Erzeugung und Umsetzung von molekularem Wasserstoff durch
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Jahrbuch 2005/2006 | van Gastel, Maurice; Reijerse, Eduard J.; Lubitz, W olfgang | Erzeugung und Umsetzung von molekularem W asserstoff durch Hydrogenasen Erzeugung und Umsetzung von molekularem Wasserstoff durch Hydrogenasen Production and Consumption of Molecular Hydrogen by Hydrogenases van Gastel, Maurice; Reijerse, Eduard J.; Lubitz, W olfgang Max-Planck-Institut für chemische Energiekonversion, Mülheim an der Ruhr Korrespondierender Autor E-Mail: [email protected] Zusammenfassung Molekularer Wasserstoff (H 2 ) ist ein w ichtiger umw eltfreundlicher Energieträger für Anw endungen, z.B. in Brennstoffzellen, an denen derzeit w eltw eit geforscht w ird. Bisher stellt die großtechnische Produktion von Wasserstoff aus Wasser mittels Sonnenlicht allerdings noch eine große Herausforderung dar. In der Natur nutzen Bakterien dieses Molekül als Energiequelle, die in sauerstoffarmer Umgebung leben. Die Hauptklassen der Hydrogenasen – der Enzyme, die Erzeugung oder Umsetzung von H2 katalysieren – w urden spektroskopisch mit EPR- und FTIR-Methoden und mit quantenchemischen Berechnungen untersucht, um den Reaktionsmechanismus aufzuklären. Summary Molecular hydrogen (H2 ) is an important energy carrier in environmentally-friendly applications, e.g. clean fuel cells, w hich are under development w orldw ide. How ever, presently the large scale production of hydrogen from w ater and sunlight is still a major challenge. In nature anaerobic bacteria use this molecule as energy source. The tw o major classes of hydrogenases, the enzymes that catalyze the production or the splitting of H2 , w ere investigated by means of EPR and FTIR spectroscopy and quantumchemical calculations to elucidate the reaction mechanism. Molekularer Wasserstoff, (H 2 ), ist ein w ichtiger Energieträger für zukünftige Anw endungen in umw eltfreundlichen Motoren oder Brennstoffzellen. Als Basis der zukünftigen H2 -Versorgung w ird w eltw eit an der Produktion des Wasserstoffs aus Wasser mittels Sonnenlicht geforscht. In der Natur w ird dieses Molekül als Energiequelle durch Bakterien genutzt, die in sauerstoffarmer Umgebung leben und daher einen Metabolismus basierend auf Wasserstoff anstelle des Sauerstoffs haben. Vermutlich existierte der Wasserstoff-Metabolismus bereits lange bevor die Atmosphäre der Erde Sauerstoff enthielt und ging damit dem Sauerstoff-Metabolismus voraus. Die Enzyme, die Wasserstoff in diesen Bakterien produzieren oder spalten, w erden Hydrogenasen genannt. Die genaue Kenntnis der Struktur und Funktion dieser Enzyme ist von fundamentaler Bedeutung für eine © 2006 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 1/8 Jahrbuch 2005/2006 | van Gastel, Maurice; Reijerse, Eduard J.; Lubitz, W olfgang | Erzeugung und Umsetzung von molekularem W asserstoff durch Hydrogenasen zukünftige biologisch-basierte Wasserstofftechnologie, aber auch für den Bau bioanorganischer Modelle für das katalytische Zentrum, die ebenfalls für einen technischen Einsatz in Frage kommen. Alle heute bekannten Hydrogenasen sind Metalloenzyme. Abhängig von der Art der Metallionen im Reaktionszentrum, an dem Wasserstoff bindet, kann eine Klassifikation von Hydrogenasen vorgenommen w erden. Die zw ei größten Klassen sind die Nickel-Eisen-(NiFe)-Hydrogenasen und die Eisen-Eisen-(FeFe)Hydrogenasen, w elche beide ein dinukleares Metallzentrum besitzen. Die Struktur, Funktion und spezifische Aktivität dieser Enzyme ist mit zahlreichen Methoden studiert w orden, sie reicht von biochemischen und molekularbiologischen Studien bis zur strukturanalytischen, spektroskopischen und quantenmechanischen Charakterisierung. Auch die Synthese und Charakterisierung von bioanorganischen Modellkomplexen spielt eine w ichtige Rolle, da diese w esentliche Aspekte der katalytischen Funktion nachbilden können, w ie einige Arbeitsgruppen bereits gezeigt haben. Von großer Bedeutung auf diesem Forschungsfeld ist die Ermittlung der Struktur der verschiedenen Zw ischenzustände (Intermediate) des Reaktionszyklus, die unterschiedlichen Ladungs-(Redox)-Zuständen des katalytischen Metallzentrums entsprechen. Spektroskopische Untersuchungen tragen hier entscheidend zum Verständnis dieser Zustände und damit des Reaktionsmechanismus auf elektronischem Niveau bei. NiFe-Hydrogenasen Nickel-Eisen-Hydrogenasen bestehen hauptsächlich aus zw ei Untereinheiten (Abb. 1). Die große Untereinheit beherbergt das Reaktionszentrum, an dem molekularer Wasserstoff bindet. In der kleinen Untereinheit befinden sich drei Eisen-Schw efel-Cluster, die Teil einer Elektrontransportkette sind. Das Protein enthält ferner einen Gaskanal („Wasserstoffkanal“) und eine Protonentransferkette („Protonenkanal") zum An- und Abtransport der Edukte und Produkte. Dies ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Sche m a tische Da rste llung e ine r Nick e l-Eise n-Hydroge na se m it große r (grün) und k le ine r (bla u) Unte re inhe it (Mole k ula rge wicht insge sa m t ca . 90 k Da ). Da s binuk le a re NiFe -Ze ntrum , die dre i Eise n-Schwe fe l-Ze ntre n (Fe S) sowie de r W a sse rstoff- und P rotone nk a na l sind a nge de ute t. © Ma x -P la nck -Institut für Bioa norga nische C he m ie Die Struktur der NiFe-Hydrogenase w urde bereits in den neunziger Jahren durch Röntgenstrukturanalyse an Hydrogenase-Einkristallen in Grenoble (Frankreich) und kurz darauf auch in Kyoto (Japan) ermittelt. Das aktive Zentrum enthält Nickel und Eisen koordiniert von vier Aminosäuren (Cysteinen) der großen Untereinheit und © 2006 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 2/8 Jahrbuch 2005/2006 | van Gastel, Maurice; Reijerse, Eduard J.; Lubitz, W olfgang | Erzeugung und Umsetzung von molekularem W asserstoff durch Hydrogenasen drei zw eiatomigen anorganischen Liganden. Mittels Infrarotspektroskopie w urden diese Liganden als zw ei Cyanide (CN- ) und ein Kohlenmonoxid (CO) identifiziert, w as für ein Protein sehr ungew öhnlich ist. Im oxidierten Zustand w urde ein zusätzlicher verbrückender Ligand (X) gefunden, der im reduzierten Zustand des Enzyms nicht beobachtet w urde. Das Metallzentrum hat damit freie Bindungsstellen, w as eine Anlagerung von Wassserstoff ermöglicht. Die Struktur des aktiven Zentrums der [NiFe]-Hydrogenase ist in Abbildung 2b dargestellt. Die exakte Geometrie des Nickel-Eisen-Zentrums hängt vom Redox-Zustand des Enzyms ab, den es w ährend des katalytischen Zyklus annimmt. Die Charakterisierung dieser Zustände ist allein mit Röntgenkristallographie nicht möglich, da diese Zustände sich in den Einkristallen nur schw er oder gar nicht erzeugen lassen. Ferner ist diese Methode für Wasserstoffkerne – d.h. für Substrat und Produkt dieses Enzyms – blind. Hier ist der Einsatz spektroskopischer Methoden erforderlich, insbesondere solcher, die hohe Empfindlichkeit für W asserstoffkerne aufw eisen, w ie die Techniken der magnetischen Resonanzspektroskopie (EPR und NMR). Die Redox-Zustände Ni-A, Ni-B, Ni-C und Ni-L des Reaktionszentrums sind paramagnetisch (sie w eisen ein ungepaartes Elektron auf) und sind damit der EPR (Electron Paramagnetic Resonance) Spektroskopie zugänglich. Mit dieser Technik w urden in unserem Labor von allen paramagnetischen Intermediaten an Hydrogenase-Einkristallen des Bakteriums Desulfovibrio (D.) vulgaris Miyazaki F die Spektren orientierungsabhängig gemessen und Größe und Orientierung der spektroskopischen Parameter entnommen (z. B. Zeeman-Aufspaltung: g-Tensor). Ein Beispiel ist in Abbildung 2a, der sich ergebene g-Tensor und seine Lage im aktiven Zentrum in Abbildung 2b gezeigt. Die g-Tensorw erte w erden als „spektroskopischer Fingerabdruck“ zur Identifizierung des jew eiligen Zustands genutzt. Sie können auch mittels moderner quantenchemischer Verfahren (Dichtefunktionaltheorie, DFT) an geometrie-optimierten Strukturen berechnet w erden. Der Vergleich der experimentellen und theoretischen Daten lieferte Aufschlüsse über die Redox- und Spinzustände der Metalle im Reaktionszentrum und w ichtige geometrische Details des katalytischen Zentrums (z. B. Art der Brückenliganden). Das ungepaarte Elektron ist über das Reaktionszentrum delokalisiert und w echselw irkt mit denjenigen Kernen, die ebenfalls ein magnetisches Moment haben (sog. Hyperfeinw echselw irkung, HFC). Die HFC ist häufig in den EPR-Spektren nicht aufgelöst. Mehrfachresonanztechniken w ie ENDOR (Electron Nuclear DOuble Resonance) und mehrdimensionale Puls-EPR-Verfahren (HYSCORE) sind in der Lage, diese sehr kleinen Wechselw irkungen zu messen. Die Abbildung 2c zeigt ENDOR-Spektren von einem Hydrogenase-Einkristall zur Ermittlung der HFC mit Protonen (1 H) des aktiven Zentrums, die Abbildung 2d ein sog. HYSCORE-Spektrum zur Messung der HFC des Stickstoffs (14 N). Die HFCs w urden ebenfalls mit DFT berechnet und mit den experimentellen Daten verglichen. © 2006 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 3/8 Jahrbuch 2005/2006 | van Gastel, Maurice; Reijerse, Eduard J.; Lubitz, W olfgang | Erzeugung und Umsetzung von molekularem W asserstoff durch Hydrogenasen Übe rsicht übe r da s NiFe -R e a k tionsze ntrum in Hydroge na se n und die zum Studium de r funk tione lle n Zusa m m e nhä nge e inge se tzte n EP R -Te chnik e n. Alle Ex pe rim e nte a m Ni-BZusta nd in Eink rista lle n de r Hydroge na se a us D. vulgaris Miya za k i F. © Ma x -P la nck -Institut für Bioa norga nische C he m ie Daten dieser Art sind von allen paramagnetischen Zuständen der Hydrogenasen erhalten w orden und führten zu einem detaillierten Bild der elektronischen und geometrischen Struktur des katalytischen Zentrums. Die w esentlichen Ergebnisse sind: (1) Das Eisen befindet sich stets im diamagnetischen Fe(II)-Zustand („low spin“), es ist nicht redoxaktiv und bindet höchstw ahrscheinlich nicht den W asserstoff. (2) Das Nickel dagegen w echselt die Oxidationsstufe (redoxaktiv) im Katalysezyklus (Wechsel zw ischen Ni(III) paramagnetisch und Ni(II) diamagnetisch). (3) Der oxidierte aktive Zustand des Enzyms (Ni-B) trägt in der Brückenposition ein Hydroxylion (OH- ), w elches nach Protonierung als W asser abgegeben w erden kann. ( 4 ) Das Ni bindet und aktiviert den Wasserstoff an seiner freien Koordinationsstelle (heterolytische H 2 Spaltung). (5) Das zentrale Intermediat Ni-C im Katalysezyklus trägt ein Hydrid in der Brückenposition zw ischen Ni und Fe. (6) Belichtung von Ni-C erzeugt den Zustand Ni-L, w elcher das Hydrid als Proton verloren hat (Protonierung eines Cysteins?) und formal ein Ni(I) enthält. Dieser Prozess ist reversibel. (7 ) Die Hydrogenase w ird durch Sauerstoff (Ni-A-Zustand) und durch Kohlenmonoxid (Ni-CO) inhibiert. In beiden Fällen w ird die freie Bindungsstelle am Nickel blockiert, so dass H2 w ahrscheinlich nicht mehr binden kann. Die sog. „EPR-silent states“ können mit der EPR nicht erfasst w erden, hier musste zusätzlich FTIRSpektroskopie eingesetzt w erden. Die „Sonden“ der FTIR-Spektroskopie sind die CO- und CN-Schw ingungen © 2006 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 4/8 Jahrbuch 2005/2006 | van Gastel, Maurice; Reijerse, Eduard J.; Lubitz, W olfgang | Erzeugung und Umsetzung von molekularem W asserstoff durch Hydrogenasen der Liganden des Eisens. Sie w eisen definierte IR-Absorptionen auf, die sich je nach Zustand, in dem sich die Hydrogenase befindet, verschieben und durch die IR-Spektroskopie empfindlich nachgew iesen w erden können. Die FTIR-Spektroskopie kann an allen Zuständen durchgeführt w erden und ist empfindlich auf Ladungsdichteänderungen am Eisen. Die Analyse der Absorptionsbanden und ihrer Verschiebungen erlaubt damit Rückschlüsse auf die Struktur und Funktion des aktiven Zentrums und trägt dazu bei, den Reaktionsmechanismus besser zu verstehen. Eine Kombination von FTIR-Spektroskopie und Elektrochemie erlaubt die selektive Einstellung bestimmter RedoxZustände durch Anlegen eines definierten Potenzials an die Hydrogenase unter gleichzeitiger Aufnahme des Infrarot-Spektrums. Mithilfe dieser Technik konnten die Redoxpotenziale der einzelnen Übergänge für die Hydrogenase aus D. vulgaris Miyazaki F sow ie ihre pH-Wert-Abhängigkeit bestimmt w erden. Diese spektroelektrochemischen Messungen führten zu folgenden w esentlichen Ergebnissen: (1) Das Eisen trägt 1 CO- und 2 CN- -Liganden. (2) Die Redox-Potenziale konnten für alle Übergänge bestimmt w erden, sie liegen etw a im Bereich -100 bis 440 mV. (3) Jeder Elektronentransfer ist im Katalysezyklus von einem Protonentranfer-Schritt begleitet. ( 4 ) Der EPR-inaktive Ni-SI-Zustand, w elcher H 2 bindet, existiert in einem Protonierungsgleichgew icht (Protonierung eines Cysteins). Die EPR-, FTIR- und theoretischen Ergebnisse führten zur Aufstellung eines Mechanismus für die heterolytische W asserstoffspaltung, der in Abbildung 3 in groben Zügen gezeigt ist. Vorge schla ge ne Struk ture n de r ve rschie de ne n R e dox Zustä nde de r Nick e l-Eise n-Hydroge na se a uf de r Ba sis von qua nte nche m ische n Be re chnunge n und EP R /FTIR Ex pe rim e nte n (sie he Te x t). © Ma x -P la nck -Institut für Bioa norga nische C he m ie FeFe-Hydrogenasen Von Eisen-Eisen-Hydrogenasen w ird angenommen, dass sie zu den ältesten Enzymen in der Natur gehören. Sie w erden z. B. im Periplasma von Schw efel-reduzierenden Bakterien gefunden. Die Wasserstoffproduktion der FeFe-Hydrogenase ist bemerkensw ert hoch. Allerdings ist dies mit einem Nachteil verbunden: auch die Sauerstoff-Empfindlichkeit des Enzyms ist sehr hoch. Dies begrenzt bislang die Einsatzmöglichkeiten dieses © 2006 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 5/8 Jahrbuch 2005/2006 | van Gastel, Maurice; Reijerse, Eduard J.; Lubitz, W olfgang | Erzeugung und Umsetzung von molekularem W asserstoff durch Hydrogenasen Hydrogenase-Typs in Studien zur Wasserstoffproduktion, z.B. durch Verw endung photosynthetisierender Bakterien. Das Protein enthält neben dem Reaktionszentrum (dem so genannten H-Cluster), auch zw ei Fe 4 S4 -Cubane, die als Elektronentransport-Relais dienen. Der H-Cluster selbst (siehe Abb. 4) besteht aus zw ei EisenUnterclustern: einer Cuban-Struktur (Abb. 4, links), die im Protein in der üblichen Weise durch vier CysteinLiganden verankert ist, und einer zw eikernigen Struktur, die mit dem Cuban nur durch eine einzelne CysteinBrücke verbunden ist. Diese Einheit (Abb. 4, rechts) enthält CN- - und CO-Liganden sow ie ein die beiden Metallzentren überbrückendes Dithiolat. Überraschenderw eise gibt es keine w eiteren Verbindungen zw ischen der zw eikernigen Struktur und dem Protein. Man könnte sich vorstellen, dass die zw eikernige Einheit als unabhängiger anorganischer Katalysator in der Ursuppe arbeitete und später in eine Proteinmatrix eingefangen w urde. In der Tat stellte sich heraus, dass anorganische Modellkomplexe, die der zw eikernigen Einheit ähneln, relativ einfach synthetisiert w erden können und recht stabil sind. Struk tur de s H-C luste rs de r Fe Fe -Hydroge na se (na ch Fonte cilla -C a m ps, Gre noble , Fra nk re ich). De r P fe il de ute t die fre ie Koordina tionsste lle de s dista le n Fe d a n, wo a uch da s C O a nge la ge rt wird. © Ma x -P la nck -Institut für Bioa norga nische C he m ie Im aktivierten Zustand enthält der H-Cluster eine freie Koordinationsstelle am „distalen Eisen“ (Fe d , Abb. 4), fern von der Fe 4 S4 -Cuban-Struktur. Es w ird angenommen, dass hier der molekulare Wasserstoff bindet, bevor er oxidiert w ird (oder freigesetzt w ird, w enn das Enzym in der anderen Richtung arbeitet). Verglichen mit NiFe-Hydrogenasen ist der Mechanismus der Wasserstoffaufnahme bzw . -abgabe in den FeFeHydrogenasen w eniger gut verstanden. Selbst über die korrekten Oxidations-Zustände der einzelnen Eisenatome im zw eikernigen Cluster in den verschiedenen Zuständen des Proteins w ird noch debattiert. Der zw eikernige Cluster kann im reduzierten Zustand entw eder [Fe I ,Fe I ] oder [Fe II ,Fe II ] sein, und im oxidierten Zustand [Fe I ,Fe II ] oder [Fe II , Fe III ] . Mössbauer-Studien von Jose J. M. Moura (Lissabon) und Mitarbeitern haben gezeigt, dass w ährend der reduktiven Aktivierung des Enzyms die Ladung vorübergehend auf dem Cuban-Untercluster gespeichert w ird. Dieser Zustand ist paramagnetisch und ergibt ein rhombisches Muster im EPR-Spektrum. Durch eine Konformationsänderung (und unter Verlust des terminalen OH - -Liganden) w ird der aktive oxidierte Zustand [Hox ] des Enzyms (paramagnetisch) erreicht. © 2006 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 6/8 Jahrbuch 2005/2006 | van Gastel, Maurice; Reijerse, Eduard J.; Lubitz, W olfgang | Erzeugung und Umsetzung von molekularem W asserstoff durch Hydrogenasen I n Abbildung 5 ist das derzeit generell akzeptierte Schema der unterschiedlichen Zustände des H-Clusters zusammengefasst. Die in Rot dargestellten Zustände sind paramagnetisch und können daher mit EPR untersucht w erden. Von diesen ist nur der oxidierte Zustand [Hox ] direkt am katalytischen Prozess beteiligt. Vorschla g für die R e dox -Zustä nde de s H-C luste rs im k a ta lytische n Zyk lus e inschlie ßlich de r R e dox -Zustä nde de s C uba n-C luste rs. re prä se ntie rt die fre ie Koordina tionsste lle . © Ma x -P la nck -Institut für Bioa norga nische C he m ie Das Enzym w ird reversibel durch CO gehemmt, w elches an der offenen Position koordiniert. Auch dieser Zustand ist paramagnetisch. Durch Untersuchung von 57 Fe-angereicherten Enzymen mit Puls- und Doppelresonanz-EPR-Techniken bei 35 GHz konnte die Verteilung des ungepaarten Elektronenspins über die sechs Eisenatome des H-Clusters sow ohl im Hox - w ie im Hox CO-Zustand kartographiert w erden (siehe Abb. 6). Obw ohl formal nur das proximale Eisen Fe p paramagnetisch ist (Fe I ), stellte sich heraus, dass alle sechs Eisenatome Spindichte aufw eisen, die durch elektronische Austauschw echselw irkung zw ischen den Eisenatomen verursacht w ird. Das hier erhaltene Resultat der Spindichteverteilung bestätigt und verfeinert ein bekanntes Modell für das Elektronaustauschmuster im H-Cluster. Zwe idim e nsiona le ge pulste Hochfe ld-EP R - und ENDO R Ex pe rim e nte (be i 35 GHz, 1,2 Te sla ) zur Unte rsuchung de s H ox C O -Zusta nde s de s m it 57Fe a nge re iche rte n Enzym s. Die Kopplungsm uste r, ge k e nnze ichne t m it A1 bis A6, ide ntifizie re n a lle 6 Eise nk e rne im H‑C luste r. Die se Spe k tre n de m onstrie re n, wie gut die P uls-EP R -Te chnik e n HYSC O R E und ENDO R se lbst a n Me ta llk e rne n e inge se tzt we rde n k önne n. © Ma x -P la nck -Institut für Bioa norga nische C he m ie Unabhängige FTIR-Studien zeigten, dass sich der Redox-Zustand des proximalen Eisens beim Übergang von © 2006 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 7/8 Jahrbuch 2005/2006 | van Gastel, Maurice; Reijerse, Eduard J.; Lubitz, W olfgang | Erzeugung und Umsetzung von molekularem W asserstoff durch Hydrogenasen Unabhängige FTIR-Studien zeigten, dass sich der Redox-Zustand des proximalen Eisens beim Übergang von der oxidierten zur reduzierten Form nicht ändert. Gleichzeitig konnte gezeigt w erden, dass der Paramagnetismus des H-Clusters sogar auf das (formal diamagnetische) Cuban übertragen w ird, w as nur erklärt w erden kann, w enn man annimmt, dass das proximale Eisen formal paramagnetisch ist. Die Kombination dieser Daten ermöglicht es, das „Redox-Dilemma“ ([I,II] oder [II,III] im oxidierten Zustand) zu entscheiden: die spektroskopischen Daten können nur dadurch erklärt w erden, dass das proximale Eisen im oxidierten und im reduzierten Zustand im Zustand Fe(I) verharrt, w ährend das distale Eisen zw ischen Fe(I) und Fe(II) w echselt. Als nächster Schritt soll die Photodissoziation der externen, das Enzym inhibierenden CO-Gruppe w ie auch der verbrückenden CO-Gruppe (siehe Abb. 4) untersucht w erden, da angenommen w ird, dass Ligandenaustausch eine w ichtige Rolle im katalytischen Mechanismus spielt. Die oben genannten spektroskopischen Untersuchungen haben einen w ichtigen Beitrag zum Verständnis des W irkmechanismus der [NiFe]-und [FeFe]-Hydrogenasen geliefert. Obw ohl noch nicht alle Details des Mechanismus erfasst w erden konnten, können die fehlenden Schritte anhand der hier dargestellten Ergebnisse bereits recht zuverlässig vorausgesagt w erden. Diese Schritte w erden voraussichtlich in der nächsten Zeit spektroskopisch in unserer Gruppe verifiziert w erden. In Kooperation mit Frank Neese w erden ferner w eitere DFT-Rechnungen zur elektronischen Struktur und zum Mechanismus durchgeführt, um Unterschiede und Gemeinsamkeiten der beiden Enzymklassen besser zu verstehen. © 2006 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 8/8
