Vortrag Tebbe, vTi - Niedersächsisches Ministerium für Ernährung
Werbung
Biogasforum – Vortrag Prof. Tebbe, vTI Braunschweig 30.11.2011 Kultivierungsunabhängige Untersuchungen zur Vielfalt mikrobieller Gemeinschaften aus experimentellen Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung von Clostridien unter besonderer Berücksichtigung von Clostridien Anja B. Dohrmann und Christoph C. Tebbe vTI – von Thünen Bundesforschung Institut für Biodiversität Braunschweig Die Suche nach Clostridium botulinum in experimentellen Biogasanlagen Anja B. Dohrmann und Christoph C. Tebbe vTI – von Thünen Bundesforschung Institut für Biodiversität Braunschweig Copyright vTI, nur für privaten Gebrauch Weitergabe nur nach vTI Genehmigung 1 Biogasforum – Vortrag Prof. Tebbe, vTI Braunschweig 30.11.2011 Forschungsprojekt (2005 bis 2007)1 • Clostridien sind wichtige, konstant vorkommende mikrobiologische Funktionsträger in Biogasreaktoren (bis zu 50 % aller Bakterien!) • Clostridien beinhalten auch hoch‐pathogene bzw. toxische Vertreter, wie Clostridien beinhalten auch hoch pathogene bzw toxische Vertreter wie Clostridium perfringens, Clostridium tetani, und Clostridium botulinum) Kommt Clostridium botulinum in Biogasreaktoren vor? H2, CO2, Acetat CO2,, CH4 Biomasse Propionat, Butyrat, Succinat, Alkohole Clostridien 1gefördert durch das Niedersächsische Ministerium für Ernährung, Landwirtschaft, Verbraucherschutz und Landesentwicklung. Zusammenarbeit zwischen dem Institut für Technologie (Team Prof. Weiland) und dem Institut für Agrarökologie (Team Prof. Tebbe) der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) Kultivierungsunabhängige DNA‐Analysen zur Charakterisierung der Bakterienvielfalt und zur Suche nach Clostridium botulinum Experimentelle Biogasanlage Institut für Technologie, FAL, Prof. Weiland Copyright vTI, nur für privaten Gebrauch Weitergabe nur nach vTI Genehmigung 2 Biogasforum – Vortrag Prof. Tebbe, vTI Braunschweig 30.11.2011 Kultivierungsunabhängig: Warum? • Klassische Verfahren: Isolierung und Kultivierung von Mikroorganismen in/auf Nährmedien • Anaerobe Kultivierung: experimentell aufwendig, langsam und teuer • Kultivierung pathogener Bakterien erfordert hohe Sicherheit (L2 bzw. L3 Labor) • Direkte DNA Extraktion liefert das gesamte genetische Programm („Metagenom“) aus dem Biogasreaktor • Nachweis erfolgt unabhängig von Kultivierbarkeit oder Pathogenität • Spezifische Gene lassen sich aus dem Biogas‐ Reaktor Metagenom durch PCR‐Verfahren quantifizieren und differenzieren Kultivierungsunabhängig: Warum? • Hinweis auf pathogene Bakterien kann ohne Risiken gewonnen werden • Ethisch vertretbarer Weg, um nach C. botulinum in zahlreichen g Umweltproben zu suchen (keine Mäuseversuche!) Copyright vTI, nur für privaten Gebrauch Weitergabe nur nach vTI Genehmigung 3 Biogasforum – Vortrag Prof. Tebbe, vTI Braunschweig 30.11.2011 16S rRNA Gene Der Goldstandard für die Suche nach Bakterien • • • • • • Kommt in allen Bakterien vor Die Ähnlichkeit der Gene korreliert mit Verwandtschaft Aus Umweltproben leicht nachweisbar durch PCR Durch qPCR auch quantifizierbar Durch phylogenetische Analysen schnelle Eingruppierung eines unbekannten Bakteriums zu bereits bekannten Vertretern Kann für genetisches Fingerprinting mikrobieller Gemeinschaften aus Umweltproben genutzt werden (SSCP DGGE TRFLP) (SSCP, DGGE, TRFLP) SSCP‐Profil • ABER • Eine Differenzierung von pathogenen und nicht‐ pathogenen Vertretern häufig nicht möglich kein direkter Nachweis von Toxinen oder Pathogenität aus einer Umweltprobe Jede Bande zeigt ein anders 16SrRNA Gen an. Fingerprint einer Bakterien‐Gemeinschaft 16S rRNA Gene Phylogenetischer Baum mit Clostridien und Verwandten Es gibt viele Bakterien mit dem Namen Clostridium (ca. 150 Arten) Clostridium (ca 150 Arten) Historisch bedingt! Nicht immer sehr miteinander verwandt Cluster I Clostridium sensu stricto eigentliche Clostridien mit 73 Arten, darunter , alle pathogenen Vertreter wie Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, oder Clostridium tetani The Prokaryotes, Introduction to the Family Clostridiaceae 12/31/2005 Copyright vTI, nur für privaten Gebrauch Weitergabe nur nach vTI Genehmigung 4 Biogasforum – Vortrag Prof. Tebbe, vTI Braunschweig 30.11.2011 Gruppe II 16S rRNA Gene von Clostridium Cluster I Keine eindeutige Gruppierung von Arten nach ihren 16S rRNA Genen rRNA Genen Gruppe III Gruppe IV Verschiedene „Arten“ mit sehr ähnlichen oder sogar gleichen 16S rRNA Genen Eindeutige Differenzierung aufgrund von 16S rRNA Genen alleine nicht möglich Gruppe I The Prokaryotes, Introduction to the Family Clostridiaceae 12/31/2005 Gruppe II 16S rRNA Gene von Clostridium Cluster I Keine eindeutige Gruppierung von Arten nach ihren 16S rRNA Genen rRNA Genen Gruppe III Verschiedene „Arten“ mit sehr ähnlichen oder sogar gleichen 16S rRNA Genen Gruppe IV Eindeutige Differenzierung aufgrund von 16S rRNA Genen alleine nicht möglich Gruppe I ABER Cluster I: Detektion würde alle bekannten C. botulinum Stämme erfassen, aber auch andere The Prokaryotes, Introduction to the Family Clostridiaceae 12/31/2005 Copyright vTI, nur für privaten Gebrauch Weitergabe nur nach vTI Genehmigung 5 Biogasforum – Vortrag Prof. Tebbe, vTI Braunschweig 30.11.2011 Clostridium botulinum (Cb) • • • • • • Phylogenetisch ist Cb keine „Art“! Heterogene Gruppe von Neurotoxin Heterogene Gruppe von Neurotoxin (BoNT) bildenden Clostridien innerhalb von Clostridium Cluster I 16S rRNA nur grobe Indikation Serologische Gruppen A bis G Nachweis serologisch über ELISA (Toxine, Differenzierung) bzw. Mäusetest (Symptome) ABER Neue PCR Systeme erlauben multiplex qPCR Nachweise und Differenzierung von BoNT‐Genen (für BoNT A bis G) (Kirchner et al., 2010, AEM 76: 4387‐4395) Gruppe II Gruppe II Nicht proteolytisch Typ B, E und F 16S rRNA Gene von Clostridium Cluster I Gruppe III Gruppe III Nicht proteolytisch Typ C und D Gruppe IV Gruppe IV Typ G BoNT‐Symptome (Einzelfälle) Gruppe I Gruppe I Proteolytisch Typ A, B und F Clostridium butyricum Clostridium barati Cl. argentinense (Typ G) The Prokaryotes, Introduction to the Family Clostridiaceae 12/31/2005 Copyright vTI, nur für privaten Gebrauch Weitergabe nur nach vTI Genehmigung 6 Biogasforum – Vortrag Prof. Tebbe, vTI Braunschweig 30.11.2011 Experimentelle Analysen Methanproduktivität Kleegrassilage Methanproduktivität 10 0 10,0 0,90 9,0 0,80 8,0 0,70 7,0 0,60 6,0 0,50 5,0 0,40 4,0 0,30 3,0 0,20 2,0 0,10 1,0 92 89 98 10 5 11 1 11 7 12 0 12 6 13 3 13 9 14 7 15 3 15 9 16 2 83 76 70 63 56 49 42 34 19 16 13 6 0,0 3 0,00 0 Raumbelastung [g oTS/l R *d)] Methanproduktivität [lN /(lR*d)] Raumbelastung 1 00 1,00 Versuchsdauer [d] Kl Kleegrassilage il Maissilage Hühnertrockenkot Schweinegülle Rindergülle mesophil (37°C) thermophil (55 °C) PCR qPCR BoNT Gene 16S rRNA Gene ‐ alle Bakterien ‐ Clostridium Cluster I Nachweis und Differenzierung von BoNT Genen aus Material der experimentellen Biogasreaktoren Gene für BoNT A, B, E, F bont Universeller Vorwärts‐Primer bont/A 639 bp bont/B 636 bp bont/E 615 bp bont/F 639 bp ~ 4000 bp Spezifische Rückwärts‐Primer Fach P, et al. 2002. Detection by PCR‐enzyme‐linked immunosorbent assay of Clostridium botulinum in fish and 14 environmental samples from a coastal area in northern France . Appl. Environ. Microbiol. 68: 5870‐5876 Copyright vTI, nur für privaten Gebrauch Weitergabe nur nach vTI Genehmigung 7 Biogasforum – Vortrag Prof. Tebbe, vTI Braunschweig BoNT A 30.11.2011 bont/A 639 bp bont/B 636 bp bont/E 615 bp bont/F 639 bp bont/A N 1 2 3 4 5 6 7 8 N 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. BoNT B 527 bp kein BoNT A! kein BoNT A! Negative Kontrolle (A. dest.) Negative Kontrolle (1.PCR) Klärschlamm Hühner‐Trockenkot (10‐1) Maissilage (10‐1) Rindergülle (5 x 10‐2) Schweinegülle (10‐1) Gärsubstrat (2 Tage, Rindergülle, 10‐1) Gärsubstrat (127 Tage, Rindergülle, 10‐1) bont/A 639 bp bont/B 636 bp bont/E 615 bp bont/F 639 bp N 1 bont/B 2 3 4 5 6 7 8 523 bp kein BoNT B! kein BoNT B! 280 ms N 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Negative Kontrolle (A. dest.) Negative Kontrolle (1.PCR) Klärschlamm Hühner‐Trockenkot (10‐1) Maissilage (10‐1) Rindergülle (5 x 10‐2) Schweinegülle (10‐1) Gärsubstrat (2 Tage, Rindergülle, 10‐1) Gärsubstrat (127 Tage, Rindergülle, 10‐1) Copyright vTI, nur für privaten Gebrauch Weitergabe nur nach vTI Genehmigung 16 8 Biogasforum – Vortrag Prof. Tebbe, vTI Braunschweig BoNT E 30.11.2011 bont/A 639 bp bont/B 636 bp bont/E 615 bp bont/F 639 bp N 1 2 3 4 5 6 7 8 bont/E 506 bp kein BoNT E! kein BoNT E! 280 ms N 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. BoNT F Negative Kontrolle (A. dest.) Negative Kontrolle (1.PCR) Klärschlamm Hühner‐Trockenkot (10‐1) Maissilage (10‐1) Rindergülle (5 x 10‐2) Schweinegülle (10‐1) Gärsubstrat (2 Tage, Rindergülle, 10‐1) Gärsubstrat (127 Tage, Rindergülle, 10‐1) bont/A 639 bp bont/B 636 bp bont/E 615 bp bont/F 639 bp N 1 2 3 4 5 6 7 8 bont/F 591 bp kein BoNT F! kein BoNT F! 280 ms N 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Negative Kontrolle (A. dest.) Negative Kontrolle (1.PCR) Klärschlamm Hühner‐Trockenkot (10‐1) Maissilage (10‐1) Rindergülle (5 x 10‐2) Schweinegülle (10‐1) Gärsubstrat (2 Tage, Rindergülle, 10‐1) Gärsubstrat (127 Tage, Rindergülle, 10‐1) Copyright vTI, nur für privaten Gebrauch Weitergabe nur nach vTI Genehmigung 9 Biogasforum – Vortrag Prof. Tebbe, vTI Braunschweig 30.11.2011 Wie verändern sich die Bakterien‐ und Clostridien‐ Gemeinschaften während der Biogasproduktion? Methanproduktivität Kleegrassilage 15 9 16 2 14 7 15 3 13 3 13 9 12 0 12 6 11 1 11 7 98 10 5 89 92 76 0,0 83 1,0 0,00 63 2,0 0,10 70 0,20 49 3,0 56 40 4,0 0,30 34 5,0 0 40 0,40 42 6,0 0,50 16 0,60 19 7,0 6 8,0 0,70 13 9,0 0,80 0 0,90 Rau umbelastung [g g oTS/l R *d)] Methanproduktivität 10,0 3 Methanpro oduktivität [lN /(lR*d)] Raumbelastung 1,00 Versuchsdauer [d] Dynamik der Bakterien‐Gemeinschaft während der Biogas‐Fermentation Kleegrassilage (mesophil) KS KGS 12 20 35 54 71 89 111 131 154 174 195 230 ‐ Nachgärung Copyright vTI, nur für privaten Gebrauch Weitergabe nur nach vTI Genehmigung 10 Biogasforum – Vortrag Prof. Tebbe, vTI Braunschweig 30.11.2011 Dynamik der Bakterien‐Gemeinschaft während der Biogas‐Fermentation Hühnertrockenkot (mesophil) KS HTK 2 3 4 7 14 21 28 36 51 70 87 105 127 147 170 190 211 246 Dynamik der Bakterien‐Gemeinschaft während der Biogas‐Fermentation Maissilage (mesophil) MS KS 2 3 4 7 14 21 28 36 51 70 87 105 127 147 170 190 211 Copyright vTI, nur für privaten Gebrauch Weitergabe nur nach vTI Genehmigung 11 Biogasforum – Vortrag Prof. Tebbe, vTI Braunschweig 30.11.2011 Dynamik der Bakterien‐Gemeinschaft während der Biogas‐Fermentation Schweinegülle (mesophil) KS SG 2 3 4 7 14 21 28 36 51 70 87 105 127 147 170 190 211 246 Dynamik der Bakterien‐Gemeinschaft während der Biogas‐Fermentation Rindergülle (mesophil) RG KS 2 3 4 7 14 21 28 36 51 70 87 105 127 147 Copyright vTI, nur für privaten Gebrauch Weitergabe nur nach vTI Genehmigung 12 Biogasforum – Vortrag Prof. Tebbe, vTI Braunschweig 30.11.2011 Dynamik der Clostridien (nicht nur Cluster I) während der Biogas‐Fermentation Rindergülle (mesophil) KS RG 2 3 4 7 14 21 28 36 51 70 87 105 127 147 170 190 211 Quantitative PCR Abundanzen von Cluster I Clostridia 9 Relative copy numbers 8 7 6 5 4 3 2 7,9 4,95 1 1 0 Cattle manure Day 85 1 1,95 1,8 Day 105 Relative copy numbers * g‐1 (fresh weight) Relative copy numbers * g‐1 (dry weight) Copyright vTI, nur für privaten Gebrauch Weitergabe nur nach vTI Genehmigung 26 13 Biogasforum – Vortrag Prof. Tebbe, vTI Braunschweig 30.11.2011 Dynamik der Clostridien (nicht nur Cluster I) während der Biogas‐Fermentation Schweinegülle (mesophil) KS SG 2 3 4 7 14 21 28 36 51 51 70 87 105 127 147 170 190 211 246 Rindergülle Schweinegülle Bande Sequenzähnlichkeit Engster Verwandter Isolationsquelle 98% (615/626) Nicht kultiviertes Clostridium Anaerober mesophiler Klärschlamm 98% (617/626) Nicht kultiviertes Clostridium Anaerober mesophiler Klärschlamm 100% ((628/628)) Nicht kultiviertes Clostridium Deponie-Abwasser p ((China)) 97% (611/624) Nicht kultiviertes Clostridium 98% (614/624) Clostridium paraputrificum, 99% (625/628) Nicht kultiviertes Clostridium Deponie-Abwasser (China) 99% (619/623) Nicht kultiviertes Clostridium Aerosol aus Schweinestall 97% (606/624) Nicht kultiviertes Clostridium Menschlicher Stuhl Gesunder menschlicher Stuhl AY442815 Kängeruh Vormagen Clostridien aus Klärschlamm oder Fäkalien – also den Substraten die auch in den Prozess gegeben wurden 28 Copyright vTI, nur für privaten Gebrauch Weitergabe nur nach vTI Genehmigung 14 Biogasforum – Vortrag Prof. Tebbe, vTI Braunschweig 30.11.2011 Dynamik der Clostridien (nicht nur Cluster I) während der Biogas‐Fermentation Rindergülle (thermophil) KS RG 1 7 14 21 28 35 49 63 78 96 110 125 139 ‐ ‐‐ 160 Höhere Clostridien‐Vielfalt im thermophilen Prozess bei Rindergülle? Dynamik der Clostridien (nicht nur Cluster I) während der Biogas‐Fermentation Schweinegülle (thermophil) 1 4 7 21 28 35 49 63 78 96 110 125 139 160 SG KS Keine Veränderung der Clostridien‐Vielfalt bei Schweinegülle im thermophilen Prozess? Copyright vTI, nur für privaten Gebrauch Weitergabe nur nach vTI Genehmigung 15 Biogasforum – Vortrag Prof. Tebbe, vTI Braunschweig 30.11.2011 Phylogenetische Zuordnung der Clostridien‐Cluster I Sequenzen unter besonderer Berücksichtigung von Berücksichtigung von Clostridium botulinum Unterschiedliche 16S rRNA Gene aus Clostridien, aber keine nahe an Gruppen von C. botulinum oder anderen pathogenen Vertretern pathogenen Vertretern Zusammenfassung (1) • Die Zusammensetzung der Bakterien in den experimentellen Biogasreaktoren wurde deutlich von den Eigenschaften der unterschiedlichen Gärsubstrate beeinflusst • In der Startphase (30 bis 100 Tage) dominierten die durch das Impfgut (hier: Klärschlamm) eingebrachten Bakterien, danach jedoch nicht mehr • Je nach Substrat und Inkubationsbedingung (meso/thermophil) stellten sich nach der Startphase relative stabile Bakterien‐Gemeinschaften ein • Bei mesophilen Prozessen: Die Veränderung der Clostridien‐Vielfalt folgte der Dynamik der anderen dominanten Bakterien g y • Bei thermophilen Prozessen: Stabile Clostridien‐Gemeinschaften stellten sich schneller ein als stabile Gemeinschaften der dominanten Bakterien (geringerer Anteil an der Gesamtpopulation?) Copyright vTI, nur für privaten Gebrauch Weitergabe nur nach vTI Genehmigung 16 Biogasforum – Vortrag Prof. Tebbe, vTI Braunschweig 30.11.2011 Zusammenfassung (2) • Bei der Vergärung von Rindergülle kam es zu keiner Massenvermehrung von Clostridien im Vergleich zu den Ausgangssubstraten, wohl aber zu einer Veränderungen ihrer Vielfalt i d ih i lf l • Clostridien aus unterschiedlichen phylogenetischen Zweigen gehörten zu den charakteristischen Bakterien in allen experimentellen Biogasreaktoren • Phylogenetische Analysen gaben keinen Hinweis, dass unter diesen Clostridien Clostridium botulinum vorkommt • Auch der negative Nachweis von Genen für vier unterschiedliche Botulinum Neurotoxine deutet darauf hin, dass es unter den gegebenen Bedingungen zu keiner Vermehrung von C. botulinum kam Schlussfolgerungen • Keine Hinweise auf das Vorkommen oder die Vermehrung von C. botulinum in experimentellen Biogasreaktoren mit 5 unterschiedlichen Substraten unter mesophilen oder thermophilen Bedingungen Substraten unter mesophilen oder thermophilen Bedingungen • In den vergangenen 3 Jahren (seit Abschluss des Projekts) haben sich erhebliche methodisch Verbesserung zur kultivierungsunabhängigen Analysen von C. botulinum aus Umweltproben ergeben • Mit Hilfe dieser neuen Methoden sollte es möglich sein, belastbare Daten zum Vorkommen und zur Vermehrung von C. botulinum in landwirtschaftlichen Biogasanlagen in Niedersachsen zu erhalten Wichtige Ergebnisse aus den hier vorgestellten Unterschungen wurden publiziert in: Dohrmann, A.B, S. Baumert, L. Klingebiel, P. Weiland, and C.C. Tebbe. 2011. Bacterial community structure in experimental methanogenic bioreactors and search for pathogenic clostridia as community members. Appl. Microbiol. Biotechnol. 89: 1991‐2004 Copyright vTI, nur für privaten Gebrauch Weitergabe nur nach vTI Genehmigung 17
