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Aus dem Institut für Biochemie und Molekularbiologie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
In vitro-Untersuchungen zum
Sekretionsmechanismus von Pathogenitätsfaktoren
mit einer N-terminalen Extension
in Escherichia coli
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2004
von Nina Chevalier
geboren in St. Wendel
Dekan:
Prof. Dr. med. Christoph Peters
Erster Gutachter:
Prof. Dr. med. M. Müller
Zweiter Gutachter:
Prof. Dr. med. D. Neumann-Haefelin
Jahr der Promotion:
2005
Für meine Eltern
Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden veröffentlicht in:
Chevalier Nina, Moser Michael, Koch Hans-Georg, Schimz Karl-Ludwig, Willery Eve,
Locht Camille, Jacob-Dubuisson Françoise and Müller Matthias (2004) Membrane targeting
of a bacterial virulence factor harbouring an extended signal peptide. J. Mol. Microbiol.
Biotechnol. 8(1): 7-18.
Inhaltsverzeichnis
1.
Zusammenfassung……………………………………………………………………...1
2.
Einleitung……………………………………………………………………………. …2
2.1
Die Zellhülle Gram-negativer Bakterien…………………………………………….2
2.2 Proteintransport in Gram-negativen Bakterien……………………………………... 3
2.2.1 Überblick über die Proteintransportmechanismen an der bakteriellen Innenmembran………….3
2.2.2 SecB/SecA-abhängiger, post-translationaler Transport sekretorischer Proteine………………… 5
2.2.2.1 Die Signalsequenz sekretorischer Proteine……………………………………………….. 6
2.2.2.2 Erkennung und Targeting sekretorischer Proteine………………………………………...6
Trigger Factor……………………………………………………………………………..7
SecB......................................................................................................................................8
SecA……………………………………………………………………………………....10
2.2.2.3 Translokation sekretorischer Proteine durch das SecYEG-Translokon………………….12
2.2.3 SRP-abhängiger, co-translationaler Transport polytoper Innenmembranproteine……………... 14
2.2.3.1 Die Signal-Anker-Sequenz polytoper Innenmembranproteine…………………………..14
2.2.3.2 Erkennung und Targeting polytoper Innenmembranproteine…………………………… 14
Das bakterielle SRP………………………………………………………………………15
2.2.3.3 Integration polytoper Innenmembranproteine in das SecYEG-Translokon……………...17
2.2.4 Die Kooperation von SRP und SecA beim Transport von Membranproteinen
mit großen periplasmatischen Domänen………………………………………………………...18
2.2.5 Der Transport über die äußere Membran: Die Proteinsekretion………………………………...19
2.2.5.1
2.2.5.2
2.2.5.3
2.2.5.4
2.2.5.5
2.2.5.6
2.3
Chaperon-Usher Sekretionsmechanismus……………………………………………….19
Typ I Sekretion…………………………………………………………………………...19
Typ II Sekretion…………………………………………………………………………. 20
Typ III Sekretion………………………………………………………………………… 20
Typ IV Sekretion…………………………………………………………………………21
Typ V Sekretion und Two-Partner Sekretion (TPS)……………………………………. 23
Typ V Sekretion/Autotransporter…………………………………………………………23
Two-Partner Sekretion (TPS)…………………………………………………………….23
Autotransporter und TpsA Proteine mit einer N-terminalen Extension………………….24
Filamentöses Hämagglutinin (FHA) aus Bordetella pertussis, ein
TpsA-Protein mit N-terminaler Extension………………………………………… 26
Bordetella pertussis…………………………………………………………………………………..26
Filamentöses Hämagglutinin (FHA)…………………………………………………………………26
2.4
Shigella extrazelluläres Protein (SepA) aus Shigella flexneri, ein
Autotransporter mit N-terminaler Extension……………………………………… 28
Shigella flexneri………………………………………………………………………………………28
Shigella extrazelluläres Protein (SepA)………………………………………………………………29
3.
Fragestellung und Zielsetzung………………………………………………………. 30
4.
5.
Material…………………………………………………………………………….. …32
4.1
Geräte und Materialien……………………………………………………………. 32
4.2
Feinchemikalien…………………………………………………………………… 33
4.3
Antibiotika………………………………………………………………………… 34
4.4
Plasmide ……………………………………………………………………………34
4.5
Escherichia coli-Stämme…………………………………………………………...35
Methoden……………………………………………………………………………... 36
5.1
Molekularbiologische Methoden…………………………………………………...36
5.1.1 Anzucht von Escherichia coli…………………………………………………………………...36
5.1.2 DNA-Isolierung………………………………………………………………………………….36
5.1.3 Transformation kompetenter Escherichia coli-Zellen………………………………………….. 37
5.1.4 DNA-Restriktionsenzymverdau und Agarosegelelektrophorese………………………………..38
5.1.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese…………………………………………………………39
5.1.6 Western-Blot……………………………………………………………………………………. 44
5.2
Herstellung von Bestandteilen des zellfreien Systems……………………………. 46
5.2.1 Bestandteile des zellfreien Transkriptions-Translations-Systems……………………………….46
5.2.1.1
5.2.1.2
S135………………………………………………………………………………………46
Rekonstituiertes System…………………………………………………………………. 48
Cytosolische Translokationsfaktoren: CTF………………………………………………48
Ribosomen……………………………………………………………………………….. 50
Initiationsfaktor 2………………………………………………………………………...51
T7-RNA-Polymerase……………………………………………………………………...51
5.2.2 Membranvesikel............................................................................................................................52
Inside-out-Innenmembranvesikel (INV)........................................................................................52
Harnstoffextrahierte Vesikel (HINV)…………………………………………………………… 53
5.2.3 Translokations- Integrationsfaktoren…………………………………………………………… 54
5.3
Versuche zum Proteintransport im zellfreien System aus Escherichia coli………..55
5.3.1 In vitro Transkriptions-Translationsreaktion…………………………………………………… 55
5.3.2 TCA –Fällung……………………………………………………………………………………58
5.3.3 Synthese und Isolierung ribosomenassoziierter naszierender Ketten (RANCs)………………...58
Synthese ribosomenassoziierter naszierender Ketten…………………………………………...58
Isolierung ribosomenassoziierter naszierender Ketten………………………………………….60
5.3.4 Puromycin- und Chloramphenicolbehandlung…………………………………………………. 61
Puromycinbehandlung………………………………………………………………………….. 61
Chloramphenicolbehandlung……………………………………………………………………61
5.3.5 Translokation/Integration in Innenmembranvesikel……………………………………………. 61
Translokation/Integration in Innenmembranvesikel…………………………………………….61
Triton-Behandlung der Vesikel…………………………………………………………………. 62
5.3.6 Flotation………………………………………………………………………………………… 62
5.3.7 Quervernetzung mit DSS und MBS……………………………………………………………..63
Quervernetzung mit DSS………………………………………………………………………...63
Quervernetzung mit MBS………………………………………………………………………..64
5.3.8 Immunpräzipitation……………………………………………………………………………...65
5.3.9 Harnstoffdenaturierung in vitro synthetisierter Proteine……………………………………….. 67
5.3.10 Proteinisolierung mit Ni+-NTA-Agarose………………………………………………………. 67
5.3.11 Gelfiltration……………………………………………………………………………………...68
5.3.12 SDS-PAGE und Autoradiographie……………………………………………………………... 69
6.
Ergebnisse…………………………………………………………………………….. 71
6.1
Das in vitro Transkriptions-Translationssystem…………………………………... 71
6.2
Die Translokation von FHA und SepA in „Inside-out“
Innenmembranvesikel……………………………………………………………... 72
6.2.1 Sowohl FHA, FHA∆ext als auch SepA werden effizient in „Inside-out“
Innenmembranvesikel transportiert……………………………………………………………...72
6.2.2 Das Auftreten von mehr als einer prozessierten Bande resultiert
aus N-terminaler Proteolyse……………………………………………………………………..77
6.3
Untersuchungen zum co- bzw. post-translationalen Translokationsverhalten
von FHA, FHA∆ext und SepA…………………………………………………… 80
6.3.1 Die Translokationseffizienz der Proteine ist größer bei co-translationaler Zugabe
von INV…………………………………………………………………………………………80
6.3.2 Auch durch Harnstoffdenaturierung und durch Zugabe von Hitzeschockproteinen
konnte die Effizienz des Proteintransportes unter post-translationalen Bedingungen
nicht verbessert werden………………………………………………………………………….84
6.3.3 Eine vorzeitige Proteinaggregation verhindert möglicherweise, dass FHA unter
post-translationalen Bedingungen translozierbar ist……………………………………………. 86
6.3.4 Kürzere Ketten von FHA aggregieren im Cytoplasma nicht und können somit
post-translational transportiert werden…………………………………………………………..88
6.4
Untersuchungen zur SecA- bzw. SRP-Abhängigkeit der
Proteintranslokation von FHA und SepA…………………………………………. 91
6.4.1 Untersuchungen mit Translokon-Mutanten deuten auf eine SecA-Abhängigkeit
von FHA und SepA hin………………………………………………………………………….91
6.4.2 Für eine effiziente Translokation von FHA und FHA∆ext in harnstoffbehandelte
Vesikel genügen SecA, SecB und die F1-Untereinheit der F1F0-ATPase,
während sich SepA auch bei zusätzlicher Zugabe von Ffh und FtsY nicht
translozieren lässt………………………………………………………………………………..94
6.4.3 In vitro benötigen sowohl FHA als auch FHA∆ext das Transport-spezifische
Chaperon SecB…………………………………………………………………………………..97
6.5
Quervernetzung von naszierenden Ketten von FHA und FHA∆ext
mit cytosolischen Komponenten…………………………………………………... 98
6.5.1 Die Quervernetzung erfolgte mit zwei verschiedenen Quervernetzungsreagenzien…………… 98
6.5.2 Kurze Ketten von FHA und von FHA∆ext werden am Ribosom von SRP,
lange Ketten von Trigger Factor erkannt………………………………………………………. 99
6.5.3 Eine zellinterne Kompetition zwischen Ffh und Trigger Factor um Bindung
naszierender Ketten existiert offensichtlich nicht……………………………………………...103
6.6
Sowohl lange als auch kurze naszierende Ketten zeigen
eine schwache Interaktion mit SecY……………………………………………... 105
7.
6.7
Untersuchungen zum Membrantargeting von FHA, FHA∆ext und SepA
mit Hilfe von Flotationsexperimenten deuten auf ein post-translationales
Targeting hin……………………………………………………………………... 107
6.8
Zusammenfassung der Ergebnisse……………………………………………….. 111
Diskussion…………………………………………………………………………… 113
7.1
SepA und FHA verhalten sich beim Transport über die innere
Bakterienmembran wie klassische sekretorische Proteine………………………. 113
7.2
FHA und SepA werden SecA abhängig durch das SecYEG Translokon
in der Innenmembran transportiert………………………………………………..114
7.3
Ist SRP am Transportprozess von FHA und SepA beteiligt?................................. 115
7.3.1 Eine Beteiligung von SRP am Transport sekretorischer Proteine
konnte bislang nicht gezeigt werden…………………………………………………………...115
7.3.2 Warum wäre eine SRP Beteiligung an der Translokation von FHA und SepA
dennoch denkbar?....................................................................................................................... 117
7.3.3 Eine Beteiligung von SRP am Transport von Proteinen mit einer ungewöhnlichen
Signalsequenz und N-terminalen Extension konnte bisher nicht eindeutig
nachgewiesen werden…………………………………………………………………………. 118
7.3.4 Bei der Translokation von FHA und SepA hat SRP keine funktionelle Bedeutung…………...120
7.4
Trigger Factor dominiert bei der Bindung an naszierende Ketten
von FHA und SepA……………………………………………………………….122
7.5
Die Rolle von SecB………………………………………………………………. 124
7.5.1 SecB kann SRP teilweise substituieren……………………………………………………….. 124
7.5.2 FHA, das im Cytoplasma nur für kurze Zeit translokations-kompetent ist, benötigt
SecB für eine effiziente Translokation…………………………………………………………125
7.5.3 Kann SecB eine co-translationale Zielsteuerung von FHA übernehmen?..................................127
8.
Literaturverzeichnis………………………………………………………………... 132
9.
Anhang………………………………………………………………………………. 157
9.1
Abkürzungsverzeichnis…………………………………………………………... 157
9.2
Sequenz von FhaB* in pcB7……………………………………………………... 161
9.3
Sequenz von FhaB*∆ext in pFJD 112…………………………………………... 163
9.4
Sequenz von SepA* in pFJD116………………………………………………… 165
Danksagung
Lebenslauf
1
1.
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Gram-negative Bakterium Escherichia coli besitzt vier verschiedene
Zellkompartimente: das Cytoplasma, die Cytoplasmamembran (Innenmembran), den
periplasmatischen Raum sowie die Außenmembran. Aufgrund dieser Kompartimentierung
muss die Zelle über spezifische Transportmechanismen verfügen, um die im Cytoplasma
synthetisierten Proteine in den periplasmatischen Raum, in das extrazelluläre Medium oder
in eine der beiden Membranen zu transportieren.
Für die Zielsteuerung (Targeting) ungefalteter Proteine an, und ihren anschließenden
Transport über bzw. ihre Integration in die Innenmembran, sind unterschiedliche
Transportwege beschrieben.
1. Sekretorische Proteine (periplasmatische und Außenmembran-Proteine) werden während
ihrer Synthese am Ribosom von dem Chaperon Trigger Factor gebunden. Für die
anschließende post-translationale Zielsteuerung an die Innenmembran sind SecB und SecA
verantwortlich. Die nachfolgende Translokation der Proteine durch das SecYEG-Translokon
wird von SecA energetisiert.
2. Das bakterielle signal recognition particle (SRP) und sein Rezeptor FtsY vermitteln
sowohl die co-translationale Zielsteuerung polytoper Innenmembranproteine an, als auch
ihre Integration in das SecYEG-Translokon und die Innenmembran.
Nicht alle Innenmembranproteine sind jedoch ausschließlich auf SRP angewiesen. So ist die
Integration polytoper Innenmembranproteine mit großen periplasmatischen Domänen von
einer Kooperation zwischen SRP und SecA abhängig. SRP ist hier für die Zielsteuerung der
Proteine an die Innenmembran verantwortlich, während SecA die Translokation der großen
periplasmatischen Domänen vermittelt.
Uneinigkeit besteht, ob es in Bakterien sekretorische Proteine gibt, an deren Zielsteuerung
SRP beteiligt ist. Hierzu gehören auch jene sekretorischen Proteine, zu deren Klasse die in
dieser Arbeit untersuchten Proteine FHA aus Bordetella pertussis und SepA aus Shigella
flexneri gehören. Hierbei handelt es sich um Autotransporter bzw. TpsA Proteine, die sich
einerseits durch eine enorme Proteinlänge, andererseits durch eine stark positiv geladene und
lange N-Region innerhalb der Signalsequenz, sowie durch eine N-terminale Extension, die
der Signalsequenz am N-terminalen Ende vorausgeht, auszeichnen.
In dieser Arbeit wurde unter Verwendung eines homologen TranskriptionsTranslationssystems von E. coli erstmalig der Sekretionsweg dieser Proteine am Beispiel
von FHA und SepA in vitro analysiert.
Eine effiziente Interaktion zwischen SRP und naszierenden Ketten von FHA und SepA
konnte nicht beobachtet werden. Vielmehr ist es das ribosomenassoziierte Chaperon Trigger
Factor, das mit naszierenden Ketten von FHA und SepA interagiert. Zielsteuerung und
Translokation geschehen abhängig von SecA und SecB und unabhängig von SRP. Gezeigt
wurde ebenfalls, dass die N-terminale Extension den Sekretionsmodus von FHA in diesem
E. coli in vitro System nicht beeinflusste.
Die Ergebnisse dieser Arbeit bekräftigen die Theorie einer zellinternen Unterscheidung
zweier verschiedener Protein-Transportwege in Bakterien: die SRP vermittelte Integration
von Innenmembranproteinen und den SecA abhängigen Transport sekretorischer Proteine.
Die hier beschriebenen Untersuchungen haben somit keinen Hinweis darauf erbracht, dass es
in Gram-negativen Bakterien sekretorische, SRP-abhängige Proteine gibt.
Obwohl eine funktionelle Beteiligung von SRP sicher ausgeschlossen werden konnte,
ergaben sich Hinweise auf ein mögliches co-translationales Targeting der Proteine an die
Innenmembran. Dieses wäre insofern günstig, als dadurch eine schnelle Proteintranslokation
über die Innenmembran sichergestellt und das Risiko einer zytotoxischen Aggregation solch
großer Proteine im Cytoplasma verringert würde. Der genaue Mechanismus eines solchen,
SRP unabhängigen, co-translationalen Targetings ist bislang nicht geklärt; diskutiert wird in
dieser Arbeit jedoch über eine Beteiligung von SecB.
Einleitung
2
2.
Einleitung
2.1
Die Zellhülle Gram-negativer Bakterien
Die Gram-negative Bakterienzelle besitzt vier verschiedene Zellkompartimente, die alle für
die physiologische und strukturelle Komplexität der Bakterienzelle essentiell sind. Neben
dem Cytoplasma existieren noch drei extracytoplasmatische Bereiche, nämlich die
Cytoplasmamembran (Innenmembran), der periplasmatische Raum und die Außenmembran
(Abb. 2.1).
Äußere
Membran
Periplasma
Innere
Membran
Cytoplasma
Abb. 2.1:
Elektronenmikroskopische
Darstellung einer Escherichia
coli-Zelle.
Die Innenmembran umgibt das
Cytoplasma. Zwischen
Innenmembran und
Außenmembran befindet sich der
periplasmatische Raum
Die Lipiddoppelschicht der Außenmembran Gram-negativer Bakterien ist höchst
asymmetrisch: ihre innere Schicht besteht aus den gleichen Phospholipiden wie die
Innenmembran (70-80% Phosphatidylethanolamin, 20-30% Phosphatidylglycerol und
Diphosphatidylglycerin), ihre äußere Schicht ist überwiegend aus Lipopolysacchariden
aufgebaut (Raetz und Dowhan, 1990; Raetz, 1993). Typisch für die Außenmembranproteine
ist ihr Aufbau aus ß-Faltblattstrukturen, während die Innenmembranproteine durch eine αhelikale Struktur ausgezeichnet sind. Den größten Anteil an den Außenmembranproteinen
stellen die sogenannten Porine, die für den Nährstoffaustausch notwendig sind (Benz, 1988;
Nikaido, 1992).
Während die Außenmembran überwiegend Schutzfunktion übernimmt und mit dem
extrazellulären Medium über Stofftransport im Austausch steht, werden die meisten
metabolischen Funktionen von der Innenmembran realisiert. Ihre Lipiddoppelschicht setzt
sich in beiden Schichten aus Phospholipiden zusammen, in die integrale Membranproteine
eingefügt sind, deren Membrandomänen aus unpolaren Aminosäureresten bestehen und zum
größten Teil α-helikale Strukturen ausbilden. Über die Innenmembran werden selektiv
Nährstoffe transportiert und Proteine transloziert; außerdem ist sie an der Lipidbiosynthese
beteiligt und Ort der oxidativen Phosphorylierung, Prozesse, die in Eukaryonten an der
3
Einleitung
Plasmamembran, an der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) bzw. an der
inneren Mitochondrienmembran stattfinden.
Im wässrigen Intermembranraum zwischen Innenmembran und Außenmembran, dem
Periplasma, verleiht das Peptidoglycannetz (Murein) der Zelle ihre Form und Stabilität; es
enthält
außerdem
verschiedenste
Enzyme,
Chaperone
für
die
Biogenese
von
Außenmembranproteinen (Missiakas und Raina, 1997) und Lipoproteine, die im
Peptidoglycan verankert die Verbindung mit der Außenmembran darstellen (Braun und
Sieglin, 1970).
Lipopolysaccharid
äußere
Membran
Porin
Periplasma
Murein Lipoprotein
Murein
innere
Membran
2.2
Abb.2.2 Die Zellhülle
Gram-negativer Bakterien
Charakteristisch ist die
dünne Mureinschicht
(Peptidoglycannetz) sowie
die mit dem Murein über
Proteine verbundene äußere
Membran. In dieser sind
zahlreiche Proteine
lokalisiert. Die äußere
Schicht dieser Membran
setzt sich aus eng
aneinanderliegenden
Lipopolysaccharidkomplexen
zusammen.
Proteintransport in Gram-negativen Bakterien
2.2.1 Überblick über die Proteintransportmechanismen an der bakteriellen
Innenmembran
Im Cytoplasma der Gram-negativen Bakterienzelle werden Proteine synthetisiert, die
unterschiedliche Bestimmungsorte in der Bakterienzelle haben. Cytoplasmatische Proteine
verbleiben nach ihrer Synthese im Cytoplasma, während Innenmembran-, Periplasma- oder
Außenmembranproteine dieses nach ihrer Synthese verlassen.
Lösliche, periplasmatische Proteine sowie Außenmembranproteine müssen durch die
Innenmembran transloziert werden, um in das Periplasma gelangen zu können bzw. in die
Außenmembran integriert oder ins extrazelluläre Medium entlassen werden zu können.
Zusammengefasst werden sie als sekretorische Proteine bezeichnet. Ihnen werden die
Innenmembranproteine gegenübergestellt, die in die Lipidschicht der Innenmembran
integriert werden.
Einleitung
4
Sowohl für sekretorische Proteine als auch für Innenmembranproteine lässt sich der
Transport in drei Phasen unterteilen.
1. Erkennung: Die zu transportierenden Proteine müssen nach oder während ihrer
Synthese am Ribosom spezifisch erkannt werden.
2. Zielsteuerung: Die Proteine müssen an die Innenmembran herangeführt werden.
Hierzu muss die Zelle über entsprechende Mechanismen verfügen, um der
Proteinerkennung eine genaue Zielsteuerung folgen zu lassen. Diese Zielsteuerung
wird auch als Targeting bezeichnet.
3. Translokation/Integration: Sekretorische Proteine werden durch die Innenmembran
transloziert,
während
Innenmembranproteine
in
die
Lipidschicht
der
Cytoplasmamembran integriert werden.
Die Integration von Innenmembranproteinen einerseits und die Translokation sekretorischer
Proteine
andererseits,
erfordern
unterschiedliche
Erkennungs-,
Targeting-
und
Transportmaschinerien (Abb. 2.3). Für die Zelle besteht die Notwendigkeit, die naszierende
Polypeptidkette des Proteins während ihrer Synthese am Ribosom spezifisch zu erkennen
und dadurch bereits zu einer frühen Phase der Translation den, für das jeweilige Protein
bestimmten Transportweg zuzuweisen.
Sekretorische Proteine interagieren nach Abschluß der Synthese und Loslösung vom
Ribosom (post-translational) mit SecA- und SecB-Proteinen, die für das anschließende
Targeting an die Innenmembran verantwortlich sind. Die nachfolgende Translokation durch
das SecYEG-Translokon wird ebenfalls durch SecA vermittelt, wobei die Energetisierung
dieses Prozesses durch die ATPase-Aktivität von SecA sowie dem Protonengradienten der
Innenmembran erfolgt.
Polytope Innenmembranproteine werden dagegen während ihrer Entstehung am Ribosom
(co-translational) vom signal recognition particle (SRP) gebunden. Durch die Interaktion
zwischen SRP und seinem membranständigen Rezeptor FtsY erfolgt die Zielsteuerung an
das SecYEG-Translokon und die sukzessive Integration in die Innenmembran.
Durch die Unterscheidung dieser beiden Transportwege stellt die Zelle sicher, dass die zur
Aggregation neigenden, hydrophoben Innenmembranproteine bevorzugten Zugang zu den
zahlenmäßig begrenzten Translokationskanälen der bakteriellen Innenmembran erhalten. In
den folgenden Kapiteln werden die unterschiedlichen Schritte bei der Erkennung und
Translokation sekretorischer Proteine bzw. der Erkennung und Integration polytoper
Innenmembranproteine näher dargestellt.
5
Signalpeptidase
YajC
D
G
YajC
D
F
SecY
N
E
SecA
N
SecA
G
SecY
GG
EE
D
F
SecY
SecA
ATP
SecB
N
YajC
F
SecY
SecY
Einleitung
SecY
E
∆µH+
C
ADP + P
C
C
N
SecA
SecB
C
N
TF
SRP
A
Ribosom
SecY
YidC
N
FtsY
SecY
FtsY
E
SRP
YidC
E
N
SRP
Ribosom
Ribosom
N
SRP
TF
B
Ribosom
Abb. 2.3: Membrantransport
sekretorischer Proteine (A)
und Integration polytoper
Innenmembranproteine (B) in
Escherichia coli im Vergleich.
A: Naszierende Ketten sekretorischer
Proteine werden am Ribosom von
Trigger Factor (TF) gebunden; nach
Ablösung vom Ribosom übernehmen
SecB und SecA die post-translationale
Zielsteuerung. SecA inseriert durch
Interaktion
mit
SecY
in
die
Cytoplasmamembran und transloziert
in
ATP-abhängigen
Zyklen
das
sekretorische Protein durch die
Innenmembran.
Die
InsertionsDeinsertionszyklen von SecA werden
durch Topologieänderungen von SecG
unterstützt. Der SecDFYajC-Komplex
ist mit dem SecYEG-Translokon
assoziiert. Für die Energetisierung des
Translokationsprozesses ist neben
dem Motorprotein SecA auch der
Protonengradient der Innenmembran
(∆µH+)
verantwortlich.
Die
Signalsequenz
wird
nach
ihrer
Translokation von der Signalpeptidase
abgespalten und proteolytisch verdaut.
B: Polytope Innenmembranproteine
werden während ihrer Synthese am
Ribosom von SRP erkannt. SRP
vermittelt gemeinsam mit seinem
Rezeptor FtsY die co-translationale
Zielsteuerung an das Translokon,
wobei hier nur SecY und SecE, nicht
jedoch SecG benötigt werden. An der
Integration in die Innenmembran ist
zusätzlich das Membranprotein YidC
beteiligt
2.2.2 SecB/SecA-abhängiger, post-translationaler Transport sekretorischer
Proteine
Sekretorische Proteine in E. coli werden zunächst als Präproteine mit einer N-terminal
lokalisierten, spaltbaren Signalsequenz synthetisiert. Nach vollständiger Synthese und
Ablösung vom Ribosom erfolgt die Zielsteuerung an die Innenmembran post-translational in
einer SecB- und SecA-abhängigen Reaktion. Die Translokation durch das SecYEG
Translokon erfolgt ebenfalls in Abhängigkeit von SecA.
Einleitung
6
2.2.2.1 Die Signalsequenz sekretorischer Proteine
Die klassische Signalsequenz besteht aus 18-30 Aminosäuren und wird im Laufe ihrer
Translokation durch die Innenmembran durch ein integrales Membranprotein, die
Signalpeptidase, abgespalten. Sie besteht typischerweise aus drei Regionen: der positiv
geladenen N-terminalen N-Region, der zentralen hydrophoben und nicht geladenen HRegion sowie einem polaren C-terminalen Bereich mit der Schnittstelle für die
Signalpeptidase, der so genannten C-Region.
Die N-Region ist 1-5 Aminosäuren lang und enthält die basischen Aminosäuren Arginin und
Lysin. Ihre positive Ladung spielt bei der Erkennung durch das Motorprotein SecA eine
wichtige Rolle (Akita et al., 1990) und ist für die korrekte Orientierung der Signalsequenz in
der
Innenmembran
verantwortlich:
Die
negativ
geladenen
Kopfgruppen
der
Membranphospholipide (de Vrije et al., 1990) und das, auf der cytosolischen Seite negative
elektrochemische Membranpotential (von Heijne, 1986a), halten die N-Region auf der
cytosolischen Seite fest.
Die H-Region stellt den hydrophoben Kernbereich der Signalsequenz dar. Mit einer Länge
von 8-15 Aminosäuren ist sie deutlich kürzer als die hydrophobe Signal-Anker-Sequenz
eines Innenmembranproteins. Die H-Region bildet in der Membran eine α-Helix aus, die der
Verankerung der Signalsequenz in der Innenmembran dient. Die Translokationseffizienz ist
von der Länge und Hydrophobizität der H-Region abhängig (Chou und Kendall, 1990;
Doud et al., 1993).
Die C-Region ist 3-7 Aminosäuren lang und enthält die Schnittstelle für die Signalpeptidase
(von Heijne, 1990). Die C-Region der Signalsequenz sowie der N-Terminus des reifen
Proteins sind neutral oder negativ geladen: Basische Aminosäuren in dieser Region stören
die korrekte Orientierung der Signalsequenz in der Innenmembran und behindern dadurch
die Translokation (Li et al., 1988).
2.2.2.2 Erkennung und Targeting sekretorischer Proteine
Obwohl die Zielsteuerung (Targeting) der sekretorischen Proteine zum Translokon ein posttranslationaler Vorgang ist, interagieren sekretorische Proteine während der Synthese am
Ribosom bereits mit dem ribosomenassozierten Chaperon Trigger Factor. Nach Abschluß
der Synthese und Loslösung vom Ribosom verliert das sekretorische Protein den Kontakt
mit Trigger Factor und wird stattdessen von SecB und SecA gebunden.
7
Einleitung
Trigger Factor
Trigger Factor ist ein konserviertes Protein, das zwar in allen Bakterien vorkommt, jedoch
nicht essentiell ist (Bukau et al., 2000). Das Protein ist 48 kD groß und besteht aus drei
Domänen: einer N-terminalen Domäne, welche die Bindung an das Ribosom vermittelt,
einer zentralen Domäne, die sich durch eine Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase-Aktivität
(PPIase-Aktivität) auszeichnet und einer C-terminalen Domäne, deren Funktion bislang noch
nicht geklärt ist (Hesterkamp und Bukau, 1996; Stoller et al., 1996).
Im zellfreien System konnte Trigger Factor mit allen bislang getesteten Polypeptidketten
sekretorischer und cytosolischer Proteine quervernetzt werden (Hesterkamp et al., 1996;
Valent et al., 1997; Beck, 2000). Dabei scheint allerdings nicht die Signalsequenz der
Proteine als primäre Bindestelle zu dienen; vielmehr wird die Interaktion zwischen Trigger
Factor und dem sekretorischen Protein über den reifen Proteinanteil vermittelt. Eine
Bindung naszierender Ketten durch Trigger Factor ist jedoch nicht Voraussetzung für eine
erfolgreiche Translokation. So zeigen auch Trigger-Factor-defiziente Zellen weiterhin
Translokation und Transport sekretorischer Proteine (Guthrie und Wickner, 1990).
Trigger Factor, der das Protein L23 am Ausgang des ribosomalen Peptidtunnels als
Bindestelle nutzt, ist in der Lage, naszierende Polypeptidketten zu binden (Kramer et al.,
2002). Interessanterweise nutzt auch SRP das Protein L23 als Bindestelle (Nissen et al.,
2000), was auf eine Kompetition zwischen SRP und Trigger Factor um die wachsende
Polypeptidkette am Ribosom hindeuten könnte (Kramer et al., 2002; Gu et al., 2003; Ullers
et al., 2003, Eisner et al., 2003). Experimentell konnte in vitro eine funktionelle Interaktion
zwischen SRP und dem sekretorischen Protein OmpA in einer Trigger Factor
Deletionsmutante nachgewiesen werden (Eisner et al., 2003), was ebenfalls auf eine solche
Kompetition hindeutet. Alternativ ist eine sequentielle Assoziation der Signalsequenz
zunächst mit SRP und anschließend mit Trigger Factor denkbar, wobei in Abwesenheit von
Trigger Factor der Kontakt mit SRP auch für sekretorische Proteine erhalten bleibt (Ullers et
al., 2003).
Trigger Factor übernimmt also zwei wesentliche Aufgaben in der Zelle: in seiner Funktion
als Chaperon hält Trigger Factor sekretorische Proteine in einer transportkompetenten
Konformation bevor SecB diese Aufgabe übernehmen kann. Erst nach vollendeter
Translation, Ablösung des Ribosoms und Dissoziation von Trigger Factor interagiert ein
sekretorisches Protein mit SecA und SecB. Außerdem verhindert Trigger Factor die stabile
Interaktion eines sekretorischen Proteins mit SRP und ist somit vermutlich auch an der
Zielsteuerung beteiligt.
Einleitung
8
TF-Signatur
GFRxGxxP
1
43 50
145
248
432
E. coli Trigger factor
Ribosom-bindende PPIase- und
Unbekannte Funktion
Domäne
Substrat-binde Dom.
Abb. 2.4 Die Trigger Factor-Domänen
Die N-terminale Ribosomen-bindende
Domäne (grün) enthält die konservierte
TF-Signatur, die an das Ribosom bindet.
In der zentralen PPIase-Domäne (gelb)
ist
auch
die
Substrat-Bindestelle
lokalisiert. Die Funktion der C-terminalen
Domäne (blau) ist unbekannt. (Abb. nach
Kramer et al., 2002)
SecB
SecB ist ein nicht-essentielles Protein und konnte bisher nur in Gram-negativen Bakterien
nachgewiesen werden. Die biochemische Strukturanalyse ergab, dass jeweils zwei der 16 kD
großen, stark negativ geladenen Untereinheiten von SecB ein Dimer bilden und, dass sich
jeweils zwei solcher Dimere zu einem Homotetramer organisieren (Kumamoto und Nault,
1989; Xu et al., 2000; Driessen, 2001). Die Struktur dieses Homotetramers entspricht dabei
einem Rechteck mit zwei seitlich gelegenen, langgestreckten Furchen, von denen jede
jeweils zwei unterschiedliche Peptidbindestellen enthält. Beide Peptidbindestellen
unterscheiden sich sowohl in ihrer strukturellen Ausprägung als auch in ihrer
Bindungsspezifität. Während die eine dieser Peptidbindestellen bevorzugt Peptidregionen
mit hydrophoben und aromatischen Aminosäuren bindet, reagiert die andere Bindestelle
spezifisch mit basischen Peptidregionen. Um mit den Peptidbindestellen auf beiden Seiten
des Chaperons interagieren zu können, muss sich das sekretorische Protein in Form einer
langgestreckten Polypeptidkette um das SecB-Homotetramer winden. In der Tat konnten
Bereiche sekretorischer Proteine identifiziert werden, die in einer Länge von bis zu 460
Aminosäuren von SecB gebunden wurden (Smith et al., 1997).
In vitro kann SecB mit den verschiedensten ungefalteten Proteinen (Lecker et al., 1990;
Fekkes et al., 1995), in vivo aber nur mit sekretorischen Proteinen interagieren (Kumamoto,
1989; Laminet et al., 1991; Kumamoto und Francetic, 1993). SecB erkennt Peptidsequenzen,
die typischerweise im Inneren gefalteter Proteine zu finden sind (Knoblauch et al., 1999),
und bindet dadurch vorzugsweise an dem ungefalteten reifen Teil der Vorläuferproteine
(Hardy und Randall, 1991). Da SecB somit nicht spezifisch an die Signalsequenz von
sekretorischen Proteinen bindet, stellt sich die Frage, wie SecB mit hoher Selektivität
sekretorische von cytosolischen Proteinen unterscheiden kann. Eine Antwort dafür wäre das
von Hardy und Randall (1991) vorgeschlagene „kinetic partitioning model“, welches besagt,
dass die Signalsequenz die Faltung sekretorischer Proteine verlangsamt (Park et al., 1988).
Somit würde SecB eher mit langsam faltenden Substraten als mit schneller faltenden
Proteinen ohne Signalsequenz interagieren (Randall et al., 1997).
9
Einleitung
Einige Beobachtungen sprechen jedoch gegen dieses „Kinetic partitioning model“. So
beschreiben Watanabe und Blobel (Watanabe und Blobel, 1989; Watanabe und Blobel,
1995) sowie Altman (Altman et al., 1990) direkte Interaktionen zwischen SecB und der
Signalsequenz bestimmter Proteine. Des Weiteren konnte unter Verwendung von prlMutanten (prl steht für Protein-Lokalisation) des E. coli-Sec-Translokons gezeigt werden,
dass einige Proteine trotz bzw. erst nach Entfernen der Signalsequenz SecB-abhängig
transportiert wurden (Derman et al., 1993; Flower et al., 1994). Hinzu kommt, dass die
Faltung SecB-assoziierter Proteine weitaus schneller sein kann, als die Faltung SecBunabhängiger Proteine (Fekkes et al., 1995). Außerdem kann SecB auch bereits gefaltete
Proteine binden und diese der Transportmaschinerie zuführen (Zahn et al., 1996; Stenberg
und Fersht, 1997). Generell akzeptiert ist, daß SecB den reifen Teil im Vorläuferprotein
bindet (Randall und Hardy, 1995) und ihn über seine Chaperonaktivität in einem
translokationskompetenten Zustand hält (Collier et al., 1988; Lecker et al., 1989 und 1990;
Randall und Hardy, 1986; Weiss et al., 1988).
Neben seiner Chaperonfunktion ist SecB vor allem an der Zielsteuerung (Targeting)
sekretorischer Proteine zur Membran beteiligt (Hartl et al., 1990; Swidersky et al., 1990).
Diese Funktion wird durch seine Affinität zu SecA vermittelt. Mit Hilfe der kürzlich
aufgeklärten SecB-Kristallstruktur konnte die SecA-Bindestelle auf SecB näher beschrieben
werden (Xu et al., 2000). So besitzt jedes der SecB-Dimere eine SecA-Bindestelle in Form
einer flachen Ebene, die einen hohen Anteil negativ geladener Aminosäuren trägt. Diese
ermöglichen eine optimale Interaktion mit der positiv geladenen SecB-Bindedomäne in
SecA. Hat SecB bereits an ein Präprotein gebunden, erhöht sich seine Affinität zu SecA
(Hartl et al., 1990; Fekkes et al., 1997).
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass SecB für einen Teil der sekretorischen Proteine
die Funktion eines exportspezifischen Chaperons übernimmt, indem es durch Bindung an
den reifen Teil des Präproteins dessen vorzeitige Faltung verhindert (Collier et al., 1988;
Lecker et al., 1990; Hardy und Randall, 1991). Darüber hinaus hat SecB durch seine
Affinität zu SecA auch eine Zielsteuerungsfunktion beim Transport sekretorischer Proteine.
Dabei muss SecB aber nicht zwangsläufig beide Aufgaben beim Transport eines Proteins
übernehmen. So gibt es Proteine, bei denen SecB nicht für die Stabilisierung der transportkompetenten Konformation zuständig ist, sondern nur für das effiziente Targeting zum
Translokon benötigt wird (de Cock und Tommassen, 1992).
Einleitung
10
Substratbindekanal
Bindestelle 2
Bindestelle 1
A
B
C
Abb. 2.5 SecB Struktur
A. Struktur des SecB-Tetramers: im Vordergrund ist die ß-Faltblatt-Struktur eines Dimers (gelb +
grün) zu sehen, im Hintergrund befindet sich das andere Dimer (rot + blau). Jedes Monomer ist in
einer eignen Farbe eingezeichnet.
B. entspricht A, ist aber um 90° gedreht, sodass mann die Grenzfläche zwischen den beiden
Dimeren sieht (gelb + grün und blau + rot). Der Verlauf des langen Substratbindekanals ist schwarz
schraffiert dargestellt.
C. Oberflächendarstellung des Tetramers in gleicher Orientierung wie in B. Die Peptidbindestellen 1
(rot) und 2 (blau) des Substratbindekanals sind markiert. In die SecA Bindung sind die C-terminalen
Reste jeder Untereinheit (orange) involviert.
(Abb. aus Xu et al., 2000 und Randall und Hardy, 2002)
SecA
SecA, das Motorprotein des post-translationalen Transportes, ist ein essentielles Protein, das
bisher in allen Bakterien und auch in Chloroplasten beschrieben wurde. Dieses Schlüsselprotein ist sowohl am Targeting, als auch an der Translokation maßgeblich beteiligt. SecA
ist der Rezeptor für sekretorische Proteine und deren Chaperone (Wickner und Leonard,
1996) und aufgrund seiner Fähigkeit zur ATP Hydrolyse neben dem Protonengradienten der
Innenmembran eine der Energiequellen des post-translationalen Transportes (Economou und
Wickner, 1994).
SecA kommt sowohl membrangebunden als auch in freier Form im Cytoplasma vor (Hartl
et al., 1990; Hoffschulte et al., 1994; Müller et al., 2001); die Membranassoziation wird
durch SecY und Phospholipide vermittelt (Hendrick und Wickner, 1991; Ulbrandt et al.,
1992), wobei SecA mit hoher Affinität an den SecYE-Komplex und mit geringer Affinität an
anionische Phospholipide bindet (Dapic und Oliver, 2000). Die Bindung von SecA an die
Membran steigt dabei mit der Anzahl von SecYE-Komplexen an (Douville et al., 1995; van
der Does et al., 1996).
Eine funktionelle und strukturelle Analyse des SecA-Proteins zeigte die Existenz
verschiedener Bindestellen für Nukleotide, Präproteine, Membranphospholipide und
mRNA.
11
Einleitung
SecA übernimmt funktionell die Aufgaben einer dimeren ATPase und stellt sich als ein
Homodimer dar, welches aus zwei 102 kD-Untereinheiten organisiert ist (Akita et al., 1991;
Economou, 1998). Jedes dieser Monomere enthält 901 Aminosäuren (Oliver und Beckwith,
1982) und besteht aus zwei Domänen: einer 68 kD großen N-terminalen Domäne und einer
34 kD großen C-terminalen Domäne (Dempsey et al., 2002).
Die N-terminale Domäne ist für die Signalsequenzerkennung verantwortlich (Kimura et al.,
1991) und zeigt ATPase-Aktivität (Oliver, 1993). Diese ATPase-Domäne besitzt zwei ATPBindestellen (NBS I und II), die sich in ihrer Affinität zu ATP unterscheiden. Während NBS
I mit seiner ausgesprochen hohen ATP-Affinität als eigentliche Domäne der ATP-Hydrolyse
gilt, ist die Rolle der geringer affinen NBS II weniger klar (Mitchell und Oliver, 1993;
Economou et al., 1995). Die Anwesenheit von SecB und/oder einer Signalsequenz
sekretorischer Proteine erhöht die ATPase-Aktivität von SecA (Miller et al., 1998; Kim et
al., 2001).
Die C-terminale Domäne ermöglicht die Dimerisierung von SecA, reguliert die ATPaseAktivität (Hirano et al., 1996) und vermittelt die Interaktion mit Membranphospholipiden
und SecY (Snyders et al., 1997). In der C-terminale Domäne ist auch die 22 Aminosäuren
umfassende, hoch konservierte Bindestelle für SecB lokalisiert, die als charakteristisches
Merkmal ein Cystein-Histidin-Motiv beinhaltet. Dieses Motiv koordiniert die Bindung eines
zweiwertigen Zinkions, welches die SecB-Bindedomäne stabilisiert und so zu einer
funktionellen Bindung zwischen SecA und SecB führt (Fekkes et al., 1999).
Die SecA-Bindestellen bei Präproteinen sind bisher noch nicht eindeutig identifiziert.
Sowohl Bereiche innerhalb der reifen Proteinform als auch die Signalsequenz scheinen
hierbei eine Rolle zu spielen (Akita et al., 1990; Miller et al., 1998). Eine Interaktion von
SecA mit Signalsequenzen konnte biochemisch nachgewiesen werden (Lill et al., 1990;
Miller et al., 1998). Die Tatsache, dass eine SecA-Interaktion des Präproteins unabhängig
von einer SecB-Bindung beobachtet werden kann (Beck et al., 2000), erlaubt die
Schlussfolgerung, dass für SecA und SecB individuelle Bindestellen existieren.
Die Frage, ob SecA in seiner löslichen oder membrangebundenen Form mit dem Komplex
aus Präprotein und SecB interagiert, wird kontrovers diskutiert. Auf der einen Seite ist
denkbar, dass SecA in einem, an das SecYEG-Translokon gebundenen Zustand, als Rezeptor
für den Präprotein-SecB-Komplex dient (Fekkes et al., 1997); auf der anderen Seite besteht
die Möglichkeit, dass SecA in seiner löslichen Form den Komplex aus Präprotein und SecB
bindet und erst anschließend mit dem SecYEG-Translokon interagiert (Hoffschulte et al.,
1994). Sowohl SecA als auch SecB können zwar an ribosomenassoziierte naszierende Ketten
binden (Chun und Randall, 1994; Randall et al., 1997), jedoch führt diese vorzeitige
Einleitung
12
Interaktion mit den ribosomenassoziierten naszierenden Ketten zu keinem effizienten cotranslationalen Targeting (Behrmann et al., 1998). Eine späte co-translationale Bindung von
SecB an ribosomenassoziierte, naszierende Ketten wurde auch von Kumamoto und
Francetic, 1993 beschrieben. Bisherige Daten sprechen dagegen dafür, dass eine SecAvermittelte Zielsteuerung mit anschließender erfolgreicher Translokation nur strikt posttranslational, also nach Ablösung des Ribosoms, stattfinden kann. Solange die naszierende
Kette am Ribosom gebunden ist, wird eine Interaktion mit SecA durch das
ribosomenassoziierte Chaperon Trigger Factor verhindert (Beck et al., 2000). Demnach
übernehmen SecA und SecB die Zielsteuerung sekretorischer Proteine erst nach der
Ablösung der naszierenden Ketten vom Ribosom (Behrmann et al., 1998).
2.2.2.3 Translokation sekretorischer Proteine durch das SecYEG-Translokon
Das SecYEG-Translokon ist ein Komplex der integralen Membranproteine SecY, SecE und
SecG. Die beiden Komponenten SecY (Ito, 1984) und SecE (Schatz et al., 1989) stellen
dabei Homologe zum eukaryontischen Sec61α und Sec61γ dar, während für die dritte
Komponente SecG (Douville et al., 1994) kein eukaryontisches Äquivalent gefunden wurde.
Zusätzlich ist zumindest transient der SecDFYajC-Komplex mit dem SecYEG-Komplex
assoziiert, allerdings ist dessen genaue Funktion für den Proteintransport unklar.
SecY ist ein für E. coli essentielles Protein und besitzt zehn transmembrane Domänen,
fünf periplasmatische Schleifen sowie sechs cytoplasmatische Segmente (Ito, 1984;
Akiyama und Ito, 1987). SecY interagiert während des Translokationsvorgangs mit der
Signalsequenz. Dies konnte unter Verwendung von SecY-Mutanten gezeigt werden, die
einen, durch eine mutierte Signalsequenz bewirkten, Translokationsdefekt aufheben können
(Bieker und Silhavy, 1990; Schatz und Beckwith, 1990; Flower et al., 1994). Auch eine
direkte Interaktion zwischen SecY und SecA konnte nachgewiesen werden. Der Austausch
einer einzelnen Aminosäure in der C-terminalen cytosolischen Domäne in der secY205Mutante verhindert spezifisch die SecY-SecA-Interaktion und führt so zu einer starken
Beeinträchtigung der Translokation sekretorischer Proteine (Matsumoto et al., 1997).
Auch SecE ist ein essentielles Protein und besitzt in E. coli drei Transmembrandomänen,
wobei nur die C-terminale Transmembrandomäne für seine Funktion essentiell ist (Schatz et
al., 1991). Die Aufgabe von SecE scheint in der Stabilisierung und dem Schutz von SecY zu
bestehen, welches in Abwesenheit von SecE durch die membrangebundene ATP-abhängige
Protease FtsH verdaut wird (Akiyama et al., 1996). Außerdem bewirken SecE-Moleküle
über eine gegenseitige Interaktion eine Oligomerisierung einzelner SecYEG-Komplexe
13
Einleitung
(Kaufmann et al., 1999). SecY und SecE sind in rekonstituierten Proteoliposomen als
einzige integrale Membranproteine für den bakteriellen Proteintransport ausreichend
(Akimaru et al., 1991).
SecG als dritte Komponente des bakteriellen Translokationskomplexes wird von einem nicht
essentiellen Gen codiert und besitzt zwei transmembrane Helices. Erst bei niederen
Temperaturen oder in Abwesenheit des Protonengradienten ist SecG für Zellwachstum und
Proteintranslokation essentiell (Nishiyama et al., 1994; Hanada et al., 1996). SecG
unterstützt durch seine, während der Proteintranslokation auftretende, Topologieänderung
den Insertions-Deinsertionszyklus von SecA bei der Translokation sekretorischer Proteine.
Nach der SecA-Deinsertion kehrt SecG wieder in seine Ausgangskonformation zurück
(Nishiyama et al., 1996).
Elektronenmikroskopische
Aufnahmen
aus
Bacillus
subtilis
zeigen,
dass
der
Komplex aus SecY und SecE eine pentagonale Ringstruktur ausbildet, die analog dem
eukaryontischen Translokon einen proteintransportierenden Kanal darstellt (Meyer et al.,
1999). Es wird angenommen, dass der SecYEG-Komplex in seiner inaktiven Form als
Dimer vorliegt, in seiner aktiven Form dagegen eine Tetramerstruktur einnimmt (Manting et
al., 2000).
In seiner Eigenschaft als ATPase gilt SecA als das Motorprotein der post-translationalen
Translokation sekretorischer Proteine durch das SecYEG-Translokon (Economou und
Wickner, 1994; Economou, 1998). Nachdem SecA ATP gebunden hat, dissoziiert SecB von
dem SecB-SecA-Polypeptidkomplex ab und SecA durchläuft eine intramolekulare
Konformationsänderung, die dazu führt, dass SecA tief in die Membran inseriert (Kim et al.,
1994; van der Does et al., 1996; Ramamurthy und Oliver, 1997). Bei dieser
Membraninsertion führt SecA einen N-terminalen Abschnitt in der Größenordnung von 20
bis 30 Aminosäuren des von ihm gebundenen Präproteins mit in den Translokationskanal
ein. Nach ATP-Hydrolyse gibt SecA die Polypeptidkette frei und deinseriert wieder. SecA
kann nun das Translokon verlassen oder nach erneuter Bindung von ATP, Präprotein und
SecY wieder in die Membran inserieren. Durch stetige Wiederholung dieser InsertionsDeinsertionszyklen wird die Polypeptidkette schrittweise durch den Translokationskanal
geschoben, bis sie schließlich komplett durch die Membran transloziert worden ist
(Economou und Wickner, 1994; Uchida et al., 1995; Sato et al., 1997). Die Signalsequenz
des Proteins wird in einem frühen Stadium der Translokation durch die membranständige
Signalpeptidase
abgespalten
und
proteolytisch
verdaut.
Die
Energetisierung
des
Translokationsvorgangs wird sowohl von der beschriebenen ATP-Hydrolyse als auch vom
Protonengradienten der Innenmembran getragen (Swidersky et al., 1990).
Einleitung
14
2.2.3 SRP-abhängiger, co-translationaler Transport polytoper
Innenmembranproteine
Im Gegensatz zur post-translationalen, SecB- und SecA-abhängigen Zielsteuerung und
Translokation sekretorischer Proteine erfahren polytope Innenmembranproteine eine cotranslationale, SRP-abhängige Integration in die Innenmembran.
2.2.3.1 Die Signal-Anker-Sequenz polytoper Innenmembranproteine
Die Signalsequenzen der Innenmembranproteine sind im Gegensatz zu denen der
sekretorischen Proteine nicht abspaltbar und werden als Signal-Anker-Sequenzen
bezeichnet, weil sie neben ihrer Signalfunktion die Membranproteine permanent in der
Lipidschicht verankern. Entscheidendes Merkmal der Signal-Anker-Sequenz ist ihre
ausgeprägte Hydrophobizität. Bestehend aus ca. 20 Aminosäuren sind die Signal-AnkerSequenzen länger als die hydrophobe H-Region der Signalsequenz sekretorischer Proteine.
Polytope Innenmembranproteine mit mehreren Transmembrandomänen besitzen eine
alternierende Anordnung dieser Signal-Anker-Sequenzen und so genannter Stopp-TransferSequenzen. Sowohl die Signal-Anker-Sequenzen als auch die Stopp-Transfer-Sequenzen
bilden α-Helices aus, mit denen sie die Innenmembran als transmembrane Domänen
durchspannen und so als permanente Membrananker fungieren. Eine korrekte Orientierung
innerhalb der Membran wird dabei durch die „positive-inside-rule“ (von Heijne, 1989)
vorgegeben. So sind Signal-Anker-Sequenzen immer N-terminal, Stopp-Transfer-Sequenzen
dagegen
immer
C-terminal
von
basischen
Aminosäuren
flankiert.
Wird
diese
Ladungsverteilung experimentell vertauscht, dreht sich die Membranorientierung um (von
Heijne, 1989).
2.2.3.2 Erkennung und Targeting polytoper Innenmembranproteine
Innenmembranproteine zeichnen sich durch stark hydrophobe Transmembrandomänen aus
und sind deswegen im wässrigen Milieu des Cytosols besonders aggregationsgefährdet
(Ahrem et al., 1989). Ein rascher, co-translationaler Ablauf der Erkennung, Zielsteuerung
und Integration der naszierenden Polypeptidkette ist daher erforderlich. Diese Aufgabe
übernimmt das signal recognition particle (SRP), das die naszierenden Ketten polytoper
Innenmembranproteine co-translational an ihren N-terminal lokalisierten Signal-AnkerSequenzen (Valent et al., 1997; Lee und Bernstein, 2001) erkennt.
15
Einleitung
SRP kommt sowohl in Eukaryonten als auch in Prokaryonten vor. In Säugetierzellen
übernimmt das eukaryontische SRP das co-translationale Targeting sowohl von
Innenmembranproteinen als auch von sekretorischen Proteinen an das endoplasmatische
Retikulum (Rapoport et al., 1996). Das prokaryontische SRP übernimmt dagegen in
Bakterien wie E. coli nur den co-translationalen Transport polytoper Innenmembranproteine.
Sekretorische Proteine werden hier in Abhängigkeit von SecA und SecB transportiert.
Eukaryontisches und prokaryontisches SRP weisen Homologien auf, zeigen aber neben ihrer
verschiedenen Substratspezifität auch einige strukturelle Unterschiede.
SRP
SRP
Rezeptor
Eukaryonten
E. coli
7S RNA
4.5S RNA
SRP 54
SRP 19
SRP 9/14
SRP 68/72
Ffh (P48)
SRα
SRβ
FtsY
Abb. 2.6: Vergleich der SRPKomponenten bei Eukaryonten und E.
coli.
Zu den eukaryontischen Komponenten
7S RNA, SRP54 sowie SRα existieren in
Prokaryonten wie E.coli die Homologen
4.5S RNA, Ffh sowie FtsY.
Das bakterielle SRP
Zu den bakteriellen SRP Komponenten in E. coli zählen die 4.5S RNA, das Fifty-Fourhomologue (Ffh) sowie der Rezeptor FtsY. Zusammen können diese Komponenten in
Prokaryonten ein funktionelles SRP bilden (Romisch et al., 1989; Luirink et al., 1992,
Keenan et al., 2001). Die vom ffs-Gen codierte 4.5S RNA (Larsen und Zwieb, 1991) bildet
zusammen mit Ffh den hoch konservierten Kern von SRP, dessen Kristallstruktur
inzwischen analysiert werden konnte (Keenan et al., 1998; Batey et al., 2000).
Ffh, das aufgrund seines Molekulargewichtes auch P48 genannt wird, setzt sich aus drei
Domänen zusammen: Die Funktion der N-Domäne ist bisher noch unbekannt, die GDomäne besitzt GTPase-Aktivität und bindet an den Rezeptor FtsY (Freymann et al., 1997).
Die M-Domäne bildet eine tiefe Grube, in die die hydrophoben und flexiblen Seitenketten
ihrer zahlreichen Methionine wie „Borsten“ hineinragen. Diese „Borsten“ verleihen der
Grube genügend Plastizität und Hydrophobizität, um die vielfältigen, hydrophoben SignalAnker-Sequenzen zu erkennen (Keenan et al., 2001). Durch zusätzliche Bindung der MDomäne an die Domäne IV der 4.5S RNA wird diese hydrophobe Signalerkennungsgrube
um das Phosphodiester Rückgrat der RNA verlängert. Der in der Regel positiv geladene NTerminus der Signal-Anker-Sequenzen könnte dann mit dem negativ geladenen Rückgrat der
RNA interagieren und damit die Orientierung der Signal-Anker-Sequenz bestimmen. Die so
Einleitung
16
verlängerte Bindetasche würde dann die Signal-Anker-Sequenz sowohl über hydrophobe, als
auch über elektrostatische Wechselwirkungen binden (Batey et al., 2000; Bernstein, 2000a).
Abb. 2.7 Struktur der Signal-Anker-Sequenz
bindenden Domäne des bakteriellen SRP
A. Oberflächendarstellung des Komplexes aus Thermus
aquaticus: Die M-Domäne von Ffh (rot) und die Domäne
IV der 4.5S RNA (schwarz) bilden zusammen den
konservierten Kern von SRP. Die hydrophoben
Aminosäuren in der Signalerkennungsgrube sind gelb
dargestellt, die angrenzenden Nukleotide der 4.5S RNA
sind grün hervorgehoben
B. Modell des Komplexes, in gleicher Orientierung wie in
A, mit gebundener Signal-Anker-Sequenz (grüner und
blauer Zylinder) in der Signalerkennungsgrube (rot). Ffh
ist als orange-rotes Band dargestellt, die 4.5S RNA als
grau-schwarze Kette. Der positiv geladene N-Terminus
der Signal-Anker-Sequenz (blau) zeigt zum negativ
geladenen Rückgrat der 4.5S RNA (rot in diesem
Bereich).
(Abb. aus Batey et al., 2000 und Walter et al., 2000)
A
Signalerkennungsgrube
B
FtsY besitzt eine GTPase-Domäne, welche die SRP-Bindung vermittelt (Montoya et al.,
1997). Die Bindung zwischen Ffh und FtsY erfolgt zunächst im nukleotidfreien Zustand.
Erst eine nachfolgende Stimulierung der GTPase-Aktivität (Powers und Walter, 1997)
bewirkt über Aufnahme und Hydrolyse von GTP die Dissoziation der beiden Komponenten
(Miller et al., 1994; Valent et al., 1998). FtsY besitzt weiterhin eine stark negativ geladene,
N-terminal lokalisierte Domäne, über die es direkt mit Membranphospholipiden interagieren
kann (de Leeuw et al., 1997; de Leeuw et al., 2000). Im Gegensatz zum eukaryontischen
SRP-Rezeptor
existiert
der
prokaryontische
SRP-Rezeptor
FtsY
sowohl
in
membranassoziierter als auch in löslicher Form. Es wird allerdings diskutiert, ob Ffh
funktionell an lösliches FtsY binden kann (Zelazny et al., 1997).
Das bakterielle SRP ist spezifisch an der Integration polytoper Innenmembranproteine
beteiligt. Wurden einzelne Komponenten des SRP-Weges entfernt, war die Integration
verschiedener Innenmembranproteine in vivo gestört (MacFarlane und Müller, 1995;
Seluanov
und
Bibi,
1997).
Die
SRP-Abhängigkeit
der
Integration
von
Innenmembranproteinen konnte auch in Experimenten bestätigt werden, in denen Ffh
spezifisch mit Membranproteinen quervernetzt wurde. Je hydrophober die Signal-AnkerSequenz des Proteins war, desto effizienter war die beobachtete Ffh-Bindung (Valent et al.,
1995; Valent et al., 1997).
17
Einleitung
Wie auch im eukaryontischen System erfolgt die SRP-vermittelte Zielsteuerung in E. coli
co-translational. In Eukaryonten bewirken die beiden SRP-Untereinheiten 9 und 14 den für
den co-translationalen Transport erforderlichen Translationsarrest. Der Translationsarrest
soll den Zeitraum verlängern, in welchem die naszierenden Ketten zum Translokon
transportiert werden können ohne, dass sie eine Länge erreichen, in der sie zur Aggregation
oder Faltung neigen. In Prokaryonten konnte dagegen bislang weder eine Arretierung der
Translation nachgewiesen werden, noch konnte eine entsprechende Untereinheit des SRP
identifiziert werden, die hierfür verantwortlich sein könnte. Dies mag darauf hindeuten, dass
die Translationsverzögerung für ein co-translationales Targeting in Prokaryonten entweder
nicht notwendig ist, oder, dass eine andere Art der Translationsregulierung hierfür in Frage
kommt.
2.2.3.3 Integration polytoper Innenmembranproteine in das SecYEG-Translokon
Obwohl die SecA/SecB abhhängige post-translationale Translokation sekretorischer Proteine
und die SRP/SR abhängige co-translationale Integration von Innenmembranproteinen
grundlegend verschiedene Vorgänge sind, benutzen beide die gleiche Membranpore, das
SecYEG-Translokon (Koch et al., 1999). Dennoch bleiben die weiteren Wege der zwei
Proteinklassen getrennt: unterschiedliche Domänen und Untereinheiten des Translokons
lenken die Integration der Membranproteine bzw. die Translokation der sekretorischen
Proteine. Unterschiedlich sind auch die dem Translokon assoziierten Proteine und die
Energiequellen der beiden Prozesse.
Die co-translational integrierende Kette des polytopen Innenmembranproteins MtlA ist in
Kontakt mit SecY, nicht aber mit SecA gefunden worden (Beck et al., 2000), was eine
SecA-unabhängige Assemblierung von MtlA bestätigte (Werner et al., 1992). Auch in vitro
benötigte die Integration der Membranproteine MtlA, SecY und Lactosepermease kein SecA
(Werner et al., 1992; Yamato, 1992; MacFarlane und Müller, 1995; Koch et al., 1999). SecE
wurde dagegen auch für die Integration SRP-abhängiger Membranproteine benötigt (Koch
und Müller, 2000).
Das Ribosom kommt durch die SRP-abhängige, co-translationale Zielsteuerung in sehr
engen Kontakt mit dem SecYEG-Translokon und dichtet es dadurch vermutlich ab
(Prinz et al., 2000). Durch Quervernetzungstudien konnte nachgewiesen werden, dass
naszierende
Ketten
verschiedener
Innenmembranproteine
mit
SecY
interagieren
(Valent et al., 1998; Scotti et al., 1999; Beck et al., 2000). Wird das SecYEG-Translokon
experimentell blockiert, ist nicht nur die Translokation sekretorischer Proteine gestört,
Einleitung
18
sondern auch die Integration polytoper Innenmembranproteine beeinträchtigt (Koch et al.,
1999). Eine essentielle Rolle von SecYE bei der SRP-abhängigen Integration von
Membranproteinen ist auch durch Untersuchungen von SecY- und SecE-Mutanten bestätigt
worden (Newitt et al., 1999, Koch & Müller, 2000). Im Unterschied zur SecA-abhängigen
Translokation ist die SRP-abhängige Integration nicht auf SecG angewiesen (Koch &
Müller, 2000). Allerdings wird für die SRP-abhängige Integration die Beteiligung von YidC,
einem 60 kDa Membranprotein postuliert (Scotti et al., 2000, Beck et al., 2001).
2.2.4 Die Kooperation von SRP und SecA beim Transport von
Membranproteinen mit großen periplasmatischen Domänen
Die Theorie zweier, voneinander unabhängiger Protein-Zielsteuerungsmechanismen für
sekretorische Proteine auf der einen Seite und Innenmembranproteinen auf der anderen
Seite, lässt sich nicht für alle Proteine aufrechterhalten. Membranproteine mit großen periplasmatischen Domänen, die zusätzlich durch die Innenmembran transloziert werden
müssen, benötigen im Anschluss an ein SRP-vermitteltes Targeting für eine erfolgreiche
Integration die Aktivität von SecA. SecA ist hier nicht wie bei sekretorischen Proteinen für
die Zielsteuerung des Proteins verantwortlich, sondern agiert als Motorprotein, welches die
schrittweise Beförderung der großen periplasmatischen Domänen durch das Translokon
ermöglicht (Scotti et al., 1999; Neumann-Haefelin et al., 2000; Dalbey et al., 2000). Die
Zielsteuerung dieser Membranproteine erfolgt dagegen wie gewohnt SRP-abhängig.
Der Nachweis einer Kooperation zwischen SRP und SecA gelang durch Experimente mit
dem Hybridprotein Momp2. Momp2 besteht aus der ersten Signal-Anker-Sequenz des SRPabhängigen Innenmembranproteins MtlA und dem reifen Proteinanteil des sekretorischen,
SecA-abhängigen Außenmembranproteins OmpA (Neumann-Haefelin et al., 2000). Auch
natürlich vorkommende Proteine ähnlicher Topologie wie YidC, FtsQ oder die
Signalpeptidase I sind auf eine Kooperation von SRP und SecA angewiesen.
19
Einleitung
2.2.5 Der Transport über die äußere Membran: Die Proteinsekretion
Die Proteinsekretion wird für zahlreiche Aspekte des bakteriellen Lebenszyklus benötigt,
wozu auch die Expression von Virulenzfaktoren zählt. Diese Proteine müssen nach dem
Transport durch die innere Bakterienmembran zusätzlich Periplasma und äußere
Bakterienmembran
überwinden.
Hierzu
besitzt
die
Gram-negative
Bakterienzelle
verschiedene Sekretionsmechanismen, die Substrate spezifisch erkennen und deren
Sekretion ermöglichen, ohne dabei die Barrierefunktion der äußersten Zellhülle zu zerstören.
Zwischen den einzelnen Sekretionsmechanismen bestehen große Unterschiede; eingeteilt
werden sie in die 6 Gruppen: Chaperone/Usher Pathway, Typ I bis Typ IV sowie TypV/TPSWeg. Vier dieser Sekretions-mechanismen (Typ II, IV, V/TPS und Chaperone/Usher
Pathway) stellen terminale Zweige des General Secretion pathway (GSP) dar, in dem
Proteine mit abspaltbarer N-terminaler Signalsequenz in zwei Schritten zunächst durch die
Innenmembran und anschließend über die Außenmembran transportiert werden (Ecomomou,
1999). Proteine, die mittels des Typ I oder Typ III Sekretionsmechanismus transportiert
werden, können dagegen in einem Schritt über beide Membranen sezerniert werden
2.2.5.1 Chaperon-Usher Sekretionsmechanismus
Der Chaperon-Usher Sekretionsmechanismus ist ein terminaler Zweig des General Secretion
Pathway, der der Sekretion und Assemblierung einiger adhäsiver Virulenzstrukturen auf der
Bakterienoberfläche dient. Der Innenmembrantransport geschieht mit Hilfe des Sec Systems;
zum Außenmembrantransport sind nur zwei weitere Komponenten notwendig: ein
periplasmatisches Chaperon sowie ein Außenmembranprotein, das als Usher bezeichnet wird
und in der Außenmembran eine ß-Fassstruktur ausbildet (Thanassi et al., 1998; Thanassi and
Hultgren, 2000).
2.2.5.2 Typ I Sekretion
Der Typ I Sekretionsmechanismus wird von einer Vielzahl Gram-negativer Bakterien
genutzt, um Toxine, Proteasen und Lipasen zu sezernieren (Henderson et al., 1998). An
diesem Sekretionsmechanismus sind drei Proteine beteiligt: das ABC-Protein (ATPBinding-Cassette), das MF-Protein (Membrane-Fusion-Protein) und das OM-Protein (OuterMembrane-Protein), die zusammen einen geschlossenen Kanal ausbilden, durch den das
Einleitung
20
Substrat ohne Ausbildung eines periplasmatischen Intermediates hindurchtransportiert
werden kann (Thanassi and Hultgren, 2000). Das OM Protein bildet in der Außenmembran
einen trimeren porinartigen Komplex (Koronakis et al., 1997; Johnson and Church, 1999;
Benz et al., 1993), der über das MF Protein mit dem ABC Protein in der Innenmembran
verbunden ist (Thanabalu et al., 1998; Letoffe et al., 1996). Das ABC Protein stellt die
Energie für den Transport durch Hydrolyse von ATP bereit. Substrate des Typ I
Sekretionsmechanismus zeichnen sich alle durch ein spezifisches Sekretionssignal am Cterminalen Proteinende aus (Binet et al., 1997).
2.2.5.3 Typ II Sekretion
Der Typ II Sekretionsmechanismus dient der Sekretion extrazellulärer Enzyme und Toxine
(Stathopoulos et al., 2000; Russel, 1998; Pugsley et al., 1997) und setzt sich aus 12 bis 14
Proteinen zusammen (Pugsley et al., 1997, Nunn, 1999). Das Protein GspD, das zur
Superfamilie der Sekretine gehört, sowie das Lipoprotein GspS sind in der Außenmembran
lokalisiert (Russel, 1998; Pugsley et al., 1997; Nouwen et al., 1999; Genin and Boucher,
1994), während der größte Teil der Komponenten in der Innenmembran sitzt (GspG-J, F, KN) (Russel, 1998). Das Protein GspE ist ebenfalls in der Innenmembran lokalisiert und
besitzt ein konserviertes ATP-Bindemotiv bzw. Autokinasefunktion (Sandkvist et al., 1995;
Py et al., 1999; Possot and Pugsley, 1997). Innen- und Außenmembran sind über das Protein
GspC verbunden, das möglicherweise dem Energietransfer von GspE zu GspD dient (Bleves
et al., 1999; Possot et al., 1999). Substate des Typ II Sekretionmechanismus werden
zunächst SecA- oder Tat-abhängig über die Innenmembran transportiert; im Periplasma
falten sie dann mit Hilfe von Chaperonen und Faltungskatalysatoren in ihre Tertiärstruktur,
die das Erkennungssignal für die Translokation durch die Pore aus GspD in der
Außenmembran ist (Filloux et al., 1998; Braun et al., 1996; Bortoli-German et al., 1994;
Hirst and Holmgren, 1987). Für eine effiziente Translokation werden der Protonengradient
und ATP benötigt (Sharff et al, 2001).
2.2.5.4 Typ III Sekretion
Der Typ III Sekretionsmechanismus ermöglicht es Bakterien, Virulenzfaktoren direkt über
eine hohle, nadelartige Struktur in das Cytosol eukaryotischer Wirtszellen zu injizieren
(Hueck et al., 1998; Cornelis et al., 1998). Der Sekretionsapparat besteht aus 20
Komponenten, die zu einem Komplex assemblieren, der drei Membranen durchspannt und
21
somit
die
Sekretion
von
Virulenzfaktoren
Einleitung
in
einem
Schritt
ohne
Ausbildung
periplasmatischer Intermediate erlaubt (Thanassi and Hultgren, 2000). Die meisten
Komponenten sind in der Innenmembran lokalisiert
und weisen Homologie zum
Biosyntheseapparat der Flagellen auf (Hueck et al., 1998), während das porenbildende
Protein der Außenmembran zur Sekretinfamilie gehört (Crago and Koronakis, 1998; Koster
et al., 1997). In der Innenmembran befinden sich u.a. das Protein LcrD, das einen zentralen
Kanal bildet (Thanassi and Hultgren, 2000) sowie das Protein N, das die zur
Komplexassemblierung und zum Transport nötige Energie in Form von ATP bereitstellt
(Woestyn et al., 1994). Das Protein J im Periplasma verbindet Innen- und Außenmembran;
die Injektionsnadel, welche ins extrazelluläre Medium ragt, ist über eine Doppelringstruktur
in der Innenmembran verankert (Koster et al., 1997). Zur Sekretion von Virulenzfaktoren in
das Wirtscytoplasma werden zusätzliche Proteine benötigt, die in der Wirtszellmembran
Poren bilden (Tardy et al. 1999; Neyt and Cornelis, 1999). Substrate der Typ III Sekretion
besitzen am N-Terminus oft zwei Sekretionssignale, eines in der mRNA und ein weiteres,
das von cytoplasmatischen Chaperonen (z.B. SycE) gebunden wird (Anderson and
Schneewind, 1999; Cheng and Schneewind, 1999).
2.2.5.5 Typ IV Sekretion
Der Typ IV Sekretionsmechanismus ist mit dem Mechanismus der DNA-Konjugation
verwandt, da er der Bakterienzelle ermöglicht, Effektormoleküle direkt in eukaryotische
Wirtszellen zu injizieren. Bei den Effektormolekülen handelt es sich um DNA- oder um
Proteinsubstrate, die während der Infektion zu einer Veränderung der physiologischen
Vorgänge (z.B. der Signaltransduktion) in der Wirtszelle führen (Thanassi and Hultgren,
2000; Christie and Covacci, 2000). An der Bildung des Translokationskanals sind zahlreiche
Proteine beteiligt, die Innenmembran und Außenmembran miteinander verbinden
(Fernandez et al., 1999; Thorstenson et al., 1993; Spudich et al., 1996); ATP wird von
Proteinen in der Innenmembran zur Verfügung gestellt und zur Assemblierung der
Translokationpore und/oder der Translokation benötigt (Thanassi and Hultgren, 2000; Sharff
et al., 2001). Über die Innenmembran werden Proteine entweder Sec-abhängig in zwei
Schritten oder Sec-unabhängig in einem Schritt transloziert.
Einleitung
22
A
B
OM-channel
forming protein
Gsp
D
Außenmembran
GspS
MFP
GspS
Periplasma
GspC
ABC-Transporter
ATPase
Gsp G-J,
F, K-N
Sec
Innenmembran
ATPase
C
GspE
ATP
N
C
N
Eukaryotische Zelle
Zur Eukaryotenzelle
D
Plasmamembran
YopB, D
B2
Needle
YopN
B5
Extrazelluläres Medium
Außenmembran
B3
B7
C
Außenmembran
B7
B9
Periplasma
B9
B8 B10
Periplasma
J
D
Q
U
R-T
LcrD
Innenmembran
B6
Sec
B4
B11
C
Innenmembran
N
ATP
ATP
N
DNA
ATP
N
SycE
C
RNA
Abb.2.8: Übersicht über die Sekretionsmechanismen I bis IV
A : Model des Typ I Sekretionsmechanismus
Über ein spezifisches C-terminales Sekretionssignal wird das Substrat erkannt und über den
Translokationskanal aus ABC-Protein, MF-Protein und OM-Protein in einem Schritt unter ATPHydrolyse transportiert.
B : Model des Typ II Sekretionsmechanismus
Nach dem SecA- oder Tat-abhängigen Innenmembrantransport faltet das Protein in seine
Tertiärstruktur. GspD bildet die Translokationspore in der Außenmembran und ist über das
periplasmatische GspC mit dem Energielieferanten GspE in der Innenmembran verbunden.
C: Model des Typ III Sekretionsmechanismus (am Beispiel der Yop Proteine)
Die Translokation des Substrates erfolgt in einem Schritt; hierzu assemblieren die Proteine R-U und
LcrD in der Innenmembran über das Protein J mit dem Protein C, das in der Außenmembran einen
Kanal bildet und dessen Öffnung von YopN reguliert wird. Durch einen zentralen Kanal in der
Injektionsnadel werden die Proteine ins Cytosol der Wirtszelle transloziert. Hierzu muss mit Hilfe von
YopB und D ein Kanal in der Plasmamembran des Eukaryoten gebildet werden.
D: Model des Typ IV Sekretionsmechanismus (am Beispiel des VirB Systems)
Substrate passieren die Innenmembran entweder Sec-abhängig mit anschließender Ausbildung
eines periplasmatischen Intermediates oder in einem einzigen Schritt (DNA). VirB 4 und 11 liefern
ATP, VirB 7 und 9 sind Ausgangspunkt der Assemblierung des Sekretionsapparates. VirB 2 ist
Hauptkomponente bei der Ausbildung des Sekretionspilus.
23
Einleitung
2.2.5.6 Typ V Sekretion und Two-partner Sekretion (TPS)
Typ V Sekretion/Autotransporter
Der Typ V Sekretionsmechanismus dient der Sekretion von Proteinen verschiedenster
Funktionen, wie z.B. Proteasen, Adhäsinen oder Invasinen (Henderson et al., 1998.) Die
Substrate der Typ V Sekretion zeichnen sich durch eine gemeinsame Struktur aus
(Henderson et al., 1998): sie bestehen 1) aus einer N-terminalen, abspaltbaren, klassischen
Signalsequenz mit der positiv geladenen N-Region, der hydrophoben H-Region und der CRegion, die die Erkennungsstelle der Signalpeptidase trägt, 2) aus dem sezernierten reifen
Protein, das auch als Passagier- oder N-Domäne bezeichnet wird und 3) aus einer
carboxyterminalen ß- oder C-Domäne, die die Translokationspore in der Außenmembran
bildet und über eine Linkerregion (Maurer et al., 1999) mit der Passagierdomäne verbunden
ist. Die C-Domäne ist für die Translokation der Passagier-Domäne durch die äußere
Membran verantwortlich. Weitere Proteine werden nicht benötigt, weshalb dieser
Mechanismus als Autotransport und die transportierten Proteine als Autotransporter
bezeichnet werden.
Nach einem Sec-abhängigen Transport (Henderson et al., 1998) über die Innenmembran, bei
dem die Signalsequenz abgespalten wird (N-terminale Prozessierung), passiert das Protein
das Periplasma wahrscheinlich in einem ungefalteten Zustand (Suzuki et al., 1995; Klauser
et al., 1990; Jose J. et al., 1996; Jose et al., 1995). Anschließend durchspannt die ß-Domäne
die Außenmembran, um dort eine wässrige Pore in Form einer ß-Fassstruktur auszubilden.
In diese faltet zunächst die Linkerregion hinein und zieht dann die Passagierdomäne, die
hierzu eine Haarnadelstruktur annimmt, mit dem C-terminalen Ende beginnend zur
bakteriellen Oberfläche (Klauser et al., 1990). Danach kann das Protein entweder über die ßDomäne mit dem Bakterium assoziiert bleiben oder von der ß-Domäne abgespalten werden
(C-terminale Prozessierung), die dann anschließend abgebaut wird (Mauer et al., 1999).
Two-partner Sekretion (TPS)
Ebenso wie die Typ V Sekretion dient auch der TPS-Weg dem Transport sehr großer
Proteine und wird überwiegend von pathogenen Bakterien genutzt. Der wesentliche
Unterschied zum Typ V-Weg besteht darin, dass die Translokationspore in der äußeren
Membran durch ein eigenständiges Protein gebildet wird, das als TpsB-Protein bezeichnet
wird. Das Substrat selbst wird als TpsA-Protein bezeichnet und entspricht bezüglich seines
Aufbaus im Wesentlichen einem Autotransporter-Protein, mit dem Unterschied, dass die CDomäne der TpsA Proteine keine Pore in der Außenmembran bildet. Wie die
Einleitung
24
Autotransporter-Proteine werden die TpsA-Proteine zunächst in einem ersten Schritt über die
innere Membran transportiert und durchdringen anschließend das Periplasma im
ungefalteten Zustand.
Es konnte gezeigt werden, dass nach verzögerter Expression der TpsB Proteine die
Sekretionskompetenz der TpsA Proteine verloren ging (Guédin et al., 1998), woraus man
folgerte, dass die Translokation dieser Proteine möglicherweise gekoppelt über Innen- und
Außenmembran verläuft. Diese Koppelung wäre eine ideale Strategie der Bakterienzelle,
eine Aggregation sehr langer Proteine im Cytoplasma und im Periplasma zu verhindern
(Guédin et al., 1998). Sowohl bei den Autotransportern (Thanassi and Hultgren, 2000) als
auch bei den Tps Proteinen (Jacob-Dubuisson et al., 2001) nimmt man an, dass der
Transport über die Außenmembran ein energieunabhängiger Prozess ist.
A
OM
C-Domäne
B
C-Domäne
TpsB Protein
TpsB Protein
Prozessierte
C-Domäne
Periplasma
IM
Sec
C-Domäne
Passagierdomäne SP
Autotransporter
SP
Passagierdomäne
TpsA Protein
C-Domäne
Abb. 2.9 Übersicht über die
Typ V Sekretion und den TPS
Mechanismus
Sowohl Autotransporter (A) als auch
TpsA Proteine (B) werden als
Vorläuferproteine mit einer Nterminalen Signalsequenz, einer
Passagierdomäne und einer CDomäne
im
Cytoplasma
synthetisiert. Nach einem Secabhängigem Transport über die
Innenmembran
wird
die
Signalsequenz
abgespalten
(Nterminale
Prozessierung);
das
Periplasma passieren beide Proteine
in ungefaltetem Zustand und werden
dann unter Abspaltung der CDomäne
(C-terminale
Prozessierung)
über
die
Außenmembran transportiert. Die
Translokationspore
in
der
Außenmembran wird bei der Typ V
Sekretion durch die C-Domäne des
Autotransporters (A), beim TPS
Mechanismus durch ein zusätzliches
Protein gebildet (B).
Autotransporter und TpsA Proteine mit einer N-terminalen Extension
Einige wenige Autotransporter (Henderson et al., 1998) und TpsA Proteine (JacobDubuisson et al., 2001) besitzen eine stark konservierte N-terminale Extension, die der
klassischen Signalsequenz am N-terminalen Proteinende voraugeht. Diese beginnt mit
M1N(R/K), dicht gefolgt von einem Motiv (Y/F, X, I/L/V, X, Y/W) aus konservierten
aromatischen und hydrophoben Aminosäuren. Der N-Region der Signalsequenz direkt voran
25
Einleitung
geht ein Motiv aus acht Aminosäuren (I18AVSELAR), das in all diesen Sequenzen stark
konserviert ist (Henderson et al., 1998). Die N-Region der Signalsequenz selbst enthält eine
ungewöhnlich hohe Anzahl geladener Aminosäuren (Henderson et al., 1998). Die Funktion
dieser ungewöhnlich langen Signalsequenz ist bislang unbekannt. Einzelne Untersuchungen
zeigten, dass ihre Deletion weder die Sekretion des jeweiligen TpsA Proteins (LambertBuisine et al, 1998) noch, dass ihre Anwesenheit die Spaltung der Signalsequenz durch die
LepB-Signalpeptidase beeinflusste (Lambert-Buisine et al., 1998; Grass and St Geme,
2000). Ob solche Proteine mit einer N-terminalen Extension regelmäßig SecA-abhängig über
die Innenmembran transportiert werden oder ob weitere Faktoren wie z.B. SRP beteiligt
sind, ist bislang nur spärlich untersucht und Gegenstand dieser Arbeit. Gearbeitet wurde
hierzu mit dem TpsA Protein FHA und dem Autotransporter SepA, die in den folgenden
beiden Kapiteln vorgestellt werden sollen.
Signalpeptidase
A
1
N
25
N-terminale Extension
N-Region
H-Region
IcsA
MNQIHKFFCNMTQCSQGGAGELPTV
Hbp
MNRIYSLRYSAVARGFIAVSEFARK
HMW1
MNKIYRLKFSKRLNALVAVSELARG
EspP
MNKIYSLKYSHITGGLIAVSELSG
SepA
MNKIYYLKYCHITKSLIAVSELARR
FHA
MNTNLYRLVFSHVRGMLVPVSEHCT
C-Region
C
Abb. 2.10 A: Die N-terminale
Extension einiger TpsA-Proteine
bzw. Autotransporter
Der eigentlichen Signalsequenz
dieser besonderen Proteinklasse
geht eine stark konservierte Nterminale Extension voraus; die
Signalsequenz selbst besteht aus
einer positiven N-Region, einer
hydrophoben H-Region und einer
C-Region mit der Erkennungsstelle
für die Signalpeptidase.
Signalpeptidase
B
N
N-terminale Extension
N-Region
H-Region
C-Region
C
MNTNLYRLVFSHVRGMLVPVSEHCT
VGNTFCGRTRGQARSGARA
TSLSVAPNALAWALMLACTGLP
LVTHA
FHA
MNKIYYLKYCHITKSLIAVSELAR
RVTCKSHRRLSRRV
ILTSVAALSLSSAWP
ALS
SepA
MKK
TAIAIAVALAGFATV
AQA
OmpA
Abb. 2.10 B: Signalsequenzen der sekretorischen Proteine OmpA, FHA und SepA
Die positiv geladenen Aminosäuren der N-Region sind rot, die hydrophoben Aminosäuren der
H-Region grün markiert. Die der Spaltstelle unmittelbar vorausgehenden Aminosäuren mit
neutralen Resten innerhalb der C-Region sind blau hervorgehoben. Die Schnittstelle der
Signalpeptidase ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. Die Signalsequenzen von FHA und SepA
unterscheiden sich von der klassischen OmpA Signalsequenz durch eine besonders lange NRegion und durch eine N-terminale Extension, die der eigentlichen Signalsequenz voraus geht.
Einleitung
2.3
26
Filamentöses Hämagglutinin (FHA) aus Bordetella pertussis, ein TpsAProtein mit N-terminaler Extension
Bordetella pertussis
Der Keuchhustenerreger Bordetella pertussis ist ein höchst kontagiöses Pathogen, das strikt
auf den humanen Respirationstrakt beschränkt ist. Die Pathogenese des Keuchhustens ist
sehr komplex und involviert zahlreiche Virulenzfaktoren, die in Adhäsine und Toxine
eingeteilt werden können. Zu der Adhäsinfamilie gehören das Filamentöse Hämagglutinin
(FHA) (Locht et al., 1993), der Autotransporter Pertactin (Charles et al., 1989), der tracheale
Kolonisierungsfaktor (TCF) (Finn and Stevens, 1995), das Serum-Resistenz Protein BrkA
(Fernandez and Weiss, 1994) und Fimbrien (Willems et al., 1993). Zu den Toxinen gehören
das Pertussis Toxin (PTX) (Locht and Keith, 1986), das Adenylat-Cyclase Toxin (AC)
(Hewlett et al., 1976), das Dermonekrotische Toxin (DNT) (Pullinger et al., 1996) und das
Tracheale Cytotoxin (TCT) (Cookson et al., 1989).
Die Pathogenese verläuft in drei Stadien: Adhäsion, Etablierung und Gewebeschädigung.
Das Bakterium haftet und vermehrt sich zunächst an den Zilien des Respirationstraktes
(Kolonisation), ohne weiter in die Zellen einzudringen. Zur effizienten Adhäsion werden
FHA, Fimbrien, PTX und Pertactin benötigt (Weiss and Hewlett, 1986). An der Etablierung
des Erregers sind durch Ausschalten der Resistenzmechanismen das Adenylat-ZyklaseToxin (Phagozytosehemmung) und das tracheale Zytotoxin (Ziliostase) beteiligt.
Hauptsächlicher Schädigungsfaktor des Gewebes ist das Pertussis Toxin, das ebenfalls für
die systemische Reaktion des menschlichen Körpers verantwortlich ist. Dieses bewirkt durch
eine ADP-Ribosylierung von G-Proteinen einen Anstieg cAMP und beeinflusst in der
Wirtszelle die Signaltransduktion.
Die Synthese der meisten Virulenzfaktoren wird durch das Bordetella Virluenz Gen (bvg)
positiv reguliert, das auch auf Änderungen der Umgebungsbedingungen reagiert (Arico et
al., 1991; Lacey et al., 1960)
Filamentöses Hämagglutinin (FHA)
FHA ist das Hauptadhäsin in B. pertussis, das trotz seiner enormen Größe in grossen
Mengen synthetisiert und sezerniert wird (Locht et al., 1993). Es spielt eine wichtige Rolle
bei der Adhäsion des Pathogens im oberen Respirationstrakt, übt dabei jedoch keine toxische
Aktivität aus (Tuomanen and Weiss, 1985; Relman et al., 1989; Kimura et al., 1990). Von
FHA sind drei Bindeaktivitäten bekannt, die diese zelluläre Anheftung vermitteln. Über ein
RGD Motiv bindet FHA an Integrine pulmonaler Makrophagen (Relman et al., 1990) und
27
Einleitung
mittles einer Lektin-artigen Bindestelle an das respiratorische Epithel (Tuomanen et al.,
1988). Auch sulfatierte Saccharide wie Heparin werden durch FHA spezifisch gebunden
(Menozzi et al., 1991), ebenso sulfatierte Glycopeptide (Brennan et al., 1991). Diese Lipide
sind in großer Zahl in der menschlichen Lunge und Trachea zu finden. (Krivan et al., 1989).
Da FHA zu den Hauptantigenen von Bordetella pertussis gehört, wurde es zur Herstellung
azellulärer Impfstoffe gegen den Keuchhusten verwendet (Sato et al., 1994).
FHA ist ein TpsA Protein, das mit Hilfe des TpsB Proteins FhaC transportiert wird (JacobDubuisson et al., 1999; Guédin et al., 1998). Bei FHA handelt es sich um das ca. 220 kDa
große, sezernierte Protein, das aus dem 367 kDa großen Vorläuferprotein FhaB
(Domenighini et al., 1990; Renauld-Mongénie et al., 1996) nach N- und C-terminaler
Prozessierung hervorgeht (Arico et al., 1993; Domenighini et al., 1990; Jacob-Dubuisson et
al., 1996). Der Vorläufer FhaB besitzt die typische Struktur eines TpsA Proteins: eine
Signalsequenz, der eine N-terminale Extension vorausgeht, eine Passagier- und eine CDomäne (Abb. 6.1).
Am N-terminalen Proteinende befindet sich eine klassische Signalsequenz mit einer positiv
geladenen
Region
(Aminosäuren
33-43),
einem
langen,
hydrophoben
Segment
(Aminosäuren 44-65) und einer Erkennungsstelle der Lep-Signalpeptidase hinter der
Aminosäure 71 (von Heijne, 1986; Delisse-Gathoye et al., 1990) (Abb. 2.10). Der
Signalsequenz geht eine 24 Aminosäuren lange N-terminale Extension voraus, die für die
Sekretion und Synthese von FHA in vivo keine Bedeutung zu haben scheint (LambertBuisine et al., 1998). Die N-terminale Extension von FHA unterscheidet sich allerdings von
anderen N-terminalen Extensionen insofern, als dass die drei letzten konservierten
Aminosäuren (Leu-Ala-Arg) fehlen und die dritte Aminosäure der N-terminalen Extension,
die in allen Proteinen basisch ist, allein in FHA durch ein neutrales Aminosäurepaar ersetzt
ist (Abb. 2.10). Beim Transport über die Innenmembran werden Signalsequenz und Nterminale Extension gemeinsam entfernt (N-terminale Prozessierung) (Jacob-Dubuisson et
al., 1996). Nach der N-terminalen Prozessierung wird durch einen noch unbekannten
Mechanismus die Aminosäure Gluatmin auf Position 72 in Pyroglutamat umgewandelt;
diese Modifizierung hat auf die Bindeeigenschaften von FHA keinen Einfluss, erhöht aber
möglicherweise die Stabilität von FHA im Respirationstrakt und die Resistenz des Proteins
gegenüber Aminopeptidasen (Lambert-Buisine et al., 1998). Auch FHA wird in
ungefaltetem Zustand durch das Periplasma transportiert; man nimmt an, dass
Proteintranslokation über die Innen- und Außenmembran gekoppelt verlaufen (Guédin et al.,
1998). Beim Transport durch das Periplasma wird die Passagierdomäne durch die C-Domäne
maskiert; die C-Domäne übernimmt somit die Funktion eines intramolekularen Chaperons,
Einleitung
28
indem sie Interaktionen der Passagier-Domäne mit anderen Strukturen oder deren
Ausbildung einer Tertiärstruktur verhindert (Renauld-Mongénie et al., 1996). Sobald die
Aussenmembran erreicht ist, wird die C-Domäne abgespalten und verdaut (C-terminale
Prozessierung)
(Renauld-Mongénie
et
al.,
1996);
unterdessen
interagiert
die
Passagierdomäne über ein Modul aus ca. 100 konservierten Aminosäuren an seinem Nterminalen Ende mit FhaC (Locht et al., 1993; Renauld-Mongénie et al., 1996), bildet
spontan eine Haarnadelstruktur aus und wird über die äußere Membran transportiert
(Makhov et al., 1994; Renauld-Mongénie et al., 1996). Als Adhäsin bleibt FHA nach seinem
Transport in der Außenhülle von B. pertussis verankert (Domenighini et al., 1990)
2.4
Shigella extrazelluläres Protein (SepA) aus Shigella flexneri, ein
Autotransporter mit N-terminaler Extension
Shigella flexneri
Shigella flexneri ist der Erreger der bakteriellen Ruhr, die sich in Form von schleimigen und
blutigen Durchfällen, begleitet von Schmerzen und Fieber, äußert. Die Shigellen dringen
dabei in die Kolonmukosa ein, was zur Degeneration des Epithels und einer starken
Entzündungsreaktion führt (LaBrec et al., 1964). Hierzu produziert das Bakterium ungefähr
neun Polypeptide, von denen IpaA-D (Andrews et al., 1991; Allaoui et al., 1992b; Ménard
et al., 1993; 1994 a, b) und IcsA (Goldberg et al., 1993) am besten untersucht sind. Die
Gene, die für Zellinvasion und Dissemination benötigt werden, befinden sich auf einem 200
kB Virulenzplasmid (Sansonetti et al., 1982).
Nach Erreichung hoher Keimzahlen im Dünndarm gelangen die Shigellen über die M-Zellen
des Kolons in die Darmwand (Wassef et al., 1989; Sansonetti et al., 1991). Über den Prozess
der induzierten Phagozytose, an dem v.a. die Proteine IpaB und IpaC beteiligt sind, erhalten
sie Eintritt in die Wirtszelle (LaBrec et al., 1964; Clerc and Sansonetti, 1987). Kurz nach
dem Eindringen lysiert Shigella flexneri die phagozytotische Vakuole (Sansonetti et al.,
1986; High et al., 1992) und entlässt sich damit in das Wirtscytosol, innerhalb dessen es sich
dadurch fortbewegen kann, dass es an seinem Pol kontinuierlich Aktinfilamente assembliert
(Bernardini et al., 1989; Makino et al., 1986; Bernardini et al., 1989; Kadurugamuwa et al.,
1991). Diese Aktivität, an der hauptsächlich das Protein IcsA beteiligt ist, ermöglicht nicht
nur die Bewegung innerhalb der Wirtszelle, sondern auch die Infektion benachbarter Zellen
(Bernardini et al., 1989; Goldberg and Theriot, 1995; Kocks et al., 1995). Die befallenen
Zellen werden schließlich zerstört; es kommt zu einer Entzündungsreaktion, die sich bis in
die Submukosa und Muskularis des Kolons erstrecken kann.
29
Einleitung
Shigella extrazelluläres Protein (SepA)
SepA, ist das Hauptsekretprotein von Shigella flexneri und wird ebenfalls durch das
Virulenzplasmid kodiert (Benjelloun-Touimi et al., 1995). Die Lokalisation von SepA auf
dem Virulenzplasmid lässt vermuten, dass es an der Shigella Pathogenizität beteiligt ist.
Herstellung und phänotypische Charakterisierung einer SepA Mutante deuten darauf hin,
dass SepA eine Rolle bei der Invasion in das Epithel und bei dessen anschließender
Zerstörung spielt. Eine SepA Mutante, die bezüglich ihrer Invasion und Disseminierung in
Kultur-Epithelzellen nicht beeinträchtigt war, zeigte außerdem abgeschwächte Virulenz an
einem Ileummodell des Hasen (Benjelloun-Touimi et al., 1995).
SepA ist ein Autotransporter, der als 146 kDa Vorläuferprotein mit einer N-terminalen
Extension und einer Signalsequenz, die zusammen 56 Aminosäuren lang sind, einer
Passagier- und C-terminalen C-Domäne synthestisiert wird (Abb. 6.1). Nach N- und Cterminaler Prozessierung wird SepA als ca. 110 kDa großes Protein ins extrazelluläre
Medium sezerniert (Benjelloun-Touimi et al., 1995). Hydrolyseexperimente mit Proteinase
K zeigten, dass die Passagierdomäne von SepA aus einer N- und einer C-terminalen Hälfte
zu je 450 Aminosäuren besteht, die über eine Linkerregion miteinander verbunden sind
(Benjelloun-Touimi et al., 1995).
SepA gehört zu einer Proteinfamilie, der ebenfalls IgA1 aus N. gonorrhoe (Pohlner et al.,
1987) und Haemophilus influenzae (Poulsen et al., 1998), Hap aus H. influenzae (St Geme et
al., 1994), Tsh aus E. coli (Stein et al., 1996) und EspP aus E. coli (Brunder et al., 1997)
angehören. Diesen Proteinen sind folgende Merkmale gemeinsam: ihre extrazelluläre
Lokalisation, ihr Transport mittels des Typ V Sekretionsmechanismus, eine ungefähre Größe
des reifen Proteins von etwa 110 kDa, starke Sequenzhomologie innerhalb der ersten 500
Aminosäuren und ein konserviertes Motiv, GDSGSP, innerhalb dieser homologen ersten 500
Aminosäuren, das als Teil der aktiven Region verschiedener Serinproteasen beschrieben
wurde (Bachovchin et al., 1990). Man geht davon aus, dass alle diese Proteine aus zwei
Domänen zu je ca. 500 Aminosäuren bestehen und, dass sie mit proteolytischer Aktivität
ausgestattet sind, die in der N-terminalen Domäne lokalisiert ist. Die proteolytische Aktivität
von SepA wurde unter Verwendung einer großen Anzahl synthetischer Peptide bestätigt und
konnte durch PMSF gehemmt werden (Benjelloun-Touimi et al., 1998). Trotz seiner starken
Homologie zu IgA Proteasen von N. gonorrhoeae und H. influenzae (Pohlner et al., 1987;
Poulsen et al., 1989), die mit höchster Spezifität eine Peptidbrücke in der Verbindungsregion
von humanem IgA spalten (Plaut, 1983), konnte SepA eben diese IgA1 Moleküle nicht
spalten. Daher nimmt man an, dass die Proteaseaktivität von SepA auf ganz spezifische,
bislang unbekannte Substrate beschränkt ist (Benjelloun-Touimi et al., 1995).
Fragestellung und Zielsetzung
3.
30
Fragestellung und Zielsetzung
In E. coli sind für die Zielsteuerung von Proteinen an die Innenmembran und ihren
anschließenden Transport unterschiedliche Transportwege beschrieben: Sekretorische
Proteine wie OmpA werden post-translational durch SecB erkannt und nachfolgend in einer
SecA-abhängigen Reaktion durch die Membran transloziert. Bei Innenmembranproteinen
wie MtlA vermittelt SRP das co-translationale Targeting und die anschließende Integration
in die Membran.
Innenmembranproteine wie Momp2, die zusätzlich über große periplasmatische Domänen
verfügen, benötigen sowohl SRP als auch SecA. SRP ist bei diesen Proteinen für die cotranslationale Zielsteuerung und Integration der Signal-Anker-Sequenz verantwortlich,
während SecA die Translokation der periplasmatischen Domänen bewirkt.
Bei dem TpsA Protein FHA aus Bordetella pertussis sowie dem Autotransporter SepA aus
Shigella flexneri handelt es sich um sekretorische Proteine mit einer abspaltbaren
Signalsequenz, was eigentlich eine SecA Abhängigkeit des Transportes verlangt. Beide
Proteine gehören jedoch zu einer Proteinklasse, die sich durch einige Besonderheiten
auszeichnet: eine moderat hydrophobe Signalsequenz mit einer stark positiv geladenen NRegion, der zusätzlich eine N-terminale Extension vorausgeht, sowie eine enorme
Proteingröße.
Aufgrund ihrer enormen Proteingröße neigen FHA und SepA leicht zur Aggregation im
Cytoplasma. Eine Aggregation von FHA oder SepA macht deren Translokation über die
Innenmembran
unmöglich
und
führt
zu
einer
cytotoxischen
Akkumulation
der
Vorläuferproteine. Ein schnelles, co-translationales Membrantargeting durch SRP mit
nachfolgender Translokation durch SecA, wie für Momp2 beschrieben, bedingt theoretisch
einen Membrankontakt, noch bevor die Translation abgeschlossen ist. Es wäre denkbar, dass
durch einen solchen Transportmechanismus eine Aggregation und Akkumulation von FHA
und SepA im Cytoplasma verhindert werden könnte.
Vorausgegangene Untersuchungen hatten gezeigt, dass die Wahrscheinlichkeit und Effizienz
einer Ffh-Bindung umso stärker ansteigt, je hydrophober die Signalsequenz ist (Valent et al.,
1995; Valent et al., 1997); außerdem wurde kürzlich postuliert, dass neben der
Hydrophobizität als Hauptkriterium für eine SRP Bindung, eine stark positiv geladene NRegion der Signalsequenz die SRP Bindung bestimmter Substrate positiv beeinflussen kann.
Das betrifft solche Substrate, deren Hydrophobizität gerade unterhalb der zur SRP Bindung
nötigen Schwellenhydrophobizität liegt (Peterson et al., 2003). Wie die von Peterson et al.
31
Fragestellung und Zielsetzung
untersuchte Signalsequenz des Autotransporters EspP, erfüllen auch jene von FHA und
SepA, die zur gleichen Proteinklasse wie EspP gehören, diese Kriterien.
Während über die SecA Abhängigkeit der Translokation von Proteinen dieser Klasse
Einigkeit besteht, wird ein SRP abhängiges Innenmembrantargeting in der Literatur bislang
widersprüchlich diskutiert (Grass and St Geme, 2000; Brandon et al., 2003; Sjibrandi et al.,
2003). Sjibrandi et al. postulierte darüber hinaus, dass das SRP abhängige Membrantargeting
des Autotransportes Hbp wahrscheinlich auf der Anwesenheit der N-terminalen Extension
basiert und, dass unter SRP depletierten Bedingungen die Membranbindung teilweise von
SecB übernommen werden kann.
Ziel dieser Arbeit war es zu klären, wie sich Proteine wie FHA und SepA bei in vitroStudien bezüglich der Zielsteuerung und des Transports verhalten. Die Frage, ob FHA und
SepA den post-translationalen, SecA-abhängigen Weg oder den co-translationalen, SRP
abhängigen Weg einschlagen oder, ob SecA und SRP beim Transport von FHA bzw. SepA
miteinander kooperieren und welche Rolle SecB hierbei spielt, sollte durch verschiedene
experimentelle Ansätze untersucht werden.
Zusätzlich beschäftigte sich diese Arbeit mit der Frage, welche Funktion die N-terminale
Extension bei der Zielsteuerung und dem Transport von FHA besitzt; hierzu wurde in in
vitro Studien zusätzlich der Sekretionsmechanismus des Proteins FHA∆ext untersucht, dem
die ersten 24 Aminosäuren und somit die N-terminale Extension entfernt worden waren.
Dazu
wurden
FHA,
FHA∆ext
und
SepA
in
einem
zellfreien
Transkriptions-
Translationssystem aus E. coli synthetisiert. Als Kontrollproteine dienten das SecA- und
SecB-abhängige, sekretorische Protein outer membrane protein A (OmpA) sowie das SRPabhängige, polytope Innenmembranprotein Mannitpermease (MtlA).
Im Anschluß an die Synthese in einem Transkriptions-Translationssystem aus E. coli sollte
die Interaktion von FHA, FHA∆ext und SepA mit unterschiedlichen Targeting- und
Transportfaktoren untersucht und die Bedingungen für eine erfolgreiche Translokation in
Innenmembranvesikel
eruiert
werden.
Diesen
Zwecken
dienten
Quervernetzungsexperimente, die den Nachweis von Interaktionen zwischen einzelnen
Proteinen ermöglichen, Flotationsexperimente zur Bestimmung einer Proteinassoziation mit
Membranen und schließlich Protease-Resistenz-Tests, die über eine erfolgreiche
Translokation bzw. Integration eines Proteins Aufschluss geben.
Material
32
4.
Material
4.1
Geräte und Materialien
Abimed Gilson:
Agfa:
Amersham:
Bachhofer:
Beckman:
Bender & Holbein:
Biorad:
Eppendorf:
Fuji:
Heidolph:
Heraeus:
Herolab:
Hettich:
Hoefer:
Knick:
Kontes Glass
Kontron/Hermle:
BRL Life Technologies:
Mettler:
Millipore:
Molecular Dynamics:
Nycomed Pharma
Pharmacia:
Qiagen:
Roth:
Schleicher und Schüll:
SCM Aminico:
Sorvall:
Peristaltikpumpe Minipuls 2, Pipetten
Entwicklermaschine für Röntgenfilme Curix 60
Enhanced Chemiluminescence ECL Westernblotting System
UV Transilluminator 312 nm
Ultrazentrifuge TL-100, Rotor TLA 100.2
Ausschwingrotor SW28, Rotor 50.2 Ti
Vortexer
Geltrockner 583
Western-Transfer-Apparatur: Trans-Blot Cell
Thermomixer „5436“, Zentrifuge 5415c
Medical X-Ray Film
Heizplatte und Rührer
„Biofuge pico“ Tischzentrifuge, Inkubator Typ B 6030;
Sterilbank; Lyophilisator LYOVAC GT2
Geldokumentation Easy Lab
Universal 16R Kühlzentrifuge
Mini Horizontal Submarine Unit: Typ HE 33
Gelelektrophoresekammer, Gradientenmischer
pH-Meter 766 Calimatic
Dounce Homogenisator
Kühlzentrifuge Centrikon H-401 bzw. ZK401
Rotor A8.24, Rotor A6.9, Rotor A6.14
Agarosegelelektrophorese-Kammer Horizon 11-14
Feinwaage AE 100, Feinwaage Toledo PB 1502
Filterpapier Type GS 0.22µm
Modell: Storm 840, Modell: 425 E
Phosphorimager mit Screens, Software Image Quant
Gradient Master Biocomp
Photometer Ultraspec 3000, pH-Meter 766 Calimatic,
Elektrophoresis Powersupply-Netzgerät EPS 500/400
bzw. ECPS 3000/150
FPLC-Anlage (mit Fraktionssammler LKB Redifrac, Pumpe
LKB Pump P-500, Kontrollgerät LKB Controller LCC-500
Plus, Ventil LKB Motor Valve MV-7, Monitor Single Path
Monitor UV-1, Schreibgerät LKB REC-2)
Plasmid Maxi Kit, Plasmid Midi Kit, Polyporphyrene
Columns (1m)
Spitzenfilter (steril) 0,2 µm; Dialyseschlauch; Parafilm
Whatman 3MM Filterpapier
Nitrozellulosemembran
French Pressure Cell
Discovery 90 Ultraspeed Centrifuge
Rotor Ti 50.2, Rotor TST 41-14
33
Vacuubrand:
Institutswerkstatt:
4.2
Boehringer Mannheim:
Baker:
BRL Life Technologies:
Epicentre:
ICN:
New England Biolabs:
MBI Fermentas:
Merck:
Pharmacia:
Promega:
Pierce:
Quiagen:
Roche:
Serva:
Sigma:
Membran-Vakuumpumpen (für Absaugen, Filtern,
Speed-Vac, Geltrockner); Dreischieber-Vakuumpumpe
RD15 für Lyophilisator
SDS-PAGE-Apparatur
Feinchemikalien
Amersham:
Roth:
Material
35
S-Methionin / 35S-Cystein labeling mix
„Enhanced Chemiluminescence ECL Westernblotting
System“
tRNA aus Hefe
Polyethylenglykol 6000
1 kb DNA-Standard-ladder
LMW, Low Molecular Weight Marker
HMW, High Molecular Weight Marker
RNaseH aus E. coli
Saccharose (ultra rein)
Restriktionsenzyme,T4-DNA-Polymerase, 10X-Puffer
T4-DNA-Ligase
Protein Molecular Weight Marker #SM 0431
APS, Bromphenolblau
Protein-A-Sepharose
RNasin RNase-Inhibitor, T7-RNA-Polymerase
DSS
Ni+-NTA
Ampicillin, Alkalische Phosphatase, Chloramphenicol, dATP,
dCTP, dGTP, dUTP, Kanamycin, Kreatinphosphat,
Kreatinphosphatkinase, PMSF, Proteinase K, Pyruvat Kinase;
RNaseH, Tetracyclin
Aceton, 30% Acrylamid/0,8% Bisacrylamid
(Rotiphoresegel30), 48% Acrylamid/1,5% Bisacrylamid (p.a.
4x krist.), Brilliant Blau R 250, BSA, Bacto-Agar für
Agarplatten, DTT, EDTA, Essigsäure, Ethanol,
Ethidiumbromid, Glukose, Glycerin, Glycin, Harnstoff, HCl,
Hefeextrakt, Hepes, Isobutanol, Isopropanol, Kaliumacetat,
KCl, KH2PO4, K2HPO4, KOH, Magnesiumacetat, MgCl2,
Mg(SO4)2, Milchpulver, NaCl, Na2HPO4, NaH2PO4, NaOH,
Pepton aus Casein, Phenol pH 8.0, PMSF, Ponceau S,
Saccharose, SDS, TCA, Tris Base, Triton X100
Agarose für DNA-Elektrophorese
18L-Aminosäuren (ohne Methionin und Cystein), βMercaptoethanol, DMF, DMSO pure, MBS, PEP, Puromycin,
Putrescin, SDS, 7B Sigma prestained Molecular Weight
Marker, Spermidin, TEMED, Triethanolamin, Tween 20;
Xylencyanol, Sepharose CL-2B
Material
4.3
34
Antibiotika
Antibiotikum
VerdünnungsFaktor
1 : 2000
Finalkonzentration
25 µg/ml
gelöst in
Ampicillin (Amp)
Konzentration
der Stammlösung
50 mg/ml
Kanamycin (Kan)
50 mg/ml
1 : 2000
25 µg/ml
H2O
Tetracyclin (Tet)
5 mg/ml
1 : 500
10 µg/ml
70% Ethanol
Chloramphenicol
(Cm)
35 mg/ml
1 : 1000
35 µg/ml
Ethanol
H2O
Alle Antibiotika-Stammlösungen wurden sterilfiltriert (Filter: 0.2 µm Porengröße) und bei
–20°C gelagert.
4.4
Plasmide
Plasmid
Resistenz
Beschreibung
Referenz/Herkunft
pDMB
Amp
OmpA unter T7-Promotor-
Behrmann et al.,
Kontrolle in pGEM-3Z
1998
MtlA unter T7-Promotor-
Beck et al., 2000
p717MtlA-B
Amp
Kontrolle in pKSM 717
pKSM 717
Amp
Expressionsvektor für T7-
Maneewannakul et
abhängige in vivo/in vitro
al., 1994
Expression
pCB7
Amp
FhaB* unter T7-PromotorKontrolle in pET22b;
Lambert-Buisine et
al., 1998
Schnittstellen Nde I und Sal I
pFJD 112
Kan
FhaB∆ext* unter T7-
F. Jacob-Dubisson
Promotor-Kontrolle in
pET24d; Schnittstellen Nco I
und Sal I
pFJD 116
Amp
pSepA* unter T7-PromotorKontrolle in pET22b;
Schnittstellen Nde I und Nco I
F. Jacob-Dubisson,
35
4.5
Material
Escherichia coli-Stämme
Stamm
Beschreibung
AD179
MC4100∆ompT
Resistenz
Verwendung
Referenz
Wildtyp-INV
Akiyama u. Ito,
1990
BL21 (DE3)
F ompT hsdSB(rBmB)
pLysS
gal dcm (DE3)
CM124
secE∆19-111, pCM22
Cm
Translationsextrakte [Novagen]
Cm, Amp
SecE-Depletions-
Traxler u.
INV
Murphy,
1996
CU164
Tet
secY39
secY39-INV
Baba et al.,
1990
DH5α
supE44 ∆lacU169
Transformation
Sambrook et
(Φ80lacZ∆M15)
und Klonierung
al., 1989
Expressionsstamm
[Novagen]
hsdR17 recA1 endA1
gyrA96 thi-1 relA1
Tuner (DE3)
F- ompT hsdSB(rB-mB-)
pLysS
gal dcm lacY1, (DE3)
für
pLysS (CmR)
Proteinaufreinigung
KN553
MRE600
Cm
∆uncB-C::Tn10
Tet,
SecG-Deletions-
Nishiyama et
∆secG::kan
Kan
INV
al., 1996
RNase negativ
Translationsextrakte Cammack u.
Wade, 1965
MC4100
araD139 ∆(argF-lac)
Translationsextrakte Silhavy et al.,
1984
U169 rpsL150 relA1
flB5301 deoC1 ptsF25
rbsR
MC4100∆tig
Wie MC4100, tig::kan
Kan
Translationsextrakte Deuerling
et
al., 1999
SL119
BL 21 recD F - hsdS
gal OmpT
TY1
Tet
Translationsextrakte Lesley et al.,
-
ompT::kan, secY205
1991
Kan,
Tet
secY205-INV
Matsumoto et
al., 1997
Methoden
36
5.
Methoden
5.1
Molekularbiologische Methoden
5.1.1 Anzucht von Escherichia coli
Zur Plasmidisolierung und zur Stammhaltung wurden E. coli-Zellen in flüssiger Kultur in
250 ml LB-Medium (10 g Pepton, 10 g NaCl und 5 g Hefeextrakt auf 1 l Wasser) bei 37°C
über Nacht im Schüttler unter aeroben Bedingungen angezogen. Bei Anzucht
antibiotikaresistenter E. coli-Stämme wurde das Medium durch die entsprechenden
Antibiotika ergänzt.
Verdünnungsausstriche
zur
Isolierung
von
Einzelkolonien
und
die
Kultur
von
transformierten Zellen erfolgte auf 1.5% Agar-LB-Platten (10 g Pepton, 10 g NaCl und 5 g
Hefeextrakt sowie 15 g Agar auf 1 l Wasser) bei 37°C über Nacht im Brutschrank. Auch
hier wurden entsprechende Antibiotika zur Selektion zugesetzt.
Zur Herstellung einer LB-Glycerin-Dauerkultur wurden 500µl einer frischen LBTageskultur mit 500µl LB-Glycerin 30%-Medium versetzt und bei -70°C eingefroren.
5.1.2 DNA-Isolierung
Hierfür wurden die Zellen wie unter 5.1.1 beschrieben in 250 ml LB-Medium über Nacht bei
37°C im Schüttler angezogen.
Die Zellen, der über Nacht gewachsenen Kulturen, wurden im A6.14 Rotor der Centrikon
Kühlzentrifuge 15 min. bei 6 000 Upm und 4°C pelletiert. Zur DNA-Isolierung wurde das
Qiagen Maxiprep Kit verwendet. Hier basierte die Isolierungsmethode auf dem Prinzip der
alkalischen Lyse. Das luftgetrocknete DNA-Pellet wurde in 1 ml TE-Puffer resuspendiert
und die DNA durch Zugabe von 100 µl Neutralisationspuffer P3 (3 M Kaliumacetat pH 5.5)
und ca. 900 µl Isopropanol 15 min. bei –80°C gefällt.
Anschließend wurde die DNA durch 20-minütige Zentrifugation bei 14 000 Upm und 4°C in
der Kühlzentrifuge Universal 16R sedimentiert und nach einmaligem Waschen mit
70% Ethanol in 100 µl TE-Puffer resuspendiert.
37
TE-Puffer:
Methoden
10 mM
Tris/HCL pH 8.0
1 mM
EDTA pH 8.0
Zur Kontrolle wurde die isolierte Plasmid-DNA mit zwei bis drei plasmidspezifischen
Restriktionsenzymen
verdaut
und
die
erwartete
Größe
der
Fragmente
in
der
Agarosegelelektrophorese verifiziert. Die DNA-Konzentration wurde über Messung der
Absorption bei 260 nm bestimmt (zur Messung wurde die DNA 1:500 mit H2O verdünnt;
eine A260 von 1 entspricht 50 µg/ml. DNA Maxipreps wurden bei –20°C gelagert.
5.1.3 Transformation kompetenter Escherichia coli-Zellen
Der gewünschte E. coli-Stamm wurde über Nacht in einer 3 ml LB-Kultur angezogen. Aus
dieser Kultur wurden 15 µl in 1.5 ml LB-Kultur 1:100 verdünnt und bei 37°C im Schüttler
bis zu einer OD600nm von 0.3 inkubiert. Dadurch sollte sichergestellt werden, dass sich die
Zellen in der, für die Transformation benötigten, exponentiellen Phase befanden.
Anschließend wurden diese Zellkulturen 5 min. bei 13 000 Upm in der Tischzentrifuge
zentrifugiert. Nachdem der Überstand abgenommen worden war, wurden die Zellpellets in
150 µl TSB resuspendiert und für 10 min. auf Eis inkubiert.
TSB-Puffer:
10%
Polyethylenglykol 6000
5%
DMSO
10 mM
Magnesiumchlorid
10 mM
Magnesiumsulfat
in LB-Medium lösen und sterilfiltrieren.
Den nun kompetenten Zellen wurden 0.5-1 µl der gewünschten DNA hinzugefügt und die
Proben für weitere 30 min. auf Eis inkubiert. Der sich daran anschließenden Zugabe von 900
µl TSB-Puffer und 10 µl 25%-iger Glukoselösung folgte eine 60-minütige Inkubation im
Eppendorf Thermoschüttler bei 37°C. Danach wurden die Zellen erneut 5 min. bei 13 000
Upm zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Zellen in einem kleinen Rest des
Überstands resuspendiert. Nun konnten die Zellen auf LB-Agarplatten ausgestrichen und
über Nacht bei 37°C inkubiert werden.
Methoden
38
5.1.4 DNA-Restriktionsenzymverdau und Agarosegelelektrophorese
Restriktionsverdau:
Der Verdau der Plasmid-DNA fand nach unten aufgeführtem Schema mit einem oder
mehreren Restriktionsenzymen statt, die auf dem entsprechenden Plasmid eine oder mehrere
Schnittstellen besaßen. Die Inkubation erfolgte über einen Zeitraum von 60 Minuten bei
37°C.
1 µl
DNA (1-2 µg/µl)
je 1 µl
Restriktionsenzym (10u/µl)
2 µl
10x Puffer (New England Biolabs)
ad 20 µl
H2O
Nach Zugabe von 2 µl 10x DNA-Ladepuffer wurden die Proben in einem 0.8%-igen
Agarosegel, welches zuvor in eine spezielle Flachbettapparatur eingegossen wurde, bei
max. 100 mA aufgetrennt. Als Laufpuffer wurde 1x TAE-Puffer verwendet.
Die DNA-Banden konnten im Gel mittels UV-Licht sichtbar gemacht, anhand eines
ebenfalls mitgelaufenen DNA-Markersystems in ihrer Größe identifiziert und mit einem
EDV-gestützten Fotosystem dokumentiert werden.
Herstellung des 0.8%-igen Agarosegels:
0.64 g Agarose wurden zu 80 ml einer 1x TAE-Lösung hinzugegeben und anschließend in
der Mikrowelle gelöst. In dieses Gemisch wurden dann 10 µl Ethidiumbromid (10 mg/ml)
pipettiert und vor dem Erkalten in die Flachbettapparatur der Elektrophoresekammer
eingegossen. Der Lauf erfolgte bei max. 100mA mit 1x TAE Laufpuffer. Die DNA Banden
konnten im Gel mittels UV-Licht sichtbar gemacht werden.
10x DNA-Ladepuffer: 50%
50x TAE-Puffer:
Glycerin
0.05%
Bromphenolblau
0.05%
Xylencyanol
242 g
Tris Base
57 ml
Essigsäure
100 ml
0.5 M EDTA pH 8.0
ad 1l
H2O
39
Methoden
5.1.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht erfolgte durch denaturierende
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese in einem Tris/Glycin-Puffersystem (Laemmli, 1970).
Je nach Molekulargewicht der aufzutrennenden Proteine bzw. je nach gewünschter
Trennleistung wurden Gele mit unterschiedlichen Polyacrylamidkonzentrationen von 13%,
15% und 17% verwendet.
Die Trenngellösungen wurden dabei zwischen zwei Glasplatten gegossen, die zuvor mittels
Abstandhaltern (Spacern) voneinander getrennt und durch Einspritzen von Sealing-Gel
(30% Acrylamid/0.8% Bisacrylamid, TEMED, H2O) abgedichtet wurden.
Die Mengenangaben entsprechen einem großen Gel mit ca. 65 -70 ml Volumen.
13%-iges Trenngel:
30 ml
30% Acrylamid, 0.8% Bisacrylamid
14 ml
2 M Tris/HCL pH 8.8
280 µl
25% SDS
ad 70 ml
H2O
Unmittelbar vor dem Eingießen zwischen die Glasplatten wurden als Starter der
Vernetzungsreaktion hinzugegeben:
28 µl
TEMED
400 µl
10% Ammoniumperoxodisulfat
15%-iges Trenngel:
35 ml
30% Acrylamid, 0.8% Bisacrylamid
17%-iges Trenngel:
39,5 ml
30% Acrylamid, 0.8% Bisacrylamid
Alle weiteren Volumenangaben entsprechen dem 13%-igen Trenngel.
Für die gleichzeitige Auftrennung von Proteinen mit großem Molekulargewicht und von
kurzen Peptidketten mit kleinem Molekulargewicht wurden 7–17%-ige Gradientengele
verwendet. Sie ermöglichten beispielsweise die Trennung von naszierenden Ketten und ihren
Quervernetzungsprodukten bei gleichbleibender Trennschärfe.
Dabei wurden 30 ml einer 7%-igen Acrylamidlösung und 30 ml einer 17%-igen
Acrylamidlösung mittels eines Gradientenmischers gemischt und durch Überschichtung in
die Gelapparatur gegossen. Zur Stabilisierung des Gradienten enthielt die schwere 17%-ige
Lösung 0.4 M Saccharose. Um ein vorzeitiges Auspolymerisieren im Gradientenmischer zu
Methoden
40
vermeiden, wurden die Konzentrationen an TEMED und APS im Vergleich zu den konstant
%-igen Gelen vermindert.
7-17%-iges Gradiententrenngel:
7%ige Lösung:
7 ml
17%ige Lösung:
30% Acrylamid, 0.8% Bisacrylamid
6 ml
17 ml
2M Tris-HCl, pH 8,8
6 ml
20µl
25% SDS
-
2,5 M Saccharose
7 ml
H2O
-
ad 30 ml
120 µl
Unmittelbar vor dem Starten des Gradientenmischers wurden zugegeben:
10 µl
TEMED
10 µl
100 µl
10% APS
100 µl
Nach der Auspolymerisation des Trenngels wurde das übergeschichtete Isobutanol
abgegossen und der über dem Trenngel liegende Raum zwischen den Glasplatten gründlich
mit Wasser gespült. Dort wurde dann das Sammelgel eingegossen und sofort ein passender
Kamm für die Bildung der Probetaschen eingeschoben.
Sammelgel:
3.35 ml
30% Acrylamid, 0.8% Bisacrylamid
2.4 ml
0.5 M Tris/HCl pH 6.8
3.75 ml
2.5 M Saccharose
80 µl
25% SDS
ad 20 ml
H2O
unmittelbar vor dem Gießen wurden zugegeben:
8 µl
TEMED
50 µl
10% APS
41
Methoden
Vorbereitung der Proteinproben:
SDS-PAGE-Ladepuffer:
Lösung 1 :
Lösung 2:
0.2 M
Tris Base
0.02 M
EDTA, pH 7.5
8.3%
SDS
83.3 mM
Tris Base
29.2%
Glycerin
0.03%
Bromphenolblau
jeweils frisch hergestellt bzw. in Aliquots bei –20°C gelagert.
Zusammensetzung:
0.5 ml
Lösung 1
0.4 ml
Lösung 2
0.1 ml
1 M DTT
Die aufzutragenden Proteinproben wurden in 20 µl SDS-PAGE-Ladepuffer aufgenommen,
5 min. gerüttelt und anschließend 5 min. bei 95°C inkubiert.
Das Gel konnte nun in die Elektrophoresekammer eingespannt werden und die Kammern mit
SDS-PAGE-Laufpuffer gefüllt werden.
SDS-PAGE-Laufpuffer: 400 ml
5x Tris-Glycin-Puffer
8 ml
25% SDS
ad
2 l H2O
5x Tris-Glycin-Puffer : 150 g
Tris
720 g
Glycin
ad 5 l
H2O
Die kurz abzentrifugierten Proben wurden dann in die Probentaschen geladen. Als
Molekulargewichtstandards wurden vorgefärbte Nieder- bzw. Hochmolekulargewichtsmarker (Prestained Low bzw. High Molecular Weight Marker) in einer Spur zum späteren
Molekulargewichtsvergleich aufgetragen. Die Gele liefen über Nacht bei einer Stromstärke
von 15–25 mA. Nach Beendigung des Laufs konnten die Gele zur Sichtbarmachung der
Methoden
42
Proteinbanden in Coomassie-Blau-Lösung angefärbt und anschließend mit Fixierlösung
entfärbt werden.
Coomassie-Blau-Lösung:
Fixierlösung:
3.125 g
Brilliant Blau R 250
1250 ml
technisches Ethanol
250 ml
Essigsäure
1000 ml
H2O
10%
Essigsäure
35%
Ethanol
Für die Autoradiographie wurden die Gele ohne Färbung 30 min. in Fixierlösung inkubiert,
15 min. gewässert und anschließend bei 55°C für Gradientengele und 60°C für 13%-, 15%-,
und 17 %-ige Gele 2 h im Vakuum-Geltrockner auf Whatman-Papier getrocknet.
Tris-Tricin-Gel:
Um eine noch exaktere Auftrennung von Proteinen zu erhalten, deren Molekuklargewichte
in ungefähr derselben Größenordnung liegen, werden Tris-Tricin-Gele verwendet (Schägger
und von Jagow, 1987). Jene wurden in dieser Arbeit überwiegend bei der Durchführung von
Western
Blots
genutzt.
Die
technische
Vorgehensweise
entsprach
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (siehe 5.1.5).
Es wurden 10%-ige Gele sowie 6-16.5%-ige Gradientengele verwendet.
10%-iges Gel:
Die Mengenangaben entsprechen einem Midigel mit ca. 30-35 ml Volumen.
10%-iges Trenngel:
6 ml
48% Acrylamid, 1.5% Bisacrylamid
10 ml
3x Gel Puffer
4 ml
Glycerol
10 ml
H2O
Unmittelbar vor dem Gießen wurden zugegeben:
10 µl
TEMED
100 µl
10% APS
dabei
der
43
Methoden
6-16.5%-iges Gradiententrenngel:
Die Mengenangaben entsprechen zwei Midigelen mit jeweils ca. 30-35 ml Volumen.
6%-ige Lösung:
16.5%-ige Lösung:
3.6 ml
48% Acrylamid, 1.5% Bisacrylamid
10 ml
7.5 ml
3 x Gel-Puffer
10 ml
Glycerol
4 ml
H2O
6 ml
18.9 ml
Unmittelbar vor dem Starten des Gradientenmischers wurden zugegeben:
5 µl
150 µl
3 x Gel-Puffer:
TEMED
15 µl
10 % APS
150 µl
3 M Tris
0.3% SDS
mit HCl auf pH 8.45 eingestellt
Sammelgel:
2.25 ml
48% Acrylamid, 1.5% Bisacrylamid
7.5 ml
Gel-Puffer
20.25 ml
H2O
Unmittelbar vor dem Gießen wurden zugegeben:
10x Kathodenpuffer:
5 µl
TEMED
250 µl
10% APS
1M
Tris
1M
Tricin
1%
SDS
pH 8.25, keine pH-Korrektion
10x Anodenpuffer:
2M
Tris
mit HCl auf pH 8.9 eingestellt
Die Gele liefen über Nacht bei einer Stromstärke zwischen 18–35 mA.
Methoden
44
5.1.6 Western-Blot
Der Western-Blot erlaubt den immunologischen Nachweis gelelektrophoretisch getrennter
Proteine mittels spezifischer Antikörper. Der Western-Blot diente hauptsächlich dazu, den
Gehalt an Translokations- bzw. Integrationsfaktoren (SecA, SecB, Ffh, FtsY, SecY) in den
verschiedenen Komponenten des zellfreien Systems zu bestimmen.
Nach der Auftrennung durch SDS PAGE wurden die Proteinproben auf eine
Nitrozellulosemembran transferiert (geblottet).
Dazu wurden folgende Materialien 5 min. in Transferpuffer äquilibriert und dann in
nachfolgender Anordnung in die Blottapparatur eingesetzt. Dies sollte, wenn möglich,
luftblasenfrei geschehen, um einen optimalen Stromfluß zwischen Kathode und Anode zu
ermöglichen.
Anordnung der Komponenten:
Kathode: Saugschwamm
3MM Whatman Filterpapier
SDS PAGE Gel
Nitrozellulosemembran
3 MM Whatman Filterpapier
Anode: Saugschwamm
Transferpuffer:
600 ml
5x Tris-Glycin-Puffer (siehe 5.1.5)
600 ml
technischer Ethanol
2 ml
25% SDS
ad
3 l H2 O
Der Transfer erfolgte bei 400 mA für 2 h. Anschließendes Anfärben der Membran mit
Ponceau-S-Lösung (0.2% Ponceau S, 3% TCA) ließ die transferierten Proteinbanden
sichtbar werden. Nach dem Entfärben der Membran mit Wasser wurde der Blot unter
leichtem Schwenken 2 h mit Milchpulver (5% Milchpulver in TTBS) blockiert und
daraufhin mit TTBS gewaschen (je dreimal 5 Minuten in 50ml TTBS Puffer).
45
10x TBS:
TTBS :
1M
Tris/HCl pH 7.5
9%
NaCl
0.1 %
Tween-20 in 1 x TBS
Methoden
Um die Antikörperadsorption zu ermöglichen, wurde das gewünschte Antiserum in
entsprechender Verdünnung in 1% BSA/TTBS für 1 h mit dem Blot inkubiert.
Antiserum vom Kaninchen
Verdünnung
Herkunft
αFfh
1 : 2 500
K.-L. Schimz
αFtsY
1 : 2 500
K.-L. Schimz
αSecA
1 : 5 000
K.-L. Schimz
αSecB
1 : 5 000
K.-L. Schimz
αTrigger Factor
1 : 10 000
E. Deuerling
αSecY
1 : 2 500
M. Müller
Nach weiteren Waschschritten (je dreimal 5 Minuten in 50ml TTBS Puffer) wurde der Blot
mit dem 2. Antikörper (HRPO gekoppelter anti-Kaninchen-Antikörper von der Ziege) in
einer Verdünnung von 1:5 000 in 1% BSA, 20 mM MgCl2 in TTBS für 1 h inkubiert. Zur
Detektion
der
antikörpermarkierten
Proteinbanden
wurde
das
„Enhanced
Chemiluminescence ECL Westernblotting System“ verwendet. Vor der ECL-Behandlung
wurde die Membran erneut gewaschen (siehe oben) und durch Abstreifen auf Filterpapier
kurz angetrocknet. Zur Detektion über Chemilumineszenz wurden Lösung 1 und 2 des ECL
Detektionskits 1:1 frisch miteinander vermischt und durch vorsichtiges Pipettieren auf der
abgetrockneten Membran verteilt. Nach 1-minütigem Einwirken wurde die Lösung entfernt
und die Nitrozellulosemembran in eine Blotkassette gelegt. Durch Auflegen eines
Röntgenfilms für ca. 10 sec. und anschließender Filmentwicklung konnten die durch den
ersten Antikörper erkannten Proteine als schwarze Banden sichtbar gemacht werden.
Methoden
5.2
46
Herstellung von Bestandteilen des zellfreien Systems
In zellfreien E. coli Extrakten konnten Proteine in vitro synthetisiert werden.
Transkriptions-translationsaktive Extrakte waren entweder S135 oder das rekonstituierte
System (RCS), bestehend aus cytosolischen Translationsfaktoren (CTF), hochsalzgewaschenen Ribosomen und gereinigtem Initiationsfaktor 2 (IF-2).
Plasmidcodierte Proteine konnten T7-Polymerase abhängig unter Ver-wendung der
radioaktiv-markierten Aminosäuren
35
S-Met und
35
S-Cys synthetisiert werden. Um
naszierende Ketten zu synthetisieren, wurden zusätzlich DNA Oligonukleotide zugegeben
(nach Haeuptle et al., 1986).
Für Translokations-Integrationsstudien konnten je nach Fragestellung und Versuchsaufbau
Innenmembranvesikel und gereinigte Proteine selektiv zugegeben werden.
5.2.1 Bestandteile des zellfreien Transkriptions-Translations-systems
5.2.1.1 S135
Zur Herstellung des transkriptions-translationsaktiven Zellextraktes S135 von E. coli
(Müller and Blobel, 1984a) wurde eine über-Nacht-Kultur des jeweiligen Stamms
(MRE600, Bl21, SL119) 1:100 in 4x je 1 l S30 Medium verdünnt. Unter aeroben
Bedingungen wuchsen die Zellen bei 37°C bis zur späteren logarithmischen Phase mit einer
OD600nm von 1-1.2. Anschließend wurden die Zellen für 10 min. bei 5 000 Upm im A6.9
Rotor der Hermle Kühlzentrifuge bei 4°C pelletiert. Der Überstand wurde verworfen, das
Pellet mit S30 Puffer gewaschen und die Zellen erneut pelletiert.
S30 Medium:
9 g/l
Trypton
0.8 g/l
Hefeextrakt
5.6 g/l
NaCl
1 ml/l
1 N NaOH
Nach dem Autoklavieren werden zugefügt:
S30 Puffer:
4 ml/l
20% Glukose
10 mM
Triethanolaminacetat, pH 8.0
14 mM
Magnesuimacetat
60 mM
Kaliumchlorid
1 mM
DTT
47
Methoden
Anschließend wurden die Zellen in einem Volumen S30 Puffer in Anwesenheit von 0.5 mM,
unmittelbar vor Gebrauch hergestelltem, PMSF resuspendiert (1 ml Puffer pro g Zellen) und
dann mittels French Press bei 8 000 Psi aufgeschlossen. Durch die darauf folgende
30-minütige Zentrifugation mit 15 500 Upm im Rotor 8.24 der Hermle Zentrifuge bei 4°C
wurde der S30 Überstand gewonnen.
Durch den anschließenden Read-Out wurde nun die endogene mRNA vollständig
translatiert. Dieser Schritt war Voraussetzung für eine spezifische in vitro Proteinsynthese.
Dazu wurden pro ml S30 zugegeben:
Volumen pro ml S30:
60 µl
1 M Triethanolaminacetat, pH 7.5
0.6 µl
1 M DTT
1.6 µl
1 M Magnesiumacetat
6 µl
18 Aminosäuren (je 1 mM)
6 µl
1 mM Methionin
6 µl
1 mM Cystein
2 µl
250 mm ATP
27 µl
200 mM PEP
2.4 µl
2 mg/ml Pyruvat Kinase
Der Read-Out wurde in Dunkelheit bei 37°C für 1h durchgeführt. Um die zugegebenen
niedermolekularen Komponenten, insbesondere nicht radioaktives Methionin und Cystein,
zu entfernen, wurde anschließend zweimal für je 1 h und ein drittes Mal über Nacht bei
jeweils 4°C gegen S30 Puffer dialysiert.
Der so gewonnene S30 konnte nun in 1.1 ml Aliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren
und dann bei – 80°C aufbewahrt werden oder direkt zu S135 weiterverarbeitet werden.
Präparation des S135:
Je 1 ml S30 wurde durch Zentrifugation für 13 min. bei 90 000 Upm in der Ultrazentrifuge
Beckman im Rotor TLA 100.2 bei 4°C pelletiert, dadurch der Membrananteil abgetrennt und
je 750 µl des Überstands als S135 abgenommen. Diese S135 Überstände wurden als 50 µl
Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C aufbewahrt.
Methoden
48
5.2.1.2 Rekonstituiertes System
Im Gegensatz zum S135 (siehe 5.2.1.1), der außer dem Membrananteil alle löslichen
Komponenten eines E. coli Extraktes enthielt, bestand das rekonstituierte System aus einem
subfraktionierten E. coli Extrakt, nämlich den cytosolischen Translationsfaktoren (CTF),
salzextrahierten Ribosomen und Initiationsfaktor 2. Dieses System ermöglichte die selektive
Zugabe von Translokations- und Integrationsfaktoren zum Transkriptions-Translationsansatz
eines in vitro Versuchs.
Cytosolische Translokationsfaktoren: CTF
Das Präparationsprotokoll bestand aus mehreren Arbeitsschritten
1. Zellanzucht und Gewinnung des S30 Extrakts.
2. Isolierung des S150-Extrakts und der Ribosomen.
3. Auftrennung des S150-Extrakts durch Saccharosedichtegradientenzentrifugation.
Die cytosolischen Translationsfaktoren wurden durch Subfraktionierung eines postribosomalen Überstands (S150) aus dem RNase-freien E. coli Stamm MRE600 bzw. aus
dem E. coli-Stamm MC4100 nach dem Protokoll von Müller und Blobel hergestellt (Müller
and Blobel, 1984b).
Alternativ konnten Trigger-Faktor-depletierte CTF und Ribosomen aus dem E. coli-Stamm
MC4100∆tig gewonnen werden.
Die Zellen einer über-Nacht-Kultur wurden 1:20 auf 4x je 1 Liter S-150-Medium verdünnt
und bei 37°C aerob bis zu einer OD600nm von 1.6-1.8 angezogen.
S150-Medium:
753 ml
10 g Hefeextrakt in H2O
166 ml
1 M K2HPO4
41 ml
1 M KH2PO4
41 ml
25% Glukose
Die Lösungen wurden einzeln autoklaviert und erst vor Zugabe der über Nacht gewachsenen
Vorkulturen im entsprechenden Verhältnis gemischt.
Alle folgenden Schritte erfolgten auf Eis bzw. bei 4°C. Nach dem Erreichen der
gewünschten OD wurden die Zellen in einem Eis-Wasser-Bad abgekühlt und durch
10-minütige Zentrifugation bei 7 000 Upm in der Kühlzentrifuge im Rotor A6.9 pelletiert.
Anschließend wurde das Feuchtgewicht der Zellen bestimmt und das Pellet im Verhältnis
1 ml S30-Puffer pro 1 g Zellen resuspendiert.
49
S30-Puffer:
50 mM
Triethanolaminacetat pH 7.5
50 mM
Kaliumacetat pH 7.5
15 mM
Magnesiumacetat
1 mM
DTT
0.5 mM
PMSF
Methoden
Der Zellaufschluss erfolgte in drei Durchgängen in der French Press bei 8 000 Psi. Der
Überstand der anschließenden 30-minütigen Zentrifugation bei 15 500 Upm im Rotor A8.24,
bei dem verbliebene Zelltrümmer und ganze Zellen entfernt wurden, lieferte zunächst den
S30 Extrakt. Dieser Extrakt wurde nun in der Ultrazentrifuge für weitere 2.5 h bei 45 000
Upm im Rotor 50.2 Ti (150 000 x g; Acceleration/Deceleration.: 9) zentrifugiert. Dadurch
entstand der S150-Überstand, der frei von Ribosomen und Membranbestandteilen war.
Das Pellet dieses Zentrifugationsschrittes diente später zur Isolierung hochsalzgewaschener
Ribosomen.
Die Auftrennung des S150-Extraktes in translationsaktive Fraktionen erfolgte durch
Saccharosedichtegradientenzentrifugation. Das Prinzip dieser Methode beruht darauf, dass
durch Zentrifugation die einzelnen Komponenten des S150-Extraktes in einem
Saccharosegradienten solange wandern, bis ihre Schwebedichte der Dichte des Gradienten
an dieser Stelle entspricht.
Jeweils 6 ml einer 10%-igen bzw. 30%-igen (w/w) Saccharoselösung wurden mit Hilfe eines
Gradientenmischers durch Unterschichtung in Zentrifugenröhrchen gegossen.
Saccharosegradientenlösung:
30% (w/w)
10% (w/w)
12.12 ml
5 ml
2.5 M Saccharose, ulta rein
1 M TeaAc, pH 7.5
39.25 ml
5 ml
1.25 ml
4 M KAc, pH 7.5
1.25 ml
500 µl
1 M MgAc2
500 µl
100µl
1 M DTT
100 µl
81.03 ml
H2O (ad 100 ml)
53.90 ml
Methoden
CTF-Puffer:
50
50 mM
Triethanolaminacetat pH 7.5
50 mM
Kaliumacetat pH 7.5
5 mM
Magnesiumacetat
1 mM
DTT
Das Äquilibrieren des Saccharosegradienten erfolgte für 1 h bei 4°C. Anschließend wurde
jedes der Zentrifugenröhrchen vorsichtig mit 1 ml des S150 überschichtet und dann für
20-24 h bei 39 000 Upm (Acceleration/Deceleration: 5) im Ausschwingrotor TST 41.14
zentrifugiert.
Im Anschluss daran wurden die Gradienten unter UV-Absorptionsmessung bei 280 nm
fraktioniert. Hierfür wurden die Zentrifugenröhrchen von unten mit einer Hohlnadel
punktiert und die Gradienten mit Hilfe der Pumpe Minipuls 2 abgezogen.
Auf diese Weise wurden pro Gradient 21 Fraktionen à 600 µl gesammelt (23 Tropfen im
Pharmacia Fraktionssammler LKB RediFrac). Die jeweils gleichen Fraktionen 1-21 der
sechs einzelnen Gradienten wurden, sofern das Absorptionsmuster dieser Gradienten 280 nm
entsprach, vereinigt.Da nicht alle Fraktionen ausreichend Translationsfaktoren für das
rekonstituierte System enthielten, wurde nun die Aktivität der einzelnen CTF-Fraktionen im
Transkriptions-Translationssystem getrennt getestet und die aktiven Fraktionen, meist die
Fraktionen 12-15, erneut vereinigt. Die so gewonnenen, translationsaktiven Fraktionen
wurden aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert.
Ribosomen
Hochsalzgewaschene Ribosomen wurden nach dem Protokoll von Müller und Blobel
gewonnen (Müller and Blobel, 1984b). Grundlage hierfür war das bei der S150-Herstellung
im Rahmen der 150 000 x g Zentrifugation angefallene Pellet (siehe CTF).
Um ribosomenassoziierte Proteine zu entfernen, wurden die Ribosomen zunächst mit
Hochsalzpuffer gewaschen. Alle folgenden Schritte wurden auf Eis bzw. bei 4°C
durchgeführt.
Hochsalzpuffer:
50 mM
Triethanolaminacetat pH 7.5
1M
Kaliumacetat pH 7.5
5 mM
Magnesiumacetat
1 mM
DTT
51
Methoden
Die in Hochsalzpuffer aufgenommenen Ribosomen wurden durch einstündige Zentrifugation
bei 90 000 Upm im Rotor TLA 100.2 erneut pelletiert. Das dadurch erhaltene durchsichtige
Ribosomenpellet war mit einer hochviskosen, gelblichen Phase überschichtet.
Diese Phase bestand aus Membranbruchstücken und konnte manuell entfernt werden.
Danach wurde das Ribosomenpellet erneut in Hochsalzpuffer aufgenommen.
200 µl dieser Ribosomen wurden auf einen 10-40%-igen (w/w) Saccharosegradienten
aufgetragen (10.38 g bzw. 47.06 g Saccharose je 100 ml Lösung in Hochsalzpuffer). Die
anschließende Zentrifugation über einen Zeitraum von 17 h erfolgte bei 29 000 Upm im
TST 41.14 Rotor in der Ultrazentrifuge. Beim Abziehen der Gradienten wurde die
Absorption der rRNA bei 254 nm aufgezeichnet und die Gradienten in Fraktionen à 500 µl
gesammelt.
25 µl der Fraktionen wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und
mit Coomassie angefärbt (siehe 5.1.5).
Die Ribosomen konnten in der Coomassiefärbung an dem charakteristischen Bandenmuster
der großen und kleinen Proteinuntereinheit erkannt werden und befanden sich zumeist in den
Fraktionen 1-9. In den oberen, weniger dichten Fraktionen befanden sich vor allem die,
durch die Hochsalzbedingungen abgewaschenen Proteine wie z.B. Trigger Factor und P48.
Daraufhin wurden die ribosomenhaltigen Fraktionen vereinigt, durch einstündige
Zentrifugation bei 90 000 Upm im Rotor TLA 100.2 in der Ultrazentrifuge erneut pelletiert,
in CTF-Puffer resuspendiert, aliquotiert, schockgefroren und bei –80°C gelagert.
Initiationsfaktor 2
Da bei der Salzextraktion der Ribosomen auch der Initiationsfaktor 2 (IF-2) entfernt wurde,
musste er bei der in vitro Synthese in aufgereinigter Form zugegeben werden.
Hierfür wurde der Initiationsfaktor 2 von H. Hoffschulte nach dem Protokoll von Müller und
Blobel aufgereinigt (Müller and Blobel, 1984a).
T7-RNA-Polymerase
Die gereinigte T7-RNA-Polymerase wurde von Promega bezogen bzw. alternativ aus einem
T7-RNA-Polymerase überproduzierenden E. coli-Stamm von D. Trescher aufgereinigt.
Methoden
52
5.2.2 Membranvesikel
Inside-out-Innenmembranvesikel (INV)
Um den Transport sekretorischer Proteine über die Innenmembran bzw. die Integration von
Innenmembranproteinen von E. coli in vitro untersuchen zu können, wurden sogenannte
Inside-out-Innenmembranvesikel, das heißt Vesikel der Innenmembran mit umgekehrter
Orientierung hergestellt. Dabei wurde weitgehend dem Protokoll von Müller und Blobel
gefolgt (Müller and Blobel, 1984a).
Zur Präparation wurden die E. coli-Stämme AD179, MRE600 bzw. SL119 verwendet.
Je 20 ml einer 100 ml über Nacht gewachsenen Vorkultur wurden in 4 x je 1 Liter INVMedium überimpft und für ca. 3 h bis zu einer OD600nm von 1.5-1.8 bei 37°C im Schüttler
angezogen.
INV-Medium:
753 ml
H2O mit jeweils 10 g Hefeextrakt u. Trypton
41 ml
1 M KH2PO4
166 ml
1 M K2HPO4
41 ml
25 % Glukose
Die einzelnen Lösungen wurden jeweils getrennt voneinander autoklaviert.
Alle folgenden Schritte wurden auf Eis bzw. bei 4°C durchgeführt. Die Zellen wurden durch
10-minütige Zentrifugation bei 7 000 Upm im Rotor A6.9 der Kühlzentrifuge pelletiert und
abgeerntet. Nach einem Waschschritt wurden die Zellen dann in Puffer A resuspendiert,
wobei auf 1 g Zellen je 1 ml des Puffers zugegeben wurde.
Puffer A:
50 mM
Triethanolaminacetat pH 7.5
250 mM
Saccharose
1 mM
EDTA
1 mM
DTT
0.5 mM
PMSF
Anschließend wurden die Zellen bei drei Durchläufen in der French Press unter hohem
Druck (8 000 Psi) aufgeschlossen. Nicht aufgebrochene Zellen und größere Zelltrümmer
wurden durch einen niedertourigen ersten Zentrifugationsschritt von 5 min bei 5 000 Upm
im Rotor A8.24 entfernt. Aus dem Überstand wurde durch Zentrifugation für 2 h bei 40 000
Upm (150 000 x g) im Rotor 50.2.Ti ein Rohmembranpellet gewonnen, das aus
53
Methoden
Innenmembranen, Außenmembranen sowie Ribosomen bestand. Dieses Pellet wurde
anschließend mit Hilfe eines Dounce Homogenisators in 8 ml Puffer A resuspendiert.
Die im Rohmembranpellet neben den gewünschten Innenmembranvesikeln außerdem
enthaltenen Außenmembranen und Ribosomen konnten aufgrund ihrer unterschiedlichen
Dichten in einem Saccharosestufengradienten voneinander getrennt werden. Dazu wurden
0.77 M, 1.44 M bzw. 2.02 M Saccharoselösungen in Puffer A hergestellt. Durch Unterschichtung von 12 ml der 0.77 M Saccharoselösung mit 12 ml der 1.44 M Lösung und
schließlich mit 10 ml der 2.02 M Lösung entstand ein Saccharosegradient, der für 1 h bei
4°C äquilibriert wurde. Nach Überschichtung von 2-2.5 ml der Rohmembranen pro Gradient
erfolgte die Zentrifugation für 16 h bei 25 000 Upm im Ausschwingrotor SW28.
Die Innenmembranvesikel befanden sich nun in der oberen Interphase zwischen der 1.44 M
und 0.77 M Saccharoselösung und waren hier als gelbliche Bande erkennbar. Mittels einer
Kanüle wurden die Zentrifugenröhrchen seitlich auf der Höhe des Unterrandes der
Membranenphase
angestochen
und
die
gelbliche
Lösung
abgezogen.
Um
die
Saccharosekonzentration der Vesikellösung zu verringern, wurde diese 4-fach mit 50 mM
Triethanolaminacetat pH 7.5 verdünnt, für 2 h bei 40 000 Upm (150 000 x g) im Rotor 50.2
Ti pelletiert und anschließend in insgesamt 1 ml INV-Puffer resuspendiert.
INV-Puffer:
50 mM
Triethanolaminacetat pH 7.5
1 mM
DTT
250 mM
Saccharose
Zur Kontrolle wurde abschließend die Proteinkonzentration dieser Vesikellösung bestimmt.
Die OD280nm sollte dabei nicht unter 30 liegen. Die Absorptionsmessung erfolgte nach
entsprechender Verdünnung in Anwesenheit von 2% SDS.
Harnstoffextrahierte Vesikel (HINV)
Durch die Behandlung mit 6 M Harnstoff wurden die Targetingfaktoren SecA, SecB, Ffh
und FtsY entfernt. Durch explizite Zugabe eines oder mehrerer dieser Faktoren zu einem
Transkriptions-Translationssystem konnten charakteristische Transport- bzw. Integrationseigenschaften verschiedener Proteine getestet und nachgewiesen werden.
Je 100 µl INV wurden mit 400 µl 7.5 M Harnstoffpuffer vermischt und auf Eis für 1 h
inkubiert (Helde et al., 1997).
Methoden
54
Harnstoffpuffer :
7.5 M
Harnstoff
50 mM
Triethanolaminacetat pH 7.5
250 mM
Saccharose
Die so entstandene 500 µl Harnstoff/INV-Lösung wurde anschließend durch ein 200 µl
Saccharosekissen (750 mM Saccharose, 50 mM Triethanolaminacetat pH 7.5) 15 min. bei
70 000 Upm im Rotor TLA 100.2 bei 4°C pelletiert. Nach Resuspension des Pellets in 100 µl
INV-Puffer und Sedimentation durch ein zweites 750 mM Saccharosekissen wurde das
Pellet in dem halben Ausgangsvolumen (in diesem Fall 50 µl) INV-Puffer aufgenommen.
5.2.3 Translokations- Integrationsfaktoren
SecA
aufgereinigt
Konzentration Protokoll
H.Hoffschulte,
1 mg/ml
Helde et al., 1997
D.Trescher
SecB
H. Hoffschulte
2 mg/ml
Hoffschulte et al., 1994
FtsY
H. Hoffschulte
1 mg/ml
Koch et al., 1999
(modifiziert nach Luirink et al.,
1994)
F1-
H.Hoffschulte
1 mg/ml
Müller et al., 1987
H.-G. Koch/M.Moser
0.1 mg/ml
Eisner et al., 2003
ATPase
Ffh
55
5.3
Methoden
Versuche zum Proteintransport im zellfreien System aus Escherichia
coli
5.3.1 In vitro Transkriptions-Translationsreaktion
Die Proteinsynthese im zellfreien System erfolgte durch gekoppelte TranskriptionTranslation (Koch et al., 1999).
Ein Reaktionsansatz für die in vitro Synthese radioaktiv-markierter Proteine enthielt neben
der Plasmid-DNA des zu synthetisierenden Proteins an biologischen Komponenten die so
genannten cytosolischen Translationsfaktoren (CTF), Ribosomen sowie Initiationsfaktor 2.
Zusätzlich wurden Nukleotide, T7-RNA-Polymerase für die RNA-Synthese, nicht
radioaktive Aminosäuren sowie
35
S-Met und
35
S-Cys zur radioaktiven Markierung der zu
translatierenden Proteine zugegeben. Für die in vitro Synthese wurde außerdem ein
ATP-regenerierendes System benötigt, welches aus Kreatinphosphat, Kreatinphosphatkinase
und Phosphoenolpyruvat bestand. Durch Zugabe der Polyamine Spermidin und Putrescin
(zur Stabilisierung der Ribosomen) sowie DTT (zum Schutz vor Oxidation) und dem RNaseInhibitor RNasin (zum Schutz vor unspezifischem Abbau der RNA) wurde die Synthese
optimiert. Für eine korrekte und effiziente Synthese waren die Puffer- und Salzbedingungen
entscheidend,
die
je
nach
Protein
variieren
konnten.
Die
jeweils
geeigneten
Salzkonzentrationen wurden durch Titrationsexperimente ermittelt. Eine effiziente Synthese
war in der Regel bei 70 mM K+ und je nach Protein bei 8-11 mM Mg++ möglich. Als
Puffersystem diente 40 mM Triethanolaminacetat pH 7.5, bei DSS-Quervernetzungsexperimenten hingegen 40 mM HEPES pH 7.5 (siehe 5.3.7). Um die gewünschten Pufferund Salzbedingungen zu erhalten, mussten die Ionenkonzentrationen der Puffer
berücksichtigt werden, in denen die einzelnen biologischen Komponenten aufgenommen
waren. Je nach Fragestellung wurden dem Reaktionsansatz weitere Komponenten zugesetzt.
Auch diese Komponenten bzw. die Puffer, in denen diese Komponenten aufgenommen
waren, mussten zur Berechnung des Endvolumens und der gewünschten Ionenkonzentration
miteinbezogen werden (SecA, SecB, FtsY, TF in CTF-Puffer; P48 in 1:1 CTFPuffer/Glycerin; INV in INV-Puffer). Daher wurde zunächst ein 5-fach konzentrierter
„Kompensationspuffer“ berechnet und pipettiert.
Methoden
56
Das unten aufgeführte Rechenbeispiel zur Zusammensetzung eines Kompensationspuffers
geht von Synthesebedingungen mit 5 µl CTF, 0.5 µl Ribosomen, 0.5 µl Initiationsfaktor,
0.5 µl INV, 1 µl SecA und 0.5 µl F1-ATPase pro 25 µl Reaktionsansatz aus:
T
Menge:
Komponente:
5 µl
CTF
0.5 µl
Ribosomen
T50K50Mg5
50
50
T K Mg
5
50 250
nmol
250
250
25
nmol
25
25
2.5
50
INV
T S
nmol
0.5 µl
Initiationsfaktor 2
K350
nmol
SecA/SecB/ Ftsy/ Ffh T50K50Mg5
0.5 µl
Mg
Sper
H2O
pro µl enthalten:
1 µl
1 µl
K
50
50
F1-ATPase T K Mg
5
Σ (1)
nmol
50
50
5
nmol
25
25
2.5
nmol
400
525
35
40
70
8
0.8
20
gewünschte Endkonzentration: mmol/l = nmol/µl mM
entspricht pro 25 µl Ansatz (2)
175
nmol
1000 1750
200
nmol
600
1225
165
entspricht pro 1 µl Ansatz 5-fach konzentriert:(4) nmol
120
245
33
4
1
4
1
0.1
je 25 µl Ansatz müssen hinzugefügt werden:
(3) = ∆ (2-1)
Stammlösung (5)
M
für 0.25 ml 5-fach Kompensationspuffer muss an
ad
Stammlösung hinzugefügt werden:
(6) = (4) x 0.25/(5)
250 µl
µl
30
15.3
8.3
10
T: Triethanolaminacetat, K: Kaliumacetat, Mg: Magnesiumacetat, Sper: Spermidin
186.4
57
Methoden
Nach Fertigstellung des Kompensationspuffers wurde der Reaktionsmix hergestellt. Durch
Zugabe der unter T7-Promotor-Kontrolle stehenden Plasmid-DNA des zu synthetisierenden
Proteins sowie der radioaktiv-markierten Aminosäuren
35
S-Met und
35
S-Cys wurde das
gewünschte radioaktiv-markierte Protein synthetisiert. Dabei wurden für n Syntheseansätze
immer (n + 1) Ansätze hergestellt.
Ein 25 µl Ansatz des Transkriptions-Translationssystems setzte sich wie folgt zusammen:
Komponente
Stammlösung
Endkonzentration
5fach Kompensationspuffer (s.oben)
µl / 25 µl
5
H2O
ad 25 µl
Polyethylenglycol 6000
40%
3.2%
2
je 1 mM
je 0.4 mM
1
Putrescin
0.2 M
8 mM
1
DTT
0.2 M
2 mM
0.25
NTP-Mix: ATP
50 mM
2.5 mM
1.25
je 10 mM
je 0.5 mM
19 Aminosäuren ( ohne Met )
CTP, GTP, UTP
KOH ( zur Neutralisation)
200 mN
Phosphenolpyruvat
0.2 M
12 mM
1.5
Kreatinphosphat
0.5 M
8 mM
0.4
10 mg/ml
40 µg/ml
0.1
Kreatinphosphatkinase
*Cytosolische Translationsfaktoren
5
*Ribosomen
0.5
Initiationsfaktor 2
0.5
*Plasmid-DNA
0.5
RNasin RNase-Inhibitor
0.2
T7-RNA-Polymerase
0.3
weiter Komponenten wie INV, Oligonukleotide usw. je nach Fragestellung
35
S-Met
10 µCi / µl
0.20 µCi / µl
0.5
* die verwendete Menge variierte je nach Präparation, Fragestellung oder Protein und wurde
entsprechend titriert.
Die Ansätze wurden 30 min. bei 37°C inkubiert. Nach erfolgter in vitro Transkription und
Translation wurde die Synthese sofort durch Abkühlen der Ansätze und Zugabe gleichen
Volumens 10%-iger TCA auf Eis gestoppt.
Methoden
58
Erfolgte die Synthese im S135-System, wurde statt der cytosolischen Translationsfaktoren
3-5 µl S135 pro 25 µl eingesetzt (die Menge an S135 variierte je nach Präparation).
Ribosomen, Initiationsfaktor 2 und RNasin (RNase-Inhibitor) mussten hier nicht zugesetzt
werden, da sie im S135 enthalten sind. Die weitere Herstellung des Reaktionsmixes sowie
die Herstellung des Kompensationspuffers und das weitere technische Vorgehen der in vitro
Transkription-Translationsreaktion entsprachen der Handhabung bei der Verwendung
cytosolischer Translationsfaktoren.
5.3.2 TCA -Fällung
Nach Zugabe von 1 Volumen 10%-iger TCA zu den Proben wurden die Proteine mindestens
30 min. auf Eis präzipitiert und anschließend in der Tischzentrifuge „Biofuge pico“ pelletiert
(5 min., 4°C, 14 000 Upm). Das Pellet wurde in 20–25 µl SDS-PAGE-Ladepuffer
aufgenommen, 5 min. gerüttelt, 5 min. bei 95°C denaturiert und konnte dann auf die SDSGele aufgetragen werden.
5.3.3 Synthese und Isolierung ribosomenassoziierter naszierender Ketten
(RANCs)
Synthese ribosomenassoziierter naszierender Ketten
Die Synthese ribosomenassoziierter Ketten erfolgte mittels einer nach Haeuptle et al. (1986)
modifizierten Methode (Behrmann et al., 1998). Vor Start der Synthese im zellfreien System
wurden DNA-Oligonukleotide hinzugegeben, die zur mRNA des zu synthetisierenden
Proteins komplementär waren. Diese DNA-Oligonukleotide hybridisierten während der
Transkription-Translationsreaktion mit der mRNA. Die endogene Endonuklease RNaseH
erkannte diese DNA/mRNA Hybride und verdaute den hybridisierten mRNA-Anteil. So
entstand eine verkürzte mRNA, die an ihrem 3`-Ende kein Stop-Codon mehr enthielt. Dies
hatte zur Folge, dass am Ende der Translation keine Freisetzung der Polypeptidkette vom
Ribosom erfolgen konnte und somit ribosmenassoziierte naszierende Ketten entstanden. Je
nach Auswahl des Oligonukleotids konnten so naszierende Ketten unterschiedlichster Länge
eines Proteins synthetisiert werden.
59
Methoden
Für die Synthese der RANCs wurden folgende DNA-Oligonukleotide verwendet:
Oligonukleotid
Synthetisiertes
Sequenz 5’→ 3’
Polypeptid
Länge in
Basenpaaren
anti-10Sa-
10Sa-RNA-
TTAAGCTGCTAAAGCGTAGTT
RNA
antisense-
TTCGTCGTTTGCGACTA
38
Oligonukleotid
FhaB*-100
naszierende
Kette GAACTTGTTGTGCGAGACGCC
21
Kette GCGAGTCAGGTTGGGGTTCTT
21
von FhaB*
FhaB*-135
naszierende
von FhaB*
FhaB*-305
naszierende
Kette GCGCACGCCCAGGCCTGAATC 24
von FhaB*
pSepA*-106
naszierende
GCT
Kette GGTAGTAATAGTGGCACTACT
21
von pSepA*
OmpA-126
naszierende Kette
von pOmpA
MtlA 189
naszierende
TAAACGTTGGATTTAGTGTC
Kette ACCGTGGTTAATGGCGTTGTT
20
21
von MtlA
Die Versuche mit naszierenden Ketten wurden stets in CTF durchgeführt; hierbei betrug die
Konzentrationen der Oligonukleotide 4 µg/25 µl Ansatz. Anti-10Sa-RNA wurde in einer
Konzentration von 0,25 µg / 25µl-Ansatz eingesetzt.
Aufgrund der Tatsache, dass die meisten E. coli-Stämme, mit Ausnahme der MC4100Stämme, eine ausreichend hohe endogene RNaseH-Konzentration besaßen, musste bei
Versuchen mit Oligonukleotiden keine RNaseH zugesetzt werden.
In E. coli Zellen gibt es zahlreiche Schutzsysteme, die ein problemfreies Ablaufen
zellinterner Vorgänge gewährleisten sollen; unter anderem das so genannte 10Sa-RNASystem, welches unvollständig synthetisierte Proteine erkennt und sie nach Modifikation der
Proteolyse zuführt (Keiler et al., 1996).
Diese 10Sa-RNA würde demnach auch die Entstehung ribosomenassoziierter Ketten zu
verhindern versuchen. Deswegen wurde pro Reaktionsansatz je 0.25 µl eines 10Sa-RNAantisense-Oligonukleotids hinzugefügt (Hanes and Plückthun et al., 1997). Die 10Sa-RNA
ist ein stabiles RNA-Molekül, welches sowohl als tRNA als auch als mRNA fungieren kann
Methoden
60
(Komine et al., 1994). Sobald blockierte Ribosomen eine mRNA ohne Terminationscodon
synthetisiert haben, tritt die 10Sa-RNA in Aktion. Auf der einen Seite fungiert sie als
Matrize für eine Translationsreaktion, durch die eine bestimmte Peptidsequenz („Tag“) an
die Peptidkette angefügt wird, zum anderen führt sie über Einfügen eines Stop-Codons zur
Ablösung der arretierten Polypeptidkette. Der angefügte C-terminale „Tag“ wird nun von
E. coli-spezifischen Proteasen erkannt und die Polypeptidkette wird abgebaut. Um diesen
Vorgang zu verhindern und um den Komplex aus Ribosom und naszierender Kette zu
stabilisieren, wurde das 10SA-RNA-antisense-Oligonukleotid hinzugegegeben, welches mit
der 10Sa-RNA hybridisierte und so deren Funktion inhibierte.
Isolierung ribosomenassoziierter naszierender Ketten
Zur Isolierung der ribosomenassoziierten naszierenden Ketten wurden diese durch ein
Saccharosekissen pelletiert. Hierzu wurde ein 10-fach Ansatz mit 250µl Reaktionsvolumen
auf ein 200 µl Saccharose-Kissen aufgetragen und 60 min bei 70 000 Upm im Rotor
TLA 100.2 bei 4°C zentrifugiert. Anschließend wurden die RANCs in
Resuspendierungspuffer RB durch Auf- und Abpipettieren aufgenommen.
Saccharose-Kissen:
20%
50mM
50mM
5mM
1 mM
Resuspendierungspuffer RB :
Saccharose
HEPES pH 7.5
Kaliumacetat pH 7.5
Magnesiumacetat
DTT
50mM
HEPES pH 7.5
50mM
Kaliumacetat pH 7.5
5mM
Magnesiumacetat
1 mM
DTT
61
Methoden
5.3.4 Puromycin- und Chloramphenicolbehandlung
Puromycinbehandlung
Um naszierende Ketten kontrolliert von den Ribosomen loszulösen, konnte Puromycin
hinzugegeben
werden.
Puromycin
führt
als
Analogon
der
endständigen
Aminoacyladenosingruppe einer t-RNA zum Kettenabbruch. Nach der Synthese wurden 2 µl
11 mM Puromycin mit KOH auf pH 6.5 titriert, zu je 25 µl Syntheseansatz zugegeben und
für weitere 10-15 min. bei 37°C inkubiert.
Choramphenicolbehandlung
Um die Proteinsynthese zu stoppen ohne eine Ablösung der wachsenden Proteinkette vom
Ribosom zu erzielen, wurde Chloramphenicol eingesetzt. Chloramphenicol hemmt die
Peptidyltransferaseaktivität am Ribosom und verhindert somit die Fortsetzung der
Proteinsynthese. Nach der Synthese wurde Chloramphenicol in einer finalen Konzentration
von 30µg/ml zu den Reaktionsansätzen gegeben und diese 10 Minuten auf Eis inkubiert.
5.3.5 Translokation/Integration in Innenmembranvesikel
Translokation/Integration in Innenmembranvesikel
Sollte die Translokation eines sekretorischen Proteins bzw. die Integration eines
Membranproteins untersucht werden, wurden zum Syntheseansatz Innenmembranvesikel
(INV), Translokonmutanten (Mutanten-Vesikel), oder harnstoffbehandelte Vesikel (HINV)
zugegeben. Die für den in vitro Transport optimale Vesikelmenge wurde jeweils austitriert.
Bei Verwendung von HINV mussten zur Wiederherstellung der Translokations- bzw.
Integrationsaktivität gereinigte Translokations- bzw. Integrationsfaktoren hinzugefügt
werden.
Erfolgte der Transport co-translational, wurden die INV nach 5 min. dem Syntheseansatz
zugegeben und dieser dann für weitere 25 min. bei 37°C inkubiert. Bei post-translationalem
Transport wurde die Synthese nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C zunächst durch
Chloramphenicol abgestoppt und 10 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die
Vesikel bei 37°C zusammen mit einem ATP-regenerierendem System (0.25 µl 250 mM
ATP, 0.4 µl 500 mM CP, 0.1 µl 10 mg/ml CPK, 1 µl 125 mM PEP pro 25 µl Ansatz)
hinzugefügt und für weitere 15 min. bei 37°C inkubiert.
Methoden
62
Der erfolgte Transport wurde mittels eines Protease-Resistenz-Tests überprüft. Dazu wurde
im Anschluss an die Synthese die Hälfte eines Doppelansatzes (50 µl) direkt mit 10%-iger
TCA gefällt, die andere Hälfte wurde zunächst mit 25 µl Proteinase K (1 mg/ml) für 20 min.
bei 25°C inkubiert. Während dieses 20-minütigen Proteaseverdaus wurden alle nicht durch
Integration in die Membran oder durch Transport ins Vesikelinnere geschützten Proteine
oder Proteindomänen im Ansatz verdaut. Anschließend wurde auch diese Probe mit 1
Volumen (50 µl) 10%-iger TCA gefällt. Um eine vollständige Inaktivierung der Proteinase
K zu erreichen, wurden so behandelte Proben nach Zugabe der 10%-igen TCA zunächst für
10 min. auf 56°C erhitzt und danach auf 4°C abgekühlt.
Triton-Behandlung der Vesikel
In einem Kontrollansatz wurden zusätzlich zur Proteinase K noch 5,5µl 10% TritonX100
zugesetzt. Der Inhalt der solubilisierten Vesikel war nun auch der Protease zugänglich. TCA
Niederschläge solcher TritonX100 Kontrollen mußten 2x mit saurem Aceton (40µl HCl auf
2ml Aceton) gewaschen werden, um das in der SDS PAGE störende Triton zu entfernen (2x
2min mit 13000Upm in der Biofuge zentrifugieren und den ÜS absaugen), bevor sie in 25µl
1x Probenpuffer aufgenommen wurden.
5.3.6 Flotation
Um die verschiedenen Targetingmechanismen der im zellfreien System synthetisierten
Proteine näher untersuchen zu können, wurde eine Differentialzentrifugation der
Translationsprodukte bzw. der naszierenden Ketten über einen dreistufigen Saccharosegradienten durchgeführt.
Stufe 1:
1.6 M Saccharose
Stufe 2:
1.25 M Saccharose in T40, K70, Mg5
Stufe 3:
0.25 M Saccharose in T40, K70, Mg5
Im Anschluss an die Synthese wurden zunächst 40 µl eines Doppelansatzes (50 µl) zu 60 µl
einer 2.5 M Saccharoselösung
in ein Beckman Zentrifugenröhrchen pipettiert. Durch
vorsichtiges Vortexen wurde der Syntheseansatz mit der
Saccharoselösung vermischt.
Vorsicht war hier deshalb geboten, weil Gefahr bestand, durch zu starkes mechanisches
Einwirken
die
eventuell
an
die
Innenmembranvesikel
gebundenen
Ribosomen-
Polypeptidketten-Komplexe abzulösen. Die nun aus 100 µl bestehende Mischung aus
63
Methoden
Saccharose und Syntheseansatz wurde zunächst mit 200 µl der 1.25 M Saccharoselösung,
dann mit 100 µl der 0.25 M Saccharoselösung überschichtet. Danach wurde der
Dreistufengradient, dessen Finalvolumen nun 400 µl betrug, für 90 min. bei 100 000 Upm
und 4°C im Rotor TLA 100.2 der Beckman-Ultrazentrifuge zentrifugiert.
Daran anschließend wurde der Gradient in 5 Fraktionen aufgeteilt. Schichtweise wurden
insgesamt 4x jeweils 100 µl des Gradienten vorsichtig abgezogen, in Eppendorfröhrchen
pipettiert und anschließend mit 100 µl 10%-iger TCA für 30 min. auf Eis gefällt.
Fraktion 5 bestand aus während der Zentrifugation pelletierten Proteinen. Sie wurden in 25
µl SDS-PAGE-Ladepuffer (siehe 5.1.5) durch 5-minütiges Rütteln resuspendiert und durch
5-minütige Inkubation bei 95°C denaturiert. Alle 5 Gradienten konnten dann in üblicher
Vorgehensweise auf ein SDS-Gel aufgetragen werden.
Das Prinzip der Flotation beruht auf der Tatsache, dass die im Syntheseansatz enthaltenen
Vesikel durch die Zentrifugation solange innerhalb des Saccharosegradienten aufsteigen, bis
die Dichte der Saccharoselösung ihrer eigenen Dichte entspricht. So fanden sich die Vesikel
meist in den Fraktionen 2-3. Dies bedeutete gleichzeitig auch, dass sich alle
vesikelassoziierten, radioaktiv-markierten Ribosom-Polypeptid-Komplexe ebenfalls in den
Fraktionen 2-3 befanden, während alle nicht vesikelassoziierten, radioaktiv-markierten
Ribosom-Polypeptid-Komplexe in den Fraktionen 4 und 5 (entspricht Pellet) aufzufinden
waren.
5.3.7 Quervernetzung mit DSS und MBS
Quervernetzung mit DSS
Mithilfe des membrangängigen, chemischen Quervernetzers Disuccinimidylsuberat (DSS)
konnten in vitro synthetisierte Proteine kovalent mit Bindungspartnern verknüpft werden.
DSS ist ein homobifunktioneller NHS-Ester, der bevorzugt mit primären Aminen reagiert. Er
besteht aus Suberinsäure (COOH-(CH2)6-COOH), die an beiden Enden über eine
Esterbindung mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) verbunden ist (Abb. 5.1). Im neutralen pHBereich reagiert DSS mit primären Aminen unter Ausbildung einer Amidbindung bei
gleichzeitiger Abspaltung von NHS (Abb.5.1). Vor allem die ε-Amine der LysinSeitenketten dienen dabei als Reaktionspartner. Dabei werden Brückenliganden mit einer
Länge von bis zu 11Å zwischen beiden Quervernetzungspartnern eingebaut.
Methoden
64
DSS
R-NH2 +
+ RI-NH2
(CH2)6
pH>7-9
-2 NHS
NH-RI
R-NH
Abb. 5.1 Strukturformel und Reaktionsschema von DSS
Bei Quervernetzungsexperimenten diente HEPES statt Trieethanolamin als Puffersystem. Im
Anschluss an die in vitro Synthese wurden die Reaktionsansätze mit 1/10 Volumen 25 mM
DSS in DMSO gemischt und für weitere 30 min. bei 25°C inkubiert. Durch Zugabe von
Tris/HCL pH 7.5 mit einer Endkonzentration von 50 mM und Inkubation für 15 min. bei
25°C wurde die Quervernetzungsreaktion abgestoppt. Die Quervernetzungsprodukte konnten
entweder mittels SDS-PAGE und Autoradiographie sichtbar gemacht werden oder mittels
Immunpräzipitation identifiziert werden.
Quervernetzung mit MBS
Als
weiteres
Quervernetzungsreagenz
hydroxysuccinimidester)
eingesetzt.
wurde
MBS
MBS
ist
(m-Maleimidobenzoyl-Nein
heterobifunktionelle
Quervernetzungsreagenz und besteht aus einem Benzolring, der an C-Atom 1 mit NHydroxysuccinimid (NHS) verestert ist und an C-Atom 4 über eine Amidbindung mit
Maleimid verknüpft ist (Abb.5.2). Unter Aufbruch der Doppelbindung und Ausbildung einer
Sulfid(CS)-Bindung kann die Maleimidgruppe mit den Sulfhydrylgruppen schwefelhaltiger
Aminosäuren quervernetzt werden.
Im neutralen Bereich reagiert MBS zusätzlich mit primären Aminen unter Abspaltung von
NHS und Ausbildung einer Amidbindung (Abb.5.2). Somit ermöglicht es die kovalente
Koppelung eng benachbarter Polypeptide, wobei v.a. die ε-Amine der Lysinseitenketten als
Reaktionspartner dienen.
65
Methoden
Maleimid
NHS-Gruppe
Abb. 5.2 Strukturformel von MBS
Statt Trieethanolamin diente auch hier HEPES als Puffersystem. Vor ihrer Quervernetzung
mussten die naszierenden Ketten allerdings zunächst isoliert werden und in DTT-freiem
Resuspensierungspuffer aufgenommen werden. Hierbei wurden naszierende Ketten aus 25 µl
Reaktionsansatz in 12,5 µl Resuspendierungspuffer aufgenommen.
Resuspendierungspuffer:
50mM
Hepes
150mM
Kaliumacetat pH 7.5
10mM
Magnesiumacetat
Im Anschluss daran wurden 12,5 µl Resuspendat (gegebenenfalls nach Puromycinbehandlung) mit einem ATP-regenerierenden System ( 0.4 µl 500 mM CP, 0.1 µl 10 mg/ml
CPK, 1 µl 125 mM PEP pro 25 µl Ansatz), NTP-Mix (ATP 50mM, CTP, GTP, UTP je
10mM, KOH 200mM), 5 µl S135 und wahlweise mit INV oder Translokations- bzw.
Insertionsfaktoren versetzt und Resuspendierungspuffer hinzugefügt, um ein Endvolumen
von 25 µl zu erreichen.
Die Quervernetzungsprodukte konnten entweder mittels SDS-PAGE und Autoradiographie
sichtbar gemacht werden oder mittels Immunpräzipitation identifiziert werden.
5.3.8 Immunpräzipitation
Zur Identifizierung von Quervernetzungsprodukten (siehe 5.3.7) im in vitro System wurden
spezifische Antikörper verwendet.
Pro Immunpräzipitation wurden 5 mg Protein-A-Sepharose in 1 ml Tritonpuffer aufgenommen und zum Quellen für 5 min. auf Eis inkubiert und äquilibriert.
Methoden
Tritonpuffer:
66
1%
Triton X-100
0.9%
NaCl
25 mM
Tris/HCl pH 6.8
5 mM
EDTA pH 8
In einem 1-minütigen Zentrifugationsschritt bei 13 000 Upm in der Tischzentrifuge “Biofuge
pico” wurde die Protein-A-Sepharose pelletiert und der Pufferüberstand abgenommen. Nach
einem Waschschritt mit 1 ml Tritonpuffer wurde das Trägermaterial schließlich in 1 ml
Tritonpuffer aufgenommen und das spezifische Antiserum vom Kaninchen zugegeben.
Dabei wurde folgende Konzentrationen eingesetzt:
Antiserum
µl pro Immunpräzipitation
αSecA
7 µl
αTF
7 µl
αFfh
15 µl
αSecB
15 µl
Nach Zugabe des Antiserum wurden die Proben kurz gevortext und dann für mindestens 1 h
bei 4°C auf einem Überkopfschüttler inkubiert. Dies sollte auf der einen Seite den
Antikörpern ermöglichen, an die Protein-A-Sepharose zu binden, auf der anderen Seite sollte
eine frühzeitige Sedimentation des Trägermaterials verhindert werden. Nach zwei weiteren
Waschschritten mit je 1 ml Tritonpuffer, um nicht gebundene Antikörper abzutrennen,
wurden die Antikörper-Protein-A-Sepharose-Komplexe erneut in 1 ml Tritonpuffer
aufgenommen.
Abhängig von Fragestellung und verwendetem Protein wurde eine Proteinlösung von
4-10-fachen (100-250 µl) Syntheseansätzen nach Quervernetzung mit DSS (siehe 5.3.7) oder
MBS (siehe 5.3.7) durch 5-minütige Inkubation bei 95°C in 1% SDS denaturiert. Diese
denaturierte Proteinlösung wurde dem in Tritonpuffer gelösten Antikörper-Protein-ASepharose-Komplex zugegeben und für mindestens 1 h auf dem Überkopfschüttler inkubiert.
Danach wurden die Proben durch zwei weitere Waschschrite mit je 1 ml Tritonpuffer und
2-minütiger Zentrifugation bei 13 000 Upm von nicht gebundenen Proteinen befreit. Um die
Proben an die Puffer- bzw. Salzbedingungen des SDS-PAGE-Ladepuffers anzupassen und,
um das Triton vollständig zu entfernen, wurden sie mit 1 ml Äquilibrierungspuffer (25 mM
Tris/HCl pH 6.8) gewaschen. Nun wurde das Pellet in 20–25 µl SDS-PAGE-Ladepuffer
(siehe 5.1.5) aufgenommen, 5 min. gerüttelt und anschließend 7 min. bei 95°C denaturiert,
67
Methoden
um die Antigen-Antikörper-Komplexe von der Protein-A-Sepharose abzulösen. Durch
1-minütige Zentrifugation wurde die nicht auf das SDS-PAGE-Gel aufzutragende
Protein-A-Sepharose sedimentiert. Anschließend konnten die Antigen-Antikörper-Komplexe
abgenommen und auf ein SDS-PAGE-Gel aufgetragen werden.
5.3.9 Harnstoffdenaturierung in vitro synthetisierter Proteine
Zur vollständigen Entfaltung in vitro synthetisierter Proteine konnten diese mittels einer
Harnstoffbehandlung denaturiert werden.
Zur Entfaltung der Proteine wurden zu einem 10-fachen Syntheseansatz nach 30-minütiger
Inkubation bei 37°C zunächst 1/10 Volumen Puromycin für 5–10 min bei 37°C zugegeben.
Anschließend wurden diese Proben mit einem, dem Syntheseansatz entsprechenden
Volumen an 15%iger TCA für 1 h auf Eis gefällt (250 µl bei 10fachem Ansatz). Nach
10-minütiger Zentrifugation bei 13 000 Upm in der Tischzentrifuge „Biofuge pico“ und
Absaugen des Überstandes wurde das Pellet dreimal mit je 1 ml eiskaltem Aceton
gewaschen und nachfolgend 5 min. zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet für ca. 5
min. luftgetrocknet und schließlich unter Zugabe von 2 µl 0.5 M Tris (vor Gebrauch
hergestellt) und 25 µl 6 M Harnstoff für 5 min. auf dem Eppendorfmixer resuspendiert. Die
so in Harnstoff gelösten Proteine konnten in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei
–80°C gelagert werden.
Bei anschließenden in vitro Transportversuchen wurden die so behandelten, denaturierten
Proteine in einem Mix aus Kompensationspuffer, ATP-regenerierendem System sowie H2O
und je nach Fragestellung entsprechenden Komponenten (z.B. INV) 1:25 verdünnt und 30
min. bei 37°C inkubiert. Die weitere Vorgehensweise bis zur Sichtbarmachung der
Proteinbanden erfolgte in der herkömmlichen Art und Weise.
5.3.10 Proteinisolierung mit Ni+-NTA-Agarose
Proteine, die an ihrem C-terminalen Ende einen Hexa-His-Anhang (His-6-Tag) tragen,
konnten durch Interaktion mit Nickel-Ionen über Ni+-NTA-Agarose isoliert werden.
Hierzu wurden die Proteine zunächst in-vitro synthetisiert, eventuell einem Proteaseverdau
unterzogen und nach der Fällung mit 10%-igem TCA 45 Minuten auf Eis gestellt. Nach 10minütiger Zentrifugation bei 13 000 Upm in der Tischzentrifuge „Biofuge pico“ und
Absaugen des Überstandes wurde das Pellet einmal mit 1 ml eiskaltem Aceton gewaschen.
Methoden
68
Das Pellet wurde anschließend in 200µl Puffer B und 2µl 100mM PMSF-EtOH
aufgenommen.
Puffer B:
8M
Harnstoff
0,1M
NaH2PO4, pH 8
0,01M
Tris-HCl, pH 8
Von der Ni+-NTA-Agarose wurden 100µl bei 13 000 Upm in der Tischzentrifuge „Biofuge
pico“ 1-2 Minuten abzentrifugiert und der Ethanolüberstand entfernt. Nach einmaliger
Waschung mit Puffer B wurde die Ni+-NTA-Agarose in 100µl Puffer B aufgenommen und
kurz gevortext bevor das zuvor in Puffer B resuspendierte Proteinpellet (siehe oben)
hinzugefügt wurde. Im Anschluss wurde dieser Ansatz 1 Stunde bei 25ºC inkubiert und
zwischendurch immer wieder vorsichtig gevortext, um die Sedimentation der Ni+-NTAAgarose zu verhindern. Nach einem dreimaligen Waschschritt mit 1 ml Puffer B wurde das
Pellet in 20–25 µl SDS-PAGE-Ladepuffer (siehe 5.1.5) aufgenommen, 5 min. gerüttelt und
anschließend 5 min. bei 95°C denaturiert. Durch eine 5-minütigen Zentrifugation bei 13 000
Upm in der Tischzentrifuge „Biofuge pico“ konnte die Ni+-NTA-Agarose sedimentiert
werden, der Überstand wurde abgenommen und auf ein SDS-PAGE-Gel aufgetragen.
5.3.11 Gelfiltration
Um Proteine entsprechend ihres Molekulargewichts aufzutrennen wurde die Gelfiltration mit
einer Sepharose CL2B-Säule durchgeführt.
Vorbereitung der Sepharose CL2B-Säule:
Zur Vorbereitung der Sepharose CL2B-Säule wurde eine Quiagen Polyphorphyrene Säule
bis zur 1ml-Marke mit Sepharose CL2B aufgefüllt und eine Quiagen-Fritte über der
Sepharose angebracht. Die frisch hergestellte Säule wurde mit 5 ml Säulenpuffer gewaschen,
anschließend wurden 200µl 1%-iges BSA aufgetragen und danach ein weiteres Mal mit
1,5ml Säulenpuffer gewaschen.
69
Säulenpuffer:
Methoden
50mM
Triethanolaminacetat, pH 8.0
150mM
Kaliumacetat
10mM
Magnesiumacetat
1mM
DTT
Nach Vorbereitung der Säule wurden die zu analysierenden Proteine in-vitro synthetisiert
und anschließend 50µl Reaktionsansatz und 50µl Säulenpuffer entweder direkt auf die Säule
aufgetragen oder zuvor bei 4ºC 30 Minuten bei 40000Upm im Rotor TLA 100.2
zentrifugiert, um aggregiertes Material zu entfernen. Das Eluat (100µl) wurde in einem Epi
aufgefangen und mit 100µl 10%-iger TCA gefällt. Durch Auftragen von je 100µl
Säulepuffer und Auffangen des Eluats konnten weitere 11 Fraktionen gesammelt werden.
Nach 30-minütiger TCA-Fällung auf Eis konnten die Proben in üblicher Vorgehensweise auf
ein SDS-Gel aufgetragen werden.
5.3.12 SDS-PAGE und Autoradiographie
Die TCA-gefällten bzw. immunpräzipitierten und in SDS-PAGE-Ladepuffer denaturierten,
radioaktiv-markierten Proteine konnten mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach
ihrer Größe aufgetrennt und analysiert werden. Vorgefärbte Markerproteine mit bekanntem
Molekulargewicht wurden zur späteren Identifizierung der Molekulargewichte einzelner
Proteinbanden ebenfalls auf die Gele aufgetragen. Um die radioaktiv-markierten Proteine
sichtbar zu machen, wurden die Gele zunächst 30 min. mit Fixierlösung behandelt
(10% Essigsäure, 35% Ethanol), zur Entfernung der hygroskopischen Essigsäure
anschließend 15 min. gewässert und danach getrocknet. Zur Detektion der radioaktiven
Proteinbanden
diente
der
Phosphoimager
(Amersham/Molecular
Dynamics).
Quantifizierung der Banden erfolgte mittels des Programms Image Quant
Dynamics).
Die
(Molecular
Methoden
70
Transkription-Translationsreaktion im zellfreien System
Bestandteile: ▪Plasmid-DNA ▪CTF, Ribosomen, Initiationsfaktor 2/ bzw.S135
▪Nukleosidtriphosphate (NTP), ▪ATP-regenerierendes System, ▪T7-RNA-Polymerase,
▪Aminosäuren, 35S-Met, 35S-Cys
Je nach Fragestellung wurden hinzugefügt:
▪Inside-out-Innenmembranvesikel (INV, H-INV,Translokonmutanten)
▪aufgereinigte Translokationsfaktoren (SecA, SecB, Ffh, TF, FtsY, F1-ATPase)
▪DNA-Oligomere zur Synthese naszierender Ketten ▪10Sa-RNA-antisense-Oligonukleotid
30 min. Inkubation bei 37°C
Flotation
Quervernetzung mit DSS
►nicht transportierte
►Auftrennung über einen
►kovalente Bindung
Proteine werden von
Saccharosegradienten
zwischen interagierenden
Proteinase K verdaut.
in 5 Fraktionen
Proteinen
Translokation/
Integration
TCA-Fällung
TCA-Fällung
TCA-
Immun-
Fällung
präzipitation
SDS-Gelelektrophorese, Detektion mittels Autoradiographie
►Nachweis
►Nachweis von
►Nachweis von
erfolgreicher
Membranassoziation der
Protein-Protein-
Translokation
synthetisierten Proteine
Interaktionen
Abb. 5.3: Versuche zum bakteriellen Proteintransport im zellfreien System aus Escherichia coli.
71
Ergebnisse
6.
Ergebnisse
6.1
Das in vitro Transkriptions-Translationssystem
Zur Analyse der Sekretionsmechanismen von FHA und SepA wurde ein gekoppeltes
Transkriptions-Translationssytem verwendet.
Vorteil eines solchen in vitro Systems ist, dass einzelne Translokationsfaktoren vollständig
entfernt werden können, was in einem in vivo System nicht möglich wäre, da die meisten
Translokationsfaktoren sowohl des SRP-Weges als auch des SecA-Weges essentiell sind.
Zu den wesentlichen Komponenten dieses zellfreien Systems zählen ein subfraktionierter
cytosolischer E. coli-Extrakt (CTF, cytosolic translation factors), der zusammen mit
salzextrahierten Ribosomen und Initiationsfaktor 2 als rekonstituiertes System bezeichnet
wird (siehe 5.2.1.2). Plasmide, die die Gene des zu exprimierenden Proteins unter der
Kontrolle eines T7- Phagenpromotors enthalten, können in diesem rekonstituierten System
in Anwesenheit von T7-RNA-Polymerase, Nukleotiden, Aminosäuren und einem ATPregenerierenden System nach Zugabe von
35
S-Methionin und
35
S-Cystein in vitro
synthetisiert und gleichzeitig radioaktiv markiert werden. Die CTF ist weitestgehend frei von
allen bekannten Proteintranslokationsfaktoren wie SecA, SecB, Ffh und FtsY. Folglich
können die für den Transport eines bestimmten Proteins benötigten Faktoren identifiziert
werden, indem unter entsprechenden Versuchsanordnungen einzelne Translokations- und
Insertionsfaktoren selektiv zugegeben werden.
Alternativ zum rekonstituierten System kann auch ein nicht subfraktionierter Zellextrakt, der
sogenannte S135 verwendet werden (siehe 5.2.1.1). Im Gegensatz zur CTF enthält er alle
löslichen Komponenten eines E. coli-Extraktes. Eine explizite Zugabe einzelner
Translokations- und Insertionssysteme ist hier daher nur bedingt erforderlich. Sowohl für
FHA als auch für SepA stellte sich heraus, dass sich der S135 gegenüber der CTF durch eine
gesteigerte Syntheseleistung des in seiner vollen Länge synthetisierten Proteins auszeichnet,
während die Syntheseleistung von naszierenden Ketten im rekonstituierten System
effizienter ist.
Um die jeweiligen Vorteile beider Systeme nutzen zu können, wurde im Rahmen der
einzelnen Untersuchungen zu Zielsteuerungs- und Transportmechanismen von FHA und
SepA sowohl auf das rekonstituierte System als auch auf den S135 als transkriptionstranslationsaktiven Extrakt zurückgegriffen
Ergebnisse
6.2
72
Die Translokation von FHA und SepA in „Inside-out“
Innenmembranvesikel
6.2.1 Sowohl FHA, FHA∆ext als auch SepA werden effizient in „Inside-out“
Innenmembranvesikel transportiert
Zunächst sollte überprüft werden, ob das dem TPS Pathway zugehörige FHA und der
Autotransporter SepA effizient in Innenmembranvesikel aus E. coli transportiert werden
können.
FHA ist das reife, sezernierte Protein, das aus dem 367kDa Vorläuferprotein FhaB nach Nund C-terminaler Prozessierung hervorgeht. Auch bei SepA handelt es sich um das reife
Protein nach Abspaltung der N-terminalen Extension und Signalsequenz und der Cterminalen C-Domäne von dem 220kD Vorläufer pSepA. Da so große Proteine in vitro nicht
effizient synthetisiert werden können und in dieser Arbeit speziell Untersuchungen zum
Transport über die innere Bakterienmembran durchgeführt wurden, bei welchem die CDomäne keine Bedeutung besitzt, wurde in dieser Arbeit jeweils eine verkürzte Form von
FhaB, pFhaB*, und von pSepA, pSepA*, verwendet. pFhaB* besteht aus der 71
Aminosäuren langen N-terminalen Extension und Signalsequenz sowie den ersten 376
Aminosäuren der N-Domäne, pSepA* aus der 56 Aminosäuren langen N-terminalen
Extension und Signalsequenz sowie den ersten 147 Aminosäuren der N-Domäne. Durch
Abspaltung der N-terminalen Extension und Signalsequenz beim Innenmembrantransport
geht aus pFhaB* FhaB* und aus pSepA* SepA* hervor. Da die Signale zum Transport über
die innere Bakterienmembran am N-Terminus lokalisiert sind, kann davon ausgegangen
werden, dass sich das verkürzte FhaB* bzw. SepA* genauso wie die jeweiligen
Volllängenproteine, FHA und SepA verhalten.
A
N Ex + SS
B
N Ex + SS
C
N Ex + SS
C
N-Domäne
FhaB
C-Domäne
N-Domäne bis AS 447
pFhaB*
C
N-Domäne
C
pSepA
C-Domäne
D
N Ex + SS
N-Domäne bis AS 203
C
pSepA*
Abb. 6.1: Strukturmodelle von FhaB, pFhaB*, pSepA und pSepA*
pFhaB* (Abb. 6.1 B) besteht aus der 71 Aminosäuren langen N-terminalen Extension und
Signalsequenz sowie den ersten 376 Aminosäuren von FhaB (Abb. 6.1 A); pSepA* (Abb. 6.1 D)
besteht aus der 56 Aminosäuren langen N-terminalen Extension und Signalsequenz sowie den
ersten 147 Aminosäuren von pSepA (Abb. 6.1 C). Sowohl pFhaB* als auch pSepA* fehlt die in FhaB
bzw. pSepA vorhandene C-Domäne. (SS = Signalsequenz; Ex = N-terminale Extension)
73
Ergebnisse
Die Proteine wurden unter Verwendung des S135 in vitro in Ab- und Anwesenheit von
„Inside-out“-Innenmembranvesikeln (INV) synthetisiert und anschließend zur Überprüfung
einer erfolgten Translokation bzw. Integration in die INV einem Protease-Resistenz-Test
unterzogen (siehe 5.3.5). Die „Inside-out“-Innenmembranvesikel sind im Vergleich zu den
Verhältnissen in der E. coli-Zelle in ihrer Orientierung invertiert: die normalerweise nach
außen gerichtete periplasmatische Seite der Innenmembran zeigt hier nach innen, die
cytosolische Seite dagegen nach außen. Da die Innenmembranvesikel alle wesentlichen
Proteintranslokationsfaktoren
(SecA, Ffh und FtsY) enthielten, können infolgedessen
sekretorische Proteine durch die Innenmembran in die INV transloziert, polytope
Innenmembranproteine dagegen in die Lipidschicht der INV integriert werden. Um die
radioaktiv-markierten Proteine anschließend sichtbar zu machen, wurden sie mittels SDSGelelektrophorese aufgetrennt und durch ein autoradiographisches Verfahren detektiert.
+
INV
PK
+
+
+
pFhaB*
FhaB*
1
2
3
4
A
INV
PK
+
+
+
+
pSepA*
SepA*
1
B
INV
PK
2
3
4
+
+
+
+
pFhaB∆ext*
FhaB∆ext*
1
C
2
3
4
Abb. 6.2: Membrantransport von
pFhaB*, pSepA* und pFhaB∆ext* im
S135
Die Proteine pFhaB*, pSepA* und
pFhaB∆ext* wurden unter radioaktiver
Markierung mit 35S-Methionin und 35SCystein in einem in vitro TranskriptionsTranslationssystem synthetisiert. Dabei
fand
die
Synthese
jeweils
in
Abwesenheit (Spuren 1 und 2; Abb. A,
B und C) bzw. in Anwesenheit (Spuren
3 und 4; Abb. A, B und C) von INV statt.
Anschließend wurden je 23 µl der
Reaktionsansätze -/+ INV direkt mit
10%-iger TCA gefällt (Spuren 1 und 3)
und jeweils weitere 23 µl vor der TCAFällung zunächst mit Proteinase K (PK)
behandelt (Spuren 2 und 4). Mittels
SDS-Gelelektrophorese wurden die
Proteine
entsprechend
ihrem
Molekulargewicht aufgetrennt. Durch
ein autoradiographisches Verfahren
(Phosphorimaging)
konnten
die
radioaktiv-markierten Proteine sichtbar
gemacht werden.
pSepA* = präSepA* (SepA* mit SS +
Ex)
pFhaB* = präFhaB* (FhaB* mit SS +
Ex)
pFhaB∆ext* = präFhaB∆ext* (FhaB∆ext*
mit SS + Ex)
SS = Signalsequenz
Ex = N-terminale Extension
Ergebnisse
74
Abb. 6.2 A und 6.2 B zeigen einen Protease-Resistenztest für FhaB* und SepA*. Nach der
Synthese der Proteine wurde eine Hälfte der Reaktionsansätze direkt mit 10%-iger TCA
gefällt (Spuren 1 und 2), die andere Hälfte vor der TCA-Fällung einem Proteaseverdau mit
Proteinase K unterzogen (Spuren 3 und 4). Alle nicht transportierten Proteine wurden dabei
durch die Proteinase K proteolytisch abgebaut. Dagegen waren alle in die INV translozierten
Proteine vor Proteaseverdau geschützt.
In Abwesenheit von INV wurden FhaB* und SepA* nach Zugabe von Proteinase K
vollständig verdaut (Spuren 1 und 2). Wurden dem Syntheseansatz dagegen INV
hinzugefügt, enstanden für FhaB* nach dem Proteaseverdau zwei weitere, für SepA* sogar
vier weitere Banden niedrigeren Molekulargewichts (Spur 4).
In dieser Arbeit wurde zusätzlich mit FHA∆ext gearbeitet, dem die ersten 24 Aminosäuren
und damit die N-terminale Extension. Diese N-terminale Extension, die der Signalsequenz
am N-terminalen Proteinende vorausgeht, ist innerhalb einer bestimmten Klasse von TPSSubstraten und Autotransportern stark konserviert; ihr konnte bislang jedoch keine
besondere Funktion zugeschrieben werden. In vivo Experimente zeigten, dass sie für eine
effiziente Synthese und Sekretion von FHA nicht von Bedeutung war (Lambert-Buisine et
al., 1998). Ob ihr hinsichtlich einer Interaktion mit intra-cytoplasmatischen Chaperonen
bzw. Transportfaktoren oder beim Vorgang des Membrantargetings bzw. der Translokation
eine Bedeutung zukommt, sollte dadurch überprüft werden, dass in mehreren Experimenten
zum Innenmembrantransport das Verhalten von FHA∆ext mit dem von FHA verglichen
wurde. Zur Durchführung der in vitro Experimente wurde auch in diesem Fall mit einer
verkürzten Proteinform, FhaB∆ext*, gearbeitet. Hierbei handelt es sich um das reife Protein,
das aus dem 424 Aminosäuren langen Vorläuferprotein pFhaB*∆ext durch die beim
Innenmembrantransport stattfindende Abspaltung der N-terminalen 47 Aminosäuren
hervorgeht.
75
1
A
22
N Extension
Ergebnisse
71
447
Signalsequenz
C
N-Domäne bis AS 447
FhaB*
Signalpeptidase
25
N
B
71
Signalsequenz
447
C
N-Domäne bis AS 447
FhaB∆ext*
Abb. 6.3 Strukturmodelle von pFhaB* und pFha∆ext*
pFhaB* (Abb. 6.3 A) besteht aus der 49 Aminosäuren langen Signalsequenz, der am N-terminalen
Proteinende eine 22 Aminosäuren lange N-terminale Extension voraus geht, sowie den ersten 376
Aminosäuren der N-Domäne. Die Spaltungsstelle der Signalpeptidase befindet sich hinter der
Aminosäure 71; das bedeutet, dass beim Transport über die Innenmembran die N-terminale
Extension und die Signalsequenz gemeinsam abgespalten werden. pFhaB∆ext* (Abb. 6.3 B)
unterscheidet sich von pFhaB* lediglich dadurch, dass am N-Terminus die ersten 24 Aminosäuren
und damit die N-terminale Extension fehlen.
Abb. 6.2 C zeigt einen Protease-Resistenztest für FhaB∆ext*. In Anwesenheit von INV
liefert FhaB∆ext* (Abb. 6.2 C, Spur 4) nach Zugabe von PK wie FhaB* zwei PK-resistenten
Banden (Abb. 6.2 A, Spur 4). In Abwesenheit von INV wurden diese durch die Proteinase K
vollständig verdaut (Abb. 6.2 C, Spur 2). Vergleicht man die beiden PK-resistenten Banden
von FhaB* und FhaB∆ext* mit dem Laufverhalten des Molekularmarkers, dann verhalten
sich die Banden bei beiden Proteine gleich.
Dass es sich bei den proteaseresistenten Banden von FHA und SepA tatsächlich um
transloziertes Protein handelt, wurde im folgenden Experiment bestätigt. Hierzu wurde in
einem Kontrollansatz zusätzlich zur Proteinase-K noch Triton in einer finalen Konzentration
von
1%
zugesetzt.
Die
Tritonbehandlung
führt
zu
einer
Solubilisierung
der
Innenmembranvesikel, wodurch deren Inhalt der Protease zugänglich wird und verdaut
werden kann (5.3.5).
Ergebnisse
76
SepA*
FhaB*
Triton
+
+
+
INV
+
PK
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
pFhaB*
FhaB*
Zusätzliche Bande
nach INV Zugabe
pSepA*
SepA*
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12
Abb 6.4: Synthese und Membrantransport von FhaB* und SepA* unter Zugabe von Triton
FhaB* und SepA* wurden im S135 in Abwesenheit von INV (wie angegeben) und in Anwesenheit
von INV (wie angegeben) synthetisiert. Nach der Synthese wurde ein Reaktionsansatz (23 µl) der
verschiedenen Versuchsansätze direkt mit 10%-iger TCA gefällt (Spuren 1, 4, 7, 10), je ein weiterer
Reaktionsansatz (23µl) vor TCA-Fällung mit Proteinase K (PK) behandelt (Spuren 2, 5, 8, 11). Zu
einem dritten Reaktionsansatz (23 µl) wurde Triton in einer finalen Konzentration von 1% zugesetzt,
danach wurde der Ansatz mit Proteinase K behandelt und anschließend mit 10%-iger TCA gefällt
(Spuren 3, 6, 9, 12). Der Punkt markiert jene Proteinbande, die erst nach Zugabe von INV auftritt.
Abb. 6.4 zeigt einen Protease-Resistenz-Test für FhaB* und SepA* unter Zugabe von Triton.
Hierzu wurden FhaB* und SepA* zunächst in Abwesenheit von Vesikeln synthetisiert. Beim
anschließenden Verdau mit Proteinase K wurden beide Substrate vollständig verdaut (Spuren
2 und 8). Wurden die Reaktionsansätze vor dem Proteinase K- Verdau zusätzlich mit Triton
behandelt, dann werden die Substrate ebenfalls vollständig verdaut (Spuren 3 und 9). Bei
Zugabe von INV waren die bereits in Abb. 6.2 gezeigten proteaseresistenten Spezies zu
sehen, was bedeutet, dass beide Proteine in die INV hineintransportiert wurden (Spuren 5
und 11). Wurden diese Reaktionsansätze nun vor dem Proteinase K-Verdau zusätzlich mit
Triton behandelt, um die Vesikel zu solubilisieren und deren Inhalt der Proteinase K
zugänglich zu machen, dann wurden die Substrate vollständig verdaut (Spuren 6 und 12).
Die Tatsache, dass die bei INV Zugabe und PK Behandlung beobachteten Protease
geschützten Fragmente (Spuren 5 und 11) nach Solubilisierung der Vesikel verschwinden
77
Ergebnisse
(Spuren 6 und 12), spricht für einen effizienten Transport der Proteine in die
Innenmembranvesikel.
6.2.2 Das Auftreten von mehr als einer prozessierten Bande resultiert aus Nterminaler Proteolyse
Vergleicht man die Syntheseansätze von FHA und SepA in An- und Abwesenheit von INV
(Spuren 1 und 4 sowie Spuren 7 und 10), dann tritt in den Syntheseansätzen mit INV
(Spuren 4 und 10) eine zusätzliche Bande auf, die in der Abbildung durch einen kleinen
Punkt markiert wurde. Diese Bande kommt dadurch zustande, dass in Anwesenheit von INV
pFhaB* und pSepA* in die Vesikel hineintransportiert werden; da die INV
Signalpeptidaseaktivität besitzen, werden während dem Transport bei FhaB* die ersten 71,
bei SepA* die ersten 56 Aminosäuren abgespalten. Aus den Spaltungsvorgängen geht ein
Fragment hervor, das ein geringeres Molekulargewicht besitzt als pFhaB* bzw. pSepA* und
sich bei der Gelelektrophorese durch ein schnelleres Laufverhalten auszeichnet. Durch
Zugabe von Proteinase K wird jenes Material verdaut, was sich außerhalb der INV befindet;
in die INV integriertes oder transloziertes Material ist proteasegeschützt. Wurden pFhaB*
und pSepA* nach ihrer Synthese in Anwesenheit von INV mit PK behandelt, dann war diese
Bande, die aus dem Transport in die INV resultierte, erwartungsgemäß proteasegeschützt.
Im Falle von FhaB* trat zusätzlich zu dieser Bande eine weitere prozessierte Bande, im Falle
von SepA* traten sogar drei weitere prozessierte Banden auf (Spuren 5 und 11). Wie
kommen diese zusätzlichen Banden, die nur nach PK Verdau beobachtet werden, zustande?
Die „positive inside rule“ (von Heijne, 1986) besagt, dass die positive Ladung der N-Region
der Signalsequenz sekretorischer Proteine aufgrund der innen negativen Membranladung
nicht durch die Innenmembran hindurch transloziert werden kann; dies führt dazu, daß sich
die hydrophobe H-Region automatisch so in der Lipidschicht orientiert, dass die N-Region
auf der cytoplasmatischen Seite der Membran verbleibt, während der Rest des Proteins durch
das Translokon hindurch transloziert wird. Nach erfolgter Translokation wird die
Signalsequenz durch die Signalpeptidase abgespalten. Bei dem verwendeten in vitro System,
wurde jedoch immer wieder beobachtet, dass die Signalpeptidaseaktivität vermindert ist.
Folge davon ist, dass die Signalsequenz nicht abgespalten wird und die N-terminale
Extension ins Cytoplasma ragt, während das restliche Protein bereits in die INV
hineintransloziert wurde. Da der ins Cytoplasma ragende Teil der N-terminalen Extension
nicht proteasegeschützt ist, kann er bei Zugabe von PK abverdaut werden.
Ergebnisse
78
Die durch einen Pfeil markierte untere prozessierte Bande von FhaB* und SepA* (Spuren 5
und 11) entspricht jeweils dem vollständig in die INV translozierten Protein nach
Abspaltung der Signalsequenz. Die zusätzlichen durch Pfeile markierten PK-geschützten
Fragmente resultieren sehr wahrscheinlich aus N-terminaler Prozessierung des unvollständig
translozierten Proteins. Für diese Annahme spricht auch, dass die kleineren translozierten,
Proteinase K resistenten Banden von FHA∆ext (Abb. 1C, Spur 4) und FHA gleich groß sind.
Warum ein kleiner Teil der Vorläuferproteine pFhaB* und pSepA* teilweise überhaupt nicht
durch die Proteinase K angegriffen wurde (Spuren 5 und 11), ist unklar.
C
C
SS
SS
Signalpeptidase
N
Ex
N
Ex
C
C
C
N
SS
SS
SS
Ex
Ex
Proteinase K
A
B
C
Abb. 6.5: Modell zur
Erklärung des
Zustandekommens mehrerer
prozessierter Banden
Nach der Translokation des
Proteins gemäß der „positive
inside
rule“
wird
die
Signalsequenz (SS) durch die
Signalpeptidase abgespalten
(A). Ist die Aktivität der
Signalpeptidase vermindert, so
kann sich nach Zugabe von
Proteinase K die Molekülgröße
von pFhaB* um die Länge der
N-terminalen
Extesnion
verringern (B). Warum dies in
manchen Fällen ausbleibt (C)
ist unklar.
SS = Signalsequenz
Ex = N-terminale Extension
Dass es sich im Fall der beiden PK resistenten Fragmente von pFhaB* (Abb. 6.4, Spuren 5
und 11) tatsächlich um Peptide handelt, die sich in ihrer N-terminalen Sequenz
unterscheiden, wurde mit folgendem Experiment bestätigt.
Nach Durchführung eines Protease-Resistenz-Testes
wurden die Proteine mit Nickel-
Nitriltriessigsäure-Agarose (Ni+-NTA-Agarose) inkubiert. Ni+-NTA besitzt eine hohe
Affinität für den am C-terminalen Ende von FhaB* befindlichen Hexa-His-Anhang. Bleibt
das C-terminale Ende von FhaB* nach dem Transport in die Vesikel tatsächlich unversehrt,
dann lassen sich die Proteine mittels ihres His-6-Tags an die Ni+-NTA-Agarose binden und
isolieren (siehe 5.3.10).
79
INV
+
PK
Ni+-NTA
+
+
+
+
+
Ergebnisse
+
pFhaB*
FhaB*
1
2
3
4
5
Abb 6.6: Synthese und Membrantransport von FhaB* mit anschließender Isolierung von
pFhaB* und FhaB* mittels Ni+-NTA-Agarose
FhaB* wurde im S135 in Abwesenheit von INV (Spuren 1 und 2) und in Anwesenheit von INV
(Spuren 3, 4, 5) synthetisiert. Der einfache (23µl) Reaktionsansatz, in welchem die Proteine in
Abwesenheit von INV synthetisiert worden waren wurde mit 10%-iger TCA gefällt (Spur 1) und der
dreifache Reaktionsansatz (69µl), in welchem die Proteine in Abwesenheit von INV synthetisiert
worden waren, wurde nach Fällung mit 10%-iger TCA in einem Phosphatpuffer resuspendiert,
anschließend mit Ni+-NTA-Agarose inkubiert und nach mehreren Waschschritten wurde pFhaB*
isoliert (Spur 2). Von den Reaktionsansätzen, die in Anwesenheit von INV synthetisiertworden
waren, wurde ein einfacher Reaktionsansatz (23µl) direkt mit 10%-iger TCA gefällt (Spur 3), ein
weiterer einfacher Reaktionsansatz (23µl) wurde vor der TCA-Fällung mit Proteinase-K (Spur 4)
behandelt; der siebenfachen Ansatz (161µl) wurde nach PK-Behandlung, TCA-Fällung und
Resuspension in Phosphatpuffer mit Ni+-NTA-Agarose inkubiert, um nach mehreren Waschschritten
FhaB* zu isolieren (Spur 5).
Abb. 6.6 zeigt, wie das Vorläuferprotein pFhaB* (Spur 2) und transloziertes reifes FhaB*
nach einem Protease-Resistenztest mittels ihres C-terminalen His-6-Tag über Ni+-NTAAgarose isoliert werden konnten (Spur 5). Wird FhaB* nach der Synthese in Anwesenheit
von Vesikeln mit Proteinase-K behandelt, treten die beiden beschriebenen Proteinase-K
resistenten Banden auf (Spur 4). Beide PK-resistenten Banden konnten über Ni+-NTAAgarose isoliert werden (Spur 5).
Ergebnisse
6.3
80
Untersuchungen zum co- bzw. post-translationalen
Translokationsverhalten von FHA, FHA∆ext und SepA
6.3.1 Die Translokationseffizienz der Proteine ist größer bei co-translationaler
Zugabe von INV
Zwischen der SRP-abhängigen Integration von Innenmembranproteinen und dem SecAabhängigen Transport sekretorischer Proteine gibt es in Bakterien zahlreiche Unterschiede.
Das signal recognition particle (SRP) übernimmt die zentrale Rolle bei der Zielsteuerung
der Membranproteine, indem es schon während der Synthese des Proteins, also cotranslational, an dessen hydrophobe Signal-Anker-Sequenz bindet und den RibosomProteinkomplex zum Translokon führt. Dieser strikt co-translationalen Zielsteuerung der
Innenmembranproteine steht das post-translationale Targeting sekretorischer Proteine
gegenüber. Erst, wenn das Protein vollständig synthetisiert ist, erfolgt nach Ablösung des
Ribosoms die SecA-abhängige, post-translationale Zielsteuerung.
Im folgenden Versuch sollte daher die Translokationseffizienz von FHA, FHA∆ext und
SepA
bei
co-
und
post-translationaler
INV
Zugabe
untersucht
und
mit
der
Translokationseffizienz eines SRP abhängigen Innenmembranproteins sowie eines SecA
abhängigen sekretorischen Proteins verglichen werden.
Um Bedingungen zu schaffen, unter denen die Proteine nur post-translational transportiert
werden können, wurde die Proteinsynthese nach 30 Minuten durch Chloramphenicol
abgestoppt und anschließend INV und ein ATP regenerierendes System zugegeben (siehe
5.3.5). Damit ein co-translationaler Transport möglich war, mussten die Vesikel von Anfang
an bei der Synthese mit dabei sein. Durch den Vergleich der Translokations- bzw.
Integrationseffizienz eines Proteins unter co- bzw. post-translationalen Bedingungen kann
jedoch keine eindeutige Aussage darüber getroffen werden, ob ein Protein tatsächlich cooder post-translational transportiert wird (siehe 5.3.5). Ein ineffizienter Transport unter posttranslationalen Bedingungen bedeutet nicht, dass der Transport des entsprechenden Proteins
explizit co-translational ist. Als Kontrollproteine wurden in diesem Versuch erstmals das
SecA abhängige, post-translational transportierte, sekretorische outer membran Protein A
(OmpA) und das SRP abhängige, co-translational transportierte Innenmembranprotein MtlA
verwendet.
81
+
Co-transl. INV
+
+
+
Co-transl. INV
+
Post-transl. INV
PK
Ergebnisse
+
+
Post-transl. INV
+
PK
+
+
+
+
4
63
+
+
MtlA
pOmpA
OmpA
% Translokation
5
1
55
2
3
4
68
5
6
MtlA-MGF
% Integration
1
A
2
3
6
4
5
6
B
+
Co-transl. INV
+
Post-transl. INV
+
PK
+
+
+
Co-transl. INV
+
Post-transl. INV
+
PK
+
+
+
+
+
+
3
55
6
pFhaB∆ext*
pFhaB*
FhaB∆ext*
FhaB*
% Translokation
% Translokation
8
1
C
2
>100
3
4
26
5
1
2
3
4
5
6
6
D
Abb 6.7: Synthese und Membrantransport von OmpA, MtlA, FhaB* und FhaB∆ext* unter cound post-translationalen Bedingungen
OmpA, MtlA, FhaB* und FhaB∆ext* wurden im S135 in Abwesenheit von INV (Spuren 1 und 2) und
in Anwesenheit von INV (co-tranlationale Versuchsbedingungen) (Spuren 3 und 4) synthetisiert. Um
den Transport unter post-translationalen Versuchsbedingungen zu untersuchen (Spuren 5 und 6),
wurden die Proteine zunächst 30 Minuten lang in Abwesenheit von INV synthetisiert. Anschliessend
wurde die Proteinsynthese durch Zugabe von Chloramphenicol in einer finalen Konzentration von
30µg/ml gestoppt und dann erst wurden die INV zusammen mit einem ATP regenerierenden System
zugesetzt und mit dem synthetisierten Protein inkubiert. Jeweils ein Reaktionsansatz (23 µl) der
verschiedenen Versuchsansätze wurde direkt mit 10%-iger TCA gefällt (ungeradzahlige Spuren), je
ein weiterer Reaktionsansatz vor TCA-Fällung mit Proteinase K (PK) behandelt (geradzahlige
Spuren). Zur Bestimmung der Integrations- bzw. der Translokationseffizienz wurde die Radioaktivität
der einzelnen Proteinbanden mit Hilfe des Programms Image Quant ermittelt. Die
Translokationseffizienz von OmpA entspricht dabei dem Verhältnis der OmpA (reifes Protein nach
Abspaltung der Signalsequenz)- und pOmpA(Vorläuferprotein)-Banden nach Proteinase K-Verdau zu
den OmpA- und pOmpA-Banden vor Proteinase-K-Verdau. Die Integrationseffizienz von MtlA
entspricht dem Verhältnis von MtlA-MGF (MtlA-MembranGeschütztesFragment: nach Integration von
MtlA sind nur die Transmembrandomänen proteasegeschützt, die cytoplasmatischen Domänen von
MtlA werden durch die PK abverdaut) zu MtlA (Vorläuferprotein). Dieser Wert wurde mit dem Faktor
1.5 multipliziert, da MtlA-MGF durch Proteinase-K-Verdau nur noch 16 der ursprünglichen 24
Methionine von MtlA enthält und damit zwangsläufig eine reduzierte Radioaktivität aufweist. Die
Translokationseffizienz von FhaB* und FhaB∆ext* entspricht dem Verhältnis der beiden FhaB*
Banden niederen Molekulargewichts zu pFhaB*, die Translokationseffizienz von SepA* entpricht dem
Verhältnis der prozessierten SepA*-Banden zu pSepA*.
Für FhaB* wurde der Wert mit 7 multipliziert, da nach Proteinase-K Verdau nur noch eine der
ursprünglich sieben schwefelhaltigen Aminosäuren von pFhaB* übrig blieb. Bei FhaB∆ext* reduzierte
Ergebnisse
82
sich die Zahl der schwefelhaltigen Aminosäuren nach Proteinase-K Verdau von ursprünglich fünf auf
eine; hier wurde mit dem Korrekturfaktor fünf gerechnet. Bei SepA* reduzierte sich die Zahl der
schwefelhaltigen Aminosäuren nach Proteinase-K Verdau von ursprünglich sechs auf drei, korrigiert
wurde somit durch Multiplikation mit dem Faktor 2.
Signalpeptidase
N1
16
24
31
59
62
296
C
pFhaB*
Signalpeptidase
N1
10
28
103
141
177
C
pSepA*
Radioaktiv markierte schwefelhaltige Aminosäuren
Verkürzte N-Domäne
N-terminale Extension + Signalsequenz
Abb. 6.8: Verteilung der radioaktiv markierten schwefelhaltigen AS innerhalb von pFhaB* und
pSepA*
Beim Transport in INV und der damit verbundenen Abspaltung der Signalsequenz reduziert sich die
Anzahl der schwefelhaltigen Aminosäuren bei pFhaB* von ursprünglich sieben auf eine Aminosäure,
bei pSepA* von ursprünglich sechs auf drei Aminosäuren.
Abb. 6.7 zeigt die Synthese und den Membrantransport von OmpA, MtlA, FhaB* und
FhaB∆ext*
unter
INV
Zugabe
zu
Beginn
der
Synthese
(co-translationale
Versuchsbedingungen) sowie unter INV Zugabe nach 30 minütiger Synthese und
Chloramphenicolbehandlung (post-translationale Versuchsbedingungen).
In Abb. 6.7 A wurde dies zunächst für das sekretorische Protein outer membran Protein A
(OmpA) geprüft. Bei der Synthese in Abwesenheit von INV (Spur 1) war nur das
Vorläuferprotein präOmpA (pOmpA) zu sehen. Zugabe von Proteinase K zu diesem Ansatz
führte zum vollständigen Verdau von pOmpA (Spur 2). Wurden zu dem Ansatz allerdings
Innenmembranvesikel hinzugegeben, konnte man eine zweite starke Bande mit einem
geringeren Molekulargewicht beobachten (Spur 3). Diese Bande stellt das prozessierte, reife
OmpA dar, welches nach Abspaltung der Signalsequenz durch die Signalpeptidase
entstanden war. Dieses prozessierte OmpA war nach seinem Transport in die INV vor dem
Verdau durch die PK geschützt (Spur 4). Die Beobachtung, dass auch das Vorläuferprotein
pOmpA zu einem gewissen Teil durch die Proteinase K nicht verdaut werden konnte (Spur
4), zeigt sich regelmäßig bei in vitro-Experimenten mit E. coli-INV und wurde im Kapitel
6.2.2 näher erörtert.
83
Erwartungsgemäß
zeigte
sich
für
OmpA
Ergebnisse
kein
großer
Unterschied
in
der
Translokationseffizienz unter co- und post-translationalen Bedingungen; somit konnte
gezeigt werden, dass OmpA post-translational translozierbar ist (Abb. 6.7 A).
Ganz anders verhält sich dagegen das Innenmembranprotein MtlA, das strikt co-translational
in die Innemembran integriert wird (Abb. 6.7 B). MtlA wurde in Abwesenheit von INV nach
Zugabe der Proteinase K fast vollständig verdaut (Spuren 1 und 2; Abb. 6.7 B). Wurde die
Synthese in Anwesenheit von INV durchgeführt und damit ein Transport unter cotranslationalen
Bedingungen
ermöglicht,
entstand
nach
Proteinase-K-Verdau
ein
membrangeschütztes Proteinfragment MtlA-MGF (MtlA-MembranGeschütztesFragment)
(Spuren 3 und 4). Dieses membrangeschützte Fragment ist deutlich kleiner, weil sich nach
der Membranintegration von MtlA sowohl die amphiphile Helix als auch die C-terminale
Domäne der Mannitpermease im Cytosol bzw. auf der Außenseite der „Inside-out“Innenmembranvesikel befinden. Dadurch sind sie der Proteinase K zugänglich und können
abverdaut werden.
Unter post-translationalen Bedingungen, d.h. nach Beendigung der Proteinsynthese und
Ablösung des synthetisierten Proteins vom Ribosom, ist die Proteinintegration in die
Innenmembran allerdings kaum nachweisbar (Spur 6).
Wie man in Abb. 6.7 C sieht, verhält sich FhaB* wie MtlA; eine effiziente Translokation
findet nur dann statt, wenn das Protein in Anwesenheit von Vesikeln synthetisiert wird
(Spuren 3 und 4). Dieses Translokationsverhalten konnte auch für SepA* beobachtet werden
(ohne Abb.).
Unter rein post-translationalen Bedingungen kann auch für FhaB∆ext* (Abb. 6.7 D) keine
effiziente Translokation erreicht werden (Spuren 5 und 6). Das Fehlen der N-terminalen
Extension scheint also keinen Einfluss auf das Translokationsverhalten unter co- und posttranslationalen Bedingungen zu haben.
Die Tatsache, dass FHA, FHA∆ext und SepA nur bei co-translationaler Vesikelzugabe
effizient transloziert werden, lässt verschiedene Schlussfolgerungen zu. Einerseits könnte
dieses Ergebnis einen ersten Hinweis dafür liefern, dass FHA und SepA SRP-abhängig an
die Innenmembran gesteuert werden; andererseits kann aber auch eine Proteinaggregation,
die mit zunehmender Synthesedauer wahrscheinlicher wird, dafür verantwortlich sein, dass
FHA nur unter co-translationaler Vesikelzugabe effizient transloziert wird. Es sollte
deswegen
überprüft
werden,
ob
sich
frühzeitig
translokationsinkompetente
Ergebnisse
84
Faltungsintermediate bilden, die eine post-translationale Zielsteuerung und Translokation
unmöglich machen.
6.3.2 Auch durch Harnstoffdenaturierung und durch Zugabe von
Hitzeschockproteinen konnte die Effizienz des Proteintransportes unter
post-translationalen Bedingungen nicht verbessert werden
Um zu prüfen, ob eine vorzeitige Faltung von FHA einen hemmenden Einfluss auf die
Translokation in INV hat, wurde in vitro synthetisiertes FHA mit Harnstoff entfaltet (siehe
5.2.2). Nach Ausverdünnung des Harnstoffs wurden die so behandelten Proteine in An- und
Abwesenheit von INV einem Protease-Resistenz-Test unterzogen.
A
OmpA
+
Co-transl. INV
H-OmpA
+
+
Post-transl. INV
+
PK
+
+
+
+
+
+
pOmpA
OmpA
% Translokation
5
1
57
2
3
B
4
57
5
6
48
7
FhaB*
+
Co-transl. INV
H-FhaB*
+
+
Post-transl. INV
+
PK
8
+
+
+
+
+
+
pFhaB*
FhaB*
% Translokation
6
1
2
>100
3
4
14
5
6
18
7
8
Abb. 6.9: Synthese und Membrantransport von FhaB* und OmpA unter co- und posttranslationalen Bedingungen sowie post-translational nach Proteinentfaltung durch Harnstoff.
OmpA und FhaB* wurden im S135 in Abwesenheit von INV (Spuren 1 und 2) und in Anwesenheit
von INV (unter co-translationalen Bedingungen) (Spuren 3 und 4) synthetisiert. Um den Transport
unter post-translationalen Versuchsbedingungen zu untersuchen (Spuren 5 und 6), wurden die
Proteine zunächst 30 Minuten lang in Abwesenheit von INV synthetisiert. Anschliessend wurde die
Proteinsynthese durch Zugabe von Chloramphenicol in einer finalen Konzentration von 30µg/ml
gestoppt und dann erst wurden die INV zusammen mit einem ATP regenerierenden System
zugesetzt und mit dem synthetisierten Protein inkubiert. Um die Proteine post-translational nach
Proteinentfaltung durch Harnstoff zu transportieren (Spuren 7 und 8), wurden diese zunächst in
85
Ergebnisse
Abwesenheit von INV synthetisiert und die Synthese anschließend mit Puromycin in einer finalen
Konzentration von 1.1mM abgestoppt, bevor die Proteinfällung mit 15%-iger TCA erfolgte. Das
durch Zentrifugation gewonne Pellet wurde in 6M Harnstoff resuspendiert und das hierdurch
entfaltete Protein einem Reaktionsansatz zugesetzt, in dem INV, alle notwendigen
Translokationsfaktoren und ein ATP-regenerierendes
System enthalten waren. Die
Endkonzentration von Harnstoff in diesem System betrug 480mM.
Ein Reaktionsansatz (23 µl) der verschiedenen Versuchsansätze wurde direkt mit 10%-iger TCA
gefällt (ungeradzahlige Spuren), je ein weiterer Reaktionsansatz vor TCA-Fällung mit Proteinase K
(PK) behandelt (geradzahlige Spuren). Zur Bestimmung der Integrations- bzw. der
Translokationseffizienz wurde die Radioaktivität der einzelnen Proteinbanden mit Hilfe des
Programms Image Quant ermittelt.
Abb. 6.9 A zeigt einen Protease-Resistenztest für OmpA, das in Anwesenheit von INV (cotranslationale Bedingungen; Spuren 3 und 4) synthetisiert wurde sowie in Abwesenheit von
INV, die erst nach 30 minütiger Synthese und anschließender Chloramphenicolbehandlung
dazugegeben wurden (post-translationale Bedingungen; Spuren 5 und 6); zusätzlich ist in
Abb. 6.9 A ein Proteaseresistenztest dargestellt, in welchem der post-translationale Transport
nach Proteinentfaltung durch Harnstoff untersucht wurde (Spuren 7 und 8). Die
Translokationseffizienz ist in allen Reaktionsansätzen gleich, was bedeutet, dass OmpA
unter co-translationalen genauso gut wie unter post-translationalen Bedingungen
transportiert werden kann. Dass weiterhin die Translokationsrate unter post-translationalen
Bedingungen ähnlich der Translokationsrate nach Harnstoffentfaltung ist, bedeutet, dass
OmpA wahrscheinlich im Cytoplasma in keinen translokationsinkompetenten Zustand
übergeht und daher keine Entfaltung durch Harnstoff nötig ist, um eine effiziente
Translokation unter post-translationalen Bedingiungen zu ermöglichen.
Im Gegensatz zu OmpA ist für FhaB* (Abb. 6.9 B) nach Harnstoffdenaturierung kein posttranslationaler Transport möglich. Dieses Ergebnis zeigt, dass eine vorzeitige Faltung von
FHA in translokationsinkompetente Faltungsintermediate für die beobachtete geringe
Translokationseffizienz
des
Proteins
unter
post-translationalen
Bedingungen
eher
unwahrscheinlich ist oder, dass durch Harnstoff keine vollständige Entfaltung von FHA
erreicht werden kann.
Als weitere Erklärungsmöglichkeit kommt in Betracht, dass sich das Protein in 6M Harnstoff
zunächst
entfaltet,
Harnstoffkonzentration
dass
auf
es
bei
480mM
der
jedoch
anschließenden
wieder
in
Ausverdünnung
den
Zustand
der
eines
translokationsinkompetenten Intermediates zurückfaltet. Es stellt sich daher die Frage, ob
bestimmte Chaperone wie Dnak, DnaJ, GrpE oder SecB notwendig sind, um das Protein
nach seiner Synthese solange in einem ungefalteten Zustand zu halten, bis durch die Bindung
von SecA die post-translationale Zielsteuerung eingeleitet wird. Hierzu wurde FhaB* in
Anwesenheit verschiedener Chaperone sowohl unter post-translationaler INV Zugabe als
Ergebnisse
86
auch nach Proteinentfaltung durch Harnstoff transportiert. Anschließend wurden die
verschiedenen
Reaktionsansätze
einem
Protease-Resistenztest
unterzogen,
um
die
Translokationseffizienz zu bestimmen. Als Chaperone wurden SecB, Dnak, DnaJ und GrpE
eingesetzt (Versuchsergebnisse nicht abgebildet). Auch in Anwesenheit dieser Chaperone
konnte FHA nicht post-translational transloziert werden.
Für SepA und für FHA∆ext wurden diese Experimente ebenfalls durchgeführt. Beide
Proteine
zeigten
ein
Translokationsverhalten,
das
dem
von
FHA
entspricht
(Versuchsergebnisse nicht abgebildet).
6.3.3 Eine vorzeitige Proteinaggregation verhindert möglicherweise, dass FHA
unter post-translationalen Bedingungen translozierbar ist
Für einen SRP abhängigen, co-translationalen Transport würde einerseits die Tatsache
sprechen, dass FHA nur unter co-translationalen Bedingungen effizient transportiert werden
kann, andererseits die Tatsache, dass ein post-translationaler Transport auch dann nicht
möglich ist, wenn durch vorausgehende Harnstoffdenaturierung die Bildung eines
translokationsinkompetenten Faltungsintermediates verhindert wurde. Durch die bisher
gezeigten Experimente kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass FHA mit
zunehmender Synthesedauer Aggregate bildet, die nicht mehr transportiert werden können.
Diese Fragestellung ist Gegenstand des folgenden Experimentes.
Durch eine sich an die Synthese anschließende 30 minütige Ultrazentrifugation bei 40.000
Umdrehungen pro Minute sollte aggregiertes Material in der Pelletfraktion von nicht
aggregiertem Material im löslichen Überstand getrennt werden. Der lösliche Überstand
wurde anschließend auf eine Sepharose CL2B-Säule geladen und einer Gelfiltration (siehe
5.3.11) unterzogen (Abb. 6.10 A), in der die Proteine entsprechend ihrem Molekulargewicht
aufgetrennt wurden. Vergleichend wurde ein nicht zentrifugierter Syntheseansatz durch
Gelfiltration analysiert (Abb. 6.10 B). Größere Moleküle, wie beispielsweise aggregierte
Proteinkomplexe, wandern schneller durch die Sepharose Säule und finden sich somit in
früheren Fraktionen als kleinere Moleküle, wie beispielsweise lösliches, nicht aggregiertes
Protein. Sollte während der Synthese Protein aggregieren, müsste es in den vorderen
und/oder mittleren Fraktionen nach Gelfiltration des nicht zentrifugierten Ansatzes auftreten,
nicht jedoch nach Zentrifugation. In dem zentrifugierten Ansatz sollte nur noch kleineres
Material vorhanden sein, das entsprechend in den hinteren Fraktionen eluiert wird.
87
Fraktionen aus Gelfiltration
1
2
3
Ergebnisse
4
5
6
7
8
9 10
pFhaB*
A
% eluiertes FhaB nach Zentrifugation
0
0
0
0
0
6
26
41
21
6
pFhaB*
B
0
% eluiertes FhaB vor Zentifugation
C
0
0
6
39
9
8
17
9
1
% des gesamten FhaB*
Gelfiltration Sepharose CL2B
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
B
A
0
5
10
Fraction
Abb. 6.10: Gelfiltration zum Nachweis einer Aggregation von pFhaB*
pFhaB* wurde zunächst in einem S135 synthetisiert. Danach wurde eine Hälfte (50µl) des
Reaktionsansatzes einer 30 minütigen Ultrazentrifugation bei 40.000 Upm unterzogen. Das Pellet mit
dem aggregierten Protein wurde anschließend verworfen, der lösliche Überstand (50µl) mit dem nicht
aggregierten Proteinanteil (Abb. 6.10 A) sowie die andere, nicht zentrifugierte Hälfte (50µl) des
Reaktionsansatzes (Abb. 6.10 B) wurden zusammen mit 50 µl Eluierungspuffer auf eine Sepharose
CL2B Säule aufgetragen. Anschließend wurden 10 Fraktionen á 100 µl eluiert, die mit 10% iger TCA
gefällt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht wurden. Zur Bestimmung der Menge an pFhaB*
in jeder, durch Gelfiltration gewonnenen Fraktion wurde die Radioaktivität der einzelnen
Proteinbanden mit Hilfe des Programms Image Quant ermittelt und der prozentuale Anteil von
pFhaB* in den einzelnen Fraktionen errechnet.
In Abb. 6.10 C wurde der prozentuale Anteil von pFhaB* der einzelnen Fraktionen graphisch
ermittelt
Die Ergebnisse der Gelfiltration sind in Abb. 6.10 dargestellt. Wurde pFhaB* direkt im
Anschluss an die Proteinsynthese der Gelfiltration unterzogen (Abb. 6.10 B, 6.10 C:
pFhaB*), dann befand sich das meiste Material nach der Elution in den Fraktionen 4 bis 7
(Abb. 6.10 B) und nur ein geringer Anteil in den hinteren Fraktionen 8 bis 10 (Abb. 6.10 B).
Da es sich bei dem Material der Fraktionen 4 bis 7 um höhermolekulares, vermutlich
aggregiertes pFhaB* handelt, bei dem Material der Fraktionen 8 bis 10 um
niedermolekulares, d.h. lösliches pFhaB*, liegen annäherend 50% des Proteins nach der
Synthese in aggregierter Form vor, was den deutlichen Transportdefekt unter posttranslationalen Bedingungen erklären würde. Durch die Zentrifugation nach der
Proteinsynthese und vor der Gelfiltration (Abb. 6.10 A, 6.10 C: A) kann das aggregierte
Material in der Pelletfraktion angereichert werden, während das nicht aggregierte Material
im löslichen Überstand verbleibt. Wird dieser lösliche Überstand im Anschluss an die
Ergebnisse
88
Zentrifugation der Gelfiltration unterzogen und mit den Ergebnissen der Gelfiltration des
nicht zentrifugierten Ansatzes verglichen, dann zeigt sich, dass der größte Teil des Materials
in den Fraktionen 8 bis 10 zu finden war, in denen sich das niedermolekulare, nicht
aggregierte Material anreichert.
Durch dieses Experiment konnte also gezeigt werden, dass FHA im Laufe der
Proteinsynthese zunehmend aggregiert und daher unter post-translationalen Bedingungen
nicht mehr translozierbar ist. Die erhöhte Translokationseffizienz bei co-translationaler
Vesikelzugabe ist daher kein eindeutiger Beweis für einen SRP abhängigen Transport,
schließt diesen jedoch nicht aus.
6.3.4 Kürzere Ketten von FHA aggregieren im Cytoplasma nicht und können
somit post-translational transportiert werden
Zur Durchführung des folgenden Versuches war die Herstellung von Ribosomen assoziierten
naszierenden Ketten von FhaB* notwendig, die im rekonstituierten System mittels einer
nach Haeuptle (Haeuptle et al., 1986) modifizierten Methode (Behrmann et al., 1998)
synthetisiert wurden (siehe 5.3.3). Diese Methode ermöglichte es, die Translation an einer
bestimmten Stelle zu arretieren und eine Population naszierender Ketten mit definierter
Länge zu synthetisieren. Dem Syntheseansatz wurden DNA-Oligonukleotide hinzugegeben,
deren Sequenz zu ausgewählten Stellen der mRNA des zu synthetisierenden Proteins
komplementär war. Im Rahmen der Transkriptions-Translationsreaktion hybridisieren diese
DNA-Oligonukleotide mit der mRNA. Die Hybridisierungsstelle des Oligonukleotids wird
dabei stromaufwärts des Stop-Codons gewählt. Die endogene Endonuklease RNaseH
erkennt spezifisch DNA-mRNA-Hybride und verdaut den hybridisierten mRNA-Teil.
Dadurch entsteht eine verkürzte mRNA, die an Ihrem 3`-Ende kein Stopp-Codon mehr
enthält. Damit kann am Ende der Translation keine Freisetzung der Polypeptidkette vom
Ribosom erfolgen und es entsteht eine ribosomenassoziierte naszierende Kette definierter
Länge. Imitiert wurde somit eine Momentaufnahme einer Polypeptidkette in statu nascendi.
Bei der Synthese von naszierenden Ketten wird auch immer ein Teil des Proteins in voller
Länge synthetisiert, was vielerlei Gründe haben kann: denkbar ist beispielsweise, dass nicht
alle Oligonukleotide von der wachsenden mRNA erkannt werden, dass gebildete Hydride
aus Oligonukleotid und mRNA instabil sind oder von der RNaseH nicht in jedem Fall
gespalten werden.
89
T7 Promotor
Plasmid
Ergebnisse
komplementäres
AUG DNA Oligonukleotid
UGA
Transkription
5'
3'
5'
mRNA
Verdau durch
endogene
RNaseH
3'
AUG
AUG
Translation
5'
5'
3'
verkürzte mRNA
ribosomenassoziierte
naszierende Kette
definierter Länge
Abb. 6.11: Synthese ribosomenassoziierter naszierender Ketten (RANCs)
Dem Transkriptions-Translationsansatz werden komplementäre DNA-Oligonukleotide hinzugegeben,
die mit der mRNA hybridisieren. Die endogene RNaseH erkennt diese Hybride und verdaut den
hybridisierten mRNA-Teil. Dadurch entsteht eine verkürzte mRNA, die an ihrem 3´-Ende kein StopCodon mehr trägt. Dies bedeutet, dass am Ende der Translationsreaktion das Ribosom die
Polypeptidkette nicht freisetzen kann (Abb. modifiziert nach Beck, 2000).
AUG = Start-Kodon
UGA = Stop-Kodon
Die Synthese naszierender Ketten in einem rekonstituierten System
musste zunächst
etabliert werden. Nach Austitration der zu verwendenden Oligonukleotidmenge und der
Mg2+-Konzentration konnten verschieden lange naszierende Ketten von FhaB* synthetisiert
werden. Für das folgende Experiment wurden Ketten von FhaB* verwendet, die 305
Aminosäuren lang waren und als FhaB*-305 bezeichnte wurden.
Bei der Synthese der naszierenden Ketten FhaB*-305 wurden INV nach 5 Minuten und
somit co-translational sowie nach Puromycinbehandlung der synthetisierten naszierenden
Ketten hinzugefügt. Die Puromycinbehandlung führt zu einer Ablösung der naszierenden
Kette vom Ribosom und erlaubt ihr dadurch, post-translational durch die Membran hindurch
transloziert zu werden. Da bei der Synthese von naszierenden Ketten auch immer ein Teil
des Proteins in voller Länge synthetisiert wird, konnte der Transport von abgelösten
naszierenden Ketten (RANCs) und von Protein in voller Länge parallel unter co- und posttranslationalen Bedingungen verglichen werden.
Ergebnisse
90
INV nach 30min + Puromycinbehandlung
INV nach 5min
+
+
PK
+
+
+
+
>100
6
64
34
pFhaB*
FhaB*
pFhaB-305*
FhaB-305*
% Translokation von FhaB*
% Translokation von FhaB-305*
1
2
3
4
Abb. 6.12: Naszierende Ketten können nach Ablösung vom Ribosom auch unter posttranslationalen Bedingungen transportiert werden
FhaB*-305 und pFhaB* wurden im rekonstituierten System in Anwesenheit von INV (Spuren 1 und 2)
und in Abwesenheit von INV (Spuren 3 und 4) synthetisiert. Den Reaktionsansätzen, in denen
FhaB*-305 und pFhaB* in Abwesenheit von INV synthetisiert worden waren, wurden die Vesikel erst
nach 30-minütiger Synthese und anschließender Behandlung mit Puromycin in einer finalen
Konzentration von 0,88mM hinzugefügt. Danach wurde jeweils ein Reaktionsansatz (23 µl) der
verschiedenen Versuchsansätze direkt mit 10%-iger TCA gefällt (ungeradzahlige Spuren), je ein
weiterer Reaktionsansatz vor TCA-Fällung mit Proteinase K (PK) behandelt (geradzahlige Spuren).
Zur Bestimmung der Integrations- bzw. der Translokationseffizienz wurde die Radioaktivität der
einzelnen Proteinbanden mit Hilfe des Programms Image Quant ermittelt.
Abb. 6.12 zeigt einen Protease-Resistenztest, in dem untersucht wurde, wie sich kürzere
pFhaB* Ketten bzw. vom Ribosom abgelöste FhaB*-305 Ketten verglichen mit dem ca.
50kD großen pFhaB* verhalten, wenn Vesikel co-translational bzw. post-translational
zugegeben werden. Werden die Vesikel co-translational zugegeben, dann ist sowohl die
Translokation von vom Ribosom abgelösten FhaB*-305-Ketten als auch jene von pFhaB*
effizient (Spuren 1 und 2), während nach 30-minütiger Zugabe von INV nur noch vom
Ribosom abgelöstes FhaB*-305 transloziert werden kann (Spuren 3 und 4). Dass die
kürzeren,
vom
Ribosom
abgelösten
FhaB*-305-Ketten
unter
post-translationalen
Bedingungen transportiert werden konnten, pFhaB* jedoch nur unter co-translationalen
Bedingungen, bedeutet, dass die zuvor in Kapitel 3.3 beschriebene Aggregation
wahrscheinlich in Abhängigkeit von der Kettenlänge auftritt. Das 30 kD große FhaB*-305
aggregiert scheinbar nicht so stark wie das 45 kD große pFhaB* und kann somit auch posttranslational transportiert werden.
91
6.4
Ergebnisse
Untersuchungen zur SecA- bzw. SRP- Abhängigkeit der
Proteintranslokation von FHA und SepA
6.4.1 Untersuchungen mit Translokon-Mutanten deuten auf eine SecAAbhängigkeit von FHA und SepA hin
In den folgenden Experimenten sollten nun die Faktoren analysiert werden, die für den
Innenmembrantransport von FHA und SepA benötigt werden.
Obwohl sekretorische Proteine einem SecA-abhängigen, post-translationalen und integrale
Innenmembranproteine einem SRP abhängigen, co-translationalen Innenmembrantargeting
unterliegen, benutzten sowohl sekretorische Proteine als auch Innenmembranproteine die
gleiche Membranpore, das SecYEG-Translokon (Koch et al., 1999). Allerdings wird SecG
nur für die Translokation SecA abhängiger Proteine benötigt. Die Zugehörigkeit eines
exportierten Proteins zu einem der beiden Transportwege lässt sich nun durch die Sensitivität
gegenüber bestimmter SecYEG Mutanten bestimmen. In den folgenden Protease-ResistenzTests kamen deswegen Innenmembranvesikel von vier verschiedenen Mutantenstämmen
zum Einsatz.
A
WT
INV
+
PK
SecY 39
secY 205
+
+
+
SecE
SecG
+
+
OmpA
pOmpA
% Translokation
2
1
B
2
60
3
4
WT
INV
+
PK
3
5
6
SecY 39
+
3
7
4
8
9
secY 205
+
10
SecE
+
1
11
12
SecG
+
+
MtlA
MtlA-MGF
% Integration
3
1
2
53
3
4
25
5
6
26
7
8
4
9
10
26
11
12
Ergebnisse
C
92
WT
INV
+
PK
SecY 39
+
secY 205
+
SecE
+
SecG
+
+
pFhaB*
FhaB*
% Translokation
20
1
D
>100
2
3
WT
INV
PK
12
4
5
20
6
7
8
SecY 39
secY 205
+
+
+
+
<1
22
<1
24
9
12
10
SecE
11
12
SecG
+
+
pSepA*
SepA*
% Translokation
1
2
3
4
5
6
3
7
8
4
9
10
<1
11
12
Abb. 6.13 Gegenüber unterschiedlichen Sec-Mutanten verhalten sich FhaB* und SepA* wie
das SecA-abhängige, sekretorische Protein OmpA.
pOmpA, MtlA, pFhaB* und pSepA* wurden im S135 in Abwesenheit von INV (Spuren 1und 2; Abb.
A, B, C und D), in Anwesenheit von Wildtyp-INV (wie angegeben) und in Anwesenheit verschiedener
Translokonmutanten (Mutanten-INV) synthetisiert. Als Translokonmutanten wurden bei den
Experimentansätzen A, B, C und D jeweils Vesikel aus den secY39- (Spuren 5 und 6), secY205(Spuren 7 und 8), secE- (Spuren 9 und 10), sowie secG-Stämmen (Spuren 11 und 12) verwendet.
Nach der Synthese wurde jeweils ein Reaktionsansatz (23 µl) der verschiedenen Versuchsansätze
direkt mit 10%-iger TCA gefällt (ungeradzahlige Spuren), je ein weiterer Reaktionsansatz vor TCAFällung mit Proteinase K (PK) behandelt (geradzahlige Spuren). Zur Bestimmung der Translokationsbzw. der Integrationseffizienz wurde die Radioaktivität der einzelnen Proteinbanden mit Hilfe des
Programms Image Quant ermittelt.
Zunächst wurde die Translokationseffizienz von pOmpA und die Integrationseffizienz von
MtlA in den unterschiedlichen Mutantenvesikeln untersucht.
In der secY39-Mutante (Spuren 5 und 6; Abb. A, B, C, D) ist die Aminosäure Arginin durch
Histidin in der fünften cytoplasmatischen Domäne von SecY ausgetauscht. Hier sind
sekretorische Proteine stark, Innenmembranproteine nur geringfügig betroffen. Unter
Verwendung dieser Mutante war für OmpA kein Transport in INV feststellbar (Spur 6; Abb.
A), wohingegen die Integrationseffizienz von MtlA reduziert, nicht aber aufgehoben war
(Spur 6; Abb. B).
Die secY205-Mutante (Spuren 7 und 8; Abb. A, B, C, D) unterscheidet sich vom Wildtyp
durch einen Aspartat-Tyrosin-Austausch in der sechsten C-terminalen, cytoplasmatischen
Domäne. Die biochemische Charakterisierung dieser Mutante ergab, dass die vorliegende
Punktmutation spezifisch die funktionelle Interaktion zwischen SecY und SecA verhindert
(Matsumoto et al., 1997). Dadurch wird die Translokation sekretorischer Proteine blockiert,
93
Ergebnisse
während die Integration polytoper Innenmembranproteine nicht beeinflusst wird, da diese als
SRP-abhängige Proteine nicht auf eine funktionelle SecA-SecY-Interaktion angewiesen sind
(Koch und Müller, 2000). So war die Translokation des SecA-abhängigen OmpA in der
secY205-Mutante fast vollständig blockiert (Spur 8; Abb. A), während die SRP-abhängige
Mannitpermease effizient integriert werden konnte (Spur 8; Abb. B).
SecE ist ebenfalls eine Komponente der Translokationspore. Die Aufgabe von SecE scheint
in der Stabilisierung von SecY zu liegen, welches durch die Anwesenheit von SecE vor
einem Verdau durch die membrangebundene Protease FtsH geschützt wird (Akiyama et al.,
1996). Außerdem scheint SecE an einer Oligomerisierung von SecYEG-Komplexen beteiligt
zu sein (Kaufmann et al., 1999). Bei Versuchen mit Membranvesikeln aus secEDepletionsstämmen (Spuren 9 und 10; Abb. A, B, C, D) zeigt sich ein Translokationsdefekt
sekretorischer Proteine und auch ein Integrationsdefekt von Innenmembranproteinen.
Sowohl OmpA (Spur 10, Abb. A) als auch MtlA (Spur 10; Abb B) waren unter Verwendung
der secE-Mutante in ihrer Translokations- bzw. Integrationseffizienz stark beeinträchtigt.
SecG als weitere Komponente der Translokationspore ist nur bei niederen Temperaturen
oder in Abwesenheit des Protonengradienten für E. coli essentiell. Während der
Proteintranslokation
unterstützt
es
den
Insertions-Deinsertionszyklus
von
SecA.
Dementsprechend wird bei der Verwendung von Membranvesikeln aus einer secGDeletionsmutante (Spuren 11 und 12; Abb. A, B, C, D) die Translokation sekretorischer
Proteine blockiert. Die Integrationseffizienz von Innenmembranproteinen ist hier nicht
betroffen (Koch und Müller, 2000).
Zusammenfassend lässt sich festhalten: SecA-abhängige Proteine wie OmpA sind in ihrer
Translokationseffizienz bei Verwendung der secY205-, secY39-, secG- und auch secEMutantenvesikel im Vergleich zu Wildtypvesikeln beeinträchtigt. Die Integration von SRPabhängigen Proteinen wie MtlA ist dagegen nur bei Verwendung der secE-Mutantenvesikel
wesentlich gestört.
In einem identischen Versuchsaufbau war die Translokationseffizienz von FhaB* und SepA*
sowohl bei Verwendung der secY39-, secY205-, secE- als auch der secG- Mutante (Spuren 6,
8, 10 und 12; Abb. 6.13 C und D) im Vergleich zu Wildtyp-INV (Spur 2; Abb.C und D)
stark beeinträchtigt. Die SecA Abhängigkeit von FHA und SepA wurde insbesondere durch
den Translokationsdefekt beider Proteine bei Verwendung der secY205-Mutante bewiesen
(Abb. 6.13 C und 6.13 D, Spur 7 und 8) und durch die Verwendung der secG Mutante (Abb.
6.13 C und 6.13 D, Spur 11 und 12) bestätigt. Dass beide Proteine zur Translokation ein
intaktes SecYEG Translokon benötigen, wurde durch die Versuche mit secE-Mutanten (Abb.
Ergebnisse
94
6.13 C und 6.13 D, Spur 9 und 10) bewiesen und durch jene mit secY39 (Abb. 6.13 C und
6.13 D, Spur 5 und 6) bestätigt.
6.4.2 Für eine effiziente Translokation von FHA und FHA∆ext in
harnstoffbehandelte Vesikel genügen SecA, SecB und die F1-Untereinheit
der F1F0-ATPase, während sich SepA auch bei zusätzlicher Zugabe von
Ffh und FtsY nicht translozieren lässt
In Abb. 6.2 und 6.7 wurde bereits gezeigt, dass FHA, FHA∆ext und SepA in „Inside-out“Innenmembranvesikel (INV) transloziert werden können. Da die INV Targetingfaktoren
(SecA, Ffh und FtsY) in ausreichenden Mengen enthalten, geht aus diesem Versuch jedoch
nicht hervor, welche Targetingfaktoren hierfür tatsächlich nötig sind. Dies sollte im
folgenden Versuch durch die Verwendung von harnstoffgewaschenen Vesikeln (HINV)
getestet werden (siehe 5.2.2). Durch die Behandlung mit 6 M Harnstoff werden die
Targetingfaktoren SecA, Ffh und FtsY entfernt. Auch das verwendete zellfreie
Transkriptions-Translations-System ist weitestgehend frei von diesen Targetingfaktoren
(Koch et al., 1999).
A
INV
+
SecA, SecB, F1
+
PK
INV
HINV
+
+
+
+
B
HINV
+
FtsY, Ffh
PK
+
+
+
+
87
24
50
MtlA
pOmpA
OmpA
2
% Translokation
1
2
62
3
4
10
5
6
50
7
8
MtlA-MGF
% Integration
9 10
11 12 13 14
95
Ergebnisse
INV
HINV
+
+
SecA, SecB, F1
+
FtsY, Ffh
+
PK
C
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
pFhaB*
FhaB*
FhaB*
% Translokation
D
6
9
>100
7
>100
pFhaB∆ext*
FhaB∆ext*
FhaB∆ext*
% Translokation
E
55
4
77
21
>100
18
99
1
65
1
6
1
6
pSepA*
SepA*
% Translokation
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Abb. 6.14: FhaB* und FhaB∆ext* benötigen für ihre Translokation in harnstoffgewaschene
Innenmembranvesikel (HINV) nur SecA, SecB und die F1-ATPase, SepA* ist weder durch
Zugabe von SecA, SecB und die F1-ATPase noch durch SRP und FtsY translozierbar
OmpA (Abb. 6.14 A) wurde in Abwesenheit von Innenmembranvesikeln (Spuren 1 und 2), OmpA
(Abb. 6.14 A) und MtlA (Abb. 6.14 B) wurden in Anwesenheit von INV (Spuren 3 und 4) oder in
Anwesenheit von HINV (Spuren 5 - 14) im S135 synthetisiert. Außerdem wurden entsprechend der
Beschriftung SecA, SecB, F1-ATPase, Ffh und FtsY bei der Synthese zugegeben. FhaB* (Abb. 6.14
C), FhaB∆ext* (Abb. 6.14 D) und SepA* (Abb. 6.14 E) wurden im rekonstituierten System (CTF) in
Abwesenheit von Innenmembranvesikeln (Spuren 1 und 2), in Anwesenheit von INV (Spuren 3 und
4) oder in Anwesenheit von HINV (Spuren 5 – 12) synthetisiert. Entsprechend der Beschriftung
wurden auch hier SecA, SecB, F1-ATPase, Ffh und FtsY zugegeben. Anschließend wurde jeweils ein
Reaktionsansatz (23 µl) direkt mit TCA gefällt (ungeradzahlige Spuren), ein weiterer Reaktionsansatz
wurde zuvor mit Proteinase K (PK) behandelt (geradzahlige Spuren). Zur Bestimmung der
Translokations- bzw. Integrationseffizienz wurde die Radioaktivität in den einzelnen Proteinbanden
mit Hilfe des Programmes Image Quant ermittelt.
Im
Rahmen
eines
Protease-Resistenztests
wurden
zunächst
das
SRP-abhängige
Kontrollprotein MtlA und das SecA-abhängige Protein OmpA untersucht (Abb. 6.14 A und
6.14 B). Nach Zugabe von INV und anschließendem Verdau mit Proteinase K wurden die
bereits in Abb. 6.7 erwähnten proteaseresistenten Spezies beobachtet, die für beide Substrate
eine erfolgreiche Translokation bzw. Integration anzeigen (Spuren 3, 4, 9, 10). Durch
Verwendung von harnstoffgewaschenen Vesikeln (HINV) wurde der Transport beider
Substrate stark reduziert (Spuren 5, 6, 11, 12). Vermutlich ist die immer noch bestehende
geringe Translokations- bzw. Intergrationsrate einerseits darauf zurückzuführen, dass der
S135 Translokationsfaktoren in geringen Mengen enthält und andererseits darauf, dass bei
der Harnstoffbehandlung der Vesikel ein kleiner Teil der Translokationsfaktoren nicht
entfernt wurde. Entsprechend früheren Ergebnissen (Koch et al., 1999) konnte die
Ergebnisse
96
Translokation von OmpA durch SecA, SecB und die F1-Untereinheit der F1F0-ATPase
wiederhergestellt werden (Spuren 7 und 8), während die Integration von MtlA von der
Zugabe der SRP-Komponente Ffh und des SRP-Rezeptors FtsY abhängig war (Spuren 13
und 14).
Der Protease-Resistenztest für FhaB*, FhaB∆ext* und SepA* (Abb. 6.14 C, 6.14 D, 6.14 E)
wurde in einem rekonstituierten System durchführt, das im Gegensatz zum S135 frei von
Translokationsfaktoren ist. Die drei Proteine wurden zunächst in der Abwesenheit von
Vesikeln synthetisiert. Bei dem anschließenden Verdau mit Proteinase K wurden alle drei
Substrate fast vollständig verdaut (Spuren 1 und 2). Nach der Zugabe von INV hingegen
wurden die bereits in Abb.6.4 gezeigten proteaseresistenten Spezies beobachtet, die für alle
drei Substrate eine erfolgreiche Translokation anzeigen (Spuren 3 und 4). Durch die
Verwendung der harnstoffgewaschenen Vesikel (HINV) wurde der Transport aller drei
Substrate stark beeinträchtigt (Spuren 5 und 6). Die Zugabe von Ffh und FtsY führte zu
keiner gesteigerten Translokationseffizienz für FhaB* und FhaB∆ext* (Abb 6.14 C und 6.14
D, Spur 9 und 10). Eine vollständige Stimulierung ihrer Translokation konnte allerdings
durch die Zugabe von SecA, SecB und der F1-Untereinheit der F1F0-ATPase erreicht werden
(Abb. 6.14 C und 6.14 D, Spur 7 und 8). Die gleichzeitige Zugabe von Ffh und FtsY führte
zu keiner weiteren Steigerung der Translokationseffizienz beider Proteine.
Diese Ergebnisse demonstrieren, dass FHA und FHA∆ext in einer SecA/SecB/F1-ATPase
abhängigen Reaktion über die Innenmembran von E. coli transportiert werden und bestätigt
die in Kapitel 6.4.1 vorgestellten Untersuchungen mit Translokonmutanten. Weder für FHA
noch für FHA∆ext wurden Hinweise auf eine Beteiligung von Ffh oder FtsY gefunden.
Im Gegensatz zu FhaB* und FhaB∆ext* konnte SepA* nach Zugabe aller hier aufgeführten
Translokationsfaktoren nicht effizient in harnstoffbehandelte Vesikel transloziert werden
(Abb. 6.14 E, Spuren 7 bis 12). Eine mögliche Schlussfolgerung ist, dass die Translokation
von SepA von weiteren unbekannten Translokationsfaktoren abhängig sein könnte, die in
diesen Ansätzen nicht substituiert wurden, nachdem sie durch die Harnstoffbehandlung der
Vesikel entfernt worden waren.
97
Ergebnisse
6.4.3 In vitro benötigen sowohl FHA als auch FHA∆ext das Transportspezifische Chaperon SecB
Mit Hilfe eines Protease-Resistenztests unter Verwendung von Harnstoffvesikeln sollte die
SecB Abhängigkeit von FHA und FHA∆ext untersucht werden.
INV
HINV
SecA, F1
+
+
SecB
PK
A
+
+
+
+
+
+
+
+
+
pFhaB*
FhaB*
FhaB*
%Translokation
B
4
84
5
20
45
FhaB∆ext*
pFhaB∆ext*
FhaB∆ext*
%Translokation
4
1
2
85
3
4
7
5
6
40
7
8
99
9
10
Abb. 6.15: Die Translokation von FhaB* und FhaB∆ext* in harnstoffgewaschene Vesikel ist
SecB abhängig
FhaB* (Abb. 6.15 A) und FhaB∆ext* (Abb. 6.15 B) wurden im rekonstituierten System (CTF) in
Abwesenheit von Innenmembranvesikeln (Spuren 1 und 2), in Anwesenheit von INV (Spuren 3 und
4) oder in Anwesenheit von HINV (Spuren 5 – 10) synthetisiert. Entsprechend der Beschriftung
wurden auch hier SecA, SecB und F1-ATPase zugegeben. Anschließend wurde jeweils ein
Reaktionsansatz (23 µl) direkt mit 10%-iger TCA gefällt (ungeradzahlige Spuren), ein weiterer
Reaktionsansatz wurde zuvor mit Proteinase K (PK) behandelt (geradzahlige Spuren). Zur
Bestimmung der Translokations- bzw. Integrationseffizienz wurde die Radioaktivität in den einzelnen
Proteinbanden mit Hilfe des Programmes Image Quant ermittelt.
Durch Verwendung von harnstoffgewaschenen Vesikeln (HINV) wurde der Transport beider
Substrate stark reduziert (Spuren 5 und 6). Nach alleiniger Zugabe von SecA und der F1Untereinheit der F1F0-ATPase konnte der Transportdefekt nur mäßig aufgehoben werden
(Spuren
7
und
8),
während
sich
bei
zusätzlicher
Zugabe
von
SecB
die
Translokationseffizienz verdoppelte (Spuren 9 und 10). Das bedeutet, dass sowohl in An- als
auch in Abwesenheit der N-terminalen Extension SecB zwingend für eine effiziente
Translokation benötigt wird.
Zusammenfassend zeigen die Protease-Resistenztests eine SecA- und SecB-abhängige
Translokation von FHA durch die innere Bakterienmembran; eine effiziente Translokation
Ergebnisse
98
findet auch in Abwesenheit von Ffh und FtsY statt. Interessant ist weiterhin der Befund, dass
sich FHA hinsichtlich seiner Abhängigkeit von bestimmten Translokationsfaktoren wie
FHA∆ext verhält. Die N-terminale Extension scheint für den Vorgang der Translokation
durch die innere Bakterienmembran in vitro keine besondere Rolle zu spielen.
6.5.
Quervernetzung von naszierenden Ketten von FHA und FHA∆ext
mit cytosolischen Komponenten
6.5.1 Die Quervernetzung erfolgte mit zwei verschiedenen
Quervernetzungsreagenzien
Es gibt eine Proteingruppe, die für ein effizientes Targeting an die Innenmembran SRP, für
die Innenmembrantranslokation selbst SecA benötigt. Zu dieser Proteingruppe gehört
Momp2, für welches beobachtet werden konnte, dass in Abwesenheit von Ffh und FtsY ein
Innenmembrantransport auch alleine durch SecA erreicht werden kann (Neumann-Haefelin
et al., 2000). Es sollte daher eine mögliche zusätzliche Beteiligung von SRP an der
Translokation von FHA, FHA∆ext und SepA nachgeprüft werden.
Da SRP seine Substrate co-translational und damit vor Beendigung der Proteinsynthese
erkennt, musste hierzu mit ribosomenassoziierten, naszierenden Ketten von FhaB*,
FhaB∆ext* und SepA* gearbeitet werden, die im rekonstituierten System mittels der in
Kapitel 6.3.4 beschriebenen modifizierten Methode nach Haeuptle (Haeuptle et al., 1986;
Behrmann et al., 1998) synthetisiert wurden. Durch die Arretierung der Translation an einer
bestimmten Stelle konnte eine Population naszierender Ketten definierter Länge synthetisiert
werden. Mit Hilfe eines chemischen Quervernetzungsreagenzes sollten Interaktionen
zwischen naszierender Kette und Bindungspartnern nachgewiesen werden.
Zur Quervernetzung wurden naszierende Ketten von FhaB* und FhaB∆ext* verwendet, die
100 und 135 Aminosäuren lang waren und als FhaB*-100 und FhaB∆ext*-100 bzw. FhaB*135 und FhaB∆ext*-135 bezeichnet wurden; für SepA* wurden Ketten verwendet, die 106
Aminosäuren lang waren und somit als SepA*-106 bezeichnet wurden.
Im Anschluss an ihre Synthese konnten in vitro synthetisierte, ribosomenassoziierte
naszierende Ketten mit Hilfe verschiedener Quervernetzungsreagenzien kovalent mit
möglichen Bindungspartnern verknüpft werden.
Als Quervernetzungsreagenzien wurden DSS (Disuccinimidylsuberat) (siehe 5.3.7) und
MBS (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester) (siehe 5.3.7) verwendet. DSS
99
Ergebnisse
steht in den FhaB*-100-RANCs und FhaB*-135-RANCs nur die primäre Aminogruppe des
Startermethionins zur Quervernetzung zur Verfügung, während MBS zusätzlich mit den
Sulfhydrilgruppen der Cysteine reagieren kann. Die Cysteine befinden sich alle innerhalb
des Signalpeptids zwischen N-terminaler Extension und dem hydrophoben Kern an Stelle
24, 31 sowie am Ende des hydrophoben Kern an Stelle 62 (Abb. 6.16).
N 1
24
N-terminale Extension
N 1
24
N-terminale Extension
31
62
CC
FhaB*-100-RANC
Signalsequenz
31
CC
62
Signalsequenz
Reifer Proteinteil
Primäre Aminogruppe, die durch DSS und MBS quervernetzt wird
SH-Gruppe, die durch MBS quervernetzt wird
FhaB*-135-RANC
Abb. 6.16 Darstellung
der durch MBS und DSS
quervernetzbaren Gruppen
in FhaB*-135-RANCs und
FhaB*-100-RANCs
DSS steht nur die
primäre Aminogruppe des
Startermethionins
zur Quervernetzung zur
Verfügung, während MBS
zusäzlich mit den
Sulfhydrylgruppen der
Cysteine reagieren kann. Die
Cysteine befinden sich alle
innerhalb des Signalpeptids
an Stelle 24, 31 und 62.
6.5.2 Kurze Ketten von FHA und von FHA∆ext werden am Ribosom von SRP,
lange Ketten von Trigger Factor erkannt
Frühere Untersuchungen zeigten, dass ribosomenassoziierte naszierende Ketten (RANCs)
des polytopen Innenmembranproteins MtlA von SRP nicht jedoch von dem Ribosomen
assoziierten Chaperon Trigger Factor gebunden werden. SRP bindet dabei mindestens an
die erste Signal-Anker-Sequenz von MtlA (Beck et al., 2000). RANCs des sekretorischen
Proteins OmpA werden hingegen von Trigger Factor gebunden, während SRP diese nicht
effizient bindet (Beck et al., 2000) und nur sehr kurze Ketten von OmpA erkennt (Eisner et
al., 2003). Dabei bindet Trigger Factor zunächst an den reifen Teil von OmpA und
interagiert erst später mit der Signalsequenz. Diese Interaktion zwischen Trigger Factor und
der Signalsequenz sekretorischer Proteine ist vermutlich dafür verantwortlich, dass SRP
nicht an diese binden kann (Eisner et al., 2003).
Es sollte zunächst untersucht werden, ob naszierende Ketten von FhaB* und FhaB∆ext* mit
SRP oder mit Trigger Factor interagieren. Verwendet wurden FhaB*-100- bzw. FhaB*-135RANCs. Da die Polypeptidkette am Ende der Translation nicht freigesetzt wird, bleiben etwa
die letzten 30 synthetisierten Aminosäuren im Peptidtunnel des Ribosoms verborgen (siehe
Ergebnisse
100
Abb. 6.17). Das bedeutet, dass bei FhaB*-100 nur etwa die ersten 70 Aminosäuren, die der
Signalsequenz mit N-terminaler Extension entsprechen, dem Quervernetzungsreagenz und
den Bindungspartnern zugänglich sind (Abb. 6.17 B). Bei FhaB*-135 befinden sich ungefähr
die ersten 105 Aminosäuren, d.h. die N-terminale Extension, die Signalsequenz und ein Teil
der N-Domäne, außerhalb des ribosomalen Ausgangstunnels (Abb. 6.17 A). Für FhaB∆ext*
wurden die gleichen DNA-Oligonukleotide verwendet, die naszierenden Ketten wurden
entsprechend als FhaB∆ext*-100 bzw. FhaB∆ext*-135 bezeichnet. Im Unterschied zu den
naszierenden Ketten von FhaB* waren sie jedoch kürzer, da ihnen die 24 Aminosäuren lange
N-terminale Extension fehlte.
A
25AS
46AS
FhaB*-135-RANC
64AS
N
C
B
25AS
N
46AS
30AS
FhaB*-100-RANC
C
N-terminale Extension
Signalsequenz
N-Domaine
Abb. 6.17 Modell der FhaB*-100- und der FhaB*-135-RANCs
Sowohl bei den FhaB*-100 RANCs (Abb. 6.17 B) als auch bei den FhaB*-135-RANCs (Abb. 6.17 A)
sind die zuletzt synthetisierten 30 Aminosäuren im Ausgangstunnel des Ribosoms verborgen. Bei
FhaB*-100 befinden sich nur die ersten 71 Aminosäuren außerhalb des Ribosoms; diese bestehen
aus der Signalsequenz und der N-terminalen Extension. Bei FhaB*-135 befinden sich ungefähr die
ersten 105 Aminosäuren, d.h. die N-terminale Extension, die Signalsequenz und 46 Aminosäuren
der N-Domäne, außerhalb des ribosomalen Ausgangstunnels. Im Gegensatz zu FhaB*-135-RANCs
ist bei FhaB*-100-RANCs der reife Proteinteil bzw. die N-Domäne Bindungspartnern bzw.
Quervernetzungsreagenzien nicht zugänglich.
101
A
Ergebnisse
FhaB*-100
INV
FhaB*-135
+
+
Puromycin
MBS
+
+
+
+
+
+
+
+
IPα
+
+
+
+
+
+
+
+
TF Ffh
+
+
TF
Ffh
xTF
xFfh
75
50
pFhaB*
37
15
FhaB*-135
FhaB*-100
1
2
B
3
4
5
6
7
8
9
FhaB∆ext*-100
+
INV
MBS
+
+
11
12
13
14
FhaB∆ext*-135
+
Puromycin
10
+
+
+
+
+
+
IPα
+
+
+
+
+
+
+
+
TF Ffh
+
+
TF Ffh
xTF
xFfh
75
50
pFhaB∆ex*t
37
15
FhaB∆ext*-135
FhaB∆ext*-100
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Abb. 6.18: Kurze Ketten von FhaB* und FhaB∆ext* werden am Ribosom von Ffh, lange Ketten
von Trigger Factor erkannt
FhaB*-100-RANCs bzw. FhaB*-135-RANCs (Abb. 6.18 A) sowie FhaB∆ext*-100-RANCs bzw.
FhaB∆ext*-135-RANCs (Abb. 6.18 B) wurden im rekonstituierten System synthetisiert. Über ein
20%-iges Saccharosekissen wurden die naszierenden Ketten durch eine 60 minütige
Ultrazentrifugation bei 70.000 Upm isoliert. Das Pellet aus Ribosomen und naszierenden Ketten
wurde in einem DTT- freien Puffer resuspendiert und anschließend zu einem Reaktionsansatz
hinzugefügt, in welchem ein ATP-regenerierendes System (siehe 5.3.7), CTP, GTP, UTP sowie
S135 und Ffh enthalten waren, um alle Translokationsfaktoren in ausreichender Konzentration
Ergebnisse
102
anzubieten. Je einer dieser Ansätze (23µl) wurde direkt mit 10%-iger TCA gefällt (Spuren 1 und 8),
ein weiterer (23µl) mit MBS quervernetzt und anschließend durch TCA gefällt (Spuren 2 und 9);
jeweils vierfache Reaktionsansätze wurden mit MBS quervernetzt und anschließend mit anti-Ffh(Spuren 7 und 14) bzw. anti-Trigger-Faktor-Antikörpern (Spuren 6 und 13) immunpräzipitiert.
Bestimmten Ansätzen wurden wahlweise INV hinzugefügt (Spuren 3, 5, 10, 12), weitere Ansätze
wurden vor der Quervernetzung mit Puromycin in einer finalen Konzentration von 0.88mM behandelt
(Spuren 4, 5, 11, 12). Die Quervernetzungs- bzw. Immunpräzipitationsprodukte von Trigger Factor
bzw. Ffh sind mit einem Punkt bzw. einem Stern gekennzeichnet.
TF = Trigger Factor
Abb. 6.18 zeigt das Verhalten verschieden langer naszierender Polypeptidketten von FhaB*
(Abb. 6.18 A) und FhaB∆ext* (Abb. 6.18 B). Wurden FhaB*-100-RANCs (Abb. 6.18 A,
Spuren 1 bis 7), bei denen gerade die N-terminale Extension und die Signalsequenz aus dem
Ausgangskanal des Ribosoms herausschauten, mit MBS quervernetzt, dann waren zwei
Quervernetzungsbanden sichtbar (Abb. 6.18 A, Spur 2). Das kleinere, ca. 62 kDa große
Quervernetzungsprodukt (Stern) konnte duch Immunpräzipitation als Ffh identifiziert
werden (Abb. 6.18 A, Spur 7). Bei Verwendung von Puromycin verschwand das
Quervernetzungsprodukt aus Ffh und der naszierenden Kette von FhaB*-100 (Abb. 6.18 A,
Spur 4), was darauf hinweist, dass die Interaktion zwischen der Signalsequenz von FHA
und Ffh nur in Zusammenhang mit einer Ribosomenbindung auftritt. Auch die Anwesenheit
von INV führte zum Verschwinden des besagten Quervernetzungsproduktes (Abb. 6.18 A,
Spur 3), was für ein SRP vermitteltes Targeting von FhaB-100*-RANCs an die
Innenmembran spricht. Das größere Quervernetzungsprodukt (Punkt) reagierte in der
Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen Trigger Factor (Abb. 6.18 A, Spur 6). Während
dieses Quervernetzungsprodukt zwischen FhaB*-100 und ribosomenassoziierten Trigger
Factor ebenfalls nach Puromycinbehandlung verschwand (Abb. 6.18 A, Spur 4), war es auch
dann noch nachweisbar, wenn INV hinzugefügt wurden (Abb. 6.18 A, Spur 3). Im
Gegensatz zu Ffh, unterlag die Population an naszierenden Ketten, die mit Trigger Factor
reagierte, keinem Targeting an die Membranvesikel. Folglich wird nur ein Teil der in vitro
synthetisierten naszierenden Ketten von Ffh erkannt.
Wurden die naszierenden Ketten von FhaB* um 35 Aminosäuren verlängert (FhaB*-135;
Abb. 6.18 A, Spuren 8 bis 14), veränderte sich die Situation deutlich. Zugunsten eines
starken Quervernetzungsproduktes zwischen Trigger Factor und der naszierenden Kette
FhaB-135* (Abb. 6.18 A, Spur 9, 10 und 13) verschwand ein Quervernetzungsprodukt mit
Ffh vollständig (Abb. 6.18 A, Spur 9 und 14). Vermutlich werden mit zunehmender Länge
der naszierenden Kette von FhaB* weitere Trigger Factor Bindestellen exponiert und Ffh,
das spezifisch die Signalsequenz erkennt, aus der Bindung verdrängt. Folglich konnten nur
sehr kurze naszierende Ketten mit SRP interagieren, während Trigger Factor unter den
103
Ergebnisse
vorgegebenen experimentellen Bedingungen bevorzugt an solche Proteinteile bindet, die
hinter der Erkennungsstelle der Signalpeptidase liegen.
Quervernetzungsexperimente wurden weiterhin mit ribosomenassoziierten, naszierenden
Ketten von FhaB*∆ext ausgeführt (Abb. 6.18 B). Diese naszierenden Ketten zeigten quasi
das gleiche Quervernetzungsverhalten wie jene von FhaB* mit der Ausnahme, dass ein
kleiner Teil der längeren naszierenden Ketten von FhaB∆ext*, FhaB∆ext-135*, mit Ffh
interagieren konnte (Abb. 6.18 B, Spur 9 und 14). Für diese Beobachtung ist allerdings
wahrscheinlich die Abwesenheit der ersten 24 Aminosäuren verantwortlich, die bewirkt,
dass die naszierenden Ketten FhaB∆ext*-135 nur geringfügig länger sind als die
naszierenden Ketten FhaB*-100. Interaktionen mit Trigger Factor traten wieder verstärkt bei
der längeren Kette auf und waren sensitiv gegenüber der Behandlung mit Puromycin (Abb.
6.18 B, Spur 4, 5, 11 und 12); sie waren jedoch unbeeinflusst von der Zugabe von INV
(Abb. 6.18 B, Spur 3 und 10). Das qualitativ gleichwertige Verhalten von FHA und
FHA∆ext macht eine Beteiligung der N-terminalen Extension an der Erkennung von SRP
und Trigger Factor sehr unwahrscheinlich.
Dass mit zunehmender Kettenlänge die Intensität der Quervernetzungsbanden zwischen
naszierenden Ketten und Trigger Factor zunimmt, wurde ebenfalls für SepA beobachtet
(ohne Abb.).
6.5.3 Eine zellinterne Kompetition zwischen Ffh und Trigger Factor um die
Bindung naszierender Ketten existiert offensichtlich nicht
Im vorausgehenden Kapitel wurde gezeigt, dass nur sehr kurze naszierende Ketten von
FhaB* mit SRP interagieren, während Trigger Factor unter den vorgegebenen
experimentellen Bedingungen bevorzugt Bindestellen im reifen Teil erkennt. Die Ergebnisse
bestätigen aber auch frühere Befunde (Eisner et al., 2003), nach denen mit steigender
Kettenlänge Trigger Factor auch mit Bindestellen in der Signalsequenz interagiert, sodass
SRP aus der Bindung der Signalsequenz verdrängt wird.
Im folgenden Experiment sollte daher überprüft werden, ob die Ab- oder Anwesenheit von
Trigger Factor das Bindeverhalten von Ffh an naszierende Ketten beeinflusst. Hierzu
wurden die naszierenden Ketten FhaB*-100 und FhaB*-135 im rekonstituierten System aus
dem Trigger-Factor-freien E. coli-Stamm MC4100∆tig synthetisiert und anschließend mit
DSS quervernetzt.
Ergebnisse
104
FhaB*-100
MC4100
+
DSS
+
IPα
FhaB*-135
MC4100 ∆tig
+
+
+
MC4100
+
Ffh
+
+
Ffh
MC4100 ∆tig
+
+
Ffh
+
+
Ffh
xTF
xFfh
75
50
pFhaB*
37
25
15
FhaB*-135
FhaB*-100
1
A
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
5
6
7
8
B
Abb. 6.19: In einem Trigger Factor freien System lässt sich keine Steigerung der Interaktion
zwischen naszierenden Ketten von FhaB* und Ffh nachweisen
FhaB*-100-RANCs (Abb. 6.19 A) und FhaB*-135 RANCs (Abb. 6.19 B) wurden in Anwesenheit von
Ffh jeweils in einem rekonstituierten System (CTF) aus dem Trigger-Factor-depletierten E. coliStamm MC4100 ∆tig synthetisiert (Spuren 5 - 8) und zu Vergleichszwecken zusätzlich in einem
rekonstituierten System aus E. coli-Stamm MC4100 (Spuren 1 – 4). Im Anschluss an die Synthese
wurde jeweils ein Reaktionansatz (23µl) direkt mit 10%-iger TCA gefällt (Spuren 1 und 5), ein
weiterer Reaktionsansatz (23µl) wurde mit DSS quervernetzt und anschließend mit 10%-iger TCA
gefällt (Spuren 2 und 6). Ein achtfacher Ansatz (184µl) wurde ebenfalls mit DSS quervernetzt und
anschließend zur Anreicherung des Quervernetzungsproduktes aus naszierender Polypeptidkette
und Bindungspartner einem 60 minütigen Ultrazentrifugationsschritt über ein Saccharosekissen
unterzogen. Das Quervernetzungsprodukt im Pellet wurde in 160µl CTF-Puffer resuspendiert, wovon
50µl direkt mit 10%-iger TCA gefällt wurden (Spuren 3 und 7) und die restlichen 110µl mit anti-FfhAntikörpern immunpräzipitiert wurden (Spuren 4 und 8). Die Quervernetzungs- bzw.
Immunpräzipitationsprodukte von Trigger Factor bzw. Ffh sind mit einem Kreuz bzw. einem Stern
gekennzeichnet.
TF = Trigger Factor
Für FhaB*-100 war swohl in An- als auch in Abwesenheit von Trigger Factor eine
Interaktion mit SRP zu beobachten; unter Trigger Factor depletierten Bedingungen
verstärkte sich diese Interaktion mit Ffh jedoch nicht (Abb. 6.19 A, Spuren 2, 3, 4, 6, 7, 8).
Für FhaB*-135-RANCs konnte weder in An- noch in Abwesenheit eine Interaktion mit Ffh
beobachtet werden (Abb. 6.19 B, Spuren 6, 7 und 8). War Trigger Factor nicht depletiert
erschien dagegen als DSS-Quervernetzungsprodukt eine prominente Doppelbande (Spuren 2
und 3), die auch in weiteren Quervernetzungsexperimenten von FHA, FHA∆ext und SepA
auftrat und mit einem spezifischen Antiserum gegen Trigger Factor immunpräzipitiert
105
Ergebnisse
werden konnte (ohne Abb.). Das Auftreten einer Doppelbande ist bereits früher für
Quervernetzungsprodukte zwischen pOmpA und Trigger Factor beobachtet worden (Beck et
al., 2000). Das Entstehen der Doppelbande ist aber nicht endgültig geklärt; mögliche
Ursachen sind: (1) Die RANCs sind in ihrer Länge heterogen, (2) unterschiedliche Lysine
von Trigger Factor oder den RANCs reagieren mit DSS, so daß ein unterschiedliches
Laufverhalten resultiert, oder (3) Trigger Factor wird an mehreren Bindestellen mit den
RANCs quervernetzt, so daß ein „Knäuel“ mit schlechteren Laufeigenschaften entsteht.
Das gleiche Experiment wurde für FhaB∆ext*-100-RANCs und FhaB∆ext*-135-RANCs
durchgeführt (ohne Abb.), die sich nicht anders als die gleichnamigen naszierenden Ketten
mit Extension verhielten. Das bedeutet, dass die N-terminale Extension keine spezifische
Bedeutung
für
die
Erkennung
ribosomenassoziierter
Proteine
durch
spezielle
Targetingfaktoren besitzt.
Auch diese Quervernetzungsdaten zeigen, dass SRP prinzipiell mit der Signalsequenz von
FHA interagieren kann. Für das sekretorische Protein OmpA konnte kürzlich ebenfalls eine
nicht funktionelle Interaktion mit SRP in frühen Phasen der Synthese gezeigt werden (Eisner
et al., 2003). Die Tatsache, dass eine Entfernung von Trigger Factor zu keiner stärkeren
Interaktion zwischen Ffh und FHA führt, spricht eher gegen eine funktionelle Bindung von
Ffh.
6.6
Sowohl lange als auch kurze naszierende Ketten zeigen eine
schwache Interaktion mit SecY
Wie aus früheren Arbeiten bekannt ist, interagieren integrale Innenmembranproteine wie
MtlA co-translational mit Bestandteilen des Translokons (Valent et al., 1998; Beck et al.,
2000). Im Gegensatz dazu binden sekretorische Proteine wie pOmpA erst post-translational
an die Membran; das Membrantargeting von pOmpA setzt somit die Loslösung des Proteins
vom
Ribosom
voraus
(Behrmann
et
al.,
1998).
Dementsprechend
können
ribosomenassoziierte naszierende Ketten (RANCs) von pOmpA auch nicht mit SecY, der
Hauptkomponente des Translokons, quervernetzt werden. Eine Interaktion zwischen OmpA
und SecY ist nur dann nachweisbar, wenn OmpA-Ketten nach Ablösung des Ribosomes
künstlich im Translokationskanal arretiert werden (Beck et al., 2000).
Obwohl bislang alle Ergebnisse gegen ein SRP abhängiges Targeting sprechen, sollte im
folgenden Experiment überprüft werden, ob FHA dennoch co-translational an die Membran
gebracht wird. Um ein solches, möglicherweise SRP unabhängiges, co-translationales
Ergebnisse
106
Targeting von FHA nachzuweisen, sollten FhaB*-100-RANCs und FhaB*-135-RANCs mit
SecY in der Innenmembran quervernetzt werden.
Puromycin
+
MBS
+
+
+
+
IPα
Puromycin
MBS
+
+
+
+
+
IPα
SecY
+
SecY
75
X SecY
xTF
xFfh
><
X
+
75
x
50
50
>
pFhaB*
FhaB*-135
<
37
37
15
15
FhaB*-100
1
A
>
pFhaB*
<
2
3
4
5
1
2
3
4
5
B
Abb. 6.20: Sowohl lange als auch kurze Ketten von FhaB* zeigen eine schwache Interaktion
mit SecY
FhaB*-100-RANCs (Abb. 6.20 B) und FhaB*-135-RANCs (Abb. 6.20 A) wurden im rekonstituierten
System synthetisiert. Über ein 20%-iges Saccharosekissen wurden die naszierenden Ketten durch
eine 60 minütige Ultrazentrifugation bei 70.000 Upm isoliert. Die pelletierten naszierenden Ketten
wurden in einem DTT-freien Puffer resuspendiert und konnten anschließend zu einem
Reaktionsansatz hinzugefügt werden, in welchem ein ATP-regenerierendes System, CTP, GTP und
UTP enthalten waren. Um alle Translokationsfaktoren in ausreichender Konzentration anzubieten,
wurden dem System Ffh und S135 zugegeben, SecY wurde dem System mit den INV zugesetzt. Ein
Teil der resuspendierten naszierenden Ketten wurde vor Zugabe zu den Reaktionsansätzen mit
Puromycin in einer finalen Konzentration von 0,88mM behandelt. Je einer der nicht
puromycinbehandelten Ansätze (25µl) wurde direkt mit 10%-iger TCA gefällt (Spur 1), ein weiterer
Ansatz (25µl) -/+ Puromycinbehandlung wurde mit MBS quervernetzt und mit TCA gefällt (Spuren 2
und 4) und jeweils fünfzehnfache Reaktionsansätze -/+ Puromycinbehandlung wurden nach der
Quervernetzung durch MBS mit anti-SecY-Antikörpern (Spuren 3 und 5) immunpräzipitiert. Die
Quervernetzungs- bzw. Immunpräzipitationsprodukte von Trigger Factor und SecY sind mit einem
Kreis und einer Klammer gekennzeichnet.
TF = Trigger Factor
In dem in Abb. 6.20 dargestellten Versuch wurde die co-translationale Interaktion zwischen
FhaB*-100 bzw. FhaB*-135 und SecY überprüft: nach Isolierung der naszierenden Ketten,
anschließender Inkubation mit INV und Quervernetzung mit MBS, konnte durch
Immunpräzipitation ein ca. 40 KD großes Quervernetzungsprodukt zwischen FhaB*-100
(10 kD) und SecY (Abb. 6.20 B, Spur 4) bzw. ein ca. 45 kD großes Quervernetzungsprodukt
zwischen FhaB*-135 (13kD) und SecY (Abb. 6.20 A, Spur 4) nachgewiesen werden (das
107
Ergebnisse
49 kD große Protein SecY zeigt im SDS-Polyacrylamidgel ein aberrantes Laufverhalten und
läuft bei 35 kD, Ito 1984). Wurden die naszierenden Ketten vor ihrer Inkubation mit INV
und dem Quervernetzer MBS mit Puromycin behandelt, dann war die Interaktion zwischen
FhaB*-100 bzw. FhaB*-135 und SecY auch nach Immunpräzipitation mit spezifischem
SecY-Antiserum nicht mehr nachweisbar (Abb. 6.20 A, B, Spur 5).
In diesem Versuch konnte nur eine schwache Interaktion zwischen SecY und unterschiedlich
langen naszierenden Ketten von FhaB* nachgewiesen werden; d.h. nur ein geringer Anteil
von FhaB* kann co-translational an das SecYEG Translokon binden.
6.7
Untersuchungen zum Membrantargeting von FHA, FHA∆ext und
SepA mit Hilfe von Flotationsexperimenten deuten auf ein posttranslationales Targeting hin
Die post-translationale und die co-translationale Zielsteuerung können experimentell in der
Flotationsanalyse in einem Saccharose-Dichtegradienten untersucht und voneinander
unterschieden werden (siehe 5.3.6)
Für Flotationsexperimente wurden ribosomenassoziierte naszierende Ketten (RANCs) in Abund Anwesenheit von Innenmembranvesikeln synthetisiert. In diesem Zustand können nur
solche Proteine an INV binden, für die in der Zelle eine co-translationale Zielsteuerung
vorgesehen ist. Proteine, für die in der Zelle eine post-translationale Zielsteuerung
vorgesehen ist, müssen vor ihrer Membranbindung zunächst fertig synthetisiert und vom
Ribosom abgelöst werden.
Das Prinzip der Flotation beruht darauf, dass die im Syntheseansatz enthaltenen Vesikel
während der Ultrazentrifugation, von einem Saccharose-Kissen hoher Dichte aus, so lange
innerhalb
des
dreistufigen
Saccharosegradienten
aufsteigen,
bis
die
Dichte
der
Saccharoselösung ihrer eigenen Dichte entspricht. Im Experiment fanden sich die Vesikel
dabei meist in den Fraktionen 2 und 3. Dies bedeutet, dass radioaktiv-markierte RibosomPolypeptid-Komplexe in der Autoradiographie ebenfalls nur dann in den Fraktionen 2 und 3
sichtbar gemacht werden konnten, wenn zuvor ein co-translationales Targeting zur Membran
bzw. zum SecYEG-Translokon stattgefunden hatte. Für post-translational zielgesteuerte
Proteine lässt sich dagegen keine Membranbindung von Ribosomen assoziierten
naszierenden Ketten nachweisen; diese naszierenden Ketten finden sich somit in den
Pelletfraktionen (P) der Gradienten.
Ergebnisse
108
MC4100
-INV
Fraktion
+INV
1
2
3
4
P
1
2
3
4
P
1
3
3
7
86
1
4
7
7
81
3
3
6
9
79
2
27
46
15
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
A
OmpA-126
%Membranbindung
B
MtlA-189
%Membranbindung
Abb. 6.21: Mittels Flotation lässt sich ein SRP-vermitteltes, co-translationales Targeting für
RANCs von MtlA nachweisen, nicht aber für RANCs von OmpA.
Ribosomenasoziierte naszierende Ketten (RANCs) von OmpA (Abb. 6.21 A) und MtlA (Abb. 6.21B)
wurden im rekonstituierten System in Abwesenheit von INV (Spuren 1 bis 5) und in Anwesenheit von
INV (Spuren 6 bis 10) synthetisiert. Nach der Synthese wurde eine Ultrazentrifugation der
Translationsprodukte über einen dreistufigen Saccharosegradienten durchgeführt. Im Anschluss an
die Zentrifugation erfolgte die Auftrennung der einzelnen Gradienten in die Fraktionen 1 bis 4, sowie
das Pellet (Spuren 1 bis 5 bzw. 6 bis 10). Zur Quantifizierung der radioaktiv markierten RANCs
wurde das Verhältnis der Radioaktivität der einzelnen Proteinbanden zur Summe der Radioaktivität
aller fünf Fraktionen mit Hilfe des Programmes Image Quant ermittelt und prozentual berechnet.
P = Pellet.
Für sämtliche Flotationsexperimente wurden RANCs im rekonstituierten System
synthetisiert, um die Membranbindung der RANCs unter definierten Konzentrationen an
Translokations- und Integrationsfaktoren untersuchen zu können. Die experimentelle
Identifizierung der verschiedenen Targetingmechanismen mittels Flotation wurde zuerst mit
naszierenden Ketten der Kontrollproteine OmpA und MtlA
durchgeführt. Die dafür
verwendeten Oligonukleotide ergaben naszierende Ketten mit einer Länge von 126
Aminosäuren für OmpA (OmpA-126) und einer Länge von 189 Aminosäuren für MtlA
(MtlA-189). Zu Kontrollzwecken wurde für jedes Protein die Flotation sowohl in Ab- als
auch in Anwesenheit von Innenmembranvesikeln durchgeführt.
Bei Verwendung naszierender Ketten des SecA-abhängigen OmpA zeigte sich keine
Veränderung des Versuchsergebnisses in Ab- oder Anwesenheit der Vesikel. Jeweils ca.
90%
der
radioaktiv-markierten
Ribosom-Polypeptidketten-Komplexe
konnten
über
Autoradiographie in Fraktion 4 und dem Pellet lokalisiert werden (Spuren 4, 5 und Spuren
9, 10; Abb. 6.21 A). OmpA als sekretorisches Protein bindet erst post-translational in einer
SecA-abhängigen Reaktion an die Membran.
Bei Experimenten mit naszierenden Ketten von MtlA stellte sich ein ganz anderes Ergebnis
dar. Befanden sich beim Versuchsansatz ohne Vesikel ca. 90% der ribosomenassoziierten
Polypeptidketten in Fraktion 4 und dem Pellet (Spuren 4 und 5; Abb. 6.21 B), so sah man
nach Zugabe von Innenmembranvesikeln eine deutliche Verschiebung. Über 70% der
109
Ergebnisse
naszierenden Ketten befanden sich nun in Fraktion 2 und 3 (Spuren 7 und 8, Abb. 6.21 B).
Dadurch, dass SRP hier co-translational an die Signal-Anker-Sequenz der Polypeptidketten
binden und diese erfolgreich an das SecYEG-Translokon steuern konnte, liessen sich die
RANCs von MtlA dementsprechend in der Membranfraktion des Flotationsgradienten
nachweisen.
Sollten sich die bisherigen Ergebnisse bestätigen und sowohl FHA als auch SepA ein SecAabhängiges Protein sein, müssten die Flotationsergebnisse der beiden Proteine mit denen von
OmpA vergleichbar sein.
Um dies zu überprüfen, wurden ribosomenassoziierte naszierende Ketten von FhaB* und
SepA* im rekonstituierten System in Ab- und Anwesenheit von INV synthetisiert und
anschließend eine Flotationsanalyse unterzogen.
MC4100
INV
Fraktion
1
2
<1
2
3
4
P
1
2
3
4
P
15
79
<1
4
6
12
67
A
SepA*-106
%Membranbindung
B
5
FhaB*-135
%Membranbindung
<1
1
5
13
80
<1
5
10
9
76
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Abb. 6.22: Für RANCs von FhaB* und SepA* lässt sich mittels Flotationsexperimenten kein
co-translationales Targeting nachweisen.
Ribosomenassoziierte naszierende Ketten (RANCs) von FhaB* und SepA* wurden im
rekonstituierten System in Abwesenheit von INV (Spuren 1 bis 5) und in Anwesenheit von INV
(Spuren 6 bis 10) synthetisiert. Nach der Synthese wurde eine Ultrazentrifugation der
Translationsprodukte über einen dreistufigen Saccharosegradienten durchgeführt. Im Anschluss an
die Zentrifugation erfolgte die Auftrennung der einzelnen Gradienten in die Fraktionen 1 bis 4 sowie
das Pellet (Spuren 1 bis 5 bzw. 6 bis 10). Zur Quantifizierung der radioaktiv markierten RANCs
wurde das Verhältnis der Radioaktivität der einzelnen Proteinbanden zur Summe der Radioaktivität
aller fünf Fraktionen mit Hilfe des Programmes Image Quant ermittelt und prozentual berechnet.
P = Pellet.
Tatsächlich fanden sich bei Verwendung von FhaB*-135-RANCs und SepA*-106-RANCs
sowohl in Ab- als auch in Anwesenheit der Innenmembranvesikel zwischen 70% und 90%
der radioaktiv-markierten Ketten in Fraktion 4 und dem Pellet (Spuren 4, 5 und Spuren 9,
Ergebnisse
110
10; Abb. 6.22 A und B). Dies erlaubt die Schlussfolgerung, dass naszierende Ketten der
beiden Proteine nicht co-translational mit Innenmembranvesikeln assoziieren können und
entspricht den Versuchsergebnissen, die für das SRP-unabhängige Protein OmpA gewonnen
wurden.
Dass sich FhaB∆ext*-RANCs in Flotationsexperimenten genauso verhielten wie FhaB*RANCs (ohne Abb.) unterstreicht wieder einmal, dass die N-terminale Extension in dem
verwendeten E. coli in vitro System keinen Einfluss auf das Membrantargeting der Proteine
hat.
Flotationsexperimente wurden außerdem mit FhaB*-100-RANCs durchgeführt (ohne Abb.),
da diese Ketten als einzige in den Quervernetzungsexperimenten mit SRP interagierten. Dass
sich FhaB*-100-RANCs jedoch genauso verhielten wie die längere FhaB*-135-Kette, ist ein
weiterer Beweis dafür, dass die Bindung von SRP an hydrophobe Bereiche der
Signalsequenz nur potentielle, jedoch keine funktionelle Bedeutung hat.
Die Flotationsexperimente sprechen für einen SecA-abhängigen, post-translationalen
Zielsteuerungsmechanismus, während die Quervernetzungsprodukte zwischen FhaB*-100
und FhaB*-135 mit SecY Hinweise auf eine schwache co-translationale Membranbindung
lieferten.
111
6.8
Ergebnisse
Zusammenfassung der Ergebnisse
In dieser Arbeit wurde erstmals der Transportmechanismus von sehr großen TpsA-Proteinen
bzw. Autotransportern mit einer N-terminalen Extension und einer ungewöhnlichen
Signalsequenz einer umfassenden in vitro-Analyse unterzogen. Hierzu wurde mit dem
Autotransporter SepA aus Shigella flexneri und dem TpsA Protein FHA aus Bordetella
pertussis gearbeitet. Um die Funktion der N-terminalen Extension beim Transport von FHA
zu untersuchen, wurde zusätzlich mit dem Protein FHA∆ext gearbeitet, dem die ersten 24 Nterminalen Aminosäuren und damit die N-terminale Extension entfernt worden war.
Für beide Proteine konnte eine Translokation in „Inside-out“-Innenmembranvesikel
nachgewiesen werden (Abb. 6.2).
Bei Protease-Resistenz-Tests mit INV aus verschiedenen E. coli-Mutanten verhielten sich
sowohl FHA als auch SepA wie das sekretorische, SecA-abhängige Protein OmpA (Abb.
6.13).
Dass die Zugabe von SecA, SecB und F1-ATPase den Transport von FHA in
harnstoffbehandelte Vesikel stimulieren konnte, bestätigte zudem die SecA Abhängigkeit der
Translokation von FHA (Abb. 6.14). Durch Versuche mit harnstoffbehandelten Vesikeln
konnte außerdem gezeigt werden, dass die Anwesenheit von SecB für eine effiziente
Translokation von FHA zwingend erforderlich war (Abb. 6.15).
Der Transport von SepA in harnstoffbehandelte Vesikel war nach Zugabe von SecA, SecB
und F1-ATPase nicht möglich (Abb. 6.14). Möglicherweise sind zu einer effizienten
Translokation weitere, bislang nicht bekannte Faktoren notwendig, die bei der
Harnstoffbehandlung der Vesikel entfernt wurden. Allerdings deuten Transportstudien mit
Mutantenvesikel darauf hin, dass SepA ebenso wie FHA auf SecA angewiesen ist (Abb.
6.13).
Wie schon für OmpA beobachtet, konnte auch für FHA und SepA in in vitro
Transportuntersuchungen mit harnstoffbehandelten Vesikeln kein Hinweis auf eine
Beteiligung von Ffh und FtsY gefunden werden(Abb. 6.14).
Quervernetzungsstudien zeigten dagegen, dass naszierende Ketten von FHA, bei denen nur
die Signalsequenz die Ribosomenoberfläche erreichte, mit SRP interagieren konnten (Abb.
6.18). Sobald der reife Teil des Proteins auf der Ribosomenoberfläche erschien, wurde SRP
durch Trigger Factor aus der Bindung an die naszierende FHA-Kette verdrängt (Abb. 6.18).
Die Intensität der Quervernetzungsprodukte zwischen Trigger Factor und naszierenden
Ketten von FHA bzw. SepA verstärkte sich mit zunehmender Kettenlänge (Abb. 6.18). Dass
die Interaktion zwischen naszierenden Ketten von FHA und SRP nur potentieller nicht
Ergebnisse
112
jedoch funktioneller Natur war, wurde in Quervernetzungsstudien gezeigt, in denen auch
unter Trigger Factor depletierten Bedingungen keine Interaktion zwischen längeren
naszierenden Ketten von FHA bzw. SepA und SRP auftrat (Abb. 6.19).
Durch Flotationsexperimente (Abb. 6.22) konnte für FHA und SepA gezeigt werden, dass im
Gegensatz zu dem polytopen Innenmembranprotein MtlA ein co-translationales Targeting
stattfand. Auch hier verhielten sich die beiden Proteine wie das SRP-unabhängige Protein
OmpA.
Widersprüchlich zu den Flotationsexperimenten sind Quervernetzungsstudien, in denen
schwache Interaktionen zwischen kurzen und langen naszierenden Ketten von FHA und
SecY nachgewiesen wurden, die für ein co-translationales Membrantargeting von FHA
sprechen (Abb. 6.20). In Protease-Resistenz-Tests war ein effizienter Transport darüber
hinaus nur dann möglich, wenn die INV zu Beginn der Synthese im System vorhanden
waren (co-translationale Bedingungen). Wurden die INVs erst nach Abstoppung der
Synthese durch Chloramphenicol (post-translationale Bedingungen) hinzugefügt, dann war
der Transport von FHA erheblich beeinträchtigt (Abb. 6.7). Allerdings ist dies primär
wahrscheinlich auf Aggregation, die mit zunehmender Proteinlänge verstärkt auftritt,
zurückzuführen. Dies wurde mit Hilfe von Gelfiltrationsexperimenten (Abb. 6.10) und
Protease-Resistenz-Tests gezeigt (Abb. 6.12).
Versuche mit harnstoffbehandelten Vesikeln, Flotationsexperimente, Protease-ResistenzTests, in denen INVs zu verschiedenen Zeitpunkten der Synthese zugegeben wurden (cound post-translationale Bedingungen) sowie Quervernetzungsexperimente wurden ebenfalls
mit FHA∆ext durchgeführt, das sich in allen Versuchen wie FHA verhielt.
Der Transport von FHA und SepA erfordert also SecA, jedoch kein SRP; für eine effiziente
Translokation von FHA wird weiterhin SecB, für jene von SepA möglicherweise ein
zusätzlicher, unbekannter Faktor benötigt. Dies zeigt, dass auch im Falle dieser besonderen
Klasse sekretorischer Proteine, zu der FHA und SepA gehören, die Zelle ihre
Unterscheidung zwischen SRP-abhängigem Transport von Innenmembranproteinen und
SecA-abhängigem Transport von sekretorischen Proteinen beibehält. Es kann jedoch nicht
ausgeschlossen werden, dass sekretorische Proteine dieser Klasse unabhängig von SRP cotranslational an die Innenmembran gebracht werden. Denkbar ist es, dass Proteine wie SecB
oder andere, bislang unbekannte Translokationsfaktoren diese Funktion eines cotranslationalen Targetings übernehmen könnten. Die N-terminale Extension hatte in dem
hier verwendeten in vitro System aus E. coli zu keinem Zeitpunkt einen Einfluss auf die
Translokation.
113
Diskussion
7.
Diskussion
7.1
SepA und FHA verhalten sich beim Transport über die innere
Bakterienmembran wie klassische sekretorische Proteine
In vorangehenden Arbeiten wurden individuelle Transportmechanismen für Innenmembranund sekretorische Proteine identifiziert (Koch et al., 1999; Beck et al., 2000):
Das
Membrantargeting und die Translokation des sekretorischen Proteins OmpA werden durch
SecB sowie SecA vermittelt, während das Membrantargeting und die Integration des
Innenmembranproteins MtlA durch SRP sowie seinen Rezeptor FtsY vermittelt werden
(Abb. 2.3).
Obwohl die Zielsteuerung von Membranproteinen unabhängig von SecA erfolgt, ist SecA an
der Assemblierung von bestimmten Membranproteinen wie Momp2 (Neumann-Haefelin et
al., 2000) beteiligt. Hierbei handelt es sich um Membranproteine mit großen
periplasmatischen Domänen, für die sich im Anschluss an die SRP abhängige Zielsteuerung
eine SecA abhängige Translokation der periplasmatischen Domäne anschließt (Scotti et al.,
1999; Neumann-Haefelin et al., 2000; Dalbey et al., 2000).
Ob es eine SRP abhängige Zielsteuerung von rein sekretorischen Proteinen mit
anschließender SecA abhängiger Translokation gibt, wird in der Literatur widersprüchlich
diskutiert. SRP abhängige Proteine haben in der Regel hydrophobere Signalsequenzen als
solche, die ohne SRP exportiert werden (Kim et al., 2001; Valent et al., 1997). Dabei kann
allerdings eine stärkere Hydrophobizität durch das Vorhandensein von helixbrechenden
Aminosäuren neutralisiert werden (Beha et al., 2003).
Die Beteiligung von SRP am Innenmembrantransport einer speziellen Klasse sekretorischer
Proteine wurde in dieser Arbeit untersucht. Der Grund zur Annahme, dass neben SecA auch
SRP beteiligt ist, liegt in der strukturellen Besonderheit dieser Proteine, die zur Familie der
Autotransporter bzw. TpsA Proteinen gehören: neben einer enormen Proteinlänge verfügen
sie über eine ungewöhnliche Signalsequenz, die mäßig hydrophob ist und eine stark positiv
geladene N-Region besitzt, sowie über eine N-terminale Extension, die der Signalsequenz
vorangeht (siehe 2.2.5.6).
In der Vergangenheit wurde der Innenmembrantransport von drei Proteinen dieser Klasse
mit Hilfe von in vivo Experimenten untersucht: HMW1 aus Haemophilus influenzae (Grass
and St Geme, 2000), Hbp aus E. coli (Sjibrandi et al., 2003) und IcsA aus Shigella flexneri
(Brandon et al., 2003). Bezüglich der Frage, ob SRP neben SecA für eine effiziente
Diskussion
114
Translokation notwendig ist, ergab sich kein eindeutiges Bild. Für HMW1 wurde nur die
SecA Abhängigkeit demonstriert (Grass and St Geme, 2000), für IcsA konnte gezeigt
werden, dass es SecA-abhängig aber SRP-unabhängig transportiert wurde (Brandon et al.,
2003). Hbp benötigte dagegen sowohl SRP als auch SecA für eine effiziente Translokation,
nicht jedoch SecB; in Abwesenheit von SRP konnte SecB jedoch die Misslokalisation bis zu
einem gewissen Grade verhindern (Sjibrandi et al., 2003).
In dieser Arbeit wurde jene Fragestellung nun anhand der Proteine Filamentöses
Hämagglutinin (FHA) aus Bordetella pertussis und Shigella extrazelluläres Protein (SepA)
aus Shigella flexneri mit Hilfe eines E.coli in vitro Systems untersucht. Dabei stellte sich
heraus, dass sich FHA und SepA wie zwei klassische sekretorische Proteine verhalten, die
für ihre Translokation SecA und SecB benötigen. Obwohl eine funktionelle Beteiligung von
SRP sicher ausgeschlossen werden konnte, ergaben sich Hinweise auf ein mögliches cotranslationales Targeting der Proteine an die Innenmembran. Ob ein SRP unabhängiges cotranslationales Targeting dieser Proteinklasse tatsächlich möglich ist und durch welchen
Mechanismus es bedingt ist, konnte hier nicht geklärt werden. Spekuliert wird über eine
Beteiligung von SecB an diesem Prozess.
Zusätzlich wurde in dieser Arbeit die Funktion der N-terminalen Extension untersucht; es
konnte gezeigt werden, dass diese auf den Transportprozess keinen Einfluss hatte.
7.2
FHA und SepA werden SecA abhängig durch das SecYEG
Translokon in der Innenmembran transportiert
SecA ist das Motorprotein für die Translokation sekretorischer Proteine. Durch repetitive
Insertions-Deinsertionszyklen schiebt SecA sekretorische Proteine durch das Translokon
(Economou und Wickner, 1994). Pro Zyklus kann SecA dabei etwa 20-30 Aminosäuren des
sekretorischen Proteins durch das Translokon befördern. Beim ersten Zyklus bindet SecA an
die Signalsequenz. Da die Signalsequenz aber schon früh während der Translokation
abgespalten wird (van der Wolk et al., 1997) und so der Substratbindung durch SecA nicht
mehr zu Verfügung steht, muss SecA für die weiteren Insertions-Deinsertionszyklen auch
Regionen innerhalb des reifen Proteinanteils erkennen und binden können.
Neben dem Membranpotential, welches die SecA-Deinsertion und Proteintranslokation
verstärkt, dient vor allem die ATPase-Aktivität von SecA der Energetisierung
des Translokationsvorgangs (Swidersky et al., 1990; Economou, 1998).
115
Diskussion
Die SecA-Abhängigkeit des Transports von FHA und SepA konnte durch zwei verschiedene
methodische Ansätze gezeigt werden.
1. In Protease-Resistenz-Tests
konnte anhand des Translokationsdefektes, der bei
Verwendung von secY205 Mutanten und secG Mutanten auftrat, die SecA
Abhängigkeit der Translokation nachgewiesen werden. Dass beide Proteine zur
Translokation ein intaktes SecYEG Translokon benötigen, wurde durch die Versuche
mit secE- und secY39-Mutanten gezeigt (Abb. 6.13)
2. Bei Flotationsexperimenten zeigten FHA und SepA ebenso wie das SecA abhängige
sekretorische Protein OmpA keine co-translationale Membranbindung (Abb. 6.22)
Die hier gewonnen in vitro Daten zur SecA Abhängigkeit von FHA und SepA decken sich
mit den in vivo Untersuchungen zur Innenmembrantranslokation von HMW1, Hbp und IcsA.
Die Verwendung von Azid und der Einsatz einer kältesensitiven SecE Mutante führten zu
einem Sekretionsdefekt von HMW1 (Grass and St Geme, 2000), der Einsatz einer
kältesensitiven SecA Mutante zu einem Sekretionsdefekt von IcsA (Brandon et al., 2003).
Azid blockiert die SecA ATPase und damit den Transport eines SecA abhängigen Proteins
aus dem Cytoplasma in das Periplasma (Oliver et al., 1990). Zum Nachweis der SecA
Abhängigkeit der Translokation von Hbp wurde ebenfalls mit Azid gearbeitet; zusätzlich
wurde eine SecA Interaktion durch Quervernetzungsexperimente nachgewiesen (Sjibrandi et
al., 2003).
7.3
Ist SRP am Transportprozess von FHA und SepA beteiligt?
7.3.1 Eine Beteiligung von SRP am Transport sekretorischer Proteine konnte
bislang nicht gezeigt werden
Durch
die
Unterscheidung
zwischen
der
SRP
abhängigen
Integration
von
Innenmembranproteinen in und der SecA abhängigen Translokation von sekretorischen
Proteinen durch die Innenmembran, versucht die Zelle einen geregelten Ablauf des
Proteintransports zu gewährleisten. Polytope Innenmembranproteine müssen bevorzugt an
die zahlenmäßig begrenzten SecYEG-Translokons herangeführt werden, da sie aufgrund
ihrer ausgeprägten Hydrophobizität nach ihrer vollständigen Synthese im Cytosol schnell
aggregieren würden (Ahrem et al., 1989). Durch den SRP-vermittelten, co-translationalen
Transportmechanismus versucht die Zelle, eine vorzeitige Faltung oder Aggregation der
Diskussion
116
Innenmembranproteine im Cytosol zu verhindern und eine rasche Zielsteuerung an das
SecYEG-Translokon zu ermöglichen. SecA-abhängigen, post-translational translozierten
sekretorischen Proteinen wird dagegen nach vollständiger Synthese am Ribosom der Zugang
zum
Translokon
nicht
unmittelbar
ermöglicht.
Zur
Stabilisierung
in
einem
transportkompetenten Zustand sind daher cytoplasmatische Chaperone notwendig.
Trotz der strikten Trennung zwischen SRP- und SecA-Weg konnte jedoch eine Kooperation
von SRP und SecA bei Proteinen beobachtet werden, die einerseits über hydrophobe SignalAnker-Sequenzen verfügen, an die SRP binden und so eine co-translationale Zielsteuerung
vermitteln kann, andererseits große periplasmatische Domänen besitzen, die SecA-abhängig
transloziert werden müssen. Experimentell am besten wurde sie für den Transport von
Momp2 untersucht (Neumann-Haefelin et al., 2000). Ein Zusammenspiel von SRP und
SecA konnte aber auch bei weiteren Proteinen wie YidC (Koch et al., 2002), FtsQ (Valent et
al., 1998) oder auch der Signalpeptidase I (Lep) (Wolfe et al., 1985; de Gier et al., 1996)
gezeigt werden.
Die Möglichkeit einer Kooperation von SRP und SecA bei der Translokation von
sekretorischen Proteinen konnte dagegen bislang nicht gezeigt werden. Aufgrund von SRP
und FtsY Depletionsexperimenten in vivo wurde zwar mehrfach postuliert, dass SRP nicht
alleine für die Integration von Innenmembranproteinen notwendig ist, sondern auch am
Targeting von sekretorischen Proteinen beteiligt ist (Phillips and Silhavy, 1992; Luirink et
al., 1994; Kim et al., 2001), die Interpretation dieser in vivo Ergebnisse wird jedoch dadurch
kompliziert, dass die Membranintegration von SecY SRP abhängig ist. Eine Verminderung
der zellulären Konzentration an SRP oder FtsY reduziert gleichzeitig die Konzentration
aktiver Translokons. Daher ist es schwierig, solche Transportdefekte, die in erster Linie
durch die SRP-/FtsY-Depletion verursacht wurden, von solchen zu unterscheiden, die aus
der verminderten SecY Konzentration resultieren (Koch et al., 1999; Seluanov and Bibi,
1997; Park et al., 2002).
7.3.2 Warum wäre eine SRP Beteiligung an der Translokation von FHA und
SepA dennoch denkbar?
Aus den bislang veröffentlichten Daten lässt sich schließen, dass die SRP Bindung im
Wesentlichen durch die Hydrophobizität der Signalsequenz/Signalankersequenz bestimmt
wird. Im SRP ist die Ffh-Untereinheit für die Interaktion mit den Signal-Anker-Sequenzen
verantwortlich. Sie trägt C-terminal eine hydrophobe Substratbindetasche, die sich durch
einen hohen Methioninanteil auszeichnet (Freymann et al., 1997). Dies ist die so genannte
117
Diskussion
M-Domäne. Die Seitenketten von Methionin interagieren dabei mit den hydrophoben
Aminosäuren der Signalsequenz (Bernstein et al., 1989). Ein charakteristisches Merkmal der
M-Domäne ist das Vorhandensein einer breiten Rinne, die fast ausschließlich aus
hydrophoben Aminosäuren besteht (Keenan et al., 1998). Mit einer Länge von etwa 2.5 nm
und einer Beite von 1.5 nm, bei einer Tiefe von ungefähr 1.2 nm, kann diese Rinne etwa 20
Aminosäuren in α-helikaler Konformation bzw. 16 Aminosäuren in β-Faltblattstruktur
aufnehmen. Über elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den positiv geladenen Resten
der Signalsequenz und dem negativ geladenen Phosphodiester-Rückgrat der RNA wird
vermutlich eine korrekte Orientierung der Signalsequenz in der Substratbindetasche
gewährleistet (Batey et al., 2000).
Die Effizienz, mit der SRP an ein Protein binden kann, steigt mit zunehmender
Hydrophobizität der Signal-Anker-Sequenz bzw. Signalsequenz an (Valent et al., 1997). In
früheren Arbeiten wurden die Signal-Anker-Sequenzen verschiedener Innenmembranproteine als Erkennungssequenz und Bindestelle für SRP identifiziert (Valent et al., 1997;
de Gier et al., 1998). Die Signal-Anker-Sequenzen sind meist länger und hydrophober als
Signalsequenzen sekretorischer Proteine. Dementsprechend können auch sekretorische
Proteine von SRP erkannt und gebunden werden, wenn die Hydrophobizität ihrer
Signalsequenz artifiziell erhöht wird (Valent et al., 1997; Lee und Bernstein, 2001).
Kürzlich wurde postuliert, dass neben der Hydrophobizität einer Signalsequenz auch deren
positive Ladung eine Rolle bei der SRP Bindung spielen kann (Peterson et al., 2003).
Untersuchungen, bei denen die Hydrophobizität und die positive Ladung innerhalb der
Signalsequenz variiert wurden, zeigten, dass geringe Änderungen der Hydrophobizität die
Substraterkennung durch SRP viel stärker beeinflussten als große Änderungen der positiven
Ladung (Peterson et al. 2003). Daraus folgerten die Autoren, dass eine stark positive Ladung
zwar eine SRP Bindung günstig beeinflusst, dass das Hauptkriterium dafür, ob SRP bindet
oder nicht, jedoch eine bestimmte Mindesthydrophobizität der Signalsequenz ist. Vermutet
wird daher, dass eine stark positiv geladene N-Region nur bei wenigen Substraten von
Bedeutung ist; das sind solche Proteine, bei denen die Hydrophobizität der Signalsequenz
knapp unterhalb der Mindesthydrophobizität liegt, die zur SRP Erkennung nötig ist
(Peterson et al., 2003).
Auf molekularer Ebene vermittelt die positive Ladung der Signalsequenz solcher Substrate
möglicherweise eine Stabilisierung der SRP-Substrat-Bindung: ist die Hydrophobizität der
Signalsequenz gerade zu gering, um eine ausreichend stabile Interaktion zwischen der HRegion des Substrates und der hydrophoben Grube der M-Domäne von SRP zu
gewährleisten, dann kann eine stark positiv geladene N-Domäne durch elektrostatische
Diskussion
118
Wechselwirkung mit dem negativ geladenen Phosphatrückrad der 4.5S RNA innerhalb der
M-Domäne von SRP interagieren und somit die Gesamtbindung des Substrates an SRP
verstärken (Peterson et al., 2003).
FHA und SepA gehören zu einer besonderen Klasse von sekretorischen Proteinen, die sich
durch einige strukturelle Besonderheiten auszeichnen, welche wiederum die Proteine zu SRP
abhängigen Substraten machen könnten.
Außergewöhnlich ist die Beschaffenheit der Signalsequenz, die, wie die von Peterson et al.
untersuchte Signalsequenz des Autotransporters EspP (Peterson et al., 2003), eine besonders
lange und zudem stark positiv geladene N-Region besitzt. Außerdem sind die
Signalsequenzen dieser Proteinklasse etwas stärker hydrophob als jene von klassischen
sekretorischen Proteinen, jedoch deutlich weniger hydrophob als die Signalankersequenzen
der SRP abhängigen Innenmembranproteine (Peterson et al., 2003).
Außergewöhnlich ist weiterhin die enorme Proteingröße dieser Proteinklasse, speziell jene
von FHA, das darüber hinaus außerordentlich effizient sezerniert wird. Ein SRP abhängiger
Transport erscheint daher gerade bei diesen Proteinen sinnvoll, da er co-translational erfolgt
und somit eine schnelle Translokation gewährleistet, die vor einer vorzeitigen Faltung und
der damit verbundenen, für die Zelle toxischen Akkumulation von Vorläuferprotein im
Cytoplasma schützt.
Ungewöhnlich ist auch die N-terminale Extension, die der Signalsequenz am N-terminalen
Ende vorausgeht. Ihre spezielle Bedeutung wurde allerdings nie genauer untersucht; dass sie
für die SRP Bindung eine Rolle spielen könnte, wurde bislang nicht nachgewiesen, sondern
nur spekuliert (Jacob-Dubuisson et al., 2001; Sjibrandi et al., 2003).
7.3.3. Eine Beteiligung von SRP am Transport von Proteinen mit einer
ungewöhnlichen Signalsequenz und N-terminalen Extension konnte bisher
nicht eindeutig nachgewiesen werden
Für alle bislang untersuchten Proteine mit einer N-terminalen
Extension
und
ungewöhnlichen Signalsequenz, HMW1, Hbp und IcsA, konnte eine SecA Abhängigkeit der
Translokation nachgewiesen werden. In vivo Untersuchungen zur Beteiligung von SRP
führten dabei zu keiner einheitlichen Aussage: Die Translokation von IcsA war SRP
unabhängig, jene von Hbp SRP abhängig.
IcsA wurde hierzu in Ffh und FtsY Mutantenstämmen exprimiert. Der Sekretionsdefekt von
IcsA war allerdings so minimal, dass eine SRP Beteiligung beim Innenmembrantransport
119
Diskussion
ausgeschlossen wurde (Brandon et al., 2003). Da in diesen Experimenten aber auch die
Integration von SRP abhängigen Innenmembranproteinen nur relativ schwach betroffen war,
muss der absolute SRP Bedarf des sekretorischen IcsA mit Vorsicht interpretiert werden. Die
Möglichkeit, dass IcsA SRP unter bestimmten Bedingungen nutzen kann, kann nicht
ausgeschlossen werden (Brandon et al., 2003).
Für das zweite Protein, Hbp, wurde die SRP Abhängigkeit der Translokation mittels zwei
verschiedener Methoden nachgewiesen. Quervernetzungsstudien mit 117 Aminosäuren
langen naszierenden Ketten von Hbp lieferten ein starkes Quervernetzungsprodukt mit SRP
(Sjibrandi et al., 2003). Darüber hinaus wurden Pulse Chase Experimente durchgeführt; zum
einen unter Ffh depletierten Bedingungen und zum anderen mit einer FtsY Mutante, die GTP
nur mit geringer Affinität bindet. Der Einsatz beider Mutanten führte zu einem erheblichen,
jedoch
nicht
vollständigen
Sekretionsdefekt,
was
auf
ein
SRP
abhängiges
Innenmembrantargeting von Hbp hinweist (Sjibrandi et al., 2003). Transport und
Prozessierung von OmpA waren dagegen nicht betroffen, was gegen einen durch die
Reduzierung von SecY bedingten sekundären Effekt spricht. In den von Sjibrandi et al.
gezeigten Pulse Chase Experimenten fand sich in der pelletierten Zellfraktion jedoch auch in
Anwesenheit von Ffh Vorläuferprotein, d.h. Protein, das aufgrund noch nicht stattgefundener
N- und C-terminaler Prozessierungsvorgänge neben seiner Passagierdomäne über CDomäne, Signalsequenz und N-terminale Extension verfügt. Bei einer co-translationalen,
SRP abhängigen Membranbindung wird das Vorläuferprotein noch während seiner Synthese
an die Membran gebracht und transloziert. Bei einer effizienten SRP abhängigen, cotranslationalen Translokation findet man somit weder im löslichen Überstand noch in der
pelletierten Zellfraktion Vorläuferproteine. Die Tatsache, dass Vorläuferproteine in der
pelletierten Zellfraktion nachweisbar sind, spricht daher eher für eine post-translationale
Translokation, bei welcher die Proteine vor ihrem Transport zu Ende synthetisiert werden.
Die Schlussfolgerung, dass die Translokation von Hbp SRP abhängig ist, sollte daher mit
Vorsicht betrachtet werden.
Diskussion
120
7.3.4 Bei der Translokation von FHA und SepA hat SRP keine funktionelle
Bedeutung
Nachdem anhand der Untersuchungen zur Translokation von Proteinen mit einer Nterminalen Extension und ungewöhnlichen Signalsequenz keine eindeutige Aussage über
eine SRP Beteiligung gemacht werden konnte, sollte diese Fragestellung auch für FHA und
SepA in vitro mit Hilfe verschiedener Techniken untersucht werden.
Protease-Resistenztests ergaben dabei keinerlei Hinweis auf eine SRP Beteiligung an der
Translokation:
1. Bei Verwendung von harnstoffbehandelten Vesikeln konnte durch alleinige Zugabe
von Ffh und FtsY keine Translokation von FHA oder SepA erreicht werden.
(Abb. 6.14)
2. Im Fall von FHA reichten alleine SecA, SecB und die F1-ATPase für eine effiziente
Translokation aus; auch die zusätzliche Zugabe von Ffh und FtsY
konnte die
Ausbeute an transloziertem Material nicht steigern (Abb. 6.14). Dies spricht gegen
eine Beteiligung von SRP und deutet auf einen alleine durch SecA vermittelten
Transport über die Innenmembran hin.
3. Obwohl
die
SecA
Abhängigkeit
von
SepA
durch
die
Versuche
mit
Translokonmutanten (Abb. 6.13) eindeutig gezeigt werden konnte, vermochte auch
die Zugabe aller Translokationsfaktoren (SecA, SecB, F1-ATPase, Ffh und FtsY)
nicht, den Transport von SepA in harnstoffbehandelte Vesikel zu stimulieren (Abb.
6.14). Möglicherweise sind die eingesetzten Komponenten für eine effiziente
Translokation speziell von SepA nicht ausreichend aktiv. Denkbar ist es jedoch auch,
dass durch die Harnstoffbehandlung der Vesikel neben SecA, SecB und der F1ATPase weitere, bislang unbekannte Faktoren entfernt wurden, die für eine effiziente
Translokation erforderlich sind.
Da IcsA und Hbp über eine konservierte N-terminale Extension verfügen, sich aber
hinsichtlich ihrer SRP Abhängigkeit deutlich unterscheiden, kann geschlossen werden, dass
die Extension nicht alleine über eine SRP Abhängigkeit entscheidet. Für FHA konnte das in
dieser Arbeit direkt nachgewiesen werden. Hierzu wurde die N-terminale Extension von
FhaB entfernt und mit Hilfe des in vitro Systems der Transport von FHA∆ext untersucht. Ein
Vergleich der Ergebnisse zum Transport von FHA mit und ohne Extension zeigte, dass die
Extension das Transportverhalten von FHA nicht beeinflusste. Die Translokation und das
Targeting von FHA waren unabhängig von der An- oder Abwesenheit der Extension
SecA/SecB abhängig und SRP unabhängig (Abb. 6.14).
121
Diskussion
Eine Beteiligung von SRP am Export der beiden Proteine FHA und SepA sollte mit zwei
weiteren unabhängigen Experimenten überprüft werden.
Durch Flotationsexperimente kann eine co-translationale Zielsteuerung von Proteinen und
SRP Interaktion nachgewiesen werden. Hinweise auf ein co-translationales Targeting
konnten für naszierende Ketten von FHA und SepA mit dieser Methode allerdings nicht
gewonnen werden (Abb. 6.22).
Zusätzlich wurde durch Quervernetzungsexperimente eine Interaktion von SRP mit
naszierenden Ketten von FHA und SepA überprüft. Eine Interaktion dieser wachsenden
Polypeptidketten mit SRP war nur dann nachweisbar, wenn gerade die Signalsequenz die
Ribosomenoberfäche erreicht hatte; sobald der reife Teil des Proteins außerhalb des
Ausgangskanals am Ribosom erschien, ging die Interaktion zwischen SRP und wachsender
Polypeptidkette verloren (Abb. 6.18). Für typische SRP Substrate wie Momp2 oder MtlA ist
eine Interaktion zwischen naszierender Kette und SRP längenunabhängig durch
Quervernetzungs- und Flotationsexperimente nachweisbar (Dissertationsschrift von Eisner;
Dissertationsschrift von Beck). Eine Interaktion zwischen naszierenden Ketten von FHA und
SepA und SRP trat jedoch längenabhängig auf: bei sehr kurzen naszierenden Ketten war eine
Interaktion nachweisbar, die verloren ging sobald die Kette eine bestimmte Länge
überschritt. Dies spricht gegen eine funktionelle Beteiligung von SRP an der
Membranbindung von FHA und SepA. Möglicherweise kommt die Interaktion zwischen
Signalsequenz und SRP nur dadurch zustande, dass durch die Arbeit mit Elongationsarretierten Ketten eine Situation geschaffen wurde, in der SRP binden kann.
Dass sich FHA∆ext auch in den Quervernetzungs- und Flotationsexperimenten (Abb. 6.18)
wie FHA verhält, unterstreicht ein weiteres Mal die Tatsache, dass die Extension keinen
Einfluss darauf hat, ob das jeweilige Protein SecA oder SRP abhängig transportiert wird.
Trotz ihrer strukturellen Verwandschaft unterscheiden sich neben IcsA auch die Proteine
SepA und FHA hinsichtlich ihrer SRP Abhängigkeit deutlich von Hbp. Die strukturelle
Beschaffenheit der Proteine kann somit die unterschiedliche SRP Abhängigkeit von Hbp,
FHA und SepA nicht erklären. Da die Untersuchungen von Sjibrandi et al. jedoch keinen
eindeutigen Hinweis auf einen co-translationalen Transport von Hbp durch die
Innenmembran von E. coli erbrachten, sollte trotz der starken Quervernetzungsprodukte
zwischen Hbp und SRP die Möglichkeit in Betracht gezogen werden, dass die gezeigten
Interaktionen zwischen Hbp und SRP nicht funktioneller Natur sind, wie für FHA und SepA
in dieser Arbeit postuliert.
Diskussion
7.4
122
Trigger Factor dominiert bei der Bindung an naszierende Ketten von
FHA und SepA
Es wurden weitere Quervernetzungsexperimente durchgeführt, in denen sich zeigte, dass
naszierende Ketten von FHA und SepA neben SRP auch Trigger Factor längenabhängig
binden.
Wie im vorangehenden Kapitel beschrieben konnten nur sehr kurze naszierende Ketten von
FHA und SepA mit SRP interagieren, während längere naszierende Ketten von Trigger
Factor gebunden werden (Abb. 6.18). Trigger Factor interagiert erst dann effizient mit der
naszierenden Kette, wenn der reife Teil auf der Ribosomenoberfläche erscheint; eine
Triggerfaktorinteraktion mit der Signalsequenz ist nur schwach ausgeprägt (Abb. 6.18). Mit
zunehmender Proteinlänge nimmt die Intensität der Crosslinks bzw. der Interaktion zwischen
Protein und Trigger Factor zu (Abb. 6.18).
Diese Beobachtung deckt sich mit kürzlich veröffentlichten Daten. Quervernetzungsstudien
zur molekularen Umgebung und den Kontakten der Signalsequenz des sekretorischen, SecA
abhängigen Proteins OmpA am Ribosom zeigten nämlich, dass die Signalsequenz
unmittelbar nach ihrem Austritt aus dem Ausgangskanal am Ribosom, SRP und SecA
zugänglich war, jedoch über das Protein L23 mit der Oberfläche des Ribosoms verbunden
blieb. Bei weiterem Wachstum der naszierenden Kette gingen diese Kontakte verloren;
gleichzeitig konnte dann Trigger Factor als Bindepartner nachgewiesen werden. War
Trigger Factor abwesend, so konnte auch bei langen naszierenden Ketten wieder eine
Interaktion mit L23 und mit SRP nachgewiesen werden. Während ihres Wachstums wird die
naszierende Kette zunehmend von Trigger Factor gebunden; Trigger Factor kontrolliert
dabei die Zugänglichkeit der Signalsequenz von OmpA für SRP und SecA, er beeinflusst
jedoch nicht die Interaktion des OmpA Vorläuferproteins mit SecB (Eisner et al., 2003).
Crosslinking-Analysen von anderen Substraten zeigten auch, dass ribosomenassoziierte
naszierende Ketten sekretorischer Proteine weitgehend in Kontakt mit Trigger Factor
vorlagen (Valent et al., 1995; 1997; Beck et al., 2000; Beha et al., 2003). Dabei scheint die
primäre Interaktion zwischen Trigger Factor und dem sekretorischen Protein nicht über die
Signalsequenz, sondern über den reifen Anteil des Proteins vermittelt zu werden. So konnte
gezeigt werden, dass Trigger Factor an sekretorische Proteine bindet, deren Signalsequenz
stark modifiziert bzw. vollständig entfernt wurde (Valent et al., 1997). Mittlerweile konnten
mit Hilfe einer Peptidbibliothek für das sekretorische Protein OmpA Erkennungssequenzen
für Trigger Factor identifiziert werden, die innerhalb des reifen Proteinanteils von OmpA
liegen (Schaffitzel, 2001; Patzelt et al., 2001).
123
Diskussion
Trigger Factor übernimmt vermutlich zwei wesentliche Aufgaben. Als Chaperon verhindert
er eine frühzeitige Faltung sekretorischer Proteine, um sie in einer transportkompetenten
Form zu halten. Außerdem scheint er die Interaktion eines sekretorischen Proteins mit SRP
zu verhindern und übernimmt damit eine wichtig Funktion bei der Zielsteuerung von
Proteinen, die SecA-abhängig transportiert werden.
Die Interaktion zwischen Trigger Factor und naszierenden Ketten von FHA und SepA, die
mit zunehmender Kettenlänge intensiver wird, unterstützt weiterhin die im vorangehenden
Kapitel gemachte Annahme, dass eine über Quervernetzung nachweisbare Bindung von SRP
an ein sekretorisches Protein nicht zwangsläufig ein SRP abhängiges Targeting bedeutet.
Dass es sich nur um eine potentielle, nicht um eine funktionelle Bindung handelt, wird durch
zwei weitere Ergebnisse bestätigt:
1)
In Flotationsexperimenten verhalten sich selbst kurze Ketten, die zuvor in den
Crosslinkingexperimenten Interaktionen mit SRP zeigten, wie das SecA abhängige
Protein OmpA (Abb. 6.22)
2)
In den Crosslinkingexperimenten kann mit längeren naszierenden Ketten, deren
reifer Teil die Ribosomenoberfläche erreicht hat, auch in Abwesenheit von Trigger
Factor keine Interaktion mit SRP beobachtet werden (Abb. 6.19)
Aus physiologischer Sicht erscheint es durchaus günstig, dass Trigger Factor die Bindung
von SRP an die Signalsequenz sekretorischer Proteine und deren Eintritt in den SRP Weg
verhindert; dadurch wird eine Interferenz mit der SRP abhängigen Integration von
Innenmembranproteinen am SecYEG Translokon verhindert, deren Akkumulation und
Aggregation im Cytoplasma für die Zelle
toxisch wäre. Ebenso wurde kürzlich eine
Verzögerung des Transportes sekretorischer Proteine beobachtet, wenn Trigger Factor
überproduziert wurde (Lee and Berstein, 2002). Folglich übt Trigger Factor zusätzlich zu
seiner Chaperonaktivität regulatorische Funktion aus, indem er den Eintritt bakterieller
Sekretproteine in den SecA Mechanismus kontrolliert.
Dass die N-terminale Extension bei der Proteinerkennung am Ribosom eine Rolle spielt,
kann ebenfalls ausgeschlossen werden. Auch in Abwesenheit der Extension kann SRP nur
sehr kurze naszierende Ketten von FHA erkennen, während längere Ketten ausschließlich an
Trigger Factor binden. Das bedeutet, dass die Erkennung von FHA und SepA am Ribosom
durch Trigger Factor erfolgt, die dadurch in den SecA abhängigen bzw. SRP unabhängigen
Weg gelenkt werden.
Diskussion
124
7.5 Die Rolle von SecB
7.5.1 SecB kann SRP teilweise substituieren
Neben den Untersuchungen zur SRP Abhängigkeit der Translokation von Hbp über die
Innenmembran, untersuchten Sjibrandi et al. weiterhin die Rolle, die SecB hierbei spielt. In
Pulse Chase Experimenten war bei Depletion von Ffh die Sekretion von Hbp beträchtlich,
jedoch nicht vollständig blockiert; alleinige SecB Depletion veränderte die Effizienz der
Sekretion von Hbp dagegen nicht. Bei Verwendung einer Doppelmutante, in der gleichzeitig
SecB und Ffh depletiert worden waren, war die Sekretion von Hbp stärker beeinträchtigt als
bei alleiniger Ffh Depletion. Diese Ergebnisse wurden so interpretiert, dass SecB in
Abwesenheit von SRP dieses teilweise substituieren kann: das bedeutet, dass SRP für ein
optimales Targeting von Hbp an die Innenmembran notwendig ist; SecB, das per se für das
Membrantargeting nicht erforderlich ist, kann allerdings als alternativer Targetingweg
benutzt werden und somit die SRP Depletion bis zu einem gewissen Grade kompensieren
(Sjibrandi et al., 2003).
Vergleichbares wurde auch für den Transport der SecB abhängigen Proteine OmpA und
MBP beobachtet, wenn deren Signalsequenz durch jene von EspP (ohne N-terminale
Extension) ersetzt wurde. Eine SecB- oder SRP-Depletion alleine hatte keinen
Transportdefekt der Fusionsproteine zur Folge, während bei gleichzeitiger Depletion beider
Translokationsfaktoren der Transport blockiert war. Daraus schlossen die Autoren, dass
MBP und OmpA aufgrund der Anwesenheit der Signalsequenz von EspP SRP abhängig zur
Membran zielgesteuert werden. In Abwesenheit von SRP übernimmt SecB die
Zielsteuerung. Allerdings ist unklar, ob für diese Zielsteuerung eine Interaktion zwischen
SecB und der EspP Signalsequenz notwendig ist, da SecB in jedem Fall mit dem reifen
OmpA bzw. MBP Teil der Fusionsproteine interagieren kann (Peterson et al., 2003).
Dafür, dass SRP und SecB in das Innenmembrantargeting ein und desselben Proteins
involviert sein können, gibt es weitere Hinweise. So wurde gezeigt, dass sich das
Targetingverhalten des sekretorischen Proteins MBP an die Innenmembran
ändert,
wenn
dessen
Signalsequenz
durch
die
erste
vollständig
Transmembrandomäne
des
Innenmembranproteins AcrB ersetzt wurde: die SecB Abhängigkeit ging verloren, MBP
unterlag nun einem vollkommen SRP abhängigen Targeting an die Innenmembran. Eine
leichte Erhöhung der Hydrophobizität der Signalsequenz von MBP führte ebenfalls zu einer
SRP Abhängigkeit des Transportes, ohne dabei jedoch die SecB Abhängigkeit vollkommen
125
Diskussion
zu zerstören. War der SRP Weg beeinträchtigt, so konnte SecB den Transport des mutierten
MBPs ersetzen (Lee and Bernstein, 2001).
Dass sich SRP und SecB in ihrer Funktion ergänzen können, weist auf eine mögliche
Flexibilität des Proteintargetings in E.coli hin (Kim et al., 2001). Ein SRP abhängiges, cotranslationales Targeting ist für ein Protein wie Hbp sicherlich günstig, birgt jedoch die
Gefahr einer Überlastung des SRP Weges. Bei limitiertem SRP Angebot wird dieses
bevorzugt von Innenmembranproteinen gebunden, deren Signalankerdomänen weitaus
hydrophober sind als die Signalsequenzen sekretorischer Proteine (Kim et al., 2001). Unter
solchen Bedingungen erscheint die Idee passend, dass SecB die Targetingfunktion von SRP
übernehmen kann. Welche Rolle SecB beim Targeting und der Translokation von FHA
spielt, ist daher Gegenstand der folgenden Kapitel.
7.5.2 FHA, das im Cytoplasma nur für kurze Zeit translokations-kompetent ist,
benötigt SecB für eine effiziente Translokation
Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass sich die Translokation von sekretorischen Proteinen
in E.coli post-translational und damit nach Vollendung der Synthese vollzieht. Das erfordert
die Anwesenheit von molekularen Chaperonen, weil sekretorische Proteine zu ihrer
Translokation in einem translokations-kompetenten Zustand bzw. einer entfaltbaren
Konformation im Zytoplasma vorliegen müssen (Randall and Hardy, 1986). Zu
den
molekularen Chaperonen, die die Faltung von Proteinvorläufern im Cytoplasma verhindern
und dadurch zu deren Translokationskompetenz beitragen, gehört auch das exportspezifische
Chaperon SecB (Collier et al., 1988; Weiss et al., 1988; Lecker et al., 1989; Lecker et al.,
1990). Zusätzlich konnte SecB Proteine disaggregieren (Khisty and Randall, 1995) und
durch Auflösung löslicher Proteinaggregate zur Rettung von aggregiertem bzw.
missgefaltetem Protein beitragen (Panse et al., 2000).
An der Aufrechterhaltung der Exportkompetenz von sowohl SecB-abhängigen als auch
SecB-unabhängigen Sekretproteinen sind zusätzlich andere Chaperone, insbesondere Dnak,
DnaJ und GrpE beteiligt (Wild et al., 1992; Wild et al., 1996). In Abwesenheit von SecB
konnten einige dieser Chaperone zwar die vorläufige Faltung der Vorläuferproteine
verhindern, nicht jedoch die Targetingfunktion von SecB übernehmen (Lecker et al., 1989).
In anderen Untersuchungen konnte SecB die vorläufige Faltung sekretorischer Proteine im
Cytoplasma nicht verhindern (Stenberg and Fersht, 1997; Panse et al., 1998), bzw. SecB
vermochte nicht, diese in einem transport-kompetenten Zustand zu halten (De Cock and
Diskussion
126
Tommassen, 1992; Ernst et al., 1994; Francetic and Kumamoto, 1996). Vermutlich spielt die
Targetingfunktion von SecB eine bedeutendere Rolle als seine Chaperonfunktion. Die
Targetingfunktion von SecB wurde in vitro direkt durch die SecB vermittelte Bindung von
Vorläuferproteinen an Plasma-Membran-Vesikel nachgewiesen (Hartl et al., 1990;
Swidersky et al., 1990). Vermittelt wird die Targetingfunktion von SecB durch seine
Fähigkeit mit SecA zu interagieren. Die 22 COOH-terminalen Aminosäuren beider SecA
Monomere sind mit positiv geladenen Aminosäuren angereichert und repräsentieren die
SecB Bindestelle (Breukink et al., 1995; Fekkes et al., 1997). An der Translokation selbst ist
SecB jedoch nicht beteiligt: SecB dissoziiert vor dem ersten Insertions-Deinsertions-Zyklus
von dem Komplex aus Vorläuferprotein und SecA (Fekkes et al., 1997).
Die Rolle, die SecB bei der Translokation von FHA spielt, wurde in dieser Arbeit untersucht.
Dabei zeigte sich bei Versuchen mit harnstoffbehandelten Vesikeln, dass SecB für eine
effiziente Translokation zwingend erforderlich ist (Abb. 6.15). Aufgrund der Abhängigkeit
der Translokation von SecA und SecB würde man erwarten, dass FHA post-translational
transportiert wird. Erzeugt man allerdings Bedingungen unter denen das Protein vom
Ribosom abgelöst wurde und daher nur noch post-translational transportiert werden kann,
dann war im Gegensatz zu OmpA ein eindeutiger Translokationsdefekt zu beobachten. Auch
ein Überschuss an SecB vermochte nicht, diesen Translokationsdefekt, der unter posttranslationalen Bedingungen auftrat, aufzuheben (siehe 6.3.2). Eine Entfernung der Nterminalen Extension beeinflusste weder die SecB Abhängigkeit der Translokation von FHA
noch dessen begrenzte Translokationskompetenz.
Weitere Versuche lieferten Hinweise, dass das Protein mit zunehmender Proteingröße
verstärkt zur Aggregation neigt (siehe 6.3.3) und, dass lange Ketten von FHA nur dann
effizient transloziert werden können, wenn INV zu Beginn der Synthese im System
vorhanden sind (Abb. 6.7). Kurze Kette ließen sich dagegen auch unter rein posttranslationalen Bedingungen transportieren (Abb. 6.12)
Dass
SecB
Chaperonfunktion
übernehmen
kann
und
den
Verlust
der
Translokationskompetenz eines Vorläuferproteins im Cytoplasma verzögern kann (Kusters
et al., 1989), wurde für FHA nicht bestätigt. Im Gegensatz zum Versuchsansatz von Kusters
et al., der mit gereinigtem und denaturiertem Vorläuferprotein arbeitete, wurde FHA hier in
seiner nativen cytosolischen Umgebung synthetisiert, in der es niemals eine vollständig
ungefaltete Konformation einnehmen würde. Folglich scheint SecB in einer in vivo
ähnlichen Situation eher Targeting- als Chaperonfunktion zu übernehmen. Auch der
Nachweis, dass SecB selektiv an naszierende Ketten von Sekretproteinen bindet, spricht für
eine primäre Targetingfunktion von SecB (Kumamoto and Francetić, 1993).
127
Diskussion
Ein Beispiel für ein sekretorisches Protein, das trotz Bindung an SecB nicht posttranslational transportiert wird, ist LamB. Für dieses Protein wurde ein löslicher Komplex
mit SecA und SecB isoliert, der kaum in INV transloziert werden konnte (Hoffschulte et al.,
1994). Die Translokation von LamB verhielt sich daher ähnlich wie die von FHA: SecB war
limitierend für eine effiziente Translokation von LamB; bei post-translationaler INV Zugabe
konnte ein Überschuss an SecB jedoch nicht die Annahme eines translokationsinkompetenen Zustandes verhindern (Ernst et al., 1994). Mögliche Erklärungen für das
Verhalten von FHA (und auch von LamB) sind, dass weitere Targetingfaktoren neben SecA
und SecB notwendig sind. Denkbar ist auch, dass SecB eine co-translationale Zielsteuerung
vermittelt.
7.5.3 Kann SecB eine co-translationale Zielsteuerung von FHA übernehmen?
Generell wird angenommen, dass sekretorische Proteine von Bakterien im Cytoplasma posttranslational von SecA und SecB erkannt werden und anschließend zur Membran gebracht
werden. Wäre nicht für solche Proteine wie FHA auch ein co-translationales Targeting
denkbar, das SecB nach co-translationaler Bindung vermittelt?
Ob SecB die Signalsequenz sekretorischer Proteine bindet, ist bislang nicht geklärt; es gibt
Hinweise, die dafür (Watanabe and Blobel, 1989; Watanabe and Blobel, 1995; Altman et al.,
1990) und solche, die dagegen (Randall et al., 1990; Randall et al., 1998) sprechen.
Allgemein akzeptiert ist jedoch, dass SecB den reifen Teil eines Proteins erkennt (Randall
and Hardy, 1995). In Anbetracht der Tatsache, dass SecB verschiedene interne Segmente des
reifen Teils, nicht aber die Signalsequenz erkennt (Randall et al., 1998), kann eine früh cotranslationale Bindung ausgeschlossen werden. Eine spät co-translationale Bindung tritt in
der Tat erst dann auf, wenn das wachsende Polypeptid eine Länge von mehr als 150
Aminosäuren erreicht hat (Knoblauch et al., 1999; Randall et al., 1997). Für einige Substrate
wurden im reifen Teil SecB Bindemotive ausfindig gemacht, die zwischen 60 und 160
Aminosäuren lang sind (Altman et al., 1990; Topping and Randall, 1994; Khisty et al., 1995;
Smith et al., 1997). Allgemein bindet SecB bevorzugt neun Aminosäuren lange Motive, die
mit aromatischen und basischen Aminosäuren angereichert sind (Knoblauch et al., 1999).
Ein großer Teil des SecB abhängigen, sekretorischen Proteins MBP wird post-translational,
ein kleiner Teil (35%) dagegen co-translational über die Innenmembran transportiert
(Josefsson and Randall, 1981). Dabei war SecB für das co-translationale Prozessing von
MBP verantwortlich; in Abwesenheit von SecB konnte MBP nur noch post-translational
Diskussion
128
transportiert werden, außerdem war die Transportkinetik verändert. War in Abwesenheit von
SecB nur ein langsamer, post-translationaler Transport von MBP möglich, so vollzog sich
der Transport in Anwesenheit von SecB sehr schnell, unabhängig davon, ob er co- oder posttranslational geschah (Kumamoto and Gannon, 1988). Daraus schloss man, dass SecB
sowohl am co- als auch am post-translationalen Transport beteiligt ist, was dadurch bestätigt
wurde, dass sowohl Volllängen-Proteine als auch naszierende Ketten sekretorischer Proteine
im Komplex mit SecB gefunden wurden (Kumamoto and Francetic, 1993; Khisty and
Randall, 1995).
Quervernetzungsexperimente zeigten dagegen, dass die naszierende Kette des sekretorischen
Proteins OmpA für die Translokationsfaktoren SecA und SecB aufgrund der Trigger Factor
Bindung nicht zugänglich ist (Beck et al., 2000; Eisner et al., 2003). In Einklang mit den
Quervernetzungsexperimenten konnten naszierende Ketten mittels SecA und SecB nicht an
Membranvesikel gebunden werden (Behrmann et al., 1998), was ebenfalls für eine posttranslationale Bindung von SecA und SecB an sekretorische Proteine spricht.
Flotationsexperimente lieferten bislang keinen Hinweis darauf, dass FHA einem cotranslationalen Innenmembrantargeting unterliegt. Mit Flotationsexperimenten kann
allerdings keine wirklich eindeutige Aussage über das Membrantargeting von SecA/SecB
abhängigen Proteinen gemacht werden, wenn man davon ausgeht, dass ihre Interaktion mit
der Membran über SecA und SecB vermutlich nicht so stabil ist wie die von
Innenmembranproteinen. Jene sind über ihre Transmembrandomänen fest mit den
Membranlipiden verankert und daher unempfindlich gegenüber mechanischen Einflüssen,
die beispielsweise bei der Zentrifugation auftreten und zu einer Lösung von Protein-ProteinWechselwirkungen führen könnten.
Ob ein co-translationales Targeting des SecA- und SecB-abhängigen FHA möglich ist, ist
daher mit Hilfe von Versuchen untersucht worden, in denen SecY mit naszierenden Ketten
von FHA quervernetzt wurde. Im Gegensatz zu OmpA (Dissertationsschrift von Beck)
konnten naszierende Ketten von FHA unabhängig von ihrer Länge mit SecY quervernetzt
werden (Abb. 6.20), während eine SRP Bindung nur für kurze (Fha*-100-RANCs), nicht
jedoch für lange (FhaB*-135-RANCs) naszierende Ketten von FHA gezeigt werden konnte.
Die Interaktion zwischen naszierenden Ketten von FHA und SecY spricht somit für die
Möglichkeit eines co-translationalen Targetings an die Innenmembran; die Tatsache, dass
keine funktionelle Interaktion zwischen naszierenden Ketten von FHA und SRP zu
beobachten war, bedeutet allerdings, dass das co-translationale Targeting nicht durch SRP
vermittelt sein kann. Spekuliert wird daher, dass SecB das co-translationale Targeting an die
129
Diskussion
Innenmembran von FHA übernehmen kann. Das konnte jedoch im Rahmen dieser Arbeit
nicht geklärt werden und müsste durch weitere Experimente überprüft werden.
Im Gegensatz zu FHA können ribosomenassoziierte naszierende Ketten von pOmpA, das
post-translational an die Membran gebracht wird, nicht mit SecY quervernetzt werden. Eine
Interaktion zwischen OmpA und SecY ist nur dann nachweisbar, wenn OmpA-Ketten nach
Ablösung des Ribosomes künstlich im Translokationskanal arretiert werden (Beck et al.,
2000).
Bei der Beurteilung der physiologischen Bedeutung der SecY Crosslinks muss allerdings
berücksichtigt werden, dass diese theoretisch auch aus einem unspezifischen Targeting und
somit aus einer nicht funktionellen Interaktion zwischen SecY und naszierenden Ketten
resultieren können. Ein entsprechendes Phänomen, nämlich ein SRP-unabhängiges Targeting
an das Sec61 Translokon des Endoplasmatischen Retikulums von Säugerzellen, war schon
zuvor beobachtet worden. Dieses Targeting war jedoch nicht funktionell (Jungnickel und
Rapoport, 1995) und wurde auf die hohen Konzentrationen an naszierenden Ketten und
Translokons im in-vitro-System zurückgeführt (Neuhof et al., 1998; Raden und Gilmore,
1998). Außerdem binden Ribosomen nicht nur über naszierende Polypeptidketten, sondern
auch über ihre ribosomale RNA (rRNA) direkt an ein Translokon (Prinz et al., 2000).
Es soll hier ein hypothetisches Modell vorgeschlagen werden, in dem angenommen wird,
dass SecB das co-translationale Targeting von FHA übernehmen kann:
Die wachsende Polypeptidkette wird am Ribosom früh co-translational von Trigger Factor
gebunden; hierdurch wird eine Interaktion mit SRP verhindert und das Protein für den SecA
Weg bestimmt. Trigger Factor kann das Protein zwar in einem translokationskompetenten
Zustand stabilisieren (Crooke et al., 1988; Lill et al., 1988), er kann aus eigener Kraft jedoch
kein Targeting vermitteln (Guthrie and Wickner, 1990). Dazu bindet
SecB spät co-
translational an ein mögliches Motiv im reifen Proteinteil der naszierenden Kette und
interagiert anschließend mit membranassoziiertem SecA, das die Signalsequenz der
wachsenden Polypeptidkette erkennt und somit die Translokation von FHA vermittelt.
Theoretisch ist natürlich auch eine Interaktion des SecB-RANC-Komplexes mit löslichem
SecA und ein anschließendes Membrantargeting denkbar; die Affinität von SecB zu SecA ist
allerdings besonders hoch, wenn SecA membrangebunden vorliegt und gleichzeitig ein
Substrat anwesend ist (Den Blaauwen et al., 1997; Hartl et al., 1990; Fekkes et al., 1997).
Eine Bindung der naszierenden Kette durch Trigger Factor schließt die SecB Bindung nicht
aus, da Trigger Factor präferenziell früh bindet, während SecB zu einem späteren Zeitpunkt
der Elongation eine höhere Bindeaffinität besitzt (Lecker et al., 1989). Außerdem wurde
Diskussion
130
kürzlich postuliert, dass SecB nur in solchen Zellen eine Rolle spielt, in denen auch Trigger
Factor enthalten ist; SecB bindet solche Ketten, die eine gewisse Kettenlänge erreichen,
während sie an Trigger Factor gebunden sind (Lee and Bernstein, 2002).
N
Signalpeptidase
G
G
SecY
SecA
SecY
N
SecY
SecY
E
SecA
ATP
SecB
SecY
G
N
E
SecY
SecB
TF
SecA
E
∆ pH
C
ADP + P
C
SecB
N
TTFF
Naszierende Kette
von FHA
N
SR
P
TF
A
Ribosom
Abb. 7.1 Graphische Darstellung des hypothetischen Modells zum Transportmechanismus
von FHA
FHA wird früh co-translational von Trigger Factor gebunden; dadurch wird eine SRP Interaktion
verhindert und das Protein für den SecA/SecB Weg vorherbestimmt. Spät co-translational bindet
SecB an FHA, um das Targeting an die Innenmembran zu übernehmen. Die Translokation durch das
SecYEG Translokon erfolgt anschließend in Abhängigkeit von SecA.
Für SepA konnte eine SecB Abhängigkeit in dieser Arbeit nicht nachgewiesen werden. Da
SepA wie FHA nur für einen kurzen Zeitraum translokationskompetent ist, ist eine
Beteiligung bislang unbekannter Faktoren, die ein co-translationales Targeting vermitteln,
denkbar.
Man muss sich an dieser Stelle jedoch noch einmal darüber im Klaren sein, dass der
Transport von Proteinen aus den Organismen Bordetella pertussis bzw. Shigella flexneri in
einem in vitro System aus E.coli untersucht wurde. Möglicherweise findet man in diesen
drei Organismen eine unterschiedliche Ausstattung mit Chaperonen und Transportfaktoren
vor. Das würde bedeuten, dass FHA und SepA in Bordetella pertussis bzw. in Shigella
flexneri auf zusätzliche Faktoren zurückgreifen können, die in dem hier verwendeten in vitro
System nicht angeboten wurden.
131
Diskussion
In dem hier verwendeten in vitro System aus E. coli hatte auch die Anwesenheit der
Extension zu keinem Zeitpunkt des Transportes einen Einfluss. Möglicherweise ist sie im
eigentlichen Organismus des Proteins jedoch an einer Bindung spezieller, in E. coli nicht
vorhandener Faktoren, involviert bzw. übernimmt eine spezifische Funktion während des
Transportprozesses.
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9.
Anhang
Anhang
9.1 Abkürzungsverzeichnis
A
AA
Abb.
Ac
ADP
AM
Amp
APS
AS
ATP
B. pertussis
Bp
BSA
bvg
Cm
Co-transl. INV
CP
CPK
CTF
CTP
DEPC
GTP
DMSO
DNA
DnaJ
DnaK
DNT
NTP
DSS
∆tig
DTT
TTP
UTP
E. coli
EDC
EDTA
ER
EspP
EtOH
Ffh
FHA
FHA∆ext
FhaB
Absorption
Acrylamid
Abbildung
Acetat
Adenosin-5´-Diphosphat
Außenmembran
Ampicillin
Ammoniumperoxodisulfat
Aminosäure(n)
Adenosin-5´-Triphosphat
Bordetella pertussis
Basenpaar(e)
Rinderserumalbumin
Bordetella Virluenz Gen
Chloramphenicol
INV Zugabe 5 Minuten nach Synthesebeginn
Kreatinphosphat
Kreatinphosphatkinase
Cytosolische Translationsfaktoren
Cytidin-5´-Triphosphat
Diethylpyrocarbonat
Guanosin-5´-Triphosphat
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure
bakterielles Chaperon der Hsp40 Familie
bakterielles Chaperon der Hsp70 Familie
Dermonekrotische Toxin, B. pertussis
Nucleosid-5´-Triphosphat
Dissuccinimidylsuberat
Trigger Factor Deletion
Dithiotreitol
Thymidin-5´-Triphosphat
Uridin-5´-Triphosphat
Escherichia coli
1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimide
Hydrochloride
Ethylendiamintetraacetat
Endoplasmatisches Retikulum
Serin Protease, E. coli
Ethanol
Fifty-four homolgoue, auch P48 genannt, Proteinanteil des
bakteriellen SRP
Filamentöses Hämagglutinin
FHA ohne N-terminale Extension
Vorläuferprotein von FHA
Anhang
FhaB*
FhaB*∆ext
FhaB∆ext
FPLC
Fraktion P
FtsY
GroEL
GSP
GTP
H. influenzae
Hbp
HEPES
H-FhaB*
HINV
His-6-Tag
HMW1
H-OmpA
IcsA
IF2
IM
INV
IP (α)
IPTG
Kan
Kb
kD
K2HPO4
KH2PO4
LB-Medium
M
MBS
MGF
Momp2
MPB
mRNA
MtlA
MtlA-MGF
N. gonorrhoe
Ni+-NTA-Agarose
NTP
OD
OmpA
OppA
PAGE
PCR
PEG
PEP
pFhaB*
pFhaB*∆ext
158
Verkürztes Fragment von FHA
Verkürztes Fragment von FHA ohne N-terminale Extension
Vorläuferprotein von FHA ohne N-terminale Extension
Fast performance liquid chromatography
Pelletfraktion
bakterieller SRP-Rezeptor (SR)
bakterielles Chaperon der Hsp60 Familie
General Secretion pathway
Guanosin-5´-Triphosphat
Haemophilus influenzae
Hämoglobin Protease aus E. coli
N-(2-Hydoxyethyl)piperazin-N‘-(2-Ethan-Sulfonsäure)
harnstoffdenaturiertes FhaB*
harnstoffgewaschene INV
Hexa-His-Anhang
High-Molecular-Weight (surface exposed) Protein, H.
influenzae
harnstoffdenaturiertes OmpA
Intracelluar Spreading Protein A, Sh. flexneri
Initiationsfaktor 2
Innenmembran
„Inside-out“ Innenmembranvesikel
Immunpräzipitation (gegen)
Isopropyl-β-D-thiogalactosid
Kanamycin
Kilobasenpaare
Kilodalton
Dikaliumhydrogenphosphat
Kaliumdihydrogenphosphat
Luria Broth Medium
molar
m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester
membrangeschütztes Fragment
Hybridprotein aus der ersten Signal-Anker-Sequenz von MtlA
und dem signalsequenzlosen OmpA
Maltose Binding Protein
messenger RNA
Mannitpermease
Membrangeschütztes Fragment von MtlA
Neisseria gonorrhoe
Nickel-Nitrilo-Tetra-Essigsäure Agarose
Nukleosidtriphosphat
Optische Dichte
Outer membrane protein A, sekretorisches Protein
Oligopeptide Binding Protein
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Polymerasekettenreaktion
Polyethylenglycol
Phosphoenolpyruvat
Vorläuferprotein des verkürzten Fragmentes von FHA
Vorläuferprotein des verkürzten Fragmentes von FHA ohne Nterminale Extension
159
PK
PLA2
PMF
PMSF
pOmpA
Post-transl. INV
pSepA
pSepA*
psi
PTX
RANC
RCS
RGD Motiv
RNA
RNase
RNaseH
RNasin
Rpm
rRNA
RT
SDS
SecA
SecB
SecDFyajC
SecYEG
SepA
SepA*
Sh. flexneri
SR
SRP
SS
TCA
Tea
TEMED
Tet
TF
TFA
TM, TMs
TPS
TpsA-Protein
TpsB-Protein
Tris
tRNA
U, u
üN
Upm
UTP
Anhang
Proteinase K
Phospholipase A2
proton motive force
Phenylmethylsulfonylfluorid
Vorläuferprotein des Outer membrane protein A
INV Zugabe 30 Minuten nach Synthesebeginn und nach
Chloramphenicol/Puromycinbehandlung
Vorläuferprotein von SepA
Vorläuferprotein des verkürzten Fragmentes von SepA
pounds per square inch
Pertussis Toxin, B. pertussis
ribosomenassoziierte naszierende Kette
rekonstituiertes System
Adhäsintypisches Arginin-Glycin-Aspartat Motiv
Ribonukleinsäure
Ribonuklease
Ribonuklease H
Ribonukleaseinhibitor
Rotationen pro Minute
ribosomale RNA
Raumtemperatur
Natriumdodecylsulfat
Motorprotein der bakteriellen Translokation
cytoplasmatisches Chaperon
nicht essentieller Proteinkomplex, assoziiert mit dem
Translokon SecYEG Translokon der bakteriellen
Innenmembran
Translokon der bakteriellen Innenmembran
Shigella extrazelluläres Protein A, Sh. flexneri
Verkürztes Fragment von SepA, Sh. flexneri
Shigella flexneri
eukaryontischer SRP-Rezeptor
Signal recognition particle
Signalsequenz
Trichloressigsäure
Triethanolamin
N, N, N‘, N‘-Tetramethylethylendiamin
Tetracylin
Trigger Factor
Trifluoressigsäure
Transmembrandomäne(n)
Two-Partner-Sekretion
Substrate, die mittels des TPS-Mechanismus transportiert
werden
Porenbildendes Außenmembranprotein, das dem TpsA Protein
den Durchtritt durch die äußere Membran erlaubt
Trihydroxymethylaminomethan
transfer-Ribonukleinsäure
Unit(s)
über Nacht
Umdrehungen pro Minute
Uridin-5´-Triphosphat
Anhang
UZ
Vol
w/w
WT
YidC
160
Ultrazentrifuge
Volumen
weight per weight (Gewicht pro Gewicht)
Wildtyp
integrales Innenmembranprotein aus E. coli
161
9.2
Anhang
Sequenz von FhaB* in pcB7
taatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgttt
aactttaagaaggagatatacat atg aac acg aac ctg tac agg ctg gtc ttc agc cat gtt
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162
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Signalsequenz
His-6-Tag
T7-Promotor
N-terminale Extension
Abb. 9.2 Sequenz von FhaB* in pcB7
163
9.3
Anhang
Sequenz von FhaB*∆ext in pFJD 112
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164
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Signalsequenz
His-6-Tag
T7-Promotor
Abb. 9.3: FhaB*∆ext in pFJD112
165
9.4
Anhang
Sequenz von SepA* in pFJD116
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Signalsequenz
Sequenz aus dem Vektor
His-6-Tag
T7-Promotor
N-terminale Extension
Abb. 9.4 Sequenz von SepA* in pFJD116
Danksagung
Danksagung
Ganz herzlich möchte ich mich bei meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Matthias Müller,
für die herzliche Aufnahme in seine Arbeitsgruppe und die Überlassung eines interessanten
Themas bedanken. Durch zahl- und hilfreiche Ratschläge, gute Ideen sowie spannende
Diskussionen hat er mich bei der Konzeption und Niederschrift dieser Arbeit auf äußerst
nette und kompetente Weise unterstützt.
Herrn Prof. Dr. Dieter Neumann-Haefelin danke ich für die Erstellung des Zweitgutachtens
dieser Arbeit.
Ein besonderer Dank gilt Dr. Michael Moser für die hervorragende Betreuung im Labor.
Durch seine große Geduld, ständige Hilfsbereitschaft und Kompetenz bei der Planung und
Durchführung der Versuche, hat er ganz besonders zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.
Vielen Dank für die nette Zusammenarbeit.
Der gesamten Arbeitsgruppe Müller, insbesondere Meriem Alami, Raluca Antonoaea,
Daniel Beha, Mascha Binder, Sandra Deitermann, Gottfried Eisner, Jörg Koch, Iris Lüke,
Dr. Ken-ichi Nishiama und Dorothea Trescher, möchte ich für ihre ständige Hilfsbereitschaft
und die nette Arbeitsatmosphäre danken. Sie haben ein Umfeld geschaffen, in dem es richtig
viel Spaß gemacht hat, zu promovieren.
Klaus Paal danke ich für die netten Arbeitsbedingungen bei der Arbeit im ersten Stock.
Dir, lieber Jörg, danke ich für das Korrekturlesen der Arbeit, für die immer vorhandenen
Ratschläge sowie Deine fachliche und außerfachliche Unterstützung.
Mein ganz besonderes Dankeschön gilt meinen Eltern, ohne die mein Studium in dieser
Form nicht möglich gewesen wäre und die mich stets bei der Verwirklichung meiner Pläne
und Wünsche unterstützt haben
Curriculum vitae
__________________________________________________________________________
PERSÖNLICHE DATEN
Geburtsdatum
Geburtsort
Familienstand
1. Januar 1979
St. Wendel
ledig
SCHULAUSBILDUNG
1985-1989
1989-1998
1998
Grundschule St. Wendel
Gymnasium Wendalinum St. Wendel
Abitur
MEDIZINISCHE AUSBILDUNG
10/1998
Beginn des Medizinstudiums an der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg
Examina
08/2000
08/2001
08/2004
11/2005
Physikum
1. Staatsexamen
2. Staatsexamen
3. Staatsexamen
Dissertation
03/2004
Promotion in der AG Prof. Müller am Institut für Biochemie und
Molekularbiologie, Universität Freiburg
Titel der Dissertation: In vitro-Untersuchungen zum
Sekretionsmechanismus von Pathogenitätsfaktoren mit einer Nterminalen Extension in Escherichia coli
Praktika und Famulaturen
07-09/1998
09/2000
03/2001
08/2002
09/2002
05-09/2003
02-03/2004
Chirurgie und Gynäkologie: Pflegedienstpraktikum im
Marienkrankenhaus St. Wendel
Biochemie: Laborpraktikum in der AG Prof. Dr. Bukau am
Institut für Biochemie und Molekularbiologie, Universität
Freiburg
Neurologie und Neurochirurgie: Famulatur im Jemen German
Hospital, Sana’a, Jemen
Innere Medizin: Famulatur in der Universitätsklinik Freiburg
Pädiatrie: Famulatur im Kanti Children’s Hospital, Kathmandu,
Nepal
Innere Medizin: Famulatur im Hospital Carlos Andrade Marin,
Quito, Ecuador und im Hospital de Orellana, Coca, Ecuador
Chirurgie und Orthopädie: Famulatur in der Praxis Dr. Gräser in
St. Wendel
Praktisches Jahr
10/2004-01/2005
02-03/2005
04-05/2005
06-08/2005
Chirurgie: Hôpitaux Universitaires de Genève, Genf, Schweiz
Innere Medizin: Universitätsklinik Freiburg
Innere Medizin: Nepean Hospital, Western Clinical School,
Penrith/Sydney, Australien
Dermatologie: Universitätsklinik Freiburg
STIPENDIEN
2001-2002
Forschungsstipendium der F.-F.-Nord-Stiftung