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108 PLATZ 10: WIRKUNGSMECHANISMUS UND SPEZIFITÄT VON ENZYMEN Reaktionsmechanismus von Chymotrypsin: Chymotrypsin ist eine Protease, die unter der Einwirkung von Trypsin aus der im exokrinen Pankreas synthetisierten Vorstufe Chymotrypsinogen entsteht. Chymotrypsin hat eine Molekularmasse um 25'000; die Sequenz der 241 Aminosäuren und die räumliche Struktur des Enzyms sind bekannt. Der molekulare Wirkungsmechanismus von Chymotrypsin ist im Detail untersucht worden. Chymotrypsin gehört mit Trypsin, Elastase, Thrombin etc. zu den sogenannten Serinproteasen. Diese sind gekennzeichnet durch einen reaktiven Serinrest an der aktiven Stelle, dessen Hydroxygruppe während des katalytischen Vorgangs vorübergehend eine Esterbindung (= Acylenzymbindung) mit der bei der Hydrolyse des Substrats freiwerdenden Carboxylgruppe eingeht. In der Aminosäurensequenz von Chymotrypsin ist dieser Serinrest in Position 195. Ein hypothetisches Schema der Hydrolyse eines Peptidsubstrats ist auf der nächsten Seite wiedergegeben. Der im katalytischen Vorgang sich abspielende Zyklus von Acylierung und Deacylierung der Serinhydroxygruppe lässt sich durch Verschiebung von Ladungen zwischen Ser-195 und den räumlich benachbarten His-57 und Asp-102 erklären. In Exp. 10.1 und 10.2 wird gezeigt, dass Chymotrypsin mit dem Substratmolekül eine kovalente Bindung eingeht. Messung der Radioaktivität: Die experimentell in "counts per minute" (cpm) gemessene Radioaktivität ist immer kleiner als die effektive Zahl der Zerfallsakte "disintegrations per minute" (dpm) des in der Probe enthaltenen Radioisotops. Um aus den cpm-Werten die dpm-Werte zu erhalten, muss die Zählausbeute unter den herrschenden Versuchsbedingungen gemessen werden (Exp. 10.4). Die dpm-Werte werden benötigt, um mit Hilfe der spezifischen Radioaktivität (dpm/Mol, bzw. Becquerel/Mol) die Konzentration einer radioaktiven Substanz zu berechnen. Eine solche Berechnung wird in Exp. 10.3 ausgeführt. Substratspezifität von Enzymen: Enzyme sind mehr oder weniger substratspezifisch. Extrem hohe Spezifität zeigen die an Transkription und Translation von DNA und mRNA beteiligten Enzyme. Proteasen weisen sehr unterschiedliche Substratspezifität auf. Hochspezifisch sind die Proteasen der Blutgerinnung (Thrombin u.a.). Chymotrypsin spaltet vorwiegend nach Trp, Tyr und Phe, Trypsin nach Lys und Arg. Wenig spezifisch spalten dagegen Pepsin und die meisten Exopeptidasen. Die Spezifität von Chymotrypsin und Trypsin wird in Exp. 10.5 nachgewiesen. Beide Enzyme hydrolysieren ausser Peptidbindungen auch Esterbindungen zwischen Aminosäuren und Alkoholen, wobei die für Peptide gültige Substratspezifität gewahrt bleibt. Als Substrate werden deshalb in Exp. 10.5 synthetische Ester benutzt, deren Spaltung eine freie Carbonsäure liefert (vgl. Exp. 3.2). Dank der Substratspezifität von Enzymreaktionen gelingt es häufig, eine ganz bestimmte Verbindung in Gegenwart ähnlicher Verbindungen selektiv nachzuweisen. Als Beispiel wird in Exp. 5.6 die klinisch-chemisch wichtige Analyse von Glucose im Blutserum ausgeführt, ohne dass dazu die Glucose aus dem Serum isoliert und gereinigt zu werden braucht. 109 Hypothetischer Mechanismus der Hydrolyse von Peptidbindungen durch Chymotrypsin ))) kovalente Bindung ......... nicht-kovalente Bindung Anlagerung des Peptidsubstrats (Adsorptionskomplex) Enzymacylierung: Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Acylrest des Peptidsubstrats und der OH-Gruppe von Ser-195 Dissoziation des abgespaltenen Aminrestes (Produkt I) Anlagerung von Wasser und hydrolytische Spaltung des Acylenzyms Dissoziation des abgespaltenen Carbonsäurerestes (= Produkt II); Herstellung des Status quo der aktiven Stelle 110 Theoretische Grundlagen: Radioaktive Isotope (S. 51-56) Gelchromatographie (S. 30) Bezug zu anderen Plätzen: Aktivität und Substratspezifität der Alkoholdehydrogenase, Exp. 1.7 Gelchromatographie, Exp. 5.2. Affinitätschromatographie von Trypsin Exp. 5.5 EXPERIMENT 10.1: Acylierung von Chymotrypsin mit p-Nitrophenyl-[3H]acetat Prinzip: In diesem Versuch wird die Bildung des Acylzwischenproduktes bei der Reaktion von Chymotrypsin mit dem synthetischen Estersubstrat p-Nitrophenyl-[3H]acetat nachgewiesen. Dies ist möglich, weil bei pH 5 diese Zwischenstufe (Stufe 2 im Schema) gebildet, aber nicht wieder gespalten wird. Der volle katalytische Zyklus findet nicht statt. Der Übergang von Stufe 3 zu Stufe 5 des Schemas erfolgt nur bei neutralem oder schwach alkalischem pH. Bei saurem pH bleibt His-57 protoniert, und H2O kann nicht angreifen (Stufe 4). Es kommt somit nur zum Umsatz einer mit dem Enzym äquimolaren Menge von Ester, d.h. pro Mol Acylenzym wird 1 Mol p-Nitrophenol (= Produkt I) freigesetzt (Stufe 3 im Schema). Zum Nachweis der Bindung von [3H]Acetat an das Enzym wird die bei pH 5 inkubierte Mischung durch Gelfiltration auf Sephadex G-25 nach der molekularen Grösse der Komponenten aufgetrennt. An den aufgefangenen Fraktionen werden Nachweisreaktionen für Protein und p-Nitrophenol sowie Radioaktivitätsmessungen ausgeführt. Bei der Ausführung des Versuches müssen die für Arbeiten mit radioaktiven Materialien gültigen Richtlinien befolgt werden (S.53). Lösungen: S Chymotrypsin (12.5 mg/ml) in Natriumacetat (0.01 M), pH 5.0 S p-Nitrophenyl-[3H]acetat (19 mM) in Aceton, spezifische Aktivität 4.8 x 109 Bq/Mol S Elutionspuffer, Natriumacetat (0.01 M), pH 3.5; Tris-HCl (1 M), pH 9 S Trichloressigsäure, 50 %; NaOH (l N); Szintillationslösung (feuergefährlich). Säule: 30 x 0.9 cm, gefüllt mit Sephadex G-25, in Elutionspuffer. 111 Ausführung (nur unter Anleitung der Assistierenden): 5. Inkubation: Zu 0.1 ml p-Nitrophenyl-[3H]acetat in Plastikröhrchen 1.0 ml Chymotrypsinlösung zugeben, mischen und 10 min bei Zimmertemperatur stehenlassen. 2. Gelfiltration: Elutionspuffer an bereitstehender Säule bis zum Gel-Niveau mit Pasteurpipette sorgfältig entfernen und Probe auf das Gel auftragen. Pumpe starten und Probe einsickern lassen. Sobald die Probe vollständig eingesickert ist, zweimal mit etwas Elutionspuffer nachwaschen (Aufschlämmen der Sephadexschicht vermeiden), dann Säule mit Elutionspuffer auffüllen und Vorratgefäss anschliessen. Fraktionensammler in Gang setzen. Total 30 Fraktionen von etwa 2 ml in nummerierte RG sammeln. Die zwei Fraktionen mit acyliertem Chymotrypsin, welche die meiste Radioaktivität enthalten, werden auch in Exp. 10.2 verwendet. 3. Bestimmung der Radioaktivität: In der Kapelle von jeder Fraktion 0.1 ml in ein Zählfläschchen geben (numeriert 1-30), mit 3 ml Szintillationslösung versetzen, schliessen und mischen. Jede Probe während 1 min im Szintillationszähler zählen. Probe aus Röhrchen Nr. 1 als Blindwert verwenden. Werte in graphische Darstellung eintragen. Blindwert abziehen. Radioaktivität pro ml (cpm/ml) berechnen. 4. Identifizierung der p-Nitrophenol und Protein enthaltenden Fraktionen: Zu 30 beschrifteten RG mit Pasteurpipette ungefähr 0.5 ml NaOH vorlegen und von den Fraktionen 1 bis 30 je 0.3 ml mit jeweils derselben 0.5 ml-Glaspipette zugeben und mischen. Den Rest der Fraktionen 1 bis 9 beiseite stellen (wird in Exp. 10.2 benötigt). Gelbfärbung zeigt p-Nitrophenolationen an. Relative Farbintensität abschätzen und Werte (0 bis ++++) ebenfalls in graphische Darstellung eintragen. Anschliessend zu jedem RG mit Pasteurpipette ca. 0.5 ml Trichloressigsäure (50 %) zugeben. Ausmass der Fällung von Chymotrypsin abschätzen und Werte (0 bis ++++) für jedes Röhrchen vermerken. 5. Graphische Darstellung des Elutionsprofils: Radioaktivität (cpm/ml) sowie Nitrophenolat- und Proteinkonzentration gegen RG-Nummer auf Millimeterpapier auftragen. Abszisse: RG-Nummer; linke Ordinate: Radioaktivität; rechte Ordinate: relative Intensität von Proteinfällung und p-Nitrophenolatfärbung. EXPERIMENT 10.2 Deacylierung des markierten Chymotrypsins Es wird nachgewiesen, dass der vollständige katalytische Zyklus, d.h. die hydrolytische Spaltung des Acylenzyms, nur bei leicht alkalischem pH-Wert stattfindet (siehe unter Prinzip und hypothetischer Mechanismus). Ausserdem wird gezeigt, dass die native Struktur des Chymotrypsins dazu notwendig 112 ist. Die Hydrolyse ist nicht durch blosses Anheben des pH-Wertes bedingt. Die zwei Acylchymotrypsin enthaltenden Fraktionen mit der höchsten Radioaktivität (meistens sind dies Nr. 5 und 6) vereinen. Pasteurpipette verwenden, gut mischen. Davon je 0.8 ml in drei Glasröhrchen A,B,C pipettieren. Mit Glaspipetten zu allen Röhrchen 1 ml Wasser zugeben. Zu Röhrchen B zwei Tropfen DTT mit Pasteurpipette geben (DTT = Dithiothreitol; reduziert Disulfidbrücken im neutralen pH-Bereich). Röhrchen B mit Glaskugel bedecken und für 5 Minuten ins 95EC-Wasserbad stellen. Anschliessend 0.25 ml Trispuffer (pH 9) zugeben, Trübung beobachten. Zu den Röhrchen A und C gemäss umstehender Tabelle Wasser bzw. Trispuffer zugeben. Alle Proben 2-3 Minuten stehen lassen und durch Zugabe von 0.15 ml 50 %iger Trichloressigsäure das Chymotrypsin ausfällen. Für 10 Minuten in Eis stellen. Anschliessend Röhrchen A-C für 5 Minuten bei max. Geschwindigkeit in Tischzentrifuge zentrifugieren. Achtung: ein viertes Röhrchen mit 2.2 ml Wasser als Gegengewicht verwenden oder die 3 Röhrchen in der Zentrifuge symmetrisch verteilen! Die Überstände mit Pasteurpipetten vorsichtig in Zählfläschchen pipettieren, 6 ml Szintillationslösung zugeben. Fläschchen dicht verschliessen, gut mischen und während 1 Minute im Szintillationszähler zählen. Resultate in Tabelle eintragen. A pH 3.5 B Denat. pH 9 C pH 9 0.25 ml - - Tris-HCl Puffer 1 M, pH 9 - 0.25 ml 0.25 ml Trichloressigsäure 50 % 0.15 ml 0.15 ml 0.15 ml ......... cpm ......... cpm ......... cpm Wasser Überstand EXPERIMENT 10.3: Acylierung von Chymotrypsin, Auswertung von Versuchsergebnissen In einem analog zu Exp. 10.1 durchgeführten Versuch wurde Chymotrypsin mit p-Nitrophenylacetat acyliert und das entstandene Acylenzym vom restlichen radioaktiven p-Nitrophenylacetat und vom freigesetzten p-Nitrophenol durch Gelfiltration abgetrennt. In den aufgefangenen 2 ml-Fraktionen wurde der Gehalt an Radioaktivität (cpm/ml) und als Mass der Proteinkonzentration die Extinktion bei 280 nm (E280 nm, Schichtdicke 1 cm) gemessen. 113 Nach Zugabe von 0.5 ml 1 M NaOH zu jeder Fraktion wurde ferner die Extinktion bei 405 nm (E405 nm, 1 cm) bestimmt. Sie ist ein Mass sowohl für das bei der Acylierungsreaktion freigesetzte pNitrophenol wie auch für das nicht umgesetzte p-Nitrophenylacetat, da das letztere in Gegenwart der starken Base sofort hydrolytisch gespalten wird. Im basischen Milieu liegt das gelbe p-NitrophenolatAnion vor, das bei 405 nm ein Extinktinsmaximum (ε405 nm = 18'400 M-1 cm-1) aufweist. Tabelle I: Messergebnisse RG cpm/ml E280 nm E405 nm* RG cpm/ml E280 nm E405 nm* 1 166 - - 13 158 - - 2 152 - - 14 150 ** - 3 162 - - 15 285 0.02 4 138 - - 16 570 0.14 5 150 - - 17 2750 0.84 6 1850 0.9 - 18 6350 2.04 7 11650 6.24 - 19 2830 0.88 8 9450 5.32 - 20 705 0.18 9 750 0.32 - 21 173 0.05 10 269 - - 22 153 - 11 147 - - 23 145 - 12 150 - - * Bestimmung nach Zugabe von 0.5 ml 1 M NaOH ** E280,1cm wurde in Röhrchen 14 bis 26 nicht gemessen 1. Graphische Darstellung des Elutionsprofils: Den Gehalt an Radioaktivität (cpm/ml) sowie E280nm und E405nm gegen RG-Nummer auf Millimeterpapier auftragen. Abszisse: RG-Nummer; linke Ordinate: Radioaktivitätsgehalt; rechte Ordinate: (a) Proteinextinktion, E280 nm, (b) p-Nitrophenolatextinktion, E405 nm. 2. Molare Konzentration von Acylchymotrypsin: Chymotrypsin hat einen molaren Extinktionskoeffizienten bei 280 nm von 5 x 104 M-1 cm-1. Berechnen Sie die molare Enzymkonzentration in RG Nr. 6, 7 und 8 und tragen Sie das Ergebnis in Tabelle II ein. 3. Spezifische Radioaktivität des markierten Chymotrypsins: Tragen Sie den für "background" (cpm aus RG 1) korrigierten Radioaktivitätsgehalt von RG Nr. 6, 7 und 8 ebenfalls in Tabelle II ein und berechnen Sie die spezifische Radioaktivität des markierten Enzyms in cpm/mmol. 114 4. Berechnung des Verhältnisses von kovalent gebundenem Acetat zu Enzym: Das verwendete p-Nitrophenylacetat hatte eine spezifische Radioaktivität von 2 x 106 Bq/mmol. Berechnen Sie daraus und aus den gemessenen Werten für spezifische Radioaktivität des markierten Acylchymotrypsins das Verhältnis von Acetat zu Enzym und tragen Sie die Ergebnisse ebenfalls in Tabelle II ein. Hinweis: Die spezifische Radioaktivität von p-Nitrophenylacetat muss von Bq/mmol in cpm/mmol umgerechnet werden, denn aus dem Experiment erhält man die spezifische Radioaktivität für acyliertes Chymotrypsin in cpm/mmol. Die Zählausbeute betrug 75%, 1 Bq = 1 Zerfall pro Sekunde. Tabelle II RG Radioaktivitätsgehalt Chymotrypsinkonzentration Gebundenes Acetat pro Chymotrypsin M (= mmol/ml) Spezifische Radioaktivität des Acylchymotrypsins cpm/mol cpm/ml 6 .......... ........... .......... .......... 7 .......... ........... .......... .......... 8 .......... .......... .......... .......... mol/mol S Wieviele aktive Stellen besitzt Chymotrypsin? S Wie könnte gezeigt werden, dass die Acetylgruppe kovalent an Ser-195 gebunden ist? 115 EXPERIMENT 10.4: Zählausbeute für 14C im Flüssigkeits-Szintillationszähler Proben: 367 Bq 14C-markierte Essigsäure; 73 Bq 14C-markierte Essigsäure; 367 Bq 14C-markierte Essigsäure mit Aceton; Blindprobe. Alle Proben sind in 10 ml Szintillationsflüssigkeit gelöst. Probe 4 dient zur Messung des "backgrounds". Proben nach folgendem Schema zählen und Zählausbeute berechnen. Probe Bq dpm Zähldauer (min) counts cpm cpm-background Zählausbeute % 1 367 ... 1 .... .... .... ..... 2 73 ... 5 .... .... .... ..... 3 367 ... 5 .... .... .... ..... 4 - ... 10 .... .... .... ..... S Weshalb zeigt Probe 3 eine geringere Zählausbeute? EXPERIMENT 10.5: Substratspezifität von Trypsin und Chymotrypsin Prinzip: Die spezifische Hydrolyse von N-Benzoyl-L-argininethylester und N-Benzoyl-L-tyrosinethylester durch die beiden Proteasen wird verfolgt, indem man die entstehenden Carbonsäuren N-BenzoylL-arginin und N-Benzoyl-L-tyrosin mit Hilfe eines pH-Indikators nachweist. Lösungen: S S S S S S Tris-HCl 4 mM, pH 9.0 N-Benzoyl-L-argininethylester, 8 mM in 50 % Methanol N-Benzoyl-L-tyrosinethylester, 8 mM in 50 % Methanol Phenolrot (sauer: gelb; alkalisch: rot; pKa = 7.7) Protease-Lösung I (20 µg/ml) Protease-Lösung II (20 µg/ml) 116 Ausführung: 4 RG vorbereiten und mit folgenden Volumina (ml) beschicken: Lösung A B C D Tris-HCl 2 2 2 2 Argininester 2 - 2 - Tyrosinester - 2 - 2 Phenolrot Je 2 Tropfen zugeben und mischen Protease I 1 1 - - Protease II - - 1 1 Mischen, ins 40E-Wasserbad stellen und Farbänderung beobachten. (Proben müssen am Anfang rötlich gefärbt sein, andernfalls muss der Versuch mit frisch hergestelltem Tris-HCl wiederholt werden.) Farbe nach Ablauf von 5 min feststellen und Ergebnisse in Tabelle eintrag Protease I Protease II Argininester (A) ............ (C) .............. Tyrosinester (B) ............ (D) .............. Protease I = ............... Protease II = .................
