Aus der Medizinischen Universitätsklinik und Poliklinik, Abteilung Rheumatologie und Klinische Immunologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br. Gestörte Expression von CD86 und ein verändertes intrazytoplasmatisches Zytokinmuster in Lymphozyten von Patienten mit Variablem Immundefektsyndrom (CVID) INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br. Vorgelegt im Jahr 2003 von Axel Klaus Denz geboren in Freiburg im Breisgau 1-2 Dekan Prof.Dr.rer.nat.M. Schumacher 1.Gutachter Prof.Dr.med.H.-H. Peter 2.Gutachter Prof.Dr.med.O. Haller Jahr der Promotion 2003 1-3 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung ........................................................................................................... 1-5 1.1. Aufgabe und Struktur des Immunsystems ..................................................... 1-5 1.2. Antigenprozessierung und -präsentation........................................................ 1-6 1.3. Immunglobuline.............................................................................................. 1-7 1.4. B-Zell-Immunantwort...................................................................................... 1-8 1.5. B-Zell-Maturation.......................................................................................... 1-10 1.6. Immunität und Toleranz ............................................................................... 1-13 1.7. T-Zell-Immunantwort .................................................................................... 1-14 1.8. Interaktion von antigenpräsentierenden, T- und B-Zellen ............................ 1-16 1.9. Zytokine ....................................................................................................... 1-19 1.9.1. Interleukin-2 ........................................................................................... 1-20 1.9.2. Interleukin-4 ........................................................................................... 1-21 1.9.3 Interleukin-10 .......................................................................................... 1-21 1.9.4. Interferon-γ ............................................................................................. 1-22 1.9.5. Tumornekrosefaktor-α............................................................................ 1-22 2. Variables Immundefektsyndrom (CVID)........................................................... 2-24 2.1. Krankheitsbild............................................................................................... 2-24 2.2 Pathogenese ................................................................................................. 2-27 2.3. Klassifikation ................................................................................................ 2-29 3. Fragestellungen der Arbeit ............................................................................... 3-31 4. Patienten und Kontrollen.................................................................................. 4-32 5. Material und Methoden .................................................................................... 5-35 5.1. Blutabnahme ................................................................................................ 5-35 5.2. Isolierung mononukleärer Zellen .................................................................. 5-35 5.3. Oberflächenfärbung mittels direkt-konjugierter Antikörper ........................... 5-36 5.4. Analyse der Zellen mittels Durchflußzytometrie ......................................... 5-43 5.4.1. Funktionsweise des FACS ..................................................................... 5-43 5.4.2. Auswertungsprinzipien ........................................................................... 5-44 5.4.3. Vorteile der Methode.............................................................................. 5-45 5.5 B-Zellselektionierung..................................................................................... 5-45 5.6. B-Zellstimulation........................................................................................... 5-46 5.7. Immunglobulin-ELISA .................................................................................. 5-47 1-4 5.8. Quantitative Bestimmung der mRNA für CD86 ............................................ 5-48 5.9. T-Zelldepletion ............................................................................................. 5-49 5.10. T-Zellstimulation......................................................................................... 5-50 5.11. Färbung intrazytoplasmatischer Zytokine................................................... 5-51 6. Ergebnisse ....................................................................................................... 6-52 6.1. B-Zell-Ergebnisse......................................................................................... 6-52 6.1.1. Klassifikation der Patienten .................................................................... 6-52 6.1.2. Expression von Reifungsmarkern und Kostimulationsmolekülen ........... 6-53 6.1.3. Kinetik der Regulation von CD69, CD80, CD86 und CD23 .................... 6-55 6.1.4. Expression von CD69, CD80, CD86, CD62L, CD137 und CD23 nach Stimulation ....................................................................................................... 6-57 6.1.5. Regulation der CD86 mRNA in B-Zellen ................................................ 6-63 6.2. T-Zell-Ergebnisse......................................................................................... 6-67 6.2.1. T-Zelloberflächenfärbung (native Zellen)................................................ 6-67 6.2.2. Oberflächenfärbung stimulierter T-Zellen ............................................... 6-70 6.2.3. Intrazytoplasmatische Zytokine in CD4+ und CD8+ T-Zellen................. 6-72 6.3.1. Transformation und Etablierung von B-Zell-Linien ................................. 6-74 6.3.2. EBV-Linien-Ergebnisse .......................................................................... 6-75 6.4. Native Monozyten ........................................................................................ 6-77 7. Diskussion........................................................................................................ 7-80 7.1. Untersuchung von nativen B-Zellen ............................................................. 7-80 7.2. Untersuchung von stimulierten B-Zellen ...................................................... 7-82 7.3. Untersuchung von nativen T-Zellen ............................................................. 7-88 7.4. Untersuchung von stimulierten T-Zellen....................................................... 7-90 7.5. Intrazytoplasmatischer Nachweis von Zytokinen in CD4+ und CD8 T-Zellen7-91 8. Zusammenfassung........................................................................................... 8-94 9. Referenzen ...................................................................................................... 9-95 10. Veröffentlichungen .................................................................................... 10-146 1-5 1. Einleitung 1.1. Aufgabe und Struktur des Immunsystems Die Hauptaufgabe des Immunsystems ist es, Bakterien, Viren und ein- oder mehrzellige Parasiten als körperfremd und damit potentiell schädlich zu erkennen und zu eliminieren, davon die Zellen des eigenen Körpers jedoch als „Selbst“ zu unterscheiden [87;246]. Zum Schutz vor Infektionen stehen dem menschlichen Organismus die sich funktionell ergänzenden Systeme der unspezifischen (natürlichen, angeborenen) und der spezifischen (erworbenen, adaptiven) Immunität zur Verfügung. Die ersten Barrieren zur Infektabwehr sind die Haut und die Schleimhäute, die durch einen sauren pH-Wert, Enzyme wie Lysozym und sekretorisches IgA bereits ein Absiedeln von Erregern verhindern können [231;392]. Gelingt es, diese Abwehr zu überwinden, stehen andere unspezifische Mechanismen wie das Komplementsystem, Phagozyten, natürliche Killerzellen und eine Vielzahl von Zytokinen zur Abwehr bereit [36;55;125;171]. Die antigenspezifische Immunabwehr der Lymphozyten und Antikörper unterstützt und vervollständigt diese Abwehrleistung der unspezifischen Immunität. Zugleich führt die spezifische Immunität gegen Antigene zu der Fähigkeit, bei Reexposition schneller, spezifischer und damit effizienter gegenüber dem gleichen Antigen reagieren zu können [8;37;228;436]. Die verschiedenen Anteile dieses komplexen Abwehrsystems kooperieren über Oberflächenstrukturen auf Zellen und humorale Faktoren miteinander. Die Lymphozyten gehen aus pluripotenten Knochenmarkvorläuferzellen hervor. Im Laufe ihrer Reifung erwerben sie die Fähigkeit, „selbst“ zu erkennen, Antigen zu erkennen sowie nach Antigenerkennung zu proliferieren und bestimmte Funktionen anzunehmen [246;247;250;330;368]. Zwei Reifungsorte, die funktionell verschiedene Lymphozyten hervorbringen, werden unterschieden: der Thymus, aus dem die sogenannten T-Lymphozyten oder T-Zellen hervorgehen [179;194;366;367] und das Knochenmark, die Milz und die fetale Leber, die Reifungsorte der B-Zellen sind [56;57;94;157;224]. T- und B-Zellen tragen an ihrer Oberfläche verschiedene membranassoziierte Glykoproteine, die als Rezeptoren verschiedene Funktionen vermitteln. Diese Oberflächenstrukturen lassen sich durch spezifische monoklonale Antikörper nachweisen und erlauben so die Differenzierung der Lymphozyten-Klassen und Subklassen durch immunhistochemische oder 1-6 durchflußzytometrische Methoden. Drei Arten von Oberflächenrezeptoren sind dabei für die Immunantwort wichtig: zunächst Proteine, die für „selbst“ kodieren, zweitens Strukturen, die das Antigen erkennen und auch als „Antigenrezeptor“ bezeichnet werden, und drittens Adhäsionsmoleküle, die die Bindung an andere Zellen vermitteln und die direkte Zell-zu-Zell-Interaktion ermöglichen. Mit der Ausprägung der Antigenrezeptoren erwirbt der Lymphozyt die Fähigkeit, ein individuelles Antigen selekiv zu erkennen und bei Antigenkontakt mit einer Proliferation des Klons zu reagieren (Prinzip der klonalen Selektion) [45;230;268;306;316]. 1.2. Antigenprozessierung und -präsentation Antigene werden von Antigen-präsentierenden Zellen (APC) durch Rezeptorvermittelte Endozytose proteolytische Enzyme aufgenommen, zu in Peptidfragmenten den Phagolysosomen gespalten und durch binden in spezialisierten Kompartimenten der Zelle an körpereigene MHCII-Moleküle [158;380]. Diese Komplexe werden auf der Zelloberfläche antigenpräsentierender Zellen, wie follikulär-dendritische Zellen (FDC), dendritische Zellen (DC), BLymphozyten und Makrophagen, von antigenspezifischen CD4+ T-Helferzellen erkannt [176;379;416]. Antigene im Zellinneren, wie viele virale Antigene, werden durch Proteasomen in ihrer Proteinstruktur aufgespalten und die resultierenden Peptide in das endoplasmatische Retikulum der Zelle transportiert, wo sie an MHCI-Moleküle binden [26;162;196;320]. Dieser Komplex kann an der Zelloberfläche von CD8+ zytotoxischen T-Zellen erkannt werden[416]. Im Gegensatz dazu erkennen B-Zellen lösliches Antigen durch ihren antigenspezifischen oberflächengebundenen Rezeptor. Als Rezeptor fungiert ein Antikörper, der mit seinem Fc-Teil in der Zellmembran verankert ist und mit seinem Fab-Anteil Antigen erkennt. Die Bindung des Antigen mit Kreuzvernetzung von Antigenrezeptoren vermittelt ein transmembranes Signal, das die terminale Differenzierung vom B-Lymphozyten zur antikörperproduzierenden Plasmazelle einleitet. Für die Interaktion zwischen antigenpräsentierenden Zellen und T-Zellen als auch für das Zusammenspiel von T- und B-Zellen sind Ligandenpaare mit Adhärenz- und signalleitenden Eigenschaften unerläßlich [25;64;65;182;197;271;288]. Ist die Expression eines Liganden gestört, kommt es 1-7 zu gravierenden Störungen der Zell-Zell-Interaktion und letztendlich der Immunabwehr [34;51;89;422]. 1.3. Immunglobuline Die von der Plasmazelle produzierten Antikörper sind Proteine mit hoher Bindungsspezifität für das Antigen, das ihre Produktion ausgelöst hat [31;306]. Sie neutralisieren entweder das Antigen direkt oder vermitteln durch Aktivierung anderer Zellen oder humoraler Faktoren die Elimination des Antigens. Sie sind als integraler Membranbestandteil auf B-Lymphozyten exprimiert oder als freie Moleküle im Blut, in der extravasalen Flüssigkeit der Gewebe, in exokrinen Sekretionen oder als gebundene Moleküle auf unterschiedlichen Zellen. Die Grundstruktur der Antikörper entspricht einem Tetramer bestehend aus zwei identischen Paaren von schweren und leichten Polypeptidketten, die jeweils einen variablen (V) und einen konstanten (C) Teil besitzen [29;302]. Die variablen, aminoterminalen Anteile der leichten und schweren Ketten bilden die Antigenbindungsstelle (Fab). Die konstanten, carboxyterminalen Anteile, als Fc bezeichnet, vermitteln die biologische Aktivität des Antikörper [244;310]. Dies bedeutet die Interaktion mit weiteren Molekülen und Zellen des Immunsystems, unter anderem die Aktivierung und Fixierung von Komplementfaktoren oder die Bindung von Killerzellen und Phagozyten. Die Antigenspezifität beruht demnach auf der Aminosäuresequenz beziehungsweise der resultierenden Sekundär- und Tertiärstruktur der jeweiligen V-Regionen [12]. Die Bindung des Antigen an den Antikörper beruht auf der Ausbildung vieler schwacher, nicht-kovalenter Bindungen, deren Reaktionspartner Stärke abhängen von der [147;396]. räumlichen Die Kongruenz konstanten der beiden Abschnitte der Schwerketten lassen sich in fünf verschiedene Klassen einteilen, die als µ, α, γ, δ und ε bezeichnet werden, Antikörper mit entsprechendem Schwerkettentyp als Immunglobulin (Ig)M, IgA, IgG, IgD und IgE. Die Antikörperklasse hat keinen Einfluß auf die Antigenspezifität des Antikörpers, entscheidet aber, welche biologischen Funktionen von dem entsprechenden Antikörper vermittelt werden [213]. Die Vielfalt der gebildeten Antikörpermoleküle hat mehrere Mechanismen zur Grundlage. Die genetische Information für die Antikörperproteine ist auf drei Gene verteilt, wobei eines für die Leichtkette vom χ-Typ (Chromosom 2), eines für 1-8 die vom λ-Typ (Chromosom 22) und eines für die Schwerkette (Chromosom 14) kodiert [96;168;375]. Bei der Reifung, also der Differenzierung zur antigenspezifischen B-Zelle, werden auf DNA-Ebene die Genabschnitte neu geordnet (Rearrangement), wobei für die Leichtkette stets ein V-Abschnitt mit einer J-Sequenz an das Gen für den konstanten Abschnitt angefügt wird. Dabei findet die Festlegung der B-Zelle auf einen Leichtkettentyp (χ oder λ) und eine Antikörperspezifität statt. Für die Schwerkette ist die genetische Information linear auf vier Gensegmenten angeordnet. Zunächst die Gene, die für alle möglichen VAbschnitte kodieren, dann die sogenannten D(„diversity“)-Gene, dann J(„joining“)Gene und schließlich die Information für die Schwerkettenklassen [136;166;168;300]. Nach einem Rearrangement ähnlich dem bei der Leichtkette verfügt die reife B-Zelle nur noch über die Information für jeweils eine V-, eine Dund eine J-Region, aber für alle Schwerkettentypen. Sie kann somit potentiell Schwerketten aller Klassen, jedoch nur einer Spezifität bilden. Die variablen Regionen der schweren (VhiDJ) und der leichten (VliJ) Ketten bilden zusammen die Antigenbindungsstelle. Geht man von einer geschätzten Anzahl der Vli-Gene (200) und der Vhi-Gene (200) aus und berücksichtigt die Diversität der J- und DSegemente, so beliefe sich die Zahl der theoretisch möglichen Rearrangements und damit Antikörperspezifitäten auf ca. 48x106. Da aber wahrscheinlich nicht alle Rearrangements gleich häufig und erfolgreich sind, ist die Zahl wohl geringer. Die ungenaue Verknüpfung der Gensegmente und die Einführung von P- und NNukleotiden erzeugen eine zusätzliche Variabilität. Nachdem ein Antikörper exprimiert ist, unterliegt er schließlich einer weiterer Veränderlichkeit durch somatische Hypermutation [168;235;371;410]. Die Kombination all dieser Mechanismen zur Erzeugung von Vielfalt schafft aus einer relativ begrenzten Anzahl von Genen ein riesiges Repertoire von Antikörperspezifitäten. 1.4. B-Zell-Immunantwort Eine einzelne B-Zelle exprimiert auf ihrer Zelloberfläche Immunglobulinmoleküle in einer Anzahl von 1-300000, die sich von sezernierten Immunglobulinen durch einen transmembranösen (25AS) und einen zytoplasmatischen Anteil (3AS) unterscheiden. Ihnen kommen zwei unterschiedliche Funktionen zu: einerseits vermitteln diese Antikörper die Bindung und Aufnahme von löslichen Antigenen 1-9 und ermöglichen Andererseits so die dienen die antigenpräsentierende Immunglobuline Funktion zusammen der B-Zellen. mit weiteren Oberflächenmolekülen als transmembrane Rezeptoren zur Zellaktivierung [31;86]. Alle Immunglobulinisotypen können einen B-Zell Antigenrezeptor bilden. Die variable Region der Immunglobuline erkennt das für sie spezifische Epitop und übermittelt Aktivierungssignale ins Zellinnere. Hierzu bedarf es der nichtkovalenten Assoziation mit dem heterodimeren Oberflächenmolekül Igα (CD79α) - Igβ (CD79β), das in seiner Struktur mit den T-Zell-Antigenrezeptor assoziierten CD3γ-, -δ-, -ε-Ketten vergleichbar ist. Die Erkennung und Bindung von multivalenten Antigenen führt zur Vernetzung der zellständigen Rezeptorkomplexe und induziert eine Reihe von Veränderungen mit einer differenzierten Genexpression abhängig vom Stadium der B-Zell-Reife [203;315]. Um eine B-Zell-Antwort gegen die meisten Antigene bilden zu können, sind zum B-Zell-Antigenrezeptor zusätzlich weitere Oberflächenmoleküle notwendig, die die Aktivierungssignale verstärken oder modulieren. Diese sogenannnten Korezeptoren schließen den CD19/CD21/CD81-Komplex, CD22, CD45 und den FcγRIIb-Rezeptor ein [44;60;127;389]. CD19 ist ein Glykoprotein der Immunglobulin-Superfamilie, welches als linienspezifischer Marker bereits im Stadium der frühen Pro-B-Zelle exprimiert wird [281;339]. Es spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung und Expansion des B-Zell-Repertoire gegenüber T-Zell-abhängigen Antigenen und ist bei der Bildung von Gedächtniszellen von Bedeutung [318;377]. Durch die integrierte Funktion von CD19/CD21/CD81 können B-Zellen bereits durch geringe Antigenmengen stimuliert werden. In Abwesenheit von CD19 ist eine hundert- bis tausendfach höhere Antigenkonzentration notwendig, um den selben Effekt zu erzielen [59;127]. Die Bindung von multivalentem Antigen führt zur Kreuzvernetzung der Rezeptorkomplexe und stößt eine Reihe von Veränderungen an, die eine differenzierte Genexpression bedingen. Erster Schritt dieser Aktivierungskaskade ist die Phosphorylierung der ITAM-Anteile der Igα- und Igβ-Ketten (CD79) durch Protein-Tyrosin-Kinasen (PTK) der Src-, Syk- und Tec-Familien, deren Aktivität durch eine membranständige Phosphatase (CD45) gesteigert werden kann. In der Folge bindet die Proteinkinase Syk an die ITAM-Motive und wird dadurch aktiviert. Über Serin- und Threoninphosphorylierungen unterschiedlicher Substrate, der 1-10 durch Inositoltriphosphat vermittelten intrazellulären Zunahme der Calciumkonzentration und der Aktivierung des ras/MAP-Signalweges kommt es zur Aktivierung von nukleären Transkriptionsfaktoren (z.B. c-fos, EGR-1, SRF, ets, IK-B, NF-κB). Diese bedingen das spezifische Expressionsmuster von Genprodukten in Abhängigkeit von der Art und der Differenzierungsstufe der Zelle [54;184;315;423]. 1.5. B-Zell-Maturation Die Reifung der B-Zellen läßt sich in eine zentrale B-Zell-Entwicklung im Knochenmark und eine periphere B-Zell-Entwicklung der naiven B-Zellen in den sekundären lymphatischen Geweben wie in der Milz, in den Lymphknoten und in mukosaassoziierten Knochenmark lymphatischen lassen sich Geweben anhand unterscheiden von [95;156]. Im phänotypischen Differenzierungsmerkmalen pluripotente hämatopoetische Stammzellen und die weiteren Vorstufen der B-Zellen nachweisen. Frühe Pro-B-Zellen entsprechen dem ersten Stadium der B-Zell-Reifung. Sie sind neben anderen Markern charakterisiert durch die Expression von CD10 (CALLA), einer membranassoziierten Endopeptidase, von CD19, einem Korezeptormolekül für die Aktivierung von B-Zellen, von CD40, einem für die frühe Proliferation wichtigen Glykoprotein, und von CD45, das die Signaltransduktion durch den BZell-Rezeptorkomplex und anderen membranständigen Rezeptoren moduliert [155;192]. Die Immunglobulingene befinden sich noch in Keimbahnkonfiguration, weshalb die Pro-B-Zellen auch keine Antikörperkette auf der Oberfläche trägt. Späte Pro-B-Zellen unterscheiden sich nicht durch ein typisches Muster an Differenzierungsantigenen, zeigen aber im Bereich der Gene für die schweren Immunglobulinketten bereits eine Umlagerung von D(Diversity)- und J(Joining)Genabschnitten. Das anschließende Rearrangement der rekombinierten DJGenabschnitte mit einem V(Variable)-Gen erfolgt vorerst nur auf einem Allel. Im Falle einer sogenannten produktiven Umlagerung mit richtigem Leseraster kann von dieser VDJ-Sequenz die Information für eine intakte µ-Immunglobulinkette abgelesen werden. Ein Kontrollmechanismus, der als allele Exklusion umschrieben wird, verhindert die VDJ-Rekombination des zweiten Allels und stellt somit sicher, daß eine B-Zelle eine einzige produktive VDJ-Umlagerung besitzt. 1-11 Im Falle einer nicht produktiven Rekombination beginnen die Zellen mit der Umlagerung des anderen Alleles des diploiden Chromosomensatzes. Die restlichen Zellen, die nach Rekombination beider Allele immer noch keine produktive Umlagerung erreicht haben, sterben innerhalb kurzer Zeit mangels weiterer Differenzierungssignale [32;136;221;268]. Die Entwicklung von Pro-BZellen zu Prä-B-Zellen ist ferner von der Funktion der Tyrosinkinase btk (Bruton’s tyrosine kinase) abhängig [184;311]. Ein Defekt dieses Enzyms führt zur X-linked Agammaglobulinämie (XLA) [68;181;402]. Prä-B-Zellen sind gekennzeichnet durch die erfolgreiche Oberflächenexpression einer µ-Immunglobulinkette und den Nachweis des typischen Pan-B-Zell-Markers CD20 [154;190]. Mit der Synthese von intakten schweren Immunglobulinketten wird nun mit den bereits vorhandenen Proteinen λ5 und VpräB der vollständige Prä-B-Zell-Rezeptor gebildet, der die weitere Proliferation als Bedingung für die weitere Entwicklung ermöglicht. Prä-B-Zellen beginnen zu diesem Zeitpunkt mit der Rekombination der Gene für die leichten Immunglobulinketten, wobei der κ-Locus zuerst umgelagert wird [156;428]. Im Falle einer nicht produktiven Rekombination werden nach dem Prinzip der allelen Exklusion zunächst das zweite κ-Allel und wenn nötig die λ-Allele umgelagert. Dieser Vorgang gewährleistet, dass B-Zellen Immunglobuline ausschließlich einer einzigen antigenen Spezifität synthetisieren [243;268]. Die Synthese einer leichten und einer schweren Kette ermöglicht die Bildung eines kompletten Moleküls. Dies ist ein typisches Merkmal unreifer BZellen, wie auch die Expression von CD21, einem Komplementrezeptor, welcher gemeinsam mit CD19 und CD81 als Korezeptor an der Signalbildung zur B-ZellAktivierung beteiligt ist. Im weiteren Verlauf der Entwicklung entstehen die reifen B-Zellen, welche auf ihrer Oberfläche durch alternatives Spleißen der mRNA sowohl IgM als auch IgD exprimieren. Bei unveränderter Spezifität der produzierten Antikörper kann jede einzelne B-Zelle im Verlauf ihrer Entwicklung unterschiedliche Isotypen bilden. Dieser Wechsel in der Synthese von IgM zu anderen Isotypen (class switch) wird durch das Antigen selbst, die Interaktion mit T-Lymphozyten und deren Produkten oder den Ort der antigenvermittelten B-ZellAktivierung beeinflußt [39;95;129;356]. Der Vorgang des class switching ist von zentraler immunbiologischer Bedeutung, da sich die einzelnen Isotypen in ihrer Effektorfunktion stark unterscheiden. Die antikörperproduzierenden Plasmazellen 1-12 stehen schließlich als differenzierteste Effektorzellen am Ende der B-Zell-Reihe. Naive B-Zellen gelangen über die Zirkulation aus dem Knochenmark in die Milz, die Lymphknoten und in mukosaassoziiertes lymphatisches Gewebe [56;226]. In der B-Zell-reichen, follikulären Zone dieser Gewebe sind als antigenpräsentierende Zellen die follikulär dendritischen Zellen (FDC, follicular dendritic cells) lokalisiert [150;379]. Erkennen B-Zellen im Bereich der follikulären Zone ihr spezifisches Antigen und erhalten gleichzeitig entsprechende T-ZellHilfe, werden sie aktiviert. Sie differenzieren sich zu Blasten, gelangen in das Zentrum der Lymphfollikel und bilden dort Keimzentren [240]. Die Proliferation der aktivierten B-Zellen führt innerhalb weniger Tage zu einer starken klonalen Expansion und zur Ausbildung der typischen Merkmale eines Sekundärfollikels mit der zentralen, von Zentroblasten gebildeten „dunklen“ Zone [52]. Nach Involution der Sekundärfollikel nach etwa drei Wochen verbleiben antigenspezifische Zellen über Monate in diesem Bereich, die B-Gedächtniszellen entsprechen. Während der Proliferation der Zentroblasten kommt es zur somatischen Hypermutation, einem Vorgang, bei dem Punktmutationen von Basenpaaren und Doppelstrangbrüche im Bereich der rearrangierten VDJ-Gene auftreten [40;173;269]. Diese Mutationen können zu einer Veränderung der Struktur der Antigenbindungsstelle führen und damit die Affinität der Antikörper für das spezifische Antigen verändern. Bei einer Zunahme der Affinität spricht man von einer Affinitätsreifung. Der nächste Schritt der peripheren B-Zell-Reifung ist durch die Entwicklung von Zentrozyten gekennzeichnet, die perizentral im Follikel die „helle“ Zone bilden. Follikulär-dendritische Zellen präsentieren Antigene, wobei nur jene B-Zellen selektioniert werden, welche spezifische Immunglobuline mit hoher Affinität besitzen. Diese positiv selektionierten Zellen entwickeln sich schließlich zu antikörpersezernierenden Plasmazellen oder B-Gedächtniszellen [8;437]. Während der Zellteilung stimulierter B-Zellen kann es unter Beibehaltung der Antigenspezifität zu einem Wechsel des Isotyps und somit der biologischen Funktion des Antikörpers kommen. Beim Isotypenwechsel (class switch) rearrangieren die Zellen ihre Keimbahn-DNA so, dass anstelle des C-Gens für die konstante µ-Region der schweren Kette ein anderes C-Gen verwendet wird, das dann in unmittelbarer Nähe zur rearrangierten VDJ-Sequenz zu liegen kommt. Die Auswahl der Immunglobulinklasse erfolgt dabei nicht zufällig, sondern ist abhängig von der T-Helferfunktion und dem Einfluß von Zytokinen [95;356]. 1-13 1.6. Immunität und Toleranz Die immunologische Toleranz gegenüber Selbstantigenen wird durch die Elimination oder funktionelle Inaktivierung von selbstreaktiven B- und TLymphozyten gewährleistet. Diese negativen Selektionsmechanismen lassen physische und funktionelle Lücken im Repertoire der Antigenrezeptoren entstehen. Diesem zum Schutz vor Autoimmunität eingeschränkten Repertoire steht die Notwendigkeit schneller Immunantworten gegen stets veränderliche Pathogene entgegen. Unreife selbstreaktive B- und T-Zellen, die kreuzvernetzende Antigene auf Zelloberflächen, Nukleinsäuren, MHC-Moleküle oder andere körpereigene Strukturen erkennen, werden bereits in den zentralen lymphatischen Organen Knochenmark und Thymus durch Apoptose beseitigt [200;248;367]. Auf diese Weise wird es ihnen unmöglich, an Immunantworten in peripheren lymphatischen Geweben teilzunehmen und durch ihre autoimmune Spezifität Schaden zu verursachen. Die Notwendigkeit einer gekoppelten Antigenerkennung durch B- und T-Zellen für die regelrechte B-Zell-Aktivierung ist ein weiterer Mechanismus zur Sicherstellung der Selbst-Toleranz [114;128]. Für B-Zellen erfolgt der Zelluntergang mit einer Latenz von ein bis zwei Tagen, in denen die RAG-Gene aktiv bleiben und durch ein sekundäres ImmunglobulinGen-Rearrangement, das als „receptor editing“ bezeichnet wird, die selbstreaktiven Leichtketten durch andere Spezifitäten ersetzt werden können [200;267;317]. Von IgM-Molekülen auf B-Zellen erkannte niedervalente, ubiquitäre, lösliche Selbstantigene induzieren in den Zellen einen Zustand der Inaktivierbarkeit, der Anergie genannt wird. Die anhaltende Exposition eines relativ schwachen, kostimulatorisch defizienten antigenen Stimulus, wie gegen Oberflächenimmunglobulin gerichtete Antikörper, Serum-Lysozym oder Einzelstrang-DNA, vermindert die Fähigkeit der B-Zelle, nach Antigenkontakt zu proliferieren und Antikörper zu sekretieren [70;108;385]. Typischerweise exprimieren anerge B-Zellen um den Faktor 20-50 weniger antigenbindendes IgM auf ihrer Oberfläche. IgD-Rezeptoren werden normal exprimiert, jedoch ist ihr Vermögen, die Tyrosinphosphorylierung der Igα/β-Ketten oder die der pp72syk Kinase zu verstärken, stark vermindert [169]. Die Interaktion mit spezifischen TZellen führt nicht zur Aktivierung und klonalen Expansion, sondern zur CD95- 1-14 vermittelten Apoptose der Zelle [91]. Anerge B-Zellen sind nicht reaktionsunfähig, doch ist das durch den Antigenrezeptor und den Transduktionskomplex generierte Signal so stark vermindert, daß für ihre Reaktivierung ein sehr viel größerer immunogener Stimulus als für native B-Zellen nötig ist [167;242;275]. 1.7. T-Zell-Immunantwort Der Thymus ist das primäre lymphatische Organ für die Entwicklung und Reifung von hämatopoetischen Vorläuferzellen zu funktionellen antigenspezifischen TLymphozyten. Die Zellen durchwandern in geregelter Folge unterschiedliche Differenzierungsstadien, unterliegen hier Selektionmechanismen zum Schutz vor Autoreaktivität und gelangen schließlich als reife, immunkompetente T-Zellen aus dem Thymus in die Zirkulation [97;194;366]. Diese Zellen lassen sich unterscheiden in immunregulatorische T-Zellen, T-Zellen, die nach Aktivierung zytotoxisch werden, T-Gedächtniszellen und T-Zellen, die eine Immunantwort supprimieren. T-Lymphozyten erkennen Antigen über einen spezifischen Antigenrezeptor (TCR), wenn es von einer antigenpräsentierenden Zelle zusammen mit einem körpereigenen MHC-Molekül angeboten wird (MHCRestriktion). Die TCR bestehen aus jeweils zwei unterschiedlichen Peptidketten (α/ β- und γ/δ-Ketten), sind in der Zellmembran verankert und bilden gemeinsam mit einem Komplex aus mindestens 5 unterschiedlichen Peptiden (CD3) die funktionelle Grundeinheit zur antigenspezifischen Signaltransduktion[131;424]. CD3 ist ein Proteinkomplex, welcher sich aus den CD3γ-, ε-, δ- und ξ-Ketten zusammensetzt und als Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie Ähnlichkeit zu CD79α (Igα) und CD79β (Igβ) des B-Zell-Antigenrezeptor-Komplexes besitzt [135;424]. Die Aminosäuresequenz des zytoplasmatischen Abschnittes von CD3γ, -ε und -δ enthält ein ITAM (immunoreceptor-tyrosine-based-activated-motif), das bei Zellstimulation durch Tyrosinkinasen phosphoryliert wird und somit die weitere Signaltransduktion über den Phospholipase-γ1(PLC-γ1)-, den Ras- oder RacAktivierungsweg einleitet [63;337]. Eine defekte Signaltransduktion führt im Falle des Fehlens eines Moleküls (ZAP-70), das die PLC-γ1 aktiviert, zum Ausbleiben der T-Zell-Reifung von CD8+-Thymozyten und in der Peripherie zum Fehlen funktioneller CD4+-T-Zellen. Klinisch führt dies zu einem schweren kombinierten 1-15 Immundefekt bereits im Säuglingsalter [104;105;280]. 85-95% aller peripheren TZellen tragen den heterodimeren TCRα/β, die restlichen TCRγ/δ. In Analogie zu den Antikörpermolekülen bestehen die TCR-Polypeptidketten α/β und γ/δ aus variablen (V-) und konstanten (C-) Domänen. Auch die Genorganisation der einzelnen Ketten des TCR ist denen der Gene für die Immunglobuline sehr ähnlich. Während der T-Zell-Reifung entsteht das kodierende Exon einer funktionalen V-β- oder V-δ-Domäne durch das Rearrangement eines V-, D- und JGensegmentes; für die kodierenden Exone einer V-α- oder V-γ-Domäne werden je ein V- und J-Gensegment rearrangiert. Jeder reife, immunkompetente T-ZellKlon ist somit durch je eine funktionale V-α- und V-β-Domäne bzw. eine V-γ- und V-δ-Domäne hinsichtlich seiner antigenen Spezifität charakterisiert [166;268]. Da die relative Affinität des T-Zell-Rezeptors für den Antigen-MHC-Komplex gering ist, erfordert die stabile Bindung einer TCRα/β tragenden T-Zelle an die APC neben der MHC-TCR-Interaktion die Beteiligung sogenannter akzessorischer TZell-Rezeptoren. CD4 ist ein auf MHC-II-restringierten, reifen T-Zellen und Makrophagen exprimiertes Glykoprotein, das MHC-II-Moleküle zum Zeitpunkt der Antigenerkennung außerhalb jenes polymorphen Bereiches bindet, der für die Antigenbindung wichtig ist. Der zytoplasmatische Teil von CD4 bindet die Tyrosinkinase Lck und schließt so CD4 in die Signaltransduktion des erweiterten T-Zell-Rezeptorkomplexes ein [144;336;400]. CD8 ist ein auf MHC-I- restringierten, reifen T-Zellen exprimiertes Heterodimer, das sich an die schwere Kette der MHC-I-Moleküle in einem nicht-polymorphen Bereich bindet und so die Sensitivität der Antigenerkennung stark erhöht [180;245]. Neben einem durch die Interaktion des TCR mit einem antigenbeladenen MHC-Molekül generierten ersten Signal ist zur T-Zell-Aktivierung ein zweites Signal durch kostimulatorische Moleküle unerläßlich. Alle Korezeptoren wirken neben ihrer Funktion als Adhäsionsmoleküle als signalleitende Einheiten und bestimmen über ihre Ligandenbindung (CD2:CD58, CD11a/CD18:CD54, CD28/CTLA-4:CD80/CD86, CD40:CD40L) über die vollständige Aktivierung der T-Zellen. Sie ermöglichen die Aktivierung der T-Zellen bereits durch 50 bis 200 Antigen-MHC-Komplexe [211;319;391]. Immunregulatorische T-Zellen sind CD4+-T-Zellen, die sich durch Antigenkontakt zur Freisetzung von Lymphokinen aktivieren lassen. Mit deren Hilfe können sie spezifische und polyklonale B-Zell-Proliferationen ebenso 1-16 unterstützen wie eine zellvermittelte Entzündungsreaktion. Die Dichotomie in Typ1- und Typ-2-Zellen ist wohl typisch für CD4+ Lymphozyten, kann aber auch in der Population der CD8+ T-Zellen und der γ/δ-T-Zellen nachgewiesen werden. Als Typ1 werden Th1-CD4+- oder Tc1-CD8+-Lymphozyten bezeichnet, welche vor allem IL-2, IFN-γ und TNF-β (LT-α) sezernieren. Analog werden als Typ2 Th2CD4+- oder Tc-CD8+-Lymphozyten definiert, die typischerweise die Zytokine IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13 bilden [1;58;321]. Als Hauptaufgabe von Th1-CD4+-TZellen gilt die Aktivierung von Makrophagen und anderen Effektorzellen (T-Zellen, NK-Zellen) durch die Induktion von CD40, CD80, CD86, MHC-II-Molekülen und TNF-Rezeptoren. Desweiteren spielen sie eine Rolle bei der T-Zell-vermittelten Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ (Delayed type hypersensitivity, DTH) und der Bildung opsonierender Antikörper [90;222]. Die wichtigste Funktion der Th2-CD4+-T-Zellen ist die Interaktion mit B-Zellen und damit die Regulation der humoralen Immunantwort. Th2-Zellen sind vor allem in den parafollikulären Zonen der Lymphknoten und der Milz angereichert, wo sie nach Aktivierung durch dendritische Zellen mit den zu den Follikeln migrierenden B-Zellen in Kontakt treten. Die antigenspezifische Hilfe der Th2-Zellen führt zur Aktivierung, Proliferation und Differenzierung der B-Zellen [175;413]. 1.8. Interaktion von antigenpräsentierenden, T- und B-Zellen Aufgrund der relativ geringen Affinität des T-Zell-Rezeptors für den Antigen-MHCII-Komplex sind zusätzliche adhärenzvermittelnde und signalleitende RezeptorLigand-Paare notwendig, um den Kontakt zwischen T-Zellen und antigenpräsentierenden Zellen oder B-Zellen zu initiieren, zu verbessern und zu stabilisieren [65;208]. Die multivalente Kreuzvernetzung des B-Zell-Rezeptors läßt als initialer Schritt der Aktivierung die ruhende B-Zelle von der G0- in die G1Phase des Zellzyklus eintreten. Bei T-Zell-abhängigen Antigenen erlaubt dann die durch kostimulatorische Oberflächenmoleküle und Zytokine vermittelte T-Zellhilfe [21] die Progression durch den Zellzyklus sowie die weitere Differenzierung zur Plasmazelle [47;156]. Einige bakterielle Polysaccharide, polymere Proteine und Lipopolysaccharide können aufgrund ihrer speziellen Eigenschaften naive BZellen auch ohne weitere T-Zell-Hilfe zur Ausdifferenzierung stimulieren [253;409]. Orte der Interaktion sind die sekundär-lymphatischen Organe, deren 1-17 Aufbau die notwendige Kolokalisation von Antigen, antigenpräsentierenden Zellen (APC), T- und B-Zellen ermöglicht. Naive CD4+T-Zellen treten über hochendotheliale Venulen in die T-Zell-Zonen der Lymphknoten oder der Milz (PALS) ein und erkennen dort mit einer Frequenz von 104-106 Zellen ihr spezifisches Antigen. Die aktivierten T-Zellen induzieren mittels autokriner Stimulation durch IL-2 und der gesteigerten Expression des IL-2-Rezeptors ihren Eintritt in die G1-Phase des Zellzyklus und ihre klonale Expansion [225;287]. Das durch die Ligation des TCR generierte Signal bewirkt in den T-Zellen zudem die Hochregulation des Oberflächenmoleküls CD40-Ligand (CD40L). CD40L ist ein Glykoprotein der TNF-Familie, das auf aktivierten CD4+- und weniger häufig auch auf CD8+-T-Zellen exprimiert wird. Einerseits wird über Signale des CD40L die Differenzierung von T-Zellen zu funktionellen Effektorzellen stimuliert, andererseits fördern Signale über das konstitutiv exprimierte CD40 die Proliferation, die Differenzierung, den Immunglobulin-Klassenwechsel, die FasExpression und auch die Expression von CD80, CD86 und MHC-II-Molekülen auf B-Zellen [22;394;395]. Das Fehlen von funktionellem CD40L im Rahmen eines Xchromosomal vererbten Gendefektes resultiert im klinischen Bild des Hyper-IgMSyndromes. Im Serum der Patienten läßt sich eine stark vergrößerte IgMFraktion, andere Isotypen jedoch nur in stark verminderter Menge nachweisen. Die B-Zellen sind aufgrund der mangelnden Stimulation über CD40 nicht in der Lage einen Klassenwechsel durchzuführen [48;129;255]. Die am besten charakterisierten kostimulatorischen Moleküle sind die Rezeptor-Ligand-Paare von CD28 auf T-Zellen und CD80 (B7.1), respektive CD86 (B7.2) auf APC und BZellen. CD28 gehört der Immunglobulingen-Superfamilie an und ist konstitutiv zu 95% auf allen CD4+ und zu 50% auf allen CD8+ T-Zellen exprimiert. Es generiert unter Einbezug der Src-ähnlichen Tyrosinkinasen Lck, der Lipidkinase PI-3 und der Proteinkinase C das für die Aktivierung naiver T-Zellen kritische zweite Signal neben dem TCR-Signal [146;216]. Fehlt dieses zweite Signal, geht die T-Zelle in einen anergen Zustand über oder wird bei IL-2 Mangel sogar apoptotisch. Die gemeinsame Stimulation über den TCR und CD28 führt zudem zu einer verstärkten Zytokinsekretion durch eine Stabilisierung der mRNA, einer Induktion von Transkriptionsfaktoren wie NFκB und somit zu einer gesteigerten T-ZellProliferation [209;338;354]. CTLA-4 (CD152), der zweite Ligand der B7-Familie, ist ein dem CD28 phylogenetisch verwandtes Molekül. CTLA-4 wird auf aktivierten 1-18 T-Zellen exprimiert, während auf ruhenden T-Zellen nur CD28 nachzuweisen ist. Trotz einer nur 30%igen Homologie ihrer Aminosäuresequenz binden CD28 und CTLA-4 an dieselben Liganden, CD80 und CD86. Verglichen mit CD28 besitzt CTLA-4 jedoch eine 20-30fach höhere Bindungsaffinität für beide Liganden. Neben den Strukturunterschieden des zytoplasmatischen Abschnittes von CTLA4 unterscheiden sich die beiden Moleküle auch in ihrer Wirkung auf T-Zellen. CTLA-4 vermittelt negative Signale, welche die T-Zell-Stimulation durch APC vermindern und in einer eingeschränkten Synthese von IL-2 resultieren [209;284;426]. Dieser funktionelle Antagonismus zu CD28 dient der Gegenregulation der T-Zell-Aktivierung und wird für die Einschränkung der Proliferation und die Terminierung der T-Zell-Antwort mitverantwortlich gemacht. Die physiologischen Liganden von CD28 und CTLA-4 auf B-Zell-Seite sind die Moleküle der B7-Familie [350]. In jüngster Vergangenheit wurden neben den drei etablierten B7-Moleküle B7.1 (CD80), B7.2 (CD86) und B7.3 weitere Homologa dieser Familie beschrieben [350]. CD80 ist ein 60kD schweres, hoch glykosyliertes Protein, das der Immunglobulin-Supergen-Familie angehört. Es ist vor allem auf Makrophagen, aktivierten B- und T-Zellen als homodimeres Molekül exprimiert und dient zusammen mit CD86 der Koregulation der T-Zell-Aktivierung [354;393]. Obwohl beide Rezeptoren zur Ig-Rezeptorfamilie zählen und an dieselben T-Zell-Oberflächenmoleküle binden, weisen die Aminosäuresequenzen nur eine Homologie von 26% auf. CD86 ist ein 80kD schweres, aus 323 Aminosäuren bestehendes Polypeptid. Es wird konstitutiv exprimiert von interdigitierenden dendritischen Zellen in T-Zell-Zonen sekundär lymphatischer Organe, von Monozyten, in geringerem Maße von Langerhans Zellen und peripheren dendritischen Zellen [123;124]. Auf B-Zellen kann CD86 durch in vitro Stimulation des Oberflächen-Immunglobulins, von CD40, von MHC-II-Molekülen, durch PMA (phorbol myristate acetate) mit Ionomycin oder Infektion mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) induziert werden [163;348;388;393]. CD86-mRNA ist bereits in unstimulierten B-Zellen nachzuweisen, läßt sich aber durch Stimulation mit anti-γ-Antikörper entsprechend der Oberflächenexpression auf das Vierfache steigern. CD86 weist für CD152 eine 20-100fach höhere Bindungsaffinität als für CD28 auf. Zudem sind die On/Off-Bindungsraten von CD86 für CD152 höher als die von CD80 [223]. Die kritische Rolle für die Funktion der B-Zelle konnte in der Maus durch Blockade von CD80 und CD86 mit löslichem, transgen-kodiertem 1-19 CD152 eindeutig gezeigt werden. Diese Mäuse wiesen eine Störung des Klassenwechsel der Immunglobuline und der Keimzentrumsarchitektur auf. Des weiteren zeigten CD86 knockout-Mäuse stark defiziente Antikörperantworten, während CD80 knockout Mäuse normale Antikörperantworten aufwiesen [34;348]. Auf T-Zellen wirkt CD86 offenbar wie CD80, indem es ihre Proliferation fördert, Anergie und Apoptose verhindert und die Synthese von IL-2 induziert [210;218]. Der initiale Kontakt zwischen T-Zellen und antigenpräsentierenden Zellen erfolgt nicht über den T-Zell-Antigenrezeptor, sondern geschieht über antigenunspezifische Adäsionsmoleküle. CD11a/CD18 (lymphocyte functionassociated antigen, LFA-1) ist das wichtigste der T-Zell-Adhäsionsmoleküle. Antikörper gegen CD11a/CD18 verhindern sowohl die Aktivierung naiver T-Zellen als auch die Stimulation von Gedächtnis-T-Zellen [227;297]. Als Liganden dienen einerseits die Matrixbestandteile Kollagen und Fibronektin, andererseits CD54 (intercellular adhesion molecule, ICAM-1) und CD102 (ICAM-2). CD54 wird unter physiologischen Bedingungen vor allem auf aktivierten endothelialen Zellen, aktivierten T- und B-Zellen und auf Monozyten exprimiert. Die Interaktion von TZellen mit APC wird durch zusätzliche Bindungen weiter stabilisiert. Hierzu gehören die Interaktion von CD50 (ICAM-3) mit CD11a/CD18 und von CD2 mit CD58 (LFA-3) [126;305;369]. Unerläßlich für eine regelrechte Aktivierung von BZellen ist zudem die Schaffung eines optimalen Mikromilieu durch die Sekretion von Th2-Zytokinen wie IL-4, IL-5, IL-6 oder IL-10 [46;233;254;273]. 1.9. Zytokine Die verschiedenen Zelltypen des Immunsystems setzen Mediatoren frei, die man als Zytokine, Interleukine oder Lymphokine bezeichnet. Aufgabe dieser 10-30 kD großen, löslichen Polypeptide ist es, die Differenzierung und Aktivierung von Effektorzellen des Immunsystemes zu regulieren und ein Netzwerk von Signalen zu bilden, welches die Immunabwehr koordiniert. Die zytokin-produzierende Zelle funktioniert hierbei als Sensor für die physiologischen und pathologischen Einflüsse ihrer unmittelbaren Umgebung. Ein großer Teil der Zytokine wird von aktivierten, immunkompetenten Zellen wie Monozyten und T-Lymphozyten produziert. Sämtliche Zytokinrezeptoren sind in ihrer Funktion signaltransduzierende, multimolekulare Komplexe mit einer hohen Spezifität für 1-20 ihren Liganden. Zytokine können grundsätzlich funktionssteigernde, beispielsweise proliferationsfördernde, oder hemmende Wirkungen entfalten. Charakteristische Kennzeichen sind ihre funktionelle Redundanz und ein ausgeprägter Pleiotropismus in ihrer Wirkung; so besitzt ein Zytokin häufig verschiedene Funktionen für Zellen unterschiedlicher Gewebe und verschiedene Zytokine zeigen ähnliche Wirkungen auf eine Zelle. T-Lymphozyten können anhand ihres Zytokinmusters für ihre Funktion beschrieben werden. Im Rahmen einer TH-1 Antwort, die sich vornehmlich gegen intrazelluläre Pathogene richtet, produzieren die Zellen vornehmlich die Zytokine IL-2, IFNγ und TNFα. Im Rahmen einer TH-2 gewichteten Antwort synthetisieren die Zellen verstärkt IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, und IL-13. TH-2 Zytokine regulieren humorale Antworten gegen extrazelluläre Infektionen [1;90;132;222]. Die für diese Arbeit wichtigen Lymphokine sollen im folgenden kurz vorgestellt werden: 1.9.1. Interleukin-2 Interleukin 2 (IL-2) ist ein 14- bis 17-kD großes Glykoprotein, das vor allem von aktivierten CD4+ T-Zellen produziert wird und als antigenunabhängiger Wachstumsfaktor für T-Zellen dient. Als auto- und parakriner Mediator fördert IL-2 die klonale Expansion reifer T-Zellen, verstärkt die Expression des IL-2-Rezeptors und ist notwendig für die T-Zell-Differenzierung [355;381]. Es spielt eine wichtige Rolle bei der durch Aktivierung induzierten Apoptose reifer T-Zellen [236]. Zudem stimuliert IL-2 die Synthese und Sekretion anderer Zytokine (IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, GM-CSF, IFN-γ), welche sowohl die Hämatopoese als auch die Immunantwort gegenüber Pathogenen regulieren. In Kombination mit anderen Faktoren wie IL-4 und IL-10 induziert IL-2 eine Ausreifung von B-Zellen zu Immunglobulin produzierenden Plasmazellen und stimuliert deren Proliferation [249;251;264]. Auch NK-Zellen, Monozyten und Makrophagen exprimieren den IL2-Rezeptor und werden so durch IL-2 zu einer gesteigerten zytotoxischen Aktivität angeregt. 1-21 1.9.2. Interleukin-4 Interleukin 4 (IL-4), ursprünglich als B-Zell-Wachstumsfaktor (BSF-1, BCGF-1) beschrieben, wird von aktivierten T-Helferzellen, Mastzellen und basophilen Granulozyten ausgeschüttet [23;291]. Es ist von biologischer Bedeutung für die humorale Immunität, die Eosinophilie und die Hemmung der Produktion von Entzündungsmediatoren durch aktivierte Makrophagen. Es vermittelt die frühe Aktivierung von B-Zellen nach Antigenkontakt, die B-Zell-Proliferation und induziert den Klassenwechsel zu IgE und IgG4 [292]. Zugleich stimuliert IL-4 die Expression von MHC-Antigenen und von CD23 in B-Zellen und Monozyten. IL-4 ist ein starker Wachstumsfaktor für aktivierte T-Zellen, Mastzellen und myeloide sowie erythroide Vorläuferzellen. Bei T-Zellen fördert es die Differenzierung von zytotoxischen Effektorzellen und induziert Th0-Zellen zur Polarisierung zu Th2Zellen mit dem typischen Muster sekretierter Zytokine wie IL-4, IL-5, IL-6 oder IL10 [290;374;397]. 1.9.3 Interleukin-10 Interleukin 10 (IL-10) ist ein 17- bis 21-kD-Peptid, das sowohl immunsuppressive als auch immunstimulatorische Eigenschaften besitzt. Es wird vor allem von Th2Zellen, aber auch von B-Zellen, Makrophagen und Mastzellen gebildet. Ursprünglich wurde IL-10 als CSIF (Cytokine Synthesis Inhibitory Factor) benannt, der die Produktion von Zytokinen durch Th1-Zellen hemmt. Im speziellen hemmt es die Synthese von IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α, TNF-β und anderer Chemokine [85;313;438]. Dieser antiinflammatorischen steht eine stimulierende Wirkung von IL-10 auf lymphoide Zellen gegenüber. So fördert es als Kostimulator das Zellwachstum von B-Zellen, die Differenzierung zur Plasmazelle und die Expression von Immunglobulinen [4;46]. Bei NK-Zellen wird die zytotoxische Aktivität verstärkt. Gemeinsam mit IL-3, IL-6, IL-11 und SCF hat IL-10 eine kostimulierende Wirkung auf primitive hämatopoetische Stammzellen, die Thrombozytopoese und die Bildung von Erythrozyten [259;404]. 1-22 1.9.4. Interferon-γ Zwei Familien von Interferonen werden unterschieden: Typ-I-Interferone werden vornehmlich in Antwort auf virale Infekte gebildet, wobei die von Leukozyten synthetisierten als Interferone-α bezeichnet werden, die Interferone anderer Zellen als Interferon-β [384]. Typ-II-Interferon wird auf immunologische und entzündliche Stimuli hin gebildet und auch als Interferon-γ (IFN-γ) klassifiziert [2]. IFN-γ wird vorwiegend von Th1-Zellen, zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) und NK-Zellen sekretiert. IFN-γ ist das wichtigste makrophagenaktivierende Zytokin. Es aktiviert neutrophile Granulozyten und NK-Zellen, fördert die Differenzierung zytotoxischer T-Lymphozyten und die Polarisierung von peripheren T-Zellen zu Th1-Zellen [431]. In B-Zellen fördert es deren Differenzierung und die Synthese von IgG2a [215]. IFN-γ vermag die Replikation von Viren zu hemmen. Es induziert die Expression von MHC-II-Antigenen, zudem von MHC-I-Molekülen, FcRezeptoren, NO-Synthasen und proinflammatorischen Zytokinen in unterschiedlichen Zellen [9;285]. Die Regulation von IFN-γ erfolgt durch antigenoder mitogenvermittelte Stimulation, wobei IL-2 und IL-12 die Synthese synergistisch hochregulieren [141]. 1.9.5. Tumornekrosefaktor-α Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) ist ein 17,5 kD großes, nicht-glykosyliertes Zytokin mit vielfältigen Wirkungen [5;403]. Es wird von Makrophagen, neutrophilen Granulozyten, aktivierten Lymphozyten (Th1 und Th2), einigen CTL, Zellen des RES und von Endothelzellen gebildet. Die Synthese wird durch gramnegative und grampositive Bakterien, Viren, Parasiten, Immunkomplexe, verschiedene Zytokine (z.B. GM-CSF, IL-1, IL-2), Tumorzellen und Komplementfaktoren stimuliert. Aufgrund seiner Entzündungszytokin biologischen charakterisiert, Wirkungen das wird jedoch TNF-α ein breites zuerst als Spektrum unterschiedlicher Wirkungen aufweist: die Hemmung der Proliferation gewisser Tumorzellen, Stimulation des Wachstums von Fibroblasten und Endothelzellen, antivirale Wirkung gegenüber DNA- und RNA-Viren, Induktion von Fieber und Akutphaseproteinen, Stimulation von Apoptose und Induktion von Adhäsionsmolekülen [6;331]. Die Wirkung von TNF-α auf die Zellen des 1-23 Immunsystems verursacht in Makrophagen und Granulozyten die Synthese von Prostaglandinen und proinflammatorischen Zytokinen. Die Bildung von neutrophilen Granulozyten im Knochenmark und ihre Ausschwemmung in die Zirkulation sind ebenfalls durch TNF-α reguliert. Durch die verbesserte Expression von MHC-Molekülen auf antigenpräsentierenden Zellen stimuliert TNF-α die Ausbildung einer spezifischen Immunantwort, es steigert die lytische Aktivität zytotoxischer T-Zellen und induziert als Kostimulator unter anderem die Expression von IL-2, des IL-2-Rezeptors und des IFN-γ-Rezeptors [28]. Eine ähnliche kostimulierende Wirkung wird auch für B-Zellen beschrieben, wo TNF-α das Wachstum und die Synthese von Immunglobulinen fördert [307]. Gehemmt wird die Produktion von TNF-α durch Moleküle wie Dexamethason, Prostaglandin E2, TGF-β, Cyclosporin A, IL-4 und IL-6 [214]. Zwei unterschiedliche Rezeptorketten binden TNF-α in seiner trimeren Form: die Typ-II-Rezeptorkette (75kD, p75, CD120b) bindet TNF-α mit einer zehnfach höheren Affinität als die Typ-I-Rezeptorkette (55kD, p55, CD120a) [378]. Die Expression beider Rezeptorketten ist differentiell reguliert, IL-2 fördert die Expression von p55, während IFN-γ die Bildung von p75 vor allem auf stimulierten T- und B-Zellen induziert. Glukokortikoide hemmen die Expression der TNF-Rezeptorketten [148]. Die Hemmung der Wirkung von TNF-α mittels eines Rezeptorfusionsproteines oder monoklonalen Antikörpers findet ihre klinische Anwendung in der Therapie chronisch entzündlicher Erkrankungen (z.B. rheumatoide Arthritis, Spondylitis ankylosans, chronisch entzündliche Darmerkrankungen) [143;161;299;352]. 2-24 2. Variables Immundefektsyndrom (CVID) 2.1. Krankheitsbild Das Variable Immundefektsyndrom (engl. common variable immunodeficiency syndrome = CVID) umfaßt eine Gruppe von bislang noch nicht genau differenzierten Immundefekten heterogener Ätiologie, die gekennzeichnet sind durch eine defekte Antikörperbildung, stark erniedrigte Serum- Immunglobulinspiegel und einer daraus resultierenden erhöhten respiratorischen und gastrointestinalen Infektanfälligkeit für bakterielle Erreger [76;152;357;359;372]. Das Krankheitsbild ist genotypisch heterogen [66;344], umfaßt unterschiedliche Phänotypen [134;165;361] und zeigt häufig eine starke Verminderung aller Immunglobulin-Isotypen im Serum. Aber auch eine isolierte Verminderung von IgG oder ein gleichzeitiger IgG- und IgA-Mangel zählen hinzu. Nach der selektiven IgA-Defizienz ist das CVID-Syndrom die zweithäufigste humorale Immundefizienz mit einer geschätzten Prävalenz von 1:10000 bis 1:50000 Einwohnern. Männer und Frauen sind in gleichem Maße von der Erkrankung betroffen. Überwiegend handelt es sich bei diesem Antikörpermangelsyndrom um sporadische Fälle, obgleich familiäre Häufungen berichtet wurden [324-326]. Die Krankheit manifestiert sich nach unauffälliger Vorgeschichte und normaler Impfanamnese in allen Altersklassen mit einem Häufigkeitsgipfel in der zweiten und dritten Lebensdekade. Man unterscheidet früh einsetzende Formen, bei denen die Abgrenzung zu kongenitalen Agammaund Dysgammaglobulinämien schwierig sein kann, und die sogenannte Lateonset-Form, die auch als erworbene primäre Hypogammaglobulinämie oder „Adult-onset Hypogammaglobulinemia“ bezeichnet wird [164;351]. Selten beginnt das Krankheitsbild vor dem 6.Lebensjahr. Im Vordergrund der klinischen Symptomatik stehen rekurrente bakterielle Infekte des oberen und unteren Respirationstraktes, vorwiegend verursacht durch Infektionen mit Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae oder Mycoplasmen [76;237;301]. Vielfach wird die Hypogammaglobulinämie erst festgestellt, wenn bereits chronische Bronchiektasen und ein erheblicher Lungengerüstumbau vorliegen [186;237]. Etwa die Hälfte der Patienten leidet unter gastrointestinalen Störungen im Sinne eines sprueähnlichen Bildes. Blähungen, Durchfallneigung, Malabsorption und 2-25 mäßig ausgeprägte Steatorrhö bilden die dominierenden Beschwerden. Rezidivierenden Diarrhoen sind meist hervorgerufen durch Infektionen mit Campylobacter jejuni oder Candida albicans; in ca. 60% der unbehandelten Patienten findet sich eine chronische Besiedelung der Gallenblase und des Duodenum mit Giardia lamblia [76;101;415]. Selten sind Haut, Skelett oder Harntrakt von bakteriellen Infektionen befallen. Lymphoproliferative Störungen, wie eine Splenomegalie oder eine diffuse Lymphadenopathie, sind bei bis zu 1/3 der CVID-Patienten festzustellen [76;425]. Bei 20-30% der neu diagnostizierten und unbehandelten Patienten läßt sich eine villöse Atrophie des Dünndarmes und eine noduläre lymphatische Hyperplasie (NLH) der Schleimhaut nachweisen [61;74;415]. Daneben kommt es zur Schleimhautatrophie im Dünndarm und im Antrum des Magen mit Hypazidität. Als Ausdruck der sich teils zusätzlich entwickelnden T-Zell-Defizienz ist die Inzidenz maligner Tumoren des lymphoretikulären Gewebes, des Gastrointestinaltraktes und der Haut bei CVIDPatienten um das 23-100fache erhöht [15;62;76;140;286;407;433;440]; seltener finden sich Tuberkulose, Mykosen oder Pneumocystis-carinii-Pneumonien. Autoimmunerkrankungen wie perniziöse Anämien, hämolytische Anämien, Autoimmunthrombozytopenien und -neutropenien, nicht-erosive Polyarthritiden, systemischer Lupus erythematodes sowie chronisch entzündliche Darmerkrankungen (M.Crohn) treten insbesondere bei erkrankten Frauen mit einer Inzidenz von bis zu 30% auf [76;115;204;357;357;359]. Eine weitere Untergruppe von Patienten (bis zu 25%) weist eine chronisch granulomatöse Entzündung mit sarkoid-ähnlichen, nicht-verkäsenden Läsionen in Leber, Lunge, Knochenmark u.a. Organen auf [76;187;364;398;432], für die kürzlich eine starke Assoziation mit einem seltenen Allel des Tumornekrose-Faktors gefunden wurde [262]. Für die Diagnosestellung fordert die WHO-Klassifikation den Ausschluß anderer primärer humoraler Immundefektsyndrome [324;326]. So wird man bei Patienten mit erhöhten oder hochnormalen IgM-Spiegeln nach einem Hyper-IgMSyndrom suchen; bei männlichen Patienten mit stark erniedrigten oder nicht nachweisbaren Serum-Immunglobulinen und einer verminderten B-Zell-Zahl sollte eine Variante der X-chromosomal vererbten Agammaglobulinämie (XLA) durch Analyse der B-Zell-Tyrosinkinase (btk) ausgeschlossen werden [66;188;256;401;421]. Wenn kein X-chromosomal gebundener Erbgang vorliegt, muß eine autosomal rezessive Agammaglobulinämie z.B. eine Mutation der 2-26 Immunglobulin-µ-Kette gesucht werden [50;429]. Des weiteren sind alle sonstigen bekannten Ursachen von Antikörpermangelzuständen auszuschließen, wie monoklonale Gammopathien, lympho-retikuläre Malignome, nephrotisches Syndrom, exsudative Gastroenteropathie, Malnutrition, gesteigerter Katabolismus oder eine langanhaltende Antikörperbildung in immunsuppressive Gegenwart normaler Therapie. oder Bei gestörter sogar erhöhter Immunglobulinspiegel ist auch eine HIV-Infektion in Betracht zu ziehen [178;185;277;324;326;335]. Wichtigstes Kriterium zur Diagnose eines Variablen Immundefektsyndromes ist neben der beschriebenen Klinik mit rekurrenten bakeriellen Infektionen und der persitierenden Hypogammaglobulinämie, das Fehlen von terminal differenzierten B-Lymphozyten oder Plasmazellen [71;76;341]. Damit einhergeht die fehlende Bildung von Antikörpern nach Stimulation mit spezifischen Antigenen [43;198]. Ein wichtiger Parameter für die Beurteilung der immunologischen Kompetenz ist die Hauttestreaktion auf diverse Impf- und Umweltantigene. Hierzu eignet sich die standardisierte Anwendung des Multitest Merieux. Neben einer Glycerinkontrolle enthält der Hautimpfstempel folgende Antigene: Tuberkulin, Trichophytin, Candidin, Proteus, Streptokokkenantigen sowie Tetanus- und Diphterietoxoid. Die Ablesung erfolgt nach 20 Minuten, 24, 48, 72 Stunden. Hautreiz und Juckreiz innerhalb von 20 Minuten deuten auf eine IgE-vermittelte allergische Sofortreaktion hin (Typ I nach Coombs und Gell). Hautrötungen nach 24 Stunden entsprechen einer Arthus-Reaktion (Typ III), die durch präzipitierende Antikörper der Klasse IgG verursacht wird. Rein zellulär vermittelte Spättypreaktivität wird nach 72 Stunden erfaßt. Zudem kann man die Antikörpertiter des Patienten gegen verschiedene Impfantigene im Serum bestimmen (Diphterie-, Tetanusantitoxine, Isoagglutinine, Masernantikörper). Im allgemeinen findet man bei CVID-Patienten eine ausgeprägte Hyporeaktivität im Multitest Merieux, insbesondere im Zeitraum nach 24-48 Stunden, und bei der quantitativen Antikörperbestimmung erniedrigte Serumspiegel für IgG und IgA, teils auch für IgM. Eine für primäre Immundefizienz verdächtige Anamnese und klinische Untersuchung in Verbindung mit einem pathologischen Merieux-Test oder einer Erniedrigung der Serumimmunglobuline geben Anlaß zu einer weitergehenden zellulären In-vitro-Diagnostik. Diese Untersuchungen werden an mononukleären Zellen aus peripherem Venenblut durchgeführt und lassen sich unterteilen in die Quantifizierung und 2-27 Phänotypisierung mittels Funktionstestung der durchflußzytometrischer entscheidenden Methoden Zellpopulationen. Der sowie die humorale Immundefekt wird bei CVID-Patienten durch eine Substitutionstherapie mit intravenösen γ-Globulin-Gaben korrigiert, ergänzt durch eine adäquate und konsequente antimikrobielle Therapie bei Infekten. Die Immunglobulin-Gaben erfolgen alle 4-6 Wochen unter ärtzlicher Überwachung. Die Dosierung sollte so gewählt werden (200-400mg/kg Körpergewicht), dass zwischen den γ-GlobulinInfusionen die IgG-Serumkonzentration nicht unter 4-5g/l absinkt. Die Prognose hängt von der Früherkennung und -behandlung der Krankheit ab, bevor rezidivierende Infekte zu irreversiblen Organschädigungen wie Brochiektasen geführt haben [76;165;358]. 2.2 Pathogenese Trotz vielfältiger Untersuchungen und zahlreicher Hypothesen zur Pathogenese konnte die Ursache des CVID bislang nicht geklärt werden. Ursprünglich wurden intrinsische B-Zelldefekte mit einer gestörten Reifung und Funktion der Zellen angenommen[81;83;322;323;341]. Später wurden eher T-Zelldefekte als Ursache vermutet, wobei sowohl eine vermehrte Suppression [24;412;425]als auch eine verminderte Hilfefunktion für B-Zellen angenommen wurden [289;411]. Auch eine defekte Antigenpräsentation [99;100] und chronische Virusinfekte wurden als Ursache des CVID erwogen [263;362;417;418] und zum Teil auch wieder verworfen [333;335;382]. Bei einzelnen Patienten wurden funktionelle Defekte von dendritischen Zellen [111] und Makrophagen [116] beschrieben. Die meisten neueren Arbeiten gehen von einer Störung der T-B-Zellkooperation ("cognate T-B-interaction") aus mit einem veränderten Muster der produzierten Zytokine durch die beteiligten T-Zellen und daraus folgend einer unzureichenden B-Zellaktivierung. Aus einer gestörten Interaktion von T- und B-Zellen resultieren Störungen der spezifischen Antikörperbildung und "Switch-Defekte", beides Befunde, die typischerweise bei CVID-Patienten vorliegen [258;325]. Insbesondere eine Verminderung der Synthese von IL-2 [77;78;118;332], IL-4 [289] und IL-9 [160] und eine Steigerung der Expression von IFN-γ und TNF-α [159;279] wurde beschrieben. Unauffällig verhielt sich die Expression von IL-6 und dessen Rezeptors [183] sowie von IL-10 [283;434]. Kürzlich beschrieben 2-28 wurde eine erhöhte Frequenz IL-12 positiver Monozyten nach Stimulation mit LPS, assoziiert mit einer gesteigerten Produktion von IFN-γ durch T-Lymphozyten [53]. Aus den gefundenen Veränderungen wurden Vermutungen über ein verändertes Mikromilieu zugunsten einer Th1-Antwort bzw. einer Suppression und eine gestörte Keimzentrumsreaktion abgeleitet. Zugrunde liegen könnte eine gestörte Signaltransduktion sowohl in T-Zellen [18;117;119;232;383]) als auch in B-Zellen [189;346]. Im Sinne phänotypischer Veränderungen von Zelloberflächenmolekülen wurde eine verminderte Expression des CD40-Liganden (CD154) [42;113] und von LSelektin (CD62L) [276] nach T-Zellaktivierung wie auch einzelne Fälle einer defekten CD80- Expression [258] beschrieben. Eine gesteigerte Expression von CD95 und eine erhöhte Apoptoserate wurden ebenfalls beschrieben und spielen möglicherweise eine Rolle bei Patienten mit niedrigen peripheren B-Zell-Zahlen [88;151;170;342]. Die Beobachtung einer gestörten Memory-Funktion im T- und B-Zellkompartiment mit einer verminderten Zahl antigenspezifischer T-Zellen nach Immunisierung mit Neoantigenen wie KLH (keyhole limpet hemocyanin) weist ebenfalls in die Richtung einer gestörten T-B-Interaktion [130;198;370]. Bei einem überwiegenden Teil der Patienten lassen sich die B-Zellen durch angemessene Stimuli in vitro zur regelrechten Expression von Aktivierungsmarkern wie CD69 stimulieren. B-Zellen vieler CVID-Patienten proliferieren nach Stimulation mit antiIgM in Kombination mit IL-2 oder IL-4 in vitro normal [43;110;272-274;289], gelangen aber nicht von der Proliferations- in die Differenzierungsphase [341]. Bei anderen Patienten finden sich Immunglobuline der Klasse IgG auf der Zelloberfläche der B-Zellen, werden aber nicht sekretiert [360]. Der IgKlassenwechsel findet hier also offensichtlich statt, aber die Ig-Sekretion ist gestört [303;349;363]. Bei einigen Patienten kann auch die Ausreifung der B-Zelle zu einer Ig-sezernierenden Plasmazelle durch in vitro Stimulation erreicht werden [272;273;334;343;360;405]. Die Stimulation von B-Lymphozyten über das CD40 Molekül unter Zugabe von Interleukin-10 für die Dauer von 96 Stunden löst bei einigen Patienten die Synthese von Immunglobulinen aller Klassen aus, bei den meisten anderen Patienten zumindest eine IgM-Synthese [102;274;304]. Nach in vitro Infektion der B-Zellen mit dem Eppstein-Barr-Virus (EBV) über den EBVRezeptor CD21 kann bei den meisten Patienten eine konstitutive IgM- und 2-29 seltener IgG-Synthese nachgewiesen werden [81;294]. Auch wurden Einzelfälle von CVID-Erkrankungen nach stattgehabter EBV-Infektion in vivo berichtet [439]. In einer Untergruppe von CVID Patienten konnte eine persistierende Aktivierung des TNF-Systems mit erhöhten Serumspiegeln des Zytokines TNFα und der löslichen Form der beiden TNF-Rezeptoren (p55-TNFR syn. CD120a, p75-TNFR syn. CD120b) nachgewiesen werden [19]. Für eine Untergruppe von CVIDPatienten mit Granulomen in verschiedenen Organen (Leber, Lunge, Knochenmark u.a.) [76;364;432] wurde kürzlich eine starke Assoziation mit dem seltenen TNF+488A Allel beschrieben [262]. Genetische Untersuchungen betroffener Familien und entsprechende Linkage-Analysen ergaben eine Assoziation der Erkrankung mit bestimmten HLA-Haplotypen wie HLA-DR3, DQB1*0201, -B8, -B9, C4AQ0 und -A1 [80;82;344;345;406;408] [67]. Bei einer bisher geringen Anzahl von Patienten wurde eine stark verminderte Frequenz somatischer Hypermutationen in den Ig V Genen der Memory B-Lymphozyten sowie funktionelle B-Zell-Defekte nachgewiesen [220]. Bei diesen Patienten, die leider nicht hinsichtlich ihrer Immunglogulinsynthese in vitro klassifiziert wurden, handelt es sich am ehesten um Patienten der Gruppe A. Bei einem Teil der CVIDPatienten konnte eine gestörte Affinitätsreifung der synthetisierten Immunglobuline nachgewiesen werden [33]. 2.3. Klassifikation Die beschriebenen Befunde sind in Abhängigkeit vom Patientenkollektiv zum Teil recht widersprüchlich. Es wurde eine Klassifikation anhand der ImmunglobulinSynthese in vitro eingeführt, da sich gemeinsame pathogenetische Prinzipien am ehesten bei Patienten innerhalb dieser Untergruppen finden würden. Zudem ermöglicht eine solche Einteilung, Ergebnisse verschiedener Untersuchungen besser miteinander vergleichen zu können. Durch Phänotypisierung und funktionelle Analyse von peripheren Blutlymphozyten sowie aufgrund histologischer Befunde lassen sich 5 Untergruppen des CVID-Syndromes unterscheiden [43;332]: 2-30 Untergruppen des CVID-Syndromes: 1. Normale periphere T- und B-Zellzahlen: A: keine IgM- und IgG-Synthese in vitro (nach SAC + IL-2) B: IgM-, aber keine IgG- Synthese in vitro C: normale IgM- und IgG-Synthese in vitro 2. Verminderte Anzahl von B-Zellen, normale T-Zellen 3. CVID mit Granulomen (TNF +488A Allel positiv) Patienten der Untergruppen 1A-C unterscheiden sich in vivo weder hinsichtlich der Klinik noch ihrer Serum-Ig-Spiegel oder weiterer phänotypischer Merkmale. Typische Veränderungen, die bei Verdacht auf einen Immundefekt bereits im routinemäßig durchgeführten Immunstatus auffallen und zur Diagnose eines CVID-Syndromes führen, sind [76;110;295;324;326;358;359;361;363]: 1. persitierende Hypogammaglobulinämie mit stark erniedrigten Serumspiegeln für IgG und IgA, meist auch für IgM 2. hochgradig gestörte terminale B-Zellreifung zu Plasmazellen bei T-Zellabhängiger (Pokeweed) und T-Zell unabhängigr (SAC + IL-2) B-ZellStimulation in vitro: Typ A mit fehlender Ig-Synthese aller Isotypen in vitro, Typ B mit erhaltener Synthese von IgM, jedoch nicht von IgG und IgA und Typ C mit erhaltener Synthese aller Isotypen in vitro 3. normale T-Zell-Untergruppen und Funktionen (Proliferation, Zytokinsynthese) mit erniedrigter CD4/CD8 Ratio und vermehrter Expression von T-Zell-Aktivierungsmarkern in 30-40% der Fälle 4. normale bis erniedrigte B-Zellzahlen mit stark erniedrigtem Anteil klassengewechselter B-Memory Zellen [414] Für die Diagnosestellung eines CVID-Syndromes ist zum heutigen Zeitpunkt der Ausschluss einer X-linked Agammaglobulinämie (XLA), eines X-linked Hyper-IgM Syndromes (XHIM) und eines Non-XHIM anhand des klinischen Phänotypes, der Erhebung der Immunantwort, dem Nachweis der Bruton Tyrosin Kinase (Btk) in Monozyten oder Blutplättchen und der normalen Expression des CD40-Liganden auf aktivierten T-Zellen unbedingt zu fordern [3;75]. 3-31 3. Fragestellungen der Arbeit Ausgehend von der Beschreibung schwerer Hypogammaglobulinämien in Mäusen, in denen das Gen für den TNFα-Rezeptor ausgeschaltet (-/-) wurde [121;270;399], ergab sich zunächst die Frage nach möglichen Veränderungen im TNFα-System der CVID-Patienten. Untersucht werden sollten einerseits das sezernierte Protein vorstimulierten mittels T-Lymphozyten einer intrazytoplasmatischen und der Untersuchung Anfärbung eines in möglichen Polymorphismus des kodierenden Genes für TNFα in Zusammanarbeit mit Herrn Prof.Gerdes am Forschungszentrum Borstel. Auf der anderen Seite war die regelrechte Expression der entsprechenden Rezeptoren (TNFα-R 55kD und 75kD, entspr. CD120a und b) auf den Zielzellen zu prüfen. Ausgehend von dieser anfänglichen Fragestellung wurden die Untersuchungen um den umfassenderen Aspekt der regelrechten Interaktion von T- und B-Lymphozyten erweitert [65;69;288]. Neben der Interaktion des TCR mit MHCII-Molekülen auf BLymphozyten nehmen die Ligandenpaare CD40-CD40L sowie die Moleküle der B7-Familie und der Rezeptoren CD28/CTLA-4 auf T-Zellen eine zentrale Rolle in der T-B-Kooperation ein [22;30;34;79;142;182;271;365]. Die Kostimulation über das Oberflächenmolekül CD40 kann ein Signal vermitteln, das Proliferation und Ig-Klassenwechsel in B-Lymphozyten bedingt und deren Apoptose verhindert [72;129;430]. Bei einem Teil der Patienten mit Variablem Immundefektsyndrom wurden Defekte in der IL-2-Synthese der T-Lymphozyten beobachtet [77;78;118;332]. Die Kostimulation der T-Zellen über CD28 durch Interaktion mit den Liganden B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86) auf der APC bewirkt eine IL-2Synthese und die Proliferation der T-Zellen [106;210;218;390;430]. Ohne diese CD28/B7-Stimulation werden die T-Zellen anerg und produzieren kein IL-2. Das Zytokin IL-2 jedoch hat wiederum entscheidenden Einfluß auf die Differenzierung der B-Lymphozyten zu antikörperproduzierenden Plasmazellen [51;293]. Eine Reihe von für die Kooperation der verschiedenen Zelltypen wichtigen Oberflächenmoleküle und immunregulatorischen Zytokinen wurden analysiert. Auf CD19+ B-Lymphozyten waren dies: CD21, CD22, CD23, CD54, CD69, CD80, CD86, auf T-Lymphozyten: CD3, CD4, CD8, CD40L, CD69, CD95, CD120a, CD120b, auf Monozyten: CD14, CD86, CD119. In vorstimulierten CD4+ und 4-32 CD8+ T-Lymphozyten wurde die Expression der Zytokine IL-2, IL-4, TNFα und IFNγ analysiert. Stimulationsversuche, in denen die verschiedenen Aktivierungswege in T- und B-Lymphozyten nachgeahmt wurden, ermöglichten die Überprüfung ihrer funktionellen Regelhaftigkeit. B-Lymphozyten wurden mittels monoklonaler Antikörper, die gegen das Oberflächenimmunglobulin der Klasse M oder gegen das kostimultorischen Molekül CD40 gerichtet waren, unter Zusatz der Zytokine IL-2 und IL-10 stimuliert. T-Lymphozyten wurden analog über den T-Zellrezeptor (TCRαβ, BMA031) oder das Oberflächenmolekül CD3 (BMA030) aktiviert. Zum Ausschluß stimulatorischer oder inhibitorischer Interaktionen wurden die Ergebnisse, die mit unfraktionierten mononukleären Zellen gewonnen wurden, mit hoch aufgereinigten Zellen der verschiedenen Zellpopulationen überprüft. In Stimulationskulturen peripherer MNC mit SAC+IL-2 oder PWM (1:200, 1:400, 1:800) über einen Zeitraum von 9 Tagen wurde die Einteilung der Patienten gemäß der Klassifikation nach Bryant et al. auf ihre Richtigkeit und zeitliche Konstanz überprüft. Angestoßen durch auffällige Befunde in der Oberflächenexpression von CD86 auf B-Lymphozyten wurde eine quantitative Bestimmung der mRNA für CD86 durchgeführt. Zudem wurden EBVtransformierte B-Zell-Linien der Patienten etabliert und deren Fähigkeit zur Expresssion von CD86 und zur Synthese von Immunglobulinen getestet. 4. Patienten und Kontrollen Die Patientengruppe umfaßte 6 Frauen und 12 Männer im Alter von 11 bis 77 Jahren, deren Diagnose eines Variablen Immundefektsyndromes (CVID) anhand der diagnostischen Kriterien der WHO-Expertengruppe für primäre Immundefizienzen gestellt worden war [324-326]. Die Patienten unterschieden sich im Zeitpunkt der Erstdiagnose wie auch der Krankheitsdauer. Als Kontrollkollektiv dienten gesunde Frauen (4) und Männer (6) im Alter von 23 bis 53 Jahren. 4-33 80 70 Lebensalter in Jahren 60 50 40 30 20 10 0 HD A NA Fig.1. Altersprofil der Patienten und Kontrollen zum Zeitpunkt der Testung Die immunologische Charakterisierung, der B-Zell-Phänotyp und die in vitro Antworten auf Stimulation mit SAC+IL-2 und PWM sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Sämtliche Patienten erhielten im regelmäßigen Abstand von 4 bis 6 Wochen eine intravenöse Substitutionstherapie von Immunglobulinen (Sandoglobin oder Polyglobulin; 300mg/kg KG) und wiesen zum Zeitpunkt der Blutabnahme keinerlei klinisch bedeutsame Infektionen auf. Familiäre Fälle von CVID wurden nicht ausgeschlossen. CVID-Patienten mit sarkoidose ähnlichen Granulomen [187;357;364;432], die für eine Untergruppe von CVID Patienten mit progressiver TZell-Defizienz und einem Polymorphismus des TNF-α Genes [262] typisch sind, befanden sich nicht in dem Kollektiv der 18 Patienten. w w m m 53 35 23 77 58 44 GWR MFT INL MMR JBK HBR m m m 32 11 73 44 ESR MHA MWR BRZ m w w 23 39 34 53 26 27 33 29 36 25 ADZ RDR JGH KDZ CHN ESK POO MBN KWR TGE * nicht vorhanden m 38 DAR w DER m m m w w m m m 38 30 MKR m m w 27 74 PLS BMR w w m m 28 33 CAS JMN HD HD HD HD HD HD HD HD HD HD C C C B B B B B B B B A A A A A A A 30 GLT m Alter Geschlecht Typ Kürzel 2,1 2,6 3,5 10,8 2,9 5,7 16,7 11,1 4,7 6,4 4,2 4,0 8,1 3,1 5,4 13,7 4,7 8,6 6,7 13,7 7,3 6,7 20,8 7,8 0,5 18,6 0,6 1,8 %CD19+ 81 83 76 68 83 76 n.v. 68 80 93 81 94 93 95 91 99 98 94 95 96 88 94 96 93 n.v.* 98 94 83 %sIgM+ 80 83 75 68 80 81 n.v. 81 83 90 81 92 97 94 91 99 95 90 96 92 93 93 94 93 n.v. 98 97 93 97 96 93 99 97 98 99 n.v. 94 97 94 99 98 95 48 95 n.v. n.v. n.v. 93 96 98 94 87 98 95 72 82 n.v. n.v. n.v. 98 97 99 100 n.v. 100 99 n.v. n.v. 100 n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. 100 99 100 99 96 100 99 100 99 n.v. n.v. n.v. 80 88 82 90 n.v. 90 94 n.v. n.v. 95 n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. n.v. 64 90 90 83 64 91 75 57 52 %sIgD+ %CD21+ %CD22+ %CD23+ native CD19+ B-Zellen Tabelle 1: Immunologische Charakterisierung der Patienten und Kontrollpersonen >7500 >7500 >7500 n.v. n.v. >7500 >7500 >7500 >7500 >7500 >7500 >7500 >7500 >7500 >7500 7313 >7500 6616 >7500 >7500 1942 0 76 99 0 71 0 246 SAC+IL-2 991 >7500 3497 n.v. n.v. 0 1245 1378 0 68 618 0 5120 387 0 0 331 975 815 979 0 0 0 0 0 0 0 0 PWM 1:200 IgM-Synthese in vitro (ng/ml) >1500 >1500 >1500 n.v. n.v. 372 >1500 >1500 >1500 942 >1500 >1500 1122 222 648 179 84 162 236 751 0 0 217 0 0 0 0 9 SAC+IL-2 836 >1500 >1500 n.v. n.v. 375 >1500 >1500 >1500 244 >1500 144 919 209 258 206 0 112 218 123 0 62 32 0 0 0 0 52 PWM 1:200 IgG-Synthese in vitro (ng/ml) 5-35 5. Material und Methoden 5.1. Blutabnahme Für jeden Testansatz wurden 50-80ml venöses Blut eines CVID-Patienten unmittelbar vor der Substitutionstherapie und entsprechend Blut eines gesunden Spenders abgenommen. Dieses wurde durch Schütteln für 10’ in einem 50ml Erlenmeyerkolben, in dem sich eine vordefinierte Anzahl von Glaskugeln befand, defibriniert. Der Vorteil dieses Schüttelblutes gegenüber EDTA- oder Citratblut liegt in der besseren Trennbarkeit der zellulären Bestandteile voneinander und der Elimination von Thrombozyten. 5.2. Isolierung mononukleärer Zellen Sämtliche Untersuchungen wurden an gereinigten Lymphozyten durchgeführt, die auf folgende Weise isoliert wurden. Das Schüttelblut wurde 1:2 mit PBS verdünnt und zu je 20ml in 50ml Zentrifugenröhrchen über 15ml Ficoll-Trennlösung geschichtet. Die Röhrchen wurden zur Auftrennung der zellulären Bestandteile des Blutes für 20’ bei 900xg (1960U/min) zentrifugiert. Nach der Dichtezentrifugation befanden sich die Erythrozyten am Boden des Röhrchens, darüber eine dünne Schicht von Granulozyten gefolgt von der Ficoll-Trennlösung. Die mononukleären Zellen mitsamt der Monozyten befanden sich in der Interphase zwischen Ficoll und Blutserum. Diese wurden abpipettiert, 1:2 mit R0 (s.Tab.2) verdünnt und erneut für 10’ bei 900xg zentrifugiert. Der zellfreie Überstand wurde dekantiert, das Zellpellet in 5ml R10Medium resuspendiert und erneut für 10’ bei 200xg (920U/min) zentrifugiert. Ein Aliquot der in R10 (s.Tab.2) aufgenommenen Zellen wurde mit 3%iger Essigsäure 1:20 verdünnt und in einer Neubauer-Zählkammer unter einem Phasenkontrastmikroskop ausgezählt. Die gewonnen peripheren Blutlymphozyten wurden für die weiteren Versuche auf Konzentrationen von 5-10x106 /ml eingestellt. 5-36 Verdünntes Vollblut (1:2 mit PBS, 20ml) Serum Zentrifugation 20‘ bei 900g (1960U/min) Interphase mit Lymphozyten und Monozyten Ficoll Granulozyten Ficoll (15ml) Erythrozyten Fig.2. Ficoll-Gradient zur Isolierung der mononukleären Zellen 5.3. Oberflächenfärbung mittels direkt-konjugierter Antikörper Nach der Isolierung der nativen PBMC oder nach erfolgter Stimulation in den verschiedenen Ansätzen wurde zur Färbung von Oberflächenantigenen stets auf dieselbe Weise verfahren. Die Zellen wurden in R10-Medium aufgenommen, 10min bei 200xg zentrifugiert und in einer Konzentration von 5 Mio. Zellen/ml in R10Medium resuspendiert. Zum Färben wurden 5-10µl der konjugierten monoklonalen Antikörper in den Standard-Polystyrol-FACS-Röhrchen vorgelegt, 100µl der Zellsuspension zugegeben, mittels Vortex gemischt und im Dunkeln bei 4°C für 30' inkubiert. Nach Hinzufügen von 1ml PBS/1% Azid-Lösung wurden die Röhrchen für 5min bei 200xg zentrifugiert, der Überstand vorsichtig dekantiert und das Zellpellet in 400µl PBS/1% Azid-Lösung resupendiert. Der Zusatz von Azid hemmt die Atmungskette und soll somit ein shedding von Oberflächenmolekülen verhindern. Die Proben wurden auf Eis gelagert und unverzüglich im Durchflußztometer analysiert. 5-37 Tab.2. Liste der verwendeten monoklonalen Antikörper und Reagenzien Antigen Antikörper Spezifität/Funktion des Antigen Clone UCHT1 - RPE, Clone UCHT1 - FITC (Dako; Glostrup, Denmark) PerCP Cat.#347344 (Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA) T-Zellen, Thymozyten; assoziiert mit dem Antigenrezeptor von TZellen; notwendig für die Oberflächenexpression des T-ZellRezeptors und die Signalvermittlung über diesen Rezeptor MHCD0405 - APC (Caltag Lab., Burlingame, CA, USA) T-Helferzellen, Thymozyten Subsets, Monozyten, Makrophagen u.a.; Korezeptor für die MHCKlasse-II-restringierte antigeninduzierte T-Zell-Aktivierung; Regulation der T-B-Zell-Adhäsion unabhängig von der Antigenerkennung; Differenzierung im Thymus; Rezeptor für HIV PE Cat.#30195X (Pharmingen, San Diego, CA, USA) T-Zellen, Thymozyten, eine Untergruppe von B-Zellen; moduliert die Signaltransduktion des Antigen-Rezeptor-Komplexes (TCR, BCR); bindet an CD72 FITC Cat.#347313 (BectonDickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA) zytotoxische T-Zellen, Thymozyten Subsets; Korezeptor für MHCKlasse-I-Moleküle; bindet Signalmoleküle an der zytoplasmatischen Seite der Membran CD10 PE Cat.#1915 (Immunotech, Marseille Cedex, France) B- und T-Vorläuferzellen, Zellen des Knochenmarkstroma; ZinkMetalloproteinase; Marker für akute lymphatische Leukämie der Prä-BZellen (CALLA) CD14 Clone RMO52 Cat.#0643 (Immunotech, Marseille Cedex, France) Monozyten, Makrophagen, polymorphkernigen Leukozyten u.a.; Rezeptor für Endotoxin (LPS) CD3 CD4 CD5 CD8 5-38 Clone 3G8 Cat.#0813 (Immunotech, Marseille Cedex, France) NK-Zellen, Monozyten, Makrophagen, Neutrophile; FcgR, bindet Immunkomplexe CD19 Clone J4.119 Cat.#1313 (Immunotech, Marseille Cedex, France) B-Zellen; FDC; exprimiert vom proB-Zell Stadium bis zur reifen BZelle, Verlust bei Ausreifung zur Plasmazelle;, Korezeptor für BZellen, Modulation der Signaltransduktion; bildet einen Komplex mit CD21 und CD81; Einfluss auf B-Zell-Entwicklung, Aktivierung und Differenzierung CD19 Clone HD37 - FITC (Dako; Glostrup, Denmark) CD16 Clone B-ly4 - RPE (Pharmingen, San Diego, CA, USA) reife B-Zellen, FDC, manche epithelialen Zellen; schwache Expression auf peripheren T-Zellen und unreifen Thymozyten; Rezeptor für C3d, C3dg, iC3b und EBV; bildet mit CD19, CD81 und Leu13 einen Signaltransduktionskomplex für BZellen CD22 Clone SJ.10.1H11 - PE (Immunotech, Marseille Cedex, France) reife B-Zellen, zytoplasmatische Expression in späten Pro- und frühen Prä-B-Zellen; Adhäsion von B-Zellen an Monozyten und TZellen; Modulation der Signaltransduktion in B-Zellen CD23 reife B-Zellen, Monozyten, Eosinophile, FDC, Thrombozyten; niedrigaffiner Rezeptor für IgE Clone M-L233 - RPE (Pharmingen, (FcERII), Einfluß auf die IgESan Diego, CA, USA) Synthese, pro-inflammatorische Funktion; Ligand für den CD19CD21-CD81-Komplex CD21 5-39 CD27 Memory B-Zellen, aktivierte CD45RA+ T-Zellen, NKZellen,medulläre Thymozyten; FITC Cat.#F7178 (Dako; Glostrup, kostimulatorisches Signal für die TDenmark) und B-Zell-Aktivierung; Interaktion mit CD70 reguliert die B-ZellProliferation und Differenzierung durch T-Zellen CD28 9.3 ascites (Geschenk von P.Linsley, Bristol-Myers Squibb, Seattle, WA, USA; 1:5000) reife CD3+ Thymozyten, periphere T-Zellen, aktivierte B-Zellen, Plasmazellen; Ligand für CD80, CD86, assoziiert mit PI3-Kinase, ITK, GRB-2-SOS; Kostimulation der T-Zell-Proliferation, Effektorfunktion und T-Zellabhängigen Antikörper-Produktion Clone mAB89 (Immunotech, Marseille Cedex, France) pan-B-Zell-Marker, Monozyten, FDC, interdigitierende Zellen (IDC); bindet den CD40L; involviert in Wachstum, Differenzierung und Isotyp-Switching von B-Zellen, antiapoptotisches Signal für Keimzentrums-B-Zellen CD54 Clone HA58 - RPE (Pharmingen, San Diego, CA, USA) ICAM-1; aktivierte T- und B-Zellen, aktiv. Monozyten, Endothelzellen u.a.; interagiert mit CD11a/CD18Integrin (LFA-1), CD11b/CD18Integrin (Mac-1); interzelluläres Adhäsionsmolekül, Rezeptor für Rhinoviren CD62L FITC, Immunotech (Marseille Cedex, France) periphere B-, T-Zellen, Monozyten, Granulozyten, NK cell subsets; Homing von Lymphozyten PE Cat.#347827 (BectonDickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA) aktivierte T-, B- und NK-Zellen, Thrombozyten; sehr frühes, funktionelles Aktivierungsantigen (VEA), fördert Ca2+- Influx, ZytokinSynthese u.a. CD40 CD69 5-40 PE Cat.#340294 (BectonDickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA) aktivierte B-Zellen, T-Zellen und Monozyten, konstitutive Expression auf dendritischen Zellen; Koregulator der T-Zell-Aktivierung, Ligand für CD28 und CTLA-4 (CD152) CD86 Clone 2331 (FUN-1) - RPE (Pharmingen, San Diego, CA, USA) aktivierte B-Zellen, Monozyten, konstitutive Expression auf IDC, demdritischen und LangerhansZellen; Koregulator der T-ZellAktivierung, Ligand für CD28 und CTLA-4 (CD152); wichtige Rolle für die Induktion und Regulation von Immunantworten CD95 Clone DX2 - RPE, Cat.#33455X (Pharmingen, San Diego, CA, USA) Apo-1, Fas; aktivierte T- und BZellen; bindet TNF-ähnlichen FasLiganden, Mediation apoptoseinduzierender Signale CD119 PE/Isotyp IFNg-R; Monozyten, Makrophagen, B-Zellen, Endothel; Rezeptor für Interferon-g CD120b BMS5051PE.01 Murine Isotype Control BMS5710PE.01 (Boehringer Ingelheim, Heidelberg, Germany) Rezeptor des Tumor-NekroseFaktor (TNF-R p75) CD137 Clone M131, unlabeled (Immunex Co. Extramural Research, Seattle, WA, USA); second step FITC goat anti-mouse IgG (Southern Biotech, Elching, Germany); Isotyp Kontrolle MOPC21 (Sigma, Deisenhofen, Germany) ILA; aktivierte B-, T-Zellen (bes. CD45RAhigh, CD45R0high), Monozyten, epitheliale Zellen; Kostimulator der T-Zell-Proliferation und des T-Zell-Überlebens CD154 Clone 24-31 - FITC (Ancell Corp., Bayport, MN, USA) CD40L; aktivierte T-Zellen; essentielle Interaktion von CD154 und CD40 für das Isotyp-Switching von B-Zellen CD80 goat anti-hu-IgM Cat.#55055 (Organon Teknika Corp., Cappel Research Products, F(ab)2 Durham, NC, USA); ICN Biomedicals, Eschwege, Germany Fragmente 5-41 goat anti-mouseIgG F(ab)2 Dianova, Hamburg, Germany Fragmente Cat.#340458 (Becton-Dickinson FastImmuneTM Immunocytometry Systems, San Control FITC/PE Jose, CA, USA) Negativkontrolle für intrazelluläre und Oberflächenfärbungen mit FastImmuneTM-Reagenzien; Kontrolle für die Quadrantenauswertung; IgG2a (clone X39), IgG1 (clone X40) Cat.#340456 (Becton-Dickinson IFNg FITC/IL-4 Immunocytometry Systems, San PE Jose, CA, USA) IFNg: produziert von aktivierten CD8+ T-Zellen, TH0 und TH1 CD4+ T-Zellen, NKC; multifunktioneller Immunmodulator mit anti-Tumor und anti-viraler Aktivität; IL-4: produziert von aktivierten THO und TH2 CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, Basophilen und Mastzellen; Regulation der IL-2-vermittelten Aktivierung und NK-ZellProliferation; Steigerung des Wachstum und der Differenzierung aktivierter B-Lymphozyten (BCGF) Cat.#340450 (Becton-Dickinson Anti-Human IL-2 Immunocytometry Systems, San PE Jose, CA, USA) produziert von CD4+ T-Zellen (TH0, TH1), einigen CD8+ nach polyklonaler oder antigener Stimulation; IL-2 ruft Proliferation und Differenzierung von T-, B- und NK-Zellen hervor; potenter Aktivator von Monozyten Cat.#340511 (Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA) in T-Lymphozyten induziert durch den AIM/CD69- oder den CD3/CD28-pathway, in MO/Makrophagen durch Endotoxine (LPS); potentes proinflammatorisches Polypeptid in der Abwehr von infektiösen Agentien und der Kontrolle des Tumorwachstums; Mediator im septischen Schock, RA, entzündliche Gewebsdestruktion und Kachexie Anti-Human TNFa FITC 5-42 Material Beschreibung Hersteller Ficoll-Hypaque Lösung Lösung zur Dichtezentrifugation (Dichte 1.077) Biochrom KG, Berlin, Germany RPMI1640 Kulturmedium R0 (w/o Phenolrot) Biochrom KG, Berlin, Germany Penicillin Endkonzentration 100U/ml Biochrom KG, Berlin, Germany Streptomycin Endkonzentration 100ug/ml Biochrom KG, Berlin, Germany L-Glutamin Endkonzentration 2mM Biochrom KG, Berlin, Germany FCS inaktiviertes, fötales Kälberserum PANBiotech, Aidenbach, Germany Kulturmedium R10 R0 + 10% FCS + Pen./Strep./LGlutamin PBS phosphate buffered saline (PBS: 40g NaCl + 6.9g NaH2Po4*H2O in 5 l Aqua dest.) PI Propidiumiodid (EK 1ug/ml, VV 50ug/ml); #81845 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA Immunomagnetische Beads Dynabeads M-450 CD19 (Pan B), #1103/4 Dynal, Hamburg, Germany DetachaBeads für Dynabeads M-450 CD19 (Pan B), #125.05/6 Dynal, Hamburg, Germany Magnet DYNAL MPC-6 (magnetic particle concentrator), #120.02 Dynal, Hamburg, Germany Permeabilisierungslösung FACS Permeabilizing Solution, Cat.#340457 Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA Lyselösung FACS Brand Lysing Solution, Cat.#92-0002 Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA Brefeldin A Blockade des Golgi-Apparates, #B6542 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA SAC Staphylococcal antigen Cowan strain Calbiochem, La Jolla, CA, I; EK 1:10000 USA PWM Pokeweed mitogen; EK 1.200, 1:400, 1:800 Gibco, Eggenstein, Germany 5-43 IL-2 Interleukin 2, EK 20U/ml Biotest, Dreieich, Germany IL-10 Interleukin 10, EK 10ng/ml Pharmingen, San Diego, CA, USA Durchflußzytometer FACSCalibur System (4-Farben, 2 Laser) Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA Auswertungssoftware CellQuest Software Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA FACS-Röhrchen Polystyrol (PS), Polypropylen (PP); 12x75mm Falcon, Zentrifuge Rotixa/P Hettich Mikroskop Standard 20 Zeiss Vortex Heidolph Brutschrank 37oC, 5% CO2-begast Heraeus Zellkulturbehälter 24-well Platte Greiner 5.4. Analyse der Zellen mittels Durchflußzytometrie 5.4.1. Funktionsweise des FACS Der „Fluorescence Activated Cell Scanner“ (FACSCalibur) ermöglicht die Analyse von fluoreszenzmarkierten Einzelzellen hinsichtlich ihrer Größe, ihrer Granularität und vier weiteren Fluoreszenezmerkmalen auf der Zelloberfläche oder im Zytoplasma. Bei der Messung wird die Zellsuspension angesaugt, mit Überdruck durch eine Düse gespritzt und so eine Hintereinanderreihung von Einzelzellen erreicht. Die mittels des Flüssigkeitsstrahles perlschnurartig aufgereiten Zellen werden mit einer Geschwindigkeit von etwa 6m/s an einem optischen System vorbeigeführt. Zwei Argon-Laser erzeugen Licht mit Wellenlängen von 488nm und 635nm, welches rechtwinklig auf die vorbeiströmende Zellsuspension trifft und die markierten Zellen zur Fluoreszenz anregt. Hochsensitive Photomultiplier (PMT) 5-44 registrieren das entstehende Streulicht (FSC, SSC) und mittels Bandpass-Filtern für 530nm (FITC), 585 (PE), 661 (APC) und >670nm (PerCP) das von den angeregten Fluoreszenzfarbstoffen emittierte Licht. Ein Computer wertet die optischen Signale aus und stellt sie für die graphische Auswertung bereit. Die Intensität der emittierten Lichtimpulse in einem vorgegebenen Frequenzbereich (Kanal) wird als numerischer Wert wiedergegeben und in einem Histogramm gegen die Anzahl der Zellen mit dieser Fluoreszenzintensität aufgetragen. Die Korrelation zweier Parameter läßt sich durch Darstellung in einem Punktwolkenhistogramm (DotPlot) zeigen. Beliebige Belegungen der Achsen durch die Streulichtparameter und Fluoreszenzen sind möglich. 5.4.2. Auswertungsprinzipien Anhand ihrer charakteristischen Streulichteigenschaften, die bedingt sind durch die unterschiedliche Zellgröße und -struktur, lassen sich die wichtigsten Leukozytengruppen wie Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten bereits voneinander trennen. Nur Zellen mit den durch das sogenannte Lymphozytenfenster (R1) definierten Streulichtparametern wurden in die weitere Auswertung einbezogen. Das Fenster wurde großzügig gesetzt und die Populationen innerhalb des Fensters anhand ihrer phänotypischen Merkmale durch Kontrollfärbungen unterschieden. Fig. 3. Exemplarische Darstellung der FACS-Auswertungsprinzipien 5-45 Jede einzelne Zelle der durch das Fenster 1 (R1) ausgewählten Zellpopulation kann nun hinsichtlich der vier Fluoeszenzmerkmale beschrieben werden. Zur graphischen Darstellung eines Merkmales wählt man die Histogrammdarstellung , in einem Punktwolkenhistogramm hingegen lassen sich zwei Merkmale gegeneinander darstellen. Das Mitführen von Iso- bzw. Negativkontrollen bei jeder Färbung erlaubt das Setzen von Auswertemarken, die die Zellen in fluoreszenznegative und -positive Populationen diskriminieren. Diese Quadranteneinteilung ist Grundlage der statistischen Auswertung. 5.4.3. Vorteile der Methode Diese objektive Methode erlaubt somit die empfindliche und schnelle Analyse tausender von Zellen. Subpopulationen können hinsichtlich 4 Merkmalen charakterisiert werden und die Methode ist nicht von subjektiven, optischen Eindrücken am Fluoreszenzmikroskop abhängig. In der Klinik wird daher diese Methode bereits vielfältig in der Routinediagnostik des Immunstatus, des HIVMonitoring, der Transplantationsmedizin oder der immunphänotypische Charakterisierung lymphoproliferativer Erkrankungen eingesetzt. 5.5 B-Zellselektionierung Nach Isolierung der mononukleären Zellfraktion mittels Dichtezentrifugation wurden die enthaltenen B-Lymphozyten durch eine Positivselektionierung zu einer Reinheit von >99% angereichert. Dies ermöglicht die Untersuchung reiner B-Zellen unter Ausschluß von möglichen stimulierenden oder suppressiven Einflüssen von Zellpopulationen wie T-Zellen oder Monozyten. Prinzip der verwendeten Dynabeads M-450 ist die Separation von Zellpopulationen mit Hilfe von Partikeln, die einerseits durch direkte Beladung mit monoklonalen Antikörpern (hier: anti-CD19 mouse-IgM mAB) spezifische Oberflächenantigene der Zellen erkennen und binden, andererseits die Eigenschaft der Magnetisierbarkeit besitzen. Die gebundenen Zellen lassen sich mittels eines externen Magneten isolieren und in einem weiteren Schritt wieder von den Beads lösen. Gemäß dem Protokoll des Herstellers (Dynal) wurde zunächst die Absolutanzahl der in der Probe enthaltenen CD19+ B-Zellen durch Bestimmung der Gesamtzellzahl und des prozentualen Anteils von B-Lymphozyten ermittelt. Die 5-46 mononukleären Zellen wurden auf eine Konzentration von 20-25x106 Zellen pro Milliliter eingestellt. Pro enthaltener B-Zelle wurden der Suspension 4-5 Beads zugegeben und in einem Überkopfmischer für 20' bei 4°C in Dunkelheit inkubiert. Mittels eines Magneten (Dynal MPC-6) wurden die Beads an der Wand des Reagenzglases fixiert und der Überstand abpipettiert. Nach Resuspension wurden die Beads ein zweites Mal mit PBS gewaschen und schließlich auf eine Konzentration von circa 2,5x106/100µl eingestellt. Zur Entfernung der magnetischen Beads wurde ein polyklonaler Antikörper gegen Maus-Ig (Dynal DETACHaBEAD) verwandt, der den Beads-gekoppelten CD19-Antikörper aus seiner Bindung an der Zelloberfläche verdrängt. Den in 100µl Medium resuspendierten Zellen wurde eine Einheit (10µl) der DETACHaBEADS zugesetzt und diese für 60' bei 23°C auf einem Probenschüttler inkubiert. Die Beads konnten mit einem Magneten nach zweimaligem Waschen vollständig entfent werden. Die gewonnen reinen B-Zellen wurden nach Zentrifugation und Auszählen zur weiteren Verwendung auf eine Konzentration von 1x106/ml R10 eingestellt. 5.6. B-Zellstimulation B-Lymphozyten wurden über den B-Zell-Rezeptor mittels polyklonaler Antikörper, die gegen die µ-Kette des sIgM gerichtet waren, das costimulatorische Oberflächenmolekül CD40 und durch die Zugabe der proliferativ wirkenden Zytokine Interleukin-2 und Interleukin-10 stimuliert. Andere Stimulationsbedingungen bestanden in der Kokultivierung mit reinen, autologen, voraktivierten T-Zellen. Sowohl native als auch stimulierte B-Lymphozyten wurden anhand einer Vielzahl von Oberflächenmarkern hinsichtlich ihrer regelrechten Aktivierbarkeit und Expression von Zellreifemarkern im Durchflußzytometer untersucht. Die Versuche wurden zunächst mit unfraktionierten mononukleären Zellen durchgeführt und zum Ausschluß von stimulierenden oder suppressiven Einflüssen anderer Zellpopulationen mit reinen B-Lymphozyten wiederholt. Für die Stimulationen wurden die Zellen in einer Konzentration von 1x106/ml für 20 Stunden in einem Gesamtvolumen von 1ml R10-Medium bei 37°C und 5%CO2 Begasung in 24-wellPlatten inkubiert. Für eine optimale Stimulation wurde der anti-µ-Antikörper in löslicher Form in einer Endkonzentration von 12,5µg/ml, Interleukin von 20U/ml und 5-47 Interleukin-10 von 10ng/ml zugegeben. Der eingesetzte anti-CD40-Antikörper wurde nicht in löslicher Form verwendet, sondern mittels eines anti-Maus-IgG-Antikörpers (F(ab)2-Fragment) zunächst an die Platte gebunden. Nach Inkubation des anti-MausAntikörpers für 16 Stunden bei 4°C in der Platte folgte die Zugabe der anti-CD40Antikörper in einer Endkonzentration von 1µg/ml für 2 Stunden bei 37°C. Nach zweimaligem Waschen mit R10-Medium wurden die Zellen hinzugefügt. Für die Stimulation von B-Zellen durch autologe T-Zellen wurden 0.5x106 vorstimulierte T-Zellen 1x106 unfraktionierten mononukleären Zellen zugegegeben. Die für CD14, CD16 und CD19 negativ depletierten T-Zellen waren zuvor gemäß dem Protokoll der T-Zell-Stimulation für 20 Stunden über CD3 und CD28 stimuliert worden. Zur Kontrolle wurde ein Ansatz von in R10-Medium kultivierten unstimulierten T-Zellen mitgeführt. 5.7. Immunglobulin-ELISA Die Einteilung der CVID-Patienten in die Klassen A bis C nach Bryant et al. wird anhand ihrer Fähigkeit zur in vitro Synthese von Immunglobulinen vorgenommen (s.o.). Die wiederholt durchgeführte Testung diente der Überprüfung der zum Teil vorbestehenden Klassifikation und deren Konstanz im Krankheitsverlauf. 6 Mononukleäre Zellen wurden in einer Konzentration von 1x10 /ml einerseits mit Staphylococcus aureus Cowan strain I (SAC) in einer Verdünnung von 1:10000 unter Zugabe von IL-2 (20U/ml), andererseits mit Pokeweed mitogen (PWM) in Verdünnungen von 1:200, 1:400 und 1:800 in einem Gesamtvolumen von 1 Milliliter R10-Medium bei 37°C und 5%CO2 Begasung in 24-well-Platten stimuliert. Nach einem Zeitraum von 9 Tagen wurden die Überstände der Kulturen abgenommen und bis zur Untersuchung mittels ELISA bei -20°C gelagert. Die Bestimmung von IgM und IgG in den Kulturüberständen wurde in ELISA-Flachbodenplatten durchgeführt. Zunächst wurden die Platten durch Inkubation für 16 Stunden mit dem Anti-hu-IgAIgG-IgM-Antiserum beschichtet. Die Kulturüberstände wurden 1:100 vorverdünnt und gemeinsam mit den spezifischen AP-konjugierten Antiseren gegen IgM und IgG in die entsprechenden Platten pipettiert. Neben den Standard-Verdünnungen wurden eine PBS- und eine Mediumkontrolle mitgeführt. Nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Substratlösung in die gewaschenen Platten pipettiert. Die Extinktionswerte der Platten bei 405nm wurden durch einen ELISA- 5-48 Reader gemessen. Der Test wurde bei einer Extinktion von 1,5 im höchsten Standard gestoppt. Die Auswertung erfolgte anhand einer Standardgeraden. 5.8. Quantitative Bestimmung der mRNA für CD86 Zum Ausschluß posttranslationaler Ursachen für die phänotypisch beobachtete Verminderung der Expression von CD86 auf der Zelloberfläche erfolgte eine quantitative Bestimmung der für CD86 kodierenden mRNA. Nach erfolgter Isolierung der peripheren mononukleären Zellen durch eine Ficoll-Hypaque-Dichtezentrifugation wurden die CD19 positiven Zellen mittels antikörperbeladener magnetischer Beads in einer Positivselektionierung auf eine Reinheit von >95% angereichert. Die Reinheit und Reife der gewonnen B-Lymphozyten wurde durch die durchflußzytometrische Bestimmung der Expression von CD3, CD4, CD8, CD19, CD21, CD22, CD23, CD69, CD80 und CD86 sichergestellt. Die Stimulation erfolgte durch einen in löslicher Form zugegebenen polyklonalen anti-IgM Antikörper. Für die Stimulation wurden die Zellen in einer Konzentration von 1x106/ml in einem Gesamtvolumen von 1 Milliliter R10Medium bei 37°C und 5%CO2 Begasung in 24-well-Platten unter Zusatz der Zytokine IL-2 (20U/ml) und Interleukin-10 (10ng/ml) inkubiert. Die optimale Dauer der Stimulation wurde nach Erstellung einer Expressionskinetik für CD69, CD80 und CD86 bei circa halbmaximaler Oberflächenexpression von CD86 auf 15 Stunden festgelegt. Die absolute Anzahl der vitalen Zellen und möglicher toter Zellen wurde nach der Stimulation durch eine Anfärbung mit Trypanblau bestimmt. Die GesamtRNA wurde mit Hilfe des Rneasy® Mini Kit der Firma Qiagen GmbH gemäß dem Herstellerprotokoll aus mindestens 2x106 Zellen gewonnen. Die Synthese der cDNA wurde mit TaqMan® Gold RT-PCR Reagenzien und "random hexamers" für 45 Minuten bei 48°C durchgeführt. Zur Beendigung der Reaktionen wurden die Proben für 5 Minuten bei 95°C inkubiert. GADPH wurde benutzt, um den Gehalt an cDNA mittels der TaqMan® GADPH Kontrollreagenzien zu quantifizieren (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany). Die Quantifizierung der CD86 mRNA erfolgte mittels des ABI PRISM 7700 sequence detection system® (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany). CD86 spezifische Oligonukleotide und eine Fluoreszenz Probe wurde mit Hilfe der PrimerExpress software (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany) entwickelt: forward primer: 5'-CTG ACA AGA CGC GGC TTT TAT C-3'; reverse primer: 5'-TC ATT GTG TTG GTT CCA CAT TT-3'; FAM labelled 5-49 probe: FAM---5'-ACC TTT CTC TAT AGA GCT TGA GGA CCC TCA GCC-3'. Die Bedingungen der PCR waren: 2 min 50°C; 10 min 95°C; 15 sec 95°C, 1 min 60°C. Die optimalen Konzentrationen der Primer wurden durch eine Primer-Matrix-PCRReaktion ermittelt. Die optimierte Konzentration beider Primer waren 300nM. Die Quantifizierung erfolgte mittels der ∆CT Werte. Die Probe des gesunden Spenders UDZ wurde als Kalibration benutzt, um Relativwerte für die Proben der Patienten zu ermitteln. 5.9. T-Zelldepletion Nach Isolierung der mononukleären Zellfraktion mittels Dichtegradientenzentrifugation wurden die enthaltenen T-Lymphozyten durch eine Negativselektionierung auf eine Reinheit von >90% angereichert. Dies ermöglichte die Untersuchung beinahe reiner T-Zellen unter Ausschluß möglicher stimulierender oder suppressiver Einflüsse von Zellpopulationen wie B-Zellen oder Monozyten. Prinzip der T-Zelldepletion war die Isolierung der T-Zellen durch die Depletion von Monozyten (CD14+), Zellen der B-Zellreihe (CD19+) und von NK-Zellen und neutrophilen Granulozyten (CD16+) aus der mononukleären Zellfraktion. Die verwendeten magnetisierbaren Partikel (DYNABEADSM-450), die auf ihrer Oberfläche kovalent mit gereinigtem Schafs-IgG beladen sind, sind spezifisch für die Erkennung von Maus-IgG und -IgM und besitzen eine sehr geringe Kreuzreaktivität mit humanen Antigenen. Im verwendeten indirekten Verfahren wurden die Zellen zunächst mit einem spezifischen Maus-Antikörper der Klasse IgG inkubiert und in einem zweiten Schritt mittels der Dynabeads M-450 Sheep anti-Mouse IgG rosettiert. Gemäß dem Protokoll des Herstellers (Dynal, Oslo, Norway) wurde die mononukleäre Zellsuspension (5x106Zellen/100µl) mit den im Überschuß zugegebenen unkonjugierten Maus-IgG-Antikörpern gegen CD14 (30µl), CD16 (20µl) und CD19 (20µl) in Eppendorf-Gefäßen (1ml) für 30' bei 4°C in Dunkelheit inkubiert. Um nicht gebundene Antikörper zu entfernen, wurden die Zellen zweimal mit Waschpuffer (PBS+1%FCS) gewaschen. Den Antikörper beladenen Zellen wurden die Dynabeads M-450 Sheep anti-Mouse IgG in einem Verhältnis von 1:5 zugegeben und diese auf einem Über-Kopf-Mischer für 15' bei 4°C inkubiert. Mittels eines Magneten (Dynal MPC-6) wurden die an die Beads gebundenen Zellen an der 5-50 Wand des Eppendorf-Gefäßes fixiert und der Überstand mit den enthaltenen T-Zellen abgenommen. Um die Reinheit der gewonnenen Zellen zu erhöhen, wurden die Zellen ein zweites Mal mit Beads inkubiert und entsprechend depletiert. Nach Zentrifugation und Auszählen wurden die auf >90% angereicherten T-Zellen zur weiteren Verwendung auf eine Konzentration von 1x106/ml R10 eingestellt. Zur Kontrolle der Methode und Sicherstellung der Reinheit der T-Zellen wurden Aliquots der Zellen vor und nach der Depletion für die Expression der Marker CD3, CD14, CD16 und CD19 durchflußzytometrisch charakterisiert. 5.10. T-Zellstimulation T-Lymphozyten wurden mittels monoklonaler Antikörper, die gegen die α/βUntereinheit des T-Zell-Rezeptors (BMA031) oder gegen das mit dem TCR assoziierte Molekül CD3 (BMA030) gerichtet waren, stimuliert. In beiden Fällen wurde eine Kostimulation durch Zugabe eines zweiten monoklonalen Antikörpers, welcher das Oberflächenmolekül CD28 erkennt und signalgebend für die Zelle wirkt, erreicht. Die Versuche wurden zunächst mit unfraktionierten mononukleären Zellen durchgeführt und zum Ausschluß von stimulierenden oder supprimierenden Einflüssen anderer Zellpopulationen mit negativ depletierten (CD14-, CD16- und CD19-negativ) und somit reinen T-Lymphozyten wiederholt. Für die Stimulationen wurden die Zellen in einer Konzentration von 1x106/ml für 44 Stunden in einem Gesamtvolumen von 1 Milliliter R10-Medium bei 37°C und 5%CO2 Begasung in 24well-Platten inkubiert. Für eine optimale Stimulation wurden die eingesetzten BMA030-, BMA031- und anti-CD28 Antikörper nicht in löslicher Form verwand, sondern zunächst mittels eines anti-Maus-Antikörpers (IgG F(ab)2) an die Platte gebunden. Nach Inkubation des anti-Maus-Antikörpers für 16 Stunden bei 4°C und zweimaligem Waschen der Platte mit R0-Medium folgte die Zugabe der Antikörper BMA030 und BMA031 in einer Endkonzentration von 200ng/ml gemeinsam mit dem Antikörper gegen CD28 für 2 Stunden bei 37°C. Nach zweimaligem Waschen mit R10-Medium wurden die Zellen hinzugefügt. Die Färbung mittels monoklonaler Antikörper und die Auswertung unter Verwendung spezifischer Isotypen-Kontrollen erfolgte gemäß dem bekannten Protokoll. 5-51 5.11. Färbung intrazytoplasmatischer Zytokine Nach der Isolierung der nativen MNC aus periphervenösem Blut und der negativen Isolierung der T-Lymphozyten durch Depletion der CD14+-, CD16+- und CD19+Zellen wurde mit den reinen T-Lymphozyten entsprechend der Stimulation für den Nachweis der Oberflächenmarker verfahren. Mittels eines anti-Maus-Antikörpers wurden die monoklonalen Antikörper, die gegen den TCR (BMA031), CD3 (BMA030) oder CD28 gerichtet waren, an die Platte gebunden. Die Zellen wurden in diesen 24well-Platten in einer Konzentration von 1x106/ml in einem Gesamtvolumen von 1 Milliliter R10-Medium bei 37°C und 5%CO2 Begasung für 24 Stunden inkubiert. Den Stimulationsansätzen wurde zudem Brefeldin A (BFA) in einer Endkonzentration von 10µg/ml zugesetzt. BFA blockiert die Exozytose der Zytokine während der Kultur durch Interaktion mit dem endoplasmatischen Retikulum und ermöglicht auf diese Weise erst den intrazytoplasmatischen Nachweis. Das verwendete Protokoll zur Anfärbung der Zytokine entspricht den Angaben des Herstellers (FastImmune Cytokine System, BectonDickinson). Die vorstimulierten Zellen wurden in R10Medium gewaschen und auf eine Konzentration von 300-500.000/100µl pro Ansatz eingestellt. Zunächst erfolgte die Anfärbung der Oberflächenmarker CD4 und CD8 mittels APC- und PerCP-konjugierter monoklonaler Antikörper. Nach 15' wurden 23ml der FACS-Lysing-Solution zugefügt, im nächsten Schritt wurden die Zellen für 30' mit 500µl der FACS-Permeabilizing-Solution inkubiert, im Anschluß 2-3ml des Waschpuffers (500ml PBS, 0,5% BSA, 0,1% NaN3) zugegeben und nach Zentrifugation der Überstand verworfen. Die 4-Farben-Durchflußzytometrie ermöglicht die Beschreibung einer Zelle anhand von vier Merkmalen, in diesem Fall zweier Oberflächenmoleküle in APC (CD4) und PerCP (CD8) und zweier intrazytoplasmatischer Merkmale in FITC (TNFα, IFNγ) und PE (IL-2, IL-4). Dazu wurde den Zellen pro Ansatz 10µl der anti-Zytokin-Antikörper zugesetzt und für 30' bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Analog wurde für die mitgeführten Isotyp-Kontrollen in FITC und PE verfahren. Nach dem Waschen wurden die Zellen zur Messung in 500µl des Waschpuffers resuspendiert. 6-52 6. Ergebnisse 6.1. B-Zell-Ergebnisse 6.1.1. Klassifikation der Patienten Die CVID Patienten wurden anhand der in vitro Antwort ihrer B-Lymphozyten auf Staphylococcus aureus Cowan strain I (SAC) und Pokeweed mitogen (PWM) klassifiziert. Unter diesen Bedingungen sekretierten die B-Zellen der Gruppe A Patienten keine signifikanten Mengen an IgM, IgA oder IgG, die der Gruppe B Patienten sekretierten nur IgM, während die Patienten der Gruppe C normale Mengen an IgM, IgA und IgG produzierten. Es wurde gezeigt, daß die Klassifikation der Patienten hinsichtlich dieser Kriterien über Jahre konstant blieb. In dieser Untersuchung wurden die Gruppen B und C zur Gruppe der NON-A Patienten zusammengefaßt. Die Bestimmung der Oberflächenmarker wurde vergleichend mit nativen und vorstimulierten Zellen von CVID-Patienten und gesunden Spendern durchgeführt. Auf B-Lymphozyten wurde die Expression der Marker CD19, CD21, CD22, CD23, CD54, CD69, CD80 und CD86 durchflußzytometrisch beschrieben. Der prozentuale Anteil der für den pan-B-Zell-Marker CD19 positiven Zellen an den mononukleären Zellen war für 6 der 8 Patienten der Gruppe A und für alle 12 der Gruppe B normal. Innerhalb der Kontrollgruppe fand sich ein Streuung von 2.1% bis 16.7%, innerhalb der Patienten der Gruppe A von 0.4% bis 20.2% und innerhalb der Gruppen B und C von 1.9% bis 13.7%. Lediglich zwei Patienten der Gruppe A wiesen einen Prozentsatz an zirkulierenden B-Zellen von <1% auf. 6-53 24 CD19+ pos. Zellen 21 18 15 12 9 6 3 0 HD A NA Abb. 4. Prozentualer Anteil CD19+ Zellen der nativen PBMC am Tag 0 6.1.2. Expression von Reifungsmarkern und Kostimulationsmolekülen Die Expression der Reifemarker CD21 und CD22 als auch des Adhäsionsmoleküls CD54 (ICAM-1) auf den untersuchten CD19 positiven B-Lymphozyten war auf einem hohen Prozentsatz der B-Zellen nachweisbar und im Vergleich der Patienten mit den % positive CD19+cells Kontrollpersonen unauffällig. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 HD A NA HD A NA HD A NA CD21+ CD22+ CD23+ HD A NA CD54+ Abb. 5. Prozentualer Anteil CD21, 22, 23, 54 + Zellen der nativen CD19+ B-Lymphozyten am Tag 0 6-54 Für die Patienten der Gruppe A ließ sich eine mögliche, jedoch nicht statistisch signifikante Verminderung der Expression von CD23 beschreiben. Bereits im Rahmen der routinemäßig durchgeführten Immunstatusuntersuchung waren die Daten zur Oberflächenexpression von IgM, IgD, CD5 und CD10 auf BZellen erhoben worden. Sowohl für die Expression von IgM als auch von IgD auf der Zelloberfläche fand sich in den Patientengruppen A und NA ein signifikant höherer Prozentsatz im Vergleich zur Kontrolle. IgM war auf 68-93% der CD19 positiven Zellen der Kontrollpersonen exprimiert, hingegen auf Patientenzellen zu 81-98%. Ähnlich verhielt sich die Expression von IgD mit einer Spanne von 68-90% bei der Kontrolle, 93-98% bei A-Patienten und 81-97% bei NA-Patienten. Dieser erhöhte Prozentsatz IgM/IgD doppelt positiver B-Zellen weist auf eine reduzierte Frequenz von Klassenwechsel hin. Für die Expression von CD5 und CD10 lagen nur für einen Teil der Patienten und Kontrollen Befunde vor. Auffälligkeiten ließen sich hierbei bislang keine feststellen. 100 % positive CD19+ cells 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 HD A NA HD A NA HD A NA HD A NA sIgM+ sIgD+ CD5+ CD10+ Abb. 6. Im Rahmen der Immunstatusdiagnostik erhobene Daten zur Expression von sIgM, sIgD, CD5 und CD10 auf nativen CD19+ B-Lymphozyten 6-55 Um eine Voraktivierung der Zellen auszuschließen, wurden diese im nativen Zustand auf die Expression des Aktivierungsmarkers CD69 untersucht. Im Kontroll- wie im Patientenkollektiv fand sich ein maximaler Prozentsatz von 2.6% CD69 positiver Zellen. Lediglich ein Patient der Gruppe NA wies mit 8.1% eine leichte Voraktivierung der B-Zellen auf. Ein höherer und individuell stärker differierender Prozentsatz positiver Zellen fand sich für die Expression von CD80 (B7.1). In der Gruppe der gesunden Spender war der Nachweis für 11.4-47.5% der Zellen positiv, unter den Patienten der Gruppe A für 7.6-49.0% und der Gruppe NA für 7.1-47.6%. Für den zweiten Vertreter der B7-Familie CD86 (B7.2) fand sich ähnlich wie für CD69 nur eine geringe Expression auf nativen Zellen: in der Kontrollgruppe 7.7-13.7%, in der Gruppe A 3.1-12.5% und in der Gruppe NA 4.3-22.6%. 100 90 % positive B-cells 80 70 60 50 40 30 20 10 0 HD A NA CD69+ HD A NA HD A NA CD80+ CD86+ Abb. 7. Prozentualer Anteil CD69, 80, 86 + Zellen der nativen CD19+ B-Lymphozyten am Tag 0 6.1.3. Kinetik der Regulation von CD69, CD80, CD86 und CD23 Zur Darstellung der zeitlichen Abfolge der Expression der Oberflächenmarker CD69, CD80, CD86 und CD23 nach Stimulation wurde eine Expressionskinetik über einen Zeitraum von 24 Stunden erstellt. Die mononukleären Zellen eines gesunden Spenders wurden mit einem gegen das sIgM gerichteten Antikörper (anti-µ, 6-56 12.5µg/ml) unter Zusatz der Zytokine IL-2 (20U/ml) und IL-10 (10ng/ml) in einer Konzentration von 1x106/ml für bis zu 24 Stunden in einem Gesamtvolumen von 1 Milliliter R10-Medium bei 37°C und 5%CO2 Begasung in 24-well-Platten inkubiert. Die Ergebnisse zum Zeitpunkt 0h entsprechen nativen unstimulierten Zellen. Der äußerst schnelle Anstieg der Expression von CD69 von 2.4% auf 64.8% innerhalb der ersten 2 Stunden und auf 91.1% innerhalb der ersten 4 Stunden bestätigt seine Funktion als früher Aktivierungsmarker. Auch für CD86 läßt sich eine Steigerung um das Vierfache von anfänglich 21.9% auf 83.3% nach 12 Stunden und auf 88.0% nach 20 Stunden beobachten. Im Vergleich zu CD69 findet sich die größte Steigerungsrate allerdings nicht in den ersten 2 bis 4 Stunden, sondern im Zeitraum von 4 bis 12 Stunden nach Stimulationsbeginn. Ein nur leichter Anstieg der Expression von anfänglich 13.5% auf 28.3% nach 24 Stunden findet sich für CD80. Hingegen fällt der prozentuale Anteil der CD23 exprimierenden Zellen geringfügig von 93.1% auf 80.2% nach 24 Stunden ab. 100 CD69 CD86 CD80 CD23 % positive CD19+ cells 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0h 2h 4h 8h 12h 16h 20h 24h Inkubationszeit Abb. 8. Kinetik der Expression von CD69, CD80, CD86 und CD23 nach Stimulation mittels anti-IgM+IL-2+IL-10 in einer gesunden Kontrolle 6-57 6.1.4. Expression von CD69, CD80, CD86, CD62L, CD137 und CD23 nach Stimulation Die unfraktionierten mononukleären Zellen von 7 Patienten der Gruppe A, 9 der Gruppe NA und 11 Kontrollpersonen wurden gemäß dem im Abschnitt "Methoden" beschriebenen Protokoll mit einem den BCR kreuzvernetzenden Anti-IgM-Antikörper und den Zytokinen IL-2 und IL-10 für 20 Stunden inkubiert. In der Kontrollgruppe exprimierten nach Stimulation 76.9% bis 88.1% der B-Lymphozyten den Aktivierungsmarker CD69, in der Gruppe NA 68.9% bis 96.4%. In der Gruppe A zeigten 5 Patienten eine der Kontrolle entsprechende Expression zwischen 73.1% und 89.2%, hingegen erreichten zwei Patienten in wiederholten Stimulationsansätzen nur Werte zwischen 55% und 65%. Diese beiden Patienten wiesen zuvor bereits BZellzahlen von <1% der MNC auf. Die Expression von CD86, ausgewertet als Prozentsatz der CD86 positiven Zellen, zeigte in der Gruppe A der CVID-Patienten eine statistisch signifikante Verminderung sowohl im Vergleich mit der Kontrolle als auch mit der Gruppe NA. In der Gruppe der gesunden Spender waren 72.2% bis 88.6% der B-Lymphozyten für CD86 positiv, in der Gruppe NA 70.1% bis 83.2%, hingegen exprimierten die Zellen der Gruppe A Patienten CD86 nur in einem Prozentsatz von 47.7% bis 65.1%. Diese Verminderung ist mit einem p=<0.0001 % positive B-Zellen (CD19+) statistisch hochsignifikant. p=<0.0001 100 80 60 40 20 0 HD A NA CD69+ HD A NA HD A NA CD86+ CD80+ Abb. 9. Expression von CD69, 80, 86 nach anti-µ-Stimulation + IL-2 + IL-10 über 20 Stunden 6-58 Der Anteil der CD80 positiven Zellen unterlag einer größeren Variabilität und erreichte in der Kontrollgruppe 15.4% bis 60.4%, in der Gruppe A 20.0% bis 58.7% und in der Gruppe NA 8.9% bis 49.7%. Die Expression der bereits auf nativen Zellen analysierten Marker CD69, CD80, CD86, CD21, CD22, CD23 und CD54, ebenso wie des Moleküls CD62L und CD137 wurde in weiteren Stimulationsansätzen untersucht. Neben der Stimulation über den BCR wurden die Zellen über das Oberflächenmolekül CD40 oder mittels voraktivierter autologer T-Zellen stimuliert. Der dargestellten Mediumkontrolle war IL-2 in einer Konzentration von 20U/ml und IL-10 von 10ng/ml zugegeben worden. Die Expression des Aktivierungsmarkers CD69 wurde in sämtlichen Patienten in vergleichbarer Höhe zur Kontrollgruppe induziert. Es ließ sich eine zunehmende Expression ausgehend von 0% bis 8.1% auf nativen Zellen, über 12.8% bis 39.2% in Medium, 52.9% bis 96.4% nach Anti-IgM Stimulation bis zu 78.6% bis 98.7% nach Stimulation mit Anti-IgM und Anti-CD40 nachweisen. % CD69+ B-Zellen (CD19+) 100 80 60 40 20 0 HD A NA 0h HD A NA 20h medium HD A NA HD A NA 20h 20h anti-IgM aIgM + aCD40 Abb. 10. Expression von CD69 auf nativen CD19+ B-Lymphozyten, nach anti-µ-Stimulation + IL-2 + IL-10 und + αCD40 über 20 Stunden Entsprechend des Nachweises der Induktion von CD69 konnte die funktionelle Aktivierung der B-Zellen durch die Analyse des Expressionsmuster des homing 6-59 receptor CD62L (LECAM-1, L-selectin) bestätigt werden. CD62L ist auf der Mehrzahl der nativen B-Zellen exprimiert, wird jedoch durch aktivierungsabhängiges Shedding in kurzer Zeit nach unten reguliert. Die Kreuzvernetzung des BCR resultierte in einer für Kontrollen und Patienten ähnlichen Abnahme der Expression von >75% auf <50%. Zwei der fünf untersuchten Patienten der Gruppe A zeigten allerdings bereits im nativen Zustand der Zellen eine Expression von <60%. % CD62L+ B-Zellen (CD19+) 100 80 60 40 20 0 HD A NA HD A NA 0h aIgM 20h Abb. 11. Expression von CD62L auf nativen CD19+ B-Lymphozyten und nach anti-µ-Stimulation + IL-2 + IL-10 über 20 Stunden Im Gegensatz zur normalen Hochregulation von CD69 und dem Verlust von CD62L exprimierten alle Patienten der Gruppe A signifikant weniger CD86 als gesunde Spender und als die Patienten der Gruppe NA. Diese Tatsache spiegelte sich sowohl in der verminderten Anzahl CD86 positiver B-Zellen (Gruppe A 47.7-65.1%, Kontrolle 72.2-88.6%; p<0.0001) als auch in einer geringeren Expressionshöhe, gemessen als mittlere Fluoreszenzintensität der CD86 positiven Zellen, wider. Weder die Kostimulation durch Anti-CD40 Antikörper (Gruppe A 37.7-59.5%, Kontrolle 63.483.5%; p<0.0001) noch die Verlängerung der Inkubationszeit von 20 auf 44 Stunden vermochten die gestörte CD86 Expression zu beheben. 6-60 p=<0.0001 % CD86+ B-Zellen (CD19+) 100 p=<0.0001 80 60 40 20 0 HD A NA 0h HD A NA HD A NA 20h medium HD A NA 20h 20h anti-IgM aIgM + aCD40 Abb. 12. Expression von CD86 auf nativen CD19+ B-Lymphozyten, nach antiµ-Stimulation + IL-2 + IL-10 und + αCD40 über 20 Stunden mean CD86 fluorescence p=0.0029 200 150 100 50 0 HD A NA Abb. 13. Fluoreszenzintensität (mean fluorescence) von CD86 auf CD19+ BLymphozyten nach anti-µ-Stimulation + IL-2 + IL-10 über 20 Stunden 6-61 Abb. 14. Expression von CD86 nach Anti-IgM + IL-2 + IL-10 Stimulation im Vergleich zwischen einem Patienten der Gruppe A und einer Kontrolle als Overlay-Histogramm-Auswertung Hingegen unterschied sich die Expression von CD80, dem zweiten Mitglied der B7Familie, zwischen den Patienten der Gruppe A, der Kontrolle und den Patienten der 6-62 Gruppe NA nicht. Nach 20 Stunden Inkubation fanden sich in allen Gruppen lediglich Steigerungen der Expression von 10-25%. % CD80+ B-Zellen (CD19+) 100 80 60 40 20 0 HD A NA 0h HD A NA 20h medium HD A NA HD A NA 20h 20h anti-IgM aIgM + aCD40 Abb. 15. Expression von CD80 auf nativen CD19+ B-Lymphozyten, nach antiµ-Stimulation + IL-2 + IL-10 und + αCD40 über 20 Stunden Um humoral oder zellulär zytotoxische Effekte als auch supprimierende Einflüsse von T-Zell Zytokinen auszuschließen, wurde das Expressionsmuster für CD86 in hoch aufgereinigten peripheren B-Zellpopulationen untersucht. Obwohl deren CD86 Expression niedriger war als nach Stimulation der unfraktionierten MNC, gelang es auch den gereinigten B-Lymphozyten nach Stimulation mit Anti-IgM Antikörpern nicht, die Expression von CD86 entsprechend der Kontrolle zu steigern. Dies betraf wiederum den prozentualen Anteil positiver Zellen wie auch die mittlere Fluoreszenzintensität. 6-63 100 90 90 p=0.0018 80 80 70 70 60 60 p=0.0054 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 0 0 HD A NA CD69+ HD A NA HD A NA CD86+ CD86 intensity mean CD86 fluorescence % positive B-Zellen (CD19+) 100 Abb. 16. Expression von CD69 und CD86 auf hochangereicherten CD19+ BLymphozyten nach anti-µ-Stimulation + IL-2 + IL-10 über 20 Stunden 6.1.5. Regulation der CD86 mRNA in B-Zellen Im nächsten Schritt wurde untersucht, ob die verminderte Oberflächenexpression mit Veränderungen der Transkription des für CD86 kodierenden Genes korreliert war. Es wurde ein für die mRNA von CD86 spezifischer und zugleich quantitativer PCR Ansatz benutzt, indem eine gesunde Kontrolle der Kalibrierung des Ergebnisses diente. Aufgereinigte B-Zellen wurden für 15 Stunden mit einem Anti-IgM Antikörper unter Zusatz von IL-2 und IL-10 inkubiert. Die funktionelle Aktivierung wurde durch die Hochregulation der Expression von CD69 nachgewiesen. In den B-Zellen der drei untersuchten Patienten der Gruppe A blieb nach Stimulation die Transkription für CD86 aus (23-35%), vielmehr ließ sich im Vergleich zu in Medium kultivierten Zellen (28-46%) eine Abnahme der Transkriptionssignale beobachten. Im Gegensatz hierzu zeigten die B-Zellen des untersuchten Patienten der Gruppe NA eine der Kontrolle vergleichbare Hochregulation. 6-64 CD86 mRNA (% of control) 100 80 HD A A A B 60 40 20 0 medium aIgM Abb. 17. Ergebnis der quantitativen Bestimmung der CD86 mRNA in CD19+ B-Lymphozyten nativ und nach anti-µ-Stimulation + IL-2 + IL-10 über 20 Stunden Um festzustellen, ob die veränderte Antwort der B-Zellen der Gruppe A Patienten nach BCR-abhängiger Aktivierung auf die Expression von CD86 beschränkt oder ob die Expression weiterer Gene betroffen ist, wurde die Induzierbarkeit von CDw137 untersucht. CDw137 gehört der Familie der TNF-Typ I Rezeptoren an und wird nach Aktivierung auf B-Zellen, T-Zellen und Monozyten exprimiert. Wie gezeigt, ist CDw137 nur auf einem kleinen Teil der nativen B-Zellen vorhanden. Während die Kreuzvernetzung des BCR die Zahl der CDw137 positiven B-Lymphozyten gesunder Spender und der Patienten der Gruppe NA erhöhte, fand sich für die B-Zellen der Gruppe A keine gesteigerte Expression von CDw137. 6-65 % CD137+ B-Zellen (CD19+) 50 p=0.0012 40 30 20 10 0 HD A NA HD A NA 0h aIgM 20h Abb. 18. Expression von CD137 auf nativen CD19+ B-Lymphozyten und nach anti-µ-Stimulation + IL-2 + IL-10 Neben der Stimulation der B-Zellen über IgM und CD40 wurde die Expression von CD86 in einem Stimulationsansatz von MNC mit voraktivierten autologen T-Zellen untersucht, die durch Hochregulation zahlreicher Oberflächenmoleküle (u.a. CD40L) % positive B-Zellen (CD19+) eine intensive T-Zell-B-Zellwechselwirkung ermöglichen. p=<0.0001 100 80 60 40 20 0 HD A NA CD69+ HD A NA HD A NA CD86+ CD80+ Abb. 19. Expression von CD69, CD80 und CD86 auf CD19+ B-Lymphozyten nach Stimulation Lymphozyten mittels voraktivierter autologer CD3+ T- 6-66 Trotz einer starken funktionellen Aktivierung mit Expression von CD69 auf >93% der B-Zellen wiesen die Patienten der Gruppe A (53.2-71.1%) auch unter diesen Stimulationsbedingungen im Vergleich zur Kontrolle (88.4-96.4%; p<0.0001) und der Gruppe NA (74.6-90.8%) eine signifikant verminderte Expression von CD86 auf. Hingegen verhielt sich die Expression von CD80 der Kontrolle entsprechend. Für die Maturitätsmarker CD21 und CD22 fanden sich unter den getesteten Stimulationsbedingungen im Vergleich zu nativen Zellen keine Veränderungen der Expression. Im Hinblick auf eine gestörte Interaktion von T- und B-Zellen und Regulation der Immunglobulinsynthese wurde die Expression von CD23 und CD54 untersucht. Für CD23 wiesen vier der untersuchten Patienten im nativen Zustand eine um bis zu 30% verminderte Expression auf. Nach Stimulation mit αIgM oder αCD40 zeigte sich für Patienten und Kontrollen gleichermaßen eine Abnahme der Expression um 10-25%, in Medium sogar um bis zu 50%. % CD23+ B-Zellen (CD19+) 100 80 60 40 20 0 HD A NA 0h HD A NA 20h medium HD A NA HD A NA 20h 20h anti-IgM aIgM + aCD40 Abb. 20. Expression von CD23 auf nativen CD19+ B-Lymphozyten, nach antiµ-Stimulation + IL-2 + IL-10 und + αCD40 über 20 Stunden CD54 (ICAM-1) ließ sich auf >88% der nativen B-Lymphozyten sowohl der Patienten als auch der Kontrollen nachweisen. Nach Kultur in Medium war ein starker Abfall der Expression von bis zu 60% zu beobachten, hingegen nach Stimulation mit Anti-IgM oder Anti-CD40 lediglich eine Verminderung um 10-20%. 6-67 % CD54+ B-Zellen (CD19+) 100 80 60 40 20 0 HD A NA 0h HD A NA HD A NA 20h medium HD A NA 20h 20h anti-IgM aIgM + aCD40 Abb. 21. Expression von CD54 auf nativen CD19+ B-Lymphozyten, nach antiµ-Stimulation + IL-2 + IL-10 und + αCD40 über 20 Stunden 6.2. T-Zell-Ergebnisse 6.2.1. T-Zelloberflächenfärbung (native Zellen) Die Expression der Oberflächenmarker CD3, CD4, CD8, CD40L, CD69, CD95 und CD120b wurde in der Durchflußzytometrie vergleichend auf nativen und vorstimulierten T-Lymphozyten von 6 CVID-Patienten der Gruppe A, 5 der Gruppe NA und 5 gesunden Spendern charakterisiert. 4 der 6 Patienten der Gruppe A und alle Patienten der Gruppe NA wiesen einen normalen Prozentsatz zirkulierender CD3 positiver Zellen auf, während zwei Patienten der Gruppe A eine Verminderung der Zahl auf <47% der mononukleären Zellen zeigten. Die Zahl der CD4+ peripheren TLymphozyten lag in der Kontrollgruppe zwischen 32.9% und 43.8% der MNC, hingegen zeigten 5 der 6 Patienten der Gruppe A und 3 der Gruppe NA eine deutliche Verminderung auf Werte zwischen 8.7% und 22.3%. 6-68 100 % positive Zellen 80 60 40 20 0 HD A NA CD3+ HD A NA CD4+ Abb. 22. Prozentualer Anteil der CD3 und CD4 positiven Zellen an nativen PBMC Diese Veränderung spiegelt sich auch im verminderten Verhältnis der CD4+ und CD8+ Zellen wider. Auf den CD4+ T-Zellen beinahe aller Patienten wurde eine starke Erhöhung der Expression des Fas-Antigens CD95 (APO-1) (p<0.001) nachgewiesen, die auf eine Voraktivierung der Zellen in vivo hinweist. Eine weniger ausgeprägte Steigerung zeigte sich für die Expression des TNF-Rezeptor CD120b (75kD). Die beschriebenen Veränderungen im Kompartiment der nativen T-Lymphozyten waren somit unabhängig von der Klassifizierung der Patienten in die Gruppen A und NA. 6-69 4 3 2 1 0 HD A NA Abb. 23. Verhältnis des prozentualen Anteils CD4+ zu CD8+ TLymphozyten (CD3+); CD4/CD8 100 90 % positive Zellen 80 70 60 50 40 30 20 10 0 HD A NA HD A NA HD A NA CD3+ CD120b+ CD3+ CD95+ CD3+ Abb. 24. Expression von CD120b (TNF-R p75) und von CD95 auf nativen CD3+ T-Lymphozyten 6-70 100 90 % positive Zellen 80 70 60 50 40 30 20 10 0 HD A NA HD A NA HD A NA CD4+ CD120b+ CD4+ CD95+ CD4+ Abb. 25. Expression von CD120b (TNF-R p75) und von CD95 auf nativen CD4+ T-Lymphozyten (p<0.001) 6.2.2. Oberflächenfärbung stimulierter T-Zellen Negativ angereicherte T-Lymphozyten von Patienten und Kontrollen wurden über die α/β-Untereinheit des T-Zell-Rezeptors (BMA031) oder das mit dem TCR assoziierte Molekül CD3 (BMA030) nebst Kostimulation über CD28 stimuliert. Die Untersuchung der Expression von CD69, CD120b (TNF-R 75kD) und CD40L auf CD3 und CD4 positiven Zellen ergab in allen Stimulationsansätzen für die Patienten eine der Kontrolle entsprechende Expression von CD69 und somit die funktionelle Aktivierung der Zellen. Da sich zwischen der Stimulation über den TCR und über CD3 keine Unterschiede im Phänotyp der Zellen zeigten, beschränkt sich die Darstellung auf die Ergebnisse der αTCR/αCD28-Stimulation. Die Auswertung über CD3 ermöglichte den Ausschluß funktioneller Defekte in einer Subpopulation der T-Zellen nicht, da sie sowohl CD4 als auch CD8 positive Zellen einschließt. Die Expression von CD120b auf CD4+ Zellen zeigte für die Patienten (51.1-94.3%) ähnlich wie für die Kontrolle (42.7-96.2%) starke individuelle Unterschiede. Für die Expression des CD40L liess sich auf CD4+ T-Zellen eine signifikante (p=0.0024), jedoch in ihrer funktionellen 6-71 Bedeutung unklare Verminderung für die untersuchten Patienten der Gruppe A im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe nachweisen. Die verminderte Expression des CD40L in der Auswertung über CD3 ist bedingt durch die Verschiebung des % positive CD3+ Zellen Verhältnisses von CD4+ und CD8+ Zellen innerhalb der Patientengruppe. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 HD A NA HD A NA HD A NA CD69+ CD120b+ CD40L+ Abb. 26. Expression von CD69, CD120b (TNF-R p75) und CD40L auf CD3+ T-Lymphozyten nach αTCR- (BMA031) + % positive CD4+ Zellen αCD28 Stimulation 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 HD A NA HD A NA HD A NA CD69+ CD120b+ CD40L+ Abb. 27. Expression von CD69, CD120b (TNF-R p75) und CD40L auf CD4+/CD3+ T-Lymphozyten nach αTCR- (BMA031) + αCD28 Stimulation 6-72 6.2.3. Intrazytoplasmatische Zytokine in CD4+ und CD8+ T-Zellen Negativ depletierte T-Lymphozyten von Patienten und Kontrollen wurden über die α/β-Untereinheit des T-Zell-Rezeptors (BMA031) oder das mit dem TCR assoziierte Molekül CD3 (BMA030) nebst Kostimulation über CD28 und Zugabe von Brefeldin A stimuliert. Es wurde die Expression der Zytokine IFNγ, TNFα, IL-2 und IL-4 und des Aktivierungsmarkers CD69 in CD4 und CD8 positiven T-Zellen durch intrazytoplasmatischen Nachweis untersucht. Da sich zwischen der Stimulation über den TCR und über CD3 keine Unterschiede im Phänotyp der Zellen zeigten, beschränkt sich die Darstellung wiederum auf die Ergebnisse der αTCR/αCD28Stimulation. Die Expression von CD69 in >90% der CD4+ oder CD8+ Zellen wurde als Nachweis der funktionelle Aktivierung in sämtlichen Kontrollen und Patienten gewertet. Der prozentuale Anteil der zytokinpositiven Zellen setzt sich aus dem jeweiligen Meßwert und dem nominellem Abzug des jeweiligen Isotypwertes zusammen. Neben der Isotyp-Kontrolle der Antikörper wurde zur Sicherstellung der Stimulationsbedingungen stets eine Tages- und eine Mediumkontrolle mitgeführt. In der Auswertung der CD4+ Zellen zeigten lediglich zwei Patienten Auffälligkeiten im Zytokinmuster. Ein Patient der Gruppe A und einer der Gruppe NA wiesen einerseits nahezu eine Verdoppelung der IFNγ positiven Zellen, andererseits eine Verminderung der IL-2 positiven Zellen um bis zu 50% gegenüber der Kontrolle und den restlichen Patienten auf. Für den Nachweis von TNFα (45.1-63.1%) und IL-4 (05.7%) stellten sich alle Patienten unauffällig dar. 6-73 100 % positive CD4+ Zellen 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 HD A NA HD A NA CD69+ IFNg+ HD A NA TNFa+ HD A NA IL-2+ HD A NA IL-4+ Abb. 28. Intrazytoplasmatischer Nachweis von IFNγ, TNFα, IL-2 und IL-4 in CD3+/CD4+ T-Lymphozyten nach αTCR- + αCD28 - Stimulation Im Kompartiment der CD8+ Zellen fiel für alle Patienten unabhängig von deren Klassifizierung in die Gruppen A und NA eine signifikante Erhöhung der IFNγ- und TNFα-Produktion auf. Für die Gruppe A liess sich eine signifikante (p=0.017) Steigerung der für IFNγ positiven CD8+ Zellen auf 41% bis 68%, für die Gruppe NA auf 34% bis 68% gegenüber der Kontrolle (5% bis 32%) nachweisen. Für TNFα zeigte sich eine signifikante (p=0.023) Steigerung der positiven CD8+ Zellen auf 38% bis 62%, für die Gruppe NA auf 29% bis 54% gegenüber der Kontrolle (6% bis 27%). Zudem konnte die verminderte IL-2 Produktion in zwei Fällen auch für die CD8+ Zellen bestätigt werden. Die relative Steigerung der Th1-Antwort erfährt eine weitere Betonung durch die Erhöhung der Absolutzahl der CD8+ Zellen innerhalb der CD3+ T-Zellen der Patienten. 6-74 100 % positive CD8+ Zellen 90 p=0.017 80 p=0.023 70 60 50 40 30 20 10 0 HD A NA HD A NA CD69+ IFNg+ HD A NA TNFa+ HD A NA IL-2+ HD A NA IL-4+ Abb. 29. Intrazytoplasmatischer Nachweis von IFNγ, TNFα, IL-2 und IL-4 in CD3+/CD8+ T-Lymphozyten nach αTCR- + αCD28 - Stimulation 6.3.1. Transformation und Etablierung von B-Zell-Linien Reine B-Lymphozyten wurden aus mononukleären Zellen über den Pan-B-Zellmarker CD19 positiv selektioniert und auf eine Konzentration von 1x106Zellen/ml R10 eingestellt. Der konzentrierte Überstand einer EBV-Kultur wurde den B-Zellen in einem Verhältnis von 1:50 zugegeben und die Zellen in einem Gesamtvolumen von 1 Milliliter R10-Medium bei 37°C und 5%CO2 Begasung in 24-well-Platten inkubiert. Nach einer Inkubationszeit von mindestens zwei Wochen und mehrfacher Teilung der Kulturen wurde die Charakterisierung der Oberflächenmarker CD86, sIgM, sIgD und sIgG entsprechend dem bekannten Protokoll durchgeführt. Für die Messung der Syntheseleistung wurden 0.5x106Zellen/ml für 9 Tage inkubiert, der Überstand gewonnen und in einem ELISA nach bekanntem Protokoll auf den Gehalt an IgM und IgG untersucht. 6-75 6.3.2. EBV-Linien-Ergebnisse Die Möglichkeit einer Rekonstitution der Expression von CD86 und der Synthese von Immunglobulinen wurde an EBV-transformierten B-Zell-Linien von 10 Patienten der Gruppe A im Vergleich zu 12 Patienten der Gruppe NA und 13 Kontrollen untersucht. Auf den Zellen wurde die Expression von CD86 und der Oberflächenimmunglobuline sIgM, sIgD und sIgG bestimmt. Die Syntheseleistung wurde durch eine ELISAUntersuchung für IgM und IgG im Kulturüberstand ermittelt. Die EBV-transformierten B-Zell-Linien der Patienten der Gruppe NA zeigten eine konstitutive (89.2%-96.4%) Expression von CD86. Im Vergleich erreichten die Patienten der Gruppe A (82.0%93.3%) mit Ausnahme eines Patienten (66.8%) eine entsprechende Expression. %CD86+ B-Zellen (CD19+) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 A NA Abb. 30. Expression von CD86 auf nativen EBVtransformierten B-Zell-Linien (CD19+) der CVID-Patienten Die Zahl der für IgM und IgD doppelt positiven Zellen war besonders in der Gruppe A der Patienten erhöht, welches auf eine verminderte Frequenz von Zellen nach durchgemachtem Klassenwechsel hinweist. Insgesamt war die Expression von sIgM, sIgD und sIgG sehr unterschiedlich zwischen den einzelnen Patienten und Kontrollen. % positive B-Zellen (CD19+) 6-76 100 80 60 40 20 0 HD A NA HD A NA HD A NA sIgM+ sIgD+ sIgG+ Abb. 31. Expression von sIgM, sIgD und sIgG auf EBVtransformierten B-Zell-Linien Im Überstand der Kultur wiesen die Patienten der Gruppe A eine der Kontrolle entsprechende Syntheseleistung für IgM auf, hingegen zeigte sich für IgG eine fehlende oder stark verminderte Synthese. p=<0.0001 25000 80000 20000 60000 15000 40000 10000 20000 5000 0 0 HD A NA IgM HD A NA IgG Abb. 32. IgM und IgG in quantitativer Bestimmung (ng/ml) im Überstand der EBV-transformierten B-Zell-Linien IgG im Überstand (ng/ml) IgM im Überstand (ng/ml) 100000 6-77 6.4. Native Monozyten Alle 11 untersuchten Patienten (4.1%-23.9%) wiesen einen der Kontrollgruppe (5.7%-18.4%) entsprechenden Prozentsatz CD14 positiver Monozyten an den isolierten mononukleären Zellen auf. Ebenso wie die Kontrolle zeigten die Patienten eine konstitutive Expression des IFNγ-Rezeptors (CD119) auf >87% der nativen Zellen. Weiterhin wurde eine konstitutive, in der Höhe normale Expression von CD86 auf nativen Monozyten der Patienten, insbesondere der Gruppe A gefunden. Von einem Patienten der Gruppe NA abgesehen, exprimierten >90% der Zellen CD86 auf ihrer Oberfläche. %CD14+ Monozyten 100 80 60 40 20 0 HD A NA Abb. 33. Prozentualer Anteil CD14 positiver Monozyten an den nativen PBMC %CD119+ Monozyten 100 80 60 40 20 0 HD A NA Abb. 34. Expression von CD119 (IFNγ-R) auf nativen CD14+ Monozyten 6-78 %CD86+ Monozyten 100 80 60 40 20 0 HD A NA Abb. 35. Expression von CD86 auf nativen Monozyten 6-79 Abb. 36. Expression von CD86 auf CD14+ nativen Monozyten im Vergleich einer gesunden Kontrolle (UDZ) und eines Patienten der Gruppe A (JMN) mittels Histogramm-Overlay Darstellung 7-80 7. Diskussion Das Variable Immundefektsyndrom (CVID) ist das häufigste (1:20000) symptomatische Antikörperdefizienz-Syndrom. Die Erkrankung ist charakterisiert durch Defekte der terminalen B-Zell Differenzierung und des Ig-Klassenwechsels, welche zu einem Mangel an Plasmazellen führen. Das Unvermögen, Antikörper der meisten oder aller Ig-Klassen zu bilden, bedingt schwere Defekte in der humoralen Immunantwort gegen bakterielle oder virale Pathogene. Der mögliche zugrundeliegende Mechanismus wird kontrovers diskutiert. Für einen Teil der CVIDPatienten wurden gestörte T-Zell Funktionen durch ein verändertes Zytokinmuster [103;118;119;278;279;289;332], durch eine verminderte Expression des CD40L [113;383] und und eine eingeschränkte Entwicklung antigen-spezifischer Memory-TZellen [198] beschrieben. Andere Untersuchungen lassen bei intakter Helferaktivität der T-Zellen [102] primäre Defekte im B-Zell Kompartiment annehmen. Bei humoralen Immunantworten hängen die B-Zell Aktivierung und die Differenzierung zu Plasmazellen von einer regelrechter Interaktion von T- und B-Zellen ab. Obligat für die Switch Rekombination und die Antikörperbildung ist eine Kostimulation durch die Rezeptor-Liganden-Paare CD28/CTLA-4 - CD80/CD86 und CD40-CD40L [22;48;49]. In T-Zellen wird die Zytokinproduktion und die CD40L Expression erst nach Triggerung des CD28 Korezeptor durch B7 Liganden auf B-Zelle, Makrophagen oder dendritischen Zellen induziert. In dieser Arbeit wurden für diese Interaktionen bedeutsame Oberflächenmoleküle auf nativen und voraktivierten B-, T-Lymphozyten und Monozyten, sowie intrazytolasmatischem die Nachweis Zytokinsynthese untersucht. von Des T-Lymphozyten weiteren konnten mittels EBV- transformierte B-Zellinien der Patienten etabliert und in ihren Eigenschaften analysiert werden. 7.1. Untersuchung von nativen B-Zellen Der prozentuale Anteil der für den pan-B-Zell-Marker CD19 positiven Zellen innerhalb der mononukleären Zellen war für 6 der 8 Patienten der Gruppe A und für alle 12 der Gruppe NA normal. Lediglich zwei Patienten der Gruppe A wiesen einen Prozentsatz an zirkulierenden B-Zellen von <1% auf und fallen damit in die CVIDKlassifikationsgruppe mit wenig B-Zellen. 7-81 Bereits im Rahmen der routinemäßig durchgeführten Immunstatusuntersuchung waren die Daten zur Oberflächenexpression von IgM, IgD, CD5 und CD10 auf BZellen erhoben worden. Sowohl für die Expression von IgM als auch von IgD auf der Zelloberfläche fand sich in den Patientengruppen A und NA ein signifikant höherer Prozentsatz im Vergleich zu gesunden Probanden. Dieser erhöhte Prozentsatz IgM/IgD doppelt positiver B-Zellen weist auf eine reduzierte Frequenz von Zellen mit vollzogenem Ig-Klassenwechsel hin [95]. Für die Expression von CD5 [193;314] und CD10 [64] lagen nur für einen Teil der Patienten und Kontrollen Befunde vor. Auffälligkeiten ließen sich hierbei keine feststellen. Für die Expression des Oberflächenmolekül CD21, das eine zentrale Rolle in T-Zell abhängigen als auch T-Zell unabhängigen Immunantworten [7;73], in der Regulation des Wachstum und der Differenzierung der B-Lymphozyten [20] sowie bei der Modulation der Signaltransduktion des Antigenrezeptors [386] spielt, fand sich bei lediglich 3 Patienten der Gruppe A auf nativen CD19+ B-Zellen eine leichte Verminderung des Prozentsatzes CD21+ Zellen auf 72% bis 87%. Diese verminderte Expression lässt sich jedoch statistisch nicht als signifikant beschreiben. Die Expression von CD21 markiert den Übergang von der unreifen zur reifen B-Zelle nach Verlassen des Knochenmark [95;226]. Nach Aktivierung der B-Zelle lässt sich das Molekül nicht mehr auf der Oberfläche nachweisen. Der verminderte Prozentsatz CD21+ B-Zellen bei einigen Patienten ist vermutlich auf eine Reifungsstörung zurückzuführen. In einer kürzlich publizierten Folgearbeit unserer Gruppe liess sich eine signifikante Assoziation zum Vorhandensein einer Splenomegalie nachweisen [414]. Für die Expression des B-Zell spezifischen Moleküls CD22, das in den Pro- und frühen Pre-B Zell Stadien zytoplasmatisch, später auf der Zelloberfläche exprimiert wird [93] und bei der Aktivierung [92] und der Signaltransduktion über den IgMRezeptor [217] einbezogen ist, fanden sich keinerlei Auffälligkeiten bei den untersuchten Patienten. Das Molekül CD23, ein niedrig affiner Rezeptor für IgE [191], ist ein Typ II Transmembranmolekül und auf vielen hämatopoetischen Zelltypen exprimiert. CD23 hat neben der Modulierung der IgE Produktion [120] pleiotrope Aufgaben in der 7-82 Kontrolle des Verhaltens von Lymphozyten. Es interagiert spezifisch mit CD21 [17]. Das Molekül liess sich bei gesunden Kontrollen auf >75% der nativen peripheren CD19+ B-Lymphozyten nachweisen. Für 4 Patienten der Gruppe A und einen Patienten der Gruppe NA fand sich eine auf 52% bis 75% verminderte Expression. CD23 defiziente Mausmodelle zeigen vornehmlich eine gestörte Regulation der IgE Synthese [207], sodass bei den betroffenen Patienten erniedrigte Spiegel von IgE zu erwarten sind, nicht lässt sich dadurch die Verminderung von IgG und IgM erklären. Allerdings kann dies ein weiterer Hinweis auf eine Dysregulation bereits der nativen B-Zellen, eine veränderte Zusammensetzung der untersuchten Population von BLmphozyten oder für einen dauerhaften Aktivierungszustand mit Verlust von CD23 auf der Zelloberfläche sein. Nach 24 Stunden Stimulation fand sich bei einer gesunden Kontrolle in den Versuchen zur Expressionskinetik ein Abfall der CD23 exprimierenden Zellen von anfänglich 93.1% auf 80.2%. Antigenspezifische Zellkontakte im Immunsystem werden durch antigen unspezifische Interaktion obligat modifiziert [369]. Beispielhaft dient CD54, Synonym für ICAM-1 (intercellular adhesion molecule), als Ligand für LFA-1 [353]. Für dieses an der regelrechten Interaktion von T- und B-Zellen massgeblich beteiligten Moleküls fand sich eine konstitutive Expression auf >90% der nativen B-Lymphozyten sämtlicher Patienten und Kontrollen. Ein Expressionsdefekt kann somit ausgeschlossen werden. 7.2. Untersuchung von stimulierten B-Zellen Signale über den Antigenrezeptor (sIg), CD40 sowie verschiedene Zytokinrezeptoren sind essentiell für eine erfolgreiche B-Zelldifferenzierung [65;208]. Es wurde daher geprüft, inwiefern B-Zellen von CVID-Patienten bei in vitro Stimulation über diese Rezeptoren eine normale Antwort in Bezug auf die Regulation wichtiger Kostimulations-/Differenzierungsmoleküle zeigen. Die Ergebnisse zur aktivierungsabhängigen Regulation ausgewählter Oberflächenmoleküle werden im folgenden detailliert diskutiert. Für das als früher Aktivierungsmarker dienende Molekül CD69 zeigte sich in sämtlichen Stimulationssituationen über die µ-Kette des Antigenrezeptor, über CD40 7-83 oder durch Zugabe der Zytokine IL-2 und IL-10 eine der Kontrolle entsprechende Induzierbarkeit. CD69 ist ein den C-Typ Lektinen im Tierreich verwandtes Typ II Transmembranglykoprotein [266] und aktivierungsabhängig auf unreifen Thymozyten, reifen T- und B-Lymphozyten, NK-Zellen (natural killer cells), Monozyten, Neutrophilen und Eosinophilen, und konstitutiv auf myeloischen Precursor-Zellen im Knochenmark, auf Subpopulationen von Lymphozyten sekundär lymphatischer Organe und Blutplättchen exprimiert [435]. Es ist das früheste Leukozyten Aktivierungsantigen. Die Besetzung des Oberflächenmoleküls durch spezifische Antikörper ruft intrazelluläre Signale wie Ca2+ Flux, Zytokinsynthese und Zellproliferation hervor. Der physiologische Ligand ist jedoch bislang unbekannt [266]. CD69 (-/-) defiziente Mäuse zeigten eine weitgehend unauffällige hämatopoetische Zellentwicklung und normale T-Zell-Subpopulationen in Thymus und der Peripherie. NK-Zellen und zytotoxische T-Lymphozyten wiesen eine den Wild-Typ Mäusen vergleichbare zytotoxische Aktivität auf. Interessanterweise war die B-Zell Entwicklung in Abwesenheit von CD69 gestört. Das B220(hi)IgM(neg) Pre-B Zell Kompartiment im Knochenmark war in CD69 (-/-) Tieren vergrössert. Nach Immunisierung mit T-zellabhängigen wie auch T-zell unabhängigen Antigenen verlief die B-Zellantwort weitgehend ungestört. Es zeigt, dass CD69 eine Rolle in der B-Zell Entwicklung spielt und lässt eine in vivo möglicherweise redundante stimulatorische Aktivität auf Knochenmarksabkömmlinge vermuten [212]. Weitere Ergebnisse deuten auf eine mögliche Beteiligung von CD69 in der Pathogenese von Erkrankungen wie der rheumatoiden Arthritis, chronisch entzündlichen Leberveränderung, dem milden Asthma bronchiale und dem erworbenen Immundefizienzsyndrome (AIDS) hin [238]. CD62L (LECAM-1, L-selectin) gehört zu der Familie der Selektine der interzellulären Adhäsionsmoleküle. Es vermittelt die Adhäsion von Leukozyten am vaskulären Endothelium, die Akkumulation im Rahmen einer Entzündungsreaktion und die Migration in periphere Lymphknoten [172;327]. Seine weite Verbreitung über sämtliche Leukozyten Populationen verspricht eine massgebliche Rolle in leukozytärendothelialen Interaktionen. Nach Aktivierung der Protein Kinase C (PKC) oder der Calmodulin Inhibition wird das Protein durch einen proteolytischen Mechanismus im Bereich der membrannahen Ektodomäne auf der Zelloberfläche nicht mehr nachweisbar [122]. Mäuse, denen dieser Oberflächenrezeptor fehlt, wiesen eine schwere Verminderung der in peripheren Lymphknoten lokalisierten Lymphozyten 7-84 auf. Die Zellen waren nicht in der Lage an die hohen endotheliale Venulen (HEV) zu binden. Signifikante Defekte in der Migration von Lymphozyten in mukosale Lymphknoten, Peyer's Patches, die Milz und nicht lymphoide Gewebe während einer entzündlichen Reaktion waren zu beobachten [14;376]. Wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, ist CD62L auf nativen B-Zellen von CVID-Patienten mit Einschränkung durch eine Verminderung bei zwei Patienten der Gruppe A auf 40% und 57% normal exprimiert und wird bei sämtlichen Patienten nach B-Zellaktivierung regelrecht herunterreguliert. Im Gegensatz zur normalen aktivierungsabhängigen Hochregulation von CD69 und dem Verlust von CD62L exprimierten alle Patienten der Gruppe A nach Stimulation über die µ-Kette des sIgM signifikant weniger CD86 als gesunde Spender und als die Patienten der Gruppe NA. Weder die Kostimulation durch α-CD40 Antikörper noch die Verlängerung der Inkubationszeit von 20 auf 44 Stunden vermochten die CD86 Expression zu normaler Höhe zu rekonstituieren. Diese Verminderung liess sich unter Ausschluss humoral oder zellulär zytotoxischer Effekte sowie supprimierender Einflüsse von T-Zell Zytokinen und in hoch aufgereinigten peripheren B-Lymphozyten bestätigen. In einer für die mRNA von CD86 spezifischen und zugleich quantitativen Polymerase-Ketten-Reaktion fand sich eine Bestätigung der gestörten Oberflächenexpression im Nachweis einer verminderten Transkription des für CD86 kodierenden Genes. Das gegenwärtige Modell zur T-B-Interaktion erfordert zwei Signale. Das erste Signal ist durch die T-Zell Rezeptor Erkennung und die Bindung an den MHC/Antigen Komplex einer antigenpräsentierenden Zelle (APC) spezifisch. Das zweite ist unspezifisch und resultiert aus der Bindung des B7 Liganden der APC mit seinen möglichen Rezeptoren auf T-Zell Seite. Im Falle von CD28 wird die T-Zelle proliferieren und Zytokine freisetzen. CD152 (CTLA-4) vermag, die T-Zelle proliferationsinhibitorisch zu beeinflussen [257]. CD80 (B7.1) wie auch CD86 (B7.2) können an CD28 und CD152 binden, sie unterscheiden sich in ihrer Bindungsaffinität, Struktur und zeitlichen Expression [223]. In Untersuchungen zur Zytokinsynthese zeigten sich bislang lediglich geringe Unterschiede zwischen CD80 und CD86 [210;218;296]. T-Zell Stimulation in Abwesenheit eines zweiten, kostimulatorischen Signals kann zur Anergie oder der Induktion des Zelltod führen 7-85 [354]. Im Gegensatz zu CD86 fanden sich für die Expression von CD80 weder im nativen noch im stimulierten Zustand Auffälligkeiten. Beispielhaft für die zentrale Bedeutung von CD80 findet sich der fallbericht einer CVID Patientin mit rekurrierenden Episoden einer zyklischen Neutropenie, einer kutanen Vaskulitis und bakteriellen Infektionen bei Nachweis eines reproduzierbaren CD80 Expressionsdefektes auf stimulierten B-Lymphozyten [258]. Neben CD86 zeigte mit CDw137 ein weiteres Oberflächenmolekül eine reduzierte Induzierbarkeit nach Stimulation der µ-Kette. CDw137 gehört der Superfamilie der TNF-Typ I Rezeptoren an [347] und wird nach Aktivierung auf B-Zellen, T-Zellen und Monozyten exprimiert [139]. Der Rezeptor hat neben seiner Bedeutung als kostimulatorisches Molekül für T-Lymphozyten eine wichtige Funktion im Prozess der Antigenpräsentation, der Entstehung zytotoxischer T-Zellen, dem Langzeitüberleben von CD8+ und der Anergisierung von CD4+ T-Zellen [205]. Für 4-1BB, das analoge murine Molekül des humanen CDw137, defiziente Mäuse zeigten bei einer gesteigerten Proliferationsrate auf Mitogene eine verminderte Zytokinproduktion und CTL Aktivität. Zudem scheint 4-1BB eine Rolle in der Regulation des Wachstums myeloischer Vorläuferzellen zu spielen [206]. Bezüglich der defizienten CD86 Expression ähneln die B-Lymphozyten der CVID Typ A Patienten phänotypisch anergen B-Lymphozyten, wie sie in einem transgenen Mausmodel für B-Zell-Toleranz [138] gefunden wurden. In diesem Modell zirkulieren reife B-Zellen in normaler Zahl, die auf ihrer Oberfläche für hen-egg lysozyme (HEL) spezifische Immunglobuline der Klassen M und D exprimieren. Jedoch sind diese BLymphozyten durch die dauerhafte Exposition von löslichem HEL für Aktivierungssignale unempfindlich. Sie vermögen nach der Kreuzvernetzung des BCR weder die Expression von CD86 zu erhöhen noch HEL-spezifische Antikörperantworten hervorzubringen [70;309]. Zudem werden antigen-spezifische TZellen während der veränderten Interaktion von T- und B-Zellen nur unvollständig aktiviert [167] und B-Zellen könnten durch CD95-induzierte Apoptose getötet werden [308;309]. Es wurde gezeigt, daß eine unvollständige Aktivierung antigenspezifischer CD4+ T-Zellen zu einer insuffizienten Produktion von IL-2 und einer wechselhaften Expression von CD40L führt. Die verminderte Produktion von IL-2 und Expression von CD40L sind zentrale Grundlagen für die Hypothese einer primäre T- 7-86 Zell-Defizienz als Ursache des CVID [119;383]. Neuerliche Ergebnisse lassen jedoch vermuten, daß naive CD4+ T-Zellen, sobald sie auf B-Zellen antigene Strukturen nicht gemeinsam mit kostimulatorischen Signalen von CD28/CD86 antreffen, keine ausreichende Menge von IL-2 sezernieren und unfähig bleiben, B-Zellen regelrecht über CD40L zu stimulieren [177;234]. Mäuse, denen das Gen für CD86 fehlt, weisen eine ausgeprägte Hypogammaglobulinämie, eine gestörte Keimzentrumsbildung und eine fehlende spezifische, T-Zell-abhängige Antikörperantwort auf [34]. Im Gegensatz zeigen Tiere, denen das Gen für CD80 fehlt, keine entsprechenden Auffälligkeiten und bestätigen die zentrale Rolle von CD86 für die Synthese von Immunglobulinen. Somit ist die effektive Stimulation naiver T-Helferzellen nicht nur von der Kostimulation über CD86 abhängig, sondern die Kostimulation ebenso Voraussetzung für eine regelrechte Aktivierung der B-Zellen, den Ig-Klassenwechsel und den Prozeß der IgVHypermutation, für den bei CVID-Patienten, die möglicherweise der Gruppe A angehören, eine Störung beschrieben wurde [220]. Die phänotypischen und funktionellen Ähnlichkeiten zwischen den B-Lymphozyten der Gruppe A Patienten und den für CD86 defizienten oder anergen B-Zellen der Mäuse lassen die Annahme zu, daß Defekte in der Regulation von CD86 als Model für die immunregulatorischen Störungen der Gruppe A CVID-Patienten dienen können. Es muss allerdings angemerkt werden, dass im Gegensatz zu den CD86 Maus-knockouts bei den CVIDPatienten eine reguläre CD86 Expression auf Monozyten und EBV-transformierten BZellinien gefunden wurde. In einer früheren Arbeit vertreten Eisenstein et al. [102] eine ähnliche Ansicht, indem sie zeigen, daß die funktionelle B-Zell-Defizienz durch Vorstimulation mit anti-CD40 in Kombination mit IL-10 und eine verlängerte Kulturdauer zum Teil reversibel war. In dieser Arbeit waren die Patienten jedoch nicht nach den Klassifikationskriterien von Bryant et al. in die Gruppen A bis C eingeteilt worden, sodaß unklar bleibt, ob die Anergie der B-Zellen auf die Patienten der Gruppe A beschränkt war. Neben den Hypothesen einer Anergisierung im Sinne einer extrinsisch bedingten funktionellen Dysregulation oder einem intrinsischen B-Zell-Defekt stellt sich zur Erklärung der experimentellen Befunde die Frage nach einer veränderten Zusammensetzung der vorhandenen B-Lymphozyten-Population, insbesondere des 7-87 Kompartiments der B-Gedächtniszellen. Nach ihrer antigen-unabhängigen Entwicklung [156] verlassen die unreifen B-Zellen das Knochenmark und bilden den reifen, naiven IgD+IgM+CD27- B-Zell-Pool [226]. Werden diese Zellen durch Antigen in Anwesenheit einer ausreichenden Kostimulation stimuliert, sind sie zur Ausbildung einer Keimzentrumsreaktion (germinal center reaction) in der Lage und entwickeln sich entweder zu Immunglobulin sezernierenden Plasmazellen oder zu BGedächtniszellen (memory B-cells) [229]. Für den Grossteil der CVID-Patienten ist die Entwicklung dieser beiden Zelltypen schwer gestört, während reife B-Zellen meist in weitgehend normaler Menge vorhanden sind [41;174;414]. Dies ist Hinweis für Defekte in der späten B-Zell-Differenzierung. Da die Entwicklung von BGedächtniszellen eine regelrechte Keimzentrumsreaktion in sekundär lymphatischen Organen voraussetzt [229], würde eine Verminderung des switched-memory B-Zell Kompartimentes die Hypothese einer gestörten Keimzentrumsreaktion unterstützen. Vielerlei mögliche Ursachen einer gestörten Keimzentrumsreaktion sind beschrieben worden. Mutationen im Gen des CD40-Liganden [89;199], Defekte in der TNFαFamilie [10] und ihren Rezeptoren [107] und die gestörte Expression kostimulatorischer Moleküle wie CD86 [153] und Chemokine [13] besitzen starken Einfluss auf Formation und Funktion des Keimzentrums. Optimierte Interaktionen zwischen B- und T-Zellen inmitten des histoarchitektonischen Netzwerkes von follikulär dendritischen Zellen sind für die Entwicklung des primären zu einem sekundären Follikel unerlässlich. Die Ergebnisse zeigen, dass die aufgrund einer unvollständigen Expression von CD86 und CDw137 vermutete funktionelle Anergie der B-Lymphozyten auf die Patienten der Gruppe A begrenzt ist. Der den anergen Phänotyp der peripheren BZellen bedingende Mechanismus bleibt spekulativ. Jedes Erklärungsmodell muß allerdings berücksichtigen, daß die Krankheit meist zwischen der ersten und dritten Lebensdekade ihren klinischen Beginn nimmt und zuvor eine unauffälligen kindliche Impf- und Infektionsanamnese bestand. Die Populationszusammensetzung des BZell Memory Kompartimentes muss in weiteren Untersuchungen beschrieben werden. Chronisch vorhandene, lösliche Proteine mit einer weiten BCR-Spezifität und subthreshold Aktivierungseigenschaften wie zum Beispiel virale oder bakterielle Superantigene sind mögliche Kandidaten für anergisierende Agenzien. Zum anderen ist ein B-Zell-troper Virus vorstellbar, der mit der Signaltransduktion der Zelle 7-88 interagiert und die Ausreifung zur Plasmazelle stört. Hierzu ist festzuhalten, dass in Untersuchungen des durch Interferon Typ I induzierten MxA-Proteins kein Hinweis für eine virale Infektion gefunden wurde [333]. In drei untersuchten CVID-Patienten konnte kein erhöhter Prozentsatz an EBV-infizierten B-Zellen festgestellt werden (persönliche Mitteilung durch Herrn Prof.G.Bauer, Virologisches Institut, Freiburg). Eine weitere Hypothese für die gestörte B-Zell-Funktion ist eine erworbene Stammzell-Mutation, die Bestandteile der Signaltransduktion beeinflußt, analog zur Situation, die für die GPI anchor deficiency bei der paroxysmalen nächtlichen Hämoglobinurie (PNH) gefunden wurde [252]. 7.3. Untersuchung von nativen T-Zellen Der prozentuale Anteil der für den pan-T-Zell-Marker CD3 positiven Zellen an den nativen mononukleären Zellen war für 4 der 6 untersuchten Patienten der Gruppe A und für alle Patienten der Gruppe NA normal. Zwei Patienten der Gruppe A wiesen eine Verminderung der Gesamt-T-Zellpopulation auf < 47% an den PBMC auf. Mit Ausnahme eines Patienten zeigten sämtliche Patienten der Gruppe A und 3 Patienten der Gruppe NA eine deutliche Verkleinerung der CD4+ T- Helferzellpopulation auf < 25% der PBMC. Diese Veränderung spiegelt sich ebenso im verminderten Verhältnis von CD4+ zu CD8+ Zellen (CD4:CD8 Ratio) wider. CD4 besitzt als Korezeptor obligate Bedeutung für die MHC-II restringierte antigeninduzierte T-Zell Aktivierung [133;340], für Mechanismen der T-Zelldifferenzierung im Thymus [195] und der Interaktion von T- und B-Lymphozyten [239]. Aktivierte CD4+ T-Zellen induzieren eine von kostimulatorischen Ligandenpaaren wie CD40 - CD40L und CD28 - CD80/CD86 obligat abhängige Proliferation und Differenzierung von unreifen Vorläufer- [312] und vor allem von reifen B-Lymphozyten [65;208]. Sie sind für eine regelrechte Entwicklung der B-Zelle zur immunglobulin-sezernierenden Plasmazelle und Ausbildung einer humoralen Immunantwort unerlässlich [95]. CD8 ist ein MHC I restringiertes, monomorphes Glykoprotein mit einer den Immunglobulinen verwandten Struktur. CD8αβ-Heterodimere sind an der Oberfläche einer Subpopulation von Thymozyten, reifen α/β- und γ/δ-T-Zell-Rezeptor-positiven T-Lymphozyten und auf natürlichen Killerzellen (NK) exprimiert [137;416]. CD8 besitzt zentrale Funktion in der Differenzierung zytotoxischer T-Lymphozyten [282;419]. Anhand ihrer Aufgabe für die zelluläre Immunantwort werden die CD8+ T- 7-89 Zellen in Naiv-, Effektor- und Memory-Populationen unterschieden [387]. Eine Verminderung der CD4+ T-Zellen, teils mit Expansion der absoluten CD8+ TLymphozytenzahl und einer Umkehr des CD4/CD8-Quotienten liess sich bei CVIDPatienten durch verschiedenen Autoren zeigen [24;112]. Eine verminderte CD4/CD8 Ratio findet sich ähnlich im Verlauf einer Virusinfektion z.B. mit dem humanen Immundefizienz-Virus (HIV) [35;328]. Bei CVID-Patienten liess sich zudem eine Expansion der CD8+ Population mit Koexpression der Aktivierungsmarker HLA-DR und CD25 (IL-2-R) [24;425] demonstrieren. Diese Ergebnisse deuten auf eine Voraktivierung von T-Lymphozyten in vivo hin, wobei deren primäre oder sekundäre Charakteristik in Bezug auf den zugrundeliegenden Defekt bislang unklar blieb und am ehesten durch vermehrte Infekte zu erklären ist. Auf den CD4+ T-Lymphozyten sämtlicher Patienten konnte eine hoch signifikante Erhöhung der Expression des Fas-Antigen CD95 (APO-1) auf 65% bis 95% der Zellen nachgewiesen werden. Eine erhöhte Expression wurde bereits auf T-Zell- [170] und B-Zell-Subsets [151;342], teils mit erhöhten Apoptoseraten einhergehend beschrieben. Bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes (SLE) wurde eine gesteigerte Expression von CD95 auf T-Lymphozyten als Mechanismus der peripheren Lymphopenie postuliert [11]. CD95 gehört der Familie der TNF-Rezeptoren an, vermittelt Apoptose induzierende Signale und ist typischerweise stark exprimiert auf aktivierten T- und BZellen [202;265]. Die starke native Überexpression von CD95 bei CVID-Patienten der Gruppe A als auch NA ist analog zu CD29 und CD57 am ehesten als Ausdruck rezidivierender Infektepisoden mit ausgeprägter zellulärer Abwehrreaktion zu beurteilen. Lediglich eine tendenziell gesteigerte Expression fand sich für den TNF-R p75 (CD120b) auf nativen CD4+ T-Zellen. Ein quantitativer Expressionsdefekt kann für CD120b somit ausgeschlossen werden, funktionell bedeutsame Veränderungen der Proteinstruktur allerdings nicht. Bei einer auch in der Kontrollgruppe auftretende grossen Variationsbreite der Expression zeigten sich auch nach Stimulation keine auffälligen Befunde. CD120b ist auf vielen Zelltypen zu finden, insbesondere solchen myeloischen Ursprungs, und wird stark auf stimulierten T- und B-Zellen exprimiert. CD120b ist der auf zirkulierenden T-Lymphozyten hauptsächlich gefundene Rezeptor für den Tumornekrosefaktor und Hauptmediator der autoregulatorischen Apoptose in CD8+ Zellen [27]. Mäuse, denen der TNF-Rezeptor mit einem Molekulargewicht von 55kD (CD120a) fehlt, zeigen schwerste Störungen in der Abwehr von Infektionen durch Mykobakterien [98], Leishmania major [399] und Listeria monozytogenes [298]. 7-90 Zudem ist die Entwicklung der Peyer's Patches im Intestinum [270] gestört. Allerdings sind sie unempfänglich für die toxischen Wirkungen des Tumornekrosefaktors im Rahmen eines Endotoxinschocks [329]. 7.4. Untersuchung von stimulierten T-Zellen Durch negative Selektion angereicherte T-Lymphozyten von Patienten und Kontrollen wurden über die α/β-Untereinheit des T-Zell-Rezeptors (BMA031) oder das mit dem TCR assoziierte Molekül CD3 (BMA030) nebst Kostimulation über CD28 stimuliert. Es fand sich in sämtlichen Stimulationsansätzen für die Patienten eine der Kontrolle entsprechende Expression von CD69 und somit eine funktionelle Aktivierbarkeit der T-Zellen [238]. Die Expression des TNF-Rezeptors (75kD) CD120b zeigte nach Stimulation auf CD4+ T-Zellen mit Ausnahme zweier Patienten der Gruppe A und zweier gesunder Probanden eine ausgeprägte Steigerung auf Werte über 80% der Zellen. Es liessen sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen beschreiben. Auffällig bleibt die grosse individuelle Variation in der Expression von CD120b auf voraktivierten T-Zellen. Die regelrechte Interaktion zwischen dem CD40 Liganden (CD40L) auf TLymphozyten und CD40 auf antigen-stimulierten B-Lymphozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen ist von zentraler Bedeutung für die Entwicklung einer humoralen wie auch zellulären Immunantwort [22;145;149;271]. Arbeiten mit CD40L defizienten Mäusen zeigen die wichtige Rolle der CD40 - CD40L Interaktion für T-Zell abhängige Immunantworten und die Formierung von Keimzentren [427]. Für die Patienten der Gruppe A zeigte sich auf vorstimulierten CD4+ T-Zellen eine geringe, jedoch signifikant (p=0.0024) verminderte CD40L Expression auf 80% bis 88% gegenüber 91% bis 98% in der Kontrollgruppe. Eine Verminderung des CD40L für Subgruppen von CVID-Patienten konnte bereits in mehreren Arbeiten nachgewiesen werden [113;383]. Die X-chromosomal vererbte Form des Hyper-IgM (HIM) Syndrom ist Folge von Mutationen im Gen des CD40L [16;89;199] mit vollständigem Verlust seiner Funktion für T- und B-Zelle. Es ist charakterisiert durch eine Verminderung oder das Fehlen von IgG, IgA und IgE bei normalen oder erhöhten Spiegeln von IgM. Klinisch stehen rekurrierende Infekte des Respirationstraktes, chronische Diarrhoen 7-91 und Leberbeteiligungen im Vordergrund [219]. Die funktionelle Bedeutung der bei den CVID-Patienten beobachteten Verminderung auf Werte >80% der CD4+ T-Zellen ist angesichts der Daten für Hyper-IgM-Konduktorinnen (Carrierstatus) als zugrundeliegende Ursache für die schweren humoralen Defekte unwahrscheinlich. Trotz einer Expression des CD40L von zum Teil lediglich 12% sind die heterozygoten Konduktorinnen des XHIM klinisch weitgehend unauffällig [84]. 7.5. Intrazytoplasmatischer Nachweis von Zytokinen in CD4+ und CD8 T-Zellen Zytokine sind lösliche Proteine, die eine wichtige Rolle in der Immunregulation von Lymphozytenfunktionen spielen. Sie regulieren Wachstum, Differenzierung und Funktion einer grossen Zahl verschiedener Zellen und vermitteln physiologische aber auch pathologische Immunantworten. T-Zellsubpopulationen lassen sich anhand ihres Zytokinprofiles definieren. Für eine zellulär vermittelte TH1-Antwort verantwortliche T-Zellen produzieren typischerweise Interleukin-2 (IL-2), Interferon-γ (IFNγ) und Tumornekrosefaktor-α (TNFα). Die typischen Stimuli für eine TH1-Antwort sind Viren und einige bakterielle Erreger. TH2-Antworten werden durch IL-4, IL-5, IL6, IL-10 und IL-13 vermittelt. TH2-Zytokine regulieren humorale Immunantworten vornehmlich in der Abwehr extrazellulärer Infektionen [90;260;261]. Sie bewirken eine B-Zell Proliferation, eine polyklonale Immunglobulinsekretion und eine Suppression von TH1-Antworten. Vielfältige biologische und analytische Verfahren wurden zur Bestimmung der Zytokinsynthese entwickelt. Der Grossteil der Methoden, wie beispielsweise der ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), bestimmt die Menge des sekretierten Zytokines im Serum oder im Kulturüberstand. Sie ermöglichem dem Untersucher nicht, eine Aussage über den Phänotyp der zytokinproduzierenden Zelle zu machen. Ein während der Inkubation der Kultur eintretender Verbrauch von Zytokinen entgeht der Messung im Überstand und kann artifizielle Verminderungen der gemessenen Syntheseleistung bedingen. Die Expression von CD69 auf der Zelloberfläche in >90% der CD4+ oder CD8+ Zellen wurde als Nachweis der funktionellen Aktivierung in sämtlichen Kontrollen und Patienten gefunden. In der Auswertung der CD4+ Zellen zeigten lediglich zwei Patienten Auffälligkeiten im Zytokinmuster. Ein Patient der Gruppe A und einer der 7-92 Gruppe NA wiesen einerseits nahezu eine Verdoppelung der für IFNγ positiven Zellen, andererseits eine Verminderung der für IL-2 positiven Zellen um bis zu 50% gegenüber der Kontrolle und den restlichen Patienten auf. Für den Nachweis von TNFα und IL-4 stellten sich alle Patienten unauffällig dar. Im Kompartiment der CD8+ Zellen fiel für alle Patienten unabhängig von deren Klassifizierung in die Gruppen A und NA eine signifikante Erhöhung der IFNγ- und TNFα-Produktion auf. Für die Gruppe A liess sich eine signifikante (p = 0.017) Steigerung der für IFNγ positiven CD8+ Zellen auf 41% bis 68%, für die Gruppe NA auf 34% bis 68% gegenüber der Kontrolle (5% bis 32%) nachweisen. Für TNFα zeigte sich eine signifikante (p = 0.023) Steigerung der positiven CD8+ Zellen auf 38% bis 62%, für die Gruppe NA auf 29% bis 54% gegenüber der Kontrolle (6% bis 27%). Zudem konnte die verminderte IL-2 Produktion in zwei Fällen auch für die CD8+ Zellen bestätigt werden. Zur Beschreibung der funktionellen in vivo Situation muss die relative Steigerung der Synthese von TH1-Zytokinen insbesondere im Kompartiment der CD8+ T-Zellen entsprechend der verminderten CD4+CD8+-Ratio nach oben korrigiert werden. Bereits in vorangegangenen Untersuchungen konnten für CVID-Patienten gesteigerte TH1-Immunantworten demonstriert werden. Nach Stimulation mit PMA (Phorbol Myristate Acetate) und Ionomycin wiesen die für die Zytotoxizität bedeutsamen CD8+CD28+, teils auch die suppressorisch wirkenden CD8+CD28- TZellsubpopulationen der CVID-Patienten im intrazytoplasmatischen Nachweis eine Steigerung der IFNγ Produktion auf. Dieses exzessive TH1-Muster wurde als Ursache der funktionellen B-Zelldefizienz angenommen, bedingt durch eine gestörte Interaktion von T- und B-Zellen und der Unfähigkeit zur Formierung von für die BZelldifferenzierung [278;279]. notwendigen Veränderungen antigen-spezifischen wurden ebenfalls für CD4+ die Memory Synthese T-Zellen von IL-2 [77;78;118;332], IL-4 [289] und IL-9 [160] beschrieben. Unauffällig verhielt sich die Expression von IL-6 und dessen Rezeptors [183] sowie von IL-10 [283;434]. Kürzlich beschrieben wurde eine erhöhte Frequenz IL-12 positiver Monozyten nach Stimulation mit LPS, assoziiert mit einer gesteigerten Produktion von IFN-γ durch TLymphozyten [53]. Für HIV-1 positive Patienten konnte als Indikator einer Immundysfunktion in der intrazytoplasmatischen Zytokinproduktion nach Mitogenstimulation neben einer verminderten IL-2 Synthese ein signifikant erhöhter 7-93 Anteil für IFNγ positiver CD8+ T-Zellen gefunden werden [109;420]. Bereits in nativen CD8+ T-Zellen HIV-seropositiver Patienten liessen sich erhöhte mRNA Werte für IFNγ zeigen [38]. Kinder mit einer selektiven IgA Defizienz wiesen als Ausdruck einer starken TH1-Antwort in Untersuchungen des CD3+/CD4+ Kompartimentes erhöhte Zahlen von für IFNγ und TNFα positiven Zellen auf [201]. Den genannten Krankheitsbildern sind chronisch rezidivierende bakterielle Infektionen vornehmlich des Respirations- und Gastrointestinaltraktes mit stetem inflammatorischem Reiz gemeinsam. Die Behςet-Erkrankung ist klinisch durch das rezidivierende Auftreten von Aphten der Mundschleimhaut und der Genitalien in Verbindung mit entzündlichen Augenveränderungen gekennzeichnet. Sie ist Ausdruck einer entzündlichen Systemerkrankung unbekannter Ätiologie mit dem Auftreten einer Vaskulitis kleiner Venen und Arterien [241]. Auch hier fanden sich erhöhte Frequenzen an IFNγ produzierenden CD4+ und CD8+ T-Zellen [373]. In Anbetracht dieser Befunde ist die gezeigte Verschiebung zu einer TH1-Immunantwort als reaktive und wohl unspezifische Veränderung in einer Situation rezidivierender inflammatorischer Reize im Rahmen der durch die humorale Defizienz bedingte Infektepisoden zu interpretieren. Gleichwohl fordert sie eine Perspektive der humoralen Immundefizienz bei CVID Patienten. 8-94 8. Zusammenfassung Das Variable Immundefektsyndrom (CVID) ist durch eine defekte B-Zellreifung und Antikörperbildung charakterisiert, die in erniedrigten Spiegeln der meisten oder aller Immunglobulinklassen und klinisch einer gesteigerten Infektanfälligkeit resultieren. Eine spezifische Untergruppe von Patienten (Typ A) weist normale Anzahlen reifer, auf der Oberfläche für sIgM/sIgD-positive zirkulierende B-Lymphozyten, die jedoch auf eine Stimulation in vitro nicht mit einer Differenzierung und Synthese von Immunglobulinen reagieren. Durch Analyse des Expressionsmuster einer grossen Zahl von aktivierungsspezifischen Oberflächenmarkern auf B-Zellen konnte gezeigt werden, dass Typ A CVID Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen eine stark verminderte Expression des CD28/CTLA-4 Liganden CD86 (B7-2) und des lymphozytären Aktivierungsmarker CD137 aufweisen. Korrelierend fanden sich erniedrigte Werte für die mRNA von CD86. Eine kombinierte Stimulation über den BZell-Antigenrezeptor und Kreuzvernetzung von CD40 konnte die Defekte in der CD86 und CD137 Expression ebenfalls nicht aufheben. Diese B-Zellen erscheinen als funktionell stumme, für die Kooperation mit T-Zellen unfähige Lymphozyten. Ihre Akkumulation in Typ A Patienten lässt eine kausale Beziehung mit der Pathogenese dieser Erkrankung annehmen. Im weiteren gilt es, diese Population hinsichtlich ihrer Entstehung und ihres Verhaltens näher zu beschreiben. Auf der Seite der TLymphozyten fand sich im Kompartiment der nativen CD4+ T-Zellen für sämtliche Patienten neben einer verminderten CD4/CD8-Ratio eine starke Erhöhung der Expression von CD95 (Fas). Nach Stimulation zeigten Typ A Patienten eine signifikante, jedoch in ihrer Bedeutung fragliche Verminderung der Expression des CD40L. Die intrazytoplasmatische Anfärbung wies für alle Patienten im CD8+ ausgeprägter als im CD4+ Kompartiment eine gesteigerte Expression der TH1Zytokine IFNγ und TNFα nach. Die phänotypischen T-Zellveränderungen wie auch die Verschiebung zu einer TH1-Immunantwort sind als reaktive und wohl unspezifische Veränderung in einer Situation rezidivierender inflammatorischer Reize im Rahmen der durch die humorale Defizienz bedingte Infektepisoden zu interpretieren. 9-95 9. Referenzen 1. Abbas,A.K., Murphy,K.M., and Sher,A., (1996) Functional diversity of helper T lymphocytes. [Review] [94 refs]. Nature. 383: 787-793. 2. Adolf,G.R., (1985) Structure and effects of interferon-gamma. Oncology. 42 Suppl 1: 33-40. 3. Agematsu,K., Futatani,T., Hokibara,S., Kobayashi,N., Takamoto,M., Tsukada,S., Suzuki,H., Koyasu,S., Miyawaki,T., Sugane,K., Komiyama,A., and Ochs,H.D., (2002) Absence of memory B cells in patients with common variable immunodeficiency. Clin.Immunol. 103: 34-42. 4. 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Immunol. 2000. 30: 1069–1077 Impaired up-regulation of CD86 in CVID 1069 Impaired up-regulation of CD86 in B cells of “type A” common variable immunodeficiency patients Axel Denz1, Hermann Eibel2, Harald Illges3, Georg Kienzle1, Michael Schlesier1, Hans-Hartmut Peter1 1 Division of Rheumatology and Clinical Immunology, Department of Internal Medicine, University Hospital Freiburg, Freiburg, Germany Clinical Research Unit for Rheumatology, Division of Rheumatology and Clinical Immunology, Department of Internal Medicine, University Hospital Freiburg, Freiburg, Germany 3 Immunology Department, University of Konstanz, Konstanz, Germany 2 Common variable immunodeficiency (CVID) is characterized by defective B cell maturation and antibody formation resulting in low serum antibody levels of most or all Ig isotypes. A specific subgroup of patients (“type A”) has normal numbers of mature surface (s)IgM/sIgDpositive circulating B cells. However, since these lymphocytes do not respond to in vitro stimulation by differentiation and Ig synthesis, they seem to suffer from so far unknown intrinsic defects. Analyzing the expression pattern of a large set of B cell activation-specific surface markers, we found that type A CVID patients show a highly reduced expression of the CD28/CTLA-4 ligand CD86 (B7-2) and of the lymphocyte activation marker CDw137 when compared to B cells of healthy donors and non-type-A CVID patients. The lowered CD86 expression levels were found to correlate with reduced levels of CD86 mRNA. Since combined stimulation via B cell antigen receptor and CD40 cross-linking did not rescue the defects in CD86 and CDw137 expression, B cells of CVID type A patients resemble functionally unresponsive lymphocytes incapable of cooperating with T cells. The fact that these cells accumulate in type A CVID patients suggests a causal relationship with the pathogenesis of this disease. Key words: CD86 / CDw137 / CD62L / B cell activation / Immunodeficiency 1 Introduction In humans, common variable immunodeficiency (CVID) is the most frequent (1/20 000) symptomatic primary antibody deficiency syndrome. The disease is characterized by defects in terminal B lymphocyte differentiation and class switching, resulting in a lack of plasma cells. The failure to produce serum antibodies of most or all Ig classes causes severe defects in humoral immune responses against bacterial or viral pathogens. These impairments lead to recurrent infections of the upper and lower respiratory tract that manifest themselves usually between the first and fourth decade of life. Males and females are affected equally. Moreover, CVID patients suffer from an increased incidence of malignancies, [I 20063] Abbreviations: CVID: Common variable immunodeficiency SAC: Staphylococcus aureus Cowan strain I PWM: Pokeweed mitogen CD40L: CD40 ligand BCR: B cell receptor HEL: Hen egg lysozyme © WILEY-VCH Verlag GmbH, D-69451 Weinheim, 2000 Received Revised Accepted 6/9/99 17/12/99 13/1/00 intestinal lymphoid hyperplasia and in some patients, CVID is associated with autoimmune or granulomatous disease [1]. Although hypogammaglobulinemia and susceptibility to infections are common to all patients, they nevertheless show heterogeneous clinical and laboratory phenotypes. Therefore, disease subgroups were established according to clinical and immunological criteria. Bryant et al. [2] introduced a typing system that is based on the Ig responses of B cells following exposure to appropriate stimuli like anti-IgM, Staphylococcus aureus Cowan strain I (SAC) or pokeweed mitogen (PWM) [2–4]. Accordingly, four groups of patients are identified: firstly, a small group of patients with very low B cell numbers and an almost complete lack of humoral responses; secondly, “type A” CVID patients, who have reduced or normal numbers of circulating B cells that fail to produce IgG, IgA and IgM upon in vitro stimulation; thirdly, “type B” patients, whose B cells in vitro produce IgM but no IgG or IgA, and fourthly “type C” CVID patients, who show normal numbers of B cells that differentiate in vitro to IgM-, IgA- and IgG-producing plasma cells, but fail to do so in vivo. 0014-2980/00/0404-1069$17.50 + .50/0 1070 A. Denz et al. The initial mechanisms underlying the defective antibody responses are still controversially discussed. For the majority of CVID patients, defects in T cell functions as reflected by aberrant cytokine [3, 5–10] and CD40 ligand expression [11, 12] as well as a reduced development of antigen-specific memory T cells [13] have been described. However, results provided by Eisenstein et al. [14] suggest primary defects in the B cell compartment since the helper activity of CVID T cells was found to be intact. Eur. J. Immunol. 2000. 30: 1069–1077 Here we show that B cells of type A CVID patients largely fail to up-regulate CD86 and CDw137 expression upon stimulation in vitro. We propose that this B cell defect is one of the undelying mechanisms leading to type A CVID. 2 Results 2.1 Phenotype of native CVID B cells In humoral immune responses, B cell activation and differentiation into plasma cells depend on cognate T-B cell interactions and stimulation through the receptor/ligand pairs CD40–CD40 ligand (L) and CD28/CTLA-4–CD80/ CD86. For B cells, activation by CD40L-induced crosslinking of CD40 has been shown to be an indispensable co-stimulatory signal required for switch recombination and antibody formation [15, 16]. Interestingly, CD27/ CD70 ligation in the presence of IL-2 and IL-10 specifically enhances Ig production and plasma cell differentiation of CD27+ B cells [17–19]. For Th cells, cytokine production and CD40L expression is induced upon triggering of the CD28 coreceptor molecule through the B7 ligands expressed by B cells, macrophages or dendritic cells. So far, two members of the B7 family, B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86), have been identified [20, 21]. Although both ligands have similar affinities for CD28 [22–25], different cellular distributions and kinetics for CD80 and CD86 expression suggest that differential interactions with these ligands may lead to distinct signals. CD80 is normally expressed at low levels on B cells, dendritic cells and macrophages but up-regulated upon activation via B cell receptor (BCR) or CD40 ligation or upon exposure to cytokines. CD86 is constitutively expressed on dendritic cells and on monocytes. On resting B cells, CD86 is expressed only at very low levels but it is rapidly induced upon BCR cross-linking or upon stimulation by cytokines [26–30]. The functional differences between both ligands were further underlined by analyses using mice deficient in either CD80 or CD86 expression. Whereas B cells of CD86-deficient mice completely failed to respond to activation by antigen with isotype switch, germinal center formation and antibody production, B cells from CD80-deficient mice showed normal humoral responses [31]. Since these studies emphasized the role of CD86 in humoral immune responses, we analyzed the CD86 expression pattern in several subgroups of CVID patients. In addition, we studied the expression pattern of CDw137, the human homologue of the murine 4-1BB receptor. CDw137 is a member of the TNFR superfamily and is expressed on T and B cells, monocytes and a number of other cell lineages upon activation. While CDw137 transmits co-stimulatory signals in T cells, its function in B cells is not known so far [32, 33]. CVID patients were classified according to the in vitro response of their B cells against SAC and PWM [2–4]. Under these conditions, B cells from type A CVID patients failed to secrete significant amounts of IgM or IgG, B cells from type B patients secreted only IgM, whereas B cells from type C patients produced normal amounts of IgM and IgG (Table 1; IgA paralleled IgG production, but is not recorded in this study). According to these criteria, the classification of patients remained stable for years. In our study, we combined B and C patients to the non-A group. Six of eight type A patients and all 12 non-A CVID patients displayed normal percentages of circulating CD19+ B cells and only two type A patients had less than 1 % of peripheral B cells. The majority of B cells showed a mature phenotype characterized by expression of IgM, IgD and CD22, while CD21 and CD23 expression was more variable in patients (Table 1). IgM/ IgD double expressing B cells were elevated in all CVID patients, indicating a reduced frequency of class switch. 2.2 B cells of type A CVID patients express reduced levels of CD86 and CDw137 Peripheral blood B cells from CVID patients and controls were stimulated in the presence of IL-2 and IL-10 by antiIgM-induced cross-linking of BCR. Analyzing the expression of CD69, CD80 and CD86 (Fig. 1 A), we found that CD69 was induced in all patients at similar levels (53–96 %) as in controls (77–88 %). In parallel, we confirmed the functional activation of B cells by analyzing the expression pattern of the homing receptor CD62L (LECAM-1, L-selectin). CD62L is expressed on the majority of native B cells, but is rapidly down-regulated by activation-induced shedding [34, 35]. As shown in Fig. 1 D, BCR cross-linking resulted in a similarly decreased CD62L expression on B cells of healthy donors and all CVID subgroups. However, in contrast to the normal up-regulation of CD69 and the loss of CD62L expression, all CVID type A patients expressed significantly less CD86 than healthy donors and non-A CVID patients. This finding was reflected by both lower numbers of CD86+ B cells (type A CVID patients 48–65 %, controls 72–89 %; p X 0.001) and reduced CD86 Eur. J. Immunol. 2000. 30: 1069–1077 Impaired up-regulation of CD86 in CVID 1071 Table 1. Immunological characterization of patients and controls Patient Age (years) Sex Native CD19+ B cells Classifi% cationa) CD19+ % sIgM+ % sIgD+ % CD21+ % CD22+ % CD23+ IgM synthesis in vitro (ng/ml) IgG synthesis in vitro (ng/ml) SAC+ IL-2 PWM 1 :200 SAC+ IL-2 PWM 1 : 200 GLT 30 m A 1.8 83 93 82 99 52 246 0 9 52 CAS 28 m A 0.6 94 97 72 100 57 0 0 0 0 JMN 33 m A 18.6 98 98 95 99 75 71 0 0 0 GWR 53 m A 0.5 ND ND 98 100 91 0 0 0 0 MFT 35 f A 7.8 93 93 87 96 64 99 0 0 0 INL 23 f A 20.8 96 94 94 99 83 76 0 217 32 MMR 77 f A 6.7 94 93 98 100 90 0 0 0 62 BRZ 43 m A 10.3 ND ND ND ND ND X 100 X 100 X 100 X 100 JBK 58 f B 7.3 88 93 96 99 90 1942 0 0 0 HBR 44 m B 13.7 96 92 93 100 64 G 7500 979 751 123 PLS 27 m B 6.7 95 96 ND ND ND G 7500 815 236 218 BMR 74 f B 8.6 94 90 ND ND ND 6616 975 162 112 ESR 32 m B 4.7 98 95 ND ND ND G 7500 331 84 0 MHA 11 m B 13.7 99 99 95 ND ND 7313 0 179 206 MWR 73 m B 5.4 91 91 48 ND ND G 7500 0 648 258 PLS 28 m B 6.7 95 96 87 ND ND G 7500 815 236 218 BRZ 44 m B 3.1 95 94 95 ND ND G 7500 387 222 209 MKR 38 f C 8.1 93 97 98 100 95 G 7500 5120 1122 919 DER 30 m C 4.0 94 92 99 ND ND G 7500 0 G 1500 144 DAR 38 m C 4.2 81 81 94 ND ND G 7500 618 G 1500 G 1500 ADZ 23 m HD 6.4 93 90 97 99 94 G 7500 68 942 244 RDR 39 f HD 4.7 80 83 94 100 90 G 7500 0 G 1500 G 1500 JGH 34 m HD 11.1 68 81 ND ND ND G 7500 1378 G 1500 G 1500 KDZ 53 m HD 16.7 ND ND 99 100 90 G 7500 1245 G 1500 G 1500 CHN 26 f HD 5.7 76 81 98 99 82 G 7500 0 372 375 ESK 27 f HD 2.9 83 80 97 97 88 ND ND ND ND POO 33 f HD 10.8 68 68 99 98 80 ND ND ND ND MBN 29 m HD 3.5 76 75 93 ND ND G 7500 3497 G 1500 G 1500 KWR 36 m HD 2.6 83 83 96 ND ND G 7500 G 7500 G 1500 G 1500 TGE 25 m HD 2.1 81 80 97 ND ND G 7500 991 G 1500 836 a) A: CVID ’type A’; B: CVID ’type B’; C: CVID ’type C’; HD: healthy donor. 1072 A. Denz et al. Eur. J. Immunol. 2000. 30: 1069–1077 Fig. 1. Decreased CD86 (B7-2) and CDw137 (ILA) expression on stimulated B cells from type A CVID patients. PBMC from healthy donors (HD, 1 ), from type A CVID patients (A, ? ) and from non-type A patients (NA, | ) were stimulated with anti-IgM plus IL-2 and IL-10 for 20 h (A, B) or with anti-IgM only (C, D). CD19+ B cells were analyzed by flow cytometry for CD69, CD80, and for CD86 expression (A), for the fluorescence intensity of CD86 (B), for CDw137 expression (C) and for CD62L down-regulation (D). Comparable results were obtained when cells were stimulated via CD40 cross-linking ± stimulation by anti-IgM and cytokines (data not shown). For unstimulated CD19+ B lymphocytes, the percentage of CD86+ cells in HD was 8.2–13.7 %, in A patients 3.1–12.5 %, and in NA patients 4.3–13.8 %. When cultivated in the presence of IL-2 and IL-10, 25.8–52.3 % of HD B cells, 16.3–34.6 % of A patient and 31.3–47.8 % of NA patient cells expressed CD86. Upon stimulation with anti-CD40, IL-2 and IL-10, 46.9–67.3 % of HD B cells, 20.5–36.2 % of A patient and 52.4–60.4 % of NA patient B lymphocytes were CD86+. After anti-IgM treatment in combination with CD40 co-stimulation in the presence of IL-2 and IL-10 73.2–83.5 % from HD, 37.7–59.5 % of A patient and 66.5–75.3 % of NA patient B cells showed CD86 up-regulation. expression levels per B cell as measured by mean fluorescence intensity (Fig. 1 A and B). Neither costimulation via anti-CD40 antibodies nor extended cultivation for up to 44 h instead of 20 h improved the impaired CD86 expression (data not shown). In contrast, the CD80 expression on B cells of type A CVID patients did not differ from that of non-A patients or healthy controls. To exclude humoral or cellular cytotoxic effects as well as suppressive influences by T cell cytokines, we also analyzed the CD86 expression pattern in highly purified peripheral B cell populations. Although their CD86 expression was lower than in PMBC B cells, the purified B lymphocytes of type A patients also failed to upregulate CD86 expression upon stimulation with anti-IgM antibodies (Fig. 2 A and B). This phenotype remained stable in all type A patients when re-tested after a period of at least 4 months. An inheritant CD86 deficiency was excluded since CD86 expression on monocytes and EBV-transfected B cell line of type A patients was found to be normal (data not shown). Eur. J. Immunol. 2000. 30: 1069–1077 Impaired up-regulation of CD86 in CVID 1073 ated cells (28–46 %). In contrast, B cells from one type B patient (HBR) showed a similar response as B cells from the healthy donor. To analyze if the changed response of CVID type A B cells to BCR-dependent activation was confined to CD86 expression only or if the expression of other genes would be affected too, we tested among other surface markers the induction of CDw137. It belongs to the family of TNFR1 molecules and is expressed upon activation on B cells, T cells and monocytes [32, 33]. As shown in Fig. 1 C, CDw137 is expressed only in a small fraction of resting CD19+ B cells. While BCR cross-linking increased the number of CDw137+ B lymphocytes purified from PBMC of healthy donors and non-A CVID patients, no up-regulation of CDw137 was found on B cells of type A CVID patients. 3 Discussion Fig. 2. Reduced CD86 (B7-2) expression of purified B cells from type A CVID patients. CD19+ B cells were isolated as described in Sect. 4.3 and stimulated as described in the legend to Fig. 1. (A) shows the compilation of the flow cytometry data for CD69 and CD86 expression. (B) depicts a representative histogram overlay for CD86 expression on normal (white area) and CVID type A (gray area) B cells. (C) shows the CD86 mRNA expression profile of B cells as revealed by CD86-specific PCR in the presence and absence of stimulating IgM-specific antibodies. We then analyzed if the reduced CD86 surface expression was correlated to changes in the transcription of the CD86 gene using a quantitative PCR assay specific for CD86 mRNA and a healthy control sample to calibrate the test. Functional activation was proven phenotypically by CD69 surface expression. As shown in Fig. 2 C, CD86 transcription in B cells from three CVID type A patients (JMN, MFT, MMR) remained silent upon stimulation and even decreased (23–35 %) in comparison to unstimul- In conclusion, our experiments show that B lymphocytes from CVID type A patients are partially unresponsive to BCR-derived signals since they show no or only partial induction of CD86 and CDw137 expression. The defect seems to be specific for B lymphocytes as normal CD86 expression was found on monocytes and EBVtransformed B cells of type A patients. Since these B cells retain a normal expression pattern for the early activation marker CD69 and the down-regulation of CD62L, they phenotypically resemble anergic B lymphocytes as found in a transgenic mouse model for B cell tolerance developed by Goodnow et al. [36]. In this model, anergic B cells expressing transgenic hen egg lysozyme (HEL)specific IgM/D are present at normal numbers and carry all developmentally regulated surface markers. However, these lymphocytes are desensitized to activating signals by continuous exposure to soluble HEL since they fail to up-regulate CD86 expression and to mount HEL-specific antibody responses upon BCR cross-linking [37, 38]. Moreover, during cognate T-B cell interactions antigenspecific T cells are incompletely activated [39] and B cells may be killed by CD95-induced apoptosis [38, 40]. Incomplete activation of antigen-specific CD4+ T cells has been shown to lead to insufficient IL-2 production and unstable CD40L expression, two key findings in CVID supporting the hypothesis of CVID being a primary Th cell deficiency [8, 12]. However, recent evidence suggests that if naive CD4+ T cells do not encounter antigen on cognate B cells in conjunction with co-stimulatory signals via CD28/CD86, they fail to secrete sufficient amounts of IL-2 and they remain unable to properly costimulate B cells via CD40L [41, 42]. The CD86 knockout mice (but not the CD80-deficient mice) provide evidence along the same line as these animals are severely hypo- 1074 A. Denz et al. gammaglobulinemic with impaired germinal center formation and abolished T-dependent specific antibody responses [31]. Thus, effective stimulation of naive Th cells not only depends on CD86 co-stimulation, it also paves the way for cognate B cell activation with class switching and somatic IgV gene hypermutation, a process which was shown to be impaired in some CVID patients who may belong to subgroup A [43]. The phenotypic and functional similarities between B cells of CVID type A patients and CD86-deficient or anergic B cells in mice are so striking that CD86 regulatory defects may represent a model for the immunoregulatory abnormalities in CVID type A. In an earlier report Eisenstein et al. [14] came to a similar conclusion, showing that functional B cell deficiency can be partially reversed by prestimulation and prolonged culture with anti-CD40 and IL-10. Unfortunately, in that study CVID patients were not classified into groups A to C, therefore it remained unclear whether anergy was confined to B cells of type A patients. Our results clearly show that B cell unresponsiveness is confined to CVID type A patients, suggesting that type B and C patients may suffer from other defects. At present, the mechanism underlying the highly anergic phenotype of peripheral B cells in subgroup A of CVID patients is unknown. Any explanation has to take into account that the onset of the disease is from the first to fourth decade of life and that immune reactivity was previously intact. Chronically present soluble proteins with broad BCR specificity like viral or bacterial superantigens may be candidates for anergy-inducing agents. Alternatively, a B cell-tropic virus may interfere with signal transduction. However, it has to be noted that there is no evidence for viral infections based on the determination of IFN type I-induced MxA protein levels [44]. Furthermore, there was no increase in circulating EBVinfected B cells in three CVID patients (G. Bauer, Freiburg, personal communication). A third hypothetical cause of impaired B cell function is an acquired stem cell mutation affecting a signaling component, analogous to the situation found for glycosylphosphatidylinositol anchor deficiency in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria [45]. Studies on the underlying B cell defect are currently in progress, focussing particularly on memory B cell development, the role of CD27/CD70 ligation and on defects of IgV hypermutation in CVID. Eur. J. Immunol. 2000. 30: 1069–1077 4 Materials and methods 4.1 Patients and healthy donors Twenty patients with well-documented CVID according to the diagnostic criteria of the WHO expert group for primary immunodeficiencies [1] were included in the study. Patients’ and controls’ characteristics, their B cell phenotypes and in vitro responses to SAC+IL-2 and PWM are summarized in Table 1. Patients were classified according to Bryant et al. [2] into types A to C. All patients were receiving regular i. v. gammaglobulin replacement therapy (Sandoglobin or Polyglobulin; 300 mg/kg) at 4–6 week intervals and were free of any serious infections when tested. There were no familial cases of CVID included in this study and none of the patients had proven granulomatous disease characteristic for a subgroup of CVID with progressive T cell deficiency and a certain TNF- § polymorphism [46]. Ten healthy donors were included as controls. Informed consent was obtained from all subjects before entry into the study. 4.2 Antibodies mAb to the following human surface molecules were used in this study: PerCP-conjugated CD3, PE-conjugated CD69 and -CD80 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA), CD21, CD23, CD54 and CD86 (all PEconjugated; Pharmingen, San Diego, CA), PE-conjugated CD22 and FITC-conjugated CD19 (Dako, Glostrup, Denmark), and allophycocyanin-conjugated (Caltag Laboratories, Burlingame, CA). Goat IgG F(ab)2 antibodies to human IgM were purchased from ICN Biomedicals (Eschwege, Germany), Dynabeads M450 pan-B (CD19) and DetachaBeads from Dynal (Oslo, Norway), goat-anti-mouse-IgG from Dianova, anti-CD40 and FITC-conjugated CD62L from Immunotech (Marseille Cedex, France). Unlabeled anti-CDw137 antibody (clone M131) was a kind gift of Immunex Co., Extramural Research (Seattle, WA). Isotype control antibody for CDw137 was MOPC21 (Sigma, Deisenhofen, Germany); as the second step reagent FITC-conjugated goat antimouse IgG (Southern Biotech, Biozol, Elching, Germany) was used. 4.3 Cells Cells were grown in RPMI 1640 medium without phenol red (Biochrom KG, Berlin, Germany) supplemented with heatinactivated FCS from PANBiotech (Aidenbach, Germany), penicillin, streptomycin and L-glutamine (Biochrom KG, Berlin, Germany). Blood samples were collected just before i. v. IgG replacement therapy. PBMC were isolated from defibrinated blood by Ficoll-Hypaque (Biochrom KG, Berlin, Germany) density gradient centrifugation and washed two times in culture medium (RPMI1640 supplemented with 10 % FCS, Eur. J. Immunol. 2000. 30: 1069–1077 100 U/ml penicillin, 100 ? g/ml streptomycin and 2 mM L-glutamine). Subsequently, the cells were adjusted to a concentration of 5 × 106 /ml in culture medium. All cell cultures were performed at 37 °C in a humidified atmosphere containing 5 % CO2. B cells were purified from PBMC by positive selection using anti-CD19 mAb-coated immunomagnetic beads (Dynal, Hamburg, Germany) by incubation at 4 °C for 30 min; B cells were released from the beads by treatment (at 23 °C for 30 min) with DetachaBeads (Dynal). By this separation method B cell purity was G 99 %. For B cell stimulation, PBMC (1 × 106 cells/ml) or purified B cells (1 × 106 cells/ml) were cultured for 20 h and 44 h in culture medium plus 20 U/ml IL-2 (Biotest, Dreieich, Germany) and 10 ng/ml IL-10 (Pharmingen, San Diego, CA) with or without goat anti-IgM IgG F(ab)2 at 12.5 ? g/ml (ICN Biomedicals, Eschwege, Germany) in 24-well plates (Greiner, Frickenhausen, Germany). For staining of CDw137 (ILA) cells were stimulated for 20 h with anti-IgM without cytokine supplementation. For some experiments culture wells had been precoated with goat anti-mouse IgG F(ab)2 fragments (Dianova, Hamburg, Germany) and subsequently with mAb to CD40 (Immunotech, Marseille, France). For in vitro Ig synthesis, PBMC (1 × 106 /ml) were stimulated with SAC (Calbiochem, La Jolla, CA) diluted to 1 : 10 000 plus 20 U/ml IL-2 or PWM (Gibco, Eggenstein, Germany) diluted to 1 : 200, 1 : 400 and 1 : 800. Supernatants were collected after 9 days and stored at − 20 °C until assayed for IgG and IgM by ELISA [47]. Impaired up-regulation of CD86 in CVID 1075 Quantification of CD86 mRNA was done using the ABI PRISM 7700 sequence detection system® (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany). CD86-specific oligonucleotides and a fluorescent probe were developed using the PrimerExpress software (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany); forward primer: 5’-CTG ACA AGA CGC GGC TTT TAT C-3’; reverse primer: 5’-TC ATT GTG TTG GTT CCA CAT TT-3’; 6’-carboxy-fluorescein (FAM)-labeled probe: FAM---5’-ACC TTT CTC TAT AGA GCT TGA GGA CCC TCA GCC-3’. PCR conditions were: 2 min 50 °C; 10 min 95 °C; 15 s 95 °C, 1 min 60 °C. Optimal primer concentrations were developed performing a primer matrix PCR reaction. Optimized concentrations for both primers were 300 nM. Quantification was done using the ¿ CT values. Samples of healthy donor UDZ was used to calibrate the relative values for the patient probes. 4.6 Statistical analysis Statistical comparisons were made using an unpaired Student’s t-test to compare different groups of study subjects, and a paired Student’s test to compare the results from the same subjects. Differences between groups were considered significant at a p value X 0.05. Acknowledgements: The excellent technical assistance of Ruth Dräger is highly appreciated. This work was supported in part by the Forschungsschwerpunktprogram BadenWürttemberg. References 4.4 Flow cytometry Phenotyping of native and stimulated PBMC samples was performed by staining with FITC-, PE-, PerCP- or allophycocyanin-conjugated mAb and four-color flow cytometry (FACSCaliburTM, Becton Dickinson), gating on viable lymphocytes as defined by a forward vs. side scatter gate and exclusion staining of dead cells with 1 ? g/ml propidium iodide. Data were further analyzed in dot plots and histogram plots using CellQuest® software (Becton Dickinson). 4.5 Quantification of CD86 mRNA Purified B cells were stimulated with anti-IgM plus IL-2 and IL-10 for 15 h. Total RNA was prepared using the Rneasy® Min Kit from Qiagen GmbH (Hilden, Germany) according to manufacturer’s protocol. cDNA synthesis was performed with the TaqMan® Gold reverse transcription (RT)-PCR reagents using random hexamers for 45 min at 48 °C. Reactions were terminated incubating the samples for 5 min at 95 °C. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GADPH) was used to quantitate cDNA contents using the TaqMan® GADPH control reagents (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany). 1 Rosen, F. S., Eibl, M., Roifman, C. M., Fisher, A., Volanakis, J., Aiuti, F., Notarangelo, L., Kishimoto, T., Resnick, I. B., Hammarstrom, L., Seger, R., Chapel, H., Cooper, M. D., Geha, R. S., Good, R. A., Waldmann, T. A. and Wedgwood, R. J. 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D., CD40 ligand expression is defective in a subset of patients with common variable immunodeficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994. 91: 1099–1103. 12 Thon, V., Wolf, H. M., Sasgary, M., Litzman, J., Samstag, A., Hauber, I., Lokaj, J. and Eibl, M. M., Defective integration of activating signals derived from the T cell receptor (TCR) and costimulatory molecules in both CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes of common variable immunodeficiency (CVID) patients. Clin. Exp. Immunol. 1997. 110: 174–181. 13 Kondratenko, I., Amlot, P. L., Webster, A. D. B. and Farrant, J., Lack of specific antibody response in common variable immunodeficiency (CVID) associated with failure in production of antigenspecific memory T cells. Clin. Exp. Immunol. 1997. 108: 9–13. Eur. J. Immunol. 2000. 30: 1069–1077 22 Freeman, G. J., Freedman, A. S., Segil, J. M., Lee, G., Whitman, J. F. and Nadler, L. M., B7, a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplastic B cells. J. Immunol. 1989. 143: 2714–2722. 23 Freeman, G. J., Gribben, J. G., Boussiotis, V. A., Ng, J. W., Restivo, V. A., Jr., Lombard, L. A., Gray, G. S. and Nadler, L. M., Cloning of B7-2: A CTLA-4 counter-receptor that costimulates human T cell proliferation. Science 1993. 262: 909–911. 24 Azuma, M., Ito, D., Yagita, H., Okumura, K., Phillips, J. H., Lanier, L. L. and Somoza, C., B70 antigen is a second ligand for CTLA-4 and CD28. Nature 1993. 366: 76–79. 25 Linsley, P. S., Greene, J. L., Brady, W., Bajorath, J., Ledbetter, J. A. and Peach, R., Human B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86) bind with similar avidities but distinct kinetics to CD28 and CTLA-4 receptors. Immunity 1994. 1: 793–801. 26 Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Gribben, J. G., Daley, J., Gray, G. and Nadler, L. M., Activated human B lymphocytes express three CTLA-4 counterreceptors that costimulate T-cell activation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993. 90: 11059–11063. 27 Hathcock, K. S., Laszlo, G., Pucillo, C., Linsley, P. and Hodes, R. J., Comparative analysis of B7-1 and B7-2 costimulatory ligands: Expression and function. J. Exp. Med. 1994. 180: 631–640. 28 Lanier, L. L., O’Fallon, S., Somoza, C., Phillips, J. H., Linsley, P. S., Okumura, K., Ito, D. and Azuma, M., CD80 (B7) and CD86 (B70) provide similar costimulatory signals for T cell proliferation, cytokine production, and generation of CTL. J. Immunol. 1995. 154: 97–105. 29 Vyth-Dreese, F. A., Dellemijn, T. A. M., Majoor, D. and De Jong, D., Localization in situ of the co-stimulatory molecules B7.1, B7.2, CD40 and their ligands in normal human lymphoid tissue. Eur. J. Immunol. 1995. 25: 3023–3029. 30 Ellis, J. H., Burden, M. N., Vinogradov, D. V., Linge, C. and Crowe, J. S., Interactions of CD80 and CD86 with CD28 and CTLA4. J. Immunol. 1996. 156: 2700–2709. 14 Eisenstein, E. M., Chua, K. and Strober, W., B cell differentiation defects in common variable immunodeficiency are ameliorated after stimulation with anti-CD40 antibody and IL-10. J. Immunol. 1994. 152: 5957–5968. 31 Borriello, F., Sethna, M. P., Boyd, S. D., Schweitzer, A. N., Tivol, E. A., Jacoby, D., Strom, T. B., Simpson, E. M., Freeman, G. J. and Sharpe, A. H., B7-1 and B7-2 have overlapping, critical roles in immunoglobulin class switching and germinal center formation. Immunity 1997. 6: 303–313. 15 Callard, R. E., Armitage, R. J., Fanslow, W. C. and Spriggs, M. K., CD40 ligand and its role in X-linked hyper-IgM syndrome. Immunol. Today 1993. 14: 559–564. 32 Schwarz, H., Valbracht, J., Tuckwell, J., von Kempis, J. and Lotz, M., ILA, the human 4-1BB homologue, is inducible in lymphoid and other cell lineages. Blood 1995. 85: 1043–1052. 16 Banchereau, J., Bazan, F., Blanchard, D., Brière, F., Galizzi, J. P., Van Kooten, C., Liu, Y. J., Rousset, F. and Saeland, S., The CD40 antigen and its ligand. Annu. Rev. Immunol. 1994. 12: 881–922. 33 Schwarz, H., Blanco, F. J., von Kempis, J., Valbracht, J. and Lotz, M., ILA, a member of the human nerve growth factor/tumor necrosis factor receptor family, regulates T-lymphocyte proliferation and survival. Blood 1996. 87: 2839–2845. 17 Lens, S. M., Tesselaar, K., van Oers, M. H. and van Lier, R. A., Control of lymphocyte function through CD27-CD70 interactions. Semin. Immunol. 1998. 10: 491–499. 34 Jung, T. M. and Dailey, M. O., Rapid modulation of homing receptors (gp90MEL-14) induced by activators of protein kinase C. Receptor shedding due to accelerated proteolytic cleavage at the cell surface. J. Immunol. 1990. 144: 3130–3136. 18 Jacquot, S., Kobata, T., Iwata, S., Morimoto, C. and Schlossman, S. F., CD154/CD40 and CD70/CD27 interactions have different and sequential functions in T cell-dependent B cell responses: enhancement of plasma cell differentiation by CD27 signaling. J. Immunol. 1997. 159: 2652–2657. 35 Kishimoto, T. K., Jutila, M. A. and Butcher, E. C., Identification of a human peripheral lymph node homing receptor: a rapidly down-regulated adhesion molecule. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990. 87: 2244–2248. 19 Agematsu, K., Nagumo, H., Oguchi, Y., Nakazawa, T., Fukushima, K., Yasui, K., Ito, S., Kobata, T., Morimoto, C. and Komiyama, A., Generation of plasma cells from peripheral blood memory B cells: synergistic effect of interleukin-10 and CD27/ CD70 interaction. Blood 1998. 91: 173–180. 36 Goodnow, C. C., Crosbie, J., Adelstein, S., Lavoie, T. B., Smith-Gill, S. J., Brink, R. A., Pritchard-Briscoe, H., Wotherspoon, J. S., Loblay, R. H. and Raphael, K., Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature 1988. 334: 676–682. 20 June, C. H., Bluestone, J. A., Nadler, L. M. and Thompson, C. B., The B7 and CD28 receptor families. Immunol. Today 1994. 15: 321–331. 37 Cooke, M. P., Heath, A. W., Shokat, K. M., Zeng, Y., Finkelman, F. D., Linsley, P. S., Howard, M. and Goodnow, C. C., Immunoglobulin signal transduction guides the specificity of B cell-T cell interactions and is blocked in tolerant self-reactive B cells. J. Exp. Med. 1994. 179: 425–438. 21 Lenschow, D. J., Walunas, T. L. and Bluestone, J. A., CD28/B7 system of T cell costimulation. Annu. Rev. Immunol. 1996. 14: 233–258. Eur. J. Immunol. 2000. 30: 1069–1077 Impaired up-regulation of CD86 in CVID 1077 38 Rathmell, J. C., Fournier, S., Weintraub, B. C., Allison, J. P. and Goodnow, C. C., Repression of B7.2 on self-reactive B cells is essential to prevent proliferation and allow Fas-mediated deletion by CD4(+) T cells. J. Exp. Med. 1998. 188: 651–659. 44 Rump, J. 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C. and Reynaud, C.-A., Defect in IgV gene somatic hypermutation in common variable immuno-deficiency syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. 95: 13135–13140. Correspondence: Hans-Hartmut Peter, Division of Rheumatology and Clinical Immunology, Department of Internal Medicine, University Hospital Freiburg, Hugstetterstr. 55, D-79106 Freiburg, Germany Fax: +49-761-270-3446 e-mail: peter — mm61.ukl.uni-freiburg.de CLINICAL OBSERVATIONS, INTERVENTIONS, AND THERAPEUTIC TRIALS Severe deficiency of switched memory B cells (CD27⫹IgM⫺IgD⫺) in subgroups of patients with common variable immunodeficiency: a new approach to classify a heterogeneous disease Klaus Warnatz, Axel Denz, Ruth Dräger, Moritz Braun, Christoph Groth, Guido Wolff-Vorbeck, Hermann Eibel, Michael Schlesier, and Hans Hartmut Peter Hypogammaglobulinemia is the hallmark of common variable immunodeficiency (CVID) syndrome, a heterogeneous disorder predisposing patients to recurrent bacterial infections. In this study, we investigated the peripheral B-cell compartment of 30 well-characterized CVID patients in comparison to 22 healthy controls. Flow cytometric analysis of peripheral blood lymphocytes revealed a reduction of classswitched CD27ⴙIgMⴚIgDⴚ memory B cells below 0.4% in 77% of our patients (group I), while this B-cell subpopulation exceeded 0.5% in all healthy donors and in 23% of CVID patients (group II). These results correlate well with the capacity of peripheral blood lymphocytes to produce immunoglobulins in vitro upon stimulation with Staphylococcus aureus Cowan I (SAC) plus interleukin-2 because the production of immunoglobulin G in vitro is entirely dependent on the presence of switched memory B cells. The subdivision of group I into patients with an increased proportion of CD21ⴚ peripheral B cells (> 20%; group Ia) and patients with normal percentages of CD21ⴚ B cells (< 20%; group Ib) revealed a significant clustering of patients with splenomegaly and autoimmune cytopenias in group Ia. Based on these observations, we propose a fast and reliable new classification for CVID patients by flow cytometric quantification of class-switched memory and immature B cells in the peripheral blood of patients. Our results point toward defects at various stages of B-cell differentiation in CVID subgroups and support the value of a B-cell–oriented classification principle. A consensus on this new classification system will hopefully provide a tool for rapidly defining homogeneous subgroups of CVID for functional studies and genetic linkage analysis. (Blood. 2002;99:1544-1551) © 2002 by The American Society of Hematology Introduction Common variable immunodeficiency (CVID) comprises a heterogeneous group of humoral immunodeficiencies of unknown etiology, with a prevalence of about 1 in 50 000. It is characterized by reduced serum levels of all switched immunoglobulin (Ig) isotypes (IgG, IgA, IgE), predisposing patients to frequent infections of the respiratory tract with encapsulated bacteria. Splenomegaly as well as malignancies and autoimmune phenomena may develop in 20% to 30% of the patients.1 Multiple etiologies are likely to result in this common clinical phenotype. Depending on the patients analyzed, primary T-cell defects,2-4 an exaggerated T-cell suppression,5 and primary B-cell defects,6-8 all leading to a complex failure of T- and B-cell cooperation, have been reported. Therefore, a classification of the patients is of primary importance to acknowledge the heterogeneity of the disease. About 80% of all CVID cases display normal T- and B-cell numbers in their peripheral blood. They have been functionally classified by Bryant et al9 according to their capacity to produce IgM, IgA, and IgG in vitro upon stimulation with Staphylococcus aureus Cowan I (SAC) plus interleukin-2 (IL-2) or anti-IgM plus IL-2 (see “Patients, materials, and methods”). Peripheral blood lymphocytes (PBLs) of patients in group A fail to produce any Ig isotype in vitro, while group B patients produce IgM only and group C patients are indistinguishable from healthy controls in producing normal amounts of all isotypes in vitro despite low serum Ig levels in vivo. A minority of CVID patients (5%-10%) have strikingly low peripheral B-cell counts (⬍ 1% of PBLs), suggesting defects at the early B-cell differentiation stages in bone marrow.10 Another subtype (5%-10%) exhibits noncaseating, sarcoidlike granulomas in different organs and tends to additionally develop a progressive T-cell deficiency.11,12 In our studies we included only CVID patients with normal B-cell counts (⬎ 1% of PBLs) and without evidence of granulomatous disease. The recent observation13 that X-linked hyper-IgM syndrome patients are lacking CD27⫹IgD⫺IgM⫺ memory B cells led us to examine this compartment in CVID. Mature class-switched CD27⫹IgD⫺IgM⫺ memory B cells were profoundly diminished or absent in all CVID patients of group A and almost all of group B. In contrast, CVID patients of group C were almost indistinguishable from healthy controls. Based on this finding we suggest a new, fast, and reliable fluorescence-activated cell sorting (FACS)–based classification defining 2 groups: CVID group I comprises patients with switched memory B cells below 0.4% of total PBLs, and CVID group II includes all patients with normal numbers of switched memory B cells (⬎ 0.4%). Group I can be subdivided according to increased (Ia) or normal (Ib) numbers of CD19⫹CD21⫺ immature B cells. This classification not only shows a good From the Division of Rheumatology and Clinical Immunology, Department of Medicine, and from the Department of Surgery, University Hospital of Freiburg, Germany. Reprints: H. H. Peter, Div of Rheumatology and Clinical Immunology, Hugstetter-Strasse 55, 79106 Freiburg, University Hospital of Freiburg, Germany; e-mail: [email protected]. Submitted July 18, 2001; accepted October 19, 2001. Supported by the Landesstiftung Baden Wuerttemberg. C.G. is a recipient of an award of the Hans-Hench Stiftung. 1544 The publication costs of this article were defrayed in part by page charge payment. Therefore, and solely to indicate this fact, this article is hereby marked ‘‘advertisement’’ in accordance with 18 U.S.C. section 1734. © 2002 by The American Society of Hematology BLOOD, 1 MARCH 2002 䡠 VOLUME 99, NUMBER 5 BLOOD, 1 MARCH 2002 䡠 VOLUME 99, NUMBER 5 CLASSIFICATION OF CVID correlation with the previous, more laborious functional classification of Bryant et al,9 but it also associates clinical features like splenomegaly and autoimmune cytopenia preferentially with group Ia. 1545 analysis (CellQuest, Becton Dickinson) was performed by forward versus side-scatter gating on viable lymphocytes (PBLs) in combination with gating on CD19⫹ cells. Ig synthesis in vitro Patients, materials, and methods Patients and controls All patients were diagnosed as having CVID based on typical medical history of recurrent bacterial infections associated with hypogammaglobulinemia (serum IgG ⬍ 3.0 g/L, IgA ⬍ 0.5 g/L). Other diseases causing hypogammaglobulinemia such as myeloma, non-Hodgkin lymphoma, exudative gastroenteropathy, nephrotic syndrome, chronic immunosuppression, or catabolic states due to malnutrition were excluded. Our group of 38 CVID patients included 2 with sarcoidlike granulomas and 6 with low peripheral B-cell counts (⬍ 1% CD19⫹ cells of PBLs) who were not subjected to detailed B-cell phenotyping. All patients were on regular intravenous IgG substitution (15-20 g IgG) every 4 to 7 weeks. Most patients were hyporeactive (usually one positive reaction to tetanus toxoid) or anergic in delayed-type skin tests (Multitest Immignost, Biosyn, Fellbach, Germany) but responded normally to mitogens (phytohemagglutinin, concanavalin A, pokeweed) and antigens (tetanus toxoid, purified protein derivative) in lymphoproliferative tests (results not shown). Table 1 summarizes patients’ age, onset of disease, sex, percentage of peripheral B cells, and their classification according to Bryant et al.9 Cell preparation After informed consent was obtained, 20 to 30 mL of blood anticoagulated with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) was drawn from CVID patients and age-matched healthy controls. Blood samples from CVID patients were always taken prior to intravenous Ig substitution. The fraction of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) was isolated by FicollHypaque density gradient centrifugation (Biochrom, Berlin, Germany) and washed twice with phosphate-buffered saline. PBMCs were centrifuged through a layer of 100% heat-inactivated fetal calf serum (PANBiotech, Aidenbach, Germany) to reduce cell-bound IgG and resuspended in RPMI 1640 (Biochrom) supplemented with 10% fetal calf serum. Antibodies and flow cytometry PBMCs (2.5 ⫻ 105/50 L RPMI 1640 plus 10% fetal calf serum) were stained for 20⬘ at 4°C with 10 L of a mixture of the following antibodies at optimal concentrations: CD27–fluorescein isothiocyanate (FITC) (Dako, Glostrup, Denmark) or CD21-FITC (Coulter-Immunotech, Hamburg, Germany), anti-IgD–phycoerythrin (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL), CD19-PC5 (Coulter-Immunotech), and anti-IgM–Cy5 (Dianova, Hamburg, Germany). Four-color data acquisition was performed with a FACSCalibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Data For in vitro Ig synthesis, 5 ⫻ 105 PBMCs were stimulated for 8 days with the T-cell–independent stimulus SAC (Calbiochem, La Jolla, CA) diluted to 1:10 000 plus 20 U/mL IL-2. Cultures were set up in 500 L RPMI 1640 medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum, penicillin, streptomycin, and L-glutamine (Biochrom). Control cultures were kept in medium without B-cell stimulants. Supernatants were collected after 8 days and stored at ⫺20°C until assayed for IgG, IgA, and IgM content by enzyme-linked immunosorbent assay.6 In this study we only report IgG and IgM concentrations and omitted IgA because it paralleled IgG and provided no additional information. Results are expressed as nanograms per milliliter of Ig isotype produced in stimulated cultures minus control cultures. Based on the results of the Ig synthesis following SAC plus IL-2 stimulation in vitro, CVID patients were assigned into one of the 3 subgroups defined by Bryant et al9 (Table 1): group A, no significant synthesis of IgM (⬍ 500 ng/mL) or IgG (⬍ 500 ng/mL); group B, significant synthesis of IgM (⬎ 4000 ng/mL) but not of IgG (⬍ 500 ng/mL); and group C, normal synthesis of IgM (⬎ 4000 ng/mL) and IgG (⬎ 500 ng/mL). Sorting of CD19ⴙCD27ⴚIgGⴚ naive B cells After isolation of CD19⫹ B cells (purity ⬎ 95%) by magnetic beads (DETACHaBEADs, Dynal, Hamburg, Germany), cells were stained for IgG (goat-F(ab⬘)2 anti-IgG–phycoerythrin, Southern Biotechnology Associates) and CD27 (CD27-FITC, Dako). Then 5 to 10 ⫻ 106 CD19⫹ B cells were sorted on a FACStar Plus (Becton Dickinson) into CD27⫺IgG⫺ naive B cells and CD27⫹IgG⫺IgM⫹ memory B cells. Purified B cells or B-cell subpopulations were cultured at 1 ⫻ 105/200 L in U-shaped microtiter plates and stimulated with SAC plus IL-2 (20 U/mL). Parallel 0.5 ⫻ 105 B cells were cocultured with 2 ⫻ 105 CD4⫹ T cells in flat-bottomed microtiter plates. CD4⫹ T cells had been positively selected by DETACHaBEADs (Dynal) and depleted of contaminating monocytes by incubation (20⬘, 4°C) with anti-CD14 and anti-CD16 monoclonal antibodies (Coulter-Immunotech) and subsequent treatment with immunomagnetic beads coated with antimouse IgG (Dynal). The purity of CD4⫹ T cells was more than 99%. Supernatants of B-cell cultures were collected after 8 days and stored at ⫺20°C until assayed for Ig isotypes by enzyme-linked immunosorbent assay. Statistical analysis Statistical comparisons of numeric data were made using an unpaired Student t test. Classified data were evaluated by the 2 or Fisher exact test. Differences between groups were considered significant at P ⬍ .05. Table 1. Characterization of CVID patients and healthy donors Group No. of patients Age, y Age at onset, y Sex M/F % peripheral B cells IgM in vitro, ng/mL IgG in vitro, ng/mL A 6 39.7 ⫾ 18.9 35.0 ⫾ 20.7 4:2 6.1 ⫾ 3.8 110 ⫾ 130 0 B 19 42.7 ⫾ 16.2 32.4 ⫾ 12.9 11:8 7.8 ⫾ 4.6 ⬎ 4000* 160 ⫾ 200 C 5 44.4 ⫾ 8.7 34.5 ⫾ 8.6 2:3 10.8 ⫾ 3.9 ⬎ 7500 ⬎ 1500 Low B cells 6 39.7 ⫾ 8.5 28.1 ⫾ 5.1 5:1 0.4 ⫾ 0.4 20 ⫾ 25 35 ⫾ 42 2 28 ⫾ 4 24 ⫾ 4 2:0 12.5 ⫾ 10.5 ⬎ 7500 190 ⫾ 100 22 32.4 ⫾ 7.6 NA 12:10 7.7 ⫾ 2.7 ⬎ 7500 ⬎ 1200† Sarcoidlike HD Patients are characterized according to Bryant et al9 into subgroups A, B, and C and are compared with healthy donors (HD). Age, onset of disease, sex, percentage of peripheral B-cell count (as percentage of PBLs), and IgM and IgG in vitro production after SAC plus IL-2 stimulation are given. There was no statistically significant difference in age, age of onset, sex distribution, and percentage of peripheral B cells between the different subgroups of CVID patients. CVID patients with low B-cell counts (⬍ 1%) and sarcoidlike lesions were not included in further studies. NA indicates not applicable. *Twelve of 19 produced more than 7500 ng/mL IgM. †Most healthy donors produced more than 1500 ng/mL IgG. 1546 WARNATZ et al BLOOD, 1 MARCH 2002 䡠 VOLUME 99, NUMBER 5 Results Decrease of class-switched CD27ⴙIgMⴚIgDⴚ B cells in CVID group A and B patients We examined B-cell subpopulations in the blood of 22 healthy donors and 30 CVID patients previously classified into groups A (n ⫽ 6), B (n ⫽ 19), and C (n ⫽ 5) (Table 1). The analysis revealed a severe decrease of CD27⫹ memory B cells in 77% of those CVID patients who had normal B-cell counts and no sarcoidlike lesions. When analyzed separately according to the classification of Bryant et al,9 CD27⫹ B cells were severely depleted in group A and B samples (1.1% ⫾ 0.7%, P ⬍ .001, and 1.7% ⫾ 1.7%, P ⫽ .006, respectively) while group C samples (4.1% ⫾ 1.6%, P ⫽ .3) showed no significant differences to healthy controls (3.2% ⫾ 1.5%). A recent report of Rajewski’s group14 demonstrated a substantial number of non–class-switched CD27⫹IgD⫹IgM⫹ memory B cells in the peripheral blood of humans. When dissecting the B-cell compartment according to surface Ig and CD27 expression, PBLs of healthy donors comprised 4.3% ⫾ 1.6% naive B cells (CD27⫺IgM⫹IgD⫹), 1.6% ⫾ 1.1% non–class-switched memory B cells (CD27⫹IgM⫹IgD⫹), less than 0.2% “IgM only” memory B cells (CD27⫹IgM⫹IgD⫺), and 1.6% ⫾ 0.6% class-switched memory B cells (CD27⫹IgM⫺IgD⫺). We could not detect a significant decrease in the non–class-switched compartment of group A or B patients (1.0% ⫾ 0.7%, P ⫽ .11, and 1.5% ⫾ 1.5%, P ⫽ .79, data not shown), but both groups lack significant numbers of classswitched memory B cells (0.1% ⫾ 0.1%, P ⬍ .0001, and 0.2% ⫾ 0.2%, P ⬍ .0001, respectively) (Figures 1 and 2). The fraction of IgM⫹IgD⫺ memory B cells was equally low and not significantly different in CVID and healthy controls (⬍ 0.2% of PBLs). The analysis of group C samples showed a slight decrease of class-switched memory B cells (1.0% ⫾ 0.4%, P ⬍ .04) (Figures 1 and 2) and an insignificant increase in non–class-switched memory B cells (3.2% ⫾ 1.8%, P ⫽ .15, data not shown). Figure 2. Profound decrease of switched memory B cells in CVID patients of subgroups A and B. PBMCs were stained for the expression of CD19, CD27, IgM, and IgD, as shown in Figure 1. CVID patients are assigned to groups A-C according to the classification by Bryant et al9 and are compared with healthy controls (HD). Rhombus symbols represent the percentage of switched memory B cells (CD27⫹IgM⫺IgD⫺) for each patient or healthy donor. Statistical analysis was performed by the Student t test, and P values are given. Good correlation between the frequency of CD27ⴙIgMⴚIgDⴚ switched memory B cells in peripheral blood and IgG synthesis in vitro The reduced size of memory B-cell populations in the subgroups of CVID patients producing little or no Ig in vitro suggests a correlation between the production of Ig isotypes in vitro and the size of memory B-cell subpopulations in vivo. While we were unable to determine a clear-cut correlation between IgM production in vitro and the IgM memory B-cell pool (see below), we found a significant dependence of IgG production in vitro on the frequency of switched memory B cells (CD27⫹IgM⫺IgD⫺) in the peripheral blood (r ⫽ 0.81, Figure 3). This correlation was independent of whether the cells were derived from CVID patients or healthy donors, suggesting a normal intrinsic function of classswitched memory B cells in CVID patients of group C. Isolated naive B cells of healthy donors do not produce IgM or IgG in vitro after SAC plus IL-2 stimulation Because more than 90% of B cells from group A CVID patients express a naive CD27⫺ phenotype, we analyzed for more adequate Figure 1. Phenotypes of peripheral B cells of CVID patients. PBMCs were stained for the expression of CD19, CD27, IgM, and IgD and analyzed by FACS. Analysis was performed by gating on CD19⫹ cells, and dead cells were excluded by forward/side scatter gating. Representative examples of each CVID subgroup (A-C) according to the classification by Bryant et al9 as well as one healthy control (HD) are given. Indicated values represent percentages of gated CD19⫹ B cells. See “Patients, materials, and methods.” Figure 3. Good correlation between percentage of switched memory B cells in peripheral blood and IgG synthesis in vitro. The percentage of switched memory B cells (CD27⫹IgM⫺IgD⫺) in the peripheral blood and IgG production after SAC and IL-2 stimulation in vitro show a significant correlation (r ⫽ 0.81) when analyzed by linear regression. Healthy controls as well as CVID patients are included in this plot. BLOOD, 1 MARCH 2002 䡠 VOLUME 99, NUMBER 5 CLASSIFICATION OF CVID 1547 Table 2. IgM production in vitro by naive (CD27ⴚ) and IgM memory (CD27ⴙ) B cells of healthy donors CD19⫹ B cells CD4⫹ T cells* Stimulus IL-2 None SAC plus IL-2 None ⫹ IL-2 ⫹ SAC plus IL-2 CD19⫹ CD27⫺IgG⫺ B cells CD27⫹IgG⫺ B cells IgM, ng/mL IgG, ng/mL IgM, ng/mL IgG, ng/mL IgM, ng/mL IgG, ng/mL 0 145 0 0 0 0 0 62 0 0 953 0 0 0 0 0 251 0 628 ⬎ 1500 0 0 ⬎ 7500 69 ⬎ 7500 1461 0 0 ⬎ 7500 43 3392 1624 0 0 ⬎ 7500 0 652 963 0 0 1005 0 146 823 331 0 0 ⬎ 7500 3193 1691 25 55 ⬎ 7500 183 ⬎ 7500 ⬎ 1500 ⬎ 7500 0 ⬎ 7500 127 228 ⬎ 7500 ⬎ 1500 2684 0 ⬎ 7500 ⬎ 7500 ⬎ 1500 3441 0 ⬎ 7500 (CD27⫺IgG⫺) 99 (CD27⫹IgG⫺) (CD19⫹ After isolation of B cells of 3 healthy donors, naive as well as IgM memory cells were sorted by FACS. Purified B cells B cells) or B-cell subpopulations (CD27⫺ or CD27⫹IgG⫺ B cells) were then stimulated with IL-2 or SAC plus IL-2. IgG and IgM concentrations in 8-day culture supernatants are given in nanograms per milliliter. While naive B cells produce IgM only in the presence of SAC plus IL-2 and CD4⫹ T cells, IgM secretion by IgM memory B cells is sufficiently activated by either stimulus alone. There was no class switch in vitro detectable in either subpopulation under the applied conditions. *In the presence (⫹) or absence (None) of CD4⫹ T cells according to the protocol. For details, see “Patients, materials, and methods.” comparison the capacity of naive B cells of healthy donors to produce Ig in vitro after stimulation with SAC plus IL-2. Highly purified CD19⫹CD27⫺IgG⫺ B cells were stimulated for 8 days with SAC plus IL-2 in the presence or absence of autologous CD4⫹ T cells. In supernatants of T-cell–free cultures, no traces of Igs were detectable, indicating that SAC plus IL-2 is unable to induce Ig synthesis in isolated CD27⫺IgM⫹IgD⫹ naive B cells (Table 2). However, in the presence of autologous CD4⫹ T cells, naive, mature B cells produced large amounts of IgM, but no class switch to IgG was observed (Table 2). Therefore, the Ig synthesis pattern in vitro of mature CD27⫺IgM⫹IgD⫹ normal B cells closely resembles that of PBLs of CVID group B patients. Cultures set up with highly purified CD27⫹IgM⫹IgD⫹ memory B cells of healthy donors produced large amounts of IgM even in the absence of T cells (Table 2). They, however, failed also to produce significant levels of IgG, confirming the previous finding that SAC plus IL-2 is not sufficient to induce class switch in vitro.15 The data presented in Table 2 also explain why in cultures of PBLs stimulated with SAC plus IL-2 it is impossible to correlate IgM production in vitro to the IgM memory B-cell pool: In the presence of CD4⫹ T cells, both CD27⫺IgM⫹ naive B cells and CD27⫹IgM⫹ memory B cells are induced to IgM production. type A patient with 10% B cells in the original PBL fraction (Table 3, patient no. 3) showed normal IgM production in vitro when 0.5 ⫻ 105/200 L isolated B cells were cocultured with 2 ⫻ 105/ 200 L autologous CD4⫹ T cells, but when 2 ⫻ 105 PBLs were added to the isolated B cells the IgM production subsided again. This suggests suppression by a population other than B cells and CD4⫹ T cells. Similar observations have previously been reported.16 Moreover, in a recent study of our group using the “Zubler system” to maximally stimulate B cells17 and the enzyme-linked immunospot assay technique as the read-out system, all type A patients produced IgM spots but no or very few IgG spots.18 In accordance with these and previous data,19 we found a normal, spontaneous IgM synthesis by 23 of 23 CVID-derived Epstein-Barr virus lines (data not shown). Taken together, all these findings Table 3. Dependence of IgM production on culture condition Cell population No. of incubated B cells per well IgM, ng/mL IgG, ng/mL IgA, ng/mL Patient no. 1 (CVID group B) PBMCs CD19⫹ B cells alone CD19⫹ B cells plus CD4⫹ T cells 30 000 ⬎ 7 500 170 0 100 000 0 0 0 50 000 ⬎ 7 500 40 0 Patient no. 2 (CVID group A) IgM production of CVID group A patients in vitro is dependent on culture conditions al9 We have applied the CVID classification of Bryant et over the last 10 years in our clinic and found that patients usually stayed in the same group when tested on repeated occasions. However, in 2 patients repeatedly classified as type A, a reversion to type B could be observed. Interestingly, we have never observed the opposite— that is, progression from type B to A. To clarify the validity of a negative IgM production in vitro we studied in a more systematic approach the influence of culture conditions on the outcome of Ig synthesis in vitro of CVID group A patients. We therefore coincubated 0.5 ⫻ 105/200 L purified B cells and 2 ⫻ 105/200 L autologous CD4⫹ T cells. In one patient (Table 3, patient no. 2), this increase of B-cell numbers in the culture normalized the IgM production, suggesting that a low B-cell frequency of 1.5% (7500 B cells/200 L of culture) in the original PBL preparation might have been a cause for the “defective” IgM production in vitro. Another PBMCs CD19⫹ B cells alone CD19⫹ B cells plus CD4⫹ T cells 7 500 0 0 0 100 000 0 0 0 50 000 ⬎ 7 500 110 0 Patient no. 3 (CVID group A) PBMCs 60 000 0 0 0 100 000 0 0 0 CD19⫹ B cells plus CD4⫹ T cells 50 000 ⬎ 7 500 290 80 CD19⫹ B cells plus CD19⫺ PBMCs 50 000 0 0 0 CD19⫹ B cells alone Ig production was measured either after incubation of PBMCs (5 ⫻ cells/500 L), isolated CD19⫹ B cells alone (0.5 ⫻ 105 cells/200 L), or in coculture with 2 ⫻ 5 ⫹ 5 ⫺ 10 CD4 T cells or 2 ⫻ 10 CD19-depleted PBMCs (CD19 PBMCs) for 8 days. The results are presented for patient no. 1 (CVID group B according to Bryant et al9) and patient no. 2 and patient no. 3 (both CVID group A). See Table 2 for comparison with healthy donors and “Patients, materials, and methods” for further details. The numbers of B cells incubated per test are recorded in the second column. In patient no. 2, the low peripheral B-cell number is likely to be the main reason for failure of a detectable IgM production. It normalized after increasing the number of incubated B cells. PBMCs of patient no. 3, however, contained a sufficient number of B cells, but IgM production was only detectable after cocultivation of purified CD4⫹ T cells and CD19⫹ B cells. The missing IgM production after adding CD19-depleted PBMCs to isolated B cells suggests a suppressive effect of the remaining populations. 105 1548 BLOOD, 1 MARCH 2002 䡠 VOLUME 99, NUMBER 5 WARNATZ et al Table 4. New classification of CVID CD19⫹ B cells, % of PBLs CD27⫺ IgM/D⫹, % of PBLs CD27⫹IgM/D⫹, % of PBLs CD27⫹IgM/D⫺, % of PBLs CD21⫺, % of B cells Bryant classification Splenomegaly Autoimmunity* CVID Subgroup No. of patients Group I a 10 4.9 ⫾ 2.6‡ 3.5 ⫾ 1.8 1.2 ⫾ 0.9 0.1 ⫾ 0.1§ 44.7 ⫾ 11.0§ A/B 10/10 (100%) 6/10 Neg. b 13 7.8 ⫾ 3.6 6.5 ⫾ 3.2㛳 0.9 ⫾ 0.4‡ 0.1 ⫾ 0.1§ 9.9 ⫾ 5.7 A/B 5/12 (42%) 6/13 Interm. 7 12.6 ⫾ 4.7㛳 7.6 ⫾ 4.3 3.8 ⫾ 1.9㛳 0.9 ⫾ 0.4¶ 12.6 ⫾ 9.0# C 3/7 Pos. 22 7.7 ⫾ 2.7 4.3 ⫾ 1.6 1.6 ⫾ 1.1 1.6 ⫾ 0.6 7.0 ⫾ 2.7 NA NA NA Group II HD 1/7 (14%)# NA Vaccination† The new classification includes only CVID patients with peripheral B-cell numbers above 1% of PBLs. PBLs of group I CVID patients comprise less than 0.4% of class-switched memory B cells (CD27⫹IgM⫺IgD⫺), while in group II, like healthy donors (HD), this population accounts for more than 0.4%. Group I is further subdivided by the percentage of immature CD21⫺ B cells into subgroups Ia (more than 20%) and Ib (less than 20%). All former group A and B patients according to the classification by Bryant et al9 fall into group I, except 2 former group B patients who fall into group II. All values are given as mean ⫾ SE. NA indicates not applicable. *There is a significant clustering of splenomegaly and autoimmune cytopenia in group Ia. Autoimmune phenomena in group Ia patients included 5 patients with thrombocytopenia and 1 with autoimmune hemolytic anemia; group Ib included 2 patients with pernicious anemia, 2 with vitiligo, 1 with autoimmune hemolytic anemia, and 1 with CREST syndrome; group II included 2 patients with pernicious anemia and 1 with vitiligo. †The new classification may allow a prediction of the response to vaccinations. Neg. indicates no response (n ⫽ 1); Interm., intermediate (n ⫽ 3); and Pos., normal response (n ⫽ 3) to vaccination with phage X174. ‡P ⬍ .02. §P ⬍ .0001 compared with HD. 㛳P ⬍ .05. ¶P ⬍ .005 compared with HD. #One patient of group II had more than 20% immature B cells in the peripheral blood, and he was the only one with splenomegaly in this group. indicate that failing IgM production in vitro is not an absolute and irreversible defect in CVID patients; it may have various causes and does not seem to be a reliable marker for a specific subgroup of CVID patients. A new, easy FACS-based classification of CVID patients with normal B-cell numbers The percentage of class-switched CD27⫹IgM⫺IgD⫺ memory B cells of the PBL fraction was a highly reliable marker for a classification of CVID patients. In all healthy donors more than 0.5% (1.6% ⫾ 0.6%) of PBLs belong to the CD27⫹IgM⫺IgD⫺ population. In contrast, PBLs of 77% of our CVID patients with normal B-cell counts contained less than 0.35% of class-switched memory B cells (0.1% ⫾ 0.1%, P ⬍ .0001). We designated this group of patients as CVID group I (Table 4). A total of 23% of our patients showed a less significant reduction of the peripheral switched memory B-cell compartment (0.9% ⫾ 0.4%, P ⫽ .005); they were classified as CVID group II. The difference to group I was also highly significant (P ⬍ .002) (Table 4). At the same time this group showed a significant increase of total B cells (12.6% ⫾ 4.7%) compared with group I (6.5% ⫾ 3.5%, P ⫽ .019) and healthy donors (7.7% ⫾ 2.7%, P ⫽ .046) (Table 4). Our new CVID group I comprises only former group A and B patients of the Bryant classification, while group C patients segregate with the new group II. As can be seen in Figure 4, CD21⫺ immature B cells normally amount to less than 20% of the CD19⫹ B-cell compartment in healthy donors. In contrast, patients of CVID group I can be divided into a subgroup Ia, with an increased proportion of CD21⫺ B cells, and a subgroup Ib, with normal numbers of this cell population (Table 4). CVID patients of group Ib showed a significant decrease of IgM memory B cells (CD27⫹IgM⫹IgD⫹, 0.9% ⫾ 0.4%, P ⬍ .02) compared with healthy donors (1.6% ⫾ 1.1%) (Table 4). Interestingly, all 10 patients of subgroup Ia were clinically characterized by splenomegaly, and 6 of 10 had recurrent autoimmune cytopenia. Some patients of CVID subgroup Ib and II, rather, exhibited other autoimmune phenomena than cytopenias, eg, pernicious anemia or vitiligo (Table 4). The clustering of splenomegaly (10 of 10) and autoimmune cytopenia (6 of 10) was significant in comparison to group Ib (5 of 12, P ⫽ .005, and 1 of 13, P ⫽ .019, respectively) and group II (1 of 7, P ⫽ .0006, and 0 of 7, P ⫽ .034, respectively). There was only one patient with increased counts of CD21⫺ B cells (and splenomegaly) in group II, suggesting a more complex defect in this patient. Our recent results of an in vivo vaccination study (A. Rump, manuscript in preparation) with the neoantigen phage X174 20 showed a surprising correlation with the new classification. The only tested patient of group Ia produced no detectable specific antibody response, while all 3 patients of group Ib had transiently detectable titers. In contrast, normal antiphage antibody responses were seen in 3 patients of group II. This suggests a predictive value of the new classification for potential vaccination studies. Figure 4. Increase of CD21ⴚ B cells in CVID patients of group Ia. PBMCs were stained for the expression of CD19, CD21, IgM, and IgD and analyzed by FACS. Analysis was performed by gating on CD19⫹ B cells, and dead cells were excluded by forward/side scatter gating. Representative FACS dot blots of the new CVID subgroups Ia, Ib, II, and one healthy control (HD) are shown. Indicated values represent percentages of gated CD19⫹ B cells. See “Patients, materials, and methods.” BLOOD, 1 MARCH 2002 䡠 VOLUME 99, NUMBER 5 Discussion After antigen-independent development in the bone marrow,21 immature B cells leave the bone marrow and gather in the longer-lived mature, naive IgD⫹IgM⫹CD27⫺ B-cell pool.22 When these cells are stimulated by antigen in the presence of the appropriate costimulation they will engage in a germinal center (GC) reaction and develop into plasma cells or memory B cells.23 In most patients with CVID the development of both cells types is greatly disturbed while mature B cells are present in normal numbers, indicating defects in the late B-cell differentiation. The functional classification of Bryant et al9 has certainly helped to identify disease subtypes but is not generally accepted. Reasons for its rare application are the laborious and expensive technique of Ig synthesis in vitro, which still awaits an international standardization, and the lack of a correlation to lymphocyte phenotypes and/or clinical features (eg, splenomegaly, autoantibodies). Based on current concepts of B-cell differentiation, we suggest 2 checkpoint markers for a new, rapid, and reliable FACS-based classification of CVID: first, CD27 as a marker for memory B cells that have undergone a GC reaction and, second, CD21 as a marker for the progression of immature via transitional into mature B cells. We want to emphasize that our proposed classification is only applicable in patients with firmly established diagnosis of CVID according to the World Health Organization definition.24 We purposely excluded CVID patients with very low B-cell numbers (⬍ 1%; CVID group III) because of the difficulty of analyzing their peripheral B-cell compartment. We also excluded patients with hypogammaglobulinemia and histologically proven sarcoidlike lesion because this subgroup tends to develop T-cell deficiency. In the last 2 years CD27 as well as CD148 25 have been established as reliable markers for human memory B cells.26,27 In all healthy donors more than 0.5% of PBLs belong to the CD27⫹IgM⫺IgD⫺ switched memory B-cell population; in contrast, PBLs of 77% of our CVID patients contained less than 0.35% of this cell type. We therefore set as a cutoff 0.4% of class-switched memory B cells and assigned all patients who fell below that percentage to CVID group I. The remaining 23% of our patients maintained switched memory B cells in the lower normal range. They were assigned to CVID group II. Two recent papers by Brouet et al28 and Jacquot et al29 also describe subsets of CVID patients with normal and decreased percentages of CD27⫹ B cells. In the latter group, Jacquot et al29 identified severe forms of CVID and suggested that defects of CD27 expression or function contribute in some patients to the pathogenesis of CVID. The progression of immature via transitional to mature B cells can be monitored by the expression of CD21.22,30 Interestingly, patients of CVID group I could be subdivided according to the percentage of CD21⫺ B cells in peripheral blood. PBLs of healthy donors never exceeded 20% of CD21⫺ immature B cells (7.0% ⫾ 2.7%), whereas 10 of 23 patients of CVID group I exhibited a remarkable expansion of this population (44.9% ⫾ 11.6%, P ⬍ .0001). This accumulation of immature B cells in the blood points toward a disturbed maturation or premature exodus of immature B cells from the bone marrow. The necessary signals for further differentiation seem to derive from the splenic microenvironment but are still elusive. Most interestingly, 10 of 10 patients in this subgroup Ia showed splenomegaly, and 6 of 10 (60%) suffered from recurrent autoimmune cytopenia (IgM-mediated idiopathic thrombocytopenia and/or autoimmune hemolytic anemia), while only 1 of 13 patients in CLASSIFICATION OF CVID 1549 subgroup Ib (P ⬍ .02) and none in group II (P ⫽ .03) presented with autoimmune cytopenia. Other autoimmune phenomena, such as vitiligo and pernicious anemia, were more common in these groups. One potential mechanism leading to autoimmune cytopenia may be the decrease of competing mature B cells for the entry into secondary follicles.31 Failure of appropriate up-regulation of CD21 or its signaling complex may by itself interfere with appropriate antibody production.32,33 When we compared our results with the classification procedure based on Ig synthesis in vitro,9 we found that, with the exception of 2 group B patients, all A and B patients belong to the new group I. We could show a significant correlation between IgG production in vitro and the percentage of switched memory B cells in vivo and demonstrated a variability of IgM production in vitro depending on the protocol. Thus, low to absent IgM production in vitro may be due to low B-cell numbers (1%-2%) in some patients and may normalize with a proportionate increase of B cells in the cell culture system (Table 3). In other patients of group A, the removal of suppressive cell populations may result in significant IgM production.5,16 Therefore, IgM production is not a reliable marker for a CVID classification. Neither was the percentage of IgM memory B cells, because the size of this population in healthy donors varied considerably. Because the development of memory B cells is essentially linked to the formation of GCs in secondary lymphoid organs,23 the finding of a significantly reduced switched memory B-cell compartment in CVID type I strongly supports the hypothesis that GC reactions are disturbed in this disease.34 Many possible causes for disturbed GC reactions have been described. Mutations in the CD40 ligand gene,35,36 defects of the tumor necrosis factor-␣ family37 and its receptors,38 and impaired expression of costimulatory molecules like CD86 39 and chemokines like B-lymphocyte chemoattractant40 all interfere strongly with the formation and function of GCs. Well-coordinated interactions of T cells and B cells within the histoarchitectural network of follicular dendritic cells are essential for the normal development of a primary into a secondary follicle. In contrast to mice, up to 25% of human peripheral B cells express hypermutated IgM and CD27 on their surface and were therefore classified as IgM memory B cells.14 The origin of the IgM memory population is discussed controversially. Patients of group Ib exhibit an expansion of mature B cells and a concomitant reduction of switched and IgM memory B cells (Table 4), suggesting defects in the formation of both memory compartments, while the IgD⫺ (“IgM only”) memory B-cell compartment was only very small and indistinguishable from healthy donors and group II patients. If the IgM memory population is dependent on GC formation as thought by some authors,26 steps within the GC leading to isotype class switch41 ought to be disturbed in patients with normal numbers of IgM memory but decreased numbers of switched memory B cells (group Ia). Alternatively, the presence of IgM memory B cells in X-linked hyper-IgM syndrome (CD40L deficiency)42 as well as findings in sheep43 point toward a GC-independent origination of this population. The recent observation that the development of IgM memory (but not switched memory) is crucially dependent on the presence of the spleen and that splenectomy leads to a permanent abolition of more than 90% of this population (Wardermann H, Weber H, et al, manuscript in revision) adds an intriguing new facet to the origin of IgM memory in man. 1550 BLOOD, 1 MARCH 2002 䡠 VOLUME 99, NUMBER 5 WARNATZ et al A different pathogenesis seems to apply for the CVID group II patients. This group comprises all former C patients and 2 additional patients of group B. On average, PBLs of these patients contained a higher percentage of total B cells compared with patients in group I and healthy donors, suggesting an increased proliferation, an augmented lifespan, or decreased apoptosis of B cells. Their IgM memory B cells especially seem to be expanded compared with healthy donors. The switched memory B cells were only slightly decreased, and quantitative flow cytometry of memory B-cell subsets as well as the synthesis of Ig in vitro could not reliably distinguish them from healthy controls. CVID group II patients probably have a normal GC reaction but somehow fail to produce substantial amounts of antibodies in vivo or have an increased catabolism of Ig. The presence of functional GC reactions in some CVID patients with switched memory B cells has additionally been supported by the finding of normal hypermutation rates in 6 of 8 tested CVID patients by Levy et al.44 The hypogammaglobulinemia in group II patients may be due to impaired terminal plasma cell differentiation, a disturbed homing of plasma cell precursors,45 or a shortened lifespan of plasma cells in vivo.46 Many interactions like CD27/CD70,47,48 CD134/ CD134L,49,50 and IL-6 with its receptor51,52 promote the terminal differentiation of B cells into plasma cells. Interestingly, one report indicated an increase in IL-6 in CVID-derived PBLs.53 In 2 recent papers, Brouet et al28 and Jacquot et al29 analyzed the role of CD27 expression and function in patients with CVID. Both found a substantial decrease in CD27⫹ B cells in a subgroup of CVID patients, as similarly observed for our patients. Brouet et al28 demonstrated for 3 of 5 of these patients a defective up-regulation of CD27 on isolated B cells after in vitro activation, suggesting a defect in CD27 expression. This finding was confirmed by the report of Jacquot et al29 describing 2 of 6 patients with defective up-regulation of CD27 after in vitro activation. However, it does not distinguish between a primary defect in CD27 up-regulation and a defect secondary to a disturbed activation signal following SAC plus IL-2 stimulation. Interestingly, both authors describe another subgroup with normal CD27 expression but impaired in vitro function despite costimulation with CD70 transfectants. Thus, Brouet et al28 reported that isolated B cells from 2 of these patients failed to produce Ig when costimulated with CD70 transfectants. Unfortunately, this finding was not correlated to Ig production in the absence of CD70/CD27 costimulation, thus rendering it impossible to distinguish defects in CD27 function from defects in SAC plus IL-2/CD40 stimulation. The group of Jacquot et al,29 however, clearly shows for one patient a disturbed costimulatory signaling via CD27. Unfortunately, neither group correlated their data to extended clinical phenotypes and the existing classification of Bryant et al.9 These findings point at an important role of CD27/CD70 costimulation in the pathogenesis of CVID and deserve further investigation. Recent results from our group show that naive, pre–germinal center B cells (CD27⫺) from CVID group I show an impaired up-regulation of CD70 and CD86 upon stimulation with anti-IgM plus IL-2, while CD27 regulation was not altered (C.G., R.D., K.W., et al, manuscript submitted). Functional investigations on the interaction between CD27 on B cells and its CD70 ligand on T cells are underway. In conclusion, this study proposes a new CVID classification that is based on flow cytometric analysis of different B-cell subsets in peripheral blood. It accommodates the previous functional classification of Bryant et al9 and confirms and extends reports by Brouet et al28 and Jacquot et al29 on low CD27⫹ B-cell counts in a subset of severely immunocompromised CVID patients. It shows a correlation with clinical findings and may permit the prediction of successful vaccination in some CVID patients. A consensus on this classification system will provide a powerful tool to rapidly define and compare homogeneous subgroups of CVID for functional studies and genetic linkage analysis. References 1. Cunningham-Rundles C, Bodian C. Common variable immunodeficiency: clinical and immunological features of 248 patients. Clin Immunol. 1999;92:34-48. 2. Stagg AJ, Funauchi M, Knight SC, Webster AD, Farrant J. 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