberg FCS Invitrogen, Karlsruhe Ficoll separation Solution Biochrom, Berlin Geneticin (G418) Invitrogen, Karlsruhe Glycerol Merck, Darmstadt Glycin AppliChem, Darmstadt Hefeextrakt BD, Heidelberg Interleukin-2 (IL-2) Sigma-Ark, München Isopropanol Merck, Darmstadt Kanamycin Invitrogen, Karlsruhe Kleenex Kimberley-Clark, Koblenz L-Glutamine Invitrogen, Karlsruhe Lipofectamine™ LTX Reagent Invitrogen, Karlsruhe LS Columns Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach MACS® MultiStand Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach MidiMACS™ Separator Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach MiniMACS™ Separator Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach MS Column Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach Normales Ziegenserum (NGS) Invitrogen, Karlsruhe Normales Mausserum (NMS) Sigma, München Opti MEM® Invitrogen, Karlsruhe Penicillin-Streptomycin Invitrogen, Karlsruhe PBS Invitrogen, Karlsruhe PFA Merck, Darmstadt PHA Murex, Burgwedel Reaktionsgefäße Eppendorf, Hamburg RPMI-1640 Invitrogen, Karlsruhe Tween 20 Roth, Karlsruhe Triton X-100 Sigma, München TAE Puffer Eppendorf, Hamburg Whatman paper Whatman, Maidstone, England 2 Material und Methoden 14 Zellkulturflaschen Sarstedt, Nümbrecht Zellkulturplatten Greiner Bio-one, Frickenhausen 2.1.6 Reagenzsysteme (Kits) GoTaq® Flexi DNA Polymerase Promega, Mannheim Luciferase Assay System Promega, Mannheim TOPO TA Cloning® Kit Invitrogen, Karlsruhe DNA Ligationskit Ver.2.1 TaKaRa Bio INC., Shiga, Japan Ultra Clene™ 15 MOBIO Laboratories, Carlsbad, USA Wizard™ Plus Midipreps Promega, Mannheim Miniprep Kit Qiagen, Hilden Apoptosis Detection Kit BD Bioscience, Heidelberg HIV-1 p24 Kapsid-Antigen-ELISA AIDS Repository, Frederick, USA Gal-Screen System Applied Biosystems, Foster City, USA DNA Ligation Kit Ver.2.1 Takara Bio Inc. Shiga, Japan ProFound™ Mammalian HA Tag IP Kit Thermo Scientific, USA NuPAGE® Novex Bis-tris gels Invitrogen, Karlsruhe Annexin V-APC: Invitrogen, Karlsruhe 2.1.7 Medien 2.1.7.1 Zellkulturmedien Adhärente Zellen: DMEM (Dulbecco’s modified Eagle Medium; Invitrogen/Gibco) mit 350 µg/ml L-Glutamin, 120 µg/ml Streptomycinsulfat, 120 µg/ml Penicillin und 10 % (v/v) hitzeinaktiviertem FKS. Suspensionszellen: RPMI-1640 Medium (Invitrogen/Gibco) mit 350 µg/ml L-Glutamin, 120 µg/ml Streptomycinsulfat, 120 µg/ml Penicillin und 10% (v/v) hitzeinaktiviertem FKS. Jurkat-NFAT: RPMI-1640 Medium (Invitrogen/Gibco) mit 350 µg/ml L-Glutamin, 120 µg/ml Streptomycinsulfat, 120 µg/ml Penicillin, 10% (v/v) hitzeinaktiviertem FKS und 200 µg/ml G418 (Geneticin). 2 Material und Methoden 15 2.1.7.2 Bakterienkulturmedien LB-Medium: 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 8 g/l NaCl, 1 g/l Glukose; Zugabe von 100 mg/l Ampicillin vor Gebrauch. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 7,2 eingestellt LBAMPAgar: 15 g/l Agar und 100 mg/l Ampicillin in LB-Medium LBKANAgar: 15 g/l Agar und 100 mg/l Kanamycin in LB-Medium SOC-Medium: 20 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 2,5 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM, MgSO4, 20 mM Glukose. 2.1.8 Lösungen und Puffer 2.1.8.1 Western Blot RIPA-Puffer: 1 % Triton X-100 (v/v), 0.15 M NaCl, 50 mM Tris (pH 7.4), 5 mMEDTA, 1 mM PMSF, 4 % SDS und 1 μg/ml Pepstatine, 1 μg/mlLeupeptine, 1 μg/ml Aprotinine in destilliertem Wasser Lauf-Puffer: 20x NuPAGE Mes SDS puffer (Invitrogen, Karlsruhe) verdünnt mit destilliertem Wasser Transfer-Puffer: 47.9 mM Tris, 38.6 mM Glycine, 1.3 mM SDS und 20 % Methanol (v/v) in destilliertem Wasser, pH 8.3 Blocking-Puffer: 0.2 % Tween 20 in PBS mit 5 % Magermilchpulver (w/v) Antikörper-Puffer: 0.2 % Tween 20 in PBS mit 1 % Magermilchpulver (w/v) Wasch-Puffer: 0.2 % Tween 20 in PBS β-Mercaptoethanol: Sigma Chemical Co. St. Louis, USA 2.1.8.2 HIV-1 p24 Kapsid-Antigen-ELISA Lyse-Lösung: 10 ml Triton X-100 (Sigma, München), ad 100 ml mQH2O Waschpuffer: 25 ml 20x Waschkonzentrat (KPL, Maryland), ad 500 ml H2O Probenpuffer: 10 ml 10 % BSA (KPL, Maryland, MD; USA), 0,2 ml Tween 20, ad 100 ml 1xPBS Lösung für den ersten AK: Anti-p24-AK aus Kaninchen (100 ml): 2 ml Normal Mouse Serum (NMS) (Sigma, Probenverdünnungspuffer München), 98 ml 2 Material und Methoden 16 Lösung für den zweiten AK: Anti-Kaninchen-AK aus Ziegen (100 ml): 5ml Normal Goat Serum (NGS) (Gibco/BRL, Eggenstein), 0,01 ml Tween 20, 95 ml 1xPBS Substrat: TMB Peroxidase Substrat System (KPL, Maryland); 1 N HCl 2.1.8.3 Andere Puffer FACS-Puffer: 1 % (v/v) FKS in PBS Annexin-Puffer: Invitrogen, Karlsruhe 50x TAE-Puffer: 5Prime, Hamburg 2.1.9 Antikörper 2.1.9.1 Western Blot rabbit polyclonal anti-GFP: Abcam (Cambridge, USA) rabbit polyclonal anti-β-actin: Abcam (Cambridge, USA) mouse monoclonal anti-HA: Abcam (Cambridge, USA) mouse monoclonal anti-hCD247: Abcam, Cambridge, USA goat anti-rabbit IRDye 800CW: LI-COR (Lincoln, USA) goat anti-mouse IRDye 680: LI-COR (Lincoln, USA) 2.1.9.2 ELISA rabbit anti-HIV-1 p24: AIDS Repository (Fredrick, USA) goat anti-rabbit IgG (H+L) HRP: AIDS Repository (Fredrick, USA) 2.1.9.3 FACS anti-CD3-PE: BD Pharmingen, San Diego, USA anti-CD4-APC: Invitrogen, Karlsruhe anti-CD25 (IL-2R)-APC: Invitrogen, Karlsruhe anti-CD28-PE: BD Pharmingen, San Diego, USA anti-CD69-PE: BD Pharmingen, San Diego, USA anti-CD74 (Ii)-PE: Ancell, MN, USA 2 Material und Methoden 17 anti-CD184 (CXCR-4)-PE BD Pharmingen, San Diego, USA anti-MHC-I-PE Dako, Hamburg 2.1.9.4 Kolokalisation mouse anti-HA: Abcam (Cambridge, USA) goat anti-ms-Alexa647: Abcam (Cambridge, USA) 2.2 Methoden 2.2.1 DNA-Methoden 2.2.1.1 Standard-Methoden Folgende Methoden wurden nach Protokollen von Maniatis (1989), durchgeführt: Isolierung von Plasmid-DNA nach alkalischer Lyse der Bakterien Ethanol- und Isopropanolfällung der DNA Konzentrationsbestimmung der Nukleinsäuren Dephosphorylierung von DNA 5'-Enden mit alkalischer Phosphatase Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen Ligation von DNA-Fragmenten mit T4-DNA Ligase Auftrennen von Nukleinsäuren durch Gelelektrophorese. 2.2.1.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien Plasmid-DNA für Klonierungen wurde durch alkalische Lyse von Bakterien und anschließende Isolierung und Reinigung der DNA gewonnen Maniatis (1989). Für Sequenzierreaktionen oder die Transfektion eukaryoter Zellen wurden die Präparationen mit dem WizardTM Plus Midipreps Kit (Promega; Madsion, WI, USA) oder dem QIAwell 8 Minipräp Kit (Qiagen; Hilden) nach Angaben der Hersteller durchgeführt. Die DNAKonzentrationen wurden in einem Spektralphotometer (Eppendorf) bestimmt. 2.2.1.3 Isolierung von DNA aus Agarose-Gelen Die DNA-Fragmente wurden in einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt, unter Bestrahlung mit langwelligem UV-Licht (366 nm) sichtbar gemacht und die DNABanden mit einem Skalpell ausgeschnitten. Anschließend wurde die DNA mit dem Ultra 2 Material und Methoden Clene™ 15 (MOBIO; Carlsbad, USA) entsprechend den Anweisungen des Herstellers isoliert. 2.2.1.4 Ligation von DNA Ligationen wurden mit dem Takara DNA Ligationskit (TaKaRa, Shiga, Japan) durchgeführt. Plasmid-DNA und Insert-DNA wurden im Verhältnis von 1 : 3 nach den Protokollen der Hersteller eingesetzt. 2.2.1.5 DNA-Sequenzierung Sequenzierreaktionen wurden kommerziell bei der Firma Eurofins-MWG in Auftrag gegeben. 2 µg DNA wurden bei 58 °C eingedampft und eingeschickt. 2.2.1.6 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Alle PCR-Reaktionen wurden nach dem Protokoll von Saiki et al. (1988), in einem Thermocycler (PTC-100TM, MJ Reserach) durchgeführt. 2.2.2 Eukaryotische Zellen 2.2.2.1 Kultur adhärenter Zellen Die adhärenten Zellen wurden in 25 cm2 Zellkulturflaschen in DMEM bei 37 °C und 5% CO2 kultiviert. Die Zellen wurden zweimal wöchentlich 1:10 bis 1:20 gesplittet. 2.2.2.2 Kultur von Suspensions-Zellen Die Suspensions-Zellen wurden in 25 cm2 Zellkulturflaschen in RPMI-1640 bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Die Zellen wurden zweimal wöchentlich 1:10 bis 1:20 gesplittet. 2.2.2.3 Gewinnung von stimulierten PBMCs Die PBMCs wurden aus dem Buffy Coat (Lymphozytenkonzentrat, welches man nach dem Abzentrifugieren von Vollblut erhält) von 0,5 l Vollblut mittels Dichtegradienten-Zentrifugation (Ficoll-Hypaque) isoliert. Dazu wurde der Buffy Coat 1:2 18 2 Material und Methoden mit PBS verdünnt. Mit diesem Blut/PBS-Gemisch wurde vorsichtig 20 ml Ficoll-Hypaque (spez. Dichte 1.077 g/ml) überschichtet und 20 min bei 1200 rcf (Beschleunigung 5, ohne Bremse) zentrifugiert. Die Lymphozyten und Monozyten (PBMC) sammeln sich dabei entsprechend ihrer spezifischen Dichte in der Interphase zwischen Überstand (Plasma/ Thrombozyten) und Ficoll-Hypaque an. Das Zellsediment bilden Erythrozyten und Granulozyten, die eine höhere Dichte besitzen. Der weiße Ring (PBMC) wurde abgenommen, mehrmals in PBS gewaschen, in RPMI-1640 (10 % FCS, 1 % L-Glutamin, 1 % Pen.-Step.) mit IL-2 (10 ng/ml) und PHA (1 µg/ml) aufgenommen und für 3 Tage inkubiert (37 °C und 5 % CO2). Das Zellsediment bilden Erythrozyten und Granulozyten, die eine höhere Dichte besitzen. 2.2.3 Bakterienkultur Alle verwendeten Plasmide enthalten ein Ampicillin-Resistenzgen, transformierte Bakterien wurden daher durch Zusatz von Ampicillin (100 µg/ml) zum Kulturmedium selektioniert. Verwendet wurde der Escherichia coli-Stamm Escherichia coli XL2TM-Blue. Die Kulturen wurden für mindestens 12 h bei 37 °C in LBamp-Flüssigmedium geschüttelt oder auf LBamp-Agar Platten inkubiert. Bakterienstocks wurden durch Vermischen von 500 µl Bakterienkultur mit 500 µl Glycerin erstellt und bei -80 °C eingefroren. 2.2.3.1 Transformation von Escherichia coli XL2TM-Blue Nach dem Auftauen der kompetenten Zellen auf Eis wurde 3 µl des Ligationsansatzes zu jeweils 12 µl der Zellen gegeben. Es folgte eine Inkubation von 20 min auf Eis. Im Anschluß wurden die Bakterien für 20 min auf Eis, für 30sek bei 42 °C im Wasserbad und für weitere 2 min 30 sek auf Eis gestellt. Nach Zugabe von 200 µl SOC-Medium und einer Inkubation von 30 min bei 37 °C wurde die Bakteriensuspension auf LBamp-Agarplatten ausplattiert und bei 37 °C über Nacht inkubiert. 2.2.4 Klonierung verschiedener nef-Allele in pBR-NL43-nef-IRES-eGFP Die verwendeten Proviren wurden mittels splice overlap extension SOE-PCR hergestellt. Als Templates dienten SGA-Produkte, die von Hui Li (Departments of Medicine and Microbiology, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, Alabama 19 2 Material und Methoden 20 35294, USA). Diese wurden in einer Standard-PCR-Reaktion mit den spezifischen 5´Primern für das jeweilige nef-Allel mit Überlappung zu env (Primer 6, 7, 20-22; siehe 2.1.3.1) und im 3´Bereich mit nef-spezifischen Primern, die eine interne MluI-Schnittstelle enthalten (Primer 3, siehe 2.1.3.1), amplifiziert. Dadurch wurde an die jeweiligen nefAllele eine Restriktionsschnittstelle für MluI angehängt. In einem zweiten PCR-Ansatz wurde der NL43 env Bereich mit den Primern pBR-NL43-HpaI (Primer 2) und pBR-NL43env (Primer 4) amplifiziert. Für die Amplifikation von SIVmac239 nef wurde mit den Primer 1 und 5 verwendet. Die Mutationen wurden ebenfalls per SOE-PCR eingefügt (Primer 8-19 u 31-34). Die Produkte dieser PCR-Reaktionen wurden über Agarosegelelektrophorese aufgereinigt, die DNA aus dem Gel isoliert und die jeweils zueinander gehörenden PCR-Produkte als Template in einer zweiten PCR mit den zugehörigen Primern pBR-NL43-HpaI und 3’MluI-Primern eingesetzt. Dieses Amplikon wurde wiederum aufgereinigt und über die Standard-Methode laut Hersteller in den pCR2.1-TOPO-TA Vektor kloniert. Durch Sequenzierung aller Produkte wurde sichergestellt, dass die gewünschten nef-Allele erhalten wurden. Anschließend folgte die Klonierung der Varianten über die singulären Schnittstellen HpaI und MluI in den proviralen Vektor pBR-NL4-3 nef-IRES-GFP. 2.2.5 Klonierung verschiedener nef-Allele in pCG und pmCherry-N1 Hierfür wurden die nef-Allele aus pBR-NIG als Template für die PCR benutzt. Am 5‘-Ende wurde nur die Schnittstelle in XbaI verändert (Primer 5, 23, 27, 29). Am 3‘-Ende wurde nef mit der Sequenz für den HA-Tag verlängert (Primer 24, 28, 30). Für die Klonierung der nef-Allele in pmCherry-N1 wurde an das 5‘-Ende per PCR eine NheISchnittstelle (Primer 35-37) und an das 3‘-Ende eine AgeI-Schnittstelle angefügt (Primer 38-40). 2.2.6 Transfektion eukaryotischer Zellen 2.2.6.1 Transfektion von Jurkat Zellen 2 x 106 Jurkat T-Zellen wurden nach den Angaben des Herstellers mit dem Amaxa „Nukleofektor“ und dem „Nukleofection Kit V“ transfiziert. 2 Material und Methoden 2.2.6.2 Transfektion von HeLa-Zellen 5 x 104 HeLa Zellen wurden die auf Poly-L-Lysin-beschichteten Deckgläschen, in einer 24-Well Platte in 500 µl DMEM ausgesäht. Am nächsten Tag wurden sie mit Lipofectamin LTX transfiziert. Dazu wurden 0,3 µg DNA in 100 µl OptiMEM mit 0,75 µl Lipofectamin LTX vermischt und nach 30 min Inkubationszeit auf die Zellen gegeben. 2.2.7 Herstellung von Virus-Stocks Die Transfektion der 293T-Zellen wurde nach der Calcium-Phosphat-PräzipitatMethode durchgeführt. Um VSV-G pseudotypisierte Viren herzustellen, die auf ihrer Oberfläche zusätzlich das Hüllprotein des Vesikulären Stromatitisvirus (VSV-G) tragen, wurden die Zellen mit einem VSV-G Expressionsplasmid kotransfiziert. Am Tag vor der Transfektion wurden 2 x 106 Zellen in 6-Well-Platten ausgesät und über Nacht bei 37 °C und 5 %igen CO2-Gehalt inkubiert. Die Zellen waren zum Zeitpunkt der Transfektion zu 5075 % konfluent. Zunächst wurde eine Lösung hergestellt, die sich aus 5 µg DNA, 1µg VSVG-DNA und 13 µl 2M CaCl2 zusammensetzte. Nach 10min Inkubationszeit wurde mit H2O auf ein Endvolumen von 100 µl aufgefüllt. Diese Lösung wurde tropfenweise zu 100 µl 2 x HBS zugegeben. Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur bildete sich ein milchiges Präzipitat. Der Transfektionscocktail wurde auf das Medium der Zellkulturen getropft, und die Zellen über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Medium (DMEM: 10 % FKS, 1 % L-Glutamin, 1 % Pen.-Step.) erneuert. Die Überstände wurden am Tag 2 nach der Transfektion abgenommen und in den folgenden 10 Tagen verwendet. 2.2.8 HIV-1 p24-Antigen ELISA Um die Menge an Viruspartikeln im Virusstock zu quantifizieren wurde der Gehalt an p24 gemessen. Dies wurde mit dem HIV-1 p24-Antigen ELISA (AIDS Repository) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Virusstocks wurden mit Triton X-100 lysiert, bevor sie in die Reaktionsgefäße überführt wurden. Die finale Farbreaktion wurde mit einem „Thermomax microplate reader“ gemessen und in ng/ml p24 angegeben. 21 2 Material und Methoden 2.2.9 Koimmunpräzipitation Die Bestimmung des Gesamtproteingehalts wurde nach Bradford durchgeführt. Die Koimmunpräzipitation wurde ebenfalls nach Protokoll des Herstellers (Pierce, ProFound Mammalian HA Tag Co-IP Kit) durchgeführt, wobei 150 µg Protein des Nefenthaltenden und 100 µg des CD3-δ-enthaltenden Zelllysats eingesetzt wurde. 2.2.10 Western Blot Zu der koimmunpräzipitierten und der ungebundenen Fraktion wurde jeweils 1 µl ßMercaptoethanol gegeben und anschließend für 10 min auf 95 °C erhitzt. Die Proteine wurden durch Verwendung von NuPAGE NovexBis-tris Gele (4-12 %) (Invitrogen, Karlsruhe) nach Angaben des Herstellers bei 120 V separiert. Anschließend wurden die Proteine, unter Verwendung des Trans-Blot SD Systems (BioRAD, München), bei 5 V für 2 h auf eine PVDF Immobilon-FL (Millipore, Schwalbach) übertragen. Es folgte die Blockierung unspezifischer Bindestellen durch 5 % Magermilch für 1,5 h, die Inkubation der primäre Antikörper bei 4 °C über Nacht und die Inkubation der sekundären Antikörper für 30 min bei RT. Zwischen den Inkubationsschritten wurde jeweils mit PBS gewaschen. Die Fluoreszenz der gebundenen sekundären Antikörper wurde mit dem „Odyssey Infrared Imaging“ System (LI-COR) gemessen. Zur Quantifizierung der integrierten Bandenintensität wurde die Odyssey-Software verwendet. 2.2.11 Kolokalisation Die HeLa Zellen (vgl. 2.2.5.2.) wurden 1 Tag nach Transfektion mit PBS gewaschen und mit 4 % PFA fixiert. Danach wurden sie mit 0,5 % Saponin permeabilisiert. Zur Blockierung unspezifischer Bindestellen, wurden die Zellen für 30 min mit 10 % BSA inkubiert. Danach sind sie mit dem primären Antikörper mouse Anti-HA (abcam) in 1 % BSA für 1h inkubiert worden und anschließend mit dem sekundären goat Anti-ms Alexa647 (abcam) Antikörper. Zwischen den jeweiligen Schritten wurde mit PBS gewaschen. Die Deckgläschen wurden mit Hilfe von ProlongGold (Invitrogen) auf den Objektträgern fixiert. Am nächsten Tag wurden die Proben mit dem konfokalen „Laser Scanning Microscop“ LSM710 (Zeiss) analysiert. 22 2 Material und Methoden 2.2.12 Infektion eukaryotischer Zellen 2.2.12.1 Infektion prästimulierter PBMCs 1 x 106 Zellen prästimulierter PBMCs wurden in Reaktionsgefäße gegeben, nachdem sie in RPMI-1640 gewaschen wurden, um IL-2 und PHA zu entfernen. Sie wurden 5min bei 1200 rpm abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Zellen wurden in 0,5 - 0,7 ml Virus-Stock aufgenommen und 4-6 h bei 37°C und 5 %igen CO2Gehalt inkubiert. Nun wurde mit RPMI-1640 + IL-2 auf ein Endvolumen von 4 ml (10 ng/ml IL-2) aufgefüllt und in 6-Well-Platten überführt. Am Tag 3 nach der Stimulation bekamen die Zellen einen zweiten Stimulus, indem 0,5ml RPMI-1640 + PHA (4,5 µg/ml) zugegeben wurde. 2.2.12.2 Infektion von Jurkat-NFAT-Zellen Für jede Probe wurden 6 Wells einer 96-Well V-Shape Platte beladen. In jedes Well wurden 5 x 104 Zellen in 110 µl RPMI-1640 + G418 (200 µg/ml) ausgesät. Anschließend wurde 40 µl Virus-Stock-Lösung zugegeben und für 2 Tage bei 37 °C und 5 %igen CO2Gehalt inkubiert. Abends wurden die Zellen durch Zugabe von 50 µl RPMI-1640 + G418 (200 µg/ml) + PHA (4 µg/ml) stimuliert. 2.2.12.3 Virusverbreitung in PBMCs Zur Analyse der Ausbreitung infektiöser Partikel in primären Zellen wurden 2 x 105 vorstimulierte PBMCs in eine 48-Well Platte ausgesät und mit 1 ng p24-enthaltendem Virusstock infiziert und bei 37 °C inkubiert. An den angegebenen Tagen wurde 200 µl Zellsuspension entnommen um im FACS auf eGFP-Expression zu Untersuchen. Um ein konstantes Volumen von 1ml einzuhalten, wurden 200 µl frisches RPMI-Medium (10 ng/ml IL-2) hinzugegeben. 2.2.12.4 Infektiositäts-Assay Zur Bestimmung der Infektiosität der viralen Partikel wurden 6000 TZM-bl oder P4-CCR5 Reporterzellen in F-96-well Platten ausgesät. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit 1 ng p24-enthaltendem Virusstock infiziert und bei 37°C inkubiert. Zwei Tage nach Infektion wurde das Medium entfernt und 40 µl Gal-Screen Substrat (Applied Biosystems) 23 2 Material und Methoden (1:1 mit PBS) dazugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation wurde die Lösung in „F-96Nunclon-delta white“ Mikrotiterplatten (Nunc) überführt und die ß-Galaktosidaseaktivität im Orion Microplate Luminometer (Berthold Detection) gemessen. Zur Datenanalyse wurde die Software Simplicity (Berthold Detection) verwendet. 2.2.13 NFAT-Assay NFAT (nuclear factor of activated T-Cells) wird besonders stark in aktivierten TZellen transkribiert. Die verwendeten Jurkat-NFAT-Zellen sind stabil mit einem Plasmid transfiziert, dass Luziferase unter der Kontrolle des NFAT-Promotors exprimiert. 16 h nach der Stimulation wurde die Luziferaseaktivität im Zelllysat mit dem Luziferase-AssaySystem von Promega bestimmt. Die Zellen wurden bei 1300 rpm für 5 min abzentrifugiert, damit das Medium abgenommen werden konnte. Anschließend wurde 35 µl 1 x Luciferase cell culture lysis reagent zugegeben. Nach 15 min wurde das Lysat mit 50 µl Luziferase-Buffer-Substrat-Lösung vermischt und die Luziferaseaktivität in relativer Lichteinheit pro 0,1 ms mittels Berthold Luminometer bestimmt. 2.2.14 FACS-Analysen 2.2.14.1 Modulation von Oberflächenrezeptoren auf T-Lymphozyten Die entsprechende Anzahl an Zellen wurde am Tag nach dem zweiten Stimulus (siehe 2.2.12.1) gemäß der Anzahl an Färbungen aufgeteilt und in 1 ml FACS-Puffer gewaschen. Nun wurden die Ansätze für 5 min bei 1300 rpm abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 100 µl FACS Puffer mit der vom Hersteller empfohlenen Menge Antikörper aufgenommen und für 30 min bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden mit 500 µl FACS-Puffer gewaschen, für 5 min bei 1300 rpm abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Dieser Wasch-Schritt wurde nochmals wiederholt. Die infizierten Zellen wurden in 200 µl FACS-Puffer mit 2 % PFA für 30 min bei 4 °C fixiert und anschließend im FACS (BD FACSCalibur oder FACSCantoII) vermessen. 2.2.14.2 T-Zellaktivierung und Apoptose primärer Blutzellen Aliquots der infizierten PBMCs (siehe 2.2.12.1) wurden am Tag 1 nach dem zweiten Stimulus die Modulation von CD69 und am Tag 2 nach dem zweiten Stimulus die 24 2 Material und Methoden 25 Modulation von CD25 via FACS untersucht. Die Färbung wurde wie in 2.2.14.1 beschrieben durchgeführt. Zur Bestimmung der apoptotischen Zellen wurde die Bindung von AnnexinV an diese Zellen überprüft. Hierzu wurden die Zellen gewaschen (siehe 2.2.14.1) und anschließend in 100 µl AnnexinV Bindepuffer (Apoptosis Detection Kit, BD Bioscience) mit 5 µl AnnexinV-APC aufgenommen, und für 15min bei Raumtemperatur und Dunkelheit inkubiert. Danach folgte die Fixierung der Zellen für 30 min im Dunkeln bei 4 °C durch Zugabe von 100 µl AnnexinV Bindepuffer mit 3 % PFA. 2.2.15 Internalisierungs-Assay Die transfizierten Jurkat Zellen wurden in ein Reagenzgefäß überführt und nach waschen mit der vom Hersteller empfohlenen Menge an anti-CD3 PE Antikörper aufgenommen und für 30min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen auf 4 Röhrchen aufgeteilt und nicht oder unterschiedlich lange im Wasserbad bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurden auf Eis gestoppt und die Zellen jeweils auf 2 weitere Röhrchen aufgeteilt. Eine Fraktion wurde mit 5 Teilen PBS pH 2 für 45 sec inkubiert, um alle Oberflächenmoleküle von der Zelloberfläche zu entfernen. Dann wurden die beiden Zellfraktionen (CD3 total und CD3 internalisiert) gewaschen und fixiert um im FACS analysiert zu werden. Dabei wurden die CD3 MFI Werte der GFP positiven Zellen verwendet. Der prozentuale Wert der CD3-Internalisierung zum Zeitpunkt T(t) wurde wie folgt berechnet: int T(0) = Hintergrund; int T(t) = internalisiertes CD3; total T(t) = totales CD3 2.2.16 Computerprogramme 2.2.16.1 Computerprogramme zur Sequenzanalyse Zur Auswertung von DNA-Sequenzen wurden die Programme „MultiAlign“ (http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin/) sowie „Reverse Complement“ (http://bioinformatics.org/sms/rev_comp.html) benutzt. Zum Übersetzen der DNASequenzen in Aminosäuresequenzen (http://www.expasy.ch/tools/dna.html) wurde und „ExPASy „BCM Translate Search tool“ Launcher“ 2 Material und Methoden (http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-util/Options/sixframe.html) 26 benutzt. Die Vergleiche der Aminosäuresequenzen wurde auch mit „MultiAlign“ (siehe oben) durchgeführt. 2.2.16.2 Computerprogramme zur FACS-Analyse Zur Aufnahme der Messwerte, sowie zur Auswertung wurde CellQuest-Pro oder FACSDiva von Becton-Dickson und Adobe AcrobatReader benutzt. Außerdem wurde Mircosoft Office Excel 2007 und GraphPad Prism zur übersichtlicheren Aufarbeitung der Daten, zur Generierung von Diagrammen und Korrelationsanalysen verwendet. 2.2.16.3 Computerprogramme zur Mirkoskopie Zur Aufnahme der Bilder, sowie zur Auswertung wurde Zen2009 von CarlZeiss verwendet. Außerdem wurde CorelDraw und GraphPad Prism für die Darstellung verwendet. 3 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Niedrige CD4+ T-Zellzahlen in Rauchgrauen Mangaben führen zum selektiven Verlust der TCR-CD3 Herabregulierung durch Nef SIVsmm infizierte Rauchgraue Mangaben zeigen trotz hoher Viruslast meist keine Anzeichen einer Immundefizienz und behalten in der Regel eine konstante Anzahl an CD4+ T-Zellen. Allerdings gibt es Ausnahmen. So erleiden etwa 5-10 % der natürlichen SIVWirte einen Verlust dieser T-Helferzellen [91]. Für die beiden Rauchgrauen Mangaben FBr und FFr wurde bereits gezeigt, dass der extreme Verlust der CD4+ T-Zellen mit einem erweiterten Korezeptortropismus von SIVsmm einher geht. Vor allem zu späteren Zeitpunkten benutzten SIVsmm aus diesen Affen hauptsächlich CXCR4 und nicht CCR5 als Korezeptor [65]. In HIV-1 infizierten treten bei ca. 50 % der Patienten CXCR4-benutzende Viren auf. Dies ist generell mit einem dramatischen Verlust der T-Zellen und rascher Progression zu AIDS assoziiert [16,86,95]. Interessanter Weise konnte auch ein Zusammenhang zwischen der Anzahl der CD4+ T-Zellen im peripheren Blut Rauchgrauer Mangaben und der Fähigkeit von SIVsmm Nef, CD3 herabzuregulieren, festgestellt werden [84]. Um zu untersuchen, ob sich auch Nef-Funktionen veränderten, wurden Proben von 4 Rauchgrauen Mangaben (genannt FBr, FFr, FJv und FTv), die zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Infektion isoliert wurden, verwendet (Fig.3, Pfeile). Die Tiere lebten im „Yerkes Primate Center“ und wurden experimentell mit SIVsmm positiven Plasma infiziert. Die Rauchgrauen Mangaben FBr und FFr wurden mit Plasma vom Tier FQi infiziert; FJv und FTv mit Plasma, das dem Tier FBr 225 wpi (engl.: weeks post infection) entnommen wurde. Alle Tiere zeigten eine extreme Abnahme der CD4+ T-Zellen während des Infektionsverlaufes (Abb. 3A links). Bemerkenswerter Weise entwickelten FBr und FFr trotz der extrem niedrigen T-Zellzahl über einen Zeitraum von mehr als 5 Jahren keine klinischen Anzeichen einer Immundefizienz. Während der akuten Phase erreichte die virale Replikation ihre Spitze (Abb. 3B links, 1-2 wpi), was mit einem leichten Abfall der CD4+ T-Zellzahl einher ging. Ein neuer Basiswert wurde erreicht, der normalerweise im weiteren Infektionsverlauf stabil bleibt. In diesen vier Fällen kam es jedoch zu einem fortschreitenden Verlust an T-Helferzellen [65]. 27 2500 28 12 1400 FFr FBr 47 51 FJv 1200 75 79 2000 1500 81 800 107 225 340 365 600 1000 400 500 0 0 1 2 3 4 7 12 17 21 25 29 33 37 63 67 71 75 79 83 92 98 9 10 0 -8 0 1 2 3 4 5 7 9 12 17 22 26 32 55 58 63 85 12 weeks post-infection 47 51 8 10 75 79 107 107 81 106 340 365 11 225 41 5 10 4 10 3 weeks post-infection 371 413 368 212 222 6 9 11 19 27 35 44 58 63 71 79 83 98 130 138 0 0,5 1 2 3 4 114 102 122 10 106 RNA-load (Copies/ml) 41 11 200 weeks post-infection B FTv 1000 102 106 110 114 118 122 126 130 138 147 156 178 195 212 221 246 303 + A Absolute CD4 (cells/mm³) 3 Ergebnisse 0 1 2 3 4 5 7 9 12 17 22 26 55 58 100 weeks post-infection + Abb. 3: Übersicht über die CD4 Zellzahl und Viruslast in den Mangaben während des + infektionsverlaufes. (A) Anzahl an CD4 T-Zellen im peripheren Blut und (B) Viruslast während des Verlaufs der SIVsmm Infektion in den Rauchgrauen Mangaben FBr, FFr (links), FJv und FTv (rechts). In + allen Tieren fällt die Anzahl an CD4 T-Zellen deutlich ab. Der Rückgang dieser Population – den primären SIVsmm Wirtszellen – ist mit dem langsamen Abnahme der Viruslast assoziiert. Die Pfeile markieren die Zeitpunkte, von denen Proben analysiert wurden. Zur funktionellen Analyse erhielten wir von unseren Kollaborationspartnern (B. H. Hahn, D. L. Sodora und G. Silvestri) PCR-Produkte von vier SIVsmm infizierten Rauchgrauen Mangaben. Die Produkte enthielten die env- und nef-Sequenz desselben viralen Genoms. So ist es möglich Veränderungen im Korezeptortropismus, die von Env determiniert werden und die damit verbundenen Anpassungen von Nef zu untersuchen. Von diesen wurde per PCR env und nef amplifiziert und zur Bestätigung sequenziert. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden die nef-Allele anschließend in den auf HIV-1 basierenden proviralen Vektor pBR-NL4-3 nef-IRES-eGFP (pBR-NIG) kloniert. Diese rekombinanten Viren exprimieren alle viralen Proteine unter Kontrolle des LTR-Promoters und Verwendung der ursprünglichen Spleißstellen [82]. Sie unterscheiden sich lediglich durch das enthaltene nef-Allel, das mit eGFP via IRES-Element im gleichen stöchiometrischen Verhältnis von einer bicistronischen mRNA koexprimiert wird. Der Sequenzvergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen (AS-Sequenzen) der SIVsmm Nefs (Abb. 4) zeigte, dass sie generell über einen funktionellen Leserahmen verfügten, der in voller Länge vorhanden war. Des Weiteren waren die meisten Domänen und vermuteten Proteininteraktionsstellen, die für HIV-1 Nef beschrieben wurden, konserviert [33]. Das N-terminale Myristylierungssignal, die saure Region, das Di-Arginin-Motiv, die C- 3 Ergebnisse Abb. 4: AS-Sequenzvergleich der primären SIVsmm Nef zeigt keine Defekte. Repräsentative SIVsmm Nef AS-Sequenzen wurden mit der Consensussequenz (n=129) aller verfügbarer Sequenzen aus dieser Studie verglichen. Punkte zeigen Übereinstimmung mit der Consensussequenz, während Buchstaben Unterschiede bedeuten. In HIV-1 Nef bekannte Motive sind in grau hervorgehoben. 29 3 Ergebnisse proximale Adapter-Protein Bindestelle und die putative V1H-Bindestelle sind im Gegensatz zu dem Prolin-Reichen Motiv, das bei SIVsmm gewöhnlich nur zwei statt drei Prolin-Reste enthält, unverändert. Es folgte die Analyse der nef-Allele auf deren Aktivität in der Herabregulierung von CD3, CD4, MHC-I, CD28 und CXCR4 von der Oberfläche infizierter PBMCs. Um Primärzellen mit hoher Effizienz zu transduzieren, wurden pseudotypisierte Viruspartikel hergestellt. Diese tragen zusätzlich das Hüllprotein des Vesikulären Stomatitis Virus (VSV-G) auf ihrer Oberfläche [14]. Der Effekt von Nef auf die Partikelinfektiosität kann so Abb. 5: Selektiver Verlust der Nef-Vermittelten TCR-CD3 Herabregulierung während der späten Phase des Infektionsverlaufes. (A) Beispiel der Dot-Plots aus der durchflusszytometrischen Analyse der Rezeptormodulation diverser Nef-Allele. Die angegebenen MFI-Werte der Y-Achse sind ein Maß für Rezeptorexpression auf der Zelloberfläche. (B) Quantitative Analyse der Nef-vermittelten Herabregulierung der Angegebenen Oberflächenmarker auf PBMCs (CD4, CD3, CD28 und MHC-I) und Jurkat T-Zellen (CXCR4). SIVsmm nef-Allele sind in Gruppen eingeteilt worden, die dem Zeitpunkt der Entnahme aus dem jeweiligen SIVsmm-infizierten Affen entsprechen. Jedes Symbol kennzeichnet die nfache Herabregulierung des Rezeptors von einem der 39 untersuchten primären nef-Allele. (C) Expression von CD69 auf der Oberfläche infizierter Zellen. Die MFI-Werte wurden 1 Tag nach Stimulation gemessen und sind relativ zum nef-defekten Kontrollkonstrukt dargestellt. (D) Analyse von infizierten Jurkat TZellen, die Luziferase unter Kontrolle des NFAT-abhängigen Promoters exprimieren. Die dargestellte Luziferaseaktivität ist der Durschnitt (±SD) aus Triplikaten und wurde 16 h vor der Messung durch PHAStimulierung induziert. 30 3 Ergebnisse umgangen werden und es wurden ähnliche Mengen an Zellen infiziert [5]. Die Koexpression von Nef und eGFP erlaubt die einfache Unterscheidung von infizierten (eGFP+) und uninfizierten (eGFP-) Zellen im FACS. Diese Zellen können dann mit fluoreszierenden Antikörpern gegen Oberflächenrezeptoren markiert werden, was die Korrelation der Nef-Expression mit der Rezeptormodulation erlaubt. Ein Beispiel ist in Abbildung 5A dargestellt. Zur Kalkulation der n-fachen Rezeptormodulation wurde die rote mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der infizierten Zellen des nef-defekten (nef-) Kontrollkonstrukts, durch die MFI des jeweiligen nef-Allels geteilt. Während die Fähigkeit von Nef CD4 und MHC-I zu modulieren stabil blieb oder sogar zunahm, zeigte sich ein dramatischer Abfall der TCR-CD3-Modulation (Abb. 5B). Im Affen FBr konnte ein totaler Verlust der CD3 Funktion ab Woche 225 nach Infektion beobachtet werden. Dieser Funktionsverlust blieb bis zum Ende des Beobachtungszeitraums (365 wpi) bestehen. In FFr war der Effekt nicht so drastisch wie in FBr, jedoch verloren auch hier die nef-Allele nach und nach die Fähigkeit der CD3 Herabregulierung. Bemerkenswert ist auch die 2-fache Zunahme der CXCR4-Modulation. Bei FBr konnte dieser Anstieg schon nach 47-52 wpi, bei FFr erst im späteren Infektionsverlauf beobachtet werden. Die Effizienz CD28 herabzuregulieren nahm gegen Ende des Beobachtungszeitraums ab. Das begünstigt die effektive Aktivierung infizierter T-Zellen. In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass die Nef-vermittelte Herabregulierung des TCR-CD3-Komplex die Sensitivität infizierter Zellen gegenüber exogener Stimuli herabsetzt [83]. CD69 ist ein Marker für frühe T-Zellaktivierung. Übereinstimmend mit dem Verlust der CD3-Modulation zu späteren Zeitpunkten wurde eine erhöhte CD69-Expression auf der Oberfläche infizierter PBMCs als Reaktion auf PHA-Stimulation beobachtet (Abb. 5C). Durch die Stimulierung der T-Zellen wird eine intrazelluläre Signalkaskade aktiviert, an deren Ende NFAT (engl.: nuclear factor of activated T-cells) steht. NFAT ist ein Transkriptionsfaktor des IL-2 Gens und reguliert dessen Expression, welches ein Kennzeichen für T-Zellaktivierung ist. Jurkat T-Zellen, die stabil mit dem Luziferase-Gen unter Kontrolle des NFAT-abhängigen Promoters transfiziert sind [32], wurden mit den proviralen HIV-1 NIG Reporterviren transduziert. Drei Tage später untersuchten wir deren Reaktivität auf Stimulierung. Auch mit dieser Methode zeigte sich ein klarer Anstieg der Aktivierung ab 225 wpi bei FBr bzw. ab 340 wpi bei FFr (Abb. 5D). 31 3 Ergebnisse 32 Zusätzlich zu den bisher beschriebenen Funktionen steigert Nef die Infektiosität viraler Partikel [1,17,64]. Um zu untersuchen, ob dies auch für primäre SIVsmm nef-Allele zutrifft, wurden TZM-bl Indikatorzellen [75,100] mit den HIV-1 Reporterviren transduziert. Alle für den jeweiligen Zeitpunkt repräsentativen nef-Allele, außer FBr75w2, Abb. 6: SIVsmm FBr und FFr Nef verstärken die Partikelinfektiosität. (A) TZM-bl Reporterzellen wurden mit HIV-1 NIG infiziert, die die angegebenen SIVsmm Nef Proteine oder kein Nef exprimieren. Die Zellen wurden mit Virusstock, der 1 ng p24 enthält, in Triplikaten infiziert. Es sind Durchschnittswerte (n=3) der quantifizierten ß-Galaktosidaseaktivität (±SD) dargestellt. (B) Korrelation zwischen den Ergebnissen der Infektiositätstests mit TZM-bl und P4-CCR5 Reporterzellen. FBr107wC8 und FFr107wC2 verstärken die Partikelinfektiosität effektiv (Abb. 6A). Das gleiche wurde mit HeLa-CD4/LTR-lacZ Indikatorzellen (P4-CCR5) beobachtet (Abb. 6B). Diese Ergebnisse sind das erste Beispiel für eine in vivo Selektion von Nef-Proteinen, die im Zuge der Adaptation an ein neues Wirtsmilieu, die Fähigkeit CD3 herabregulieren verloren haben. Der HIV-1-ähnliche Nef-Phänotyp im natürlichen SIVsmm infizierten Wirt ist also eine Folge der niedrigen CD4+ T-Zellzahlen und nicht der Grund dafür. Die beiden Rauchgrauen Mangaben FTv und FJv wurden experimentell mit Plasma des Tieres FBr vom Zeitpunkt 225wpi infiziert. Erstaunlicher Weise setzte bei ihnen der CD4+ T-Zellverlust schon 1-2 Wochen nach Infektion ein und erreichte seinen Tiefpunkt bereits nach 4 Wochen (Abb. 3A rechts). Die Viruslast sank parallel dazu ebenfalls schneller ab als bei FBr und FFr, was vermutlich mit dem schnellen Wirtszellverlust Abb. 7: In FJv wurden nefAllele selektioniert, die CD3 nicht herabregulieren können. Quantitative Analyse der Nef-vermittelten TCR-CD3 Rezeptormodulation. Jedes Symbol entspricht der nfachen Aktivität eines Nefs vom angegebenen Tier/ Zeitpunkt. zusammenhängt 3B links). Auch (Abb. von diesen Tieren (FTv und FJv) wurden nef-Allele auf Rezeptormodulation von der Oberfläche 3 Ergebnisse 33 infizierter Zellen untersucht. Hier konnte allerdings nur bei einem Mangaben (FJv) der selektive Verlust der TCR-CD3 Modulation beobachtet werden (Abb. 7). 3.2 I123L und L146F sind in SIVsmm Nef für den selektiven Verlust der TCRCD3 Herabregulierung verantwortlich Im AS-Sequenzvergleich zeigt sich, dass die CD3-defekten Nefs sich in nur drei Positionen von aktiven unterscheiden (Abb.8). Dabei handelt es sich um die Substitutionen I123L, L146F und H181Q, die alle im konservierten Kernbereich des Proteins liegen. Um zu untersuchen, ob diese 3 Substitutionen mit dem selektiven Verlust der TCR-CD3 Modulation verbunden sind, wurden Nef-Mutanten hergestellt. Die AS wurden jeweils einzeln oder in Kombination ausgetauscht. So wurden die AS, die in inaktiven Nef-Proteinen vorkommen, in das aktive SIVsmm FBr75wL4 Nef eingefügt, um die CD3-Modulation auszuschalten (Loss-of-function). Die im aktiven Nef präsenten AS Abb. 8: SIVsmm nef-Allele die CD3 nicht herabregulieren können unterscheiden sich durch 3 ASSubstitutionen von den aktiven. Dargestellt ist die AS-Sequenz des sogenannten Kernbereiches von Nef. Der Ausschnitt befindet sich im grauen Bereich des Proteins, wie im Schema gezeigt. Buchstaben bedeuten Substitutionen, während Punkte Übereinstimmungen kennzeichnen. Die 3 AS-Substitutionen sind hervorgehoben. Grün zeigt Fähigkeit zur CD3 Herabregulierung an, rot Inaktivität in der Funktion. wurden in die inaktiven SIVsmm FBr225wH1 und K2 Nefs eingefügt, um die CD3Modulation wiederherzustellen (Gain-of-function). Anschließend wurden diese nefMutanten in das provirale Konstrukt pBR-NIG kloniert und Virusstocks hergestellt, um PBMCs zu transduzieren. Die nef-Allele, welche nur eine Mutation enthalten, zeigen meist einen intermediären Phänotyp (Abb. 9). Unter den Einzelmutanten zeigten Veränderungen an der Position 123 die stärksten Effekte. Etwas geringer waren die Auswirkungen auf die CD3-Modulation, wenn die Position 146 mutiert wurde. Position 181 hatte keinen Einfluss. Im Einklang hiermit war die Kombination der Substitutionen an 3 Ergebnisse Abb 9.: Die AS-Substitutionen an den Positionen 123 und 146 sind für die TCR-CD3-Modulation verantwortlich. Quantitative Analyse der Nef-vermittelten TCR-CD3 Rezeptormodulation. Dargestellt ist die n-fache Herabregulierung im Vergleich zu Nef- (kein Nef). WT (Wildtyp) bezeichnet das ursprünglich isolierte SIVsmm nef-Allel, für die Mutanten sind die Substitutionen angegeben. Die roten Balken bedeuten keine CD3-Modulation, während die grünen das aktivste Nef der Serie markieren. den ersten beiden Stellen (I123L+L146F) ausreichend, um die CD3-Modulation im aktiven FBr75wL4 Nef zu eliminieren. Im Gegensatz dazu bewirken die Mutationen L123I und F146L zusammen in den inaktiven nef-Allelen FBr225wH1 und 225wK2 eine vollständige Wiederherstellung (vgl. Abb. 3B) dieser Funktion. Der Effekt konnte durch Hinzufügen der dritten Mutation (181) nicht verstärkt werden. Somit ist die Kombination der Substitutionen an den Positionen 123 und 146 in SIVsmm Nef für die Herabregulierung von TCR-CD3 verantwortlich. Da der Kernbereich von Nef wichtig für dessen Tertiärstruktur und somit auch für die Funktionalität des gesamten Proteins ist, wurden auch andere konservierte Nef-Funktionen untersucht. Wie erwartet wurden durch die eingefügten Mutationen keine anderen Nef-Eigenschaften, wie die Herabregulierung von CD4, MHC-I und CXCR4, sowie CD28 beeinflusst (Abb. 10). Es handelt sich damit um selektive Änderungen, die in vivo selektioniert wurden. Die CD3-Modulation kann also in SIVsmm Nef von anderen Funktionen genetisch getrennt werden. 34 3 Ergebnisse Abbildung 10: Die dargestellten Mutationen in SIVsmm Nef beeinflussen die weiteren untersuchten Nef-Funktionen nicht. Die AS-Substitutionen an den Positionen 123 und 146 in SIVsmm Nef, welche die CD3-Modulation determinieren, haben keinen Einfluss auf die CXCR4- (A), CD28- (B), MHC-I- (C) und CD4-Modulation (D). NA7 Nef ist ein HIV-1 nef-Allel, das als Kontrolle diente. In rot sind nef-Allele hervorgehoben, die CD3 nicht herabregulieren können; grüne sind aktiv. 35 3 Ergebnisse 36 3.3 Die AS-Substitutionen I123L und L146F verhindern eine effektive Bindung von SIVsmm Nef an die ζ-Kette des TCR-CD3-Komplexes Das SIVmac239 Nef Protein bindet an zwei Elemente in der zytoplasmatischen Domäne der CD3-δ Untereinheit des TCR-CD3-Komplexes. Es konnte gezeigt werden, dass diese Interaktion mit der Fähigkeit von Nef korreliert, die Expression von TCR-CD3-Komplexen auf der Zelloberfläche zu verringern [80,81]. Wie auch bei anderen Oberflächenrezeptoren, die von Nef herabreguliert werden, erfolgt dies durch Endozytose [93]. Um zu untersuchen, ob die beiden AS-Substitutionen in SIVsmm Nef auch direkte Auswirkung auf die Beschleunigung der CD3-Endozytose, haben wurden Jurkat T-Zellen mit dem pCG-NIG Expressionsplasmid transfiziert. Es exprimiert das jeweilige nef-Allel oder ein defektes Nef (nef*) zusammen mit eGFP von einer bicistronischen mRNA. So wird Nef und eGFP im gleichen stöchiometrischen Verhältnis hergestellt, was die Unterscheidung von transfizierten und nicht-transfizierten Zellen im Durchflusszytometer erlaubt. Ein Tag später wurden die Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen CD3 gefärbt und für die angegebene Zeit inkubiert (Abb. 11). Anschließend wurden die Zellen aufgeteilt. Von einer Hälfte wurden die gesamten Oberflächenmoleküle durch Waschen mit saurem (pH2) Medium entfernt. Dann wurden die beiden Fraktionen im FACS auf CD3-Expression analysiert. Setzt man nun die Messwerte für CD3 beider Zellfraktionen ins Verhältnis, erhält man ein Maß für die Rezeptorinternalisierung [37]. Wie in Abbildung 11 dargestellt, sind die größten Effekte bereits nach 2 bzw. 5min zu erkennen. Hier erhöht das aktive Kontroll-Nef mac239 die Endozytoserate Erwartungsgemäß Mutationen etwa um (Vgl. Abb. 9) L123I+F146L in das 5-fache. verstärkten 225wH1 Nef die die Internalisierungsrate um das 4-fache (im Vergleich zum WT). Im Gegensatz dazu bewirkten die Substitutionen Abb. 11: AS-Substitutionen an den Positionen 123 und 146 beeinflussen die Nef-vermittelte CD3 Endozytoserate. Jurkat T-Zellen wurden mit dem pCG-NIG Expressionsplasmid transient transfiziert und expimieren die Angezeigten nefallele zusammen mit eGFP, oder nur eGFP (nef*) von einer bicistronischen mRNA. HIV-1 NL4-3 Nef ist in rot dargestellt und SIVmac239 Nef als Positivkontrolle in grün. 3 Ergebnisse 37 I123L+L146F im 75wL4 Nef ein Absinken der Rate auf das Hintergrundlevel von Nef* (kein Nef). In Experimenten mit transient transfizierten nicht-lymphatischen 293T-Zellen konnte bestätigt werden, dass die Substitutionen an den Positionen 123+146 in SIVsmm Nef ausreichen, um die Endozytoserate vom TCR-CD3-Komplex spezifisch zu determinieren. Die Kerndomäne des SIVmac239 Nef bindet an zwei Elemente der Zytoplasmadomäne der CD3-δ (CD247) Untereinheit des TCR-CD3-Komplexes [80]. Diese Interaktion ist auch in HIV-2 Nef konserviert [43]. Da SIVsmm der Vorläufer beider Immundefizienzviren ist, wurde vermutet, dass die beiden Substitutionen die Bindung zur CD3-δ Kette beeinflussen. Um dies zu überprüfen, wurden zunächst Fusionsproteine hergestellt. Diese bestehen aus dem kompletten nef-Leserahmen, der am 3‘-Ende um eine kleine Sequenz verlängert wurde. Es handelt sich um einen Sequenzausschnitt der für das Hämagglutinin (HA), das Glykoprotein des Influenzavirus-A, kodiert. Dieser Schritt erlaubt es, alle Nef-Proteine vom gleichen Antikörper und mit gleicher Effizienz zu detektieren. HA-markierte Varianten von Nef und CD3-δ wurden in 293T-Zellen überexprimiert und koimmunpräzipitiert, anschließend auf einem Gel aufgetrennt und auf eine Membran geplottet, um die Proteine per Antikörperbindung nachzuweisen. Es Abb. 12: AS-Positionen 123+146 regulieren die Bindung an die CD3 ζ-Kette. (A) Koimmunpräzipitation (Ko-IP) mit den angegebenen Nef.HA Varianten und CD3-δ. Nef.HA oder nicht funktionelles (nef*) und CD3-δ wurden überexprimiert und gleiche Mengen an Zelllysat für die Ko-IP mit anti-HA verwendet. IPFraktion ist im oberen Abschnitt, die ungebundene Fraktion im mittleren bzw. im unteren Teil des repräsentativen Experiments. (B) Quantifizierung der mit Nef.HA koimmunopräzipitierten CD3-δ (Bandenintensität). Dargestellt sind Mittelwerte (n=3) (±SD). (C) FACS-basiertes FRET Experiment. 293T Zellen wurden mit CD3-δ- und Nef-Fusionsproteinen (YFP-, bzw. CFP-Fusionsproteinen) transfiziert und deren Interaktion (FRET-Signal) im FACS überprüft. 3 Ergebnisse 38 zeigte sich, dass CD3-δ effektiv an mac239, 225wH1 L123I+F146L und 75wL4 Nef binden kann (Abb. 12A oben). Wohingegen eine sehr schwache Bindung mit 225wH1 und 75wL4 I123L+L146F oder keine mit NL4-3 Nef nachgewiesen werden konnte. Es wurde immer die gleiche Menge an Protein und Zelllysat eingesetzt (Abb. 12A Mitte, unten). Die Quantifizierung der CD3-δ Bandenintensität aus 3 unabhängigen Experimenten zeigte einen hochsignifikanten Anstieg der Bindungskapazität von 225wH1 Nef, sobald die Mutationen L123I+F146L eingefügt wurden (Abb. 12B). Im Gegensatz dazu bewirkten die umgekehrten Mutationen in 75wL4 eine signifikante Abschwächung der Bindefähigkeit. Das gleiche Ergebnis konnte mit dem Durchflusszytometer basierenden FRET-Experiment (engl.: Fluorescence resonance energy transfer) erzielt werden. Diese Methode zeigt, ob sich zwei Moleküle in unmittelbarer räumlicher Nähe zueinander befinden, was mit Hilfe der Energieübertragung von einem Fluorochrom auf ein anderes detektiert werden kann. Somit ist dies ein indirekter Nachweis der Bindung zweier Partner. Die jeweiligen nef-Allele und CD3-δ wurden mit CFP oder YFP (engl.: Cyan- oder Yellow fluorescent protein) fusioniert. Anschließend wurden Zellen mit beiden Konstrukten kotransfiziert und im Durchflusszytometer analysiert. Es wurde spezifisch CFP angeregt und die YFP-Emission gemessen. Zusammengefasst bewirken die AS 123I+146L eine deutlich erhöhte Population an FRET-positiven Zellen, im Vergleich zu Nef Proteinen mit 123L+146F. Es konnte früher bereits gezeigt werden, dass im Gegensatz zu NL4-3, SIVmac239 Nef und CD3-δ des TCR-CD3 kooperativ AP-2 (Adapterprotein) binden können [93]. Dies führt zu einer Umverteilung der CD3-Untereinheit, die normalerweise an der zytoplasmatischen Seite der Zellwand lokalisiert ist und dort ihre Funktion ausübt. Man findet sie dann hauptsächlich in kleinen punktartigen Kompartimenten im Zytoplasma wieder, die in einer Region nahe des Zellkerns akkumulieren. Die beiden Substitutionen determinieren in SIVsmm Nef die Bindung an CD3-δ und deren Herabregulierung. Falls dieser Vorgang ebenfalls endozytosevermittelt ist, sollte auch hier diese Umverteilung und Kolokalisation stattfinden. Um zu untersuchen, ob die Mutationen diesen Vorgang beeinflussen, wurden HeLa Zellen mit HA-markierten nef-Allelen und dem 8-δ.eGFP Konstrukt transient transfiziert. Letzteres besteht aus der Ecto- und Transmembrandomäne des humanen CD8 Rezeptors und der zytoplasmatischen Domäne 3 Ergebnisse Abb. 13: Die AS an den Positionen 123+146 sind für die Kolokalisierung von SIVsmm Nef und der ζKette verantwortlich. HeLa Zellen wuchsen auf Deckgläschen, wurden mit dem Fusionsprotein CD8δ.eGFP in Kombination mit den angegebenen HA-markierten Nef-Proteinen transient transfiziert und nach der Immunofärbung auf einem Objektträger befestigt. Konfokale Bilder wurden aufgenommen und im Scatter-Plot auf Kolokalisation der beiden Signale überprüft. Hierzu wurde das Bestimmtheitsmaß (R²) der Funktion angegeben. 39 3 Ergebnisse 40 der CD3-δ Kette (AS 52-164), an deren C-Terminus eGFP fusioniert wurde [47,80,93]. Die Zellen wurden permeabilisiert, fixiert und nach Immunofärbung der Nef.HA Varianten mit floureszenzmarkierten Antikörpern im konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop analysiert. HIV-1 NL4-3 Nef kann den TCR-CD3-Komplex nicht von der Zelloberfläche herabregulieren. 8-δ kann somit hauptsächlich an der Zelloberfläche detektiert werden und kolokalisiert nicht mit NL4-3 Nef (Abb. 13). SIVmac239 Nef hingegen bindet an die CD3 Untereinheit, reguliert diese von der Zelloberfläche herab und kolokalisiert mit CD3-δ (R²=0,72). Betrachtet man die SIVsmm nef-Allele 225wH1 und 75wL4 I123L+L146F, so fällt auf, dass das grüne Signal von CD3-δ gleichmäßig über die gesamte Zelloberfläche verteilt ist. Es findet keine Überlagerung mit dem roten Nef-Signal statt. Die Nefs 225wH1 L123I+F146L und 75wL4 können CD3 herabregulieren und man kann eine Umverteilung des grünen Signals von der Zelloberfläche in kleine punktartige Strukturen erkennen. Es handelt sich dabei wahrscheinlich um Endosomen, in denen CD3-δ zusammen mit Nef vorkommt. Die Überlagerung der Fluoreszenzsignale beider Kanäle wurde in der letzten Spalte als Beispiel für die abgebildeten Zellen dargestellt. In diesen Scatter-Plots ist das Bestimmtheitsmaß als Quantifizierung für die Überlagerung der Signale angegeben. So erkennt man, dass die AS an den Positionen 123+146 in SIVsmm Nef einen hochsignifikanten Unterschied in der Kolokalisation mit CD3-δ bewirken (Abb. 14A). Dies geschieht in selektiver Art und Weise und beeinflusst die ebenso AP-2-abhängige Herabregulierung von CD4 nicht (Abb. 14B). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Anwesenheit der AS 123I und 146L für die Herabregulierung des TCR-CD3-Komplex essentiell sind. Sie sind verantwortlich für die Bindung an CD3-δ. Die effiziente Bindung ist Abb. 14: Mutationen an den Positionen 123+146 bewirken hochsignifikante Veränderungen in der Kolokalisation von SIVsmm Nef mit der CD3-ζ-Kette, jedoch keine Unterschiede mit CD4. Quantifizierung der Kolokalisation zwischen den Nef.HA Varianten und der CD3-δ Untereinheit (A) oder CD4 (B) als Kontrolle. Dargestellt sind Durchschnittswerte des Bestimmtheitsmaßes aus 3-4 Experimenten (±SD). Grüne Balken repräsentieren nefAllele, die CD3 herabregulieren können, rote sind nicht dazu fähig. 3 Ergebnisse mit der beschleunigten Internalisierung und der Kolokalisation von CD3-δ und SIVsmm Nef assoziiert. 3.4 Selektive Eliminierung der SIVmac239 Nef-vermittelten TCR-CD3 Herabregulierung Um die in vivo Relevanz der CD3 Herabregulierung im Tiermodell zu untersuchen wäre eine Mutante, die für diese Funktion selektiv Defekt ist, gut geeignet. So wäre die Konvertierung des asymptomatischen SIVsmm Phänotyp, durch Eliminierung der CD3-Modulation in einen progressiven Phänotyp, das beste Modell. Unglücklicher Weise sind Rauchgraue Mangaben derzeit nicht für solche Tierversuche verfügbar. SIVsmm ist der Vorläufer von SIVmac239 und deren nef-Sequenz ist stark konserviert. Es wurde der Versuch gestartet eine SIVmac239 Nef Mutante herzustellen, die in der CD3-Modulation selektiv defekt ist. SIVmac239 ist sehr pathogen in Rhesusaffen. Deshalb sollte SIVmac239, dessen Nef CD3 nicht herabregulieren kann und somit indirekt die T-Zellaktivierung erhöht, einen noch aggressiveren Phänotyp ausbilden. Die zweite Möglichkeit ist eine bessere Immunantwort und dadurch die Kontrolle der Virusinfektion. Somit könnten in sehr kurzer Zeit relevante in vivo Daten erhalten werden. Ein AS-Alignment mit Sequenzen von SIVsmm Nef-Proteinen die inaktiv in der CD3-Modulation sind und SIVmac239 Nef zeigte im Kernbereich Unterschiede an vier Positionen (Abb. 15). Es handelte sich um die Stellen 123, 146 und 181, von denen die ersten beiden in SIVsmm Nef für die CD3-Modulation verantwortlich sind und eine Abb. 15: Im Kernbereich sind generell nur vier AS-Variationen zwischen SIVmac239 Nef und SIVsmm Nef-Proteinen, die CD3 nicht herabregulieren können, zu erkennen. Dargestellt ist ein Ausschnitt des AS-Sequenzvergleich zwischen SIVmac239 Nef (grün umrandet) und repräsentativen SIVsmm NefProteinen, die CD3 nicht modulieren können (rot umrandet). Die anderen Sequenzunterschiede sind nicht konserviert oder ebenfalls in aktiven SIVsmm nef-Allelen vorhanden. Der Ausschnitt befindet sich im grauen Bereich des Proteins, wie im Schema gezeigt. Sequenzhomologie ist durch Punkte gekennzeichnet, während Buchstaben die Substitutionen anzeigen. Orange markiert sind die vier generellen Sequenzunterschiede. 41 3 Ergebnisse 42 Abb. 16: SIVmac239 Nef I123L+L146F kann den TCR-CD3-Komplex nicht mehr Herabregulieren. PBMCs sind mit HIV-1 NL4-3 NIG Konstrukten, die die angegebenen nef-Allele exprimieren, transduziert worden. Gezeigt sind HIV-1 NL4-3 Nef (schwarz), SIVmac239 WT Nef (grün) und Mutanten. Anschließend wurde die Expression von CD3, CD4, CD28 und MHC-I untersucht. Die Nef-vermittelte Modulation der Rezeptoren wurde wie weiter oben bereits beschrieben berechnet. Die gestrichelten Linien zeigen entweder das Level von Nef-, also keine Aktivität (CD3), oder das von SIVmac239 WT (CD4, CD28, MHC-I). Dargestellt sind Mittelwerte (n=3) (±SD). weitere an Position 158. Analog wurden die AS durch diejenigen substituiert, die in den CD3-defekten Nef-Varianten anwesend sind. Die nef-Mutanten wurden in das provirale Konstrukt pBR-NIG kloniert. Dann wurden Virusstocks hergestellt, mit denen PBMCs transduziert wurden, um die Nef-vermittelte Modulation von Oberflächenrezeptoren zu untersuchen. In SIVmac239 Nef ist die Kombination der beiden Substitutionen I123L+L146F ebenfalls ausreichend um die CD3 Herabregulierung vollständig auszuschalten (Abb. 16 links). Die zusätzliche Mutation N181Q hatte hier, genauso wie im SIVsmm Nef, keinerlei Auswirkung auf die Abb. 17: SIVmac239 Nef Mutanten können die TZellaktivierung nicht blockieren. Jurkat-NFAT Zellen wurden mit VSV-G pseudotypisierten HIV-1 NIG Viren transduziert und die Reportergenaktivität im Gesamtzelllysat nach Stimulation mit PHA gemessen. Dargestellt sind Mittelwerte (n=4) (±SD). Die gestrichelte Linie zeigt das Level vom SIVmac239 WT an. CD3-Modulation. Es sind keine Unterschiede in der Modulation von CD4 und CD28 zu beobachten. Die Substitutionen I123L+L146F+D158N verursachen eine Reduktion der MHC-I Herabregulierung von 3-facher auf 2-fache Aktivität. Somit konnte SIVmac239 Nef auch ein generiert 3 Ergebnisse werden, das inaktiv für die TCR-CD3 Herabregulierung ist. Um zu überprüfen, ob die Eliminierung der CD3-Modulation Auswirkungen auf die T-Zellaktivierung hat, wurden Jurkat NFAT Zellen mit den pBR-NIG Reporterviren transduziert. Diese Zelllinie ist stabil mit dem Luziferase-Gen unter Kontrolle des NFAT Promoters transfiziert. Nach Aktivierung der Jurkat-NFAT Zellen wird die Genexpression über den NFAT-Promoter zu untersuchen. Die exprimierte Luziferase kann quantifiziert werden und ist ein Maß für den Aktivierungszustand der Zellen. Bereits die Infektion mit Viren, die kein nef-Gen enthalten (nef-), erhöht den Aktivierungszustand um das 5-fache (Abb. 17). Dieser Effekt ist Nef-unabhängig und dem mitgeführten Transaktivatorprotein Tat (engl.: transactivator of transcription) zuzuschreiben. Eine Hemmung der T-Zellaktivierung beobachtet man beim SIVmac239 WT Nef, wohingegen HIV-1 NL4-3 Nef und die SIVmac239 Mutanten einen verstärkenden Effekt auf die Reportergenexpression ausüben. Eine wichtige Funktion von Nef ist die direkte Erhöhung der Partikelinfektiosität [1,17,64]. Nun wurde die Auswirkung der Mutationen im konservierten Kernbereich auf Abb. 18: Die mutierten SIVmac nef-Allele erhöhen die Partikelinfektiosität und verstärken die Virusausbreitung. (A) Infektiosität der HIV-1 NIG Varianten, welche die dargestellten nef-Allele Exprimieren. P4-CCR5 Reporterzellen wurden mit den HIV-1 NIG Konstrukten infiziert, die die angegebenen nef-Allele oder kein Nef (nef-) exprimieren. Die Infektionen wurden in Triplikaten mit Virusstock gemacht, der 1 ng p24 Antigen enthält. Dargestellt sind Mittelwerte (n=3) (±SD). (B) Replikationskinetik von rekombinanten HIV-1 NIG Viren. Vorstimulierte PBMCs wurden mit 1 ng p24 enthaltendem Virusstock infiziert. Die Anzahl der HIV-1 infizierten Zellen (eGFP pos.) wurde an den Tagen 1, 3, 5, 7, 10 und 12 nach Infektion untersucht (dpi). (C) Gesamtzahl der infizierten Zellen während des Experiments im Vergleich zum SIVmac239 WT Nef (=100%). Die gestrichelten Linien geben das Level des SIVmac239 WT Nef an. Gezeigt sind Prozentwerte (n=2) (±SD). 43 3 Ergebnisse die Infektiosität untersucht. Dies wurde getestet, indem man die gleiche Anzahl an P4-CCR5 (HeLa-CD4/LTR-lacZ) Indikatorzellen mit der gleichen Menge pBR-NIG Viren infizierte. Diese Zelllinie exprimiert an ihrer Oberfläche CD4 zusammen mit den beiden Korezeptoren CCR5 und CXCR4 und als Reportergen die ß-Galaktosidase unter der Kontrolle des HIV-1 LTR-Promoters. So kann die im Luminometer gemessene ß-Galaktosidase-Aktivität als Maß für die Infektiosität betrachtet werden. Diese wurde 3 Tage nach der Infektion gemessen (Abb 18A). Alle untersuchten SIVmac Nefs steigerten die Partikelinfektiosität. Etwas überraschend erhöhte die Kombination der Substitutionen I123L+L146F die Infektiosität, sobald eine dritte Mutation hinzugefügt wurde, sank sie wieder auf den Wert des SIVmac239 WT Nef. Es ist bekannt, dass die Funktion von Nef die Partikelinfektiosität zu erhöhen und die Stimulation der viralen Replikation in primären T-Zellen nicht miteinander korrelieren und daher zwei unabhängige Funkionen widerspiegeln [60]. Deshalb wurde untersucht, ob die Mutationen eine Auswirkung auf die Virusverbreitung in PBMCs haben. Wie man in Abbildung 18B erkennt, unterstützen alle SIVmac239 Nefs die Virusverbreitung. Betrachtet man die Gesamtheit an infizierten Zellen während des Experiments (Abb. 18C), unterstützen die Mutanten (135- 138,5 %) die Verbreitung sogar noch besser als der WT (100 %). Wie erwartet wirkt sich der Verlust der CD3-Modulation auf die T-Zellaktivierung aus und führt indirekten zur erhöhten Verbreitung der Viruspartikel. Somit sind SIVmac239 Nef-Proteine hergestellt worden, die einen Defekt in der CD3-Modulation aufweisen und geeignete Kandidaten für weitere Untersuchungen darstellen. 44 4 Diskussion 4 Diskussion Ein typisches Kennzeichen von AIDS in Menschen ist der Verlust von CD4+ T-Zellen. Im Gegensatz dazu verläuft eine SIV-Infektion bei natürlichen Wirten wie Rauchgrauen Mangaben normalerweise asymptomatisch mit stabilen CD4+ T-Zellzahlen. Es gibt jedoch Ausnahmen, zu denen die zwei hier untersuchten Affen gehören. Die beiden Mangaben FBr und FFr erlitten während des Infektionsverlaufes einen dramatischen und chronischen Verlust der CD4+ T-Zellen (Abb. 3). Dieser Verlust erreichte seinen Tiefpunkt im Fall von FFr zum Zeitpunkt 63 wpi, bzw. 79 wpi im Fall FBr. Fortan belief sich die Menge an CD4 + T-Zellen pro μl Blut beim Affen FFr auf ca. 25-35 und bei FBr auf ca. 25-65 (normal ist >500). Besonders bemerkenswert ist, dass selbst der fast komplette Verlust der CD4+ T-Zellen in den natürlichen Wirten von SIVsmm nicht ausreicht, um AIDS hervorzurufen. Eine frühere Studie zeigte, dass der Verlust der CD4+ T-Zellen in den beiden Rauchgrauen Mangaben die Folge eines auf CXCR4 und CCR8 erweiterten Korezeptortropismus des Virus war [66]. Die Fähigkeit den CXCR4-Rezeptor zu benutzen, entwickelt sich auch in ca. 50% aller AIDS-Patienten [16,86,95]. In Menschen, wie auch in experimentell infizierten Rhesusaffen, ist dies mit einem rapiden Verlust der T-Helferzellen und beschleunigter AIDS-Progression verbunden [38,46,48,76]. Es gibt erste Hinweise darauf, dass die Nef-vermittelte Herabregulierung von CD3 infizierte Rauchgraue Mangaben vor erhöhter T-Zellaktivierung und dem Verlust ihrer CD4+ T-Zellen bewahrt [83,84]. Die vorliegende Doktorarbeit zeigt, dass Nef in den beiden Mangaben in Folge der niedrigen CD4+ T-Zellzahlen die Fähigkeit zur CD3-Herabregulierung verliert. So waren SIVsmm nef-Allele aus dem Affen FBr ab dem Zeitpunkt 225 wpi inaktiv in der CD3-Rerabregulierung. Der Funktionsverlust beschränkte sich ausschließlich auf die CD3-Modulation und ist somit ein selektiver Defekt. Die Tatsache, dass die CD4 + T-Zellzahl schon wesentlich früher ihren Tiefpunkt erreichte (79 wpi), legt nahe, dass dieser Vorgang eine Adaptation von Nef an das neue Umfeld im Wirt ist. Im Mangaben FFr zeigte sich ein ähnlicher Verlauf: Hier war 365 wpi noch kein totaler Verlust der CD3-Modulation erreicht, die Tendenz jedoch ist erkennbar gewesen. Somit trug Nef in diesen beiden Fällen nicht direkt zur Depletion der T-Helferzellen bei. Hier war die Erweiterung des Korezptortropismus von SIVsmm, das normalerweise CCR5-trop ist, ausreichend um den Verlust der Zellen zu bewirken. 45 4 Diskussion Die Erweiterung des Korezptortropismus bedeutet für das Virus eine erhebliche Vergrößerung des Zielzellspektrums. So exprimieren nur etwa 10-20 % der CD4+ T-Zellen den Rezeptor CCR5, wohingegen 80-90 % CXCR4 auf ihrer Oberfläche präsentieren [69,71]. Durch das Verwenden des Chemokinrezeptors CXCR4 können außerdem naive CD4+ T-Zellen infiziert werden. Die Funktion von Nef, den CXCR4 Korezeptor von der Oberfläche infizierter Zellen herabzuregulieren, steigt bei FBr 47-52 wpi und bei FFr 107 wpi stark an. Dadurch wird die Partikelinfektiosität der Viren gesteigert und eine Superinfektion verhindert [99,101]. Eine weitere Möglichkeit basiert auf den bekannten Funktionen des Chemokins SDF-1α, welches der Ligand von CXCR4 ist. Die Chemokin-abhängige Wanderung von Lymphozyten zu den sekundären lymphatischen Organen ist wichtig für die Entwicklung einer Immunantwort. Da ein Großteil der infizierten T-Zellen spezifisch für virale Antigene ist [28] kann so die Migration der infizierten T-Zellen zu den Lymphknoten blockiert werden und verhindert damit die effektive Etablierung einer Immunantwort [44,52]. Durch die Erweiterung der Korezeptoraffinität kann also die Mehrheit der CD4 + T-Zellen infiziert werden. Unter diesen sind auch viele naive T-Zellen, die einen ruhenden Phänotyp aufweisen und in diesem Zustand schlecht für die Virusproduktion geeignet sind. Nef könnte durch den Verlust der TCR-CD3-Modulation für eine Erhöhung der Suszeptibilität für exogene Stimuli sorgen und somit einen Aktivierungsstatus erlauben, der die virale Replikation verstärkt. Die vorliegende Doktorarbeit zeigt, dass SIVsmm NefProteine, die zu späten Zeitpunkten aus den beiden Rauchgrauen Mangaben isoliert wurden, die T-Zellaktivierung infizierter Zellen nicht mehr effektiv unterdrücken können. Dies wurde mit Hilfe zweier Methoden untersucht: Experimente in Jurkat-NFAT Reporterzellen zeigten, dass die SIVsmm nef-Allele von späten Zeitpunkten einen Effekt, ähnlich wie HIV-1 Nef haben. Sie verstärken die zelluläre Aktivierung als Reaktion auf exogene Stimuli (Abb. 5D). Infizierte PBMCs exprimieren durch den Verlust der Nefvermittelten Modulation des TCR-CD3-Komplexes wesentlich mehr CD69, einen frühen T-Zellaktivierungsmarker, auf ihrer Oberfläche (Abb. 5C). Übereinstimmend mit früheren Publikationen besteht also auch hier ein Zusammenhang zwischen der T-Zellaktivierung und der TCR-CD3-Expression an der Zelloberfläche [83,84]. Somit verändert sich im Verlauf einer Infektion die Aktivität des Persistenzfaktors Nef, dessen Aufgabe es in natürlichen Wirten ist, effektive Virusreplikation im Kontext eines intakten Immunsystems 46 4 Diskussion zu gewährleisten. Mit dem Verlust der Fähigkeit zur CD3-Modulation ähnelt der Phänotyp von SIVsmm Nef dabei dem von HIV-1 Nef, welches mit der Hyperaktivierung des Immunsystems und beschleunigter Progression zu AIDS in Verbindung steht [34,63,89]. Im Gegensatz zu HIV-1 war jedoch auch diese SIVsmm Variante in dessen natürlichem Wirt nicht pathogen. Die vorliegende Doktorarbeit beschreibt erstmals einen SIVsmm Phänotyp, der dem von HIV-1 in AIDS-Patienten ähnelt. Trotz extrem niedriger T-Zellzahlen und Eigenschaften wie CXCR4-Tropismus und fehlende CD3-Modulation entwickeln diese Wirte jedoch keine Immundefizienz. Dies spricht für fundamentale Unterschiede zwischen Menschen und den Raugrauen Mangaben, die offensichtlich Mechanismen entwickelt haben, um den Verlust der CD4+ T-Zellen zu kompensieren und so ihre Immunkompetenz bewahren. Es wurde postuliert, dass möglicherweise γδ-T-Zellen oder CD4-/CD8doppeltnegative T-Zellen kritische Aufgaben der T-Helferzellen übernehmen und den Ausbruch von AIDS verhindern [65]. Ob dies der Grund für den unterschiedlichen Infektionsverlauf ist, muss noch geklärt werden. Zwei weitere Rauchgraue Mangaben, FTv und FJv, wurden experimentell mit Plasma vom Tier FBr, das man zum Zeitpunkt 225 wpi entnommen hatte, infiziert. In beiden Tieren erreichte der Verlust an CD4+ T-Zellen bereits nach 4 wpi sein Maximum (61-30 CD4+ T-Zellen pro µl Blut) (Abb. 3A). Der Grund hierfür scheint wieder der erweiterte Korezeptortropismus zu sein (Publikation in Vorbereitung). Da die untersuchten nef-Allele von FJv CD3 nicht herabregulieren konnten, ist diese Nef-Funktion selektioniert worden. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die Fähigkeit von Nef, den TCR-CD3-Komplex von der Zelloberfläche herabzuregulieren, mit der Anzahl an CD4+ T-Zellen im Blut in Verbindung steht, jedoch nicht der Grund dafür ist. Es ist notwendig weitere Proben von späteren Zeitpunkten zu untersuchen, da der Verlust der CD3-Modulation, wie in den beiden Affen FBr und FFr, auch zeitversetzt selektioniert werden kann. Das bedeutet, dass Nef seine Funktionen verändert, um in der neuen Umgebung effektive Persistenz zu gewährleisten. Vergleicht man die AS-Sequenzen CD3-modulierender SIVsmm Nefs mit denen von selektiv defekten Allelen, so sind nur drei konsistente Unterschiede erkennbar (Abb. 4). Übereinstimmend mit den bisher bekannten Daten sind dies Substitutionen im konservierten Kernbereich von Nef, der für die Bindung zur CD3-δ Kette essentiell ist [81]. 47 4 Diskussion Es handelt sich um die in vivo selektionierten Mutationen I123L, L146F und H181Q. Mutationsanalysen zeigten, dass die Kombination der beiden AS an den Stellen 123 und 146 in SIVsmm für die Herabregulierung des TCR-CD3-Komplexes von der Zelloberfläche verantwortlich ist. So konnte die Funktion durch die Substitutionen I123L+L146F in einem repräsentativen Nef ausgeschaltet werden und umgekehrt durch die Mutationen L123I+F146L in inaktiven Allelen, in vollem Umfang angeschaltet werden (Abb. 9). Die dritte Mutation an Position 181 hatte dagegen in allen Experimenten keine erkennbare Funktion. Im SIVmac239 Nef waren die beiden Mutationen ebenfalls ausreichend um die CD3-Modulation vollständig und selektiv zu eliminieren (Abb. 16). Im Gegensatz zu SIVsmm nef-Allelen, die aktiv CD3 Herabregulieren, unterscheidet sich SIVmac239 Nef an vier AS-Positionen (123, 146, 158 und 181) von inaktiven SIVsmm nef-Allelen. Die Daten dieser Doktorarbeit zeigen, dass durch die Substitutionen an den Positionen 123, 146 in SIVsmm und in SIVmac239 Nef nur die CD3-Modulation und keine der weiteren Funktionen wie die CD4-, MHC-I-, oder CD28-Modulation eliminiert wurden. Lediglich die Partikelinfektiosität war im SIVmac239 Nef I123L+L146F im Vergleich zum WT stark erhöht. Mit der zusätzlichen Mutation D158N war sie vergleichbar mit dem WT Nef (Abb. 18). Übereinstimmend mit früheren Ergebnissen liegen diese Positionen im Kernbereich des Proteins [47]. Nef induziert die Endozytose von CD4 und CD28 über einen AP-2 abhängigen Weg [70,92]. Die Internalisierung von CD3 wird durch Nef ebenfalls über einen AP-2 vermittelten Prozess herbeigeführt. Allerdings erfolgt dies über eine neue, bisher unbekannte AP-2 Bindedomäne in Nef [44]. Dies erklärt warum die CD3-Modulation in Nef von anderen Funktionen unabhängig ist. Somit wurden hier erstmals Nef-Proteine, die einen selektiven Defekt in der CD3-Modulation haben, hergestellt. SIVmac239 Nef I123L+L146F+D158N ist damit ein geeigneter Kandidat, um im per se pathogenen Rhesusaffen-Modell zu untersuchen [50], ob der Verlust der CD3-Modulation von Nef die Pathogenität von SIVmac239 erhöht. TCR-CD3-Komplexe unterliegen einem ständigen Kreislauf aus Internalisierung und Recycling zur Zelloberfläche [55,58,67]. Dieses konstitutive Recycling erfolgt größtenteils unabhängig von CD3-δ und wird von Sortierungssignalen anderer Untereinheiten vermittelt [26,27,58]. Nach der Interaktion des TCR mit einem peptidbeladenen MHC-I-Komplex findet eine Herabregulierung statt, die allerdings nicht mit einer gesteigerten Endozytose zusammenhängt. Vielmehr reflektiert dies eine Blockierung des 48 4 Diskussion 49 Recyclings zur Zytoplasmamembran [97]. Die vorliegende Doktorarbeit zeigt, dass die beiden Substitutionen in SIVsmm Nef die Endozytoserate von CD3-δ beeinflussen (Abb. 10). Dadurch wird der Mechanismus, der CD3-δ normalerweise zur Endozytosemaschinerie rekrutiert, umgangen. SIVmac239 Nef bindet ohne die Hilfe zusätzlicher zellulärer Faktoren an CD3-δ [81]. In Übereinstimmung damit konnte hier durch Koimmunpräzipitation die direkte Bindung von SIVsmm Nef und CD3-δ nachgewiesen werden (Abb. 11). Weiter wurde gezeigt, dass die AS an den Positionen 123+146 die Bindung determinieren. Im Gegensatz zur durchflusszytometrischen Herabregulierung von CD3 konnte hier jedoch keine vollständige Eliminierung beobachtet werden. Trotzdem bestand ein hochsignifikanter Unterschied zwischen aktiven und inaktiven nef-Allelen. Dies bedeutet, dass die inaktiven Nef-Proteine noch sehr schwach an CD3-δ binden können. Eventuell liegt dies an der Menge eingesetzten Proteins bzw. an der Überexpression der FRET-Komponenten, was möglicherweise zu einer Verschiebung des Bindegleichgewichts führt. Andererseits könnte dies ein Hinweis auf einen gewissen Schwellenwert für die Bindungsstärke sein, der überschritten werden muss, um einen Mechanismus wie z.B. eine Änderung der Struktur zu bewirken und CD3 effektiv herabregulieren zu können. So schlagen Swigut et Abb. 19: 3D-Modell des auskristallisierten Nefcore-TCRζDP1-Komplexes. (A) Frontalansicht und (B) Rückansicht des Strukturmodells. SIVmac239 Nefcore (Asp95-Ser235) wurde mit dem CD3-δ-Fragment auskristallisiert und die Struktur des Komplexes bestimmt [51]. Im Modell ist die Sekundärstruktur hervorgehoben. α-Helices sind gelb, β-Faltblätter pink und unstrukturierte Bereiche grau dargestellt. Die Bindedomäne im δ-Fragment ist grün, außerdem ist die Molekülstruktur der AS dargestellt [81]. In Nefcore sind die Molekülstrukturen der drei AS-Positionen, die für die CD3-Modulation verantwortlich sind, grün markiert. 4 Diskussion 50 al ein Modell vor, in dem Nef zuerst an zwei unterschiedliche Domänen im zytoplasmatischen Bereich von CD3-δ binden muss, damit eine Konformationsänderung stattfindet, die dann die Bindung an AP-2 erlaubt. SIVmac239 Nef und CD3-δ kooperieren also, um AP-2 rekrutieren zu können, was wiederum zu einem stabileren ternären Komplex führt, der dann endozytiert werden kann. Der Kernbereich von Nef ist hochkonserviert und bereits geringe Veränderungen können zu Instabilität und Funktionsverlust führen [57]. Die drastische Auswirkung, die diese Mutationen zur Folge haben, ist ein Indikator für die Spezifität dieser AS. Da allein die Variation I (Isoleucin) zu L (Leucin) an Position 123 einen zweifachen Effekt auf die CD3-Modulation hat, handelt es sich hier wahrscheinlich nicht um eine direkte Interaktion der AS mit CD3-δ. An der Position 146 ist beim aktiven Nef die kleinere AS Leucin vorhanden, wohingegen die große AS Phenylalanin mit aromatischem Ring die Bindung negativ beeinflusst. Beide AS sind in α-helikale Strukturen eingebettet (Abb. 18). Die Seitenketten beider AS ragen in das Zentrum des Kernbereichs von Nef hinein. Wahrscheinlich ist die Größe dieser Tasche, die das Zentrum des Proteins bildet maßgeblich. Das könnte ein Hinweis darauf sein, dass sich durch Änderung von Größe (146) und Konformation (123) der Seitenketten die Struktur von Nef verändert. Vermutlich ermöglicht dies den Zugang zur Bindestelle für CD3-δ, ohne dabei die Struktur so stark zu verändern, dass andere Nef-Funktionen beeinflusst werden. Zusammenfassend wurden hier nef-Allele eines sehr seltenen SIVsmm Phänotyps, anhand von Proben aus vier Rauchgrauen Mangaben, untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der Verlust der Nef-Funktion CD3 herabzuregulieren, als Folge der niedrigen CD4+ T-Zellzahlen entstand und nicht der Grund dafür war. Der erweiterte Korezeptortropismus und der Verlust der CD3-Modulation, sind in HIV-1-infizierten Patienten mit AIDS verbunden, jedoch in natürlichen Wirten nicht ausreichend um Immundefizienz zu induzieren. Während andere Nef-Funktionen, wie die CD4- oder die MHC-I-Modulation erhalten blieben, sind der selektive Defekt der CD3- und die erhöhte CXCR4-Herabregulierung das Produkt einer in vivo Selektion. Dies ist höchstwahrscheinlich die Folge des erweiterten Wirtszelltropismus. Die verantwortlichen AS sind identifiziert worden und es konnten Gain-of-function- und Loss-of-functionMutanten generiert werden. Mit Hilfe dieser Nef-Varianten wurde gezeigt, dass die AS 123 und 146 die Fähigkeit von SIVsmm Nef determinieren, an CD3-δ zu binden. Deswegen 4 Diskussion sind sie verantwortlich für die Nef-vermittelte TCR-CD3 Endozytoserate und die Kolokalisation mit CD3-δ. Durch die Generierung des selektiv defekten SIVmac239 Nefs ist nun ein geeignetes Werkzeug vorhanden, um die in vivo Relevanz der Nef-vermittelten CD3-Modulation in Bezug auf die Immunpathogenese von AIDS im Tiermodell zu untersuchen. 51 5 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Das akzessorische Nef-Protein der Immundefizienzviren ermöglicht eine effektive Persistenz und trägt dadurch entscheidend zur Progression zu AIDS (engl.: acquired immunodeficiency syndrome) im Menschen bei. Im Gegensatz dazu verursachen viele SIVs (engl.: simian immunodeficiency virus) in ihren natürlichen Affenwirten, wie z.B. den Rauchgrauen Mangaben, keine Immundefizienz. Ein fundamentaler Unterschied zwischen der HIV-1 Infektion im Menschen und der apathogenen SIV-Infektion im natürlichen Wirt ist das Fehlen einer chronisch erhöhten Immunaktivierung. Dies schützt den Wirt vor einer schnelleren Umsatzrate der CD4+ T-Zellen. SIVsmm-infizierte Rauchgraue Mangaben haben daher trotz hoher Viruslast normalerweise eine stabile Anzahl CD4+ T-Zellen. Etwa 5-10 % dieser Affen zeigen jedoch einen signifikanten Verlust von CD4+ T-Zellen, der mit dem von HIV-1-infizierten AIDS-Patienten vergleichbar ist. Wir konnten bereits zeigen, dass eine niedrige Anzahl CD4+ T-Zellen in SIVsmm infizierten Rauchgrauen Mangaben (smm; engl.: sooty mangabey monkey) mit ineffektiver CD3-Herabregulierung von Nef korreliert. Somit könnte die Nef-vermittelte Herabregulierung von CD3 und die damit verbundene T-Zellaktivierung, die Hyperaktivierung des Immunsystems verhindern. In einer anderen Studie wurde gezeigt, dass der Verlust von CD4+ T-Zellen auch als Folge eines erweiterten viralen Korezeptortropismus möglich ist. In dieser Doktorarbeit wurde untersucht, ob möglicherweise auch spezifische Nef-Funktionen als Ursache für die extrem niedrigen CD4+ T-Zellzahlen der untersuchten Rauchgrauen Mangaben verantwortlich waren. Dazu wurden nef-Allele der Tiere, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Infektionsverlaufes aus Blut isoliert wurden, genetisch und phänotypisch untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass Nef die Fähigkeit CD3 herabzuregulieren erst nach dem Absinken der CD4+ T-Zellzahlen und der Erweiterung des viralen Korezeptortropismus verlor. Somit war der Verlust der Nef-vermittelten CD3-Modulation nicht die Ursache, sondern die Folge der niedrigen CD4+ T-Zellzahlen. Dies lag möglicherweise daran, dass durch die Veränderung des Korezeptortropismus auch ruhende T-Zellen infiziert werden konnten, wodurch die Nef-vermittelte Herabregulierung von CD3 keinen Vorteil mehr darstellte und verloren ging. Als spezifische Determinanten für die Herunterregulierung von CD3 wurden die Aminosäuren an den Positionen 123 und 146 in SIVsmm Nef identifiziert. Somit ist die CD3-Modulation 52 5 Zusammenfassung 53 von anderen untersuchten Nef-Funktionen genetisch trennbar. Gain- und Loss-of-function Mutationsanalysen zeigten eine Beschleunigung der Endozytoserate von CD3 und eine erhöhte Bindefähigkeit zu CD3-δ als Mechanismus der Nef-vermittelten Herunterregulierung von CD3. Ferner kolokalisieren nur nef-Allele, welche CD3 herabregulieren, mit der CD3-δ-Kette. Erstmals konnten SIVmac239 Nef-Mutanten hergestellt werden, die selektiv defekt für die CD3-Herabregulierung sind. Dadurch kann jetzt im für Tierstudien verfügbaren Rhesusaffen-Modell geklärt werden, ob der Verlust der CD3-Modulation von Nef die Pathogenität des Virus weiter erhöht. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass der Verlust der CD3-Modulation von SIVsmm Nef nicht der Grund, sondern die Folge der niedrigen CD4 + T-Zellzahlen und der Erweiterung des viralen Korezeptortropismus war. Die genetischen Determinanten und der Mechanismus der Nef-vermittelten CD3-Modulation in Nef wurden identifiziert. Erstmals gelang die Generierung von SIVmac nef-Allelen, die einen selektiven defekt in der CD3-Herabregulierung haben und nun die Untersuchung dieser spezifischen Nef-Funktion in vivo erlauben. Somit kann die Rolle der Nef-vermittelten CD3-Herabregulierung in der Pathogenese von Immundefizienzviren weiter aufgeklärt werden. 6 Literaturverzeichnis 6 Literaturverzeichnis 1. Aiken C, Trono D (1995) Nef stimulates human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA synthesis. J Virol 69: 5048-5056. 2. 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Swigut T, Greenberg M, Skowronski J (2003) Cooperative interactions of simian immunodeficiency virus Nef, AP-2, and CD3-zeta mediate the selective induction of T-cell receptor-CD3 endocytosis. J Virol 77: 8116-8126. 94. Tanaka M, Herr W (1990) Differential transcriptional activation by Oct-1 and Oct-2: interdependent activation domains induce Oct-2 phosphorylation. Cell 60: 375386. 95. Tersmette M, Gruters RA, de Wolf F, de Goede RE, Lange JM, et al. (1989) Evidence for a role of virulent human immunodeficiency virus (HIV) variants in the pathogenesis of acquired immunodeficiency syndrome: studies on sequential HIV isolates. Journal of virology 63: 2118-2125. 59 6 Literaturverzeichnis 96. Tsuchiya S, Yamabe M, Yamaguchi Y, Kobayashi Y, Konno T, et al. (1980) Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer 26: 171-176. 97. 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Wildum S, Schindler M, Munch J, Kirchhoff F (2006) Contribution of Vpu, Env, and Nef to CD4 down-modulation and resistance of human immunodeficiency virus type 1-infected T cells to superinfection. J Virol 80: 8047-8059. 60 Danksagung Danksagung Ich danke Herrn Prof. Dr. Frank Kirchhoff für die Möglichkeit, diese Arbeit im Institut für Molekulare Virologie des Universitätsklinikums Ulm, durchzuführen. Natürlich danke ich auch für die Betreuung, die ständige Diskussionsbereitschaft und Förderung meiner Arbeit. Frau Prof. Dr. Barbara Spellerberg danke ich für ihre Bereitschaft, diese Arbeit zu Begutachten. Danke an unsere Kollaborationspartner für die Bereitstellung von Materialien. Ebenfalls gebührt Herrn Dr. Michael Schindler besonderer Dank für die Durchführung des FACS-basierenden FRET-Assays. Dank an alle Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter, die immer für eine angenehme Atmosphäre gesorgt haben, mich mit Tricks und Tipps unterstützten und auch für außerbiologische Themen immer zu haben waren. Der Elli und dem Reinhard möchte ich für die Nachhilfe in deutscher Rechtschreibung und Grammatik danken. Natürlich möchte ich meinen Eltern Anne-Marie und Harald Schmökel danken, die mir das alles ermöglichten, mich ständig vorantrieben, stets Verständnis zeigten und immer für mich da waren. Meiner Frau Bernadette möchte ich für ihre Liebe und Loyalität danken. Und natürlich dafür, dass sie mich nach ergreifenden Laborerlebnissen so tapfer ertragen hat. Schön, dass es dich gibt. 61
