Gestörte Expression von CD86 und ein verändertes

Aus der Medizinischen Universitätsklinik und Poliklinik,
Abteilung Rheumatologie und Klinische Immunologie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br.
Gestörte Expression von CD86 und ein verändertes
intrazytoplasmatisches Zytokinmuster in Lymphozyten
von Patienten mit Variablem Immundefektsyndrom
(CVID)
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i.Br.
Vorgelegt im Jahr 2003
von Axel Klaus Denz
geboren in Freiburg im Breisgau
1-2
Dekan
Prof.Dr.rer.nat.M. Schumacher
1.Gutachter
Prof.Dr.med.H.-H. Peter
2.Gutachter
Prof.Dr.med.O. Haller
Jahr der Promotion
2003
1-3
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ........................................................................................................... 1-5
1.1. Aufgabe und Struktur des Immunsystems ..................................................... 1-5
1.2. Antigenprozessierung und -präsentation........................................................ 1-6
1.3. Immunglobuline.............................................................................................. 1-7
1.4. B-Zell-Immunantwort...................................................................................... 1-8
1.5. B-Zell-Maturation.......................................................................................... 1-10
1.6. Immunität und Toleranz ............................................................................... 1-13
1.7. T-Zell-Immunantwort .................................................................................... 1-14
1.8. Interaktion von antigenpräsentierenden, T- und B-Zellen ............................ 1-16
1.9. Zytokine ....................................................................................................... 1-19
1.9.1. Interleukin-2 ........................................................................................... 1-20
1.9.2. Interleukin-4 ........................................................................................... 1-21
1.9.3 Interleukin-10 .......................................................................................... 1-21
1.9.4. Interferon-γ ............................................................................................. 1-22
1.9.5. Tumornekrosefaktor-α............................................................................ 1-22
2. Variables Immundefektsyndrom (CVID)........................................................... 2-24
2.1. Krankheitsbild............................................................................................... 2-24
2.2 Pathogenese ................................................................................................. 2-27
2.3. Klassifikation ................................................................................................ 2-29
3. Fragestellungen der Arbeit ............................................................................... 3-31
4. Patienten und Kontrollen.................................................................................. 4-32
5. Material und Methoden .................................................................................... 5-35
5.1. Blutabnahme ................................................................................................ 5-35
5.2. Isolierung mononukleärer Zellen .................................................................. 5-35
5.3. Oberflächenfärbung mittels direkt-konjugierter Antikörper ........................... 5-36
5.4. Analyse der Zellen mittels Durchflußzytometrie ......................................... 5-43
5.4.1. Funktionsweise des FACS ..................................................................... 5-43
5.4.2. Auswertungsprinzipien ........................................................................... 5-44
5.4.3. Vorteile der Methode.............................................................................. 5-45
5.5 B-Zellselektionierung..................................................................................... 5-45
5.6. B-Zellstimulation........................................................................................... 5-46
5.7. Immunglobulin-ELISA .................................................................................. 5-47
1-4
5.8. Quantitative Bestimmung der mRNA für CD86 ............................................ 5-48
5.9. T-Zelldepletion ............................................................................................. 5-49
5.10. T-Zellstimulation......................................................................................... 5-50
5.11. Färbung intrazytoplasmatischer Zytokine................................................... 5-51
6. Ergebnisse ....................................................................................................... 6-52
6.1. B-Zell-Ergebnisse......................................................................................... 6-52
6.1.1. Klassifikation der Patienten .................................................................... 6-52
6.1.2. Expression von Reifungsmarkern und Kostimulationsmolekülen ........... 6-53
6.1.3. Kinetik der Regulation von CD69, CD80, CD86 und CD23 .................... 6-55
6.1.4. Expression von CD69, CD80, CD86, CD62L, CD137 und CD23 nach
Stimulation ....................................................................................................... 6-57
6.1.5. Regulation der CD86 mRNA in B-Zellen ................................................ 6-63
6.2. T-Zell-Ergebnisse......................................................................................... 6-67
6.2.1. T-Zelloberflächenfärbung (native Zellen)................................................ 6-67
6.2.2. Oberflächenfärbung stimulierter T-Zellen ............................................... 6-70
6.2.3. Intrazytoplasmatische Zytokine in CD4+ und CD8+ T-Zellen................. 6-72
6.3.1. Transformation und Etablierung von B-Zell-Linien ................................. 6-74
6.3.2. EBV-Linien-Ergebnisse .......................................................................... 6-75
6.4. Native Monozyten ........................................................................................ 6-77
7. Diskussion........................................................................................................ 7-80
7.1. Untersuchung von nativen B-Zellen ............................................................. 7-80
7.2. Untersuchung von stimulierten B-Zellen ...................................................... 7-82
7.3. Untersuchung von nativen T-Zellen ............................................................. 7-88
7.4. Untersuchung von stimulierten T-Zellen....................................................... 7-90
7.5. Intrazytoplasmatischer Nachweis von Zytokinen in CD4+ und CD8 T-Zellen7-91
8. Zusammenfassung........................................................................................... 8-94
9. Referenzen ...................................................................................................... 9-95
10.
Veröffentlichungen .................................................................................... 10-146
1-5
1. Einleitung
1.1. Aufgabe und Struktur des Immunsystems
Die Hauptaufgabe des Immunsystems ist es, Bakterien, Viren und ein- oder
mehrzellige Parasiten als körperfremd und damit potentiell schädlich zu erkennen
und zu eliminieren, davon die Zellen des eigenen Körpers jedoch als „Selbst“ zu
unterscheiden [87;246]. Zum Schutz vor Infektionen stehen dem menschlichen
Organismus die sich funktionell ergänzenden Systeme der unspezifischen
(natürlichen, angeborenen) und der spezifischen (erworbenen, adaptiven)
Immunität zur Verfügung. Die ersten Barrieren zur Infektabwehr sind die Haut und
die Schleimhäute, die durch einen sauren pH-Wert, Enzyme wie Lysozym und
sekretorisches IgA bereits ein Absiedeln von Erregern verhindern können
[231;392]. Gelingt es, diese Abwehr zu überwinden, stehen andere unspezifische
Mechanismen wie das Komplementsystem, Phagozyten, natürliche Killerzellen
und eine Vielzahl von Zytokinen zur Abwehr bereit [36;55;125;171]. Die
antigenspezifische Immunabwehr der Lymphozyten und Antikörper unterstützt
und vervollständigt diese Abwehrleistung der unspezifischen Immunität. Zugleich
führt die spezifische Immunität gegen Antigene zu der Fähigkeit, bei Reexposition
schneller, spezifischer und damit effizienter gegenüber dem gleichen Antigen
reagieren zu können [8;37;228;436]. Die verschiedenen Anteile dieses komplexen
Abwehrsystems kooperieren über Oberflächenstrukturen auf Zellen und humorale
Faktoren
miteinander.
Die
Lymphozyten
gehen
aus
pluripotenten
Knochenmarkvorläuferzellen hervor. Im Laufe ihrer Reifung erwerben sie die
Fähigkeit,
„selbst“
zu
erkennen,
Antigen
zu
erkennen
sowie
nach
Antigenerkennung zu proliferieren und bestimmte Funktionen anzunehmen
[246;247;250;330;368].
Zwei
Reifungsorte,
die
funktionell
verschiedene
Lymphozyten hervorbringen, werden unterschieden: der Thymus, aus dem die
sogenannten T-Lymphozyten oder T-Zellen hervorgehen [179;194;366;367] und
das Knochenmark, die Milz und die fetale Leber, die Reifungsorte der B-Zellen
sind [56;57;94;157;224]. T- und B-Zellen tragen an ihrer Oberfläche verschiedene
membranassoziierte Glykoproteine, die als Rezeptoren verschiedene Funktionen
vermitteln.
Diese
Oberflächenstrukturen
lassen
sich
durch
spezifische
monoklonale Antikörper nachweisen und erlauben so die Differenzierung der
Lymphozyten-Klassen
und
Subklassen
durch
immunhistochemische
oder
1-6
durchflußzytometrische Methoden. Drei Arten von Oberflächenrezeptoren sind
dabei für die Immunantwort wichtig: zunächst Proteine, die für „selbst“ kodieren,
zweitens Strukturen, die das Antigen erkennen und auch als „Antigenrezeptor“
bezeichnet werden, und drittens Adhäsionsmoleküle, die die Bindung an andere
Zellen vermitteln und die direkte Zell-zu-Zell-Interaktion ermöglichen. Mit der
Ausprägung der Antigenrezeptoren erwirbt der Lymphozyt die Fähigkeit, ein
individuelles Antigen selekiv zu erkennen und bei Antigenkontakt mit einer
Proliferation
des
Klons
zu
reagieren
(Prinzip
der
klonalen
Selektion)
[45;230;268;306;316].
1.2. Antigenprozessierung und -präsentation
Antigene werden von Antigen-präsentierenden Zellen (APC) durch Rezeptorvermittelte
Endozytose
proteolytische
Enzyme
aufgenommen,
zu
in
Peptidfragmenten
den
Phagolysosomen
gespalten
und
durch
binden
in
spezialisierten Kompartimenten der Zelle an körpereigene MHCII-Moleküle
[158;380]. Diese Komplexe werden auf der Zelloberfläche antigenpräsentierender
Zellen, wie follikulär-dendritische Zellen (FDC), dendritische Zellen (DC), BLymphozyten und Makrophagen, von antigenspezifischen CD4+ T-Helferzellen
erkannt [176;379;416]. Antigene im Zellinneren, wie viele virale Antigene, werden
durch Proteasomen in ihrer Proteinstruktur aufgespalten und die resultierenden
Peptide in das endoplasmatische Retikulum der Zelle transportiert, wo sie an
MHCI-Moleküle
binden
[26;162;196;320].
Dieser
Komplex
kann
an
der
Zelloberfläche von CD8+ zytotoxischen T-Zellen erkannt werden[416]. Im
Gegensatz
dazu
erkennen
B-Zellen
lösliches
Antigen
durch
ihren
antigenspezifischen oberflächengebundenen Rezeptor. Als Rezeptor fungiert ein
Antikörper, der mit seinem Fc-Teil in der Zellmembran verankert ist und mit
seinem Fab-Anteil Antigen erkennt. Die Bindung des Antigen mit Kreuzvernetzung
von Antigenrezeptoren vermittelt ein transmembranes Signal, das die terminale
Differenzierung vom B-Lymphozyten zur antikörperproduzierenden Plasmazelle
einleitet. Für die Interaktion zwischen antigenpräsentierenden Zellen und T-Zellen
als auch für das Zusammenspiel von T- und B-Zellen sind Ligandenpaare mit
Adhärenz-
und
signalleitenden
Eigenschaften
unerläßlich
[25;64;65;182;197;271;288]. Ist die Expression eines Liganden gestört, kommt es
1-7
zu gravierenden Störungen der Zell-Zell-Interaktion und letztendlich der
Immunabwehr [34;51;89;422].
1.3. Immunglobuline
Die von der Plasmazelle produzierten Antikörper sind Proteine mit hoher
Bindungsspezifität für das Antigen, das ihre Produktion ausgelöst hat [31;306].
Sie neutralisieren entweder das Antigen direkt oder vermitteln durch Aktivierung
anderer Zellen oder humoraler Faktoren die Elimination des Antigens. Sie sind als
integraler Membranbestandteil auf B-Lymphozyten exprimiert oder als freie
Moleküle im Blut, in der extravasalen Flüssigkeit der Gewebe, in exokrinen
Sekretionen oder als gebundene Moleküle auf unterschiedlichen Zellen. Die
Grundstruktur der Antikörper entspricht einem Tetramer bestehend aus zwei
identischen Paaren von schweren und leichten Polypeptidketten, die jeweils einen
variablen (V) und einen konstanten (C) Teil besitzen [29;302]. Die variablen,
aminoterminalen
Anteile
der
leichten
und
schweren
Ketten
bilden
die
Antigenbindungsstelle (Fab). Die konstanten, carboxyterminalen Anteile, als Fc
bezeichnet, vermitteln die biologische Aktivität des Antikörper [244;310]. Dies
bedeutet die Interaktion mit weiteren Molekülen und Zellen des Immunsystems,
unter anderem die Aktivierung und Fixierung von Komplementfaktoren oder die
Bindung von Killerzellen und Phagozyten. Die Antigenspezifität beruht demnach
auf der Aminosäuresequenz beziehungsweise der resultierenden Sekundär- und
Tertiärstruktur der jeweiligen V-Regionen [12]. Die Bindung des Antigen an den
Antikörper beruht auf der Ausbildung vieler schwacher, nicht-kovalenter
Bindungen,
deren
Reaktionspartner
Stärke
abhängen
von
der
[147;396].
räumlichen
Die
Kongruenz
konstanten
der
beiden
Abschnitte
der
Schwerketten lassen sich in fünf verschiedene Klassen einteilen, die als µ, α, γ, δ
und ε bezeichnet werden, Antikörper mit entsprechendem Schwerkettentyp als
Immunglobulin (Ig)M, IgA, IgG, IgD und IgE. Die Antikörperklasse hat keinen
Einfluß auf die Antigenspezifität des Antikörpers, entscheidet aber, welche
biologischen Funktionen von dem entsprechenden Antikörper vermittelt werden
[213]. Die Vielfalt der gebildeten Antikörpermoleküle hat mehrere Mechanismen
zur Grundlage. Die genetische Information für die Antikörperproteine ist auf drei
Gene verteilt, wobei eines für die Leichtkette vom χ-Typ (Chromosom 2), eines für
1-8
die vom λ-Typ (Chromosom 22) und eines für die Schwerkette (Chromosom 14)
kodiert
[96;168;375].
Bei
der
Reifung,
also
der
Differenzierung
zur
antigenspezifischen B-Zelle, werden auf DNA-Ebene die Genabschnitte neu
geordnet (Rearrangement), wobei für die Leichtkette stets ein V-Abschnitt mit
einer J-Sequenz an das Gen für den konstanten Abschnitt angefügt wird. Dabei
findet die Festlegung der B-Zelle auf einen Leichtkettentyp (χ oder λ) und eine
Antikörperspezifität statt. Für die Schwerkette ist die genetische Information linear
auf vier Gensegmenten angeordnet. Zunächst die Gene, die für alle möglichen VAbschnitte kodieren, dann die sogenannten D(„diversity“)-Gene, dann J(„joining“)Gene
und
schließlich
die
Information
für
die
Schwerkettenklassen
[136;166;168;300]. Nach einem Rearrangement ähnlich dem bei der Leichtkette
verfügt die reife B-Zelle nur noch über die Information für jeweils eine V-, eine Dund eine J-Region, aber für alle Schwerkettentypen. Sie kann somit potentiell
Schwerketten aller Klassen, jedoch nur einer Spezifität bilden. Die variablen
Regionen der schweren (VhiDJ) und der leichten (VliJ) Ketten bilden zusammen
die Antigenbindungsstelle. Geht man von einer geschätzten Anzahl der Vli-Gene
(200) und der Vhi-Gene (200) aus und berücksichtigt die Diversität der J- und DSegemente, so beliefe sich die Zahl der theoretisch möglichen Rearrangements
und damit Antikörperspezifitäten auf ca. 48x106. Da aber wahrscheinlich nicht alle
Rearrangements gleich häufig und erfolgreich sind, ist die Zahl wohl geringer. Die
ungenaue Verknüpfung der Gensegmente und die Einführung von P- und NNukleotiden erzeugen eine zusätzliche Variabilität. Nachdem ein Antikörper
exprimiert ist, unterliegt er schließlich einer weiterer Veränderlichkeit durch
somatische Hypermutation [168;235;371;410]. Die Kombination all dieser
Mechanismen zur Erzeugung von Vielfalt schafft aus einer relativ begrenzten
Anzahl von Genen ein riesiges Repertoire von Antikörperspezifitäten.
1.4. B-Zell-Immunantwort
Eine einzelne B-Zelle exprimiert auf ihrer Zelloberfläche Immunglobulinmoleküle
in einer Anzahl von 1-300000, die sich von sezernierten Immunglobulinen durch
einen transmembranösen (25AS) und einen zytoplasmatischen Anteil (3AS)
unterscheiden. Ihnen kommen zwei unterschiedliche Funktionen zu: einerseits
vermitteln diese Antikörper die Bindung und Aufnahme von löslichen Antigenen
1-9
und
ermöglichen
Andererseits
so
die
dienen
die
antigenpräsentierende
Immunglobuline
Funktion
zusammen
der
B-Zellen.
mit
weiteren
Oberflächenmolekülen als transmembrane Rezeptoren zur Zellaktivierung [31;86].
Alle Immunglobulinisotypen können einen B-Zell Antigenrezeptor bilden. Die
variable Region der Immunglobuline erkennt das für sie spezifische Epitop und
übermittelt Aktivierungssignale ins Zellinnere. Hierzu bedarf es der nichtkovalenten Assoziation mit dem heterodimeren Oberflächenmolekül Igα (CD79α)
- Igβ (CD79β), das in seiner Struktur mit den T-Zell-Antigenrezeptor assoziierten
CD3γ-, -δ-, -ε-Ketten vergleichbar ist. Die Erkennung und Bindung von
multivalenten
Antigenen
führt
zur
Vernetzung
der
zellständigen
Rezeptorkomplexe und induziert eine Reihe von Veränderungen mit einer
differenzierten Genexpression abhängig vom Stadium der B-Zell-Reife [203;315].
Um eine B-Zell-Antwort gegen die meisten Antigene bilden zu können, sind zum
B-Zell-Antigenrezeptor zusätzlich weitere Oberflächenmoleküle notwendig, die die
Aktivierungssignale
verstärken
oder
modulieren.
Diese
sogenannnten
Korezeptoren schließen den CD19/CD21/CD81-Komplex, CD22, CD45 und den
FcγRIIb-Rezeptor
ein
[44;60;127;389].
CD19
ist
ein
Glykoprotein
der
Immunglobulin-Superfamilie, welches als linienspezifischer Marker bereits im
Stadium der frühen Pro-B-Zelle exprimiert wird [281;339]. Es spielt eine wichtige
Rolle bei der Aufrechterhaltung und Expansion des B-Zell-Repertoire gegenüber
T-Zell-abhängigen Antigenen und ist bei der Bildung von Gedächtniszellen von
Bedeutung [318;377]. Durch die integrierte Funktion von CD19/CD21/CD81
können B-Zellen bereits durch geringe Antigenmengen stimuliert werden. In
Abwesenheit
von
CD19
ist
eine
hundert-
bis
tausendfach
höhere
Antigenkonzentration notwendig, um den selben Effekt zu erzielen [59;127]. Die
Bindung
von
multivalentem
Antigen
führt
zur
Kreuzvernetzung
der
Rezeptorkomplexe und stößt eine Reihe von Veränderungen an, die eine
differenzierte Genexpression bedingen. Erster Schritt dieser Aktivierungskaskade
ist die Phosphorylierung der ITAM-Anteile der Igα- und Igβ-Ketten (CD79) durch
Protein-Tyrosin-Kinasen (PTK) der Src-, Syk- und Tec-Familien, deren Aktivität
durch eine membranständige Phosphatase (CD45) gesteigert werden kann. In der
Folge bindet die Proteinkinase Syk an die ITAM-Motive und wird dadurch aktiviert.
Über Serin- und Threoninphosphorylierungen unterschiedlicher Substrate, der
1-10
durch
Inositoltriphosphat
vermittelten
intrazellulären
Zunahme
der
Calciumkonzentration und der Aktivierung des ras/MAP-Signalweges kommt es
zur Aktivierung von nukleären Transkriptionsfaktoren (z.B. c-fos, EGR-1, SRF,
ets, IK-B, NF-κB). Diese bedingen das spezifische Expressionsmuster von
Genprodukten in Abhängigkeit von der Art und der Differenzierungsstufe der Zelle
[54;184;315;423].
1.5. B-Zell-Maturation
Die Reifung der B-Zellen läßt sich in eine zentrale B-Zell-Entwicklung im
Knochenmark und eine periphere B-Zell-Entwicklung der naiven B-Zellen in den
sekundären lymphatischen Geweben wie in der Milz, in den Lymphknoten und in
mukosaassoziierten
Knochenmark
lymphatischen
lassen
sich
Geweben
anhand
unterscheiden
von
[95;156].
Im
phänotypischen
Differenzierungsmerkmalen pluripotente hämatopoetische Stammzellen und die
weiteren Vorstufen der B-Zellen nachweisen. Frühe Pro-B-Zellen entsprechen
dem ersten Stadium der B-Zell-Reifung. Sie sind neben anderen Markern
charakterisiert
durch
die
Expression
von
CD10
(CALLA),
einer
membranassoziierten Endopeptidase, von CD19, einem Korezeptormolekül für
die Aktivierung von B-Zellen, von CD40, einem für die frühe Proliferation
wichtigen Glykoprotein, und von CD45, das die Signaltransduktion durch den BZell-Rezeptorkomplex und anderen membranständigen Rezeptoren moduliert
[155;192]. Die Immunglobulingene befinden sich noch in Keimbahnkonfiguration,
weshalb die Pro-B-Zellen auch keine Antikörperkette auf der Oberfläche trägt.
Späte Pro-B-Zellen unterscheiden sich nicht durch ein typisches Muster an
Differenzierungsantigenen, zeigen aber im Bereich der Gene für die schweren
Immunglobulinketten bereits eine Umlagerung von D(Diversity)- und J(Joining)Genabschnitten. Das anschließende Rearrangement der rekombinierten DJGenabschnitte mit einem V(Variable)-Gen erfolgt vorerst nur auf einem Allel. Im
Falle einer sogenannten produktiven Umlagerung mit richtigem Leseraster kann
von dieser VDJ-Sequenz die Information für eine intakte µ-Immunglobulinkette
abgelesen
werden.
Ein
Kontrollmechanismus,
der
als
allele
Exklusion
umschrieben wird, verhindert die VDJ-Rekombination des zweiten Allels und stellt
somit sicher, daß eine B-Zelle eine einzige produktive VDJ-Umlagerung besitzt.
1-11
Im Falle einer nicht produktiven Rekombination beginnen die Zellen mit der
Umlagerung des anderen Alleles des diploiden Chromosomensatzes. Die
restlichen Zellen, die nach Rekombination beider Allele immer noch keine
produktive Umlagerung erreicht haben, sterben innerhalb kurzer Zeit mangels
weiterer Differenzierungssignale [32;136;221;268]. Die Entwicklung von Pro-BZellen zu Prä-B-Zellen ist ferner von der Funktion der Tyrosinkinase btk (Bruton’s
tyrosine kinase) abhängig [184;311]. Ein Defekt dieses Enzyms führt zur X-linked
Agammaglobulinämie (XLA) [68;181;402]. Prä-B-Zellen sind gekennzeichnet
durch die erfolgreiche Oberflächenexpression einer µ-Immunglobulinkette und
den Nachweis des typischen Pan-B-Zell-Markers CD20 [154;190]. Mit der
Synthese von intakten schweren Immunglobulinketten wird nun mit den bereits
vorhandenen Proteinen λ5 und VpräB der vollständige Prä-B-Zell-Rezeptor
gebildet, der die weitere Proliferation als Bedingung für die weitere Entwicklung
ermöglicht. Prä-B-Zellen beginnen zu diesem Zeitpunkt mit der Rekombination
der Gene für die leichten Immunglobulinketten, wobei der κ-Locus zuerst
umgelagert wird [156;428]. Im Falle einer nicht produktiven Rekombination
werden nach dem Prinzip der allelen Exklusion zunächst das zweite κ-Allel und
wenn nötig die λ-Allele umgelagert. Dieser Vorgang gewährleistet, dass B-Zellen
Immunglobuline ausschließlich einer einzigen antigenen Spezifität synthetisieren
[243;268]. Die Synthese einer leichten und einer schweren Kette ermöglicht die
Bildung eines kompletten Moleküls. Dies ist ein typisches Merkmal unreifer BZellen, wie auch die Expression von CD21, einem Komplementrezeptor, welcher
gemeinsam mit CD19 und CD81 als Korezeptor an der Signalbildung zur B-ZellAktivierung beteiligt ist. Im weiteren Verlauf der Entwicklung entstehen die reifen
B-Zellen, welche auf ihrer Oberfläche durch alternatives Spleißen der mRNA
sowohl IgM als auch IgD exprimieren. Bei unveränderter Spezifität der
produzierten Antikörper kann jede einzelne B-Zelle im Verlauf ihrer Entwicklung
unterschiedliche Isotypen bilden. Dieser Wechsel in der Synthese von IgM zu
anderen Isotypen (class switch) wird durch das Antigen selbst, die Interaktion mit
T-Lymphozyten und deren Produkten oder den Ort der antigenvermittelten B-ZellAktivierung beeinflußt [39;95;129;356]. Der Vorgang des class switching ist von
zentraler immunbiologischer Bedeutung, da sich die einzelnen Isotypen in ihrer
Effektorfunktion stark unterscheiden. Die antikörperproduzierenden Plasmazellen
1-12
stehen schließlich als differenzierteste Effektorzellen am Ende der B-Zell-Reihe.
Naive B-Zellen gelangen über die Zirkulation aus dem Knochenmark in die Milz,
die Lymphknoten und in mukosaassoziiertes lymphatisches Gewebe [56;226]. In
der
B-Zell-reichen,
follikulären
Zone
dieser
Gewebe
sind
als
antigenpräsentierende Zellen die follikulär dendritischen Zellen (FDC, follicular
dendritic cells) lokalisiert [150;379]. Erkennen B-Zellen im Bereich der follikulären
Zone ihr spezifisches Antigen und erhalten gleichzeitig entsprechende T-ZellHilfe, werden sie aktiviert. Sie differenzieren sich zu Blasten, gelangen in das
Zentrum der Lymphfollikel und bilden dort Keimzentren [240]. Die Proliferation der
aktivierten B-Zellen führt innerhalb weniger Tage zu einer starken klonalen
Expansion und zur Ausbildung der typischen Merkmale eines Sekundärfollikels
mit der zentralen, von Zentroblasten gebildeten „dunklen“ Zone [52]. Nach
Involution
der
Sekundärfollikel
nach
etwa
drei
Wochen
verbleiben
antigenspezifische Zellen über Monate in diesem Bereich, die B-Gedächtniszellen
entsprechen. Während der Proliferation der Zentroblasten kommt es zur
somatischen Hypermutation, einem Vorgang, bei dem Punktmutationen von
Basenpaaren und Doppelstrangbrüche im Bereich der rearrangierten VDJ-Gene
auftreten [40;173;269]. Diese Mutationen können zu einer Veränderung der
Struktur der Antigenbindungsstelle führen und damit die Affinität der Antikörper für
das spezifische Antigen verändern. Bei einer Zunahme der Affinität spricht man
von einer Affinitätsreifung. Der nächste Schritt der peripheren B-Zell-Reifung ist
durch die Entwicklung von Zentrozyten gekennzeichnet, die perizentral im Follikel
die „helle“ Zone bilden. Follikulär-dendritische Zellen präsentieren Antigene, wobei
nur jene B-Zellen selektioniert werden, welche spezifische Immunglobuline mit
hoher Affinität besitzen. Diese positiv selektionierten Zellen entwickeln sich
schließlich zu antikörpersezernierenden Plasmazellen oder B-Gedächtniszellen
[8;437]. Während der Zellteilung stimulierter B-Zellen kann es unter Beibehaltung
der Antigenspezifität zu einem Wechsel des Isotyps und somit der biologischen
Funktion des Antikörpers kommen. Beim Isotypenwechsel (class switch)
rearrangieren die Zellen ihre Keimbahn-DNA so, dass anstelle des C-Gens für die
konstante µ-Region der schweren Kette ein anderes C-Gen verwendet wird, das
dann in unmittelbarer Nähe zur rearrangierten VDJ-Sequenz zu liegen kommt. Die
Auswahl der Immunglobulinklasse erfolgt dabei nicht zufällig, sondern ist
abhängig von der T-Helferfunktion und dem Einfluß von Zytokinen [95;356].
1-13
1.6. Immunität und Toleranz
Die immunologische Toleranz gegenüber Selbstantigenen wird durch die
Elimination oder funktionelle Inaktivierung von selbstreaktiven B- und TLymphozyten gewährleistet. Diese negativen Selektionsmechanismen lassen
physische und funktionelle Lücken im Repertoire der Antigenrezeptoren
entstehen. Diesem zum Schutz vor Autoimmunität eingeschränkten Repertoire
steht die Notwendigkeit schneller Immunantworten gegen stets veränderliche
Pathogene
entgegen.
Unreife
selbstreaktive
B-
und
T-Zellen,
die
kreuzvernetzende Antigene auf Zelloberflächen, Nukleinsäuren, MHC-Moleküle
oder andere körpereigene Strukturen erkennen, werden bereits in den zentralen
lymphatischen Organen Knochenmark und Thymus durch Apoptose beseitigt
[200;248;367]. Auf diese Weise wird es ihnen unmöglich, an Immunantworten in
peripheren lymphatischen Geweben teilzunehmen und durch ihre autoimmune
Spezifität Schaden zu verursachen. Die Notwendigkeit einer gekoppelten
Antigenerkennung durch B- und T-Zellen für die regelrechte B-Zell-Aktivierung ist
ein weiterer Mechanismus zur Sicherstellung der Selbst-Toleranz [114;128]. Für
B-Zellen erfolgt der Zelluntergang mit einer Latenz von ein bis zwei Tagen, in
denen die RAG-Gene aktiv bleiben und durch ein sekundäres ImmunglobulinGen-Rearrangement,
das
als
„receptor
editing“
bezeichnet
wird,
die
selbstreaktiven Leichtketten durch andere Spezifitäten ersetzt werden können
[200;267;317].
Von
IgM-Molekülen
auf
B-Zellen
erkannte
niedervalente,
ubiquitäre, lösliche Selbstantigene induzieren in den Zellen einen Zustand der
Inaktivierbarkeit, der Anergie genannt wird. Die anhaltende Exposition eines
relativ schwachen, kostimulatorisch defizienten antigenen Stimulus, wie gegen
Oberflächenimmunglobulin
gerichtete
Antikörper,
Serum-Lysozym
oder
Einzelstrang-DNA, vermindert die Fähigkeit der B-Zelle, nach Antigenkontakt zu
proliferieren
und
Antikörper
zu
sekretieren
[70;108;385].
Typischerweise
exprimieren anerge B-Zellen um den Faktor 20-50 weniger antigenbindendes IgM
auf ihrer Oberfläche. IgD-Rezeptoren werden normal exprimiert, jedoch ist ihr
Vermögen, die Tyrosinphosphorylierung der Igα/β-Ketten oder die der pp72syk
Kinase zu verstärken, stark vermindert [169]. Die Interaktion mit spezifischen TZellen führt nicht zur Aktivierung und klonalen Expansion, sondern zur CD95-
1-14
vermittelten Apoptose der Zelle [91]. Anerge B-Zellen sind nicht reaktionsunfähig,
doch ist das durch den Antigenrezeptor und den Transduktionskomplex generierte
Signal so stark vermindert, daß für ihre Reaktivierung ein sehr viel größerer
immunogener Stimulus als für native B-Zellen nötig ist [167;242;275].
1.7. T-Zell-Immunantwort
Der Thymus ist das primäre lymphatische Organ für die Entwicklung und Reifung
von hämatopoetischen Vorläuferzellen zu funktionellen antigenspezifischen TLymphozyten. Die Zellen durchwandern in geregelter Folge unterschiedliche
Differenzierungsstadien, unterliegen hier Selektionmechanismen zum Schutz vor
Autoreaktivität und gelangen schließlich als reife, immunkompetente T-Zellen aus
dem Thymus in die Zirkulation [97;194;366]. Diese Zellen lassen sich
unterscheiden in immunregulatorische T-Zellen, T-Zellen, die nach Aktivierung
zytotoxisch werden, T-Gedächtniszellen und T-Zellen, die eine Immunantwort
supprimieren. T-Lymphozyten erkennen Antigen über einen spezifischen
Antigenrezeptor (TCR), wenn es von einer antigenpräsentierenden Zelle
zusammen mit einem körpereigenen MHC-Molekül angeboten wird (MHCRestriktion). Die TCR bestehen aus jeweils zwei unterschiedlichen Peptidketten
(α/ β- und γ/δ-Ketten), sind in der Zellmembran verankert und bilden gemeinsam
mit einem Komplex aus mindestens 5 unterschiedlichen Peptiden (CD3) die
funktionelle Grundeinheit zur antigenspezifischen Signaltransduktion[131;424].
CD3 ist ein Proteinkomplex, welcher sich aus den CD3γ-, ε-, δ- und ξ-Ketten
zusammensetzt und als Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie Ähnlichkeit zu
CD79α (Igα) und CD79β (Igβ) des B-Zell-Antigenrezeptor-Komplexes besitzt
[135;424]. Die Aminosäuresequenz des zytoplasmatischen Abschnittes von CD3γ,
-ε und -δ enthält ein ITAM (immunoreceptor-tyrosine-based-activated-motif), das
bei Zellstimulation durch Tyrosinkinasen phosphoryliert wird und somit die weitere
Signaltransduktion über den Phospholipase-γ1(PLC-γ1)-, den Ras- oder RacAktivierungsweg einleitet [63;337]. Eine defekte Signaltransduktion führt im Falle
des Fehlens eines Moleküls (ZAP-70), das die PLC-γ1 aktiviert, zum Ausbleiben
der T-Zell-Reifung von CD8+-Thymozyten und in der Peripherie zum Fehlen
funktioneller CD4+-T-Zellen. Klinisch führt dies zu einem schweren kombinierten
1-15
Immundefekt bereits im Säuglingsalter [104;105;280]. 85-95% aller peripheren TZellen tragen den heterodimeren TCRα/β, die restlichen TCRγ/δ. In Analogie zu
den Antikörpermolekülen bestehen die TCR-Polypeptidketten α/β und γ/δ aus
variablen (V-) und konstanten (C-) Domänen. Auch die Genorganisation der
einzelnen Ketten des TCR ist denen der Gene für die Immunglobuline sehr
ähnlich. Während der T-Zell-Reifung entsteht das kodierende Exon einer
funktionalen V-β- oder V-δ-Domäne durch das Rearrangement eines V-, D- und JGensegmentes; für die kodierenden Exone einer V-α- oder V-γ-Domäne werden
je ein V- und J-Gensegment rearrangiert. Jeder reife, immunkompetente T-ZellKlon ist somit durch je eine funktionale V-α- und V-β-Domäne bzw. eine V-γ- und
V-δ-Domäne hinsichtlich seiner antigenen Spezifität charakterisiert [166;268]. Da
die relative Affinität des T-Zell-Rezeptors für den Antigen-MHC-Komplex gering
ist, erfordert die stabile Bindung einer TCRα/β tragenden T-Zelle an die APC
neben der MHC-TCR-Interaktion die Beteiligung sogenannter akzessorischer TZell-Rezeptoren. CD4 ist ein auf MHC-II-restringierten, reifen T-Zellen und
Makrophagen exprimiertes Glykoprotein, das MHC-II-Moleküle zum Zeitpunkt der
Antigenerkennung außerhalb jenes polymorphen Bereiches bindet, der für die
Antigenbindung wichtig ist. Der zytoplasmatische Teil von CD4 bindet die
Tyrosinkinase Lck und schließt so CD4 in die Signaltransduktion des erweiterten
T-Zell-Rezeptorkomplexes
ein
[144;336;400].
CD8
ist
ein
auf
MHC-I-
restringierten, reifen T-Zellen exprimiertes Heterodimer, das sich an die schwere
Kette der MHC-I-Moleküle in einem nicht-polymorphen Bereich bindet und so die
Sensitivität der Antigenerkennung stark erhöht [180;245]. Neben einem durch die
Interaktion des TCR mit einem antigenbeladenen MHC-Molekül generierten
ersten Signal ist zur T-Zell-Aktivierung ein zweites Signal durch kostimulatorische
Moleküle unerläßlich. Alle Korezeptoren wirken neben ihrer Funktion als
Adhäsionsmoleküle als signalleitende Einheiten und bestimmen über ihre
Ligandenbindung (CD2:CD58, CD11a/CD18:CD54, CD28/CTLA-4:CD80/CD86,
CD40:CD40L) über die vollständige Aktivierung der T-Zellen. Sie ermöglichen die
Aktivierung der T-Zellen bereits durch 50 bis 200 Antigen-MHC-Komplexe
[211;319;391]. Immunregulatorische T-Zellen sind CD4+-T-Zellen, die sich durch
Antigenkontakt zur Freisetzung von Lymphokinen aktivieren lassen. Mit deren
Hilfe können sie spezifische und polyklonale B-Zell-Proliferationen ebenso
1-16
unterstützen wie eine zellvermittelte Entzündungsreaktion. Die Dichotomie in Typ1- und Typ-2-Zellen ist wohl typisch für CD4+ Lymphozyten, kann aber auch in
der Population der CD8+ T-Zellen und der γ/δ-T-Zellen nachgewiesen werden. Als
Typ1 werden Th1-CD4+- oder Tc1-CD8+-Lymphozyten bezeichnet, welche vor
allem IL-2, IFN-γ und TNF-β (LT-α) sezernieren. Analog werden als Typ2 Th2CD4+- oder Tc-CD8+-Lymphozyten definiert, die typischerweise die Zytokine IL-4,
IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13 bilden [1;58;321]. Als Hauptaufgabe von Th1-CD4+-TZellen gilt die Aktivierung von Makrophagen und anderen Effektorzellen (T-Zellen,
NK-Zellen) durch die Induktion von CD40, CD80, CD86, MHC-II-Molekülen und
TNF-Rezeptoren. Desweiteren spielen sie eine Rolle bei der T-Zell-vermittelten
Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ (Delayed type hypersensitivity,
DTH) und der Bildung opsonierender Antikörper [90;222]. Die wichtigste Funktion
der Th2-CD4+-T-Zellen ist die Interaktion mit B-Zellen und damit die Regulation
der humoralen Immunantwort. Th2-Zellen sind vor allem in den parafollikulären
Zonen der Lymphknoten und der Milz angereichert, wo sie nach Aktivierung durch
dendritische Zellen mit den zu den Follikeln migrierenden B-Zellen in Kontakt
treten. Die antigenspezifische Hilfe der Th2-Zellen führt zur Aktivierung,
Proliferation und Differenzierung der B-Zellen [175;413].
1.8. Interaktion von antigenpräsentierenden, T- und B-Zellen
Aufgrund der relativ geringen Affinität des T-Zell-Rezeptors für den Antigen-MHCII-Komplex sind zusätzliche adhärenzvermittelnde und signalleitende RezeptorLigand-Paare
notwendig,
um
den
Kontakt
zwischen
T-Zellen
und
antigenpräsentierenden Zellen oder B-Zellen zu initiieren, zu verbessern und zu
stabilisieren [65;208]. Die multivalente Kreuzvernetzung des B-Zell-Rezeptors läßt
als initialer Schritt der Aktivierung die ruhende B-Zelle von der G0- in die G1Phase des Zellzyklus eintreten. Bei T-Zell-abhängigen Antigenen erlaubt dann die
durch kostimulatorische Oberflächenmoleküle und Zytokine vermittelte T-Zellhilfe
[21] die Progression durch den Zellzyklus sowie die weitere Differenzierung zur
Plasmazelle [47;156]. Einige bakterielle Polysaccharide, polymere Proteine und
Lipopolysaccharide können aufgrund ihrer speziellen Eigenschaften naive BZellen auch ohne weitere T-Zell-Hilfe zur Ausdifferenzierung stimulieren
[253;409]. Orte der Interaktion sind die sekundär-lymphatischen Organe, deren
1-17
Aufbau die notwendige Kolokalisation von Antigen, antigenpräsentierenden Zellen
(APC),
T-
und
B-Zellen
ermöglicht.
Naive
CD4+T-Zellen
treten
über
hochendotheliale Venulen in die T-Zell-Zonen der Lymphknoten oder der Milz
(PALS) ein und erkennen dort mit einer Frequenz von 104-106 Zellen ihr
spezifisches Antigen. Die aktivierten T-Zellen induzieren mittels autokriner
Stimulation durch IL-2 und der gesteigerten Expression des IL-2-Rezeptors ihren
Eintritt in die G1-Phase des Zellzyklus und ihre klonale Expansion [225;287]. Das
durch die Ligation des TCR generierte Signal bewirkt in den T-Zellen zudem die
Hochregulation des Oberflächenmoleküls CD40-Ligand (CD40L). CD40L ist ein
Glykoprotein der TNF-Familie, das auf aktivierten CD4+- und weniger häufig auch
auf CD8+-T-Zellen exprimiert wird. Einerseits wird über Signale des CD40L die
Differenzierung
von
T-Zellen
zu
funktionellen
Effektorzellen
stimuliert,
andererseits fördern Signale über das konstitutiv exprimierte CD40 die
Proliferation, die Differenzierung, den Immunglobulin-Klassenwechsel, die FasExpression und auch die Expression von CD80, CD86 und MHC-II-Molekülen auf
B-Zellen [22;394;395]. Das Fehlen von funktionellem CD40L im Rahmen eines Xchromosomal vererbten Gendefektes resultiert im klinischen Bild des Hyper-IgMSyndromes. Im Serum der Patienten läßt sich eine stark vergrößerte IgMFraktion, andere Isotypen jedoch nur in stark verminderter Menge nachweisen.
Die B-Zellen sind aufgrund der mangelnden Stimulation über CD40 nicht in der
Lage einen Klassenwechsel durchzuführen [48;129;255]. Die am besten
charakterisierten kostimulatorischen Moleküle sind die Rezeptor-Ligand-Paare
von CD28 auf T-Zellen und CD80 (B7.1), respektive CD86 (B7.2) auf APC und BZellen. CD28 gehört der Immunglobulingen-Superfamilie an und ist konstitutiv zu
95% auf allen CD4+ und zu 50% auf allen CD8+ T-Zellen exprimiert. Es generiert
unter Einbezug der Src-ähnlichen Tyrosinkinasen Lck, der Lipidkinase PI-3 und
der Proteinkinase C das für die Aktivierung naiver T-Zellen kritische zweite Signal
neben dem TCR-Signal [146;216]. Fehlt dieses zweite Signal, geht die T-Zelle in
einen anergen Zustand über oder wird bei IL-2 Mangel sogar apoptotisch. Die
gemeinsame Stimulation über den TCR und CD28 führt zudem zu einer
verstärkten Zytokinsekretion durch eine Stabilisierung der mRNA, einer Induktion
von Transkriptionsfaktoren wie NFκB und somit zu einer gesteigerten T-ZellProliferation [209;338;354]. CTLA-4 (CD152), der zweite Ligand der B7-Familie,
ist ein dem CD28 phylogenetisch verwandtes Molekül. CTLA-4 wird auf aktivierten
1-18
T-Zellen exprimiert, während auf ruhenden T-Zellen nur CD28 nachzuweisen ist.
Trotz einer nur 30%igen Homologie ihrer Aminosäuresequenz binden CD28 und
CTLA-4 an dieselben Liganden, CD80 und CD86. Verglichen mit CD28 besitzt
CTLA-4 jedoch eine 20-30fach höhere Bindungsaffinität für beide Liganden.
Neben den Strukturunterschieden des zytoplasmatischen Abschnittes von CTLA4 unterscheiden sich die beiden Moleküle auch in ihrer Wirkung auf T-Zellen.
CTLA-4 vermittelt negative Signale, welche die T-Zell-Stimulation durch APC
vermindern und in einer eingeschränkten Synthese von IL-2 resultieren
[209;284;426].
Dieser
funktionelle
Antagonismus
zu
CD28
dient
der
Gegenregulation der T-Zell-Aktivierung und wird für die Einschränkung der
Proliferation und die Terminierung der T-Zell-Antwort mitverantwortlich gemacht.
Die physiologischen Liganden von CD28 und CTLA-4 auf B-Zell-Seite sind die
Moleküle der B7-Familie [350]. In jüngster Vergangenheit wurden neben den drei
etablierten B7-Moleküle B7.1 (CD80), B7.2 (CD86) und B7.3 weitere Homologa
dieser Familie beschrieben [350]. CD80 ist ein 60kD schweres, hoch
glykosyliertes Protein, das der Immunglobulin-Supergen-Familie angehört. Es ist
vor allem auf Makrophagen, aktivierten B- und T-Zellen als homodimeres Molekül
exprimiert und dient zusammen mit CD86 der Koregulation der T-Zell-Aktivierung
[354;393]. Obwohl beide Rezeptoren zur Ig-Rezeptorfamilie zählen und an
dieselben T-Zell-Oberflächenmoleküle binden, weisen die Aminosäuresequenzen
nur eine Homologie von 26% auf. CD86 ist ein 80kD schweres, aus 323
Aminosäuren bestehendes Polypeptid. Es wird konstitutiv exprimiert von
interdigitierenden dendritischen Zellen in T-Zell-Zonen sekundär lymphatischer
Organe, von Monozyten, in geringerem Maße von Langerhans Zellen und
peripheren dendritischen Zellen [123;124]. Auf B-Zellen kann CD86 durch in vitro
Stimulation des Oberflächen-Immunglobulins, von CD40, von MHC-II-Molekülen,
durch PMA (phorbol myristate acetate) mit Ionomycin oder Infektion mit dem
Epstein-Barr-Virus (EBV) induziert werden [163;348;388;393]. CD86-mRNA ist
bereits in unstimulierten B-Zellen nachzuweisen, läßt sich aber durch Stimulation
mit anti-γ-Antikörper entsprechend der Oberflächenexpression auf das Vierfache
steigern. CD86 weist für CD152 eine 20-100fach höhere Bindungsaffinität als für
CD28 auf. Zudem sind die On/Off-Bindungsraten von CD86 für CD152 höher als
die von CD80 [223]. Die kritische Rolle für die Funktion der B-Zelle konnte in der
Maus durch Blockade von CD80 und CD86 mit löslichem, transgen-kodiertem
1-19
CD152 eindeutig gezeigt werden. Diese Mäuse wiesen eine Störung des
Klassenwechsel der Immunglobuline und der Keimzentrumsarchitektur auf. Des
weiteren zeigten CD86 knockout-Mäuse stark defiziente Antikörperantworten,
während CD80 knockout Mäuse normale Antikörperantworten aufwiesen [34;348].
Auf T-Zellen wirkt CD86 offenbar wie CD80, indem es ihre Proliferation fördert,
Anergie und Apoptose verhindert und die Synthese von IL-2 induziert [210;218].
Der initiale Kontakt zwischen T-Zellen und antigenpräsentierenden Zellen erfolgt
nicht
über
den
T-Zell-Antigenrezeptor,
sondern
geschieht
über
antigenunspezifische Adäsionsmoleküle. CD11a/CD18 (lymphocyte functionassociated antigen, LFA-1) ist das wichtigste der T-Zell-Adhäsionsmoleküle.
Antikörper gegen CD11a/CD18 verhindern sowohl die Aktivierung naiver T-Zellen
als auch die Stimulation von Gedächtnis-T-Zellen [227;297]. Als Liganden dienen
einerseits die Matrixbestandteile Kollagen und Fibronektin, andererseits CD54
(intercellular adhesion molecule, ICAM-1) und CD102 (ICAM-2). CD54 wird unter
physiologischen Bedingungen vor allem auf aktivierten endothelialen Zellen,
aktivierten T- und B-Zellen und auf Monozyten exprimiert. Die Interaktion von TZellen mit APC wird durch zusätzliche Bindungen weiter stabilisiert. Hierzu
gehören die Interaktion von CD50 (ICAM-3) mit CD11a/CD18 und von CD2 mit
CD58 (LFA-3) [126;305;369]. Unerläßlich für eine regelrechte Aktivierung von BZellen ist zudem die Schaffung eines optimalen Mikromilieu durch die Sekretion
von Th2-Zytokinen wie IL-4, IL-5, IL-6 oder IL-10 [46;233;254;273].
1.9. Zytokine
Die verschiedenen Zelltypen des Immunsystems setzen Mediatoren frei, die man
als Zytokine, Interleukine oder Lymphokine bezeichnet. Aufgabe dieser 10-30 kD
großen, löslichen Polypeptide ist es, die Differenzierung und Aktivierung von
Effektorzellen des Immunsystemes zu regulieren und ein Netzwerk von Signalen
zu bilden, welches die Immunabwehr koordiniert. Die zytokin-produzierende Zelle
funktioniert hierbei als Sensor für die physiologischen und pathologischen
Einflüsse ihrer unmittelbaren Umgebung. Ein großer Teil der Zytokine wird von
aktivierten, immunkompetenten Zellen wie Monozyten und T-Lymphozyten
produziert.
Sämtliche
Zytokinrezeptoren
sind
in
ihrer
Funktion
signaltransduzierende, multimolekulare Komplexe mit einer hohen Spezifität für
1-20
ihren
Liganden.
Zytokine
können
grundsätzlich
funktionssteigernde,
beispielsweise proliferationsfördernde, oder hemmende Wirkungen entfalten.
Charakteristische Kennzeichen sind ihre funktionelle Redundanz und ein
ausgeprägter Pleiotropismus in ihrer Wirkung; so besitzt ein Zytokin häufig
verschiedene Funktionen für Zellen unterschiedlicher Gewebe und verschiedene
Zytokine zeigen ähnliche Wirkungen auf eine Zelle. T-Lymphozyten können
anhand ihres Zytokinmusters für ihre Funktion beschrieben werden. Im Rahmen
einer TH-1 Antwort, die sich vornehmlich gegen intrazelluläre Pathogene richtet,
produzieren die Zellen vornehmlich die Zytokine IL-2, IFNγ und TNFα. Im Rahmen
einer TH-2 gewichteten Antwort synthetisieren die Zellen verstärkt IL-4, IL-5, IL-6,
IL-10, und IL-13. TH-2 Zytokine regulieren humorale Antworten gegen
extrazelluläre
Infektionen
[1;90;132;222].
Die
für
diese
Arbeit
wichtigen
Lymphokine sollen im folgenden kurz vorgestellt werden:
1.9.1. Interleukin-2
Interleukin 2 (IL-2) ist ein 14- bis 17-kD großes Glykoprotein, das vor allem von
aktivierten CD4+ T-Zellen produziert wird und als antigenunabhängiger
Wachstumsfaktor für T-Zellen dient. Als auto- und parakriner Mediator fördert IL-2
die klonale Expansion reifer T-Zellen, verstärkt die Expression des IL-2-Rezeptors
und ist notwendig für die T-Zell-Differenzierung [355;381]. Es spielt eine wichtige
Rolle bei der durch Aktivierung induzierten Apoptose reifer T-Zellen [236]. Zudem
stimuliert IL-2 die Synthese und Sekretion anderer Zytokine (IL-2, IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, GM-CSF, IFN-γ), welche sowohl die Hämatopoese als auch die
Immunantwort gegenüber Pathogenen regulieren. In Kombination mit anderen
Faktoren wie IL-4 und IL-10 induziert IL-2 eine Ausreifung von B-Zellen zu
Immunglobulin produzierenden Plasmazellen und stimuliert deren Proliferation
[249;251;264]. Auch NK-Zellen, Monozyten und Makrophagen exprimieren den IL2-Rezeptor und werden so durch IL-2 zu einer gesteigerten zytotoxischen Aktivität
angeregt.
1-21
1.9.2. Interleukin-4
Interleukin 4 (IL-4), ursprünglich als B-Zell-Wachstumsfaktor (BSF-1, BCGF-1)
beschrieben, wird von aktivierten T-Helferzellen, Mastzellen und basophilen
Granulozyten ausgeschüttet [23;291]. Es ist von biologischer Bedeutung für die
humorale Immunität, die Eosinophilie und die Hemmung der Produktion von
Entzündungsmediatoren durch aktivierte Makrophagen. Es vermittelt die frühe
Aktivierung von B-Zellen nach Antigenkontakt, die B-Zell-Proliferation und
induziert den Klassenwechsel zu IgE und IgG4 [292]. Zugleich stimuliert IL-4 die
Expression von MHC-Antigenen und von CD23 in B-Zellen und Monozyten. IL-4
ist ein starker Wachstumsfaktor für aktivierte T-Zellen, Mastzellen und myeloide
sowie erythroide Vorläuferzellen. Bei T-Zellen fördert es die Differenzierung von
zytotoxischen Effektorzellen und induziert Th0-Zellen zur Polarisierung zu Th2Zellen mit dem typischen Muster sekretierter Zytokine wie IL-4, IL-5, IL-6 oder IL10 [290;374;397].
1.9.3 Interleukin-10
Interleukin 10 (IL-10) ist ein 17- bis 21-kD-Peptid, das sowohl immunsuppressive
als auch immunstimulatorische Eigenschaften besitzt. Es wird vor allem von Th2Zellen, aber auch von B-Zellen, Makrophagen und Mastzellen gebildet.
Ursprünglich wurde IL-10 als CSIF (Cytokine Synthesis Inhibitory Factor) benannt,
der die Produktion von Zytokinen durch Th1-Zellen hemmt. Im speziellen hemmt
es die Synthese von IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α, TNF-β und anderer Chemokine
[85;313;438]. Dieser antiinflammatorischen steht eine stimulierende Wirkung von
IL-10 auf lymphoide Zellen gegenüber. So fördert es als Kostimulator das
Zellwachstum von B-Zellen, die Differenzierung zur Plasmazelle und die
Expression von Immunglobulinen [4;46]. Bei NK-Zellen wird die zytotoxische
Aktivität verstärkt. Gemeinsam mit IL-3, IL-6, IL-11 und SCF hat IL-10 eine
kostimulierende Wirkung auf primitive hämatopoetische Stammzellen, die
Thrombozytopoese und die Bildung von Erythrozyten [259;404].
1-22
1.9.4. Interferon-γ
Zwei Familien von Interferonen werden unterschieden: Typ-I-Interferone werden
vornehmlich in Antwort auf virale Infekte gebildet, wobei die von Leukozyten
synthetisierten als Interferone-α bezeichnet werden, die Interferone anderer
Zellen als Interferon-β [384]. Typ-II-Interferon wird auf immunologische und
entzündliche Stimuli hin gebildet und auch als Interferon-γ (IFN-γ) klassifiziert [2].
IFN-γ wird vorwiegend von Th1-Zellen, zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) und
NK-Zellen sekretiert. IFN-γ ist das wichtigste makrophagenaktivierende Zytokin.
Es aktiviert neutrophile Granulozyten und NK-Zellen, fördert die Differenzierung
zytotoxischer T-Lymphozyten und die Polarisierung von peripheren T-Zellen zu
Th1-Zellen [431]. In B-Zellen fördert es deren Differenzierung und die Synthese
von IgG2a [215]. IFN-γ vermag die Replikation von Viren zu hemmen. Es induziert
die Expression von MHC-II-Antigenen, zudem von MHC-I-Molekülen, FcRezeptoren,
NO-Synthasen
und
proinflammatorischen
Zytokinen
in
unterschiedlichen Zellen [9;285]. Die Regulation von IFN-γ erfolgt durch antigenoder mitogenvermittelte Stimulation, wobei IL-2 und IL-12 die Synthese
synergistisch hochregulieren [141].
1.9.5. Tumornekrosefaktor-α
Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) ist ein 17,5 kD großes, nicht-glykosyliertes Zytokin
mit vielfältigen Wirkungen [5;403]. Es wird von Makrophagen, neutrophilen
Granulozyten, aktivierten Lymphozyten (Th1 und Th2), einigen CTL, Zellen des
RES und von Endothelzellen gebildet. Die Synthese wird durch gramnegative und
grampositive Bakterien, Viren, Parasiten, Immunkomplexe, verschiedene Zytokine
(z.B. GM-CSF, IL-1, IL-2), Tumorzellen und Komplementfaktoren stimuliert.
Aufgrund
seiner
Entzündungszytokin
biologischen
charakterisiert,
Wirkungen
das
wird
jedoch
TNF-α
ein
breites
zuerst
als
Spektrum
unterschiedlicher Wirkungen aufweist: die Hemmung der Proliferation gewisser
Tumorzellen, Stimulation des Wachstums von Fibroblasten und Endothelzellen,
antivirale Wirkung gegenüber DNA- und RNA-Viren, Induktion von Fieber und
Akutphaseproteinen,
Stimulation
von
Apoptose
und
Induktion
von
Adhäsionsmolekülen [6;331]. Die Wirkung von TNF-α auf die Zellen des
1-23
Immunsystems verursacht in Makrophagen und Granulozyten die Synthese von
Prostaglandinen
und
proinflammatorischen
Zytokinen.
Die
Bildung
von
neutrophilen Granulozyten im Knochenmark und ihre Ausschwemmung in die
Zirkulation sind ebenfalls durch TNF-α reguliert. Durch die verbesserte
Expression von MHC-Molekülen auf antigenpräsentierenden Zellen stimuliert
TNF-α die Ausbildung einer spezifischen Immunantwort, es steigert die lytische
Aktivität zytotoxischer T-Zellen und induziert als Kostimulator unter anderem die
Expression von IL-2, des IL-2-Rezeptors und des IFN-γ-Rezeptors [28]. Eine
ähnliche kostimulierende Wirkung wird auch für B-Zellen beschrieben, wo TNF-α
das Wachstum und die Synthese von Immunglobulinen fördert [307]. Gehemmt
wird die Produktion von TNF-α durch Moleküle wie Dexamethason, Prostaglandin
E2, TGF-β, Cyclosporin A, IL-4 und IL-6 [214]. Zwei unterschiedliche
Rezeptorketten binden TNF-α in seiner trimeren Form: die Typ-II-Rezeptorkette
(75kD, p75, CD120b) bindet TNF-α mit einer zehnfach höheren Affinität als die
Typ-I-Rezeptorkette (55kD, p55, CD120a) [378]. Die Expression beider
Rezeptorketten ist differentiell reguliert, IL-2 fördert die Expression von p55,
während IFN-γ die Bildung von p75 vor allem auf stimulierten T- und B-Zellen
induziert. Glukokortikoide hemmen die Expression der TNF-Rezeptorketten [148].
Die Hemmung der Wirkung von TNF-α mittels eines Rezeptorfusionsproteines
oder monoklonalen Antikörpers findet ihre klinische Anwendung in der Therapie
chronisch entzündlicher Erkrankungen (z.B. rheumatoide Arthritis, Spondylitis
ankylosans, chronisch entzündliche Darmerkrankungen) [143;161;299;352].
2-24
2. Variables Immundefektsyndrom (CVID)
2.1. Krankheitsbild
Das Variable Immundefektsyndrom (engl. common variable immunodeficiency
syndrome = CVID) umfaßt eine Gruppe von bislang noch nicht genau
differenzierten Immundefekten heterogener Ätiologie, die gekennzeichnet sind
durch
eine
defekte
Antikörperbildung,
stark
erniedrigte
Serum-
Immunglobulinspiegel und einer daraus resultierenden erhöhten respiratorischen
und
gastrointestinalen
Infektanfälligkeit
für
bakterielle
Erreger
[76;152;357;359;372]. Das Krankheitsbild ist genotypisch heterogen [66;344],
umfaßt unterschiedliche Phänotypen [134;165;361] und zeigt häufig eine starke
Verminderung aller Immunglobulin-Isotypen im Serum. Aber auch eine isolierte
Verminderung von IgG oder ein gleichzeitiger IgG- und IgA-Mangel zählen hinzu.
Nach der selektiven IgA-Defizienz ist das CVID-Syndrom die zweithäufigste
humorale Immundefizienz mit einer geschätzten Prävalenz von 1:10000 bis
1:50000 Einwohnern. Männer und Frauen sind in gleichem Maße von der
Erkrankung
betroffen.
Überwiegend
handelt
es
sich
bei
diesem
Antikörpermangelsyndrom um sporadische Fälle, obgleich familiäre Häufungen
berichtet wurden [324-326]. Die Krankheit manifestiert sich nach unauffälliger
Vorgeschichte und normaler Impfanamnese in allen Altersklassen mit einem
Häufigkeitsgipfel in der zweiten und dritten Lebensdekade. Man unterscheidet
früh einsetzende Formen, bei denen die Abgrenzung zu kongenitalen Agammaund Dysgammaglobulinämien schwierig sein kann, und die sogenannte Lateonset-Form, die auch als erworbene primäre Hypogammaglobulinämie oder
„Adult-onset Hypogammaglobulinemia“ bezeichnet wird [164;351]. Selten beginnt
das Krankheitsbild vor dem 6.Lebensjahr. Im Vordergrund der klinischen
Symptomatik stehen rekurrente bakterielle Infekte des oberen und unteren
Respirationstraktes, vorwiegend verursacht durch Infektionen mit Haemophilus
influenzae, Streptococcus pneumoniae oder Mycoplasmen [76;237;301]. Vielfach
wird die Hypogammaglobulinämie erst festgestellt, wenn bereits chronische
Bronchiektasen und ein erheblicher Lungengerüstumbau vorliegen [186;237].
Etwa die Hälfte der Patienten leidet unter gastrointestinalen Störungen im Sinne
eines sprueähnlichen Bildes. Blähungen, Durchfallneigung, Malabsorption und
2-25
mäßig
ausgeprägte
Steatorrhö
bilden
die
dominierenden
Beschwerden.
Rezidivierenden Diarrhoen sind meist hervorgerufen durch Infektionen mit
Campylobacter jejuni oder Candida albicans; in ca. 60% der unbehandelten
Patienten findet sich eine chronische Besiedelung der Gallenblase und des
Duodenum mit Giardia lamblia [76;101;415]. Selten sind Haut, Skelett oder
Harntrakt von bakteriellen Infektionen befallen. Lymphoproliferative Störungen,
wie eine Splenomegalie oder eine diffuse Lymphadenopathie, sind bei bis zu 1/3
der CVID-Patienten festzustellen [76;425]. Bei 20-30% der neu diagnostizierten
und unbehandelten Patienten läßt sich eine villöse Atrophie des Dünndarmes und
eine noduläre lymphatische Hyperplasie (NLH) der Schleimhaut nachweisen
[61;74;415]. Daneben kommt es zur Schleimhautatrophie im Dünndarm und im
Antrum des Magen mit Hypazidität. Als Ausdruck der sich teils zusätzlich
entwickelnden
T-Zell-Defizienz
ist
die
Inzidenz
maligner
Tumoren
des
lymphoretikulären Gewebes, des Gastrointestinaltraktes und der Haut bei CVIDPatienten um das 23-100fache erhöht [15;62;76;140;286;407;433;440]; seltener
finden sich Tuberkulose, Mykosen oder Pneumocystis-carinii-Pneumonien.
Autoimmunerkrankungen wie perniziöse Anämien, hämolytische Anämien,
Autoimmunthrombozytopenien und -neutropenien, nicht-erosive Polyarthritiden,
systemischer
Lupus
erythematodes
sowie
chronisch
entzündliche
Darmerkrankungen (M.Crohn) treten insbesondere bei erkrankten Frauen mit
einer Inzidenz von bis zu 30% auf [76;115;204;357;357;359]. Eine weitere
Untergruppe von Patienten (bis zu 25%) weist eine chronisch granulomatöse
Entzündung mit sarkoid-ähnlichen, nicht-verkäsenden Läsionen in Leber, Lunge,
Knochenmark u.a. Organen auf [76;187;364;398;432], für die kürzlich eine starke
Assoziation mit einem seltenen Allel des Tumornekrose-Faktors gefunden wurde
[262]. Für die Diagnosestellung fordert die WHO-Klassifikation den Ausschluß
anderer primärer humoraler Immundefektsyndrome [324;326]. So wird man bei
Patienten mit erhöhten oder hochnormalen IgM-Spiegeln nach einem Hyper-IgMSyndrom suchen; bei männlichen Patienten mit stark erniedrigten oder nicht
nachweisbaren Serum-Immunglobulinen und einer verminderten B-Zell-Zahl sollte
eine Variante der X-chromosomal vererbten Agammaglobulinämie (XLA) durch
Analyse
der
B-Zell-Tyrosinkinase
(btk)
ausgeschlossen
werden
[66;188;256;401;421]. Wenn kein X-chromosomal gebundener Erbgang vorliegt,
muß eine autosomal rezessive Agammaglobulinämie z.B. eine Mutation der
2-26
Immunglobulin-µ-Kette gesucht werden [50;429]. Des weiteren sind alle sonstigen
bekannten Ursachen von Antikörpermangelzuständen auszuschließen, wie
monoklonale
Gammopathien,
lympho-retikuläre
Malignome,
nephrotisches
Syndrom, exsudative Gastroenteropathie, Malnutrition, gesteigerter Katabolismus
oder
eine
langanhaltende
Antikörperbildung
in
immunsuppressive
Gegenwart
normaler
Therapie.
oder
Bei
gestörter
sogar
erhöhter
Immunglobulinspiegel ist auch eine HIV-Infektion in Betracht zu ziehen
[178;185;277;324;326;335].
Wichtigstes Kriterium zur Diagnose eines Variablen Immundefektsyndromes ist
neben der beschriebenen Klinik mit rekurrenten bakeriellen Infektionen und der
persitierenden Hypogammaglobulinämie, das Fehlen von terminal differenzierten
B-Lymphozyten oder Plasmazellen [71;76;341]. Damit einhergeht die fehlende
Bildung von Antikörpern nach Stimulation mit spezifischen Antigenen [43;198]. Ein
wichtiger Parameter für die Beurteilung der immunologischen Kompetenz ist die
Hauttestreaktion auf diverse Impf- und Umweltantigene. Hierzu eignet sich die
standardisierte Anwendung des Multitest Merieux. Neben einer Glycerinkontrolle
enthält der Hautimpfstempel folgende Antigene: Tuberkulin, Trichophytin,
Candidin, Proteus, Streptokokkenantigen sowie Tetanus- und Diphterietoxoid. Die
Ablesung erfolgt nach 20 Minuten, 24, 48, 72 Stunden. Hautreiz und Juckreiz
innerhalb
von
20
Minuten
deuten
auf
eine
IgE-vermittelte
allergische
Sofortreaktion hin (Typ I nach Coombs und Gell). Hautrötungen nach 24 Stunden
entsprechen einer Arthus-Reaktion (Typ III), die durch präzipitierende Antikörper
der Klasse IgG verursacht wird. Rein zellulär vermittelte Spättypreaktivität wird
nach 72 Stunden erfaßt. Zudem kann man die Antikörpertiter des Patienten gegen
verschiedene Impfantigene im Serum bestimmen (Diphterie-, Tetanusantitoxine,
Isoagglutinine, Masernantikörper). Im allgemeinen findet man bei CVID-Patienten
eine ausgeprägte Hyporeaktivität im Multitest Merieux, insbesondere im Zeitraum
nach 24-48 Stunden, und bei der quantitativen Antikörperbestimmung erniedrigte
Serumspiegel für IgG und IgA, teils auch für IgM. Eine für primäre Immundefizienz
verdächtige Anamnese und klinische Untersuchung in Verbindung mit einem
pathologischen Merieux-Test oder einer Erniedrigung der Serumimmunglobuline
geben Anlaß zu einer weitergehenden zellulären In-vitro-Diagnostik. Diese
Untersuchungen werden an mononukleären Zellen aus peripherem Venenblut
durchgeführt
und
lassen
sich
unterteilen
in
die
Quantifizierung
und
2-27
Phänotypisierung
mittels
Funktionstestung
der
durchflußzytometrischer
entscheidenden
Methoden
Zellpopulationen.
Der
sowie
die
humorale
Immundefekt wird bei CVID-Patienten durch eine Substitutionstherapie mit
intravenösen γ-Globulin-Gaben korrigiert, ergänzt durch eine adäquate und
konsequente antimikrobielle Therapie bei Infekten. Die Immunglobulin-Gaben
erfolgen alle 4-6 Wochen unter ärtzlicher Überwachung. Die Dosierung sollte so
gewählt werden (200-400mg/kg Körpergewicht), dass zwischen den γ-GlobulinInfusionen die IgG-Serumkonzentration nicht unter 4-5g/l absinkt. Die Prognose
hängt von der Früherkennung und -behandlung der Krankheit ab, bevor
rezidivierende Infekte zu irreversiblen Organschädigungen wie Brochiektasen
geführt haben [76;165;358].
2.2 Pathogenese
Trotz vielfältiger Untersuchungen und zahlreicher Hypothesen zur Pathogenese
konnte die Ursache des CVID bislang nicht geklärt werden. Ursprünglich wurden
intrinsische B-Zelldefekte mit einer gestörten Reifung und Funktion der Zellen
angenommen[81;83;322;323;341]. Später wurden eher T-Zelldefekte als Ursache
vermutet, wobei sowohl eine vermehrte Suppression [24;412;425]als auch eine
verminderte Hilfefunktion für B-Zellen angenommen wurden [289;411]. Auch eine
defekte Antigenpräsentation [99;100] und chronische Virusinfekte wurden als
Ursache des CVID erwogen [263;362;417;418] und zum Teil auch wieder
verworfen [333;335;382]. Bei einzelnen Patienten wurden funktionelle Defekte von
dendritischen Zellen [111] und Makrophagen [116] beschrieben.
Die meisten neueren Arbeiten gehen von einer Störung der T-B-Zellkooperation
("cognate T-B-interaction") aus mit einem veränderten Muster der produzierten
Zytokine durch die beteiligten T-Zellen und daraus folgend einer unzureichenden
B-Zellaktivierung. Aus einer gestörten Interaktion von T- und B-Zellen resultieren
Störungen der spezifischen Antikörperbildung und "Switch-Defekte", beides
Befunde,
die
typischerweise
bei
CVID-Patienten
vorliegen
[258;325].
Insbesondere eine Verminderung der Synthese von IL-2 [77;78;118;332], IL-4
[289] und IL-9 [160] und eine Steigerung der Expression von IFN-γ und TNF-α
[159;279] wurde beschrieben. Unauffällig verhielt sich die Expression von IL-6
und dessen Rezeptors [183] sowie von IL-10 [283;434]. Kürzlich beschrieben
2-28
wurde eine erhöhte Frequenz IL-12 positiver Monozyten nach Stimulation mit
LPS, assoziiert mit einer gesteigerten Produktion von IFN-γ durch T-Lymphozyten
[53]. Aus den gefundenen Veränderungen wurden Vermutungen über ein
verändertes Mikromilieu zugunsten einer Th1-Antwort bzw. einer Suppression und
eine gestörte Keimzentrumsreaktion abgeleitet. Zugrunde liegen könnte eine
gestörte Signaltransduktion sowohl in T-Zellen [18;117;119;232;383]) als auch in
B-Zellen [189;346].
Im Sinne phänotypischer Veränderungen von Zelloberflächenmolekülen wurde
eine verminderte Expression des CD40-Liganden (CD154) [42;113] und von LSelektin (CD62L) [276] nach T-Zellaktivierung wie auch einzelne Fälle einer
defekten CD80- Expression [258] beschrieben. Eine gesteigerte Expression von
CD95 und eine erhöhte Apoptoserate wurden ebenfalls beschrieben und spielen
möglicherweise eine Rolle bei Patienten mit niedrigen peripheren B-Zell-Zahlen
[88;151;170;342]. Die Beobachtung einer gestörten Memory-Funktion im T- und
B-Zellkompartiment mit einer verminderten Zahl antigenspezifischer T-Zellen nach
Immunisierung mit Neoantigenen wie KLH (keyhole limpet hemocyanin) weist
ebenfalls in die Richtung einer gestörten T-B-Interaktion [130;198;370]. Bei einem
überwiegenden Teil der Patienten lassen sich die B-Zellen durch angemessene
Stimuli in vitro zur regelrechten Expression von Aktivierungsmarkern wie CD69
stimulieren. B-Zellen vieler CVID-Patienten proliferieren nach Stimulation mit antiIgM in Kombination mit IL-2 oder IL-4 in vitro normal [43;110;272-274;289],
gelangen aber nicht von der Proliferations- in die Differenzierungsphase [341]. Bei
anderen Patienten finden sich Immunglobuline der Klasse IgG auf der
Zelloberfläche der B-Zellen, werden aber nicht sekretiert [360]. Der IgKlassenwechsel findet hier also offensichtlich statt, aber die Ig-Sekretion ist
gestört [303;349;363]. Bei einigen Patienten kann auch die Ausreifung der B-Zelle
zu einer Ig-sezernierenden Plasmazelle durch in vitro Stimulation erreicht werden
[272;273;334;343;360;405]. Die Stimulation von B-Lymphozyten über das CD40
Molekül unter Zugabe von Interleukin-10 für die Dauer von 96 Stunden löst bei
einigen Patienten die Synthese von Immunglobulinen aller Klassen aus, bei den
meisten anderen Patienten zumindest eine IgM-Synthese [102;274;304]. Nach in
vitro Infektion der B-Zellen mit dem Eppstein-Barr-Virus (EBV) über den EBVRezeptor CD21 kann bei den meisten Patienten eine konstitutive IgM- und
2-29
seltener IgG-Synthese nachgewiesen werden [81;294]. Auch wurden Einzelfälle
von CVID-Erkrankungen nach stattgehabter EBV-Infektion in vivo berichtet [439].
In einer Untergruppe von CVID Patienten konnte eine persistierende Aktivierung
des TNF-Systems mit erhöhten Serumspiegeln des Zytokines TNFα und der
löslichen Form der beiden TNF-Rezeptoren (p55-TNFR syn. CD120a, p75-TNFR
syn. CD120b) nachgewiesen werden [19]. Für eine Untergruppe von CVIDPatienten
mit
Granulomen
in
verschiedenen
Organen
(Leber,
Lunge,
Knochenmark u.a.) [76;364;432] wurde kürzlich eine starke Assoziation mit dem
seltenen TNF+488A Allel beschrieben [262]. Genetische Untersuchungen
betroffener
Familien
und
entsprechende
Linkage-Analysen ergaben eine
Assoziation der Erkrankung mit bestimmten HLA-Haplotypen wie HLA-DR3,
DQB1*0201, -B8, -B9, C4AQ0 und -A1 [80;82;344;345;406;408] [67]. Bei einer
bisher geringen Anzahl von Patienten wurde eine stark verminderte Frequenz
somatischer Hypermutationen in den Ig V Genen der Memory B-Lymphozyten
sowie funktionelle B-Zell-Defekte nachgewiesen [220]. Bei diesen Patienten, die
leider nicht hinsichtlich ihrer Immunglogulinsynthese in vitro klassifiziert wurden,
handelt es sich am ehesten um Patienten der Gruppe A. Bei einem Teil der CVIDPatienten
konnte
eine
gestörte
Affinitätsreifung
der
synthetisierten
Immunglobuline nachgewiesen werden [33].
2.3. Klassifikation
Die beschriebenen Befunde sind in Abhängigkeit vom Patientenkollektiv zum Teil
recht widersprüchlich. Es wurde eine Klassifikation anhand der ImmunglobulinSynthese in vitro eingeführt, da sich gemeinsame pathogenetische Prinzipien am
ehesten bei Patienten innerhalb dieser Untergruppen finden würden. Zudem
ermöglicht eine solche Einteilung, Ergebnisse verschiedener Untersuchungen
besser miteinander vergleichen zu können. Durch Phänotypisierung und
funktionelle
Analyse
von
peripheren
Blutlymphozyten
sowie
aufgrund
histologischer Befunde lassen sich 5 Untergruppen des CVID-Syndromes
unterscheiden [43;332]:
2-30
Untergruppen des CVID-Syndromes:
1. Normale periphere T- und B-Zellzahlen:
A: keine IgM- und IgG-Synthese in vitro (nach SAC + IL-2)
B: IgM-, aber keine IgG- Synthese in vitro
C: normale IgM- und IgG-Synthese in vitro
2. Verminderte Anzahl von B-Zellen, normale T-Zellen
3. CVID mit Granulomen (TNF +488A Allel positiv)
Patienten der Untergruppen 1A-C unterscheiden sich in vivo weder hinsichtlich
der Klinik noch ihrer Serum-Ig-Spiegel oder weiterer phänotypischer Merkmale.
Typische Veränderungen, die bei Verdacht auf einen Immundefekt bereits im
routinemäßig durchgeführten Immunstatus auffallen und zur Diagnose eines
CVID-Syndromes führen, sind [76;110;295;324;326;358;359;361;363]:
1. persitierende
Hypogammaglobulinämie
mit
stark
erniedrigten
Serumspiegeln für IgG und IgA, meist auch für IgM
2. hochgradig gestörte terminale B-Zellreifung zu Plasmazellen bei T-Zellabhängiger (Pokeweed) und T-Zell unabhängigr (SAC + IL-2) B-ZellStimulation in vitro: Typ A mit fehlender Ig-Synthese aller Isotypen in
vitro, Typ B mit erhaltener Synthese von IgM, jedoch nicht von IgG und
IgA und Typ C mit erhaltener Synthese aller Isotypen in vitro
3. normale
T-Zell-Untergruppen
und
Funktionen
(Proliferation,
Zytokinsynthese) mit erniedrigter CD4/CD8 Ratio und vermehrter
Expression von T-Zell-Aktivierungsmarkern in 30-40% der Fälle
4. normale bis erniedrigte B-Zellzahlen mit stark erniedrigtem Anteil
klassengewechselter B-Memory Zellen [414]
Für die Diagnosestellung eines CVID-Syndromes ist zum heutigen Zeitpunkt der
Ausschluss einer X-linked Agammaglobulinämie (XLA), eines X-linked Hyper-IgM
Syndromes (XHIM) und eines Non-XHIM anhand des klinischen Phänotypes, der
Erhebung der Immunantwort, dem Nachweis der Bruton Tyrosin Kinase (Btk) in
Monozyten oder Blutplättchen und der normalen Expression des CD40-Liganden
auf aktivierten T-Zellen unbedingt zu fordern [3;75].
3-31
3. Fragestellungen der Arbeit
Ausgehend von der Beschreibung schwerer Hypogammaglobulinämien in
Mäusen, in denen das Gen für den TNFα-Rezeptor ausgeschaltet (-/-) wurde
[121;270;399], ergab sich zunächst die Frage nach möglichen Veränderungen im
TNFα-System der CVID-Patienten. Untersucht werden sollten einerseits das
sezernierte
Protein
vorstimulierten
mittels
T-Lymphozyten
einer
intrazytoplasmatischen
und
der
Untersuchung
Anfärbung
eines
in
möglichen
Polymorphismus des kodierenden Genes für TNFα in Zusammanarbeit mit Herrn
Prof.Gerdes am Forschungszentrum Borstel. Auf der anderen Seite war die
regelrechte Expression der entsprechenden Rezeptoren (TNFα-R 55kD und
75kD, entspr. CD120a und b) auf den Zielzellen zu prüfen. Ausgehend von dieser
anfänglichen Fragestellung wurden die Untersuchungen um den umfassenderen
Aspekt der regelrechten Interaktion von T- und B-Lymphozyten erweitert
[65;69;288]. Neben der Interaktion des TCR mit MHCII-Molekülen auf BLymphozyten nehmen die Ligandenpaare CD40-CD40L sowie die Moleküle der
B7-Familie und der Rezeptoren CD28/CTLA-4 auf T-Zellen eine zentrale Rolle in
der T-B-Kooperation ein [22;30;34;79;142;182;271;365]. Die Kostimulation über
das Oberflächenmolekül CD40 kann ein Signal vermitteln, das Proliferation und
Ig-Klassenwechsel in B-Lymphozyten bedingt und deren Apoptose verhindert
[72;129;430]. Bei einem Teil der Patienten mit Variablem Immundefektsyndrom
wurden
Defekte
in
der
IL-2-Synthese
der
T-Lymphozyten
beobachtet
[77;78;118;332]. Die Kostimulation der T-Zellen über CD28 durch Interaktion mit
den Liganden B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86) auf der APC bewirkt eine IL-2Synthese und die Proliferation der T-Zellen [106;210;218;390;430]. Ohne diese
CD28/B7-Stimulation werden die T-Zellen anerg und produzieren kein IL-2. Das
Zytokin IL-2 jedoch hat wiederum entscheidenden Einfluß auf die Differenzierung
der B-Lymphozyten zu antikörperproduzierenden Plasmazellen [51;293]. Eine
Reihe
von
für
die
Kooperation
der
verschiedenen
Zelltypen
wichtigen
Oberflächenmoleküle und immunregulatorischen Zytokinen wurden analysiert. Auf
CD19+ B-Lymphozyten waren dies: CD21, CD22, CD23, CD54, CD69, CD80,
CD86, auf T-Lymphozyten: CD3, CD4, CD8, CD40L, CD69, CD95, CD120a,
CD120b, auf Monozyten: CD14, CD86, CD119. In vorstimulierten CD4+ und
4-32
CD8+ T-Lymphozyten wurde die Expression der Zytokine IL-2, IL-4, TNFα und
IFNγ
analysiert.
Stimulationsversuche,
in
denen
die
verschiedenen
Aktivierungswege in T- und B-Lymphozyten nachgeahmt wurden, ermöglichten
die Überprüfung ihrer funktionellen Regelhaftigkeit. B-Lymphozyten wurden
mittels monoklonaler Antikörper, die gegen das Oberflächenimmunglobulin der
Klasse M oder gegen das kostimultorischen Molekül CD40 gerichtet waren, unter
Zusatz der Zytokine IL-2 und IL-10 stimuliert. T-Lymphozyten wurden analog über
den T-Zellrezeptor (TCRαβ, BMA031) oder das Oberflächenmolekül CD3
(BMA030)
aktiviert.
Zum
Ausschluß
stimulatorischer
oder
inhibitorischer
Interaktionen wurden die Ergebnisse, die mit unfraktionierten mononukleären
Zellen gewonnen wurden, mit hoch aufgereinigten Zellen der verschiedenen
Zellpopulationen überprüft. In Stimulationskulturen peripherer MNC mit SAC+IL-2
oder PWM (1:200, 1:400, 1:800) über einen Zeitraum von 9 Tagen wurde die
Einteilung der Patienten gemäß der Klassifikation nach Bryant et al. auf ihre
Richtigkeit und zeitliche Konstanz überprüft. Angestoßen durch auffällige Befunde
in der Oberflächenexpression von CD86 auf B-Lymphozyten wurde eine
quantitative Bestimmung der mRNA für CD86 durchgeführt. Zudem wurden EBVtransformierte B-Zell-Linien der Patienten etabliert und deren Fähigkeit zur
Expresssion von CD86 und zur Synthese von Immunglobulinen getestet.
4. Patienten und Kontrollen
Die Patientengruppe umfaßte 6 Frauen und 12 Männer im Alter von 11 bis 77
Jahren, deren Diagnose eines Variablen Immundefektsyndromes (CVID) anhand
der
diagnostischen
Kriterien
der
WHO-Expertengruppe
für
primäre
Immundefizienzen gestellt worden war [324-326]. Die Patienten unterschieden
sich im Zeitpunkt der Erstdiagnose wie auch der Krankheitsdauer. Als
Kontrollkollektiv dienten gesunde Frauen (4) und Männer (6) im Alter von 23 bis
53 Jahren.
4-33
80
70
Lebensalter in Jahren
60
50
40
30
20
10
0
HD
A
NA
Fig.1. Altersprofil der Patienten und Kontrollen
zum Zeitpunkt der Testung
Die immunologische Charakterisierung, der B-Zell-Phänotyp und die in vitro
Antworten
auf
Stimulation
mit
SAC+IL-2
und
PWM
sind
in
Tabelle
1
zusammengefaßt. Sämtliche Patienten erhielten im regelmäßigen Abstand von 4 bis
6 Wochen eine intravenöse Substitutionstherapie von Immunglobulinen (Sandoglobin
oder Polyglobulin; 300mg/kg KG) und wiesen zum Zeitpunkt der Blutabnahme
keinerlei klinisch bedeutsame Infektionen auf. Familiäre Fälle von CVID wurden nicht
ausgeschlossen.
CVID-Patienten
mit
sarkoidose
ähnlichen
Granulomen
[187;357;364;432], die für eine Untergruppe von CVID Patienten mit progressiver TZell-Defizienz und einem Polymorphismus des TNF-α Genes [262] typisch sind,
befanden sich nicht in dem Kollektiv der 18 Patienten.
w
w
m
m
53
35
23
77
58
44
GWR
MFT
INL
MMR
JBK
HBR
m
m
m
32
11
73
44
ESR
MHA
MWR
BRZ
m
w
w
23
39
34
53
26
27
33
29
36
25
ADZ
RDR
JGH
KDZ
CHN
ESK
POO
MBN
KWR
TGE
* nicht vorhanden
m
38
DAR
w
DER
m
m
m
w
w
m
m
m
38
30
MKR
m
m
w
27
74
PLS
BMR
w
w
m
m
28
33
CAS
JMN
HD
HD
HD
HD
HD
HD
HD
HD
HD
HD
C
C
C
B
B
B
B
B
B
B
B
A
A
A
A
A
A
A
30
GLT
m
Alter Geschlecht Typ
Kürzel
2,1
2,6
3,5
10,8
2,9
5,7
16,7
11,1
4,7
6,4
4,2
4,0
8,1
3,1
5,4
13,7
4,7
8,6
6,7
13,7
7,3
6,7
20,8
7,8
0,5
18,6
0,6
1,8
%CD19+
81
83
76
68
83
76
n.v.
68
80
93
81
94
93
95
91
99
98
94
95
96
88
94
96
93
n.v.*
98
94
83
%sIgM+
80
83
75
68
80
81
n.v.
81
83
90
81
92
97
94
91
99
95
90
96
92
93
93
94
93
n.v.
98
97
93
97
96
93
99
97
98
99
n.v.
94
97
94
99
98
95
48
95
n.v.
n.v.
n.v.
93
96
98
94
87
98
95
72
82
n.v.
n.v.
n.v.
98
97
99
100
n.v.
100
99
n.v.
n.v.
100
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
100
99
100
99
96
100
99
100
99
n.v.
n.v.
n.v.
80
88
82
90
n.v.
90
94
n.v.
n.v.
95
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
64
90
90
83
64
91
75
57
52
%sIgD+ %CD21+ %CD22+ %CD23+
native CD19+ B-Zellen
Tabelle 1: Immunologische Charakterisierung der Patienten und Kontrollpersonen
>7500
>7500
>7500
n.v.
n.v.
>7500
>7500
>7500
>7500
>7500
>7500
>7500
>7500
>7500
>7500
7313
>7500
6616
>7500
>7500
1942
0
76
99
0
71
0
246
SAC+IL-2
991
>7500
3497
n.v.
n.v.
0
1245
1378
0
68
618
0
5120
387
0
0
331
975
815
979
0
0
0
0
0
0
0
0
PWM 1:200
IgM-Synthese in vitro (ng/ml)
>1500
>1500
>1500
n.v.
n.v.
372
>1500
>1500
>1500
942
>1500
>1500
1122
222
648
179
84
162
236
751
0
0
217
0
0
0
0
9
SAC+IL-2
836
>1500
>1500
n.v.
n.v.
375
>1500
>1500
>1500
244
>1500
144
919
209
258
206
0
112
218
123
0
62
32
0
0
0
0
52
PWM 1:200
IgG-Synthese in vitro (ng/ml)
5-35
5. Material und Methoden
5.1. Blutabnahme
Für jeden Testansatz wurden 50-80ml venöses Blut eines CVID-Patienten
unmittelbar vor der Substitutionstherapie und entsprechend Blut eines gesunden
Spenders abgenommen. Dieses wurde durch Schütteln für 10’ in einem 50ml
Erlenmeyerkolben, in dem sich eine vordefinierte Anzahl von Glaskugeln befand,
defibriniert. Der Vorteil dieses Schüttelblutes gegenüber EDTA- oder Citratblut liegt in
der besseren Trennbarkeit der zellulären Bestandteile voneinander und der
Elimination von Thrombozyten.
5.2. Isolierung mononukleärer Zellen
Sämtliche Untersuchungen wurden an gereinigten Lymphozyten durchgeführt, die
auf folgende Weise isoliert wurden. Das Schüttelblut wurde 1:2 mit PBS verdünnt und
zu je 20ml in 50ml Zentrifugenröhrchen über 15ml Ficoll-Trennlösung geschichtet.
Die Röhrchen wurden zur Auftrennung der zellulären Bestandteile des Blutes für 20’
bei 900xg (1960U/min) zentrifugiert. Nach der Dichtezentrifugation befanden sich die
Erythrozyten am Boden des Röhrchens, darüber eine dünne Schicht von
Granulozyten gefolgt von der Ficoll-Trennlösung. Die mononukleären Zellen mitsamt
der Monozyten befanden sich in der Interphase zwischen Ficoll und Blutserum. Diese
wurden abpipettiert, 1:2 mit R0 (s.Tab.2) verdünnt und erneut für 10’ bei 900xg
zentrifugiert. Der zellfreie Überstand wurde dekantiert, das Zellpellet in 5ml R10Medium resuspendiert und erneut für 10’ bei 200xg (920U/min) zentrifugiert. Ein
Aliquot der in R10 (s.Tab.2) aufgenommenen Zellen wurde mit 3%iger Essigsäure
1:20
verdünnt
und
in
einer
Neubauer-Zählkammer
unter
einem
Phasenkontrastmikroskop ausgezählt. Die gewonnen peripheren Blutlymphozyten
wurden für die weiteren Versuche auf Konzentrationen von 5-10x106 /ml eingestellt.
5-36
Verdünntes Vollblut
(1:2 mit PBS, 20ml)
Serum
Zentrifugation
20‘ bei 900g
(1960U/min)
Interphase mit Lymphozyten
und Monozyten
Ficoll
Granulozyten
Ficoll (15ml)
Erythrozyten
Fig.2. Ficoll-Gradient zur Isolierung der mononukleären Zellen
5.3. Oberflächenfärbung mittels direkt-konjugierter Antikörper
Nach der Isolierung der nativen PBMC oder nach erfolgter Stimulation in den
verschiedenen Ansätzen wurde zur Färbung von Oberflächenantigenen stets auf
dieselbe Weise verfahren. Die Zellen wurden in R10-Medium aufgenommen, 10min
bei 200xg zentrifugiert und in einer Konzentration von 5 Mio. Zellen/ml in R10Medium resuspendiert. Zum Färben wurden 5-10µl der konjugierten monoklonalen
Antikörper
in
den
Standard-Polystyrol-FACS-Röhrchen
vorgelegt,
100µl
der
Zellsuspension zugegeben, mittels Vortex gemischt und im Dunkeln bei 4°C für 30'
inkubiert. Nach Hinzufügen von 1ml PBS/1% Azid-Lösung wurden die Röhrchen für
5min bei 200xg zentrifugiert, der Überstand vorsichtig dekantiert und das Zellpellet in
400µl PBS/1% Azid-Lösung resupendiert. Der Zusatz von Azid hemmt die
Atmungskette und soll somit ein shedding von Oberflächenmolekülen verhindern. Die
Proben wurden auf Eis gelagert und unverzüglich im Durchflußztometer analysiert.
5-37
Tab.2. Liste der verwendeten monoklonalen Antikörper und Reagenzien
Antigen
Antikörper
Spezifität/Funktion des Antigen
Clone UCHT1 - RPE, Clone
UCHT1 - FITC (Dako; Glostrup,
Denmark)
PerCP
Cat.#347344 (Becton-Dickinson
Immunocytometry Systems, San
Jose, CA, USA)
T-Zellen, Thymozyten; assoziiert
mit dem Antigenrezeptor von TZellen; notwendig für die
Oberflächenexpression des T-ZellRezeptors und die
Signalvermittlung über diesen
Rezeptor
MHCD0405 - APC
(Caltag Lab., Burlingame, CA,
USA)
T-Helferzellen, Thymozyten
Subsets, Monozyten, Makrophagen
u.a.; Korezeptor für die MHCKlasse-II-restringierte antigeninduzierte T-Zell-Aktivierung;
Regulation der T-B-Zell-Adhäsion
unabhängig von der
Antigenerkennung; Differenzierung
im Thymus; Rezeptor für HIV
PE Cat.#30195X (Pharmingen,
San Diego, CA, USA)
T-Zellen, Thymozyten, eine
Untergruppe von B-Zellen;
moduliert die Signaltransduktion
des Antigen-Rezeptor-Komplexes
(TCR, BCR); bindet an CD72
FITC Cat.#347313 (BectonDickinson Immunocytometry
Systems, San Jose, CA, USA)
zytotoxische T-Zellen, Thymozyten
Subsets; Korezeptor für MHCKlasse-I-Moleküle; bindet
Signalmoleküle an der
zytoplasmatischen Seite der
Membran
CD10
PE Cat.#1915 (Immunotech,
Marseille Cedex, France)
B- und T-Vorläuferzellen, Zellen
des Knochenmarkstroma; ZinkMetalloproteinase; Marker für akute
lymphatische Leukämie der Prä-BZellen (CALLA)
CD14
Clone RMO52 Cat.#0643
(Immunotech, Marseille Cedex,
France)
Monozyten, Makrophagen,
polymorphkernigen Leukozyten
u.a.; Rezeptor für Endotoxin (LPS)
CD3
CD4
CD5
CD8
5-38
Clone 3G8 Cat.#0813
(Immunotech, Marseille Cedex,
France)
NK-Zellen, Monozyten,
Makrophagen, Neutrophile; FcgR,
bindet Immunkomplexe
CD19
Clone J4.119 Cat.#1313
(Immunotech, Marseille Cedex,
France)
B-Zellen; FDC; exprimiert vom proB-Zell Stadium bis zur reifen BZelle, Verlust bei Ausreifung zur
Plasmazelle;, Korezeptor für BZellen, Modulation der
Signaltransduktion; bildet einen
Komplex mit CD21 und CD81;
Einfluss auf B-Zell-Entwicklung, Aktivierung und
Differenzierung
CD19
Clone HD37 - FITC (Dako; Glostrup, Denmark)
CD16
Clone B-ly4 - RPE (Pharmingen,
San Diego, CA, USA)
reife B-Zellen, FDC, manche
epithelialen Zellen; schwache
Expression auf peripheren T-Zellen
und unreifen Thymozyten;
Rezeptor für C3d, C3dg, iC3b und
EBV; bildet mit CD19, CD81 und
Leu13 einen
Signaltransduktionskomplex für BZellen
CD22
Clone SJ.10.1H11 - PE
(Immunotech, Marseille Cedex,
France)
reife B-Zellen, zytoplasmatische
Expression in späten Pro- und
frühen Prä-B-Zellen; Adhäsion von
B-Zellen an Monozyten und TZellen; Modulation der
Signaltransduktion in B-Zellen
CD23
reife B-Zellen, Monozyten,
Eosinophile, FDC, Thrombozyten;
niedrigaffiner Rezeptor für IgE
Clone M-L233 - RPE (Pharmingen,
(FcERII), Einfluß auf die IgESan Diego, CA, USA)
Synthese, pro-inflammatorische
Funktion; Ligand für den CD19CD21-CD81-Komplex
CD21
5-39
CD27
Memory B-Zellen, aktivierte
CD45RA+ T-Zellen, NKZellen,medulläre Thymozyten;
FITC Cat.#F7178 (Dako; Glostrup, kostimulatorisches Signal für die TDenmark)
und B-Zell-Aktivierung; Interaktion
mit CD70 reguliert die B-ZellProliferation und Differenzierung
durch T-Zellen
CD28
9.3 ascites (Geschenk von
P.Linsley, Bristol-Myers Squibb,
Seattle, WA, USA; 1:5000)
reife CD3+ Thymozyten, periphere
T-Zellen, aktivierte B-Zellen,
Plasmazellen; Ligand für CD80,
CD86, assoziiert mit PI3-Kinase,
ITK, GRB-2-SOS; Kostimulation
der T-Zell-Proliferation,
Effektorfunktion und T-Zellabhängigen Antikörper-Produktion
Clone mAB89 (Immunotech,
Marseille Cedex, France)
pan-B-Zell-Marker, Monozyten,
FDC, interdigitierende Zellen (IDC);
bindet den CD40L; involviert in
Wachstum, Differenzierung und
Isotyp-Switching von B-Zellen,
antiapoptotisches Signal für
Keimzentrums-B-Zellen
CD54
Clone HA58 - RPE (Pharmingen,
San Diego, CA, USA)
ICAM-1; aktivierte T- und B-Zellen,
aktiv. Monozyten, Endothelzellen
u.a.; interagiert mit CD11a/CD18Integrin (LFA-1), CD11b/CD18Integrin (Mac-1); interzelluläres
Adhäsionsmolekül, Rezeptor für
Rhinoviren
CD62L
FITC, Immunotech (Marseille
Cedex, France)
periphere B-, T-Zellen, Monozyten,
Granulozyten, NK cell subsets;
Homing von Lymphozyten
PE Cat.#347827 (BectonDickinson Immunocytometry
Systems, San Jose, CA, USA)
aktivierte T-, B- und NK-Zellen,
Thrombozyten; sehr frühes,
funktionelles Aktivierungsantigen
(VEA), fördert Ca2+- Influx, ZytokinSynthese u.a.
CD40
CD69
5-40
PE Cat.#340294 (BectonDickinson Immunocytometry
Systems, San Jose, CA, USA)
aktivierte B-Zellen, T-Zellen und
Monozyten, konstitutive Expression
auf dendritischen Zellen;
Koregulator der T-Zell-Aktivierung,
Ligand für CD28 und CTLA-4
(CD152)
CD86
Clone 2331 (FUN-1) - RPE
(Pharmingen, San Diego, CA,
USA)
aktivierte B-Zellen, Monozyten,
konstitutive Expression auf IDC,
demdritischen und LangerhansZellen; Koregulator der T-ZellAktivierung, Ligand für CD28 und
CTLA-4 (CD152); wichtige Rolle für
die Induktion und Regulation von
Immunantworten
CD95
Clone DX2 - RPE, Cat.#33455X
(Pharmingen, San Diego, CA,
USA)
Apo-1, Fas; aktivierte T- und BZellen; bindet TNF-ähnlichen FasLiganden, Mediation apoptoseinduzierender Signale
CD119
PE/Isotyp
IFNg-R; Monozyten, Makrophagen,
B-Zellen, Endothel; Rezeptor für
Interferon-g
CD120b
BMS5051PE.01
Murine Isotype Control
BMS5710PE.01 (Boehringer
Ingelheim, Heidelberg, Germany)
Rezeptor des Tumor-NekroseFaktor (TNF-R p75)
CD137
Clone M131, unlabeled (Immunex
Co. Extramural Research, Seattle,
WA, USA); second step FITC goat
anti-mouse IgG (Southern Biotech,
Elching, Germany); Isotyp
Kontrolle MOPC21 (Sigma,
Deisenhofen, Germany)
ILA; aktivierte B-, T-Zellen (bes.
CD45RAhigh, CD45R0high),
Monozyten, epitheliale Zellen;
Kostimulator der T-Zell-Proliferation
und des T-Zell-Überlebens
CD154
Clone 24-31 - FITC (Ancell Corp.,
Bayport, MN, USA)
CD40L; aktivierte T-Zellen;
essentielle Interaktion von CD154
und CD40 für das Isotyp-Switching
von B-Zellen
CD80
goat anti-hu-IgM
Cat.#55055 (Organon Teknika Corp., Cappel Research Products,
F(ab)2
Durham, NC, USA); ICN Biomedicals, Eschwege, Germany
Fragmente
5-41
goat anti-mouseIgG F(ab)2 Dianova, Hamburg, Germany
Fragmente
Cat.#340458 (Becton-Dickinson
FastImmuneTM
Immunocytometry Systems, San
Control FITC/PE
Jose, CA, USA)
Negativkontrolle für intrazelluläre
und Oberflächenfärbungen mit
FastImmuneTM-Reagenzien;
Kontrolle für die
Quadrantenauswertung; IgG2a
(clone X39), IgG1 (clone X40)
Cat.#340456 (Becton-Dickinson
IFNg FITC/IL-4
Immunocytometry Systems, San
PE
Jose, CA, USA)
IFNg: produziert von aktivierten
CD8+ T-Zellen, TH0 und TH1 CD4+
T-Zellen, NKC; multifunktioneller
Immunmodulator mit anti-Tumor
und anti-viraler Aktivität; IL-4:
produziert von aktivierten THO und
TH2 CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen,
Basophilen und Mastzellen;
Regulation der IL-2-vermittelten
Aktivierung und NK-ZellProliferation; Steigerung des
Wachstum und der Differenzierung
aktivierter B-Lymphozyten (BCGF)
Cat.#340450 (Becton-Dickinson
Anti-Human IL-2
Immunocytometry Systems, San
PE
Jose, CA, USA)
produziert von CD4+ T-Zellen (TH0,
TH1), einigen CD8+ nach
polyklonaler oder antigener
Stimulation; IL-2 ruft Proliferation
und Differenzierung von T-, B- und
NK-Zellen hervor; potenter
Aktivator von Monozyten
Cat.#340511 (Becton-Dickinson
Immunocytometry Systems, San
Jose, CA, USA)
in T-Lymphozyten induziert durch
den AIM/CD69- oder den
CD3/CD28-pathway, in
MO/Makrophagen durch
Endotoxine (LPS); potentes
proinflammatorisches Polypeptid in
der Abwehr von infektiösen
Agentien und der Kontrolle des
Tumorwachstums; Mediator im
septischen Schock, RA,
entzündliche Gewebsdestruktion
und Kachexie
Anti-Human
TNFa FITC
5-42
Material
Beschreibung
Hersteller
Ficoll-Hypaque Lösung
Lösung zur Dichtezentrifugation
(Dichte 1.077)
Biochrom KG, Berlin,
Germany
RPMI1640
Kulturmedium R0 (w/o Phenolrot)
Biochrom KG, Berlin,
Germany
Penicillin
Endkonzentration 100U/ml
Biochrom KG, Berlin,
Germany
Streptomycin
Endkonzentration 100ug/ml
Biochrom KG, Berlin,
Germany
L-Glutamin
Endkonzentration 2mM
Biochrom KG, Berlin,
Germany
FCS
inaktiviertes, fötales Kälberserum
PANBiotech, Aidenbach,
Germany
Kulturmedium R10
R0 + 10% FCS + Pen./Strep./LGlutamin
PBS
phosphate buffered saline (PBS: 40g NaCl + 6.9g NaH2Po4*H2O
in 5 l Aqua dest.)
PI
Propidiumiodid (EK 1ug/ml, VV
50ug/ml); #81845
Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, USA
Immunomagnetische
Beads
Dynabeads M-450 CD19 (Pan B),
#1103/4
Dynal, Hamburg,
Germany
DetachaBeads
für Dynabeads M-450 CD19 (Pan B),
#125.05/6
Dynal, Hamburg,
Germany
Magnet
DYNAL MPC-6 (magnetic particle
concentrator), #120.02
Dynal, Hamburg,
Germany
Permeabilisierungslösung
FACS Permeabilizing Solution,
Cat.#340457
Becton-Dickinson
Immunocytometry
Systems, San Jose, CA,
USA
Lyselösung
FACS Brand Lysing Solution,
Cat.#92-0002
Becton-Dickinson
Immunocytometry
Systems, San Jose, CA,
USA
Brefeldin A
Blockade des Golgi-Apparates,
#B6542
Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, USA
SAC
Staphylococcal antigen Cowan strain Calbiochem, La Jolla, CA,
I; EK 1:10000
USA
PWM
Pokeweed mitogen; EK 1.200, 1:400,
1:800
Gibco, Eggenstein,
Germany
5-43
IL-2
Interleukin 2, EK 20U/ml
Biotest, Dreieich,
Germany
IL-10
Interleukin 10, EK 10ng/ml
Pharmingen, San Diego,
CA, USA
Durchflußzytometer
FACSCalibur System (4-Farben, 2
Laser)
Becton-Dickinson
Immunocytometry
Systems, San Jose, CA,
USA
Auswertungssoftware
CellQuest Software
Becton-Dickinson
Immunocytometry
Systems, San Jose, CA,
USA
FACS-Röhrchen
Polystyrol (PS), Polypropylen (PP);
12x75mm
Falcon,
Zentrifuge
Rotixa/P
Hettich
Mikroskop
Standard 20
Zeiss
Vortex
Heidolph
Brutschrank
37oC, 5% CO2-begast
Heraeus
Zellkulturbehälter
24-well Platte
Greiner
5.4. Analyse der Zellen mittels Durchflußzytometrie
5.4.1. Funktionsweise des FACS
Der „Fluorescence Activated Cell Scanner“ (FACSCalibur) ermöglicht die Analyse
von fluoreszenzmarkierten Einzelzellen hinsichtlich ihrer Größe, ihrer Granularität
und vier weiteren Fluoreszenezmerkmalen auf der Zelloberfläche oder im
Zytoplasma. Bei der Messung wird die Zellsuspension angesaugt, mit Überdruck
durch eine Düse gespritzt und so eine Hintereinanderreihung von Einzelzellen
erreicht. Die mittels des Flüssigkeitsstrahles perlschnurartig aufgereiten Zellen
werden mit einer Geschwindigkeit von etwa 6m/s an einem optischen System
vorbeigeführt. Zwei Argon-Laser erzeugen Licht mit Wellenlängen von 488nm und
635nm, welches rechtwinklig auf die vorbeiströmende Zellsuspension trifft und die
markierten Zellen zur Fluoreszenz anregt. Hochsensitive Photomultiplier (PMT)
5-44
registrieren das entstehende Streulicht (FSC, SSC) und mittels Bandpass-Filtern für
530nm (FITC), 585 (PE), 661 (APC) und >670nm (PerCP) das von den angeregten
Fluoreszenzfarbstoffen emittierte Licht. Ein Computer wertet die optischen Signale
aus und stellt sie für die graphische Auswertung bereit. Die Intensität der emittierten
Lichtimpulse in einem vorgegebenen Frequenzbereich (Kanal) wird als numerischer
Wert wiedergegeben und in einem Histogramm gegen die Anzahl der Zellen mit
dieser Fluoreszenzintensität aufgetragen. Die Korrelation zweier Parameter läßt sich
durch Darstellung
in einem Punktwolkenhistogramm (DotPlot) zeigen. Beliebige
Belegungen der Achsen durch die Streulichtparameter und Fluoreszenzen sind
möglich.
5.4.2. Auswertungsprinzipien
Anhand ihrer charakteristischen Streulichteigenschaften, die bedingt sind durch die
unterschiedliche
Zellgröße
und
-struktur,
lassen
sich
die
wichtigsten
Leukozytengruppen wie Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten bereits
voneinander trennen. Nur Zellen mit den durch das sogenannte Lymphozytenfenster
(R1) definierten Streulichtparametern wurden in die weitere Auswertung einbezogen.
Das Fenster wurde großzügig gesetzt und die Populationen innerhalb des Fensters
anhand ihrer phänotypischen Merkmale durch Kontrollfärbungen unterschieden.
Fig. 3. Exemplarische Darstellung der FACS-Auswertungsprinzipien
5-45
Jede einzelne Zelle der durch das Fenster 1 (R1) ausgewählten Zellpopulation kann
nun hinsichtlich der vier Fluoeszenzmerkmale beschrieben werden. Zur graphischen
Darstellung eines Merkmales wählt man die Histogrammdarstellung , in einem
Punktwolkenhistogramm hingegen lassen sich zwei Merkmale gegeneinander
darstellen. Das Mitführen von Iso- bzw. Negativkontrollen bei jeder Färbung erlaubt
das Setzen von Auswertemarken, die die Zellen in fluoreszenznegative und -positive
Populationen
diskriminieren.
Diese
Quadranteneinteilung
ist
Grundlage
der
statistischen Auswertung.
5.4.3. Vorteile der Methode
Diese objektive Methode erlaubt somit die empfindliche und schnelle Analyse
tausender
von
Zellen.
Subpopulationen
können
hinsichtlich
4
Merkmalen
charakterisiert werden und die Methode ist nicht von subjektiven, optischen
Eindrücken am Fluoreszenzmikroskop abhängig. In der Klinik wird daher diese
Methode bereits vielfältig in der Routinediagnostik des Immunstatus, des HIVMonitoring,
der
Transplantationsmedizin
oder
der
immunphänotypische
Charakterisierung lymphoproliferativer Erkrankungen eingesetzt.
5.5 B-Zellselektionierung
Nach Isolierung der mononukleären Zellfraktion mittels Dichtezentrifugation wurden
die enthaltenen B-Lymphozyten durch eine Positivselektionierung zu einer Reinheit
von >99% angereichert. Dies ermöglicht die Untersuchung reiner B-Zellen unter
Ausschluß von möglichen stimulierenden oder suppressiven Einflüssen von
Zellpopulationen wie T-Zellen oder Monozyten. Prinzip der verwendeten Dynabeads
M-450 ist die Separation von Zellpopulationen mit Hilfe von Partikeln, die einerseits
durch direkte Beladung mit monoklonalen Antikörpern (hier: anti-CD19 mouse-IgM
mAB) spezifische Oberflächenantigene der Zellen erkennen und binden, andererseits
die Eigenschaft der Magnetisierbarkeit besitzen. Die gebundenen Zellen lassen sich
mittels eines externen Magneten isolieren und in einem weiteren Schritt wieder von
den Beads lösen. Gemäß dem Protokoll des Herstellers (Dynal) wurde zunächst die
Absolutanzahl der in der Probe enthaltenen CD19+ B-Zellen durch Bestimmung der
Gesamtzellzahl und des prozentualen Anteils von B-Lymphozyten ermittelt. Die
5-46
mononukleären Zellen wurden auf eine Konzentration von 20-25x106 Zellen pro
Milliliter eingestellt. Pro enthaltener B-Zelle wurden der Suspension 4-5 Beads
zugegeben und in einem Überkopfmischer für 20' bei 4°C in Dunkelheit inkubiert.
Mittels eines Magneten (Dynal MPC-6) wurden die Beads an der Wand des
Reagenzglases fixiert und der Überstand abpipettiert. Nach Resuspension wurden
die Beads ein zweites Mal mit PBS gewaschen und schließlich auf eine
Konzentration von circa 2,5x106/100µl eingestellt. Zur Entfernung der magnetischen
Beads wurde ein polyklonaler Antikörper gegen Maus-Ig (Dynal DETACHaBEAD)
verwandt, der den Beads-gekoppelten CD19-Antikörper aus seiner Bindung an der
Zelloberfläche verdrängt. Den in 100µl Medium resuspendierten Zellen wurde eine
Einheit (10µl) der DETACHaBEADS zugesetzt und diese für 60' bei 23°C auf einem
Probenschüttler
inkubiert.
Die
Beads
konnten
mit
einem
Magneten
nach
zweimaligem Waschen vollständig entfent werden. Die gewonnen reinen B-Zellen
wurden nach Zentrifugation und Auszählen zur weiteren Verwendung auf eine
Konzentration von 1x106/ml R10 eingestellt.
5.6. B-Zellstimulation
B-Lymphozyten wurden über den B-Zell-Rezeptor mittels polyklonaler Antikörper, die
gegen
die
µ-Kette
des
sIgM
gerichtet
waren,
das
costimulatorische
Oberflächenmolekül CD40 und durch die Zugabe der proliferativ wirkenden Zytokine
Interleukin-2
und
Interleukin-10
stimuliert.
Andere
Stimulationsbedingungen
bestanden in der Kokultivierung mit reinen, autologen, voraktivierten T-Zellen.
Sowohl native als auch stimulierte B-Lymphozyten wurden anhand einer Vielzahl von
Oberflächenmarkern hinsichtlich ihrer regelrechten Aktivierbarkeit und Expression
von Zellreifemarkern im Durchflußzytometer untersucht. Die Versuche wurden
zunächst mit unfraktionierten mononukleären Zellen durchgeführt und zum
Ausschluß
von
stimulierenden
oder
suppressiven
Einflüssen
anderer
Zellpopulationen mit reinen B-Lymphozyten wiederholt. Für die Stimulationen wurden
die Zellen in einer Konzentration von 1x106/ml für 20 Stunden in einem
Gesamtvolumen von 1ml R10-Medium bei 37°C und 5%CO2 Begasung in 24-wellPlatten inkubiert. Für eine optimale Stimulation wurde der anti-µ-Antikörper in
löslicher Form in einer Endkonzentration von 12,5µg/ml, Interleukin von 20U/ml und
5-47
Interleukin-10 von 10ng/ml zugegeben. Der eingesetzte anti-CD40-Antikörper wurde
nicht in löslicher Form verwendet, sondern mittels eines anti-Maus-IgG-Antikörpers
(F(ab)2-Fragment) zunächst an die Platte gebunden. Nach Inkubation des anti-MausAntikörpers für 16 Stunden bei 4°C in der Platte folgte die Zugabe der anti-CD40Antikörper in einer Endkonzentration von 1µg/ml für 2 Stunden bei 37°C. Nach
zweimaligem Waschen mit R10-Medium wurden die Zellen hinzugefügt.
Für die Stimulation von B-Zellen durch autologe T-Zellen wurden 0.5x106
vorstimulierte T-Zellen 1x106 unfraktionierten mononukleären Zellen zugegegeben.
Die für CD14, CD16 und CD19 negativ depletierten T-Zellen waren zuvor gemäß
dem Protokoll der T-Zell-Stimulation für 20 Stunden über CD3 und CD28 stimuliert
worden. Zur Kontrolle wurde ein Ansatz von in R10-Medium kultivierten
unstimulierten T-Zellen mitgeführt.
5.7. Immunglobulin-ELISA
Die Einteilung der CVID-Patienten in die Klassen A bis C nach Bryant et al. wird
anhand ihrer Fähigkeit zur in vitro Synthese von Immunglobulinen vorgenommen
(s.o.). Die wiederholt durchgeführte Testung diente der Überprüfung der zum Teil
vorbestehenden
Klassifikation
und
deren
Konstanz
im
Krankheitsverlauf.
6
Mononukleäre Zellen wurden in einer Konzentration von 1x10 /ml einerseits mit
Staphylococcus aureus Cowan strain I (SAC) in einer Verdünnung von 1:10000 unter
Zugabe von IL-2 (20U/ml), andererseits mit Pokeweed mitogen (PWM) in
Verdünnungen von 1:200, 1:400 und 1:800 in einem Gesamtvolumen von 1 Milliliter
R10-Medium bei 37°C und 5%CO2 Begasung in 24-well-Platten stimuliert. Nach
einem Zeitraum von 9 Tagen wurden die Überstände der Kulturen abgenommen und
bis zur Untersuchung mittels ELISA bei -20°C gelagert. Die Bestimmung von IgM und
IgG in den Kulturüberständen wurde in ELISA-Flachbodenplatten durchgeführt.
Zunächst wurden die Platten durch Inkubation für 16 Stunden mit dem Anti-hu-IgAIgG-IgM-Antiserum beschichtet. Die Kulturüberstände wurden 1:100 vorverdünnt und
gemeinsam mit den spezifischen AP-konjugierten Antiseren gegen IgM und IgG in
die entsprechenden Platten pipettiert. Neben den Standard-Verdünnungen wurden
eine PBS- und eine Mediumkontrolle mitgeführt. Nach einer Inkubationszeit von 2
Stunden bei Raumtemperatur wurde die Substratlösung in die gewaschenen Platten
pipettiert. Die Extinktionswerte der Platten bei 405nm wurden durch einen ELISA-
5-48
Reader gemessen. Der Test wurde bei einer Extinktion von 1,5 im höchsten
Standard gestoppt. Die Auswertung erfolgte anhand einer Standardgeraden.
5.8. Quantitative Bestimmung der mRNA für CD86
Zum Ausschluß posttranslationaler Ursachen für die phänotypisch beobachtete
Verminderung der Expression von CD86 auf der Zelloberfläche erfolgte eine
quantitative Bestimmung der für CD86 kodierenden mRNA. Nach erfolgter Isolierung
der peripheren mononukleären Zellen durch eine Ficoll-Hypaque-Dichtezentrifugation
wurden die CD19 positiven Zellen mittels antikörperbeladener magnetischer Beads in
einer Positivselektionierung auf eine Reinheit von >95% angereichert. Die Reinheit
und Reife der gewonnen B-Lymphozyten wurde durch die durchflußzytometrische
Bestimmung der Expression von CD3, CD4, CD8, CD19, CD21, CD22, CD23, CD69,
CD80 und CD86 sichergestellt. Die Stimulation erfolgte durch einen in löslicher Form
zugegebenen polyklonalen anti-IgM Antikörper. Für die Stimulation wurden die Zellen
in einer Konzentration von 1x106/ml in einem Gesamtvolumen von 1 Milliliter R10Medium bei 37°C und 5%CO2 Begasung in 24-well-Platten unter Zusatz der Zytokine
IL-2 (20U/ml) und Interleukin-10 (10ng/ml) inkubiert. Die optimale Dauer der
Stimulation wurde nach Erstellung einer Expressionskinetik für CD69, CD80 und
CD86 bei circa halbmaximaler Oberflächenexpression von CD86 auf 15 Stunden
festgelegt. Die absolute Anzahl der vitalen Zellen und möglicher toter Zellen wurde
nach der Stimulation durch eine Anfärbung mit Trypanblau bestimmt. Die GesamtRNA wurde mit Hilfe des Rneasy® Mini Kit der Firma Qiagen GmbH gemäß dem
Herstellerprotokoll aus mindestens 2x106 Zellen gewonnen. Die Synthese der cDNA
wurde mit TaqMan® Gold RT-PCR Reagenzien und "random hexamers" für 45
Minuten bei 48°C durchgeführt. Zur Beendigung der Reaktionen wurden die Proben
für 5 Minuten bei 95°C inkubiert. GADPH wurde benutzt, um den Gehalt an cDNA
mittels der TaqMan® GADPH Kontrollreagenzien zu quantifizieren (PE Applied
Biosystems, Weiterstadt, Germany). Die Quantifizierung der CD86 mRNA erfolgte
mittels des ABI PRISM 7700 sequence detection system® (PE Applied Biosystems,
Weiterstadt, Germany). CD86 spezifische Oligonukleotide und eine Fluoreszenz
Probe wurde mit Hilfe der PrimerExpress software (PE Applied Biosystems,
Weiterstadt, Germany) entwickelt: forward primer: 5'-CTG ACA AGA CGC GGC TTT
TAT C-3'; reverse primer: 5'-TC ATT GTG TTG GTT CCA CAT TT-3'; FAM labelled
5-49
probe: FAM---5'-ACC TTT CTC TAT AGA GCT TGA GGA CCC TCA GCC-3'. Die
Bedingungen der PCR waren: 2 min 50°C; 10 min 95°C; 15 sec 95°C, 1 min 60°C.
Die optimalen Konzentrationen der Primer wurden durch eine Primer-Matrix-PCRReaktion ermittelt. Die optimierte Konzentration beider Primer waren 300nM. Die
Quantifizierung erfolgte mittels der ∆CT Werte. Die Probe des gesunden Spenders
UDZ wurde als Kalibration benutzt, um Relativwerte für die Proben der Patienten zu
ermitteln.
5.9. T-Zelldepletion
Nach
Isolierung
der
mononukleären
Zellfraktion
mittels
Dichtegradientenzentrifugation wurden die enthaltenen T-Lymphozyten durch eine
Negativselektionierung auf eine Reinheit von >90% angereichert. Dies ermöglichte
die Untersuchung beinahe reiner T-Zellen unter Ausschluß möglicher stimulierender
oder suppressiver Einflüsse von Zellpopulationen wie B-Zellen oder Monozyten.
Prinzip der T-Zelldepletion war die Isolierung der T-Zellen durch die Depletion von
Monozyten (CD14+), Zellen der B-Zellreihe (CD19+) und von NK-Zellen und
neutrophilen Granulozyten (CD16+) aus der mononukleären Zellfraktion. Die
verwendeten magnetisierbaren Partikel (DYNABEADSM-450), die auf ihrer
Oberfläche kovalent mit gereinigtem Schafs-IgG beladen sind, sind spezifisch für die
Erkennung von Maus-IgG und -IgM und besitzen eine sehr geringe Kreuzreaktivität
mit humanen Antigenen. Im verwendeten indirekten Verfahren wurden die Zellen
zunächst mit einem spezifischen Maus-Antikörper der Klasse IgG inkubiert und in
einem zweiten Schritt mittels der Dynabeads M-450 Sheep anti-Mouse IgG rosettiert.
Gemäß dem Protokoll des Herstellers (Dynal, Oslo, Norway) wurde die
mononukleäre
Zellsuspension
(5x106Zellen/100µl)
mit
den
im
Überschuß
zugegebenen unkonjugierten Maus-IgG-Antikörpern gegen CD14 (30µl), CD16 (20µl)
und CD19 (20µl) in Eppendorf-Gefäßen (1ml) für 30' bei 4°C in Dunkelheit inkubiert.
Um nicht gebundene Antikörper zu entfernen, wurden die Zellen zweimal mit
Waschpuffer (PBS+1%FCS) gewaschen. Den Antikörper beladenen Zellen wurden
die Dynabeads M-450 Sheep anti-Mouse IgG in einem Verhältnis von 1:5 zugegeben
und diese auf einem Über-Kopf-Mischer für 15' bei 4°C inkubiert. Mittels eines
Magneten (Dynal MPC-6) wurden die an die Beads gebundenen Zellen an der
5-50
Wand des Eppendorf-Gefäßes fixiert und der Überstand mit den enthaltenen T-Zellen
abgenommen. Um die Reinheit der gewonnenen Zellen zu erhöhen, wurden die
Zellen ein zweites Mal mit Beads inkubiert und entsprechend depletiert. Nach
Zentrifugation und Auszählen wurden die auf >90% angereicherten T-Zellen zur
weiteren Verwendung auf eine Konzentration von 1x106/ml R10 eingestellt. Zur
Kontrolle der Methode und Sicherstellung der Reinheit der T-Zellen wurden Aliquots
der Zellen vor und nach der Depletion für die Expression der Marker CD3, CD14,
CD16 und CD19 durchflußzytometrisch charakterisiert.
5.10. T-Zellstimulation
T-Lymphozyten wurden mittels monoklonaler Antikörper, die gegen die α/βUntereinheit des T-Zell-Rezeptors (BMA031) oder gegen das mit dem TCR
assoziierte Molekül CD3 (BMA030) gerichtet waren, stimuliert. In beiden Fällen
wurde eine Kostimulation durch Zugabe eines zweiten monoklonalen Antikörpers,
welcher das Oberflächenmolekül CD28 erkennt und signalgebend für die Zelle wirkt,
erreicht. Die Versuche wurden zunächst mit unfraktionierten mononukleären Zellen
durchgeführt und zum Ausschluß von stimulierenden oder supprimierenden
Einflüssen anderer Zellpopulationen mit negativ depletierten (CD14-, CD16- und
CD19-negativ) und somit reinen T-Lymphozyten wiederholt. Für die Stimulationen
wurden die Zellen in einer Konzentration von 1x106/ml für 44 Stunden in einem
Gesamtvolumen von 1 Milliliter R10-Medium bei 37°C und 5%CO2 Begasung in 24well-Platten inkubiert. Für eine optimale Stimulation wurden die eingesetzten
BMA030-, BMA031- und anti-CD28 Antikörper nicht in löslicher Form verwand,
sondern zunächst mittels eines anti-Maus-Antikörpers (IgG F(ab)2) an die Platte
gebunden. Nach Inkubation des anti-Maus-Antikörpers für 16 Stunden bei 4°C und
zweimaligem Waschen der Platte mit R0-Medium folgte die Zugabe der Antikörper
BMA030 und BMA031 in einer Endkonzentration von 200ng/ml gemeinsam mit dem
Antikörper gegen CD28 für 2 Stunden bei 37°C. Nach zweimaligem Waschen mit
R10-Medium wurden die Zellen hinzugefügt. Die Färbung mittels monoklonaler
Antikörper und die Auswertung unter Verwendung spezifischer Isotypen-Kontrollen
erfolgte gemäß dem bekannten Protokoll.
5-51
5.11. Färbung intrazytoplasmatischer Zytokine
Nach der Isolierung der nativen MNC aus periphervenösem Blut und der negativen
Isolierung der T-Lymphozyten durch Depletion der CD14+-, CD16+- und CD19+Zellen wurde mit den reinen T-Lymphozyten entsprechend der Stimulation für den
Nachweis der Oberflächenmarker verfahren. Mittels eines anti-Maus-Antikörpers
wurden die monoklonalen Antikörper, die gegen den TCR (BMA031), CD3 (BMA030)
oder CD28 gerichtet waren, an die Platte gebunden. Die Zellen wurden in diesen 24well-Platten in einer Konzentration von 1x106/ml in einem Gesamtvolumen von 1
Milliliter R10-Medium bei 37°C und 5%CO2 Begasung für 24 Stunden inkubiert. Den
Stimulationsansätzen wurde zudem Brefeldin A (BFA) in einer Endkonzentration von
10µg/ml zugesetzt. BFA blockiert die Exozytose der Zytokine während der Kultur
durch Interaktion mit dem endoplasmatischen Retikulum und ermöglicht auf diese
Weise erst den intrazytoplasmatischen Nachweis. Das verwendete Protokoll zur
Anfärbung der Zytokine entspricht den Angaben des Herstellers (FastImmune
Cytokine System, BectonDickinson). Die vorstimulierten Zellen wurden in R10Medium gewaschen und auf eine Konzentration von 300-500.000/100µl pro Ansatz
eingestellt. Zunächst erfolgte die Anfärbung der Oberflächenmarker CD4 und CD8
mittels APC- und PerCP-konjugierter monoklonaler Antikörper. Nach 15' wurden 23ml der FACS-Lysing-Solution zugefügt, im nächsten Schritt wurden die Zellen für
30' mit 500µl der FACS-Permeabilizing-Solution inkubiert, im Anschluß 2-3ml des
Waschpuffers (500ml PBS, 0,5% BSA, 0,1% NaN3) zugegeben und nach
Zentrifugation
der
Überstand
verworfen.
Die
4-Farben-Durchflußzytometrie
ermöglicht die Beschreibung einer Zelle anhand von vier Merkmalen, in diesem Fall
zweier Oberflächenmoleküle in APC (CD4) und PerCP (CD8) und zweier
intrazytoplasmatischer Merkmale in FITC (TNFα, IFNγ) und PE (IL-2, IL-4). Dazu
wurde den Zellen pro Ansatz 10µl der anti-Zytokin-Antikörper zugesetzt und für 30'
bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Analog wurde für die mitgeführten Isotyp-Kontrollen in
FITC und PE verfahren. Nach dem Waschen wurden die Zellen zur Messung in
500µl des Waschpuffers resuspendiert.
6-52
6. Ergebnisse
6.1. B-Zell-Ergebnisse
6.1.1. Klassifikation der Patienten
Die CVID Patienten wurden anhand der in vitro Antwort ihrer B-Lymphozyten auf
Staphylococcus aureus Cowan strain I (SAC) und Pokeweed mitogen (PWM)
klassifiziert. Unter diesen Bedingungen sekretierten die B-Zellen der Gruppe A
Patienten keine signifikanten Mengen an IgM, IgA oder IgG, die der Gruppe B
Patienten sekretierten nur IgM, während die Patienten der Gruppe C normale
Mengen an IgM, IgA und IgG produzierten. Es wurde gezeigt, daß die Klassifikation
der Patienten hinsichtlich dieser Kriterien über Jahre konstant blieb. In dieser
Untersuchung wurden die Gruppen B und C zur Gruppe der NON-A Patienten
zusammengefaßt.
Die Bestimmung der Oberflächenmarker wurde vergleichend mit nativen und
vorstimulierten Zellen von CVID-Patienten und gesunden Spendern durchgeführt. Auf
B-Lymphozyten wurde die Expression der Marker CD19, CD21, CD22, CD23, CD54,
CD69, CD80 und CD86 durchflußzytometrisch beschrieben. Der prozentuale Anteil
der für den pan-B-Zell-Marker CD19 positiven Zellen an den mononukleären Zellen
war für 6 der 8 Patienten der Gruppe A und für alle 12 der Gruppe B normal.
Innerhalb der Kontrollgruppe fand sich ein Streuung von 2.1% bis 16.7%, innerhalb
der Patienten der Gruppe A von 0.4% bis 20.2% und innerhalb der Gruppen B und C
von 1.9% bis 13.7%. Lediglich zwei Patienten der Gruppe A wiesen einen
Prozentsatz an zirkulierenden B-Zellen von <1% auf.
6-53
24
CD19+ pos. Zellen
21
18
15
12
9
6
3
0
HD
A
NA
Abb. 4. Prozentualer Anteil CD19+ Zellen der nativen PBMC am Tag 0
6.1.2. Expression von Reifungsmarkern und Kostimulationsmolekülen
Die Expression der Reifemarker CD21 und CD22 als auch des Adhäsionsmoleküls
CD54 (ICAM-1) auf den untersuchten CD19 positiven B-Lymphozyten war auf einem
hohen Prozentsatz der B-Zellen nachweisbar und im Vergleich der Patienten mit den
% positive CD19+cells
Kontrollpersonen unauffällig.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
HD A NA
HD A NA
HD A NA
CD21+
CD22+
CD23+
HD A NA
CD54+
Abb. 5. Prozentualer Anteil CD21, 22, 23, 54 + Zellen der
nativen CD19+ B-Lymphozyten am Tag 0
6-54
Für die Patienten der Gruppe A ließ sich eine mögliche, jedoch nicht statistisch
signifikante
Verminderung
der
Expression
von
CD23
beschreiben.
Bereits im Rahmen der routinemäßig durchgeführten Immunstatusuntersuchung
waren die Daten zur Oberflächenexpression von IgM, IgD, CD5 und CD10 auf BZellen erhoben worden. Sowohl für die Expression von IgM als auch von IgD auf der
Zelloberfläche fand sich in den Patientengruppen A und NA ein signifikant höherer
Prozentsatz im Vergleich zur Kontrolle. IgM war auf 68-93% der CD19 positiven
Zellen der Kontrollpersonen exprimiert, hingegen auf Patientenzellen zu 81-98%.
Ähnlich verhielt sich die Expression von IgD mit einer Spanne von 68-90% bei der
Kontrolle, 93-98% bei A-Patienten und 81-97% bei NA-Patienten. Dieser erhöhte
Prozentsatz IgM/IgD doppelt positiver B-Zellen weist auf eine reduzierte Frequenz
von Klassenwechsel hin. Für die Expression von CD5 und CD10 lagen nur für einen
Teil der Patienten und Kontrollen Befunde vor. Auffälligkeiten ließen sich hierbei
bislang keine feststellen.
100
% positive CD19+ cells
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
HD A NA
HD A NA
HD A NA
HD A NA
sIgM+
sIgD+
CD5+
CD10+
Abb. 6. Im Rahmen der Immunstatusdiagnostik erhobene Daten zur
Expression von sIgM, sIgD, CD5 und CD10 auf nativen
CD19+ B-Lymphozyten
6-55
Um eine Voraktivierung der Zellen auszuschließen, wurden diese im nativen Zustand
auf die Expression des Aktivierungsmarkers CD69 untersucht. Im Kontroll- wie im
Patientenkollektiv fand sich ein maximaler Prozentsatz von 2.6% CD69 positiver
Zellen. Lediglich ein Patient der Gruppe NA wies mit 8.1% eine leichte Voraktivierung
der B-Zellen auf. Ein höherer und individuell stärker differierender Prozentsatz
positiver Zellen fand sich für die Expression von CD80 (B7.1). In der Gruppe der
gesunden Spender war der Nachweis für 11.4-47.5% der Zellen positiv, unter den
Patienten der Gruppe A für 7.6-49.0% und der Gruppe NA für 7.1-47.6%. Für den
zweiten Vertreter der B7-Familie CD86 (B7.2) fand sich ähnlich wie für CD69 nur
eine geringe Expression auf nativen Zellen: in der Kontrollgruppe 7.7-13.7%, in der
Gruppe A 3.1-12.5% und in der Gruppe NA 4.3-22.6%.
100
90
% positive B-cells
80
70
60
50
40
30
20
10
0
HD A NA
CD69+
HD A NA
HD A NA
CD80+
CD86+
Abb. 7. Prozentualer Anteil CD69, 80, 86 + Zellen der nativen
CD19+ B-Lymphozyten am Tag 0
6.1.3. Kinetik der Regulation von CD69, CD80, CD86 und CD23
Zur Darstellung der zeitlichen Abfolge der Expression der Oberflächenmarker CD69,
CD80, CD86 und CD23 nach Stimulation wurde eine Expressionskinetik über einen
Zeitraum von 24 Stunden erstellt. Die mononukleären Zellen eines gesunden
Spenders wurden mit einem gegen das sIgM gerichteten Antikörper (anti-µ,
6-56
12.5µg/ml) unter Zusatz der Zytokine IL-2 (20U/ml) und IL-10 (10ng/ml) in einer
Konzentration von 1x106/ml für bis zu 24 Stunden in einem Gesamtvolumen von 1
Milliliter R10-Medium bei 37°C und 5%CO2 Begasung in 24-well-Platten inkubiert.
Die Ergebnisse zum Zeitpunkt 0h entsprechen nativen unstimulierten Zellen. Der
äußerst schnelle Anstieg der Expression von CD69 von 2.4% auf 64.8% innerhalb
der ersten 2 Stunden und auf 91.1% innerhalb der ersten 4 Stunden bestätigt seine
Funktion als früher Aktivierungsmarker. Auch für CD86 läßt sich eine Steigerung um
das Vierfache von anfänglich 21.9% auf 83.3% nach 12 Stunden und auf 88.0% nach
20 Stunden beobachten. Im Vergleich zu CD69 findet sich die größte Steigerungsrate
allerdings nicht in den ersten 2 bis 4 Stunden, sondern im Zeitraum von 4 bis 12
Stunden nach Stimulationsbeginn. Ein nur leichter Anstieg der Expression von
anfänglich 13.5% auf 28.3% nach 24 Stunden findet sich für CD80. Hingegen fällt der
prozentuale Anteil der CD23 exprimierenden Zellen geringfügig von 93.1% auf 80.2%
nach 24 Stunden ab.
100
CD69
CD86
CD80
CD23
% positive CD19+ cells
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0h 2h 4h 8h 12h 16h 20h 24h
Inkubationszeit
Abb. 8. Kinetik der Expression von CD69, CD80, CD86 und CD23 nach
Stimulation mittels anti-IgM+IL-2+IL-10 in einer gesunden
Kontrolle
6-57
6.1.4. Expression von CD69, CD80, CD86, CD62L, CD137 und CD23 nach
Stimulation
Die unfraktionierten mononukleären Zellen von 7 Patienten der Gruppe A, 9 der
Gruppe NA und 11 Kontrollpersonen wurden gemäß dem im Abschnitt "Methoden"
beschriebenen Protokoll mit einem den BCR kreuzvernetzenden Anti-IgM-Antikörper
und den Zytokinen IL-2 und IL-10 für 20 Stunden inkubiert. In der Kontrollgruppe
exprimierten
nach
Stimulation
76.9%
bis
88.1%
der
B-Lymphozyten
den
Aktivierungsmarker CD69, in der Gruppe NA 68.9% bis 96.4%. In der Gruppe A
zeigten 5 Patienten eine der Kontrolle entsprechende Expression zwischen 73.1%
und 89.2%, hingegen erreichten zwei Patienten in wiederholten Stimulationsansätzen
nur Werte zwischen 55% und 65%. Diese beiden Patienten wiesen zuvor bereits BZellzahlen von <1% der MNC auf. Die Expression von CD86, ausgewertet als
Prozentsatz der CD86 positiven Zellen, zeigte in der Gruppe A der CVID-Patienten
eine statistisch signifikante Verminderung sowohl im Vergleich mit der Kontrolle als
auch mit der Gruppe NA. In der Gruppe der gesunden Spender waren 72.2% bis
88.6% der B-Lymphozyten für CD86 positiv, in der Gruppe NA 70.1% bis 83.2%,
hingegen exprimierten die Zellen der Gruppe A Patienten CD86 nur in einem
Prozentsatz von 47.7% bis 65.1%. Diese Verminderung ist mit einem p=<0.0001
% positive B-Zellen (CD19+)
statistisch hochsignifikant.
p=<0.0001
100
80
60
40
20
0
HD A NA
CD69+
HD A NA
HD A NA
CD86+
CD80+
Abb. 9. Expression von CD69, 80, 86 nach anti-µ-Stimulation + IL-2 +
IL-10 über 20 Stunden
6-58
Der Anteil der CD80 positiven Zellen unterlag einer größeren Variabilität und
erreichte in der Kontrollgruppe 15.4% bis 60.4%, in der Gruppe A 20.0% bis 58.7%
und in der Gruppe NA 8.9% bis 49.7%. Die Expression der bereits auf nativen Zellen
analysierten Marker CD69, CD80, CD86, CD21, CD22, CD23 und CD54, ebenso wie
des Moleküls CD62L und CD137 wurde in weiteren Stimulationsansätzen untersucht.
Neben
der
Stimulation
über
den
BCR
wurden
die
Zellen
über
das
Oberflächenmolekül CD40 oder mittels voraktivierter autologer T-Zellen stimuliert.
Der dargestellten Mediumkontrolle war IL-2 in einer Konzentration von 20U/ml und
IL-10 von 10ng/ml zugegeben worden. Die Expression des Aktivierungsmarkers
CD69 wurde in sämtlichen Patienten in vergleichbarer Höhe zur Kontrollgruppe
induziert. Es ließ sich eine zunehmende Expression ausgehend von 0% bis 8.1% auf
nativen Zellen, über 12.8% bis 39.2% in Medium, 52.9% bis 96.4% nach Anti-IgM
Stimulation bis zu 78.6% bis 98.7% nach Stimulation mit Anti-IgM und Anti-CD40
nachweisen.
% CD69+ B-Zellen (CD19+)
100
80
60
40
20
0
HD A NA
0h
HD A NA
20h
medium
HD A NA
HD A NA
20h
20h
anti-IgM aIgM + aCD40
Abb. 10. Expression von CD69 auf nativen CD19+ B-Lymphozyten, nach
anti-µ-Stimulation + IL-2 + IL-10 und + αCD40 über 20 Stunden
Entsprechend des Nachweises der Induktion von CD69 konnte die funktionelle
Aktivierung der B-Zellen durch die Analyse des Expressionsmuster des homing
6-59
receptor CD62L (LECAM-1, L-selectin) bestätigt werden. CD62L ist auf der Mehrzahl
der nativen B-Zellen exprimiert, wird jedoch durch aktivierungsabhängiges Shedding
in kurzer Zeit nach unten reguliert. Die Kreuzvernetzung des BCR resultierte in einer
für Kontrollen und Patienten ähnlichen Abnahme der Expression von >75% auf
<50%. Zwei der fünf untersuchten Patienten der Gruppe A zeigten allerdings bereits
im nativen Zustand der Zellen eine Expression von <60%.
% CD62L+ B-Zellen (CD19+)
100
80
60
40
20
0
HD A NA
HD A NA
0h
aIgM 20h
Abb. 11. Expression von CD62L auf nativen CD19+ B-Lymphozyten und
nach anti-µ-Stimulation + IL-2 + IL-10 über 20 Stunden
Im Gegensatz zur normalen Hochregulation von CD69 und dem Verlust von CD62L
exprimierten alle Patienten der Gruppe A signifikant weniger CD86 als gesunde
Spender und als die Patienten der Gruppe NA. Diese Tatsache spiegelte sich sowohl
in der verminderten Anzahl CD86 positiver B-Zellen (Gruppe A 47.7-65.1%, Kontrolle
72.2-88.6%; p<0.0001) als auch in einer geringeren Expressionshöhe, gemessen als
mittlere Fluoreszenzintensität der CD86 positiven Zellen, wider. Weder die
Kostimulation durch Anti-CD40 Antikörper (Gruppe A 37.7-59.5%, Kontrolle 63.483.5%; p<0.0001) noch die Verlängerung der Inkubationszeit von 20 auf 44 Stunden
vermochten die gestörte CD86 Expression zu beheben.
6-60
p=<0.0001
% CD86+ B-Zellen (CD19+)
100
p=<0.0001
80
60
40
20
0
HD A NA
0h
HD A NA
HD A NA
20h
medium
HD A NA
20h
20h
anti-IgM aIgM + aCD40
Abb. 12. Expression von CD86 auf nativen CD19+ B-Lymphozyten, nach antiµ-Stimulation + IL-2 + IL-10 und + αCD40 über 20 Stunden
mean CD86 fluorescence
p=0.0029
200
150
100
50
0
HD
A
NA
Abb. 13. Fluoreszenzintensität (mean fluorescence) von CD86 auf CD19+ BLymphozyten nach anti-µ-Stimulation + IL-2 + IL-10 über 20 Stunden
6-61
Abb. 14. Expression von CD86 nach Anti-IgM + IL-2 + IL-10 Stimulation
im Vergleich zwischen einem Patienten der Gruppe A und
einer Kontrolle als Overlay-Histogramm-Auswertung
Hingegen unterschied sich die Expression von CD80, dem zweiten Mitglied der B7Familie, zwischen den Patienten der Gruppe A, der Kontrolle und den Patienten der
6-62
Gruppe NA nicht. Nach 20 Stunden Inkubation fanden sich in allen Gruppen lediglich
Steigerungen der Expression von 10-25%.
% CD80+ B-Zellen (CD19+)
100
80
60
40
20
0
HD A NA
0h
HD A NA
20h
medium
HD A NA
HD A NA
20h
20h
anti-IgM aIgM + aCD40
Abb. 15. Expression von CD80 auf nativen CD19+ B-Lymphozyten, nach antiµ-Stimulation + IL-2 + IL-10 und + αCD40 über 20 Stunden
Um humoral oder zellulär zytotoxische Effekte als auch supprimierende Einflüsse von
T-Zell Zytokinen auszuschließen, wurde das Expressionsmuster für CD86 in hoch
aufgereinigten peripheren B-Zellpopulationen untersucht. Obwohl deren CD86
Expression niedriger war als nach Stimulation der unfraktionierten MNC, gelang es
auch den gereinigten B-Lymphozyten nach Stimulation mit Anti-IgM Antikörpern
nicht, die Expression von CD86 entsprechend der Kontrolle zu steigern. Dies betraf
wiederum den prozentualen Anteil positiver Zellen wie auch die mittlere
Fluoreszenzintensität.
6-63
100
90
90
p=0.0018
80
80
70
70
60
60
p=0.0054
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0
0
HD A NA
CD69+
HD A NA
HD A NA
CD86+
CD86 intensity
mean CD86 fluorescence
% positive B-Zellen (CD19+)
100
Abb. 16. Expression von CD69 und CD86 auf hochangereicherten CD19+ BLymphozyten nach anti-µ-Stimulation + IL-2 + IL-10 über 20 Stunden
6.1.5. Regulation der CD86 mRNA in B-Zellen
Im nächsten Schritt wurde untersucht, ob die verminderte Oberflächenexpression mit
Veränderungen der Transkription des für CD86 kodierenden Genes korreliert war. Es
wurde ein für die mRNA von CD86 spezifischer und zugleich quantitativer PCR
Ansatz benutzt, indem eine gesunde Kontrolle der Kalibrierung des Ergebnisses
diente. Aufgereinigte B-Zellen wurden für 15 Stunden mit einem Anti-IgM Antikörper
unter Zusatz von IL-2 und IL-10 inkubiert. Die funktionelle Aktivierung wurde durch
die Hochregulation der Expression von CD69 nachgewiesen. In den B-Zellen der drei
untersuchten Patienten der Gruppe A blieb nach Stimulation die Transkription für
CD86 aus (23-35%), vielmehr ließ sich im Vergleich zu in Medium kultivierten Zellen
(28-46%) eine Abnahme der Transkriptionssignale beobachten. Im Gegensatz hierzu
zeigten die B-Zellen des untersuchten Patienten der Gruppe NA eine der Kontrolle
vergleichbare Hochregulation.
6-64
CD86 mRNA (% of control)
100
80
HD
A
A
A
B
60
40
20
0
medium
aIgM
Abb. 17. Ergebnis der quantitativen Bestimmung der CD86 mRNA in CD19+
B-Lymphozyten nativ und nach anti-µ-Stimulation + IL-2 + IL-10 über
20 Stunden
Um festzustellen, ob die veränderte Antwort der B-Zellen der Gruppe A Patienten
nach BCR-abhängiger Aktivierung auf die Expression von CD86 beschränkt oder ob
die Expression weiterer Gene betroffen ist, wurde die Induzierbarkeit von CDw137
untersucht. CDw137 gehört der Familie der TNF-Typ I Rezeptoren an und wird nach
Aktivierung auf B-Zellen, T-Zellen und Monozyten exprimiert. Wie gezeigt, ist
CDw137 nur auf einem kleinen Teil der nativen B-Zellen vorhanden. Während die
Kreuzvernetzung des BCR die Zahl der CDw137 positiven B-Lymphozyten gesunder
Spender und der Patienten der Gruppe NA erhöhte, fand sich für die B-Zellen der
Gruppe A keine gesteigerte Expression von CDw137.
6-65
% CD137+ B-Zellen (CD19+)
50
p=0.0012
40
30
20
10
0
HD A NA
HD A NA
0h
aIgM 20h
Abb. 18. Expression von CD137 auf nativen CD19+ B-Lymphozyten und
nach anti-µ-Stimulation + IL-2 + IL-10
Neben der Stimulation der B-Zellen über IgM und CD40 wurde die Expression von
CD86 in einem Stimulationsansatz von MNC mit voraktivierten autologen T-Zellen
untersucht, die durch Hochregulation zahlreicher Oberflächenmoleküle (u.a. CD40L)
% positive B-Zellen (CD19+)
eine intensive T-Zell-B-Zellwechselwirkung ermöglichen.
p=<0.0001
100
80
60
40
20
0
HD A NA
CD69+
HD A NA
HD A NA
CD86+
CD80+
Abb. 19. Expression von CD69, CD80 und CD86 auf CD19+ B-Lymphozyten
nach
Stimulation
Lymphozyten
mittels
voraktivierter
autologer
CD3+
T-
6-66
Trotz einer starken funktionellen Aktivierung mit Expression von CD69 auf >93% der
B-Zellen wiesen die Patienten der Gruppe A (53.2-71.1%) auch unter diesen
Stimulationsbedingungen im Vergleich zur Kontrolle (88.4-96.4%; p<0.0001) und der
Gruppe NA (74.6-90.8%) eine signifikant verminderte Expression von CD86 auf.
Hingegen verhielt sich die Expression von CD80 der Kontrolle entsprechend. Für die
Maturitätsmarker
CD21
und
CD22
fanden
sich
unter
den
getesteten
Stimulationsbedingungen im Vergleich zu nativen Zellen keine Veränderungen der
Expression. Im Hinblick auf eine gestörte Interaktion von T- und B-Zellen und
Regulation der Immunglobulinsynthese wurde die Expression von CD23 und CD54
untersucht. Für CD23 wiesen vier der untersuchten Patienten im nativen Zustand
eine um bis zu 30% verminderte Expression auf. Nach Stimulation mit αIgM oder
αCD40 zeigte sich für Patienten und Kontrollen gleichermaßen eine Abnahme der
Expression um 10-25%, in Medium sogar um bis zu 50%.
% CD23+ B-Zellen (CD19+)
100
80
60
40
20
0
HD A NA
0h
HD A NA
20h
medium
HD A NA
HD A NA
20h
20h
anti-IgM aIgM + aCD40
Abb. 20. Expression von CD23 auf nativen CD19+ B-Lymphozyten, nach antiµ-Stimulation + IL-2 + IL-10 und + αCD40 über 20 Stunden
CD54 (ICAM-1) ließ sich auf >88% der nativen B-Lymphozyten sowohl der Patienten
als auch der Kontrollen nachweisen. Nach Kultur in Medium war ein starker Abfall der
Expression von bis zu 60% zu beobachten, hingegen nach Stimulation mit Anti-IgM
oder Anti-CD40 lediglich eine Verminderung um 10-20%.
6-67
% CD54+ B-Zellen (CD19+)
100
80
60
40
20
0
HD A NA
0h
HD A NA
HD A NA
20h
medium
HD A NA
20h
20h
anti-IgM aIgM + aCD40
Abb. 21. Expression von CD54 auf nativen CD19+ B-Lymphozyten, nach antiµ-Stimulation + IL-2 + IL-10 und + αCD40 über 20 Stunden
6.2. T-Zell-Ergebnisse
6.2.1. T-Zelloberflächenfärbung (native Zellen)
Die Expression der Oberflächenmarker CD3, CD4, CD8, CD40L, CD69, CD95 und
CD120b
wurde
in
der
Durchflußzytometrie
vergleichend
auf
nativen
und
vorstimulierten T-Lymphozyten von 6 CVID-Patienten der Gruppe A, 5 der Gruppe
NA und 5 gesunden Spendern charakterisiert. 4 der 6 Patienten der Gruppe A und
alle Patienten der Gruppe NA wiesen einen normalen Prozentsatz zirkulierender CD3
positiver Zellen auf, während zwei Patienten der Gruppe A eine Verminderung der
Zahl auf <47% der mononukleären Zellen zeigten. Die Zahl der CD4+ peripheren TLymphozyten lag in der Kontrollgruppe zwischen 32.9% und 43.8% der MNC,
hingegen zeigten 5 der 6 Patienten der Gruppe A und 3 der Gruppe NA eine
deutliche Verminderung auf Werte zwischen 8.7% und 22.3%.
6-68
100
% positive Zellen
80
60
40
20
0
HD A NA
CD3+
HD A NA
CD4+
Abb. 22. Prozentualer Anteil der CD3 und CD4 positiven Zellen an
nativen PBMC
Diese Veränderung spiegelt sich auch im verminderten Verhältnis der CD4+ und
CD8+ Zellen wider. Auf den CD4+ T-Zellen beinahe aller Patienten wurde eine starke
Erhöhung der Expression des Fas-Antigens CD95 (APO-1) (p<0.001) nachgewiesen,
die auf eine Voraktivierung der Zellen in vivo hinweist. Eine weniger ausgeprägte
Steigerung zeigte sich für die Expression des TNF-Rezeptor CD120b (75kD). Die
beschriebenen Veränderungen im Kompartiment der nativen T-Lymphozyten waren
somit unabhängig von der Klassifizierung der Patienten in die Gruppen A und NA.
6-69
4
3
2
1
0
HD
A
NA
Abb. 23. Verhältnis des prozentualen Anteils CD4+ zu CD8+ TLymphozyten (CD3+); CD4/CD8
100
90
% positive Zellen
80
70
60
50
40
30
20
10
0
HD A NA
HD A NA
HD A NA
CD3+
CD120b+
CD3+
CD95+
CD3+
Abb. 24. Expression von CD120b (TNF-R p75) und von
CD95 auf nativen CD3+ T-Lymphozyten
6-70
100
90
% positive Zellen
80
70
60
50
40
30
20
10
0
HD A NA
HD A NA
HD A NA
CD4+
CD120b+
CD4+
CD95+
CD4+
Abb. 25. Expression von CD120b (TNF-R p75) und von
CD95
auf
nativen
CD4+
T-Lymphozyten
(p<0.001)
6.2.2. Oberflächenfärbung stimulierter T-Zellen
Negativ angereicherte T-Lymphozyten von Patienten und Kontrollen wurden über die
α/β-Untereinheit des T-Zell-Rezeptors (BMA031) oder das mit dem TCR assoziierte
Molekül CD3 (BMA030) nebst Kostimulation über CD28 stimuliert. Die Untersuchung
der Expression von CD69, CD120b (TNF-R 75kD) und CD40L auf CD3 und CD4
positiven Zellen ergab in allen Stimulationsansätzen für die Patienten eine der
Kontrolle entsprechende Expression von CD69 und somit die funktionelle Aktivierung
der Zellen. Da sich zwischen der Stimulation über den TCR und über CD3 keine
Unterschiede im Phänotyp der Zellen zeigten, beschränkt sich die Darstellung auf die
Ergebnisse der αTCR/αCD28-Stimulation. Die Auswertung über CD3 ermöglichte
den Ausschluß funktioneller Defekte in einer Subpopulation der T-Zellen nicht, da sie
sowohl CD4 als auch CD8 positive Zellen einschließt. Die Expression von CD120b
auf CD4+ Zellen zeigte für die Patienten (51.1-94.3%) ähnlich wie für die Kontrolle
(42.7-96.2%) starke individuelle Unterschiede. Für die Expression des CD40L liess
sich auf CD4+ T-Zellen eine signifikante (p=0.0024), jedoch in ihrer funktionellen
6-71
Bedeutung unklare Verminderung für die untersuchten Patienten der Gruppe A im
Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe nachweisen. Die verminderte Expression des
CD40L in der Auswertung über CD3 ist bedingt durch die Verschiebung des
% positive CD3+ Zellen
Verhältnisses von CD4+ und CD8+ Zellen innerhalb der Patientengruppe.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
HD A NA
HD A NA
HD A NA
CD69+
CD120b+
CD40L+
Abb. 26. Expression von CD69, CD120b (TNF-R p75) und CD40L
auf CD3+ T-Lymphozyten nach αTCR- (BMA031) +
% positive CD4+ Zellen
αCD28 Stimulation
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
HD A NA
HD A NA
HD A NA
CD69+
CD120b+
CD40L+
Abb. 27. Expression von CD69, CD120b (TNF-R p75) und CD40L
auf CD4+/CD3+ T-Lymphozyten nach αTCR- (BMA031)
+ αCD28 Stimulation
6-72
6.2.3. Intrazytoplasmatische Zytokine in CD4+ und CD8+ T-Zellen
Negativ depletierte T-Lymphozyten von Patienten und Kontrollen wurden über die
α/β-Untereinheit des T-Zell-Rezeptors (BMA031) oder das mit dem TCR assoziierte
Molekül CD3 (BMA030) nebst Kostimulation über CD28 und Zugabe von Brefeldin A
stimuliert. Es wurde die Expression der Zytokine IFNγ, TNFα, IL-2 und IL-4 und des
Aktivierungsmarkers
CD69
in
CD4
und
CD8
positiven
T-Zellen
durch
intrazytoplasmatischen Nachweis untersucht. Da sich zwischen der Stimulation über
den TCR und über CD3 keine Unterschiede im Phänotyp der Zellen zeigten,
beschränkt sich die Darstellung wiederum auf die Ergebnisse der αTCR/αCD28Stimulation. Die Expression von CD69 in >90% der CD4+ oder CD8+ Zellen wurde
als Nachweis der funktionelle Aktivierung in sämtlichen Kontrollen und Patienten
gewertet. Der prozentuale Anteil der zytokinpositiven Zellen setzt sich aus dem
jeweiligen Meßwert und dem nominellem Abzug des jeweiligen Isotypwertes
zusammen. Neben der Isotyp-Kontrolle der Antikörper wurde zur Sicherstellung der
Stimulationsbedingungen stets eine Tages- und eine Mediumkontrolle mitgeführt. In
der Auswertung der CD4+ Zellen zeigten lediglich zwei Patienten Auffälligkeiten im
Zytokinmuster. Ein Patient der Gruppe A und einer der Gruppe NA wiesen einerseits
nahezu
eine
Verdoppelung
der
IFNγ
positiven
Zellen,
andererseits
eine
Verminderung der IL-2 positiven Zellen um bis zu 50% gegenüber der Kontrolle und
den restlichen Patienten auf. Für den Nachweis von TNFα (45.1-63.1%) und IL-4 (05.7%) stellten sich alle Patienten unauffällig dar.
6-73
100
% positive CD4+ Zellen
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
HD A NA
HD A NA
CD69+
IFNg+
HD A NA
TNFa+
HD A NA
IL-2+
HD A NA
IL-4+
Abb. 28. Intrazytoplasmatischer Nachweis von IFNγ, TNFα,
IL-2 und IL-4 in CD3+/CD4+ T-Lymphozyten nach
αTCR- + αCD28 - Stimulation
Im Kompartiment der CD8+ Zellen fiel für alle Patienten unabhängig von deren
Klassifizierung in die Gruppen A und NA eine signifikante Erhöhung der IFNγ- und
TNFα-Produktion auf. Für die Gruppe A liess sich eine signifikante (p=0.017)
Steigerung der für IFNγ positiven CD8+ Zellen auf 41% bis 68%, für die Gruppe NA
auf 34% bis 68% gegenüber der Kontrolle (5% bis 32%) nachweisen. Für TNFα
zeigte sich eine signifikante (p=0.023) Steigerung der positiven CD8+ Zellen auf 38%
bis 62%, für die Gruppe NA auf 29% bis 54% gegenüber der Kontrolle (6% bis 27%).
Zudem konnte die verminderte IL-2 Produktion in zwei Fällen auch für die CD8+
Zellen bestätigt werden. Die relative Steigerung der Th1-Antwort erfährt eine weitere
Betonung durch die Erhöhung der Absolutzahl der CD8+ Zellen innerhalb der CD3+
T-Zellen der Patienten.
6-74
100
% positive CD8+ Zellen
90
p=0.017
80
p=0.023
70
60
50
40
30
20
10
0
HD A NA
HD A NA
CD69+
IFNg+
HD A NA
TNFa+
HD A NA
IL-2+
HD A NA
IL-4+
Abb. 29. Intrazytoplasmatischer Nachweis von IFNγ, TNFα,
IL-2 und IL-4 in CD3+/CD8+ T-Lymphozyten nach
αTCR- + αCD28 - Stimulation
6.3.1. Transformation und Etablierung von B-Zell-Linien
Reine B-Lymphozyten wurden aus mononukleären Zellen über den Pan-B-Zellmarker
CD19 positiv selektioniert und auf eine Konzentration von 1x106Zellen/ml R10
eingestellt. Der konzentrierte Überstand einer EBV-Kultur wurde den B-Zellen in
einem Verhältnis von 1:50 zugegeben und die Zellen in einem Gesamtvolumen von 1
Milliliter R10-Medium bei 37°C und 5%CO2 Begasung in 24-well-Platten inkubiert.
Nach einer Inkubationszeit von mindestens zwei Wochen und mehrfacher Teilung
der Kulturen wurde die Charakterisierung der Oberflächenmarker CD86, sIgM, sIgD
und sIgG entsprechend dem bekannten Protokoll durchgeführt. Für die Messung der
Syntheseleistung wurden 0.5x106Zellen/ml für 9 Tage inkubiert, der Überstand
gewonnen und in einem ELISA nach bekanntem Protokoll auf den Gehalt an IgM und
IgG untersucht.
6-75
6.3.2. EBV-Linien-Ergebnisse
Die Möglichkeit einer Rekonstitution der Expression von CD86 und der Synthese von
Immunglobulinen wurde an EBV-transformierten B-Zell-Linien von 10 Patienten der
Gruppe A im Vergleich zu 12 Patienten der Gruppe NA und 13 Kontrollen untersucht.
Auf den Zellen wurde die Expression von CD86 und der Oberflächenimmunglobuline
sIgM, sIgD und sIgG bestimmt. Die Syntheseleistung wurde durch eine ELISAUntersuchung für IgM und IgG im Kulturüberstand ermittelt. Die EBV-transformierten
B-Zell-Linien der Patienten der Gruppe NA zeigten eine konstitutive (89.2%-96.4%)
Expression von CD86. Im Vergleich erreichten die Patienten der Gruppe A (82.0%93.3%) mit Ausnahme eines Patienten (66.8%) eine entsprechende Expression.
%CD86+ B-Zellen (CD19+)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
A
NA
Abb. 30. Expression von CD86 auf nativen EBVtransformierten B-Zell-Linien (CD19+) der
CVID-Patienten
Die Zahl der für IgM und IgD doppelt positiven Zellen war besonders in der Gruppe A
der Patienten erhöht, welches auf eine verminderte Frequenz von Zellen nach
durchgemachtem Klassenwechsel hinweist. Insgesamt war die Expression von sIgM,
sIgD und sIgG sehr unterschiedlich zwischen den einzelnen Patienten und
Kontrollen.
% positive B-Zellen (CD19+)
6-76
100
80
60
40
20
0
HD A NA
HD A NA
HD A NA
sIgM+
sIgD+
sIgG+
Abb. 31. Expression von sIgM, sIgD und sIgG auf EBVtransformierten B-Zell-Linien
Im Überstand der Kultur wiesen die Patienten der Gruppe A eine der Kontrolle
entsprechende Syntheseleistung für IgM auf, hingegen zeigte sich für IgG eine
fehlende oder stark verminderte Synthese.
p=<0.0001
25000
80000
20000
60000
15000
40000
10000
20000
5000
0
0
HD
A
NA
IgM
HD
A
NA
IgG
Abb. 32. IgM und IgG in quantitativer Bestimmung
(ng/ml) im Überstand der EBV-transformierten
B-Zell-Linien
IgG im Überstand (ng/ml)
IgM im Überstand (ng/ml)
100000
6-77
6.4. Native Monozyten
Alle 11 untersuchten Patienten (4.1%-23.9%) wiesen einen der Kontrollgruppe
(5.7%-18.4%) entsprechenden Prozentsatz CD14 positiver Monozyten an den
isolierten mononukleären Zellen auf. Ebenso wie die Kontrolle zeigten die Patienten
eine konstitutive Expression des IFNγ-Rezeptors (CD119) auf >87% der nativen
Zellen. Weiterhin wurde eine konstitutive, in der Höhe normale Expression von CD86
auf nativen Monozyten der Patienten, insbesondere der Gruppe A gefunden. Von
einem Patienten der Gruppe NA abgesehen, exprimierten >90% der Zellen CD86 auf
ihrer Oberfläche.
%CD14+ Monozyten
100
80
60
40
20
0
HD
A
NA
Abb. 33. Prozentualer Anteil CD14 positiver
Monozyten an den nativen PBMC
%CD119+ Monozyten
100
80
60
40
20
0
HD
A
NA
Abb. 34. Expression von CD119 (IFNγ-R) auf
nativen CD14+ Monozyten
6-78
%CD86+ Monozyten
100
80
60
40
20
0
HD
A
NA
Abb. 35. Expression von CD86 auf nativen Monozyten
6-79
Abb. 36. Expression von CD86 auf CD14+ nativen Monozyten im
Vergleich einer gesunden Kontrolle (UDZ) und eines Patienten
der Gruppe A (JMN) mittels Histogramm-Overlay Darstellung
7-80
7. Diskussion
Das
Variable
Immundefektsyndrom
(CVID)
ist
das
häufigste
(1:20000)
symptomatische Antikörperdefizienz-Syndrom. Die Erkrankung ist charakterisiert
durch Defekte der terminalen B-Zell Differenzierung und des Ig-Klassenwechsels,
welche zu einem Mangel an Plasmazellen führen. Das Unvermögen, Antikörper der
meisten oder aller Ig-Klassen zu bilden, bedingt schwere Defekte in der humoralen
Immunantwort
gegen
bakterielle
oder
virale
Pathogene.
Der
mögliche
zugrundeliegende Mechanismus wird kontrovers diskutiert. Für einen Teil der CVIDPatienten wurden gestörte T-Zell Funktionen durch ein verändertes Zytokinmuster
[103;118;119;278;279;289;332], durch eine verminderte Expression des CD40L
[113;383] und und eine eingeschränkte Entwicklung antigen-spezifischer Memory-TZellen [198] beschrieben. Andere Untersuchungen lassen bei intakter Helferaktivität
der T-Zellen [102] primäre Defekte im B-Zell Kompartiment annehmen. Bei
humoralen Immunantworten hängen die B-Zell Aktivierung und die Differenzierung zu
Plasmazellen von einer regelrechter Interaktion von T- und B-Zellen ab. Obligat für
die Switch Rekombination und die Antikörperbildung ist eine Kostimulation durch die
Rezeptor-Liganden-Paare CD28/CTLA-4 - CD80/CD86 und CD40-CD40L [22;48;49].
In T-Zellen wird die Zytokinproduktion und die CD40L Expression erst nach
Triggerung des CD28 Korezeptor durch B7 Liganden auf B-Zelle, Makrophagen oder
dendritischen Zellen induziert. In dieser Arbeit wurden für diese Interaktionen
bedeutsame Oberflächenmoleküle auf nativen und voraktivierten B-, T-Lymphozyten
und
Monozyten,
sowie
intrazytolasmatischem
die
Nachweis
Zytokinsynthese
untersucht.
von
Des
T-Lymphozyten
weiteren
konnten
mittels
EBV-
transformierte B-Zellinien der Patienten etabliert und in ihren Eigenschaften
analysiert werden.
7.1. Untersuchung von nativen B-Zellen
Der prozentuale Anteil der für den pan-B-Zell-Marker CD19 positiven Zellen innerhalb
der mononukleären Zellen war für 6 der 8 Patienten der Gruppe A und für alle 12 der
Gruppe NA normal. Lediglich zwei Patienten der Gruppe A wiesen einen Prozentsatz
an zirkulierenden B-Zellen von <1% auf und fallen damit in die CVIDKlassifikationsgruppe mit wenig B-Zellen.
7-81
Bereits im Rahmen der routinemäßig durchgeführten Immunstatusuntersuchung
waren die Daten zur Oberflächenexpression von IgM, IgD, CD5 und CD10 auf BZellen erhoben worden. Sowohl für die Expression von IgM als auch von IgD auf der
Zelloberfläche fand sich in den Patientengruppen A und NA ein signifikant höherer
Prozentsatz im Vergleich zu gesunden Probanden. Dieser erhöhte Prozentsatz
IgM/IgD doppelt positiver B-Zellen weist auf eine reduzierte Frequenz von Zellen mit
vollzogenem Ig-Klassenwechsel hin [95]. Für die Expression von CD5 [193;314] und
CD10 [64] lagen nur für einen Teil der Patienten und Kontrollen Befunde vor.
Auffälligkeiten ließen sich hierbei keine feststellen.
Für die Expression des Oberflächenmolekül CD21, das eine zentrale Rolle in T-Zell
abhängigen als auch T-Zell unabhängigen Immunantworten [7;73], in der Regulation
des Wachstum und der Differenzierung der B-Lymphozyten [20] sowie bei der
Modulation der Signaltransduktion des Antigenrezeptors [386] spielt, fand sich bei
lediglich 3 Patienten der Gruppe A auf nativen CD19+ B-Zellen eine leichte
Verminderung des Prozentsatzes CD21+ Zellen auf 72% bis 87%. Diese verminderte
Expression lässt sich jedoch statistisch nicht als signifikant beschreiben. Die
Expression von CD21 markiert den Übergang von der unreifen zur reifen B-Zelle
nach Verlassen des Knochenmark [95;226]. Nach Aktivierung der B-Zelle lässt sich
das Molekül nicht mehr auf der Oberfläche nachweisen. Der verminderte Prozentsatz
CD21+ B-Zellen bei einigen Patienten ist vermutlich auf eine Reifungsstörung
zurückzuführen. In einer kürzlich publizierten Folgearbeit unserer Gruppe liess sich
eine signifikante Assoziation zum Vorhandensein einer Splenomegalie nachweisen
[414].
Für die Expression des B-Zell spezifischen Moleküls CD22, das in den Pro- und
frühen Pre-B Zell Stadien zytoplasmatisch, später auf der Zelloberfläche exprimiert
wird [93] und bei der Aktivierung [92] und der Signaltransduktion über den IgMRezeptor [217] einbezogen ist, fanden sich keinerlei Auffälligkeiten bei den
untersuchten Patienten.
Das Molekül CD23, ein niedrig affiner Rezeptor für IgE [191], ist ein Typ II
Transmembranmolekül und auf vielen hämatopoetischen Zelltypen exprimiert. CD23
hat neben der Modulierung der IgE Produktion [120] pleiotrope Aufgaben in der
7-82
Kontrolle des Verhaltens von Lymphozyten. Es interagiert spezifisch mit CD21 [17].
Das Molekül liess sich bei gesunden Kontrollen auf >75% der nativen peripheren
CD19+ B-Lymphozyten nachweisen. Für 4 Patienten der Gruppe A und einen
Patienten der Gruppe NA fand sich eine auf 52% bis 75% verminderte Expression.
CD23 defiziente Mausmodelle zeigen vornehmlich eine gestörte Regulation der IgE
Synthese [207], sodass bei den betroffenen Patienten erniedrigte Spiegel von IgE zu
erwarten sind, nicht lässt sich dadurch die Verminderung von IgG und IgM erklären.
Allerdings kann dies ein weiterer Hinweis auf eine Dysregulation bereits der nativen
B-Zellen, eine veränderte Zusammensetzung der untersuchten Population von BLmphozyten oder für einen dauerhaften Aktivierungszustand mit Verlust von CD23
auf der Zelloberfläche sein. Nach 24 Stunden Stimulation fand sich bei einer
gesunden Kontrolle in den Versuchen zur Expressionskinetik ein Abfall der CD23
exprimierenden Zellen von anfänglich 93.1% auf 80.2%.
Antigenspezifische
Zellkontakte
im
Immunsystem
werden
durch
antigen
unspezifische Interaktion obligat modifiziert [369]. Beispielhaft dient CD54, Synonym
für ICAM-1 (intercellular adhesion molecule), als Ligand für LFA-1 [353]. Für dieses
an der regelrechten Interaktion von T- und B-Zellen massgeblich beteiligten Moleküls
fand sich eine konstitutive Expression auf >90% der nativen B-Lymphozyten
sämtlicher
Patienten
und
Kontrollen.
Ein
Expressionsdefekt
kann
somit
ausgeschlossen werden.
7.2. Untersuchung von stimulierten B-Zellen
Signale über den Antigenrezeptor (sIg), CD40 sowie verschiedene Zytokinrezeptoren
sind essentiell für eine erfolgreiche B-Zelldifferenzierung [65;208]. Es wurde daher
geprüft, inwiefern B-Zellen von CVID-Patienten bei in vitro Stimulation über diese
Rezeptoren eine normale Antwort in Bezug auf die Regulation wichtiger
Kostimulations-/Differenzierungsmoleküle
zeigen.
Die
Ergebnisse
zur
aktivierungsabhängigen Regulation ausgewählter Oberflächenmoleküle werden im
folgenden detailliert diskutiert.
Für das als früher Aktivierungsmarker dienende Molekül CD69 zeigte sich in
sämtlichen Stimulationssituationen über die µ-Kette des Antigenrezeptor, über CD40
7-83
oder durch Zugabe der Zytokine IL-2 und IL-10 eine der Kontrolle entsprechende
Induzierbarkeit. CD69 ist ein den C-Typ Lektinen im Tierreich verwandtes Typ II
Transmembranglykoprotein
[266]
und
aktivierungsabhängig
auf
unreifen
Thymozyten, reifen T- und B-Lymphozyten, NK-Zellen (natural killer cells),
Monozyten, Neutrophilen und Eosinophilen, und konstitutiv auf myeloischen
Precursor-Zellen im Knochenmark, auf Subpopulationen von Lymphozyten sekundär
lymphatischer Organe und Blutplättchen exprimiert [435]. Es ist das früheste
Leukozyten Aktivierungsantigen. Die Besetzung des Oberflächenmoleküls durch
spezifische Antikörper ruft intrazelluläre Signale wie Ca2+ Flux, Zytokinsynthese und
Zellproliferation hervor. Der physiologische Ligand ist jedoch bislang unbekannt
[266].
CD69
(-/-)
defiziente
Mäuse
zeigten
eine
weitgehend
unauffällige
hämatopoetische Zellentwicklung und normale T-Zell-Subpopulationen in Thymus
und der Peripherie. NK-Zellen und zytotoxische T-Lymphozyten wiesen eine den
Wild-Typ Mäusen vergleichbare zytotoxische Aktivität auf. Interessanterweise war die
B-Zell Entwicklung in Abwesenheit von CD69 gestört. Das B220(hi)IgM(neg) Pre-B
Zell Kompartiment im Knochenmark war in CD69 (-/-) Tieren vergrössert. Nach
Immunisierung mit T-zellabhängigen wie auch T-zell unabhängigen Antigenen verlief
die B-Zellantwort weitgehend ungestört. Es zeigt, dass CD69 eine Rolle in der B-Zell
Entwicklung spielt und lässt eine in vivo möglicherweise redundante stimulatorische
Aktivität auf Knochenmarksabkömmlinge vermuten [212]. Weitere Ergebnisse deuten
auf eine mögliche Beteiligung von CD69 in der Pathogenese von Erkrankungen wie
der rheumatoiden Arthritis, chronisch entzündlichen Leberveränderung, dem milden
Asthma bronchiale und dem erworbenen Immundefizienzsyndrome (AIDS) hin [238].
CD62L (LECAM-1, L-selectin) gehört zu der Familie der Selektine der interzellulären
Adhäsionsmoleküle. Es vermittelt die Adhäsion von Leukozyten am vaskulären
Endothelium, die Akkumulation im Rahmen einer Entzündungsreaktion und die
Migration in periphere Lymphknoten [172;327]. Seine weite Verbreitung über
sämtliche Leukozyten Populationen verspricht eine massgebliche Rolle in leukozytärendothelialen Interaktionen. Nach Aktivierung der Protein Kinase C (PKC) oder der
Calmodulin Inhibition wird das Protein durch einen proteolytischen Mechanismus im
Bereich der membrannahen Ektodomäne auf der Zelloberfläche nicht mehr
nachweisbar [122]. Mäuse, denen dieser Oberflächenrezeptor fehlt, wiesen eine
schwere Verminderung der in peripheren Lymphknoten lokalisierten Lymphozyten
7-84
auf. Die Zellen waren nicht in der Lage an die hohen endotheliale Venulen (HEV) zu
binden. Signifikante Defekte in der Migration von Lymphozyten in mukosale
Lymphknoten, Peyer's Patches, die Milz und nicht lymphoide Gewebe während einer
entzündlichen Reaktion waren zu beobachten [14;376]. Wie in dieser Arbeit gezeigt
wurde, ist CD62L auf nativen B-Zellen von CVID-Patienten mit Einschränkung durch
eine Verminderung bei zwei Patienten der Gruppe A auf 40% und 57% normal
exprimiert und wird bei sämtlichen Patienten nach B-Zellaktivierung regelrecht
herunterreguliert.
Im Gegensatz zur normalen aktivierungsabhängigen Hochregulation von CD69 und
dem Verlust von CD62L exprimierten alle Patienten der Gruppe A nach Stimulation
über die µ-Kette des sIgM signifikant weniger CD86 als gesunde Spender und als die
Patienten der Gruppe NA. Weder die Kostimulation durch α-CD40 Antikörper noch
die Verlängerung der Inkubationszeit von 20 auf 44 Stunden vermochten die CD86
Expression zu normaler Höhe zu rekonstituieren. Diese Verminderung liess sich
unter Ausschluss humoral oder zellulär zytotoxischer Effekte sowie supprimierender
Einflüsse von T-Zell Zytokinen und in hoch aufgereinigten peripheren B-Lymphozyten
bestätigen. In einer für die mRNA von CD86 spezifischen und zugleich quantitativen
Polymerase-Ketten-Reaktion
fand
sich
eine
Bestätigung
der
gestörten
Oberflächenexpression im Nachweis einer verminderten Transkription des für CD86
kodierenden Genes.
Das gegenwärtige Modell zur T-B-Interaktion erfordert zwei Signale. Das erste Signal
ist durch die T-Zell Rezeptor Erkennung und die Bindung an den MHC/Antigen
Komplex einer antigenpräsentierenden Zelle (APC) spezifisch. Das zweite ist
unspezifisch und resultiert aus der Bindung des B7 Liganden der APC mit seinen
möglichen Rezeptoren auf T-Zell Seite. Im Falle von CD28 wird die T-Zelle
proliferieren und Zytokine freisetzen. CD152 (CTLA-4) vermag, die T-Zelle
proliferationsinhibitorisch zu beeinflussen [257]. CD80 (B7.1) wie auch CD86 (B7.2)
können
an
CD28
und
CD152
binden,
sie
unterscheiden
sich
in
ihrer
Bindungsaffinität, Struktur und zeitlichen Expression [223]. In Untersuchungen zur
Zytokinsynthese zeigten sich bislang lediglich geringe Unterschiede zwischen CD80
und CD86 [210;218;296]. T-Zell Stimulation in Abwesenheit eines zweiten,
kostimulatorischen Signals kann zur Anergie oder der Induktion des Zelltod führen
7-85
[354]. Im Gegensatz zu CD86 fanden sich für die Expression von CD80 weder im
nativen noch im stimulierten Zustand Auffälligkeiten. Beispielhaft für die zentrale
Bedeutung von CD80 findet sich der fallbericht einer CVID Patientin mit
rekurrierenden Episoden einer zyklischen Neutropenie, einer kutanen Vaskulitis und
bakteriellen
Infektionen
bei
Nachweis
eines
reproduzierbaren
CD80
Expressionsdefektes auf stimulierten B-Lymphozyten [258].
Neben CD86 zeigte mit CDw137 ein weiteres Oberflächenmolekül eine reduzierte
Induzierbarkeit nach Stimulation der µ-Kette. CDw137 gehört der Superfamilie der
TNF-Typ I Rezeptoren an [347] und wird nach Aktivierung auf B-Zellen, T-Zellen und
Monozyten exprimiert [139]. Der Rezeptor hat neben seiner Bedeutung als
kostimulatorisches Molekül für T-Lymphozyten eine wichtige Funktion im Prozess der
Antigenpräsentation, der Entstehung zytotoxischer T-Zellen, dem Langzeitüberleben
von CD8+ und der Anergisierung von CD4+ T-Zellen [205]. Für 4-1BB, das analoge
murine Molekül des humanen CDw137, defiziente Mäuse zeigten bei einer
gesteigerten Proliferationsrate auf Mitogene eine verminderte Zytokinproduktion und
CTL Aktivität. Zudem scheint 4-1BB eine Rolle in der Regulation des Wachstums
myeloischer Vorläuferzellen zu spielen [206].
Bezüglich der defizienten CD86 Expression ähneln die B-Lymphozyten der CVID Typ
A Patienten phänotypisch anergen B-Lymphozyten, wie sie in einem transgenen
Mausmodel für B-Zell-Toleranz [138] gefunden wurden. In diesem Modell zirkulieren
reife B-Zellen in normaler Zahl, die auf ihrer Oberfläche für hen-egg lysozyme (HEL)
spezifische Immunglobuline der Klassen M und D exprimieren. Jedoch sind diese BLymphozyten
durch
die
dauerhafte
Exposition
von
löslichem
HEL
für
Aktivierungssignale unempfindlich. Sie vermögen nach der Kreuzvernetzung des
BCR weder die Expression von CD86 zu erhöhen noch HEL-spezifische
Antikörperantworten hervorzubringen [70;309]. Zudem werden antigen-spezifische TZellen während der veränderten Interaktion von T- und B-Zellen nur unvollständig
aktiviert [167] und B-Zellen könnten durch CD95-induzierte Apoptose getötet werden
[308;309]. Es wurde gezeigt, daß eine unvollständige Aktivierung antigenspezifischer CD4+ T-Zellen zu einer insuffizienten Produktion von IL-2 und einer
wechselhaften Expression von CD40L führt. Die verminderte Produktion von IL-2 und
Expression von CD40L sind zentrale Grundlagen für die Hypothese einer primäre T-
7-86
Zell-Defizienz als Ursache des CVID [119;383]. Neuerliche Ergebnisse lassen jedoch
vermuten, daß naive CD4+ T-Zellen, sobald sie auf B-Zellen antigene Strukturen
nicht gemeinsam mit kostimulatorischen Signalen von CD28/CD86 antreffen, keine
ausreichende Menge von IL-2 sezernieren und unfähig bleiben, B-Zellen regelrecht
über CD40L zu stimulieren [177;234].
Mäuse,
denen
das
Gen
für
CD86
fehlt,
weisen
eine
ausgeprägte
Hypogammaglobulinämie, eine gestörte Keimzentrumsbildung und eine fehlende
spezifische, T-Zell-abhängige Antikörperantwort auf [34]. Im Gegensatz zeigen Tiere,
denen das Gen für CD80 fehlt, keine entsprechenden Auffälligkeiten und bestätigen
die zentrale Rolle von CD86 für die Synthese von Immunglobulinen. Somit ist die
effektive Stimulation naiver T-Helferzellen nicht nur von der Kostimulation über CD86
abhängig, sondern die Kostimulation ebenso Voraussetzung für eine regelrechte
Aktivierung der B-Zellen, den Ig-Klassenwechsel und den Prozeß der IgVHypermutation, für den bei CVID-Patienten, die möglicherweise der Gruppe A
angehören, eine Störung beschrieben wurde [220]. Die phänotypischen und
funktionellen Ähnlichkeiten zwischen den B-Lymphozyten der Gruppe A Patienten
und den für CD86 defizienten oder anergen B-Zellen der Mäuse lassen die Annahme
zu, daß Defekte in der Regulation von CD86 als Model für die immunregulatorischen
Störungen der Gruppe A CVID-Patienten dienen können. Es muss allerdings
angemerkt werden, dass im Gegensatz zu den CD86 Maus-knockouts bei den CVIDPatienten eine reguläre CD86 Expression auf Monozyten und EBV-transformierten BZellinien gefunden wurde. In einer früheren Arbeit vertreten Eisenstein et al. [102]
eine ähnliche Ansicht, indem sie zeigen, daß die funktionelle B-Zell-Defizienz durch
Vorstimulation mit anti-CD40 in Kombination mit IL-10 und eine verlängerte
Kulturdauer zum Teil reversibel war. In dieser Arbeit waren die Patienten jedoch nicht
nach den Klassifikationskriterien von Bryant et al. in die Gruppen A bis C eingeteilt
worden, sodaß unklar bleibt, ob die Anergie der B-Zellen auf die Patienten der
Gruppe A beschränkt war.
Neben den Hypothesen einer Anergisierung im Sinne einer extrinsisch bedingten
funktionellen Dysregulation oder einem intrinsischen B-Zell-Defekt stellt sich zur
Erklärung der experimentellen Befunde die Frage nach einer veränderten
Zusammensetzung der vorhandenen B-Lymphozyten-Population, insbesondere des
7-87
Kompartiments
der
B-Gedächtniszellen.
Nach
ihrer
antigen-unabhängigen
Entwicklung [156] verlassen die unreifen B-Zellen das Knochenmark und bilden den
reifen, naiven IgD+IgM+CD27- B-Zell-Pool [226]. Werden diese Zellen durch Antigen
in Anwesenheit einer ausreichenden Kostimulation stimuliert, sind sie zur Ausbildung
einer Keimzentrumsreaktion (germinal center reaction) in der Lage und entwickeln
sich entweder zu Immunglobulin sezernierenden Plasmazellen oder zu BGedächtniszellen (memory B-cells) [229]. Für den Grossteil der CVID-Patienten ist
die Entwicklung dieser beiden Zelltypen schwer gestört, während reife B-Zellen meist
in weitgehend normaler Menge vorhanden sind [41;174;414]. Dies ist Hinweis für
Defekte in der späten B-Zell-Differenzierung. Da die Entwicklung von BGedächtniszellen eine regelrechte Keimzentrumsreaktion in sekundär lymphatischen
Organen voraussetzt [229], würde eine Verminderung des switched-memory B-Zell
Kompartimentes die Hypothese einer gestörten Keimzentrumsreaktion unterstützen.
Vielerlei mögliche Ursachen einer gestörten Keimzentrumsreaktion sind beschrieben
worden. Mutationen im Gen des CD40-Liganden [89;199], Defekte in der TNFαFamilie
[10]
und
ihren
Rezeptoren
[107]
und
die
gestörte
Expression
kostimulatorischer Moleküle wie CD86 [153] und Chemokine [13] besitzen starken
Einfluss auf Formation und Funktion des Keimzentrums. Optimierte Interaktionen
zwischen B- und T-Zellen inmitten des histoarchitektonischen Netzwerkes von
follikulär dendritischen Zellen sind für die Entwicklung des primären zu einem
sekundären Follikel unerlässlich.
Die Ergebnisse zeigen, dass die aufgrund einer unvollständigen Expression von
CD86 und CDw137 vermutete funktionelle Anergie der B-Lymphozyten auf die
Patienten der Gruppe A begrenzt ist. Der den anergen Phänotyp der peripheren BZellen bedingende Mechanismus bleibt spekulativ. Jedes Erklärungsmodell muß
allerdings berücksichtigen, daß die Krankheit meist zwischen der ersten und dritten
Lebensdekade ihren klinischen Beginn nimmt und zuvor eine unauffälligen kindliche
Impf- und Infektionsanamnese bestand. Die Populationszusammensetzung des BZell Memory Kompartimentes muss in weiteren Untersuchungen beschrieben
werden. Chronisch vorhandene, lösliche Proteine mit einer weiten BCR-Spezifität
und subthreshold Aktivierungseigenschaften wie zum Beispiel virale oder bakterielle
Superantigene sind mögliche Kandidaten für anergisierende Agenzien. Zum anderen
ist ein B-Zell-troper Virus vorstellbar, der mit der Signaltransduktion der Zelle
7-88
interagiert und die Ausreifung zur Plasmazelle stört. Hierzu ist festzuhalten, dass in
Untersuchungen des durch Interferon Typ I induzierten MxA-Proteins kein Hinweis
für eine virale Infektion gefunden wurde [333]. In drei untersuchten CVID-Patienten
konnte kein erhöhter Prozentsatz an EBV-infizierten B-Zellen festgestellt werden
(persönliche Mitteilung durch Herrn Prof.G.Bauer, Virologisches Institut, Freiburg).
Eine weitere Hypothese für die gestörte B-Zell-Funktion ist eine erworbene
Stammzell-Mutation, die Bestandteile der Signaltransduktion beeinflußt, analog zur
Situation, die für die GPI anchor deficiency bei der paroxysmalen nächtlichen
Hämoglobinurie (PNH) gefunden wurde [252].
7.3. Untersuchung von nativen T-Zellen
Der prozentuale Anteil der für den pan-T-Zell-Marker CD3 positiven Zellen an den
nativen mononukleären Zellen war für 4 der 6 untersuchten Patienten der Gruppe A
und für alle Patienten der Gruppe NA normal. Zwei Patienten der Gruppe A wiesen
eine Verminderung der Gesamt-T-Zellpopulation auf < 47% an den PBMC auf. Mit
Ausnahme eines Patienten zeigten sämtliche Patienten der Gruppe A und 3
Patienten
der
Gruppe
NA
eine
deutliche
Verkleinerung
der
CD4+
T-
Helferzellpopulation auf < 25% der PBMC. Diese Veränderung spiegelt sich ebenso
im verminderten Verhältnis von CD4+ zu CD8+ Zellen (CD4:CD8 Ratio) wider. CD4
besitzt als Korezeptor obligate Bedeutung für die MHC-II restringierte antigeninduzierte T-Zell Aktivierung [133;340], für Mechanismen der T-Zelldifferenzierung im
Thymus [195] und der Interaktion von T- und B-Lymphozyten [239]. Aktivierte CD4+
T-Zellen induzieren eine von kostimulatorischen Ligandenpaaren wie CD40 - CD40L
und CD28 - CD80/CD86 obligat abhängige Proliferation und Differenzierung von
unreifen Vorläufer- [312] und vor allem von reifen B-Lymphozyten [65;208]. Sie sind
für eine regelrechte Entwicklung der B-Zelle zur immunglobulin-sezernierenden
Plasmazelle und Ausbildung einer humoralen Immunantwort unerlässlich [95]. CD8
ist
ein
MHC
I
restringiertes,
monomorphes
Glykoprotein
mit
einer
den
Immunglobulinen verwandten Struktur. CD8αβ-Heterodimere sind an der Oberfläche
einer Subpopulation von Thymozyten, reifen α/β- und γ/δ-T-Zell-Rezeptor-positiven
T-Lymphozyten und auf natürlichen Killerzellen (NK) exprimiert [137;416]. CD8
besitzt zentrale Funktion in der Differenzierung zytotoxischer T-Lymphozyten
[282;419]. Anhand ihrer Aufgabe für die zelluläre Immunantwort werden die CD8+ T-
7-89
Zellen in Naiv-, Effektor- und Memory-Populationen unterschieden [387]. Eine
Verminderung der CD4+ T-Zellen, teils mit Expansion der absoluten CD8+ TLymphozytenzahl und einer Umkehr des CD4/CD8-Quotienten liess sich bei CVIDPatienten durch verschiedenen Autoren zeigen [24;112]. Eine verminderte CD4/CD8
Ratio findet sich ähnlich im Verlauf einer Virusinfektion z.B. mit dem humanen
Immundefizienz-Virus (HIV) [35;328]. Bei CVID-Patienten liess sich zudem eine
Expansion der CD8+ Population mit Koexpression der Aktivierungsmarker HLA-DR
und CD25 (IL-2-R) [24;425] demonstrieren. Diese Ergebnisse deuten auf eine
Voraktivierung von T-Lymphozyten in vivo hin, wobei deren primäre oder sekundäre
Charakteristik in Bezug auf den zugrundeliegenden Defekt bislang unklar blieb und
am ehesten durch vermehrte Infekte zu erklären ist. Auf den CD4+ T-Lymphozyten
sämtlicher Patienten konnte eine hoch signifikante Erhöhung der Expression des
Fas-Antigen CD95 (APO-1) auf 65% bis 95% der Zellen nachgewiesen werden. Eine
erhöhte Expression wurde bereits auf T-Zell- [170] und B-Zell-Subsets [151;342], teils
mit
erhöhten
Apoptoseraten
einhergehend
beschrieben.
Bei
Patienten
mit
systemischem Lupus erythematodes (SLE) wurde eine gesteigerte Expression von
CD95 auf T-Lymphozyten als Mechanismus der peripheren Lymphopenie postuliert
[11]. CD95 gehört der Familie der TNF-Rezeptoren an, vermittelt Apoptose
induzierende Signale und ist typischerweise stark exprimiert auf aktivierten T- und BZellen [202;265]. Die starke native Überexpression von CD95 bei CVID-Patienten der
Gruppe A als auch NA ist analog zu CD29 und CD57 am ehesten als Ausdruck
rezidivierender Infektepisoden mit ausgeprägter zellulärer Abwehrreaktion zu
beurteilen. Lediglich eine tendenziell gesteigerte Expression fand sich für den TNF-R
p75 (CD120b) auf nativen CD4+ T-Zellen. Ein quantitativer Expressionsdefekt kann
für CD120b somit ausgeschlossen werden, funktionell bedeutsame Veränderungen
der Proteinstruktur allerdings nicht. Bei einer auch in der Kontrollgruppe auftretende
grossen Variationsbreite der Expression zeigten sich auch nach Stimulation keine
auffälligen Befunde. CD120b ist auf vielen Zelltypen zu finden, insbesondere solchen
myeloischen Ursprungs, und wird stark auf stimulierten T- und B-Zellen exprimiert.
CD120b ist der auf zirkulierenden T-Lymphozyten hauptsächlich gefundene Rezeptor
für den Tumornekrosefaktor und Hauptmediator der autoregulatorischen Apoptose in
CD8+ Zellen [27]. Mäuse, denen der TNF-Rezeptor mit einem Molekulargewicht von
55kD (CD120a) fehlt, zeigen schwerste Störungen in der Abwehr von Infektionen
durch Mykobakterien [98], Leishmania major [399] und Listeria monozytogenes [298].
7-90
Zudem ist die Entwicklung der Peyer's Patches im Intestinum [270] gestört.
Allerdings
sind
sie
unempfänglich
für
die
toxischen
Wirkungen
des
Tumornekrosefaktors im Rahmen eines Endotoxinschocks [329].
7.4. Untersuchung von stimulierten T-Zellen
Durch negative Selektion angereicherte T-Lymphozyten von Patienten und Kontrollen
wurden über die α/β-Untereinheit des T-Zell-Rezeptors (BMA031) oder das mit dem
TCR assoziierte Molekül CD3 (BMA030) nebst Kostimulation über CD28 stimuliert.
Es fand sich in sämtlichen Stimulationsansätzen für die Patienten eine der Kontrolle
entsprechende Expression von CD69 und somit eine funktionelle Aktivierbarkeit der
T-Zellen [238]. Die Expression des TNF-Rezeptors (75kD) CD120b zeigte nach
Stimulation auf CD4+ T-Zellen mit Ausnahme zweier Patienten der Gruppe A und
zweier gesunder Probanden eine ausgeprägte Steigerung auf Werte über 80% der
Zellen. Es liessen sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen
beschreiben. Auffällig bleibt die grosse individuelle Variation in der Expression von
CD120b auf voraktivierten T-Zellen.
Die regelrechte Interaktion zwischen dem CD40 Liganden (CD40L) auf TLymphozyten und CD40 auf antigen-stimulierten B-Lymphozyten, Makrophagen und
dendritischen Zellen ist von zentraler Bedeutung für die Entwicklung einer humoralen
wie auch zellulären Immunantwort [22;145;149;271]. Arbeiten mit CD40L defizienten
Mäusen zeigen die wichtige Rolle der CD40 - CD40L Interaktion für T-Zell abhängige
Immunantworten und die Formierung von Keimzentren [427]. Für die Patienten der
Gruppe A zeigte sich auf vorstimulierten CD4+ T-Zellen eine geringe, jedoch
signifikant (p=0.0024) verminderte CD40L Expression auf 80% bis 88% gegenüber
91% bis 98% in der Kontrollgruppe. Eine Verminderung des CD40L für Subgruppen
von CVID-Patienten konnte bereits in mehreren Arbeiten nachgewiesen werden
[113;383]. Die X-chromosomal vererbte Form des Hyper-IgM (HIM) Syndrom ist
Folge von Mutationen im Gen des CD40L [16;89;199] mit vollständigem Verlust
seiner Funktion für T- und B-Zelle. Es ist charakterisiert durch eine Verminderung
oder das Fehlen von IgG, IgA und IgE bei normalen oder erhöhten Spiegeln von IgM.
Klinisch stehen rekurrierende Infekte des Respirationstraktes, chronische Diarrhoen
7-91
und Leberbeteiligungen im Vordergrund [219]. Die funktionelle Bedeutung der bei
den CVID-Patienten beobachteten Verminderung auf Werte >80% der CD4+ T-Zellen
ist
angesichts
der
Daten
für
Hyper-IgM-Konduktorinnen
(Carrierstatus)
als
zugrundeliegende Ursache für die schweren humoralen Defekte unwahrscheinlich.
Trotz einer Expression des CD40L von zum Teil lediglich 12% sind die heterozygoten
Konduktorinnen des XHIM klinisch weitgehend unauffällig [84].
7.5. Intrazytoplasmatischer Nachweis von Zytokinen in CD4+ und CD8 T-Zellen
Zytokine sind lösliche Proteine, die eine wichtige Rolle in der Immunregulation von
Lymphozytenfunktionen spielen. Sie regulieren Wachstum, Differenzierung und
Funktion einer grossen Zahl verschiedener Zellen und vermitteln physiologische aber
auch pathologische Immunantworten. T-Zellsubpopulationen lassen sich anhand
ihres
Zytokinprofiles
definieren.
Für
eine
zellulär
vermittelte
TH1-Antwort
verantwortliche T-Zellen produzieren typischerweise Interleukin-2 (IL-2), Interferon-γ
(IFNγ) und Tumornekrosefaktor-α (TNFα). Die typischen Stimuli für eine TH1-Antwort
sind Viren und einige bakterielle Erreger. TH2-Antworten werden durch IL-4, IL-5, IL6, IL-10 und IL-13 vermittelt. TH2-Zytokine regulieren humorale Immunantworten
vornehmlich in der Abwehr extrazellulärer Infektionen [90;260;261]. Sie bewirken
eine B-Zell Proliferation, eine polyklonale Immunglobulinsekretion und eine
Suppression von TH1-Antworten. Vielfältige biologische und analytische Verfahren
wurden zur Bestimmung der Zytokinsynthese entwickelt. Der Grossteil der Methoden,
wie beispielsweise der ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), bestimmt die
Menge des sekretierten Zytokines im Serum oder im Kulturüberstand. Sie
ermöglichem dem Untersucher nicht, eine Aussage über den Phänotyp der zytokinproduzierenden Zelle zu machen. Ein während der Inkubation der Kultur eintretender
Verbrauch von Zytokinen entgeht der Messung im Überstand und kann artifizielle
Verminderungen der gemessenen Syntheseleistung bedingen.
Die Expression von CD69 auf der Zelloberfläche in >90% der CD4+ oder CD8+ Zellen
wurde als Nachweis der funktionellen Aktivierung in sämtlichen Kontrollen und
Patienten gefunden. In der Auswertung der CD4+ Zellen zeigten lediglich zwei
Patienten Auffälligkeiten im Zytokinmuster. Ein Patient der Gruppe A und einer der
7-92
Gruppe NA wiesen einerseits nahezu eine Verdoppelung der für IFNγ positiven
Zellen, andererseits eine Verminderung der für IL-2 positiven Zellen um bis zu 50%
gegenüber der Kontrolle und den restlichen Patienten auf. Für den Nachweis von
TNFα und IL-4 stellten sich alle Patienten unauffällig dar. Im Kompartiment der CD8+
Zellen fiel für alle Patienten unabhängig von deren Klassifizierung in die Gruppen A
und NA eine signifikante Erhöhung der IFNγ- und TNFα-Produktion auf. Für die
Gruppe A liess sich eine signifikante (p = 0.017) Steigerung der für IFNγ positiven
CD8+ Zellen auf 41% bis 68%, für die Gruppe NA auf 34% bis 68% gegenüber der
Kontrolle (5% bis 32%) nachweisen. Für TNFα zeigte sich eine signifikante (p =
0.023) Steigerung der positiven CD8+ Zellen auf 38% bis 62%, für die Gruppe NA auf
29% bis 54% gegenüber der Kontrolle (6% bis 27%). Zudem konnte die verminderte
IL-2 Produktion in zwei Fällen auch für die CD8+ Zellen bestätigt werden. Zur
Beschreibung der funktionellen in vivo Situation muss die relative Steigerung der
Synthese von TH1-Zytokinen insbesondere im Kompartiment der CD8+ T-Zellen
entsprechend der verminderten CD4+CD8+-Ratio nach oben korrigiert werden.
Bereits
in
vorangegangenen
Untersuchungen
konnten
für
CVID-Patienten
gesteigerte TH1-Immunantworten demonstriert werden. Nach Stimulation mit PMA
(Phorbol Myristate Acetate) und Ionomycin wiesen die für die Zytotoxizität
bedeutsamen CD8+CD28+, teils auch die suppressorisch wirkenden CD8+CD28- TZellsubpopulationen der CVID-Patienten im intrazytoplasmatischen Nachweis eine
Steigerung der IFNγ Produktion auf. Dieses exzessive TH1-Muster wurde als
Ursache der funktionellen B-Zelldefizienz angenommen, bedingt durch eine gestörte
Interaktion von T- und B-Zellen und der Unfähigkeit zur Formierung von für die BZelldifferenzierung
[278;279].
notwendigen
Veränderungen
antigen-spezifischen
wurden
ebenfalls
für
CD4+
die
Memory
Synthese
T-Zellen
von
IL-2
[77;78;118;332], IL-4 [289] und IL-9 [160] beschrieben. Unauffällig verhielt sich die
Expression von IL-6 und dessen Rezeptors [183] sowie von IL-10 [283;434]. Kürzlich
beschrieben wurde eine erhöhte Frequenz IL-12 positiver Monozyten nach
Stimulation mit LPS, assoziiert mit einer gesteigerten Produktion von IFN-γ durch TLymphozyten [53]. Für HIV-1 positive Patienten konnte als Indikator einer
Immundysfunktion
in
der
intrazytoplasmatischen
Zytokinproduktion
nach
Mitogenstimulation neben einer verminderten IL-2 Synthese ein signifikant erhöhter
7-93
Anteil für IFNγ positiver CD8+ T-Zellen gefunden werden [109;420]. Bereits in nativen
CD8+ T-Zellen HIV-seropositiver Patienten liessen sich erhöhte mRNA Werte für IFNγ
zeigen [38]. Kinder mit einer selektiven IgA Defizienz wiesen als Ausdruck einer
starken TH1-Antwort in Untersuchungen des CD3+/CD4+ Kompartimentes erhöhte
Zahlen von für IFNγ und TNFα positiven Zellen auf [201]. Den genannten
Krankheitsbildern sind chronisch rezidivierende bakterielle Infektionen vornehmlich
des Respirations- und Gastrointestinaltraktes mit stetem inflammatorischem Reiz
gemeinsam. Die Behςet-Erkrankung ist klinisch durch das rezidivierende Auftreten
von Aphten der Mundschleimhaut und der Genitalien in Verbindung mit
entzündlichen Augenveränderungen gekennzeichnet. Sie ist Ausdruck einer
entzündlichen Systemerkrankung unbekannter Ätiologie mit dem Auftreten einer
Vaskulitis kleiner Venen und Arterien [241]. Auch hier fanden sich erhöhte
Frequenzen an IFNγ produzierenden CD4+ und CD8+ T-Zellen [373]. In Anbetracht
dieser Befunde ist die gezeigte Verschiebung zu einer TH1-Immunantwort als
reaktive und wohl unspezifische Veränderung in einer Situation rezidivierender
inflammatorischer Reize im Rahmen der durch die humorale Defizienz bedingte
Infektepisoden zu interpretieren. Gleichwohl fordert sie eine Perspektive der
humoralen Immundefizienz bei CVID Patienten.
8-94
8. Zusammenfassung
Das Variable Immundefektsyndrom (CVID) ist durch eine defekte B-Zellreifung und
Antikörperbildung charakterisiert, die in erniedrigten Spiegeln der meisten oder aller
Immunglobulinklassen und klinisch einer gesteigerten Infektanfälligkeit resultieren.
Eine spezifische Untergruppe von Patienten (Typ A) weist normale Anzahlen reifer,
auf der Oberfläche für sIgM/sIgD-positive zirkulierende B-Lymphozyten, die jedoch
auf eine Stimulation in vitro nicht mit einer Differenzierung und Synthese von
Immunglobulinen reagieren. Durch Analyse des Expressionsmuster einer grossen
Zahl von aktivierungsspezifischen Oberflächenmarkern auf B-Zellen konnte gezeigt
werden, dass Typ A CVID Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen eine stark
verminderte Expression des CD28/CTLA-4 Liganden CD86 (B7-2) und des
lymphozytären Aktivierungsmarker CD137 aufweisen. Korrelierend fanden sich
erniedrigte Werte für die mRNA von CD86. Eine kombinierte Stimulation über den BZell-Antigenrezeptor und Kreuzvernetzung von CD40 konnte die Defekte in der CD86
und CD137 Expression ebenfalls nicht aufheben. Diese B-Zellen erscheinen als
funktionell stumme, für die Kooperation mit T-Zellen unfähige Lymphozyten. Ihre
Akkumulation in Typ A Patienten lässt eine kausale Beziehung mit der Pathogenese
dieser Erkrankung annehmen. Im weiteren gilt es, diese Population hinsichtlich ihrer
Entstehung und ihres Verhaltens näher zu beschreiben. Auf der Seite der TLymphozyten fand sich im Kompartiment der nativen CD4+ T-Zellen für sämtliche
Patienten neben einer verminderten CD4/CD8-Ratio eine starke Erhöhung der
Expression von CD95 (Fas). Nach Stimulation zeigten Typ A Patienten eine
signifikante, jedoch in ihrer Bedeutung fragliche Verminderung der Expression des
CD40L. Die intrazytoplasmatische Anfärbung wies für alle Patienten im CD8+
ausgeprägter als im CD4+ Kompartiment eine gesteigerte Expression der TH1Zytokine IFNγ und TNFα nach. Die phänotypischen T-Zellveränderungen wie auch
die Verschiebung zu einer TH1-Immunantwort sind als reaktive und wohl
unspezifische Veränderung in einer Situation rezidivierender inflammatorischer Reize
im Rahmen der durch die humorale Defizienz bedingte Infektepisoden zu
interpretieren.
9-95
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Eur. J. Immunol. 2000. 30: 1069–1077
Impaired up-regulation of CD86 in CVID
1069
Impaired up-regulation of CD86 in B cells of “type
A” common variable immunodeficiency patients
Axel Denz1, Hermann Eibel2, Harald Illges3, Georg Kienzle1, Michael Schlesier1,
Hans-Hartmut Peter1
1
Division of Rheumatology and Clinical Immunology, Department of Internal Medicine,
University Hospital Freiburg, Freiburg, Germany
Clinical Research Unit for Rheumatology, Division of Rheumatology and Clinical Immunology,
Department of Internal Medicine, University Hospital Freiburg, Freiburg, Germany
3
Immunology Department, University of Konstanz, Konstanz, Germany
2
Common variable immunodeficiency (CVID) is characterized by defective B cell maturation
and antibody formation resulting in low serum antibody levels of most or all Ig isotypes. A
specific subgroup of patients (“type A”) has normal numbers of mature surface (s)IgM/sIgDpositive circulating B cells. However, since these lymphocytes do not respond to in vitro
stimulation by differentiation and Ig synthesis, they seem to suffer from so far unknown
intrinsic defects. Analyzing the expression pattern of a large set of B cell activation-specific
surface markers, we found that type A CVID patients show a highly reduced expression of
the CD28/CTLA-4 ligand CD86 (B7-2) and of the lymphocyte activation marker CDw137
when compared to B cells of healthy donors and non-type-A CVID patients. The lowered
CD86 expression levels were found to correlate with reduced levels of CD86 mRNA. Since
combined stimulation via B cell antigen receptor and CD40 cross-linking did not rescue the
defects in CD86 and CDw137 expression, B cells of CVID type A patients resemble functionally unresponsive lymphocytes incapable of cooperating with T cells. The fact that these
cells accumulate in type A CVID patients suggests a causal relationship with the pathogenesis of this disease.
Key words: CD86 / CDw137 / CD62L / B cell activation / Immunodeficiency
1 Introduction
In humans, common variable immunodeficiency (CVID)
is the most frequent (1/20 000) symptomatic primary
antibody deficiency syndrome. The disease is characterized by defects in terminal B lymphocyte differentiation
and class switching, resulting in a lack of plasma cells.
The failure to produce serum antibodies of most or all
Ig classes causes severe defects in humoral immune
responses against bacterial or viral pathogens. These
impairments lead to recurrent infections of the upper and
lower respiratory tract that manifest themselves usually
between the first and fourth decade of life. Males and
females are affected equally. Moreover, CVID patients
suffer from an increased incidence of malignancies,
[I 20063]
Abbreviations: CVID: Common variable immunodeficiency
SAC: Staphylococcus aureus Cowan strain I PWM: Pokeweed mitogen CD40L: CD40 ligand BCR: B cell receptor
HEL: Hen egg lysozyme
© WILEY-VCH Verlag GmbH, D-69451 Weinheim, 2000
Received
Revised
Accepted
6/9/99
17/12/99
13/1/00
intestinal lymphoid hyperplasia and in some patients,
CVID is associated with autoimmune or granulomatous
disease [1]. Although hypogammaglobulinemia and susceptibility to infections are common to all patients, they
nevertheless show heterogeneous clinical and laboratory
phenotypes. Therefore, disease subgroups were established according to clinical and immunological criteria.
Bryant et al. [2] introduced a typing system that is based
on the Ig responses of B cells following exposure to
appropriate stimuli like anti-IgM, Staphylococcus aureus
Cowan strain I (SAC) or pokeweed mitogen (PWM) [2–4].
Accordingly, four groups of patients are identified: firstly,
a small group of patients with very low B cell numbers
and an almost complete lack of humoral responses; secondly, “type A” CVID patients, who have reduced or normal numbers of circulating B cells that fail to produce
IgG, IgA and IgM upon in vitro stimulation; thirdly, “type
B” patients, whose B cells in vitro produce IgM but no
IgG or IgA, and fourthly “type C” CVID patients, who
show normal numbers of B cells that differentiate in vitro
to IgM-, IgA- and IgG-producing plasma cells, but fail to
do so in vivo.
0014-2980/00/0404-1069$17.50 + .50/0
1070
A. Denz et al.
The initial mechanisms underlying the defective antibody
responses are still controversially discussed. For the
majority of CVID patients, defects in T cell functions as
reflected by aberrant cytokine [3, 5–10] and CD40 ligand
expression [11, 12] as well as a reduced development
of antigen-specific memory T cells [13] have been described. However, results provided by Eisenstein et al. [14]
suggest primary defects in the B cell compartment since
the helper activity of CVID T cells was found to be intact.
Eur. J. Immunol. 2000. 30: 1069–1077
Here we show that B cells of type A CVID patients largely
fail to up-regulate CD86 and CDw137 expression upon
stimulation in vitro. We propose that this B cell defect is
one of the undelying mechanisms leading to type A
CVID.
2 Results
2.1 Phenotype of native CVID B cells
In humoral immune responses, B cell activation and differentiation into plasma cells depend on cognate T-B cell
interactions and stimulation through the receptor/ligand
pairs CD40–CD40 ligand (L) and CD28/CTLA-4–CD80/
CD86. For B cells, activation by CD40L-induced crosslinking of CD40 has been shown to be an indispensable
co-stimulatory signal required for switch recombination
and antibody formation [15, 16]. Interestingly, CD27/
CD70 ligation in the presence of IL-2 and IL-10 specifically enhances Ig production and plasma cell differentiation of CD27+ B cells [17–19]. For Th cells, cytokine production and CD40L expression is induced upon triggering of the CD28 coreceptor molecule through the B7
ligands expressed by B cells, macrophages or dendritic
cells. So far, two members of the B7 family, B7-1 (CD80)
and B7-2 (CD86), have been identified [20, 21]. Although
both ligands have similar affinities for CD28 [22–25], different cellular distributions and kinetics for CD80 and
CD86 expression suggest that differential interactions
with these ligands may lead to distinct signals. CD80 is
normally expressed at low levels on B cells, dendritic
cells and macrophages but up-regulated upon activation
via B cell receptor (BCR) or CD40 ligation or upon exposure to cytokines. CD86 is constitutively expressed on
dendritic cells and on monocytes. On resting B cells,
CD86 is expressed only at very low levels but it is rapidly
induced upon BCR cross-linking or upon stimulation by
cytokines [26–30]. The functional differences between
both ligands were further underlined by analyses using
mice deficient in either CD80 or CD86 expression.
Whereas B cells of CD86-deficient mice completely
failed to respond to activation by antigen with isotype
switch, germinal center formation and antibody production, B cells from CD80-deficient mice showed normal
humoral responses [31]. Since these studies emphasized
the role of CD86 in humoral immune responses, we analyzed the CD86 expression pattern in several subgroups
of CVID patients. In addition, we studied the expression
pattern of CDw137, the human homologue of the murine
4-1BB receptor. CDw137 is a member of the TNFR
superfamily and is expressed on T and B cells, monocytes and a number of other cell lineages upon activation. While CDw137 transmits co-stimulatory signals in T
cells, its function in B cells is not known so far [32, 33].
CVID patients were classified according to the in vitro
response of their B cells against SAC and PWM [2–4].
Under these conditions, B cells from type A CVID
patients failed to secrete significant amounts of IgM or
IgG, B cells from type B patients secreted only IgM,
whereas B cells from type C patients produced normal
amounts of IgM and IgG (Table 1; IgA paralleled IgG production, but is not recorded in this study). According to
these criteria, the classification of patients remained stable for years. In our study, we combined B and C patients
to the non-A group. Six of eight type A patients and all 12
non-A CVID patients displayed normal percentages of
circulating CD19+ B cells and only two type A patients
had less than 1 % of peripheral B cells. The majority of
B cells showed a mature phenotype characterized by
expression of IgM, IgD and CD22, while CD21 and CD23
expression was more variable in patients (Table 1). IgM/
IgD double expressing B cells were elevated in all CVID
patients, indicating a reduced frequency of class switch.
2.2 B cells of type A CVID patients express
reduced levels of CD86 and CDw137
Peripheral blood B cells from CVID patients and controls
were stimulated in the presence of IL-2 and IL-10 by antiIgM-induced cross-linking of BCR. Analyzing the expression of CD69, CD80 and CD86 (Fig. 1 A), we found that
CD69 was induced in all patients at similar levels
(53–96 %) as in controls (77–88 %). In parallel, we confirmed the functional activation of B cells by analyzing
the expression pattern of the homing receptor CD62L
(LECAM-1, L-selectin). CD62L is expressed on the
majority of native B cells, but is rapidly down-regulated
by activation-induced shedding [34, 35]. As shown
in Fig. 1 D, BCR cross-linking resulted in a similarly
decreased CD62L expression on B cells of healthy
donors and all CVID subgroups. However, in contrast to
the normal up-regulation of CD69 and the loss of CD62L
expression, all CVID type A patients expressed significantly less CD86 than healthy donors and non-A CVID
patients. This finding was reflected by both lower numbers of CD86+ B cells (type A CVID patients 48–65 %,
controls 72–89 %; p X 0.001) and reduced CD86
Eur. J. Immunol. 2000. 30: 1069–1077
Impaired up-regulation of CD86 in CVID
1071
Table 1. Immunological characterization of patients and controls
Patient
Age
(years)
Sex
Native CD19+ B cells
Classifi%
cationa) CD19+
%
sIgM+
%
sIgD+
%
CD21+
%
CD22+
%
CD23+
IgM synthesis
in vitro (ng/ml)
IgG synthesis
in vitro (ng/ml)
SAC+
IL-2
PWM
1 :200
SAC+
IL-2
PWM
1 : 200
GLT
30
m
A
1.8
83
93
82
99
52
246
0
9
52
CAS
28
m
A
0.6
94
97
72
100
57
0
0
0
0
JMN
33
m
A
18.6
98
98
95
99
75
71
0
0
0
GWR
53
m
A
0.5
ND
ND
98
100
91
0
0
0
0
MFT
35
f
A
7.8
93
93
87
96
64
99
0
0
0
INL
23
f
A
20.8
96
94
94
99
83
76
0
217
32
MMR
77
f
A
6.7
94
93
98
100
90
0
0
0
62
BRZ
43
m
A
10.3
ND
ND
ND
ND
ND
X 100
X 100
X 100
X 100
JBK
58
f
B
7.3
88
93
96
99
90
1942
0
0
0
HBR
44
m
B
13.7
96
92
93
100
64
G 7500
979
751
123
PLS
27
m
B
6.7
95
96
ND
ND
ND
G 7500
815
236
218
BMR
74
f
B
8.6
94
90
ND
ND
ND
6616
975
162
112
ESR
32
m
B
4.7
98
95
ND
ND
ND
G 7500
331
84
0
MHA
11
m
B
13.7
99
99
95
ND
ND
7313
0
179
206
MWR
73
m
B
5.4
91
91
48
ND
ND
G 7500
0
648
258
PLS
28
m
B
6.7
95
96
87
ND
ND
G 7500
815
236
218
BRZ
44
m
B
3.1
95
94
95
ND
ND
G 7500
387
222
209
MKR
38
f
C
8.1
93
97
98
100
95
G 7500
5120
1122
919
DER
30
m
C
4.0
94
92
99
ND
ND
G 7500
0
G 1500
144
DAR
38
m
C
4.2
81
81
94
ND
ND
G 7500
618
G 1500
G 1500
ADZ
23
m
HD
6.4
93
90
97
99
94
G 7500
68
942
244
RDR
39
f
HD
4.7
80
83
94
100
90
G 7500
0
G 1500
G 1500
JGH
34
m
HD
11.1
68
81
ND
ND
ND
G 7500
1378
G 1500
G 1500
KDZ
53
m
HD
16.7
ND
ND
99
100
90
G 7500
1245
G 1500
G 1500
CHN
26
f
HD
5.7
76
81
98
99
82
G 7500
0
372
375
ESK
27
f
HD
2.9
83
80
97
97
88
ND
ND
ND
ND
POO
33
f
HD
10.8
68
68
99
98
80
ND
ND
ND
ND
MBN
29
m
HD
3.5
76
75
93
ND
ND
G 7500
3497
G 1500
G 1500
KWR
36
m
HD
2.6
83
83
96
ND
ND
G 7500
G 7500
G 1500
G 1500
TGE
25
m
HD
2.1
81
80
97
ND
ND
G 7500
991
G 1500
836
a) A: CVID ’type A’; B: CVID ’type B’; C: CVID ’type C’; HD: healthy donor.
1072
A. Denz et al.
Eur. J. Immunol. 2000. 30: 1069–1077
Fig. 1. Decreased CD86 (B7-2) and CDw137 (ILA) expression on stimulated B cells from type A CVID patients. PBMC from
healthy donors (HD, 1 ), from type A CVID patients (A, ? ) and from non-type A patients (NA, | ) were stimulated with anti-IgM plus
IL-2 and IL-10 for 20 h (A, B) or with anti-IgM only (C, D). CD19+ B cells were analyzed by flow cytometry for CD69, CD80, and
for CD86 expression (A), for the fluorescence intensity of CD86 (B), for CDw137 expression (C) and for CD62L down-regulation
(D). Comparable results were obtained when cells were stimulated via CD40 cross-linking ± stimulation by anti-IgM and cytokines (data not shown). For unstimulated CD19+ B lymphocytes, the percentage of CD86+ cells in HD was 8.2–13.7 %, in A
patients 3.1–12.5 %, and in NA patients 4.3–13.8 %. When cultivated in the presence of IL-2 and IL-10, 25.8–52.3 % of HD B
cells, 16.3–34.6 % of A patient and 31.3–47.8 % of NA patient cells expressed CD86. Upon stimulation with anti-CD40, IL-2 and
IL-10, 46.9–67.3 % of HD B cells, 20.5–36.2 % of A patient and 52.4–60.4 % of NA patient B lymphocytes were CD86+. After
anti-IgM treatment in combination with CD40 co-stimulation in the presence of IL-2 and IL-10 73.2–83.5 % from HD,
37.7–59.5 % of A patient and 66.5–75.3 % of NA patient B cells showed CD86 up-regulation.
expression levels per B cell as measured by mean
fluorescence intensity (Fig. 1 A and B). Neither costimulation via anti-CD40 antibodies nor extended cultivation for up to 44 h instead of 20 h improved the
impaired CD86 expression (data not shown). In contrast,
the CD80 expression on B cells of type A CVID patients
did not differ from that of non-A patients or healthy controls.
To exclude humoral or cellular cytotoxic effects as well
as suppressive influences by T cell cytokines, we also
analyzed the CD86 expression pattern in highly purified
peripheral B cell populations. Although their CD86
expression was lower than in PMBC B cells, the purified
B lymphocytes of type A patients also failed to upregulate CD86 expression upon stimulation with anti-IgM
antibodies (Fig. 2 A and B). This phenotype remained
stable in all type A patients when re-tested after a period
of at least 4 months. An inheritant CD86 deficiency was
excluded since CD86 expression on monocytes and
EBV-transfected B cell line of type A patients was found
to be normal (data not shown).
Eur. J. Immunol. 2000. 30: 1069–1077
Impaired up-regulation of CD86 in CVID
1073
ated cells (28–46 %). In contrast, B cells from one type B
patient (HBR) showed a similar response as B cells from
the healthy donor.
To analyze if the changed response of CVID type A
B cells to BCR-dependent activation was confined to
CD86 expression only or if the expression of other genes
would be affected too, we tested among other surface
markers the induction of CDw137. It belongs to the family of TNFR1 molecules and is expressed upon activation
on B cells, T cells and monocytes [32, 33]. As shown in
Fig. 1 C, CDw137 is expressed only in a small fraction of
resting CD19+ B cells. While BCR cross-linking increased
the number of CDw137+ B lymphocytes purified from
PBMC of healthy donors and non-A CVID patients, no
up-regulation of CDw137 was found on B cells of type A
CVID patients.
3 Discussion
Fig. 2. Reduced CD86 (B7-2) expression of purified B cells
from type A CVID patients. CD19+ B cells were isolated as
described in Sect. 4.3 and stimulated as described in the
legend to Fig. 1. (A) shows the compilation of the flow cytometry data for CD69 and CD86 expression. (B) depicts a
representative histogram overlay for CD86 expression on
normal (white area) and CVID type A (gray area) B cells. (C)
shows the CD86 mRNA expression profile of B cells as
revealed by CD86-specific PCR in the presence and
absence of stimulating IgM-specific antibodies.
We then analyzed if the reduced CD86 surface expression was correlated to changes in the transcription of the
CD86 gene using a quantitative PCR assay specific for
CD86 mRNA and a healthy control sample to calibrate
the test. Functional activation was proven phenotypically
by CD69 surface expression. As shown in Fig. 2 C, CD86
transcription in B cells from three CVID type A patients
(JMN, MFT, MMR) remained silent upon stimulation and
even decreased (23–35 %) in comparison to unstimul-
In conclusion, our experiments show that B lymphocytes
from CVID type A patients are partially unresponsive to
BCR-derived signals since they show no or only partial
induction of CD86 and CDw137 expression. The defect
seems to be specific for B lymphocytes as normal CD86
expression was found on monocytes and EBVtransformed B cells of type A patients. Since these B
cells retain a normal expression pattern for the early activation marker CD69 and the down-regulation of CD62L,
they phenotypically resemble anergic B lymphocytes as
found in a transgenic mouse model for B cell tolerance
developed by Goodnow et al. [36]. In this model, anergic
B cells expressing transgenic hen egg lysozyme (HEL)specific IgM/D are present at normal numbers and carry
all developmentally regulated surface markers. However,
these lymphocytes are desensitized to activating signals
by continuous exposure to soluble HEL since they fail to
up-regulate CD86 expression and to mount HEL-specific
antibody responses upon BCR cross-linking [37, 38].
Moreover, during cognate T-B cell interactions antigenspecific T cells are incompletely activated [39] and B
cells may be killed by CD95-induced apoptosis [38, 40].
Incomplete activation of antigen-specific CD4+ T cells
has been shown to lead to insufficient IL-2 production
and unstable CD40L expression, two key findings in
CVID supporting the hypothesis of CVID being a primary
Th cell deficiency [8, 12]. However, recent evidence suggests that if naive CD4+ T cells do not encounter antigen
on cognate B cells in conjunction with co-stimulatory
signals via CD28/CD86, they fail to secrete sufficient
amounts of IL-2 and they remain unable to properly costimulate B cells via CD40L [41, 42]. The CD86 knockout
mice (but not the CD80-deficient mice) provide evidence
along the same line as these animals are severely hypo-
1074
A. Denz et al.
gammaglobulinemic with impaired germinal center formation and abolished T-dependent specific antibody
responses [31]. Thus, effective stimulation of naive Th
cells not only depends on CD86 co-stimulation, it also
paves the way for cognate B cell activation with class
switching and somatic IgV gene hypermutation, a process which was shown to be impaired in some CVID
patients who may belong to subgroup A [43]. The phenotypic and functional similarities between B cells of CVID
type A patients and CD86-deficient or anergic B cells in
mice are so striking that CD86 regulatory defects may
represent a model for the immunoregulatory abnormalities in CVID type A.
In an earlier report Eisenstein et al. [14] came to a similar
conclusion, showing that functional B cell deficiency can
be partially reversed by prestimulation and prolonged
culture with anti-CD40 and IL-10. Unfortunately, in that
study CVID patients were not classified into groups A
to C, therefore it remained unclear whether anergy was
confined to B cells of type A patients. Our results clearly
show that B cell unresponsiveness is confined to CVID
type A patients, suggesting that type B and C patients
may suffer from other defects.
At present, the mechanism underlying the highly anergic
phenotype of peripheral B cells in subgroup A of CVID
patients is unknown. Any explanation has to take into
account that the onset of the disease is from the first to
fourth decade of life and that immune reactivity was previously intact. Chronically present soluble proteins with
broad BCR specificity like viral or bacterial superantigens may be candidates for anergy-inducing agents.
Alternatively, a B cell-tropic virus may interfere with signal transduction. However, it has to be noted that there is
no evidence for viral infections based on the determination of IFN type I-induced MxA protein levels [44]. Furthermore, there was no increase in circulating EBVinfected B cells in three CVID patients (G. Bauer, Freiburg, personal communication). A third hypothetical
cause of impaired B cell function is an acquired stem cell
mutation affecting a signaling component, analogous
to the situation found for glycosylphosphatidylinositol
anchor deficiency in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria [45]. Studies on the underlying B cell defect are currently in progress, focussing particularly on memory B
cell development, the role of CD27/CD70 ligation and on
defects of IgV hypermutation in CVID.
Eur. J. Immunol. 2000. 30: 1069–1077
4 Materials and methods
4.1 Patients and healthy donors
Twenty patients with well-documented CVID according to
the diagnostic criteria of the WHO expert group for primary
immunodeficiencies [1] were included in the study. Patients’
and controls’ characteristics, their B cell phenotypes and in
vitro responses to SAC+IL-2 and PWM are summarized in
Table 1. Patients were classified according to Bryant et al. [2]
into types A to C. All patients were receiving regular i. v.
gammaglobulin replacement therapy (Sandoglobin or Polyglobulin; 300 mg/kg) at 4–6 week intervals and were free of
any serious infections when tested. There were no familial
cases of CVID included in this study and none of the
patients had proven granulomatous disease characteristic
for a subgroup of CVID with progressive T cell deficiency
and a certain TNF- § polymorphism [46]. Ten healthy donors
were included as controls. Informed consent was obtained
from all subjects before entry into the study.
4.2 Antibodies
mAb to the following human surface molecules were used in
this study: PerCP-conjugated CD3, PE-conjugated CD69
and -CD80 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems,
San Jose, CA), CD21, CD23, CD54 and CD86 (all PEconjugated; Pharmingen, San Diego, CA), PE-conjugated
CD22 and FITC-conjugated CD19 (Dako, Glostrup, Denmark), and allophycocyanin-conjugated (Caltag Laboratories, Burlingame, CA). Goat IgG F(ab)2 antibodies to human
IgM were purchased from ICN Biomedicals (Eschwege, Germany), Dynabeads M450 pan-B (CD19) and DetachaBeads
from Dynal (Oslo, Norway), goat-anti-mouse-IgG from Dianova, anti-CD40 and FITC-conjugated CD62L from Immunotech (Marseille Cedex, France). Unlabeled anti-CDw137
antibody (clone M131) was a kind gift of Immunex Co.,
Extramural Research (Seattle, WA). Isotype control antibody
for CDw137 was MOPC21 (Sigma, Deisenhofen, Germany);
as the second step reagent FITC-conjugated goat antimouse IgG (Southern Biotech, Biozol, Elching, Germany)
was used.
4.3 Cells
Cells were grown in RPMI 1640 medium without phenol red
(Biochrom KG, Berlin, Germany) supplemented with heatinactivated FCS from PANBiotech (Aidenbach, Germany),
penicillin, streptomycin and L-glutamine (Biochrom KG, Berlin, Germany).
Blood samples were collected just before i. v. IgG replacement therapy. PBMC were isolated from defibrinated blood
by Ficoll-Hypaque (Biochrom KG, Berlin, Germany) density
gradient centrifugation and washed two times in culture medium (RPMI1640 supplemented with 10 % FCS,
Eur. J. Immunol. 2000. 30: 1069–1077
100 U/ml penicillin, 100 ? g/ml streptomycin and 2 mM
L-glutamine). Subsequently, the cells were adjusted to a
concentration of 5 × 106 /ml in culture medium. All cell cultures were performed at 37 °C in a humidified atmosphere
containing 5 % CO2.
B cells were purified from PBMC by positive selection using
anti-CD19 mAb-coated immunomagnetic beads (Dynal,
Hamburg, Germany) by incubation at 4 °C for 30 min; B cells
were released from the beads by treatment (at 23 °C for
30 min) with DetachaBeads (Dynal). By this separation
method B cell purity was G 99 %.
For B cell stimulation, PBMC (1 × 106 cells/ml) or purified B
cells (1 × 106 cells/ml) were cultured for 20 h and 44 h in culture medium plus 20 U/ml IL-2 (Biotest, Dreieich, Germany)
and 10 ng/ml IL-10 (Pharmingen, San Diego, CA) with or
without goat anti-IgM IgG F(ab)2 at 12.5 ? g/ml (ICN Biomedicals, Eschwege, Germany) in 24-well plates (Greiner, Frickenhausen, Germany). For staining of CDw137 (ILA) cells
were stimulated for 20 h with anti-IgM without cytokine supplementation. For some experiments culture wells had been
precoated with goat anti-mouse IgG F(ab)2 fragments (Dianova, Hamburg, Germany) and subsequently with mAb to
CD40 (Immunotech, Marseille, France).
For in vitro Ig synthesis, PBMC (1 × 106 /ml) were stimulated
with SAC (Calbiochem, La Jolla, CA) diluted to 1 : 10 000 plus
20 U/ml IL-2 or PWM (Gibco, Eggenstein, Germany) diluted
to 1 : 200, 1 : 400 and 1 : 800. Supernatants were collected
after 9 days and stored at − 20 °C until assayed for IgG and
IgM by ELISA [47].
Impaired up-regulation of CD86 in CVID
1075
Quantification of CD86 mRNA was done using the ABI
PRISM 7700 sequence detection system® (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany). CD86-specific oligonucleotides and a fluorescent probe were developed using the
PrimerExpress software (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany); forward primer: 5’-CTG ACA AGA CGC
GGC TTT TAT C-3’; reverse primer: 5’-TC ATT GTG TTG GTT
CCA CAT TT-3’; 6’-carboxy-fluorescein (FAM)-labeled
probe: FAM---5’-ACC TTT CTC TAT AGA GCT TGA GGA
CCC TCA GCC-3’. PCR conditions were: 2 min 50 °C;
10 min 95 °C; 15 s 95 °C, 1 min 60 °C.
Optimal primer concentrations were developed performing a
primer matrix PCR reaction. Optimized concentrations for
both primers were 300 nM. Quantification was done using
the ¿ CT values. Samples of healthy donor UDZ was used to
calibrate the relative values for the patient probes.
4.6 Statistical analysis
Statistical comparisons were made using an unpaired Student’s t-test to compare different groups of study subjects,
and a paired Student’s test to compare the results from the
same subjects. Differences between groups were considered significant at a p value X 0.05.
Acknowledgements: The excellent technical assistance of
Ruth Dräger is highly appreciated. This work was supported
in part by the Forschungsschwerpunktprogram BadenWürttemberg.
References
4.4 Flow cytometry
Phenotyping of native and stimulated PBMC samples
was performed by staining with FITC-, PE-, PerCP- or
allophycocyanin-conjugated mAb and four-color flow
cytometry (FACSCaliburTM, Becton Dickinson), gating on viable lymphocytes as defined by a forward vs. side scatter
gate and exclusion staining of dead cells with 1 ? g/ml propidium iodide. Data were further analyzed in dot plots and histogram plots using CellQuest® software (Becton Dickinson).
4.5 Quantification of CD86 mRNA
Purified B cells were stimulated with anti-IgM plus IL-2 and
IL-10 for 15 h. Total RNA was prepared using the Rneasy®
Min Kit from Qiagen GmbH (Hilden, Germany) according to
manufacturer’s protocol. cDNA synthesis was performed
with the TaqMan® Gold reverse transcription (RT)-PCR
reagents using random hexamers for 45 min at 48 °C.
Reactions were terminated incubating the samples for
5 min at 95 °C. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GADPH) was used to quantitate cDNA contents using
the TaqMan® GADPH control reagents (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany).
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Correspondence: Hans-Hartmut Peter, Division of Rheumatology and Clinical Immunology, Department of Internal
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D-79106 Freiburg, Germany
Fax: +49-761-270-3446
e-mail: peter — mm61.ukl.uni-freiburg.de
CLINICAL OBSERVATIONS, INTERVENTIONS, AND THERAPEUTIC TRIALS
Severe deficiency of switched memory B cells (CD27⫹IgM⫺IgD⫺) in subgroups
of patients with common variable immunodeficiency: a new approach to
classify a heterogeneous disease
Klaus Warnatz, Axel Denz, Ruth Dräger, Moritz Braun, Christoph Groth, Guido Wolff-Vorbeck, Hermann Eibel,
Michael Schlesier, and Hans Hartmut Peter
Hypogammaglobulinemia is the hallmark
of common variable immunodeficiency
(CVID) syndrome, a heterogeneous disorder predisposing patients to recurrent
bacterial infections. In this study, we investigated the peripheral B-cell compartment of
30 well-characterized CVID patients in comparison to 22 healthy controls. Flow cytometric analysis of peripheral blood lymphocytes revealed a reduction of classswitched CD27ⴙIgMⴚIgDⴚ memory B cells
below 0.4% in 77% of our patients (group
I), while this B-cell subpopulation exceeded 0.5% in all healthy donors and in
23% of CVID patients (group II). These
results correlate well with the capacity of
peripheral blood lymphocytes to produce
immunoglobulins in vitro upon stimulation with Staphylococcus aureus Cowan I
(SAC) plus interleukin-2 because the production of immunoglobulin G in vitro is entirely
dependent on the presence of switched
memory B cells. The subdivision of group I
into patients with an increased proportion of
CD21ⴚ peripheral B cells (> 20%; group Ia)
and patients with normal percentages of
CD21ⴚ B cells (< 20%; group Ib) revealed a
significant clustering of patients with splenomegaly and autoimmune cytopenias in
group Ia. Based on these observations, we
propose a fast and reliable new classification for CVID patients by flow cytometric
quantification of class-switched memory
and immature B cells in the peripheral blood
of patients. Our results point toward defects
at various stages of B-cell differentiation in
CVID subgroups and support the value of a
B-cell–oriented classification principle. A
consensus on this new classification system will hopefully provide a tool for rapidly
defining homogeneous subgroups of CVID
for functional studies and genetic linkage
analysis. (Blood. 2002;99:1544-1551)
© 2002 by The American Society of Hematology
Introduction
Common variable immunodeficiency (CVID) comprises a heterogeneous group of humoral immunodeficiencies of unknown etiology, with a prevalence of about 1 in 50 000. It is characterized by
reduced serum levels of all switched immunoglobulin (Ig) isotypes
(IgG, IgA, IgE), predisposing patients to frequent infections of the
respiratory tract with encapsulated bacteria. Splenomegaly as well
as malignancies and autoimmune phenomena may develop in 20%
to 30% of the patients.1 Multiple etiologies are likely to result in
this common clinical phenotype. Depending on the patients
analyzed, primary T-cell defects,2-4 an exaggerated T-cell suppression,5 and primary B-cell defects,6-8 all leading to a complex failure
of T- and B-cell cooperation, have been reported.
Therefore, a classification of the patients is of primary importance to acknowledge the heterogeneity of the disease. About 80%
of all CVID cases display normal T- and B-cell numbers in their
peripheral blood. They have been functionally classified by Bryant
et al9 according to their capacity to produce IgM, IgA, and IgG in
vitro upon stimulation with Staphylococcus aureus Cowan I (SAC)
plus interleukin-2 (IL-2) or anti-IgM plus IL-2 (see “Patients,
materials, and methods”). Peripheral blood lymphocytes (PBLs) of
patients in group A fail to produce any Ig isotype in vitro, while
group B patients produce IgM only and group C patients are
indistinguishable from healthy controls in producing normal
amounts of all isotypes in vitro despite low serum Ig levels in vivo.
A minority of CVID patients (5%-10%) have strikingly low
peripheral B-cell counts (⬍ 1% of PBLs), suggesting defects at the
early B-cell differentiation stages in bone marrow.10 Another
subtype (5%-10%) exhibits noncaseating, sarcoidlike granulomas
in different organs and tends to additionally develop a progressive
T-cell deficiency.11,12 In our studies we included only CVID
patients with normal B-cell counts (⬎ 1% of PBLs) and without
evidence of granulomatous disease.
The recent observation13 that X-linked hyper-IgM syndrome
patients are lacking CD27⫹IgD⫺IgM⫺ memory B cells led us to
examine this compartment in CVID. Mature class-switched
CD27⫹IgD⫺IgM⫺ memory B cells were profoundly diminished or
absent in all CVID patients of group A and almost all of group B. In
contrast, CVID patients of group C were almost indistinguishable
from healthy controls. Based on this finding we suggest a new, fast,
and reliable fluorescence-activated cell sorting (FACS)–based
classification defining 2 groups: CVID group I comprises patients
with switched memory B cells below 0.4% of total PBLs, and
CVID group II includes all patients with normal numbers of
switched memory B cells (⬎ 0.4%). Group I can be subdivided
according to increased (Ia) or normal (Ib) numbers of CD19⫹CD21⫺
immature B cells. This classification not only shows a good
From the Division of Rheumatology and Clinical Immunology, Department of
Medicine, and from the Department of Surgery, University Hospital of Freiburg,
Germany.
Reprints: H. H. Peter, Div of Rheumatology and Clinical Immunology,
Hugstetter-Strasse 55, 79106 Freiburg, University Hospital of Freiburg,
Germany; e-mail: [email protected].
Submitted July 18, 2001; accepted October 19, 2001.
Supported by the Landesstiftung Baden Wuerttemberg. C.G. is a recipient of
an award of the Hans-Hench Stiftung.
1544
The publication costs of this article were defrayed in part by page charge
payment. Therefore, and solely to indicate this fact, this article is hereby
marked ‘‘advertisement’’ in accordance with 18 U.S.C. section 1734.
© 2002 by The American Society of Hematology
BLOOD, 1 MARCH 2002 䡠 VOLUME 99, NUMBER 5
BLOOD, 1 MARCH 2002 䡠 VOLUME 99, NUMBER 5
CLASSIFICATION OF CVID
correlation with the previous, more laborious functional classification of Bryant et al,9 but it also associates clinical features
like splenomegaly and autoimmune cytopenia preferentially with
group Ia.
1545
analysis (CellQuest, Becton Dickinson) was performed by forward versus
side-scatter gating on viable lymphocytes (PBLs) in combination with
gating on CD19⫹ cells.
Ig synthesis in vitro
Patients, materials, and methods
Patients and controls
All patients were diagnosed as having CVID based on typical medical
history of recurrent bacterial infections associated with hypogammaglobulinemia (serum IgG ⬍ 3.0 g/L, IgA ⬍ 0.5 g/L). Other diseases causing
hypogammaglobulinemia such as myeloma, non-Hodgkin lymphoma,
exudative gastroenteropathy, nephrotic syndrome, chronic immunosuppression, or catabolic states due to malnutrition were excluded. Our group of 38
CVID patients included 2 with sarcoidlike granulomas and 6 with low
peripheral B-cell counts (⬍ 1% CD19⫹ cells of PBLs) who were not
subjected to detailed B-cell phenotyping. All patients were on regular
intravenous IgG substitution (15-20 g IgG) every 4 to 7 weeks. Most
patients were hyporeactive (usually one positive reaction to tetanus toxoid)
or anergic in delayed-type skin tests (Multitest Immignost, Biosyn,
Fellbach, Germany) but responded normally to mitogens (phytohemagglutinin, concanavalin A, pokeweed) and antigens (tetanus toxoid, purified
protein derivative) in lymphoproliferative tests (results not shown). Table 1
summarizes patients’ age, onset of disease, sex, percentage of peripheral B
cells, and their classification according to Bryant et al.9
Cell preparation
After informed consent was obtained, 20 to 30 mL of blood anticoagulated
with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) was drawn from CVID
patients and age-matched healthy controls. Blood samples from CVID
patients were always taken prior to intravenous Ig substitution. The fraction
of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) was isolated by FicollHypaque density gradient centrifugation (Biochrom, Berlin, Germany) and
washed twice with phosphate-buffered saline. PBMCs were centrifuged
through a layer of 100% heat-inactivated fetal calf serum (PANBiotech,
Aidenbach, Germany) to reduce cell-bound IgG and resuspended in RPMI
1640 (Biochrom) supplemented with 10% fetal calf serum.
Antibodies and flow cytometry
PBMCs (2.5 ⫻ 105/50 ␮L RPMI 1640 plus 10% fetal calf serum) were
stained for 20⬘ at 4°C with 10 ␮L of a mixture of the following antibodies at
optimal concentrations: CD27–fluorescein isothiocyanate (FITC) (Dako,
Glostrup, Denmark) or CD21-FITC (Coulter-Immunotech, Hamburg, Germany), anti-IgD–phycoerythrin (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL), CD19-PC5 (Coulter-Immunotech), and anti-IgM–Cy5
(Dianova, Hamburg, Germany). Four-color data acquisition was performed
with a FACSCalibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Data
For in vitro Ig synthesis, 5 ⫻ 105 PBMCs were stimulated for 8 days with
the T-cell–independent stimulus SAC (Calbiochem, La Jolla, CA) diluted to
1:10 000 plus 20 U/mL IL-2. Cultures were set up in 500 ␮L RPMI 1640
medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum, penicillin, streptomycin, and L-glutamine (Biochrom). Control cultures were kept
in medium without B-cell stimulants. Supernatants were collected after 8
days and stored at ⫺20°C until assayed for IgG, IgA, and IgM content by
enzyme-linked immunosorbent assay.6 In this study we only report IgG and
IgM concentrations and omitted IgA because it paralleled IgG and provided
no additional information. Results are expressed as nanograms per milliliter
of Ig isotype produced in stimulated cultures minus control cultures. Based
on the results of the Ig synthesis following SAC plus IL-2 stimulation in
vitro, CVID patients were assigned into one of the 3 subgroups defined by
Bryant et al9 (Table 1): group A, no significant synthesis of IgM (⬍ 500
ng/mL) or IgG (⬍ 500 ng/mL); group B, significant synthesis of IgM
(⬎ 4000 ng/mL) but not of IgG (⬍ 500 ng/mL); and group C, normal
synthesis of IgM (⬎ 4000 ng/mL) and IgG (⬎ 500 ng/mL).
Sorting of CD19ⴙCD27ⴚIgGⴚ naive B cells
After isolation of CD19⫹ B cells (purity ⬎ 95%) by magnetic beads
(DETACHaBEADs, Dynal, Hamburg, Germany), cells were stained for
IgG (goat-F(ab⬘)2 anti-IgG–phycoerythrin, Southern Biotechnology Associates) and CD27 (CD27-FITC, Dako). Then 5 to 10 ⫻ 106 CD19⫹ B cells
were sorted on a FACStar Plus (Becton Dickinson) into CD27⫺IgG⫺ naive
B cells and CD27⫹IgG⫺IgM⫹ memory B cells. Purified B cells or B-cell
subpopulations were cultured at 1 ⫻ 105/200 ␮L in U-shaped microtiter
plates and stimulated with SAC plus IL-2 (20 U/mL). Parallel 0.5 ⫻ 105 B
cells were cocultured with 2 ⫻ 105 CD4⫹ T cells in flat-bottomed microtiter
plates. CD4⫹ T cells had been positively selected by DETACHaBEADs
(Dynal) and depleted of contaminating monocytes by incubation (20⬘, 4°C)
with anti-CD14 and anti-CD16 monoclonal antibodies (Coulter-Immunotech) and subsequent treatment with immunomagnetic beads coated with
antimouse IgG (Dynal). The purity of CD4⫹ T cells was more than 99%.
Supernatants of B-cell cultures were collected after 8 days and stored at
⫺20°C until assayed for Ig isotypes by enzyme-linked immunosorbent assay.
Statistical analysis
Statistical comparisons of numeric data were made using an unpaired
Student t test. Classified data were evaluated by the ␹2 or Fisher exact test.
Differences between groups were considered significant at P ⬍ .05.
Table 1. Characterization of CVID patients and healthy donors
Group
No. of patients
Age, y
Age at onset, y
Sex
M/F
% peripheral B cells
IgM in vitro,
ng/mL
IgG in vitro,
ng/mL
A
6
39.7 ⫾ 18.9
35.0 ⫾ 20.7
4:2
6.1 ⫾ 3.8
110 ⫾ 130
0
B
19
42.7 ⫾ 16.2
32.4 ⫾ 12.9
11:8
7.8 ⫾ 4.6
⬎ 4000*
160 ⫾ 200
C
5
44.4 ⫾ 8.7
34.5 ⫾ 8.6
2:3
10.8 ⫾ 3.9
⬎ 7500
⬎ 1500
Low B cells
6
39.7 ⫾ 8.5
28.1 ⫾ 5.1
5:1
0.4 ⫾ 0.4
20 ⫾ 25
35 ⫾ 42
2
28 ⫾ 4
24 ⫾ 4
2:0
12.5 ⫾ 10.5
⬎ 7500
190 ⫾ 100
22
32.4 ⫾ 7.6
NA
12:10
7.7 ⫾ 2.7
⬎ 7500
⬎ 1200†
Sarcoidlike
HD
Patients are characterized according to Bryant et al9 into subgroups A, B, and C and are compared with healthy donors (HD). Age, onset of disease, sex, percentage of
peripheral B-cell count (as percentage of PBLs), and IgM and IgG in vitro production after SAC plus IL-2 stimulation are given. There was no statistically significant difference in
age, age of onset, sex distribution, and percentage of peripheral B cells between the different subgroups of CVID patients.
CVID patients with low B-cell counts (⬍ 1%) and sarcoidlike lesions were not included in further studies.
NA indicates not applicable.
*Twelve of 19 produced more than 7500 ng/mL IgM.
†Most healthy donors produced more than 1500 ng/mL IgG.
1546
WARNATZ et al
BLOOD, 1 MARCH 2002 䡠 VOLUME 99, NUMBER 5
Results
Decrease of class-switched CD27ⴙIgMⴚIgDⴚ B cells in CVID
group A and B patients
We examined B-cell subpopulations in the blood of 22 healthy
donors and 30 CVID patients previously classified into groups A
(n ⫽ 6), B (n ⫽ 19), and C (n ⫽ 5) (Table 1). The analysis revealed
a severe decrease of CD27⫹ memory B cells in 77% of those CVID
patients who had normal B-cell counts and no sarcoidlike lesions.
When analyzed separately according to the classification of Bryant
et al,9 CD27⫹ B cells were severely depleted in group A and B
samples (1.1% ⫾ 0.7%, P ⬍ .001, and 1.7% ⫾ 1.7%, P ⫽ .006,
respectively) while group C samples (4.1% ⫾ 1.6%, P ⫽ .3)
showed no significant differences to healthy controls
(3.2% ⫾ 1.5%).
A recent report of Rajewski’s group14 demonstrated a substantial number of non–class-switched CD27⫹IgD⫹IgM⫹ memory B
cells in the peripheral blood of humans. When dissecting the B-cell
compartment according to surface Ig and CD27 expression, PBLs
of healthy donors comprised 4.3% ⫾ 1.6% naive B cells
(CD27⫺IgM⫹IgD⫹), 1.6% ⫾ 1.1% non–class-switched memory B
cells (CD27⫹IgM⫹IgD⫹), less than 0.2% “IgM only” memory B
cells (CD27⫹IgM⫹IgD⫺), and 1.6% ⫾ 0.6% class-switched memory
B cells (CD27⫹IgM⫺IgD⫺). We could not detect a significant
decrease in the non–class-switched compartment of group A or B
patients (1.0% ⫾ 0.7%, P ⫽ .11, and 1.5% ⫾ 1.5%, P ⫽ .79, data
not shown), but both groups lack significant numbers of classswitched memory B cells (0.1% ⫾ 0.1%, P ⬍ .0001, and
0.2% ⫾ 0.2%, P ⬍ .0001, respectively) (Figures 1 and 2). The
fraction of IgM⫹IgD⫺ memory B cells was equally low and not
significantly different in CVID and healthy controls (⬍ 0.2% of
PBLs). The analysis of group C samples showed a slight decrease
of class-switched memory B cells (1.0% ⫾ 0.4%, P ⬍ .04) (Figures 1 and 2) and an insignificant increase in non–class-switched
memory B cells (3.2% ⫾ 1.8%, P ⫽ .15, data not shown).
Figure 2. Profound decrease of switched memory B cells in CVID patients of
subgroups A and B. PBMCs were stained for the expression of CD19, CD27, IgM,
and IgD, as shown in Figure 1. CVID patients are assigned to groups A-C according
to the classification by Bryant et al9 and are compared with healthy controls (HD).
Rhombus symbols represent the percentage of switched memory B cells
(CD27⫹IgM⫺IgD⫺) for each patient or healthy donor. Statistical analysis was
performed by the Student t test, and P values are given.
Good correlation between the frequency of CD27ⴙIgMⴚIgDⴚ
switched memory B cells in peripheral blood and IgG
synthesis in vitro
The reduced size of memory B-cell populations in the subgroups of
CVID patients producing little or no Ig in vitro suggests a
correlation between the production of Ig isotypes in vitro and the
size of memory B-cell subpopulations in vivo. While we were
unable to determine a clear-cut correlation between IgM production in vitro and the IgM memory B-cell pool (see below), we
found a significant dependence of IgG production in vitro on the
frequency of switched memory B cells (CD27⫹IgM⫺IgD⫺) in the
peripheral blood (r ⫽ 0.81, Figure 3). This correlation was independent of whether the cells were derived from CVID patients or
healthy donors, suggesting a normal intrinsic function of classswitched memory B cells in CVID patients of group C.
Isolated naive B cells of healthy donors do not produce IgM
or IgG in vitro after SAC plus IL-2 stimulation
Because more than 90% of B cells from group A CVID patients
express a naive CD27⫺ phenotype, we analyzed for more adequate
Figure 1. Phenotypes of peripheral B cells of CVID patients. PBMCs were stained
for the expression of CD19, CD27, IgM, and IgD and analyzed by FACS. Analysis was
performed by gating on CD19⫹ cells, and dead cells were excluded by forward/side
scatter gating. Representative examples of each CVID subgroup (A-C) according to
the classification by Bryant et al9 as well as one healthy control (HD) are given.
Indicated values represent percentages of gated CD19⫹ B cells. See “Patients,
materials, and methods.”
Figure 3. Good correlation between percentage of switched memory B cells in
peripheral blood and IgG synthesis in vitro. The percentage of switched memory
B cells (CD27⫹IgM⫺IgD⫺) in the peripheral blood and IgG production after SAC and
IL-2 stimulation in vitro show a significant correlation (r ⫽ 0.81) when analyzed by
linear regression. Healthy controls as well as CVID patients are included in this plot.
BLOOD, 1 MARCH 2002 䡠 VOLUME 99, NUMBER 5
CLASSIFICATION OF CVID
1547
Table 2. IgM production in vitro by naive (CD27ⴚ) and IgM memory (CD27ⴙ) B cells of healthy donors
CD19⫹ B cells
CD4⫹ T
cells*
Stimulus
IL-2
None
SAC plus IL-2
None
⫹
IL-2
⫹
SAC plus IL-2
CD19⫹
CD27⫺IgG⫺ B cells
CD27⫹IgG⫺ B cells
IgM,
ng/mL
IgG,
ng/mL
IgM,
ng/mL
IgG,
ng/mL
IgM,
ng/mL
IgG,
ng/mL
0
145
0
0
0
0
0
62
0
0
953
0
0
0
0
0
251
0
628
⬎ 1500
0
0
⬎ 7500
69
⬎ 7500
1461
0
0
⬎ 7500
43
3392
1624
0
0
⬎ 7500
0
652
963
0
0
1005
0
146
823
331
0
0
⬎ 7500
3193
1691
25
55
⬎ 7500
183
⬎ 7500
⬎ 1500
⬎ 7500
0
⬎ 7500
127
228
⬎ 7500
⬎ 1500
2684
0
⬎ 7500
⬎ 7500
⬎ 1500
3441
0
⬎ 7500
(CD27⫺IgG⫺)
99
(CD27⫹IgG⫺)
(CD19⫹
After isolation of
B cells of 3 healthy donors, naive
as well as IgM memory
cells were sorted by FACS. Purified B cells
B cells)
or B-cell subpopulations (CD27⫺ or CD27⫹IgG⫺ B cells) were then stimulated with IL-2 or SAC plus IL-2. IgG and IgM concentrations in 8-day culture supernatants are given in
nanograms per milliliter. While naive B cells produce IgM only in the presence of SAC plus IL-2 and CD4⫹ T cells, IgM secretion by IgM memory B cells is sufficiently activated
by either stimulus alone. There was no class switch in vitro detectable in either subpopulation under the applied conditions.
*In the presence (⫹) or absence (None) of CD4⫹ T cells according to the protocol. For details, see “Patients, materials, and methods.”
comparison the capacity of naive B cells of healthy donors to
produce Ig in vitro after stimulation with SAC plus IL-2. Highly
purified CD19⫹CD27⫺IgG⫺ B cells were stimulated for 8 days
with SAC plus IL-2 in the presence or absence of autologous CD4⫹
T cells. In supernatants of T-cell–free cultures, no traces of Igs were
detectable, indicating that SAC plus IL-2 is unable to induce Ig
synthesis in isolated CD27⫺IgM⫹IgD⫹ naive B cells (Table 2).
However, in the presence of autologous CD4⫹ T cells, naive,
mature B cells produced large amounts of IgM, but no class switch
to IgG was observed (Table 2). Therefore, the Ig synthesis pattern
in vitro of mature CD27⫺IgM⫹IgD⫹ normal B cells closely
resembles that of PBLs of CVID group B patients. Cultures set up
with highly purified CD27⫹IgM⫹IgD⫹ memory B cells of healthy
donors produced large amounts of IgM even in the absence of T
cells (Table 2). They, however, failed also to produce significant
levels of IgG, confirming the previous finding that SAC plus IL-2 is
not sufficient to induce class switch in vitro.15 The data presented in
Table 2 also explain why in cultures of PBLs stimulated with SAC
plus IL-2 it is impossible to correlate IgM production in vitro to the
IgM memory B-cell pool: In the presence of CD4⫹ T cells, both
CD27⫺IgM⫹ naive B cells and CD27⫹IgM⫹ memory B cells are
induced to IgM production.
type A patient with 10% B cells in the original PBL fraction (Table
3, patient no. 3) showed normal IgM production in vitro when
0.5 ⫻ 105/200 ␮L isolated B cells were cocultured with 2 ⫻ 105/
200 ␮L autologous CD4⫹ T cells, but when 2 ⫻ 105 PBLs were
added to the isolated B cells the IgM production subsided again.
This suggests suppression by a population other than B cells and
CD4⫹ T cells. Similar observations have previously been reported.16 Moreover, in a recent study of our group using the “Zubler
system” to maximally stimulate B cells17 and the enzyme-linked
immunospot assay technique as the read-out system, all type A
patients produced IgM spots but no or very few IgG spots.18 In
accordance with these and previous data,19 we found a normal,
spontaneous IgM synthesis by 23 of 23 CVID-derived Epstein-Barr
virus lines (data not shown). Taken together, all these findings
Table 3. Dependence of IgM production on culture condition
Cell population
No. of incubated
B cells per well
IgM,
ng/mL
IgG,
ng/mL
IgA,
ng/mL
Patient no. 1 (CVID group B)
PBMCs
CD19⫹ B cells alone
CD19⫹ B cells plus CD4⫹ T cells
30 000
⬎ 7 500
170
0
100 000
0
0
0
50 000
⬎ 7 500
40
0
Patient no. 2 (CVID group A)
IgM production of CVID group A patients in vitro is dependent
on culture conditions
al9
We have applied the CVID classification of Bryant et
over the
last 10 years in our clinic and found that patients usually stayed in
the same group when tested on repeated occasions. However, in 2
patients repeatedly classified as type A, a reversion to type B could
be observed. Interestingly, we have never observed the opposite—
that is, progression from type B to A. To clarify the validity of a
negative IgM production in vitro we studied in a more systematic
approach the influence of culture conditions on the outcome of Ig
synthesis in vitro of CVID group A patients. We therefore
coincubated 0.5 ⫻ 105/200 ␮L purified B cells and 2 ⫻ 105/200 ␮L
autologous CD4⫹ T cells. In one patient (Table 3, patient no. 2), this
increase of B-cell numbers in the culture normalized the IgM
production, suggesting that a low B-cell frequency of 1.5% (7500 B
cells/200 ␮L of culture) in the original PBL preparation might have
been a cause for the “defective” IgM production in vitro. Another
PBMCs
CD19⫹ B cells alone
CD19⫹ B cells plus CD4⫹ T cells
7 500
0
0
0
100 000
0
0
0
50 000
⬎ 7 500
110
0
Patient no. 3 (CVID group A)
PBMCs
60 000
0
0
0
100 000
0
0
0
CD19⫹ B cells plus CD4⫹ T cells
50 000
⬎ 7 500
290
80
CD19⫹ B cells plus CD19⫺ PBMCs
50 000
0
0
0
CD19⫹ B cells alone
Ig production was measured either after incubation of PBMCs (5 ⫻
cells/500
␮L), isolated CD19⫹ B cells alone (0.5 ⫻ 105 cells/200 ␮L), or in coculture with 2 ⫻
5
⫹
5
⫺
10 CD4 T cells or 2 ⫻ 10 CD19-depleted PBMCs (CD19 PBMCs) for 8 days. The
results are presented for patient no. 1 (CVID group B according to Bryant et al9) and
patient no. 2 and patient no. 3 (both CVID group A). See Table 2 for comparison with
healthy donors and “Patients, materials, and methods” for further details. The
numbers of B cells incubated per test are recorded in the second column. In patient
no. 2, the low peripheral B-cell number is likely to be the main reason for failure of a
detectable IgM production. It normalized after increasing the number of incubated B
cells. PBMCs of patient no. 3, however, contained a sufficient number of B cells, but
IgM production was only detectable after cocultivation of purified CD4⫹ T cells and
CD19⫹ B cells. The missing IgM production after adding CD19-depleted PBMCs to
isolated B cells suggests a suppressive effect of the remaining populations.
105
1548
BLOOD, 1 MARCH 2002 䡠 VOLUME 99, NUMBER 5
WARNATZ et al
Table 4. New classification of CVID
CD19⫹
B cells,
% of PBLs
CD27⫺
IgM/D⫹,
% of PBLs
CD27⫹IgM/D⫹,
% of PBLs
CD27⫹IgM/D⫺,
% of PBLs
CD21⫺,
% of B
cells
Bryant
classification
Splenomegaly
Autoimmunity*
CVID
Subgroup
No. of
patients
Group I
a
10
4.9 ⫾ 2.6‡
3.5 ⫾ 1.8
1.2 ⫾ 0.9
0.1 ⫾ 0.1§
44.7 ⫾ 11.0§
A/B
10/10 (100%)
6/10
Neg.
b
13
7.8 ⫾ 3.6
6.5 ⫾ 3.2㛳
0.9 ⫾ 0.4‡
0.1 ⫾ 0.1§
9.9 ⫾ 5.7
A/B
5/12 (42%)
6/13
Interm.
7
12.6 ⫾ 4.7㛳
7.6 ⫾ 4.3
3.8 ⫾ 1.9㛳
0.9 ⫾ 0.4¶
12.6 ⫾ 9.0#
C
3/7
Pos.
22
7.7 ⫾ 2.7
4.3 ⫾ 1.6
1.6 ⫾ 1.1
1.6 ⫾ 0.6
7.0 ⫾ 2.7
NA
NA
NA
Group II
HD
1/7 (14%)#
NA
Vaccination†
The new classification includes only CVID patients with peripheral B-cell numbers above 1% of PBLs. PBLs of group I CVID patients comprise less than 0.4% of
class-switched memory B cells (CD27⫹IgM⫺IgD⫺), while in group II, like healthy donors (HD), this population accounts for more than 0.4%. Group I is further subdivided by the
percentage of immature CD21⫺ B cells into subgroups Ia (more than 20%) and Ib (less than 20%). All former group A and B patients according to the classification by Bryant et
al9 fall into group I, except 2 former group B patients who fall into group II. All values are given as mean ⫾ SE.
NA indicates not applicable.
*There is a significant clustering of splenomegaly and autoimmune cytopenia in group Ia. Autoimmune phenomena in group Ia patients included 5 patients with
thrombocytopenia and 1 with autoimmune hemolytic anemia; group Ib included 2 patients with pernicious anemia, 2 with vitiligo, 1 with autoimmune hemolytic anemia, and 1
with CREST syndrome; group II included 2 patients with pernicious anemia and 1 with vitiligo.
†The new classification may allow a prediction of the response to vaccinations. Neg. indicates no response (n ⫽ 1); Interm., intermediate (n ⫽ 3); and Pos., normal
response (n ⫽ 3) to vaccination with phage ␾ X174.
‡P ⬍ .02.
§P ⬍ .0001 compared with HD.
㛳P ⬍ .05.
¶P ⬍ .005 compared with HD.
#One patient of group II had more than 20% immature B cells in the peripheral blood, and he was the only one with splenomegaly in this group.
indicate that failing IgM production in vitro is not an absolute and
irreversible defect in CVID patients; it may have various causes
and does not seem to be a reliable marker for a specific subgroup of
CVID patients.
A new, easy FACS-based classification of CVID patients with
normal B-cell numbers
The percentage of class-switched CD27⫹IgM⫺IgD⫺ memory B
cells of the PBL fraction was a highly reliable marker for a
classification of CVID patients. In all healthy donors more than
0.5% (1.6% ⫾ 0.6%) of PBLs belong to the CD27⫹IgM⫺IgD⫺
population. In contrast, PBLs of 77% of our CVID patients with
normal B-cell counts contained less than 0.35% of class-switched
memory B cells (0.1% ⫾ 0.1%, P ⬍ .0001). We designated this
group of patients as CVID group I (Table 4). A total of 23% of our
patients showed a less significant reduction of the peripheral
switched memory B-cell compartment (0.9% ⫾ 0.4%, P ⫽ .005);
they were classified as CVID group II. The difference to group I
was also highly significant (P ⬍ .002) (Table 4). At the same time
this group showed a significant increase of total B cells
(12.6% ⫾ 4.7%) compared with group I (6.5% ⫾ 3.5%, P ⫽ .019)
and healthy donors (7.7% ⫾ 2.7%, P ⫽ .046) (Table 4). Our new
CVID group I comprises only former group A and B patients of the
Bryant classification, while group C patients segregate with the
new group II.
As can be seen in Figure 4, CD21⫺ immature B cells normally
amount to less than 20% of the CD19⫹ B-cell compartment in
healthy donors. In contrast, patients of CVID group I can be
divided into a subgroup Ia, with an increased proportion of CD21⫺
B cells, and a subgroup Ib, with normal numbers of this cell
population (Table 4). CVID patients of group Ib showed a
significant decrease of IgM memory B cells (CD27⫹IgM⫹IgD⫹,
0.9% ⫾ 0.4%, P ⬍ .02) compared with healthy donors
(1.6% ⫾ 1.1%) (Table 4). Interestingly, all 10 patients of subgroup
Ia were clinically characterized by splenomegaly, and 6 of 10 had
recurrent autoimmune cytopenia. Some patients of CVID subgroup
Ib and II, rather, exhibited other autoimmune phenomena than
cytopenias, eg, pernicious anemia or vitiligo (Table 4). The
clustering of splenomegaly (10 of 10) and autoimmune cytopenia
(6 of 10) was significant in comparison to group Ib (5 of 12,
P ⫽ .005, and 1 of 13, P ⫽ .019, respectively) and group II (1 of 7,
P ⫽ .0006, and 0 of 7, P ⫽ .034, respectively). There was only one
patient with increased counts of CD21⫺ B cells (and splenomegaly)
in group II, suggesting a more complex defect in this patient.
Our recent results of an in vivo vaccination study (A. Rump,
manuscript in preparation) with the neoantigen phage ␾ X174 20
showed a surprising correlation with the new classification. The
only tested patient of group Ia produced no detectable specific
antibody response, while all 3 patients of group Ib had transiently
detectable titers. In contrast, normal antiphage antibody responses
were seen in 3 patients of group II. This suggests a predictive value
of the new classification for potential vaccination studies.
Figure 4. Increase of CD21ⴚ B cells in CVID patients of group Ia. PBMCs were
stained for the expression of CD19, CD21, IgM, and IgD and analyzed by FACS.
Analysis was performed by gating on CD19⫹ B cells, and dead cells were excluded by
forward/side scatter gating. Representative FACS dot blots of the new CVID
subgroups Ia, Ib, II, and one healthy control (HD) are shown. Indicated values
represent percentages of gated CD19⫹ B cells. See “Patients, materials, and
methods.”
BLOOD, 1 MARCH 2002 䡠 VOLUME 99, NUMBER 5
Discussion
After antigen-independent development in the bone marrow,21
immature B cells leave the bone marrow and gather in the
longer-lived mature, naive IgD⫹IgM⫹CD27⫺ B-cell pool.22 When
these cells are stimulated by antigen in the presence of the
appropriate costimulation they will engage in a germinal center
(GC) reaction and develop into plasma cells or memory B cells.23
In most patients with CVID the development of both cells types is
greatly disturbed while mature B cells are present in normal
numbers, indicating defects in the late B-cell differentiation. The
functional classification of Bryant et al9 has certainly helped to
identify disease subtypes but is not generally accepted. Reasons for
its rare application are the laborious and expensive technique of Ig
synthesis in vitro, which still awaits an international standardization, and the lack of a correlation to lymphocyte phenotypes and/or
clinical features (eg, splenomegaly, autoantibodies). Based on
current concepts of B-cell differentiation, we suggest 2 checkpoint
markers for a new, rapid, and reliable FACS-based classification of
CVID: first, CD27 as a marker for memory B cells that have
undergone a GC reaction and, second, CD21 as a marker for the
progression of immature via transitional into mature B cells. We
want to emphasize that our proposed classification is only applicable in patients with firmly established diagnosis of CVID
according to the World Health Organization definition.24 We
purposely excluded CVID patients with very low B-cell numbers
(⬍ 1%; CVID group III) because of the difficulty of analyzing their
peripheral B-cell compartment. We also excluded patients with
hypogammaglobulinemia and histologically proven sarcoidlike
lesion because this subgroup tends to develop T-cell deficiency.
In the last 2 years CD27 as well as CD148 25 have been
established as reliable markers for human memory B cells.26,27 In
all healthy donors more than 0.5% of PBLs belong to the
CD27⫹IgM⫺IgD⫺ switched memory B-cell population; in contrast,
PBLs of 77% of our CVID patients contained less than 0.35% of
this cell type. We therefore set as a cutoff 0.4% of class-switched
memory B cells and assigned all patients who fell below that
percentage to CVID group I. The remaining 23% of our patients
maintained switched memory B cells in the lower normal range.
They were assigned to CVID group II. Two recent papers by Brouet
et al28 and Jacquot et al29 also describe subsets of CVID patients
with normal and decreased percentages of CD27⫹ B cells. In the
latter group, Jacquot et al29 identified severe forms of CVID and
suggested that defects of CD27 expression or function contribute in
some patients to the pathogenesis of CVID. The progression of
immature via transitional to mature B cells can be monitored by the
expression of CD21.22,30 Interestingly, patients of CVID group I
could be subdivided according to the percentage of CD21⫺ B cells
in peripheral blood. PBLs of healthy donors never exceeded 20%
of CD21⫺ immature B cells (7.0% ⫾ 2.7%), whereas 10 of 23
patients of CVID group I exhibited a remarkable expansion of this
population (44.9% ⫾ 11.6%, P ⬍ .0001). This accumulation of
immature B cells in the blood points toward a disturbed maturation
or premature exodus of immature B cells from the bone marrow.
The necessary signals for further differentiation seem to derive
from the splenic microenvironment but are still elusive. Most
interestingly, 10 of 10 patients in this subgroup Ia showed
splenomegaly, and 6 of 10 (60%) suffered from recurrent autoimmune cytopenia (IgM-mediated idiopathic thrombocytopenia and/or
autoimmune hemolytic anemia), while only 1 of 13 patients in
CLASSIFICATION OF CVID
1549
subgroup Ib (P ⬍ .02) and none in group II (P ⫽ .03) presented
with autoimmune cytopenia. Other autoimmune phenomena, such
as vitiligo and pernicious anemia, were more common in these
groups. One potential mechanism leading to autoimmune cytopenia may be the decrease of competing mature B cells for the entry
into secondary follicles.31 Failure of appropriate up-regulation of
CD21 or its signaling complex may by itself interfere with
appropriate antibody production.32,33
When we compared our results with the classification procedure
based on Ig synthesis in vitro,9 we found that, with the exception of
2 group B patients, all A and B patients belong to the new group I.
We could show a significant correlation between IgG production in
vitro and the percentage of switched memory B cells in vivo and
demonstrated a variability of IgM production in vitro depending on
the protocol. Thus, low to absent IgM production in vitro may be
due to low B-cell numbers (1%-2%) in some patients and may
normalize with a proportionate increase of B cells in the cell culture
system (Table 3). In other patients of group A, the removal of
suppressive cell populations may result in significant IgM production.5,16 Therefore, IgM production is not a reliable marker for a
CVID classification. Neither was the percentage of IgM memory B
cells, because the size of this population in healthy donors varied
considerably.
Because the development of memory B cells is essentially
linked to the formation of GCs in secondary lymphoid organs,23 the
finding of a significantly reduced switched memory B-cell compartment in CVID type I strongly supports the hypothesis that GC
reactions are disturbed in this disease.34 Many possible causes for
disturbed GC reactions have been described. Mutations in the
CD40 ligand gene,35,36 defects of the tumor necrosis factor-␣
family37 and its receptors,38 and impaired expression of costimulatory molecules like CD86 39 and chemokines like B-lymphocyte
chemoattractant40 all interfere strongly with the formation and
function of GCs. Well-coordinated interactions of T cells and B
cells within the histoarchitectural network of follicular dendritic
cells are essential for the normal development of a primary into a
secondary follicle.
In contrast to mice, up to 25% of human peripheral B cells
express hypermutated IgM and CD27 on their surface and were
therefore classified as IgM memory B cells.14 The origin of the IgM
memory population is discussed controversially. Patients of group
Ib exhibit an expansion of mature B cells and a concomitant
reduction of switched and IgM memory B cells (Table 4),
suggesting defects in the formation of both memory compartments,
while the IgD⫺ (“IgM only”) memory B-cell compartment was
only very small and indistinguishable from healthy donors and
group II patients. If the IgM memory population is dependent on
GC formation as thought by some authors,26 steps within the GC
leading to isotype class switch41 ought to be disturbed in patients
with normal numbers of IgM memory but decreased numbers of
switched memory B cells (group Ia). Alternatively, the presence of
IgM memory B cells in X-linked hyper-IgM syndrome (CD40L
deficiency)42 as well as findings in sheep43 point toward a
GC-independent origination of this population. The recent observation that the development of IgM memory (but not switched
memory) is crucially dependent on the presence of the spleen and
that splenectomy leads to a permanent abolition of more than 90%
of this population (Wardermann H, Weber H, et al, manuscript in
revision) adds an intriguing new facet to the origin of IgM memory
in man.
1550
BLOOD, 1 MARCH 2002 䡠 VOLUME 99, NUMBER 5
WARNATZ et al
A different pathogenesis seems to apply for the CVID group II
patients. This group comprises all former C patients and 2
additional patients of group B. On average, PBLs of these patients
contained a higher percentage of total B cells compared with
patients in group I and healthy donors, suggesting an increased
proliferation, an augmented lifespan, or decreased apoptosis of B
cells. Their IgM memory B cells especially seem to be expanded
compared with healthy donors. The switched memory B cells were
only slightly decreased, and quantitative flow cytometry of memory
B-cell subsets as well as the synthesis of Ig in vitro could not
reliably distinguish them from healthy controls. CVID group II
patients probably have a normal GC reaction but somehow fail to
produce substantial amounts of antibodies in vivo or have an
increased catabolism of Ig. The presence of functional GC reactions in some CVID patients with switched memory B cells has
additionally been supported by the finding of normal hypermutation rates in 6 of 8 tested CVID patients by Levy et al.44 The
hypogammaglobulinemia in group II patients may be due to
impaired terminal plasma cell differentiation, a disturbed homing
of plasma cell precursors,45 or a shortened lifespan of plasma cells
in vivo.46 Many interactions like CD27/CD70,47,48 CD134/
CD134L,49,50 and IL-6 with its receptor51,52 promote the terminal
differentiation of B cells into plasma cells. Interestingly, one report
indicated an increase in IL-6 in CVID-derived PBLs.53
In 2 recent papers, Brouet et al28 and Jacquot et al29 analyzed the
role of CD27 expression and function in patients with CVID. Both
found a substantial decrease in CD27⫹ B cells in a subgroup of
CVID patients, as similarly observed for our patients. Brouet et al28
demonstrated for 3 of 5 of these patients a defective up-regulation
of CD27 on isolated B cells after in vitro activation, suggesting a
defect in CD27 expression. This finding was confirmed by the
report of Jacquot et al29 describing 2 of 6 patients with defective
up-regulation of CD27 after in vitro activation. However, it does
not distinguish between a primary defect in CD27 up-regulation
and a defect secondary to a disturbed activation signal following
SAC plus IL-2 stimulation. Interestingly, both authors describe
another subgroup with normal CD27 expression but impaired in
vitro function despite costimulation with CD70 transfectants. Thus,
Brouet et al28 reported that isolated B cells from 2 of these patients
failed to produce Ig when costimulated with CD70 transfectants.
Unfortunately, this finding was not correlated to Ig production in
the absence of CD70/CD27 costimulation, thus rendering it
impossible to distinguish defects in CD27 function from defects in
SAC plus IL-2/CD40 stimulation. The group of Jacquot et al,29
however, clearly shows for one patient a disturbed costimulatory
signaling via CD27. Unfortunately, neither group correlated their
data to extended clinical phenotypes and the existing classification
of Bryant et al.9 These findings point at an important role of
CD27/CD70 costimulation in the pathogenesis of CVID and
deserve further investigation. Recent results from our group show
that naive, pre–germinal center B cells (CD27⫺) from CVID group
I show an impaired up-regulation of CD70 and CD86 upon
stimulation with anti-IgM plus IL-2, while CD27 regulation was
not altered (C.G., R.D., K.W., et al, manuscript submitted).
Functional investigations on the interaction between CD27 on B
cells and its CD70 ligand on T cells are underway.
In conclusion, this study proposes a new CVID classification
that is based on flow cytometric analysis of different B-cell subsets
in peripheral blood. It accommodates the previous functional
classification of Bryant et al9 and confirms and extends reports by
Brouet et al28 and Jacquot et al29 on low CD27⫹ B-cell counts in a
subset of severely immunocompromised CVID patients. It shows a
correlation with clinical findings and may permit the prediction of
successful vaccination in some CVID patients. A consensus on this
classification system will provide a powerful tool to rapidly define
and compare homogeneous subgroups of CVID for functional
studies and genetic linkage analysis.
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