Onkolytische Aktivität des Designer Host Defense Peptids
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Aus der Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte des Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikums Bergmannsheil der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. M. Lehnhardt Onkolytische Aktivität des Designer Host Defense Peptids [D]-K4H2L9 bei Weichteilsarkomen im immunkompetenten syngenen Mausmodell Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Corinn Isabel Mata Mera aus Bonn in 2012 Dekan: Prof. Dr. med. Klaus Überla Referent: Prof. Dr. med. Lars Steinsträßer Korreferent: PD Dr. rer. nat. Carsten Theiß Tag der Mündlichen Prüfung: 5. November 2013 Abstract Mata Mera Corinn Isabel Onkolytische Aktivität des Designer Host Defense Peptids [D]-K4H2L9 bei Weichteilsarkomen im immunkompetenten syngenen Mausmodell Problem: Weichteilsarkome, die 1 % der Neoplasien darstellen, haben häufig eine schlechte Prognose aufgrund einer oftmals späten Diagnose und einer hohen Rate an Resistenzen gegen Zytostatika und Strahlentherapie, sowie Rezidiven. Seit der Entdeckung der antibakteriellen und teilweise onkolytisch wirksamen Host Defense Peptide, entwickeln die Forscher synthetische Peptide, die möglichst spezifisch Krebszellen bekämpfen. Das synthetisch hergestellte Designer-Peptid [D]-K4H2L9 zeigte im Einsatz gegen Weichteilsarkomzellen vielversprechende Ergebnisse unter anderem im athymischen Xenograft-Modell. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Wirksamkeit dieses Host Defense Peptids im immunkompetenten Organismus überprüft, um Einzelheiten über seine Wirkungsweisen herauszufinden. Methode: Zunächst wurde die Einschränkung der Proliferationsaktivität von Fibrosarkomzellen, Synovialsarkomzellen und von nicht-tumorösen Fibroblasten durch [D]K4H2L9 sowie durch das Vergleichspeptid scP-K3H3L9 mittels BrdU-Assays untersucht. Auch der Effekt einer Kombinationstherapie mit dem Zytostatikum Doxorubicin wurde in vitro geprüft. Im syngenen immunkompetenten Mausmodell wurde dann die Wirksamkeit von [D]K4H2L9 in vivo beobachtet. Proben der Tumore aus diesem Versuch wurden anschließend mittels Immunhistochemie und RT-PCR analysiert, um einzelne Auswirkungen der PeptidTherapie identifizieren zu können. Ergebnis: Das Peptid [D]-K4H2L9 erreichte in vitro eine Hemmung der Zellproliferationsrate bis 98 % gegen maligne und nicht-maligne Zellen. Das Vergleichspeptid scP-K3H3L9 hemmte die Zellproliferation nicht. In Kombination mit dem Zytostatikum Doxorubicin zeigte [D]K4H2L9 einen Synergie-Effekt bei Anwendung auf die Sarkomzellen. Die in vivo-Applikation erzielte eine partielle Ansprechrate von 40 % mit Komplettremissionen in weiteren 20 %. In den peptidbehandelten Tumoren zeigten sich eine Hemmung der Angiogenese sowie eine Rekrutierung von T-Zellen und Makrophagen. MIG konnte als ein vermittelndes Zytokin identifiziert werden. Diskussion: [D]-K4H2L9 zeigte im Rahmen dieser Dissertation weitere vorteilhafte Wirkungen eines onkolytischen Therapeutikums. So erwies es sich bei den in vitro-Versuchen abermals als spezifisch gegen maligne Zellen, wobei das für den Subtyp spezifische therapeutische Fenster bei der Dosierung beachtet werden muss. Die Hemmung der Angiogenese korrelierte mit dem Therapieerfolg. Nach einem ersten Nachweis einer Rekrutierung von Immunzellen und einer signifikanten Erhöhung der MIG-Expression im Tumorgewebe nach [D]-K4H2L9-Einfluss gilt es die chemotaktische Wirkung noch genauer zu analysieren und weitere vermittelnde Zytokine zu identifizieren. Des Weiteren ist die in vivo-Untersuchung der Kombinationstherapie mit dem Zytostatikum Doxorubicin, sowohl lokal als dann gegebenenfalls auch systemisch, von großem Interesse. Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG 7 1.1 Weichteilsarkome 1.1.1 Definition 7 7 1.1.2 Epidemiologie und Klassifikation 7 1.1.3 Ätiologie 9 1.1.4 Pathologie 10 1.1.5 Symptome 11 1.1.6 Diagnostik 11 1.1.7 Therapie 14 1.1.8 Prognose 15 1.2 Host Defense Peptide 1.2.1 Natürliche Host Defense Peptide des Immunsystems 16 16 1.2.2 Synthetische Host Defense Peptide in der Tumortherapie 18 1.2.3 Gezielt-konfigurierte Peptide im Einsatz gegen Neoplasien 19 2 ZIELSETZUNG 22 3 MATERIAL UND METHODEN 23 3.1 Material 3.1.1 Chemikalien und Reagenzien 23 23 3.1.2 Antikörper und Seren 24 3.1.3 Primer und Sonden 25 3.1.4 Fertige Versuchsansätze 26 3.1.5 Puffer, Lösungen 26 3.1.6 Geräte 27 3.1.7 Das synthetische Host Defense-Peptid 29 3.1.8 Das Scrambled-Peptid scP-K3H3L9 29 3.1.9 Primärzellen und Zelllinien 29 3.1.10 Tiere 30 3.2 Methoden 3.2.1 Lösen der Peptide 3.2.1.1 Lösen des Peptids [D]-K4H2L9 30 30 30 1 3.2.1.2 Lösen des Scrambled-Peptids scP-K3H3L9 31 3.2.2 Generierung und Kultivierung der Zellen 31 3.2.2.1 Gewinnung der humanen Fibroblasten 31 3.2.2.2 Zellkulturbedingungen 31 3.2.3 In vitro-Versuch: BrdU-Zellproliferationsassay 32 3.2.4 In vivo-Versuch 33 3.2.4.1 Genehmigung 33 3.2.4.2 Projektübersicht 33 3.2.4.3 Injektion der Tumorzellen 34 3.2.4.4 Therapeutische Injektionen 35 3.2.4.5 Euthanasie 35 3.2.4 Immunhistochemie 36 3.2.4.1 Allgemeines Protokoll 36 3.2.4.2 Ki67-Proliferationsaktivitätfärbung 38 3.2.4.3 CD31-Blutgefäßfärbung 38 3.2.4.4 CD3-T-Zellfärbung 38 3.2.4.5 F4/80-Makrophagenfärbung 38 3.2.4.6 Auswertung der immunhistochemischen Färbungen 39 3.2.5 Genexpressionsanalyse 39 3.2.5.1 RNA-Isolation 39 3.2.5.2 cDNA-Synthese 41 3.2.5.3 Real-time-PCR 41 3.2.5.4 Gel-Elektrophorese 42 4 ERGEBNISSE 44 4.1 Wirkung des Peptids [D]-K4H2L9 in in vitro-Studien 4.1.1 Hemmung der Zellproliferation 44 44 4.1.2 Nachweis der spezifischen Wirkung durch [D]-K4H2L9 45 4.1.3 Hemmung der Zellproliferation durch Doxorubicin 46 4.1.4 Kombination von [D]-K4H2L9 mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin 47 4.2 Wirksamkeit des Peptids [D]-K4H2L9 im syngenen Tiermodell 48 4.3 Histologische Beobachtungen in den Tumoren nach [D]-K4H2L9-Therapie 4.3.1 Hemmung der Proliferation in vivo 54 54 4.3.2 Hemmung der Angiogenese 55 4.3.3 Rekrutierung von T-Zellen 56 4.3.4 Rekrutierung von Makrophagen 56 2 4.4 Genexpressionsanalyse nach dem Einfluss von [D]-K4H2L9 57 5 DISKUSSION 61 6 ZUSAMMENFASSUNG 71 7 LITERATUR 72 DANKSAGUNG CURRICULUM VITAE 3 Abkürzungen Abb. Abbildung AMP antimikrobielles Peptid BrdU 5-Brom-2-Desoxy-Uracil BFS-1 wt murines Fibrosarkom cDNA komplementäre DNA (engl.: complementary DNA) CT Computertomographie DAB 3,3’-Diaminobenzidin DAPI 4’,6-Diamidin-2-phenylindol DMEM engl.: Dulbecco’s Modified Eagle Medium DNA Desoxyribonukleinsäure EDTA Ethyldiamintetraessigsäure FCS fötales Kälberserum (engl.: Fetal Calf Serum) H Histidin hBD humanes β-Defensin HDP Host Defense Peptid HE Hämatoxylin-Eosin(-Färbung) HFB primäre humane Fibroblasten HNP Humane Neutrophile Peptide HT1080 humane Fibrosarkomzelllinie IGFbp Insulin-ähnlicher-Wachstumsfaktor bindendes Protein (engl.: insulin-like growth factor binding protein) IL Interleukin IFN-γ Interferon-gamma IP Interferon-gamma induziertes Protein (engl.: interferon-gamma inducible protein) 5-JÜR fünf-Jahre-Überlebensrate K Lysin L Leucin LD50 mittlere letale Dosis LDH Laktatdehydrogenase MCP Monozyten chemotaktisches Protein (engl.: monocyte chemotactic protein) 4 MDR Multiple Resistenzen (engl.: multidrug-resistence) MFH Malignes Fibröses Histiozytom MIG Monokin induziert durch Interferon-gamma (engl.: monokine induced by gamma) MRT Magnetresonanztomographie MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid NaOH Natriumhydroxid (Natronlauge) NOV Nephroblastom überexprimiertes Gen (engl.: nephroblastoma overexpressed gene) PBS phosphatgepufferte Salzlösung (engl.: phosphate buffered saline) PCR Polymerase-Kettenreaktion (engl:. polymerase chain reaction) PECAM engl.: Platelet endothelial cell adhesion molecule Pen Penicillin R rückwärts R0-Resektion Tumorexzision ohne mikroskopische Tumorrückstände RNA Ribonukleinsäure rpm Umdrehungen pro Minute (engl.: rounds per minute) RPMI engl.: Roswell Park Memorial Institute RT-PCR Echtzeit-PCR (engl.: Realtime-PCR) scP Kontrollpeptid (engl.: scrambled peptide) Strep Streptomycin SW872 humane Liposarkomzelllinie SW982 humane Synovialsarkomzelllinie Tab. Tabelle TAM Tumor-assoziierte-Makrophagen V vorwärts VEGF Vakulärer-endothelialer Wachstumsfaktor (engl.: vascular endothelial growth factor) wt Wildtyp 5 Tabellenverzeichnis 1.1 1.2 1.3 1.4 Einteilung der Sarkome TNM-Klassifikation maligner Tumore nach UICC Stadiengruppierung der Weichteilsarkome Die Aminosäuresequenzen einiger 15-mer kationischen Peptide 8 13 13 20 3.1 Übersicht über Primer und Sonden für die RT-PCR 25 Abbildungsverzeichnis 1.1 1.2 3.1 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12 4.13 4.14 4.15 Diagnostizierte Weichteilsarkom-Subtypen im Referenzzentrum für Gliedmaßentumore Einschränkung der Zellvitalität verschiedener Sarkomzelllinien und Referenzzellen durch das Host Defense Peptid [D]-K4H2L9 21 Arbeitsphasen bei der Untersuchung der Wirkung des Host Defense Peptids [D]-K4H2L9 30 Bestimmung der antiproliferativen Aktivität des Peptids [D]-K4H2L9 Bestimmung der antiproliferativen Aktivität des Peptids scP-K3H3L9 Bestimmung der antiproliferativen Aktivität des Zytostatikums Doxorubicin Bestimmung des antiproliferativen Effekts bei der Kombination von [D]-K4H2L9 und Doxorubicin Hemmung des Tumorwachstums in vivo durch die Therapie mit [D]-K4H2L9 Tumorgewicht eine Woche nach Therapieende Bilder der Veränderung der Tumorgröße Serielle Lungenschnitte Wachstumskurven der einzelnen Tumore der Therapie- und der Kontrollgruppe Immunhistochemische Anfärbung proliferierender Zellen im Tumorgewebe Immunhistochemische Anfärbung der Gefäßanschnitte im Tumorgewebe Immunhistochemischer Nachweis von T-Zellen im Tumorgewebe Immunhistochemischer Nachweis von Makrophagen im Tumorgewebe Gelelektrophorese der PCR-Ansätze Genexpression einiger Zytokine eine Woche nach Therapieende 9 44 46 47 48 49 50 51 52 52 54 55 56 57 58 59 6 1 Einleitung 1.1 Weichteilsarkome 1.1.1 Definition Der Begriff Sarkom wurde ursprünglich für „fleischige“ und große Tumoren verwendet entsprechend der griechischen Termini „sarkos“ für Fleisch und „oma“ für Geschwulst (Stock, 1979). Der heutige Begriff des Sarkoms ist histologisch definiert und bezeichnet Tumore mesenchymalen Ursprungs. Weichteilsarkome umfassen Neoplasien die von extraskelettalen mesenchymalen Geweben ausgehen, wozu unter anderem Fett-, Muskel- oder Bindegewebe, aber auch Strukturen des Gefäß- oder Lymphsystems gehören. 1.1.2 Epidemiologie und Klassifikation Weichteilsarkome sind seltene Tumore und machen weniger als 1 % aller Neoplasien der Erwachsenen und 15 % der Neoplasien im Kindesalter aus. Das Durchschnittsalter der Diagnose liegt bei 57 Jahren (Vincenzi et al., 2010). Bei diesen Neoplasien handelt es sich, unter anderem auf Grund der vielen verschiedenen Ursprungsgewebe, um eine sehr heterogene Gruppe von Tumoren, welche mehr als 50 Subtypen umfasst (Vincenzi et al., 2010) (Tab. 1.1). Im Register für Gliedmaßentumore am Institut für Pathologie des Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikums Bergmannsheil, Ruhr-Universität Bochum, waren das Liposarkom mit 22,9 %, das Maligne Fibröse Histiozytom (MFH) mit 17,5 % und das Leiomyosarkom mit 10,1 % die häufigsten Weichteilsarkome. Die Fibromatose und das Myxofibrosarkom stellten jeweils 6,5 % und das Synovialsarkom 6,4 % der Diagnosen dar (n=2056; 1990-2009) (Abb. 1.1). Diese Verteilung entspricht der allgemeinen Literatur. 7 Tab. 1.1 Einteilung der Sarkome (Enzinger, 1995). Bezugsgewebe Diagnose bindegewebige Fibrosarkom Tumoren Subtypen firbrohistiozytäre Tumoren lipomatöse Tumoren pleomorph myxoid riesenzellig lipomartig sklerosieren inflammatorisch klassisch myxoid inflamma- glattmuskuläre malignes fibröses Histiozytom hochdifferenziertes Liposarkom (LS) myxoides LS rundzelliges LS pleomorphes LS mischzelliges LS Leiomyosarkom Tumoren xanthomatös granularzellig Mit torisch epitheloides Leiomyosarkom skelettmuskuläre Rhabdomyosarkom embryonal botryoid spindelzellig Riesenzellen alveolär pleomorph Tumoren vaskuläre Tumoren perivaskuläre Tumoren synoviale Tumoren mesotheliale Tumoren neurale Tumoren paraganglionäre Tumoren chondromatöse/ ossäre Tumoren mesenchymal variante Diff. verschiedenartige Tumoren Ektomesenchymom Angiosarkom klassisch Lymphangiosarkom Kaposi-Sarkom malignes Hämangioperizytom maligner Glomustumor maligner tendosynovialer Riesenzelltumor malignes Mesotheliom (lokal) epithelial diffuses Mesothelium maligner peripherer klassisch Nervenscheidentumor maligner Granularzelltumor Klarzellsarkom malignes melanozytäres Schwannom Neuroblastom Ganglioneuroblastom peripherer neuroektodermaler Tumor malignes Paragangliom extraskelletales hochdiff. Chondrosarkom extraskelletales Osteosarkom malignes Mesenchymom alveoläres Weichteilsarkom epitheloides Sarkom extraskelletales Ewingsarkom Synovialsarkom biphasisch maligner extrarenaler Rhabdoidtumor desmoplastischer kleinzelliger Tumor epitheloid spindelzellig biphasisch Tritontumor mit drüsiger Differenzierung myxoid mesenchymal dedifferenziert monophasisch unklassifizierbare Tumoren 8 Liposarkom 22,9% Malignes fibröses Histiozytom 17,5% Leiomyosarkom 10,1% Fibromatose 6,5% Myxofibrosarkom 6,5% Synovialsarkom 6,4% Maligner peripherer Nervenscheidentumor 5,6% Spindelzellsarkom 3,6% Rhabdomyosarkom 3% Dermatofibrosarcoma protuberans 2,8% Fibrosarkom 2,6% Myofibroblastisches Sarkom 2,3% Hämangio-Tumoren 2,1% Restliche Diagnosen <2% Abb. 1.1 Diagnostizierte Weichteilsarkom-Subtypen im Referenzzentrum für Gliedmaßentumore. Das Diagramm zeigt die Weichteilsarkom-Subtypen, die in den Jahren von 1990 bis 2009 am häufigsten im Register für Gliedmaßentumore am Institut für Pathologie des Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikums Bergmannsheil eingetragen wurden sind. Die Diagnosen, die in über 2 % der 2056 registrierten Fälle gestellt wurden, werden hier einzeln und namentlich aufgeführt. 1.1.3 Ätiologie Die meisten Fälle von Weichteiltumoren scheinen bis heute ohne erkennbare Ursache zu entstehen. Nur in wenigen Fällen sind genetische Charakteristika, Umweltfaktoren oder Immunschwäche als Ursache zu identifizieren (Fletcher, 2002). So wurden nach externer Bestrahlung im Rahmen einer vorangegangenen Tumortherapie vermehrt Fälle von Weichteilsarkomen, wie dem Malignen Fibrösen Histiozytom (MFH) zu 16 % oder den Lymphangio- und Angiosarkomen zu 15 % beobachtet (Brady et al., 1992). Auch Herbizid-Expositionen begünstigen eine Weichteilsarkomentstehung (Zahm and Fraumeni, 1997). Genetische Charakteristika, die die Entstehung von Weichteilsarkomen begünstigen, können entweder erworbene oder auch vererbte Veränderungen des Erbguts sein. So wurde eine erhöhte Inzidenz festgestellt bei Veränderungen der Gene von Tumorsuppressoren wie p53, welches den Zellzyklus in der G1-Phase arretiert sobald DNA-Schäden entstehen, oder dem Rb-Gen, welches die Synthese der Enzyme für die DNA-Replikation erst induziert, wenn die Zelle in die S-Phase des Zellzyklus übertritt, und somit auch eine unkontrollierte DNA-Synthese verhindert (Bühling, 2000). Ein 9 Defizit dieser Tumorsuppressoren begünstigt eine Vermehrung von genetisch veränderten Zellen. Ein Beispiel hierfür ist das Li-Fraumeni-Syndrom, bei dem die Entstehung von Weichteilsarkomen neben anderen Neoplasien auf die vererbte Mutation, überwiegend im p53-Gen, zurückzuführen ist. Darüber hinaus werden einige Subtypen von Weichteilsarkomen mit bestimmten chromosomalen Translokationen in Verbindung gebracht. So wird die Translokation von Chromosomenabschnitten des X-Chromosomen mit dem Chromosomen 18, bezeichnet als t(X;18), in über 95 % der Synovialsarkome vorgefunden. Zu diagnostischen Zwecken kann das Transkript des am Translokationsort entstandenen Fusionsgen SYT-SSX detektiert werden, das aus den Exons 1-10 des SYT-Gens des Chromosom 18 und aus den Exons 5 und 6 des SSX-Gens des X Chromosoms besteht (Thorson et al., 2006). Das Kaposi-Sarkom tritt bei einer deutlichen Immunschwäche wie in etwa bei AIDSPatienten oder bei immunsupprimierten Patienten nach einer Transplantation und einer hinzukommenden Infektion durch den Humanen Herpesvirus 8 auf (Fulciniti et al., 2012). Eine Besserung des Immunstatus der betroffenen Personen hemmt die Proliferation der entarteten Zellen. 1.1.4 Pathologie Obwohl es sich bei den Weichteiltumoren um eine sehr heterogene Tumorentität handelt, bestehen klinische und histologische Gemeinsamkeiten. So treten 60 % der Sarkome in den Extremitäten auf und nur je weitere 10 % in der Rumpfwand und im Retroperitoneum (Fletcher, 2002). Ihr Malignitätsgrad korreliert meist mit der Tumorwachstumsrate. Weichteilsarkome wachsen zentripetal, dabei bildet sich um sie herum eine reaktive Pseudokapsel. In dieser faserreichen Struktur zwischen gesundem Gewebe und Tumor befinden sich neben absterbenden Zellen und Immunzellen auch vitale Tumorzellen. Daher sollten diese bei therapeutischen Eingriffen nicht eröffnet werden. Umgeben von der Pseudokapsel wachsen die Weichteilsarkome für gewöhnlich nicht infiltrativ. Einzelne Tumorzellen treten auch nur selten in die Lymphwege über (Gilbert et al., 2009; Gitelis et al., 1989). Stattdessen streuen die Primärtumore ihre Tochtergeschwülste, auch Metastasen genannt, fast ausschließlich über die Blutgefäße (Liebig et al., 2009). Histolytische Enzyme wie zum Beispiel Metalloproteinasen ermöglichen durch Abbauprozesse des 10 umgebenden Bindegewebes ein Loslösen von Tumorzellen aus dem Zellverband und ein Einbrechen dieser in die Blutgefäße. In der Blutbahn kann ein FibrinThrombozyten-Belag die Tumorzellen vor onkolytischen Immunzellen schützen. Oberflächenrezeptoren der Tumorzellen bewirken die Adhäsion an Endothelien, meist nachdem eine Tumorzelle als Tumorembolus in der terminalen Endstrombahn der Gefäße stecken geblieben ist. Nach der Zerstörung der Basalmembran der Gefäße gelangen die Tumorzellen dort in das umliegende Parenchym, wo sie unter vorteilhaften Wachstumsbedingungen zu soliden Metastasen proliferieren. Organe wie Knochen, Leber und Lunge tragen Oberflächenrezeptoren auf ihren Parenchym- und Endothelzellen, die eine Metastasierung begünstigen (Bühling, 2000). Die Metastasen der Weichteilsarkome befinden sich hauptsächlich in der Lunge (Vikis et al., 2010). Extrapulmonale Metastasen treten dabei kaum als primäre Tochtergeschwülste, sondern hauptsächlich in einem fortgeschrittenen Tumorstadium oder bei einem Rückfall auf. Dabei erreichen sie lediglich einen Anteil von 4,7 % (Ryzewicz et al., 2008). 1.1.5 Symptome Die klinische Manifestation der Tumore findet sehr spät statt. Die Tumore wachsen zunächst ohne Schmerzen zu verursachen. Meist ist eine Vorwölbung an einer Extremität ein erstes Anzeichen eines Weichteilsarkoms, welches von den Patienten jedoch oft fälschlich als Folge eines Bagatelltraumas eingeordnet wird (Steinau et al., 2001). Wenn der Tumor sehr tief lokalisiert ist, können schließlich Schmerzen auf Grund einer Nervenkompression auftreten. 1.1.6 Diagnostik Liegt die Verdachtsdiagnose Tumor beziehungsweise Sarkom vor, so gilt es, diese Diagnose zu sichern. Entsprechend des Leitsatzes Typing, Grading, Staging findet zunächst die Analyse des Subtypes und des Entartungsgrades statt und dann das Feststellen des Stadiums der Tumorerkrankung. Um den Subtyp und den Entartungsgrad des Tumors zu erfassen, bedarf es einer Probenentnahme. Von den vier möglichen Methoden wird die Aspirationsbiopsie am häufigsten verwandt. Mit bildgebenden Verfahren kann bei dieser Gewebeentnahme durch die Hohlnadel sichergestellt werden, dass die Biopsie dem gewünschten Bereich des veränderten Gewebes entstammt. In 68-93 % der Fälle kann in den Vereinigten Staaten mit diesem Verfahren eine Diagnose gestellt werden (Dupuy et al., 1998; 11 Mitsuyoshi et al., 2006). Ist dies nicht möglich, liegt eine Inzisionsbiopsie nahe, bei der mit einem Skalpell eine größere Gewebeprobe entnommen werden kann. Eine Exzisionsbiopsie wird nur bei kleinen kutanen Tumoren mit einem geringen Malignitätsverdacht eingesetzt. Bei der Feinnadelbiopsie wird nur eine geringe Menge Gewebe entnommen, die durch einen erfahrenen Pathologen beurteilt werden muss. Sie wird vor allem bei der Lymphknotenanalyse und bei der Diagnose von Rezidiven praktiziert. Bei allen Biopsiemethoden gilt es, nach den Prinzipien der Tumoroperationen vorzugehen (Abschnitt 1.1.7), um eine Verschleppung von Tumorzellen in das gesunde umgebende Gewebe zu verhindern. Die räumliche Ausbreitung des Tumors kann durch eine Magnetresonanztomographie (MRT) mit Kontrastmittel dargestellt werden. Eine Abgrenzung zwischen gesundem mesenchymalem und entartetem Gewebe ist meist möglich. Auch benachbarte Gefäße und Nerven sowie gegebenenfalls deren Infiltration, Nekrosen, Ödeme oder Einblutungen werden beurteilbar. Zur Ausbreitungsdiagnostik gehört zudem ein Röntgenbild der Lunge, da dies der häufigste Ort einer Metastasierung bei Weichteilsarkomen ist. Zeigt das Röntgenbild einen positiven oder unklaren Befund erfolgt zur weiteren Diagnostik eine Computertomographie (CT) zur genaueren Darstellung der Lunge. Bei Verdacht auf okkulte Metastasen kann eine Positronen-Emissions-Tomographie eingesetzt werden. Je nach Subtyp ist eine genauere Untersuchung der Lymphknoten, erst durch Palpation und Ultraschall, später auch durch perioperative Entnahme und histologische Aufarbeitung, sinnvoll und notwendig. Die Knochenszintigraphie oder ein CT der Knochen sind ebenso nur bei bestimmten Subtypen indiziert, wie zum Beispiel bei dem myxoiden Liposarkom, welches vermehrt in die Knochen metastasiert (Gilbert et al., 2009). Die gesammelten Informationen über die Ausbreitung und den Entartungsgrad des Tumors erlauben die Feststellung des Tumorstadiums mittels eines Staging-Systems. Dieser folgt nach einer optimalen Therapieplanung eine angemessene Therapie. Für gewöhnlich erfolgt die Stadieneinteilung nach dem pTNM-System, das durch das American Joint Comittee on Cancer (AJCC) und die Union Internationale Contre le Cancer (UICC) unterstützt wird. Dabei gibt der Buchstabe p an, ob die Diagnose postoperativ durch einen Pathologen gesichert wurde. Die übrigen Buchstaben werden je nach Befund mit einer kleinen Zahl oder einem kleinen Buchstaben versehen, wobei die Bezeichnung T die Tumorgröße angibt, N den Lymphknotenbefall und M den 12 Metastasenstatus. Unter verschiedenen fakultativen zusätzlichen Kategorien findet sich auch der Buchstabe G, der mit aufsteigenden Ziffern den Grad der Gewebeentartung angibt. Diese einzelnen Befunde ergeben das Stadium der Tumorerkrankung, welchem oft eine bestimmte Prognose und bestimmte Therapiemaßnahmen zugeordnet sind (Tab. 1.2 und Tab. 1.3). Alle genannten diagnostischen Mittel werden nach Bedarf wiederholt eingesetzt, um den Verlauf der Krankheit zu beobachten und die Therapie gegebenenfalls anzupassen. Beispielsweise wird zur Evaluation der Wirksamkeit einer Radio- oder Chemotherapie eine aktuelle MRT-Aufnahme benötigt. Tab. 1.2 TNM-Klassifikation maligner Tumore nach UICC. T N M Primärtumor T1a Tumordurchmesser ≤ 5 cm Lokalisation oberflächlich zur Fascia superficialis ohne deren Infiltration T1b Tumordurchmesser ≤ 5 cm Lokalisation unterhalb der Fascia superficialis und/oder deren Infiltration sowie retroperitoneale, mediastinale bzw. Beckentumoren T2a Tumordurchmesser > 5cm Lokalisation oberflächlich zur Fascia superficialis ohne deren Infiltration T2b Tumordurchmesser > 5cm Lokalisation unterhalb der Fascia superficialis und/oder deren Infiltration sowie retroperitoneale, mediastinale bzw. Beckentumoren Regionäre Lymphknoten NX Regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden N0 Keine regionären Lymphknotenmetastasen N1 Regionäre Lymphknotenmetastasen Fernmetastasen MX Fernmetastasen können nicht beurteilt werden M0 Keine Fernmetastasen M1 Fernmetastasen Tab. 1.3 Stadiengruppierung der Weichteilsarkome (Spiessl, 1993). Das Stadium der Sarkomerkrankung ist von dem Entartungsgrad des Tumors (G), von dessen Größe (T), vom Lymphknotenbefall (N) und von dem Metastasenstatus (M) abhängig. Stadium I A B Stadium II A B C Stadium III Stadium IV G1 G2 G1 G2 G1 G2 G3 G4 G3 G4 G3 G4 Jedes G Jedes G T1a und b T1a und b T2a T2a T2b T2b T1a und b T1a und b T2a T2a T2b T2b Jedes T Jedes T N0 N0 N0 N0 N0 N0 N0 N0 N0 N0 N0 N0 N1 Jedes N M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M1 13 1.1.7 Therapie Der Therapieansatz bei Weichteilsarkomen ist primär chirurgisch. Dabei soll eine Exzision des Tumors weit im Gesunden erfolgen. Es gelten die tumor-chirurgischen Ansätze „En-bloc“-Resektion und die „no touch isolation technique“. Hierbei soll der Tumor nicht berührt und dessen Kapsel nicht eröffnet werden, um eine Kontamination des umliegenden Gewebes mit Tumorzellen zu vermeiden. Ein Sicherheitsabstand von 4-5 cm seitlich und 2 cm zur Tiefe sollte eingehalten werden (Steinau et al., 2001). Postoperativ gilt es, Hämatome und Ödeme zu vermeiden, da diese wiederum die Tumorzellverschleppung begünstigen. Eine präoperative oder postoperative Chemotherapie wird je nach histologischem Subtyp eingesetzt. Entschieden wird hier nach der Sensibilität des Sarkoms gegenüber den zytotoxischen Medikamenten und nach dem Metastasierungsrisiko. Die Chemotherapeutika können einerseits den Tumor präoperativ verkleinern und somit die Tumorresektion erleichtern oder auch eine Sensibilisierung für eine folgende Strahlentherapie erreichen. Die Ansprechrate von Weichteilsarkomen auf eine Chemotherapie liegt nur bei Aktinomycin D, Ifosfamid und Doxorubicin über 15% und wird folglich insgesamt nur zurückhaltend nach den oben genannten Kriterien und vor allem im fortgeschrittenen Tumorstadium eingeleitet. Doxorubicin, welches ein geläufiges Zytostatikum in der Sarkomtherapie ist und Ansprechraten bis 26 % erreicht, interkaliert zwischen den Basenpaaren der DNA, verhindert auf diese Weise die Transkription und Replikation und führt zu Mutationen. Es inhibiert die Topoisomerase II, die auch für die DNAReplikation benötigt wird, und reguliert die Expression proapoptotischer Faktoren wie zum Beispiel Cytochrom C und verschiedene Kaspasen hoch (Lehnhardt et al., 2005). Ein Mechanismus der Tumorzellen der Wirkung dieses und der anderen Chemotherapeutika zu entgehen, ist in etwa die Ausschleusung jeglicher Medikamente aus der Zelle durch die Expression des Transportproteins des Multidrug-ResistanceGen 1 (MDR-1). Auch eine erworbene Unfähigkeit der Zellen, den programmierten Zelltod (Apoptose) einzuleiten, zum Beispiel durch eine Mutation im TumorsuppressorGen p53, kann für eine Resistenz gegenüber den Therapeutika verantwortlich sein. Das Protein p53 akkumuliert bei metabolischem Stress, äußeren negativen Reizen und DNA-Schäden und hält über die Einbindung weiterer Faktoren den Zellzyklus bis zu einer Behebung der Stresssituation und einer erfolgten DNA-Reparatur an. Erfolgt dies nicht, wird die Apoptose der geschädigten Zelle eingeleitet. Einige Chemotherapeutika 14 wirken über eine Aktivierung des Tumorsuppressors und verlieren ihre Wirkung, wenn eine Mutation im p53-Gen vorliegt (Gomez-Lazaro et al., 2004; Wattel et al., 1994). Die Strahlentherapie hingegen hat als adjuvante oder neoadjuvante Methode einen festen Platz in der Tumortherapie. Die Kombination mit einer Operation ist vor allem bei Extremitätenbefall zu einer Vermeidung der Amputation die Therapiemethode erster Wahl. Die Überlebensrate ist in diesem Fall ähnlich der einer Amputation bei verbesserter lokaler Tumorkontrolle und verbesserter Lebensqualität. Diese wird durch die Nebenwirkungen wie in etwa einer Ödembildung, Fibrose oder auch Wundheilungsstörungen nicht merklich gemindert (Yang et al., 1998). Ein Beheben des Weichteildefektes bzw. auch des Knochendefektes zum Funktionserhalt nach Tumorresektion erfolgt im plastischen chirurgischen Bereich bevorzugt mittels autologen Transplantationen. 1.1.8 Prognose Die Lebenserwartung der Patienten hängt stark von dem Stadium der Tumorerkrankung, von dem histologischen Subtyp, von der Therapie und dem Therapieendergebnis ab. Nach gestellter Diagnose und erfolgreicher Therapie ohne mikroskopische Tumorrückstände (R0-Resektion), werden innerhalb des ersten Jahres in 22-60 % der Fälle Rezidive beschrieben. Diese hohen Rückfallsraten werden hauptsächlich auf das Vorhandensein nicht erkennbarer Metastasen zum Diagnosezeitpunkt zurückgeführt (Worth, 2005). Die beste Prognose haben Patienten, dessen Tumor sich im ersten Dedifferenzierungsstadium befindet (G1). Hier beträgt die fünf-Jahre-Überlebensrate (5-JÜR) 75 %. Bei Patienten mit einem G2- oder einem G3-Tumor beträgt sie hingegen nur 56 % beziehungsweise 26 % (Kotilingam et al., 2006). Die schlechteste Prognose haben Patienten, bei denen keine R0-Resektion mehr möglich ist und bei denen bereits Lungenmetastasen bestehen. Kontrolluntersuchungen, um einen Rückfall oder ein Tumorwachstum frühzeitig zu erkennen und entsprechend zu therapieren, finden zunächst alle drei Monate statt. Bei ausbleibendem Rückfall werden die Untersuchungsintervalle nach festgelegten Abschnitten verlängert, so dass nach zwei Jahren ohne Tumorrezidiv jährliche Untersuchungen ausreichen. Der lokale Befund kann durch Ultraschall oder MRTAufnahmen kontrolliert und das Auftreten von Lungenmetastasen durch Röntgen- oder CT-Aufnahmen detektiert werden. 15 1.2 Host Defense Peptide 1.2.1 Natürliche Host Defense Peptide des Immunsystems Als natürliche Host Defense Peptide (HDP) werden körpereigene Peptide bezeichnet, denen antimikrobielle und teilweise auch onkolytische Eigenschaften im Rahmen der angeborenen Immunantwort nachgewiesen werden konnten. Erst in den achtziger Jahren des zwanzigsten Jahrhunderts wurden diese Peptide, von denen zunächst nur eine antimikrobielle Wirkung bekannt war und sie dementsprechend antimikrobielle Peptide (AMP) genannt wurden, in einzelnen Lebewesen wie den Säugetieren und den Amphibien entdeckt. Mittlerweile sind antimikrobielle Peptide in fast allen Lebewesen nachgewiesen worden. Ihr Wirkspektrum ist sehr breit und schließt gram-negative sowie gram-positive Bakterien ein; aber auch eine Wirksamkeit in der Bekämpfung von Viren und Pilzen wurde bestätigt (Klotman and Chang, 2006; Zasloff, 2002). Einige Jahre nach ihrer Entdeckung wurden bereits onkolytische Wirkungen unter den AMPs beobachtet. Es handelt sich bei den HDPs meistens um kurze kationische Peptide bestehend aus 5 bis 40 Aminosäuren. Dabei liegt die positive Ladung zwischen +2 bis +9 bei neutralem pH-Wert und wird durch einen hohen Gehalt an positiv geladenen Aminosäuren wie Lysin und Arginin erreicht. Allerdings wurden vereinzelt auch anionische HDPs beobachtet (Lai et al., 2007). Des Weiteren sind auch hydrophobe Aminosäuren charakteristisch für viele HDPs (Hoskin and Ramamoorthy, 2008). In ihrer dreidimensionalen Struktur sind die Peptide mit einer hydrophoben und einer hydrophilen Seite amphipathisch. Auf Grund der positiven Ladung nähern sie sich vor allem Bakterien, deren Zellmembran durch Cardiolipin und Phosphatidylserin und deren Zellwand bei gramnegativen Bakterien durch Lipopolysaccharide negativ geladen ist. Krebszellen nähern sie sich auf Grund des höheren Anteils an Phosphatidylserin, N-Acetylneuraminsäure und Heparansulfaten in der Membran, die eine negative Ladung dieser verursachen (Riedl et al., 2011). Die Moleküle wirken über verschiedene zytotoxische Mechanismen. Ein Angriffspunkt und Inhalt zahlreicher Modelle ist die Zellmembran. So wird beispielsweise angenommen, dass sich die amphipathischen Host Defense Peptide in deren Lipiddoppelschicht einlagern und Poren in der Membran bilden. Die daraus resultierende erhöhte Membrandurchlässigkeit bewirkt nachfolgend den Zelltod. Ein anderes Modell beschreibt ein flächiges Anlagern der Host Defense Peptide an die 16 Membran mit einer folgenden Detergens-ähnlichen unstrukturierten Auflösung dieser (Bechinger and Lohner, 2006; Shai, 1999). Einige HDPs wirken jedoch über eine Interaktion mit intrazellulären Strukturen wie Enzymen, Organellen oder sogar der DNA nach einem Eindringen in die Zelle ohne deren Membran zu zerstören. Magainin 1 leitet beispielsweise im Zytosol die Apoptose der Zelle über eine Cytochrom C-Freisetzung aus Mitochondrien ein und steigert die Aktivität von Proteasomen (Cruz-Chamorro et al., 2006; Teixeira et al., 2012). Eine chemotaktische Wirkung auf Immunzellen wurde vielen HDPs nachgewiesen; dabei rekrutieren die verschiedenen HDPs bestimmte Gruppen von Immunzellen. Das humane β-Defensin 2 (hBD-2) zieht beispielsweise speziell T-Gedächtnis-Zellen und unreife dendritische Zellen an (Zasloff, 2002). Zu den beiden großen Gruppen der Host Defense Peptide zählen zum einen die Kathelizidine, die aus Vorläufermolekülen entstehen und reich an α-Helices sind, und zum anderen die Defensine, die sich durch β-Faltblattstrukuren und Dissulfidbrücken in der Sekundärstruktur auszeichnen. Ein gut erforschtes Kathelizidin ist das humane HDP LL-37, das in Lösung helikal angeordnet ist und ubiquitär im Körper produziert wird. Neben direkten antibakteriellen Eigenschaften wurde auch eine chemotaktische Wirkung auf Neutrophile, Monozyten und T-Zellen beobachtet. Diese wird durch eine Induktion von Chemokinen und deren Rezeptoren vermittelt (Mookherjee et al., 2009; Nijnik et al., 2012). LL-37 unterstützt jedoch das Tumorwachstum von Brust-, Lungen- und Ovarialkarzinomen durch eine Stimulation der Zellproliferation der Tumor- nicht aber der Stromazellen. Auch die Stimulation der Angiogenese begünstigt ein Tumorwachstum (Coffelt et al., 2009; Heilborn et al., 2005). Währenddessen wirkte ein zentrales Element des Peptids, bestehend aus den Aminosäuren 6-32, zytotoxisch gegen orale Plattenepithelkarzinomzellen (Okumura et al., 2004). Da LL-37 nicht nur negativ geladene sondern auch zwitterionische Membranen angreift, beeinträchtigt es auch den Stoffwechsel von gesunden eukaryotischen Zellen und wirkt hämolytisch (Johansson et al., 1998; Oren et al., 1999). Zu der Gruppe der Defensine zählen unter anderem die Humanen Neutrophilen Peptide 1-3 (HNP). Diese wirken zytotoxisch gegen verschiedene humane und murine Tumorzelllinien über eine Porenformation in deren Zellmembran sowie über eine Schädigung der DNA (Gera and Lichtenstein, 1991; Kagan et al., 1990). Darüber hinaus verschlechtern ihre anti-angiogenetischen Eigenschaften die Wachstumsbedingungen 17 der Tumorzellen (Chavakis et al., 2004). Auch diese HDPs greifen nicht spezifisch maligne Zellen sondern auch gesunde Zellen an (Nishimura et al., 2004). Unter den nicht-humanen Host Defense Peptiden wurde ebenso eine onkolytische Potenz beobachtet. So wirken die bovinen Kathelizidine BMAP-27 und -28 zytotoxisch gegen Leukämie-Zellen und schnell proliferierende hämatopoetische Zellen. Die in den Insekten entdeckten Cecropine A und B lysieren einzelne maligne Zelllinien ohne gesunde eukaryotische Zellen bei der entsprechenden Konzentration zu beeinträchtigen und auch die aus den Amphibien isolierten Magainine greifen spezifisch Tumorzellen an (Hoskin and Ramamoorthy, 2008). 1.2.2 Synthetische Host Defense Peptide in der Tumortherapie Mit der Entdeckung der onkolytischen Eigenschaften der Host Defense Peptide entstand die Hoffnung, unter diesen Molekülen ein neues effektives Therapeutikum für die Behandlung von Tumorerkrankungen zu finden. Die Fähigkeiten, Zellmembranen zu zerstören, Angiogenese zu hemmen und Immunzellen durch Chemotaxis zu rekrutieren, stellen eine viel versprechende Kombination von Wirkmechanismen dar. Allerdings zeigen viele der in der Natur entdeckten HDPs auch nachteilige Eigenschaften, die einem Einsatz als Therapeutikum widersprechen. So greifen einige HDPs auch gesunde Zellen an und führen beispielsweise zu einer Hämolyse. Zudem werden die meisten HDPs schnell im Blutkreislauf abgebaut, so dass sie, wenn sie von extern zugeführt werden, die Zielstruktur nicht erreichen oder zu kurz in einer therapeutischen Dosis dort präsent sind. Das Ziel vieler Forschungsgruppen besteht somit darin, Peptide zu finden, die eine maximale Wirkung gegen Tumorzellen zeigen, jedoch ein Minimum an nachteiligen Eigenschaften. Zur genaueren Erforschung der existierenden Host Defense Peptide werden diese unter anderem künstlich synthetisiert. Die ursprüngliche Sequenz und Konfiguration der Aminosäuren wird im Verlauf oft verändert mit dem Ziel einer Optimierung der therapeutischen Eigenschaften. Die dadurch entstehenden Peptide werden dann Designer Host Defense Peptide genannt. Da die Peptidproduktion sehr teuer ist, ist es erstrebenswert, Peptide für die Tumortherapie zu finden, die eine hohe Effektivität bei kurzer Aminosäuresequenz zeigen. Die Verwendung von D-Aminosäuren in synthetischen HDPs führt zu einer schlechteren Abbaubarkeit der Peptide durch körpereigene Peptidasen und verbessert somit die Pharmakokinetik. Darüber hinaus erwiesen sich synthetische HDPs mit D18 konfigurierten Aminosäuren als selektiver in ihrer Wirkung gegen Tumorzellen im Vergleich zu gesunden Körperzellen. Dies steht offenbar im Zusammenhang mit der Sekundärstruktur, die die Host Defense Peptide in oder auf Membranen annehmen: Die α-helikale Konformation der rein L-konfigurierten Peptide scheint den Peptiden mit Dkonfigurierten Aminosäuren hinsichtlich der selektiven Anlagerung an negativ geladene Membranen unterlegen zu sein (Papo et al., 2004). Der Bedarf an neuen Medikamenten in der Tumortherapie wird deutlich angesichts der hohen Resistenzraten der Neoplasien gegenüber den konventionellen Chemotherapeutika. Die Resistenzmechanismen bestehen oft in der Veränderung von intrazellulären Prozessen der Krebszellen. Der Vorteil der Host Defense Peptide besteht darin, dass sie oftmals bereits über die Auflösung der Zellmembran wirken, so dass hier der einzige wirksame Resistenzmechanismus in einer stark veränderten Membranstruktur bestehen würde. Meist wirken die HDPs jedoch über mehrere Mechanismen, so dass der Selektionsdruck, einen besonderen Resistenzmechanismus auszubilden, nicht gegeben ist (Peschel and Sahl, 2006). Auf der Suche nach dem optimalen Host Defense Peptid ist der onkolytische Effekt in in vivo-Mausmodellen mehrfach nachgewiesen worden. Die HDPs sind sowohl lokal als auch systemisch zur Unterbindung der Metastasenentstehung wirksam (Papo et al., 2006). Auch die Unabhängigkeit ihrer Wirkung von vorhandenen Resistenzgenen konnte belegt werden (Held-Kuznetsov et al., 2009). Die Frage nach einer möglichen Steigerung der Medikamentenakkumulation in Krebszellen durch HDPs, was eine Kombinationstherapie von HDPs und Chemotherapeutika zu einer effektiven Therapieoption machen würde, ist noch nicht geklärt. 1.2.3 Gezielt-konfigurierte Peptide im Einsatz gegen Neoplasien Die Forschungsgruppe um Professor Yechiel Shai, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel erforscht kationische Peptide bestehend aus 15 Aminosäuren und insbesonders ihre Wirksamkeit gegen Prostatamalignome im in vivo-Mausmodell. Die Peptide bestehen aus den Aminosäuren Histidin (H), Leucin (L) und Lysin (K) zu verschiedenen Anteilen. Die Lysine sind Träger der positiven Ladung des Peptids und die Leucine verleihen den Peptiden Hydrophobizität, während die Histidine durch ihre niedrige Säurekonstante (pKs) von 6,1 dadurch eine Spezifität vermitteln, dass sie erst im sauren anaeroben Milieu der Tumorzellen protoniert werden und die positive Ladung des Peptids weiter verstärkt wird (Makovitzki et al., 2009). Erste Versuche ergaben, 19 dass auch diese Peptide durch die Verwendung von D-konfigurierten Aminosäuren resistenter gegen einen proteolytischen Abbau und aktiver bei der Zelllyse sind, weshalb diese Eigenschaft bei der Synthese von den 15-mer Peptiden fortan beibehalten wurde (Rosenfeld et al., 2008). Zunächst zeigte das Peptid [D]-K6L9 eine starke Hemmung des Tumorwachstums. Seine Toxizität gegen gesunde Zellen, die sich in vitro und bei systemischer Applikation in vivo zeigte, erforderte jedoch eine Veränderung des Peptids. Die Peptide [D]-K3H3L9 und [D]-H6L9 erwiesen sich lediglich in vitro bei hohen Konzentrationen als toxisch bei potenter onkolytischer Wirkung von bereits niedrigen Konzentrationen. Zusätzlich zeigten die histidinhaltigen Peptide eine Hemmung der Vaskularisierung in den Tumoren (Makovitzki et al., 2009). Tab. 1.4 Die Aminosäuresequenzen einiger 15-mer kationischen Peptide (Frei nach Makovitzki et al., 2009). Aufgelistet sind einige der 15-mer Host Defense Peptide dessen Eigenschaften und Wirkungen gegen Tumorzellen genauer erforscht werden. D-Aminosäuren sind hier fettgedruckt und unterstrichen. Host Defense Peptide [D]-K6L9 Sequenz LKLLKKLLKKLLKLL [D]-K3H3L9 LHLLHKLLKHLLKLL [D]-H6L9 LHLLHHLLHHLLHLL [D]-K4H2L9 LKLLHKLLKHLLKLL Die Forschungsgruppe „Molekulare Onkologie und Wundheilung“ von Professor Steinsträßer, Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte des Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikums Bergmannsheil, Bochum, erforscht seit 2005 die Wirksamkeit der Peptide [D]-K3H3L9 und [D]-K4H2L9 im Einsatz gegen Weichteilsarkome. Beide Host Defense Peptide konnten die Zellvitalität von Sarkomzelllinien häufig vorkommender Subtypen, darunter Liposarkom-, Fibrosarkom- und Synovialsarkomzellen, einschränken und im athymischen in vivo-Mausmodell das Tumorwachstum sowie die Vaskularisierung der Tumore hemmen. Für das selektive [D]-K3H3L9 konnte bereits eine onkolytische Wirkung im immunkompetenten Organismus nachgewiesen werden. Auch eine gesteigerte Migration von T-Zellen in das Tumorgewebe nach der Peptidtherapie wurde beobachtet (Steinstraesser et al., 2011). Das Peptid [D]-K4H2L9 erwies sich ebenso als selektiv gegenüber Sarkomzellen unter realen Bedingungen. So betrug die mittlere letale Dosis (LD50) für Sarkomzellen im sauren Tumormilieu (pH 6,3) 3-5 µM und für Fibroblasten bei einem physiologischen 20 pH-Wert (pH 7,3) das 3-6-fache mit 19 µM (Abb. 1.2). Die Oberflächenladung dieses kationischen Peptids beträgt je nach dem pH-Wert seiner Umgebung zwischen +4 und +6. Eine hämolytische Wirkung auf humanes oder murines Blut wurde ausgeschlossen. Die schnelle LDH-Freisetzung aus den Sarkomzellen durch das Peptid spricht für eine Lyse der Membran die den LDH-Austritt verursacht (Mersch, 2010). Abb. 1.2 Einschränkung der Zellvitalität verschiedener Sarkomzelllinien und Referenzzellen durch das Host Defense Peptid [D]-K4H2L9. Das Diagramm stellt die Einschränkung der Zellvitalität bei saurem pH-Wert (pH = 6,3) und steigenden [D]-K4H2L9-Konzentrationen dar. Es wurden die humanen Synovialsarkomzellen SW982, die humanen Fibrosarkomzellen HT1080, die humanen Liposarkomzellen SW872 und als Referenzzellen die humanen Fibroblasten untersucht. Die humanen Fibroblasten wurden zusätzlich bei einem physiologischen pH-Wert von 7,3 untersucht. Die Zellvitalität wurde mittels MTTAssay analysiert (Mersch, 2010). 21 2 Zielsetzung Die Prognose der Weichteilsarkom-Erkrankung ist auf Grund des späten Diagnosezeitpunktes, der hohen Resistenzraten gegen Chemotherapeutika und eingeschränkter Sensibilität gegenüber Strahlentherapie oftmals ungünstig. Es bedarf daher noch effizienterer Methoden, um einen größeren Therapieerfolg zu erreichen. Die ersten Forschungsergebnisse des Einsatzes von Host Defense Peptiden gegen Karzinome sind vielversprechend und zeigen unter anderem eine Reduktion des Tumorwachstums und der Metastasenentstehung. Das Anliegen der Tumorforschung ist es nun, die effektivsten und wirtschaftlichsten Peptide mit dem günstigsten Nebenwirkungsprofil zu finden. Das Ziel der vorliegenden Doktorarbeit besteht darin, die onkolytischen Eigenschaften gegen Weichteilsarkome des synthetischen Host Defense Peptids [D]-K4H2L9 zu untersuchen. Hierzu wird zunächst in vitro die anti-proliferative Wirkung des Peptids auch im Vergleich mit einem Scrambled-Peptid analysiert. Zudem wird eine Kombinationstherapie von [D]-K4H2L9 mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin durchgeführt. Die Spezifität der Wirkung gegen entartete Zellen wird durch das Mitführen gesunder Zellen bei den entsprechenden Versuchen geprüft. Zur Erforschung der Wirkung von [D]-K4H2L9 im lebenden Organismus wird es zur lokalen Therapie subkutaner Sarkome bei immunkompetenten Mäusen angewendet. Dies ermöglicht eine nachfolgende Analyse von immunmodulatorischen Funktionen. Hierzu wird mit den murinen Sarkomen nach Beendigung des in vivo-Versuchs immunhistochemisch weitergearbeitet, um Rückschlüsse über Interaktionen des Peptids mit dem Immunsystem oder über eine Beeinflussung der Vaskularisierung durch das Peptid ziehen zu können. Mögliche Wege dieser Einflussnahme werden durch eine Analyse der Genexpression einiger Zytokine in den Tumoren untersucht. 22 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Chemikalien und Reagenzien Agarose Roth, Karlsruhe Augen- und Nasensalbe 5 g Bepanthen Bayer AG, Leverkusen Alexa Flour® 488 Streptavidin Invitrogen, Heidelberg Ammoniak Roth, Karlsruhe Antigen Unmasking Solution Vector, Burlingame (USA) Bacillol® Bode Chemie, Hamburg Bromphenolblau Fisher Scientific, Schwerte ß-Mercaptoethanol Sigma, Steinheim 100 bp Ladder Invitrogen, Heidelberg CASYTON® Schärfe Systeme Reutlingen DAPI Staining Solution Invitrogen, Heidelberg Doxorubicin in 0,9 %NaCl (2 mg/ml) Apotheke, Bergmannsheil, Bochum Dispase Invitrogen, Heidelberg EDTA(Ethylendiamintetraessigsäure) Sigma, Steinheim Entellan Mounting Medium Merck, Darmstadt Eisessig Sigma, Steinheim Essigsäure Sigma, Steinheim Ethanol Merck, Darmstadt FCS (Fötales Kälberserum) Perbio Science, Thermo Scientific, Bonn Flourescent Mounting Medium Dako, Hamburg Formafix 5 % Patho Med. Logistik GmbH, Viersen GelStar® Nucleic Acid Gel Stain Lonza, Maine, USA Glycerol 87 % Merck, Darmstadt Glycerol 99,5 % Roth, Karlsruhe Hautdesinfektionsmittel (Softasept) B. Braun Melsungen AG, Melsungen Hämatoxylin Lösung nach Mayer Apotheke, Bergmannsheil, Bochum Immersol 518F Carl Zeiss, Oberkochen Isofluran Abott, Wiesbaden Kalziumchlorid Sigma, Steinheim Kollagenase II Cell Systems, Troisdorf 23 O.C.T.-Kryomedium VWR, Darmstadt Lachgas Air Products, Hattingen Matrigel BD Biosciences, Heidelberg Natriumchlorid Merck, Darmstadt Natriumhydroxid Roth, Karlsruhe Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) PAA Laboratories, Cölbe Proteinase K Roth, Karlsruhe Proteinase K solution Qiagen, Hilden Reinstwasser (Millipore) Forschungslabor Plastische Chirurgie; Bergmannsheil Bochum Salzsäure 1N Roth, Karlsruhe Sauerstoff Air Products, Hattingen Stickstoff, flüssig Air Products, Hattingen Tris-Base Appli Chem, Darmstadt Triton X-100 Sigma, Steinheim Trypsin-EDTA PAA Laboratories,Cölbe Tween® 20 Roth, Karlsruhe Veet® Haarentfernungs-Creme Sensitive Reckitt Benckiser Deutschland GmbH,Mannheim Xylenecyanol Sigma, Steinheim Xylol (Isomere) Roth, Karlsruhe 3.1.2 Antikörper und Seren Anti-muriner-CD31-AK in Ratte Dianova, Hamburg Anti-Ratte-IgG in Ziege Dianova, Hamburg Biotinyl. Anti-Kaninchen-IgG in Ziege Vector, Burlingame (USA) Monoklonaler Anti-CD3-AK in Ratte Acris, Herford Monoklonaler Anti-F4/80-AK in Ratte Acris, Herford Monoklonaler Anti-Ki67-AK Acris, Herford in Kaninchen Normales Ziegenserum Vector, Burlingame (USA) 24 3.1.3 Primer und Sonden Die folgenden eingesetzten Primersequenzen und Sonden für die Realtime-PCR stammen von der Firma Roche, Mannheim. Die Auswahl erfolgte mittels des verfügbaren Assay Design Center der Universal Probe Library auf der Website www.roche-applied-science.com. Hergestellt wurden die Primer von der Firma TIB MOLBIOL, Berlin. Tab. 3.1 Übersicht über Primer und Sonden für die RT-PCR. Zugangsnummer der Primer mit deren Vorwärts- (V) und Rückwärtssequenz (R), sowie der zugehörigen Sondenummer, die bei der Genexpressionsanalyse der aufgeführten Proteine verwendet wurden. Die Länge der Amplikons ist in Basenpaaren (bp) angegeben. Gen Zugangsnummer/ Sonden- (Synonym) Fragmentgröße nummer IFN-γ EF423643.1 21 89 bp IGFbp-3 NM_008343.2 Gene_1 63 NM_010551.3 62 NM_021274.1 10) 111 bp MCP-1 (JE) NM_011333.3 71 9) 75 bp NOV NM_010930.4 (Igfbp 9) 94 bp 18S rRNA NR_003278.1 68 bp V: aaggtcacagacccttctgg R: tggcagcagctctctggt 3 V: gctgccgtcattttctgc R: tctcactggcccgtcatc 62 76 bp MIG (CXCL NM_008599.4 V:ccaggtgtcttagccagtcc R: gcagtgcaggaataatgtttca 66 bp IP-10 (CXCL V: gcagcctaagcacctacctc R: ctttccacactcccagcatt 94 bp IL-16 V: atctggaggaactggcaaaa R: ttcaagacttcaaagagtctgaggta 88 bp IL-12 Sequenz 5’-3’ V: catccacgtgttggctca R: gatcatcttgctggtgaatgagt 1 V: cttttcctcttgggcatcat R: gcatcgtgcattccttatca 11 V: agtggacctgtggctcaga R: tcaactcctacggtggcttc 48 V:gcaattattccccatgaacg R: gggacttaatcaacgcaagc 25 3.1.4 Fertige Versuchsansätze ABC Kit ELITE Vectastain, Wertheim Cell Proliferation ELISA, BrdU Roche, Mannheim ImmPACT DAB Vector, Burlingame (USA) LightCycler® 480 Probes Master Roche, Mannheim RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden RNase-free DNase Set Qiagen, Hilden Transcriptor First Strand cDNA Roche, Mannheim Synthesis Kit 3.1.5 Puffer, Lösungen DMEM-Zellkulturmedium für HFB225 890 ml Dulbecco’s Modified Eagle und SW982 Medium (DMEM ohne Kalzium und Magnesium), PAA Laboratories Cölbe, 100 ml/l FCS, 10 ml/l Pen (100 U/µg)/Strep (100 µg/ml) PBS (Phosphatpuffer), pH 7,2 PAA Laboratories, Cölbe PBST-Puffer 0,1 % Tween 20 in PBS Probenpuffer (6-fach), 0,125 g Bromphenolblau, 0,125 g Xylenecyanol, 17,2 ml 87 % Glycerol auf 50 ml MQ-Wasser RPMI-Zellkulturmedium für BFS-1-wt PAA Laboratories, Cölbe 100 ml/l FCS, 10 ml/l Pen (100 U/µg)/Strep (100 µg/ml) 50 x TAE, 242 g Tris Base, 57,1 ml Eisessig, 18,6 g EDTA auf 1l MQ-Wasser, pH 8 (eingestellt mit NaOH) TE-Kalziumchloridpuffer 6,10 g Tris Base, 0,37 g EDTA, 0,56 g Kalziumchlorid, 5 ml Triton X-100 in 1000 ml MQ-Wasser; pH 8 (eingestellt mit 10 M HCl) 26 3.1.6 Geräte Analysenwaage BL 600 Sartorius, Göttingen Anästhesiegerät Sulla 19 Draeger, Lübeck Backofen Bachofer, Reutlingen Bio-Photometer Eppendorf, Hamburg Cell strainer 100 µM BD Biosciences, Heidelberg Combitips plus biopur 0,5 ml, 2,5 ml, Eppendorf, Hamburg 5 ml, 10 ml Deckgläser Diagonal, Knittel Glass, Braunschweig Eismaschine Ziegra, Isemhagen Einmalpipetten 5 ml, 10 ml, 25 ml Biochrom, Berlin Einweg-Pinzette, steril Servoprax, Wesel Electrophoresis Power Supply E881 Consort, Turnhout, Belgien Elektrophoresekammer Subcell GT Bio-rad, Kalifornien, USA Feinwaage RC210D Sartorius, Göttingen Homogenisator PT3100 Polytron® Kinematica, Luzern, Schweiz Image Station 4000MM Kodak, Stuttgart Insulinspritzen, steril BD Biosciences, Heidelberg Kalliper 572587 LUX, Wermelskirchen Kamera PowerShot S2IS Canon, Japan Kanülen G1, G17 Braun, Emmenbrücke Kryo-Röhrchen Nalgene, Wien Laminar Air Flow-Käfige und Racks Allentown Caging Equipment Co., New Jersey, USA Laserdissektionsmikroskop DM600B Leica Mikrosysteme Vetrieb GmbH, Wetzler LightCycler® 480II Roche, Mannheim Microplate Luminometer Orion Berthold–Detection Systems, Alabama, USA Magnetrührer MR0 Heidolph, Schwabach Megafuge 1.0R Heraeus, Tuttlingen Mikrowelle R2V26 Sharp, Hamburg Multipette® stream Eppendorf, Hamburg Objektträger Menzel-Gläser, Braunschweig 27 Opti-seal optical disposable adhesive Bioplastics, Landgraaf, Niederlande Permanentstift Lumocolor Staedler, Nürnberg Petrischalen Sarstedt, Nürnbrecht pH-Meter pH340/ION-Set WTW, Weilheim Pipettenspitzen (0,5-2 µl, 0,5-10 µl, Biosphere AG, Wilhelmshaven 20-100 µl, 20-200 µl, 100-1000 µl) Pipettierhilfe Eppendorf, Hamburg Präparierbesteck, steril Forschungslabor Plastische Chirurgie, Bergmannsheil Bochum Reinstwasseranlage MiliQ-Plus Millipore, Schwalbach 50 ml Röhrchen, steril, Schraubkappe VWR International GmbH, Darmstadt Safe Lock Tubes 1,5 ml, PCR, clean Eppendorf, Hamburg Skalpelle, steril Aesculap, Tuttlingen Speed Vac Sternkopf, Lübeck Stereo-Mikroskop Axiokop2 Plus Zeiss, Jena Sterilbank HS12 Heraeus Holding GmbH, Hanau Thermocycler 60 bio-med, Oberschleißheim Untersuchungshandschuhe Nitril Top Glove, Duisburg UV-Einmal-Küvetten Eppendorf, Hamburg Vortex Genie 2 Scientific Industries, New York, USA WärmeinkubatorZellen/Medien Heraeus, Tuttlingen 6-well-Platte BD Bioscience, Heidelberg 96-well-Platten black, clear bottom Costar, NY, USA 96x0,2 ml-well-plate, Roche LC480 Bioplastics, Landgraaf, Niederlande compatible, white Zellkulturflasche, 150 cm2 TPP, Trasadingen, Schweiz Zellzähler CASY®-1TT Schärfe System, Reutlingen Zentrifuge 5415R Eppendorf, Hamburg Zentrifugenröhrchen 10 ml, steril TPP, Trasadingen, Schweiz 28 3.1.7 Das synthetische Host Defense Peptid Das eingesetzte Peptid [D]-K4H2L9 wurde freundlicherweise von Prof. Yechiel Shai, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel, als Lyophilisat zur Verfügung gestellt. Die Aminosäuresequenz lautet wie folgt: L K L L H K L L K H L L K L L -NH2 (D-Aminsäuren sind fettgedruckt und unterstrichen). 3.1.8 Das Scrambled-Peptid scP-K3H3L9 Das verwendete Kontrollpeptid besteht aus den L-Aminosäuren Lysin, Histidin und Leucin, welche wie folgt angeordnet sind: L K L K L L K L L H L H L H L -NH2. Im Folgenden wird dieses Peptid als scP-K3H3L9 bezeichnet. Das Peptid wurde von PolyPeptide Laboratories France SAS in Straßburg synthetisiert. 3.1.9 Primärzellen und Zelllinien Gearbeitet wurde in den folgenden in vitro-Versuchen und auch im syngenen Mausmodell mit der murinen Fibrosarkomzelllinie BFS-1 wt. Die BFS-1 wt-Zellen stammen von einem Fibrosarkom ab, welches in einer weiblichen C57BL/6-Maus durch das Karzinogen Methylcholanthrene induziert wurde. Die Zellen wurden freundlicherweise von Prof. Hehlgans, Universität Regensburg, zur Verfügung gestellt. Bei den in vitro-Versuchen wurden zusätzlich Synovialsarkomzellen SW982 als humane Sarkomzelllinie eingesetzt. Diese wurde bereits bei Vorversuchen der Arbeitsgruppe im athymischen Mausmodell verwendet. Die Zelllinie stammt von der Firma CLS (Cell Line Service, Eppelheim). Die primären humanen Fibroblasten, HFB225, repräsentierten gesunde Zellen. Diese wurden aus einem chirurgischen Resektat eines Patienten der Klinik für Plastische Chirurgie des Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikums Bergmannsheil in Bochum gewonnen. Die Genehmigung für die Verarbeitung von Haut (Dermis und Epidermis) für Forschungszwecke wurde durch das Ethikkomitee des Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikums Bergmannsheil, Ruhr-Universität Bochum erteilt und trägt das Aktenzeichen 2353/3.3. Der 47-jährige Spender des Gewebes wurde aufgeklärt und erteilte schriftlich seine Zustimmung. 29 3.1.10 Tiere Die männlichen C57BL/6 Mäuse für den in vivo-Versuch stammen aus den Charles River Laboratories, Sulzfeld. Zum Zeitpunkt der Lieferung waren sie ca. 6 Wochen alt und wogen 20 g. 3.2 Methoden Abb. 3.1 Arbeitsphasen bei der Untersuchung der Wirkung des Host Defense Peptids [D]-K4H2L9. Nach der Kultivierung der verschiedenen Zelllinien und der in vitro-Versuche folgte die intratumorale [D]-K4H2L9-Therapie von murinen Fibrosarkomen (BFS-1 wt) in immunkompetenten Mäusen. Bei der abschließenden Finalisierung der Versuchstiere wurden Gewebeproben asserviert. Eine Analyse der Tumore durch immunhistochemische Färbungen (IHC) und Genexpressionsanalyse mittels RT-PCR sollte Aufschluss über mögliche Einflüsse des Peptids geben. 3.2.1 Lösen der Peptide 3.2.1.1 Lösen des Peptids [D]-K4H2L9 Zunächst musste das als Lyophilisat gelieferte Peptid in Lösung gebracht werden. Dazu wurden die vorhandenen 25 mg Peptid in 20 ml 20 % Essigsäure gelöst, welche das Peptid aktivierte. Auf 20 Eppendorfgefäße verteilt verdampfte die Flüssigkeit in 34 Stunden durch Wärme und unter Vakuumbedingungen in einer Speed Vac. Das auf diese Weise neu erhaltene Lyophilisat wurde nun in PBS gelöst. Die dafür verwendeten 2,5 ml PBS mit den 25 mg des gelösten Peptids wurden gesammelt und aliquotiert. Die Endkonzentration der Aliquots betrug folglich 10 mg/ml. Die Peptidlösungen wurden bei -80 ºC aufbewahrt und erst unmittelbar vor Gebrauch aufgetaut. 30 3.2.1.2 Lösen des Scrambled-Peptids scP-K3H3L9 Die 55 mg Scrambled-Peptid scP-K3H3L9 wurden auf Grund seiner Hydrophobizität in 0,1 % Essigsäure gelöst. Die 5 mg/ml konzentrierte Lösung wurde aliquotiert bei -80 ºC aufbewahrt. 3.2.2 Generierung und Kultivierung der Zellen 3.2.2.1 Gewinnung der humanen Fibroblasten Die Gewinnung der primären humanen Fibroblasten fand nach Überführung von sterilen chirurgischen Resektaten ins Forschunglabor der Plastischen Chirurgie statt. Dort wurde die bei einer Abdominoplastik entnommene Haut zunächst durch PBS gereinigt und von Fett befreit. Nach Ausdünnen der Dermis mit Hilfe eines Skalpells wurde die Haut in 0,2 %iger Dispase-PBS-Lösung über Nacht bei 4 ºC inkubiert. Am nächsten Morgen konnten Epidermis und Dermis voneinander separiert werden. Letztere wurde zunächst durch ein Skalpell zerkleinert und folgend durch 1 % Kollagenase II zwei Stunden lang im 37 ºC-Schüttler bei 200 rounds per minute (rpm) enzymatisch verdaut. Die so erhaltene Zellsuspension wurde durch DMEM-Nährmedium verdünnt, mit Hilfe eines 100 µm-Filters von gröberen Gewebestücken befreit und für 10 min bei Raumtemperatur und 1400 rpm zentrifugiert. Das so erhaltene Zellpellet wurde in Medium resuspendiert und die gewünschte Zellzahl in Kulturflaschen ausgesät. 3.2.2.2 Zellkulturbedingungen Die Zellen wurden stets in sterilen Behältern kultiviert und mit sterilen Substanzen behandelt. Die BFS-1 wt-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS) und 1 % Penicillin/Streptomycin-Zusatz (Pen/Strep) kultiviert, die Synovialsarkomzellen und die Fibroblasten in DMEM mit ebenfalls jeweils 10 % FCS und 1 % Pen/Strep. Einmal pro Woche wurden die Zellen in neue 150 cm2Kulturflaschen umgesetzt. Dafür wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mittels Trypsin-EDTA (0,05 %/ 0,02 %) in PBS (5 ml/ 150 cm2) vom Boden der Kulturflasche abgelöst. Diese Reaktion wurde nach 2-3 Minuten mit FCS-haltigem Medium gestoppt. Dem Überführen der entstandenen Zellsuspension in ein 10 ml-Röhrchen folgte ein Abzentrifugieren der Zellen bei 1400 rpm für 5 Minuten und Raumtemperatur und ein erneutes Lösen in Nährmedium. Die Zellzahl pro Milliliter wurde durch den CASYZellzähler bestimmt und die Zellen mit einer Dichte von 3000 Zellen/cm2 in die 31 Kulturflaschen ausgesät. Ein Mediumwechsel fand alle zwei Tage statt. Die Kultivierung der Zellen erfolgte bei 37 ºC und 5 % CO2. 3.2.3 In vitro-Versuch: BrdU-Zellproliferationsassay Zur Quantifizierung der antiproliferativen Aktivität zytotoxisch und onkolytisch wirksamer Substanzen diente der 5-Brom-2-Desoxy-Uracil(BrdU)-Assay, der nach dem Protokoll des Herstellers des entsprechenden Kits durchgeführt wurde. Je 3x104 Zellen/well der BFS-1 wt und HFB-Zellen beziehungsweise 2x104 Zellen/well der SW982-Zellen wurden in FCS-haltigem Medium in eine 96-well-Platte ausgesät. Nach 24 Stunden fand ein Mediumwechsel statt. Zu dem nun FCS-freien Medium wurden onkolytische Substanzen in den gewünschten Konzentrationen zugegeben. Der Negativkontrolle wurde PBS zugesetzt und das Medium der Positivkontrollen enthielt 0,1 % Triton X-100. Zur Messung des Hintergrundsignals wurden einige Messzellen nur mit Medium versehen. Nach weiteren 24 Stunden wurde das Thymidinanalogon Bromdesoxyuridin hinzugegeben, welches während der Zellproliferation in die neu synthetisierte DNA der Zellen eingebaut wurde. Diese Inkubation wurde nach 22 Stunden abgestoppt, indem die Reagenzien abgesaugt und die Zellen für eine halbe Stunde fixiert wurden. Es folgte die 90-minütige Inkubation mit dem BrdU-Antikörper. Nach dreimaligem Waschen und Substratzugabe konnte die Lichtemission, die der Proliferationsaktivität entsprach, durch ein Luminometer gemessen werden. Die Veränderung der Zellproliferation durch die anfangs zugegebenen Substanzen wurde durch den Vergleich zur Negativkontrolle ausgewertet. Vorher wurde das gemessene Hintergrundsignal von allen Werten abgezogen. Mit Hilfe dieses Tests wurde die onkolytische Wirksamkeit der Peptide [D]-K4H2L9 und scP-K3H3L9 bestimmt. Die Dosisabhängigkeit dieses Effektes wurde durch Einsetzen folgender Konzentrationen herausgestellt: 100 µM, 87,5 µM, 75 µM, 62,5 µM, 50 µM, 25 µM, 12,5 µM, 6,25 µM, 3,125 µM, 1,5625 µM und 0 µM. Es wurde berücksichtigt, dass das scP-K3H3L9 in 0,1 % Essigsäure gelöst ist. Dementsprechend wurde den Negativkontrollen auch die Essigsäure zugesetzt, die sich bei der höchsten Peptidkonzentration in den Ansätzen befand (0,04 %). Durch das basische Nährmedium in den Ansätzen beziehungsweise in den Negativkontrollen wurde die Essigsäure gepuffert. Auch der onkolytische Effekt von Doxorubicin, einem Standardzytostatikum, wurde quantifiziert. Da das Chemotherapeutikum bereits im nanomolaren Bereich wirkt, 32 wurden hier geringere Konzentrationen gewählt: 5 µM, 4,588 µM, 3,59 µM, 2,5 µM, 1,25 µM, 625 nM, 312,5 nM, 156,25 nM, 78,125 nM, 39,0625 nM und 0 nM. Um Aussagen über die pharmakologische Interaktion der beiden Substanzen treffen zu können, wurden die Zellen zusätzlich mit beiden Substanzen inkubiert. Hierbei wurden Konzentrationen benutzt, die in Einzelversuchen die Zellproliferation um ca. 25 % einschränken. Diese Konzentrationen wurden anhand der erhaltenen Dosis-WirkungsKurve ermittelt. Für die kombinierte Proliferationshemmung durch [D]-K4H2L9 und Doxorubicin wurden folgende Werte eingesetzt: Die BFS-1 wt-Zellen wurden mit 6,1 µM [D]-K4H2L9 und 40 nM Doxorubicin inkubiert, die SW982-Zellen mit 1,6 µM [D]-K4H2L9 und 8 nM Doxorubicin und die HFB225-Zellen mit 7 µM [D]-K4H2L9 und 2,2 nM Doxorubicin. 3.2.4 In vivo-Versuch 3.2.4.1 Genehmigung Die Durchführung des Tierversuchs erfolgte gemäß des deutschen Tierschutzgesetzes (§7 ff. TierSchG) nach Genehmigung durch die Bezirksregierung Arnsberg (AZ: 8.8750.10.37.09.235). 3.2.4.2 Projektübersicht Um die Wirksamkeit des synthetischen Peptids im physiologischen Kontext, vor allem bei vorhandenem Immunsystem zu ermitteln, wurde ein syngenes Mausmodell angewandt. Dazu wurde 15 immunkompetenten C57BL/6–Mäusen nach einer einwöchigen Eingewöhnungszeit subkutan BFS-1 wt-Zellen injiziert. Sobald der Tumor eine durchschnittliche Größe von ca. 38 mm3 ± 35,02 mm3 erreicht hatte, startete die Behandlung mit dem synthetischen Host Defense Peptid oder mit PBS in der Kontrollgruppe. Die Substanzen wurden dreimal pro Woche über einen Zeitraum von drei Wochen intratumoral injiziert. Nach Ablauf der Therapieperiode erfolgte eine Beobachtungszeit von einer Woche, bevor die Tiere euthanasiert wurden. Während des gesamten Versuchs wurde das Futtergewicht, das Tiergewicht sowie die durch einen Messschieber bestimmte Tumorgröße und oberflächliches Nekrosenausmaß protokolliert. Die fotografische Dokumentation von sämtlichen Eingriffen erfolgte mit anliegendem Lineal und aufgetragener Rückennummer. Die Messungen sowie die therapeutischen Injektionen und die Rasur erfolgten stets in Narkose. Dazu wurden die Tiere unter eine Narkoseglocke gesetzt, die mit 5 Vol% 33 Isofluran und 3-4 l/min Sauerstoff geflutet wurde. Nach Einsetzen der Wirkung wurden die Mäuse mit einer Gesichtsmaske, die Mund und Nase umschloss, auf den Versuchsplatz gelegt. Über die Gesichtsmaske wurde die Narkose mit Hilfe von 1,5 Vol% Isofluran und 0,4-0,5 l/min Sauerstoff aufrechterhalten. Die Tiefe der Narkose konnte anhand der Atemfrequenz eingeschätzt und das Isofluran in einem Rahmen von 0,6-3 Vol% entsprechend angepasst werden. Bei schmerzhaften Eingriffen wie der Tumor- oder Peptidinjektion wurde zusätzlich 0,75-1 l/min Lachgas zugeflutet. Ein Austrocknen der Augen während der Narkose wurde mit Augensalbe verhindert. Nach diesem Narkoseschema erwachten die Tiere sehr schnell, sobald sie zurück in ihren Käfig waren. Um das Tumorwachstum besser fotografisch und metrisch verfolgen zu können, wurde die linke Seite der Mäuse zunächst mit einem elektrischen Rasierer rasiert und dann mit Veet-Enthaarungscreme enthaart. Letztere wirkte kurz ein und wurde dann zusammen mit den gebrochenen Haaren durch einen Spatel entfernt. Gründlich nachgereinigt wurde mit Wasser und Desinfektionsmittel um eine starke Hautreizung und Wunden zu vermeiden. Zur Berechnung des Tumorvolumens diente folgende Formel: V = π/6 x a x b x c (Sersa et al., 2010), wobei a der Länge, b der Breite und c der Höhe entsprach. Von Bedeutung war dabei das Einbeziehen der Höhe des Tumors, weil sich gerade zu Beginn des Versuchs die Tumorgröße von behandelten und nicht-behandelten Versuchstieren in der Höhe unterschied. Zehn Mäuse erhielten die Host Defense Peptid-Behandlung während fünf Tieren die Trägersubstanz PBS appliziert wurde. 3.2.4.3 Injektion der Tumorzellen Die BFS-1 wt-Zellen wurden mit Trypsin-EDTA-Lösung (5 ml/150 cm2) vom Boden der Kulturflaschen abgelöst, nachdem die Zellen dreimal mit PBS gewaschen wurden, um alte und zerstörte Zellen zu beseitigen. Die Ablösereaktion wurde nach 2-3 Minuten mit FCS-haltigem Medium gestoppt. Anschließend erfolgte bei Raumtemperatur ein Abzentrifugieren der Zellen bei 1400 rpm für 5 Minuten und ein Wiederlösen in PBS. Nachdem die Zellzahl mit Hilfe des CASY-Zellzählers ermittelt wurde, wurde die 34 benötigte Menge an Zellen, d.h. 5 x 105 Zellen pro Maus, in ein steriles 50 ml-Gefäß pipettiert und erneut abzentrifugiert. Das Pellet wurde in je 50 µl PBS pro Maus gelöst. Je 50 µl der Zellsuspension wurden zusammen mit je 50 µl Matrigel im Kühlraum in die Insulinspritzen aufgezogen, welche bis zur Injektion auf Eis gelagert wurden. Die dazu verwandten Pipettenspitzen und Insulinspritzen wurden vorher auf 4 ºC heruntergekühlt. Das Matrigel als gelatinöses proteinhaltiges Sekret muriner Sarkomzellen übernahm zunächst die Funktion einer extrazellulären Matrix. Es verfestigte sich, sobald es auf die Körpertemperatur der Tiere aufgewärmt war und erlaubte den lokalen Verbleib der Tumorzellen. Die Injektion erfolgte in oben beschriebener Narkose langsam sukutan in die linke Flanke. Die Haut wurde vorher desinfiziert. Das Ausbreitungsvolumen wurde mit dem Messschieber gemessen und der Eingriff fotografisch festgehalten. 3.2.4.4 Therapeutische Injektionen Als Dosis der Host Defense Peptid-Behandlung wurde 5 mg/kg gewählt; entsprechend in vivo durchgeführter Vorversuche im Forschungslabor der Plastischen Chirurgie des Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikums Bergmannsheil Bochum. Bei nun fast 30 g schweren Mäusen betrug die Dosis folglich 150 µg. Diese Menge wurde in einem Volumen von 50 µl injiziert. Dementsprechend wurde eine Peptidlösung für die Versuche angesetzt, die vor den Injektionen aufgetaut, gemischt und abzentrifugiert wurde. Das benötigte Volumen wurde in 1,5 ml-Reaktionsgefäße vorgelegt und in die sterilen Insulinspritzen aufgezogen. Für die Kontrollgruppe wurde die äquivalente Menge an PBS vorgelegt und ebenfalls aufgezogen. Diese Schritte erfolgten unter sterilen Bedingungen. Die Spritzen wurden bis zur intratumoralen Injektion auf Eis gelagert. 3.2.4.5 Euthanasie Der Versuch schloss mit der Finalisierung der Tiere. Diese wurden dazu wie beschrieben in Narkose versetzt und die Tumormaße, Körper- und Futtergewicht erneut festgehalten. Nach Atemstillstand durch reines Isofluran wurde zusätzlich eine zervikale Dislokation durchgeführt. Der Tumor wurde präpariert, entnommen, beschrieben, erneut gemessen und gewogen. Ein Teil des Tumors wurde wie Teile der Lunge, Haut, Leber und Milz in 5 % Formafix zur Herstellung von Paraffinschnitten konserviert. Ein zweiter Teil wurde wie Lunge und Haut in Kryoröhrchen durch Stickstoff 35 schockgefrostet, so dass dieses Gewebe zur RNA-Isolation und der folgenden Genexpressionsanalyse verwendet werden konnte. Der dritte Teil des Tumors wurde auf einem Korkplättchen in Kryo–Medium eingebettet und in flüssigem Stickstoff eingefroren, um die Option der Herstellung von Gefrierschnitten zu erhalten. Die Entnahme der Organe erfolgte nach Eröffnung des Bauchraums und des Brustkorbs. Indikationen für eine frühzeitige Euthanasie wären ein Gewichtsverlust von mehr als 20 Prozent, persistierende Schmerzen oder ein Tumordurchmesser größer als 20 mm gewesen. Diese Umstände traten jedoch nicht ein. Für die immunhistochemischen Untersuchungen stellte das Pathologische Institut des Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikums Bergmannsheil, Bochum, Paraffinschnitte von 2-3 µm Dicke aus Tumor- und Lungengewebe sowie der Haut her. Zur Übersicht wurde jeweils ein Schnitt pro Probe einer HE-Färbung unterzogen. 3.2.4 Immunhistochemie 3.2.4.1 Allgemeines Protokoll Zur Anfärbung der gewünschten Strukturen in den Tumor-Paraffinschnitten wurde immunhistochemisch mit zwei Methoden gearbeitet. Zum einen wurde der braune Farbstoff 3,3’-Diaminobenzidin (DAB) und zum anderen eine Floureszenzfärbung eingesetzt. Welche Strukturen gefärbt wurden, entschied sich durch den Einsatz der entsprechenden Antikörper, die folgend genannt werden. Alle Paraffinschnitte wurden zunächst für eine Stunde bei 70 ºC durch Hitze fixiert. Dann kühlten sie eine halbe Stunde bei Raumtemperatur ab. Die Deparaffinierung erfolgte durch Inkubation in Xylen für 2 x 5 Minuten und die Hydration in einer absteigenden Alkoholreihe, das heißt für je zwei Minuten in 100 %, 95 %, 70 %, 50 % Ethanol und MQ-Wasser. Proteinbindestellen wurden folgend in Antigendemaskierungslösung (Citrat-Puffer, pH 6) freigelegt, in welchem die Schnitte erst 10 Minuten lang in der Mikrowelle erhitzt wurden (ohne zu kochen) und dann 30 Minuten bei 4 ºC abkühlten. Wie nach jedem einzelnen der nachfolgenden Schritte erfolgte ein Waschen erst für eine und dann für vier Minuten in PBS. Bei einer DABFärbung, nicht aber bei einer Fluoreszenzfärbung, erfolgte nun ein Quenchen der endogenen Peroxidase-Aktivität in 3 % Wasserstoffperoxid-Lösung, um falsch positiven Anfärbungen durch DAB vorzubeugen. Für die DAB- und die Fluoreszenzfärbung wurden anschließend die unspezifischen Proteinbindestellen in den Tumorschnitten für 30 Minuten durch Serum geblockt. Da dieses entsprechend dem 36 Wirt des Zweitantikörpers gewählt wird, wurde in den beschriebenen Versuchen Ziegenserum (15 µl/ml PBST) verwendet. Erneut wurden die Schnitte gewaschen und für ebenfalls 30 Minuten mit dem Erstantikörper inkubiert. Es wurde stets eine Negativkontrolle mitgeführt, die mit PBS statt mit dem Erstantikörper während der 30 Minuten inkubiert wurde. Nach insgesamt fünf Minuten Waschen wurde für weitere 30 Minuten der Zweitantikörper spezifisch gegen den Wirt des Erstantikörpers auf das Tumorgewebe gegeben. Es folgte ein weiterer Waschschritt. Für die DAB-Färbung wurde wie folgt weitergearbeitet: Nach dem Protokoll des Herstellers wurde das ABC ELITE Reagenz eine halbe Stunde vor Gebrauch angesetzt (10 µl Reagenz A plus 1 ml PBST plus 10 µl Reagenz B) und die Schnitte dann für eine halbe Stunde mit diesem inkubiert. In diesem Schritt wurden die Zweitantikörper mit einer exogenen Peroxidase versehen, die das später zugegebene DAB farblich umsetzen kann. Während des folgenden Waschschrittes wurde kurz vor Gebrauch das ImmPACT DAB Substrat nach Herstellerempfehlung in einem mit Aluminiumfolie umwickelten Eppendorf-Gefäß angesetzt (1 Tropfen ImmPACT DAB Chromogen-Konzentrat auf 1 ml ImmPACT Verdünnungsmittel). Dieses wurde probeweise für wenige Minuten auf einen Schnitt gegeben. Nach kurzem Abwaschen des Substrates durch PBS wurde die Farbintensität unter dem Lichtmikroskop geprüft und nach Ermessen weitergefärbt. Nach Feststellen der optimalen Färbezeit wurden die restlichen Schnitte dementsprechend gefärbt. Die maximale Färbezeit betrug 30 Minuten. Nach fünfminütigem Waschen in PBS erfolgte eine Gegenfärbung und Nachbehandlung zur längerfristigen Qualitätssicherung der immunhistochemischen Färbung. Dazu wurden die Schnitte 30 Sekunden in Hämatoxylin-Lösung nach Mayer gefärbt und wurden dann unter laufendem Leitungswasser solange gespült, bis dieses farblos blieb. Zehnmal wurden die Tumorschnitte nun in 2 % Essigsäure (2 ml Eisessig plus 98 ml MQ-Wasser) und danach zehnmal in Leitungswasser getaucht. Nach einer Minute in Bläuungslösung (1,5 ml Ammoniak plus 98,5 ml 70 % Ethanol) verblieben die Schnitte noch eine Minute in Leitungswasser. Zum Entwässern erfolgte nun eine verkürzte aufsteigende Alkoholreihe von je 2 Minuten in 95 % und 100 % Ethanol. Der letzte Schritt bestand in fünfminütiger Xylene-Inkubation. Beim Eindecken mit Deckgläschen wurde Entellan als Medium verwendet. Bei der Fluoreszenzfärbung wurde anschließend an das Waschen zum Entfernen der Zweitantikörperlösung Streptavidin Alexa Fluor488® (10 µg/ml PBS) für eine halbe 37 Stunde auf das Tumorgewebe gegeben, welches an den biotinylierten Zweitantikörper binden konnte. Auch die Streptavidin-Lösung wurde durch PBS entfernt und eine Gegenfärbung der Zellkerne durch eine DAPI-Löung (300 ng/ml PBS) erfolgte. Zum Eindecken mit Deckgläschen wurde ein Floureszenz-Eindeckmedium verwendet. Die Schnitte wurden im Dunkeln bei 4 ºC aufbewahrt. 3.2.4.2 Ki67-Proliferationsaktivitätfärbung Zum Anfärben der sich in der Proliferation befindenden Zellen wurde der monoklonale Antikörper Anti-Ki67 gewählt, der in Kaninchen produziert wurde. Dieser markiert ein Antigen, das während aller Zellzyklusphasen außer in der G0-Phase im Zellkern exprimiert wird. So kann die Proliferationsaktivität genauer als durch eine MitosenAuszählung festgestellt werden (Ueda et al., 1989). Der Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:100 für die Fluoreszenzfärbung eingesetzt und in einer Verdünnung von 1:20 für die DAB-Färbung. DAB verblieb fünf Minuten auf den Tumorschnitten. 3.2.4.3 CD31-Blutgefäßfärbung Für die Anfärbung der Blutgefäße mittels des Antikörpers Anti-CD31 aus dem Wirt Ratte wurde auch die DAB-Färbung angewandt. Die Färbezeit mit DAB betrug drei Minuten. Bei CD31 handelt es sich um ein integrales Membranprotein, welches konstitutiv auf der Oberfläche von Endothelzellen exprimiert wird und ein Bestandteil der Zellkontakte im Endothelzellverband ist. Ein Synonym ist PECAM-1 (engl.: Platelet endothelial cell adhesion molecule; übersetzt in etwa: Plättchen-endothelialesZelladhäsionsmolekül), welches darauf hinweist, dass dieses Molekül auch von Thrombozyten und darüber hinaus auch von Monozyten und Neutrophilen exprimiert wird (Newman, 1997). 3.2.4.4 CD3-T-Zellfärbung Die T-Zellen wurden immunhistochemisch über das Oberflächenprotein CD3 gekennzeichnet. Verwendet wurde hierfür der monoklonale Antikörper Anti-CD3, der in der Ratte synthetisiert wurde. Die Färbezeit mit DAB betrug sechs Minuten. 3.2.4.5 F4/80-Makrophagenfärbung Auch zur Anfärbung der Makrophagen wurde DAB verwendet. Einzelne Schritte bzw. deren Reihenfolge wichen vom allgemeinen Protokoll ab: 38 Im Unterschied zu dem oben beschriebenen Protokoll wurde hier nach Herstellerempfehlung Proteinase K-Lösung zur Demaskierung der Antigene anstelle des High-Temperature-Antigen-Retrievals mit Citratpuffer verwendet. Um diese herzustellen, wurde zunächst eine Proteinase K-Stammlösung aus 0,016 g Proteinase K (30 units/mg) und jeweils 20 ml TE-Kalziumchloridpuffer und Glycerol hergestellt. Diese Stammlösung wurde bei -20 ºC aufbewahrt. Die Arbeitslösung, mit der die Tumorschnitte nun einzeln zur Antigendemaskierung inkubiert wurden, setzte sich aus 1 ml der Proteinase K-Stammlösung und aus 19 ml des TE-Kalziumchloridpuffers zusammen und wurde bei 4 ºC aufbewahrt. Die Inkubation der Tumorschnitte fand für 20 Minuten bei 37 ºC statt und es folgte eine Abkühlungsphase bei Raumtemperatur von 10 Minuten. Nach einem Waschschritt und der Ziegenseruminkubation (siehe oben) folgte die 60-minütige Inkubation mit dem monoklonalen Erstantikörper Anti-F4/80, der in der Ratte produziert wurde. Dieser bindet an das F4/80-Glykoprotein, welches sich auf der Oberfläche von murinen Makrophagen befindet (Schaller et al., 2002). Hiernach erfolgte das Quenchen der Endogenen Peroxidase-Aktivität und nach der Inkubation mit dem Zweitantikörper Anti-Ratte in Ziege erfolgte die Färbung nach dem allgemeinen Protokoll (Abschnitt 3.2.4.1). Die 3,3’-Diaminobenzidin-Lösung verblieb für eineinhalb Minuten auf den Tumorschnitten. 3.2.4.6 Auswertung der immunhistochemischen Färbungen Nach der immunhistochemischen Färbung der Schnitte wurde die Negativkontrolle überprüft. Folgend wurden von je drei Personen die Antigen-positiven Strukturen in je zehn Sichtfeldern pro geblindetem Tumorschnitt ausgezählt. Nekroseareale, die durch die Hämatoxylin- oder DAPI-Gegenfärbung gut sichtbar waren, wurden beim Auszählen ausgespart. Die Makrophagen wurden bei einer 1000-fachen Vergrößerung und die anderen Strukturen bei einer 400-fachen Vergrößerung ausgezählt. Pro Behandlungsgruppe wurden je fünf Tumore immunhistochemisch analysiert. 3.2.5 Genexpressionsanalyse 3.2.5.1 RNA-Isolation Die RNA-Isolation erfolgte mittels des RNeasy Mini Kits und die Durchführung orientierte sich an dem vom Hersteller beigefügten Protokoll zur RNA-Isolation aus Tiergewebe. Nur wenige Arbeitsschritte wichen von diesem ab. 39 Es wurden etwa 30 mg Tumorgewebe in 600 µl RLT-Puffer mittels eines PolytronHomogenisators zerkleinert. Der Homogenisatoraufsatz wurde zwischen dem Homogenisieren der einzelnen Proben nacheinander in 20 ml MQ-Wasser, zweimal in 20 ml 70 % Ethanol, in 20 ml Natronlauge-EDTA-Lösung (0,1 M NaOH, 1 mM EDTA) und zweimal in 30 ml MQ-Wasser gereinigt. Anschließend wurde den Proben 290 µl MQ-Wasser und 10 µl Proteinase K-Lösung zugegeben, um das restliche inhomogene Gewebe für 10 Minuten bei 55 ºC enzymatisch zu verdauen. Nach dreiminütigem Abzentrifugieren der dann noch vorhandenen Gewebereste bei 10.000 rpm wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und um sein halbes Volumen durch 100 %-igen Ethanol erweitert. Nach vorsichtigem Mischen durch auf- und abpippetieren wurden die Proben schrittweise auf Rneasy-Mini-Säulen pippetiert, die sich in einem 2 ml-Auffangröhrchen befanden. In diese hinein wurde die Flüssigkeit durch die Silikagel-Membran der Rneasy-Mini-Säule in 15 Sekunden bei 8.000 rpm abzentrifugiert. Die aufgefangene Flüssigkeit wurde verworfen. Nun wurden 350 µl RW1-Puffer auf die Rneasy-Mini-Säulen gegeben. Auch dieser wurde nach dem beschriebenen Abzentrifugieren in die Auffangröhrchen verworfen. Zum DNase-Verdau zum Entfernen von Kontaminationen durch DNA wurde das RNase-freie DNase-Set eingesetzt. So wurde auf jede Silikagel-Membran der Rneasy-Mini-Säulen ein Gemisch aus 10 µl DNase I-Stammlösung und 70 µl RDD-Puffer gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten wurden erneut 350 µl RW1-Puffer in die Säulen pippetiert, in die Auffangröhrchen abzentrifugiert und verworfen. Anschließend wurden die RNeasy-Mini-Säulen in neue Auffangröhrchen umgesetzt. Es wurden nun 500 µl RPE-Puffer in die Säulen pippetiert und durch beschriebenes Abzentrifugieren wurden die Membranen gewaschen. Das Zentrifugat wurde abermals verworfen. Nach dem der Waschschritt wiederholt wurde, wurde die Silikagel-Membran durch zweiminütiges Zentrifugieren bei maximaler Geschwindigkeit getrocknet. Zum Schluss wurden die Mini-Säulen in RNase-freie 1,5 ml-Reaktionsgefäße gestellt und die RNA in 30 µl RNase-freiem Wasser aus der Membran gelöst. Das Wasser verblieb für zwei Minuten in der Säule bevor es bei maximaler Geschwindigkeit über eine Minute in die Reaktionsgefäße abzentrifugiert wurde. Die RNA-Konzentration in den Lösungen wurde mit Hilfe einer 1:50-Verdünnung im Photometer unter Verwendung UV-Lichtdurchlässiger Küvetten und Licht einer Wellenlänge von 230 nm bestimmt. Zum Isolieren der RNA aus den BFS-1 wt-Zellen wurde auch das RNeasy Mini Kit verwendet. Die RNA wurde nach dem Hersteller-Protokoll zur Isolierung der RNA aus 40 Tierzellen mit Durchführung des optionalen DNase-Verdaus vollzogen. Zunächst wurden 400.000 Zellen in 2 ml ihres Mediums in eine Kammer einer Sechs-Well-Platte ausgesät. Am nächsten Tag wurden sie nach Absaugen des Mediums mit 350µl des 1:100 verdünnten β-Mercaptoethanols in RLT-Puffer vom Boden der Kammer abgelöst. Die Zellmembranen wurden aufgelöst und durch fünfmaliges auf- und abpipettieren mit einer 1 ml-Pipette wurde die Suspension homogenisiert. Überführt in ein EppendorfGefäß wurden 350 µl 70 %-iger Ethanol hinzugefügt. Die Probe wurde nun auf die RNeasy-Mini-Säule pipettiert und die RNA-Isolation erfolgte ab diesem Schritt entsprechend der Isolation der RNA aus Tiergewebe. 3.2.5.2 cDNA-Synthese Die cDNA-Synthese erfolgte aus der isolierten RNA mittels Transkriptor ErststrangcDNA-Synthese-Kit nach Angabe des Herstellers. Verwendung fand hierbei das Protokoll für eine Zwei-Schritt-RT-PCR. Zunächst wurden für die Matrizen-Lösungen 1 µg RNA der Probe, 1 µl Oligo(dT)18-Primer und 2 µl Random-Hexamer-Primer zusammengefügt. Durch PCR-geeignetes Wasser wurden die Ansätze auf ein Volumen von 13 µl erweitert. Zur Denaturierung wurden die Proben für zehn Minuten auf einen Hitzeblock bei 65 ºC platziert und anschließend auf Eis gekühlt. Pro Probe wurden anschließend 4 µl des RNase Inhibitor-Ansatzes, Reversen Transkriptase-Reaktions-Puffers, 0,5 µl des 2 µl 0,5 µl des des Deoxynukleotid-Mixes und Reversen Transkriptase-Ansatzes hinzugefügt. Durch ein kurzes Zentrifugieren nach kurzem auf- und abpipettieren wurden alle Komponenten am Gefäßboden gesammelt. Zur cDNA-Synthese wurden die Proben für 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann für eine halbe Stunde bei 55 ºC inkubiert. Die Reverse Transkriptase wurde dann bei einer fünfminütigen Inkubation bei 85 ºC inaktiviert. Die synthetisierte cDNA wurde anschließend auf Eis gekühlt und bei -20 ºC aufbewahrt. 3.2.5.3 Real-time-PCR Zur Analyse der Genexpression in den Tumoren wurde ein LightCycler 480 II und das Universal Probe Library-System der Firma Roche verwendet. Hierbei arbeitet man mit sogenannten Hydrolyse-Sonden und macht sich die 5’-3’-Exonuklease-Aktivität der Polymerase zu Nutze. Jede Sonde verfügt über einen Fluoreszenfarbstoff (FAM) und einen dunklen Quencher (Löschsubstanz), der in räumlicher Nähe zum Fluoreszenzfarbstoff dessen Lichtemission verhindert. Kommt es zu einer Anlagerung 41 von Primer und Sonde an die cDNA, so füllt die Polymerase den Gegenstrang mit passenden Desoxynukleosidtriphosphaten auf und baut gleichzeitig die angelagerte Sonde ab, so dass es zu einer räumlichen Trennung von Quencher und Fluorophor kommt und ein Fluoreszenzsignal detektiert werden kann. Die Menge des Amplifikates korreliert somit mit der Zunahme des Fluoreszenzsignals, welche in Echtzeit mitverfolgt werden kann. Die Spezifität der PCR ergibt sich aus der Kombination von Sonde und Primern. Die Expression folgender Gene wurde quantifiziert: IFN-γ, IGFbp-3, IL-12, IL-16, IP10, MCP-1, MIG und NOV. Die verwendeten Primer und Sonden sind in der Tabelle 3.1 aufgeführt. In 96-well-Platten wurden die verschiedenen Reagenzien zur Analyse der Genexpression pro well wie folgt angesetzt: 7,4 µl Wasser, je 0,2 µl des VorwärtsPrimer, des Rückwärts-Primer und der Sonde und 10 µl des Probes Master®. Der Probes Master enthielt die Polymerase, die Desoxyribonukleotidtriphosphate und Magnesiumchlorid. Es wurden pro Ansatz je 2 µl der entsprechenden cDNA hinzugefügt. Der Negativkontrolle wurde anstelle von cDNA 2 µl Wasser zugesetzt. Die Amplifikation der spezifischen DNA-Abschnitte geschah durch Anwendung des folgenden PCR-Programmes: Nach einer 10-minütigen Hitzeaktivierung der TaqPolymerase bei 95 ºC erfolgten je 50 Zyklen bestehend aus 10 Sekunden 95 ºC, 30 Sekunden 60 ºC, eine Sekunde 72 ºC und zuletzt wurden die Proben auf 40 ºC herabgekühlt. Die Genexpression in den einzelnen Tumoren wurde im Triplikat gemessen, pro Behandlungsgruppe wurden fünf Tumore analysiert. Die Auswertung erfolgte durch die LightCycler-Software unter Berücksichtigung der sogenannten Crossing Points der einzelnen Proben und unter Anwendung der 2. Ableitung. Jede Messung wurde auf das Haushaltsgen 18SrRNA der Probe normalisiert, um etwaige initiale Konzentrationsunterschiede zu berichtigen. Die Expression der Zytokine IFN-γ, IP-10 und MIG, die in den Peptid-behandelten Tumoren stärker exprimiert wurden, wurde auch in der cDNA in vitro-kultivierter BFS-1 wt-Zellen im Triplikat gemessen, um auszuschließen, dass die Expression der Zytokine in den Tumoren nicht allein auf die Tumorzellen zurückzuführen ist. 3.2.5.4 Gel-Elektrophorese Zur Darstellung der spezifischen Amplifikation der gefragten cDNA-Sequenzen durch die Verwendung von Primer und Sonden wurde eine Gel-Elektrophorese durchgeführt. 42 Dazu wurde zunächst ein Gel vorbereitet: 0,5 g Agarose wurden in 1 ml 50-fachem TAE-Puffer und 49 ml MQ-Wasser in der Mikrowelle erhitzt, bis sich die Agarose vollständig gelöst hatte. Dann wurde 5 µl Gelstar®, ein Farbstoff, der zwischen die Basenpaare der DNA interkaliert und mittels UV-Licht angeregt und lokalisierbar wird, zugefügt. Das Gesamtvolumen des Ansatzes wurde mit MQ-Wasser wieder auf 50 ml aufgefüllt. Das Gel wurde in eine Kammer mit einem Gelkamm für 15 Geltaschen gegossen und polymerisierte in 30 Minuten. Es wurde nun in die GelElektrophoresekammer gelegt und vollständig mit TAE-Puffer bedeckt. Je 4 µl des 6fachen Probenpuffers wurden zu den 20 µl der PCR-Ansätze nach Ablauf der Polymerase-Kettenreaktion pipettiert. Hiervon wurden dann 3 µl in eine Geltasche überführt. Von einem Basenpaar-Marker (0,1 µg/µl) wurden 5 µl in eine Geltasche überführt. Nach Anlegen einer elektrischen Spannung (100 V (konstant), 200 mA, 40 W, 45 Minuten) wanderten die negativ geladenen DNA-Moleküle in Richtung der positiv geladenen Anode und wurden so nach Größe aufgetrennt. Auf diese Weise wurde die Entstehung verschiedener Amplikons in den PCR-Ansätzen analysiert. Es wurden jeweils eine Probe und deren Negativkontrolle pro Primer-Sonden-Kombination untersucht. Die Banden im Gel wurden mit einem Kodak Imager 4000MM aufgenommen und sichtbar gemacht. 43 4 Ergebnisse 4.1 Wirkung des Peptids [D]-K4H2L9 in in vitro-Studien 4.1.1 Hemmung der Zellproliferation Die Zellproliferation der verschiedenen Tumorzellen nach Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen des Host Defense Peptids [D]-K4H2L9 wurde anhand eines BrdUAssays gemessen. Es wurden die eingebauten Thymidin-Analoga quantifiziert, die nach Zugabe des HDPs entsprechend der Zellproliferationsaktivität in das genetische Material der Zellen eingebaut wurden. Die verwendeten Konzentrationen des Peptids lagen zwischen 0-100 µM. Wie in den folgenden Versuchen wurde die humane Synovialsarkomzelllinie SW982, die murine Fibrosarkomzelllinie BFS-1 und die humanen Fibroblasten HFB als Kontrollzellen eingesetzt. Abb. 4.1 Bestimmung der antiproliferativen Aktivität des Peptids [D]-K4H2L9. Die Zellproliferationsrate wurde durch die Quantifizierung derThymidin-Analoga gemessen, die während der Replikation in die DNA der Zellen eingebaut wurden. Die als Kontrollzellen dienenden Fibroblasten werden im Gegensatz zu den entarteten Zelllinien in rot dargestellt. Bei geringen Konzentrationen unter 10 µM wurde teilweise ein Anstieg der Zellproliferation beobachtet, die dann bei weiter ansteigenden Konzentrationen abfiel (Abb. 4.1). Die SW982-Zellen zeigten mit steigender [D]-K4H2L9-Konzentration einen langsamen, aber stetigen Abfall der Zellproliferation. Es wurde eine maximale Hemmung der Zellproliferation von 89,52 % erreicht. Signifikant wurde die Hemmung ab einer Konzentration von 25 µM [D]-K4H2L9 (p<0,05). 44 Die BFS-1-Zellen reagierten währenddessen zunächst mit einem Anstieg der Zellproliferation, die dann aber exponentiell abnahm. Ab einer Konzentration von 12,5 µM wurde die Proliferation der BFS-1-Zellen um 95 % gehemmt. Im Vergleich dazu wurde die Proliferation der HFB-Zellen weniger konstant gehemmt. Nach einem kurzen Anstieg der Replikationsrate um 109,8 % fiel diese zunächst auf 5 % der anfänglichen Zellproliferation bei einer Peptidkonzentration von 12,5 µM ab und befand sich bei weiter steigender Konzentration bei 33,09 %. Im Vergleich zu den anderen Zelllinien ist bei den HFB-Zellen das Konzentrationsintervall des Wirkoptimums sehr klein. Der Zellproliferationsanstieg war bei den BFS-1-Zellen und den HFB-Zellen ab einer Konzentration von 3,125 µM signifikant (p<0,05) und der folgende Proliferationsabfall ab einer Konzentration von 12,5 µM (p<0,01). 4.1.2 Nachweis der spezifischen Wirkung durch [D]-K4H2L9 Um nachzuweisen, dass das Peptid [D]-K4H2L9 eine spezifische onkolytische Wirkung hat, die auf seine spezifische Struktur und auf die D-konfigurierten Aminosäuren zurückzuführen ist, wurde ein Scrambled Peptid eingesetzt. Hierbei handelt es sich auch um ein 15-mer Peptid bestehend aus den drei gleichen Aminosäuren wie [D]-K4H2L9 allerdings mit einer anderen Sequenz und ohne D-konfigurierte Aminosäuren (Abschnitt 3.1.8). Das Scrambled Peptid scP-K3H3L9 wurde in genau den gleichen Konzentrationen zu den drei Zelltypen gegeben wie vorher [D]-K4H2L9 und eine antiproliferative Wirkung mit einem BrdU-Assay untersucht. Es zeigte sich keine Hemmung der Zellproliferation, sondern eher eine Stimulation dieser. Bei geringen Konzentrationen zeigte sich die stärkste Stimulation der Zellproliferation. Sie stieg bei den BFS-1- und den HFB-Zellen um mehr als 100 % bei einer Peptidkonzentration von 6,25 µM. Weiterhin ließ sich für diese Zellen keine Relation zwischen Peptidkonzentration und Zellproliferationsrate erkennen, da diese scheinbar unabhängig von der Konzentration variierte. Bei den mit scP-K3H3L9 inkubierten Zellproliferationsrate als BSF-1-Zellen in der wurde Kontrolle einmalig beobachtet. Sie eine lag niedrigere bei einer Peptidkonzentration von 62,5 µM bei 85,9 % der Ausgangsproliferationsrate. Die SW982-Zellen erreichten eine maximale Steigerung der Zellproliferation auf 160,1 % bei einer Peptidkonzentration von 3,125 µM, danach fiel die Zellproliferationsrate ab 45 und erreichte bei 100 µM eine geminderte Zellproliferationsrate von 87 % der Ausgangsproliferationsrate (Abb. 4.2). Die Steigerung der Zellproliferationsrate erreichte bei den HFB-Zellen und den SW982Zellen im Konzentrationsintervall von 3,125-6,25µM ein signifikantes Niveau (p<0,05). Bei den BFS-1-Zellen wurde eine signifikante Erhöhung der Zellproliferationsrate erst bei höheren scP-K3H3L9-Konzentrationen von 62,5-100 µM erreicht (p<0,05). Abb. 4.2 Bestimmung der antiproliferativen Aktivität des Peptids scP-K3H3L9. Der BrdUZellproliferationsassay wurde mit dem Vergleichspeptid durchgeführt, welches keine Aminosäuren der D-Konfiguration enthält. Die als Kontrollzellen dienenden Fibroblasten werden im Gegensatz zu den entarteten Zelllinien in rot dargestellt. 4.1.3 Hemmung der Zellproliferation durch Doxorubicin Das Chemotherapeutikum Doxorubicin ist eines der wirksamsten Chemotherapeutika im Einsatz gegen die Weichteilsarkome. Aber selbst dessen Wirksamkeit ist stark begrenzt mit einer Ansprechrate von etwa 20-26 % (Lehnhardt et al., 2005). Für die SW982-, BFS-1- und HFB-Zellen wurde eine Dosis-Wirkungskurve für Doxorubicin ermittelt. Auf Grund der starken zytotoxischen Wirkung wurde diese für die Konzentrationen von 0-5 µM erstellt. Die Zellproliferationsraten von den SW982und den BFS-1-Zellen zeigten bei steigender Wirkstoffkonzentration einen rapiden exponentiellen Abfall. Die Proliferation der SW982-Zellen wurde ab einer Konzentration von 0,625 µM um 99,59 % eingeschränkt. Die BFS-1-Zellen zeigten ab einer Konzentration von 2,5 µM Doxorubicin keine Proliferation mehr. Die 46 Einschränkung der Proliferation der humanen Fibroblasten (HFB) schwankte ab einer Doxorubicin-Konzentration von 0,15625 µM um -89,05 % (Abb. 4.3). Die Hemmung der Zellproliferation wurde spätestens ab einer Doxorubicinkonzentration von 156,25 nM hoch signifikant (p<0,01). Abb. 4.3 Bestimmung der antiproliferativen Aktivität des Zytostatikums Doxorubicin. Die Menge der in die DNA eingebauten Thymidin-Analoga entspricht der Proliferationsaktivität der Zelllinien. Sie wurde nach einer Inkubation mit verschiedenen Doxorubicin-Konzentrationen gemessen. Die als Kontrollzellen dienenden Fibroblasten werden im Gegensatz zu den entarteten Zelllinien in rot dargestellt. 4.1.4 Kombination von [D]-K4H2L9 mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin Eine effektive Kombinationstherapie von [D]-K4H2L9 mit einem Chemotherapeutikum würde mit einer einhergehenden Dosisreduktion beider Substanzen zum einen die Therapiekosten durch verringerten HDP-Bedarf senken und zum anderen das Ausmaß der Nebenwirkungen beider Wirkstoffe reduzieren. In diesem Versuch wurden [D]K4H2L9- und Doxorubicin-Konzentrationen eingesetzt, die die Zellproliferation einzeln angewandt um ca. 25 % einschränken. Bei den BSF-1-Zellen reduzierten 6,1 µM [D]-K4H2L9 die Zellproliferation um 25,77 % und 40 nM Doxorubicin die Zellproliferation um 16,77 %. Die Kombination der Substanzen in diesen Konzentrationen zeigte eine Hemmung der Zellproliferationsrate um 92,93 %. Die Proliferation der SW982-Zellen wurde durch 1,6 µM [D]-K4H2L9 um 47 17,89 % gehemmt Kombinationstherapie und durch bewirkte 8 nM eine Doxorubicin Hemmung um um 28,84 %. 59,62 %. Die Eine Kombinationstherapie der gesunden humanen Fibroblasten bewirkte durch eine Inkubation der HFB-Zellen mit 7 µM [D]-K4H2L9, welches einzeln angewandt eine Hemmung der Proliferation um 15,76 % erreichte, und zusätzlich mit 2,2 nM Doxorubicin, welches einzeln angewandt eine Hemmung von 31,45 % erreichte, eine Hemmung der Proliferation von insgesamt 38,62 % (Abb. 4.4). Abb. 4.4 Bestimmung des antiproliferativen Effekts bei der Kombination von [D]-K4H2L9 und Doxorubicin. [D]-K4H2L9 und Doxorubicin wurden gemeinsam zu den Versuchzellen hinzugegeben, in Konzentrationen, die einzeln etwa eine 25 %ige Hemmung der Zellproliferationsrate bewirken. Die Ermittlung der Proliferationsrate erfolgte durch die Quantifizierung der eingebauten Thymidin-Analoga in der DNA. 4.2 Wirksamkeit des Peptids [D]-K4H2L9 im syngenen Tiermodell Um die Wirkung des Peptids in vivo zu untersuchen wurde ein immunkompetentes Modell gewählt, da in diesem Fall auch Interaktionen des Peptids mit dem Immunsystem beurteilt werden können. Die subkutanen BFS-1-Tumoren wurden ab einem Volumen von 38 mm3 ± 35,02 mm3 dreimal pro Woche über drei Wochen intratumoral mit 5 mg/kg [D]-K4H2L9 (n=10) oder mit dem entsprechenden Volumen PBS (n=5) behandelt. Nach einer weiteren Beobachtungswoche wurden die Tumore entnommen. Die mit [D]-K4H2L9 behandelten Tumore zeigten ein langsameres 48 Wachstum gegenüber den Tumoren der Kontrollgruppe. Der Unterschied zwischen den durchschnittlichen Tumorgrößen der beiden Gruppen wurde bereits ab dem dritten Behandlungstag signifikant (p<0,05) und erreichte vom vierten bis zum letzten Behandlungstag eine hohe Signifikanz (p<0,01). Am fünften Behandlungstag zeigten sich abweichend davon noch einmal signifikant (p<0,05) unterschiedliche Tumorgrößen. Die nicht therapierten Tumore waren am letzten Behandlungstag mit einem durchschnittlichen Volumen von 422 mm3 mehr als doppelt so groß wie die behandelten Tumore mit 204 mm3. Nach dem Absetzen der Therapie wuchsen allerdings auch die mit [D]-K4H2L9 behandelten Tumore wieder schneller, so dass ihr Volumen von 623 mm3 zu Versuchsende zwei Dritteln des durchschnittlichen Volumens der nicht behandelten Tumore entsprach, welches 974 mm3 betrug (Abb. 4.5). Auch das Gewicht der schließlich entnommenen Tumore unterschied sich mit 0,60 g der Behandlungsgruppe zu 1,16 g der Kontrollgruppe signifikant (p<0,05) (Abb. 4.6). Abb. 4.5 Hemmung des Tumorwachstums in vivo durch die Therapie mit [D]-K4H2L9. Ab einem durchschnittlichen Tumorvolumen von 38,11 mm3 ± 35,02 mm3 wurde den C57BL/6-Mäusen 9 Dosen à 150 µg [D]-K4H2L9 in 50 µl PBS intratumoral verabreicht (n=10) bzw. der Kontrollgruppe (n=5) nur das entsprechende Volumen PBS. An die neunte und letzte Injektion(→) schloss sich eine Beobachtungswoche an. Signifikante (*, p<0,05) beziehungsweise hoch signifikante Unterschiede der Tumorgröße (**, p<0,01) sind im Graphen gekennzeichnet. 49 Abb. 4.6 Tumorgewicht eine Woche nach Therapieende. Nach Abschluss der Therapie wurde das Tumorwachstum noch eine Woche in vivo beobachtet. Anschließend wurde der Tumor entnommen und gewogen. Die Tumore der Kontrollgruppe (n=5) erwiesen sich als signifikant (*, p<0,05) schwerer als die behandelten Tumore (n=10). Während der etwa fünfwöchigen Versuchszeit wurden bei den Tieren weder Schmerzen noch Kachexie oder andere auffällige Unverträglichkeiten des Peptids beobachtet. Makroskopisch auffällig war ein größeres Nekrosenausmaß in den mit dem Host Defense Peptid behandelten Tumoren, das heißt es wurden in 90 % der Fälle nekrotische Ulzera beobachtet, die teilweise bis tief in den Tumor reichten. In der Kontrollgruppe wurden hingegen nur in 20 % kleine Erosionen am Tumor sichtbar (Abb. 4.7). Die Tumore, denen nur PBS verabreicht wurde, zeigten bei der Entnahme makroskopisch ein gut entwickeltes Gefäßsystem, während dies nur bei 30 % der mit Peptid behandelten Tumore zutraf. Makroskopisch erreichte die [D]-K4H2L9-Therapie in 30 % eine Komplettremission. In diesen Fällen war nur noch fibrotisches Narbengewebe bei der Tumorexzision erkennbar. In weiteren 10 % war bei der Probenentnahme makroskopisch von nur noch sehr wenig Tumorgewebe auszugehen. Histologisch konnte nach Anfertigen serieller Schnitte eine Komplettremission bei 20 % der behandelten Mäuse bestätigt werden. Bei der Organentnahme und bei anschließender histologischer Untersuchung von Lunge und Leber konnten keine soliden Metastasen festgestellt werden (Abb. 4.8). Die BFS-1Tumore zeichneten sich durch einen sehr lockeren Zellverband aus. Eindrücklich war auch die gute Abgrenzbarkeit der Tumore zu dem umgebenden Bindegewebe durch die für die Sarkome typische Pseudokapsel. 50 Abb. 4.7 Bilder der Veränderung der Tumorgröße. Ab der subkutanen Injektion muriner Fibrosarkomzellen (BFS-1 wt) in die linke Flanke der C57BL/6-Mäuse fand eine fotografische Dokumentation des Wachstumsverlaufs der Tumore statt. Gezeigt werden Bilder, die bei Beginn und bei Abschluss der Therapie mit dem HDP [D]-K4H2L9 beziehungsweise mit der Trägersubstanz PBS (Kontrollgruppe) aufgenommen wurden sowie histologische Querschnitte der entnommenen Tumore in der HE-Färbung. Die Vergleichbarkeit der Größenverhältnisse der Querschnitte wird durch die gleichlangen schwarzen Balken gewährt. Die histologische Analyse der Schnitte des Tumor 15 zeigten kein solides Tumorgewebe, sondern nur Kutis, Subkutis und Haarfollikel. Die zugehörigen Wachstumskurven der dargestellten Tumore sind in Abb. 4.9 entsprechend gekennzeichnet. 51 Abb. 4.8 Serielle Lungenschnitte. In den seriellen Lungenschnitten ließen sich keine soliden Metastasen beobachten. Der Maßstab entspricht 100 µm. Abb. 4.9 Wachstumskurven der einzelnen Tumore der Therapie- und der Kontrollgruppe. Logarithmische Auftragung des Wachstums der einzelnen Tumore zur besseren Einsicht der Volumenunterschiede zu Beginn des Versuchs. Die Verabreichung des HDPs beziehungsweise der Trägersubstanz erfolgte von Tag 0 bis zu Tag 19. Die Darstellung des Wachstums erfolgt hier zur besseren Übersicht nur bei Volumina im Bereich von 10-1000 mm3. Die Wachstumskurven der Tumore, deren Bilder in der Abb. 4.7 gezeigt werden, sind hier mit einem gleichfarbigem Pfeil und der Rückennummer der Tiere gekennzeichnet. 52 Bei Betrachtung der einzelnen Wachstumskurven fällt nach Abbau des Matrigels und dem damit verbundenen Abfall des Tumorvolumens zu Beginn auf, dass sich Perioden mit schnellem Wachstum mit Perioden mit langsamen Wachstum abwechseln. Bei den Tumoren der Peptidbehandlung verringerte sich das Volumen intermittierend oder gegen Ende des Versuches auch teilweise stetig. Die einzelnen Kurven zeigen, dass weder das Startvolumen noch die Wachstumsgeschwindigkeit vor der Therapie mit dem Therapieerfolg korrelieren (Abb. 4.9). 53 4.3 Histologische Beobachtungen in den Tumoren nach [D]-K4H2L9Therapie 4.3.1 Hemmung der Proliferation in vivo Mit der Ki67-Anfärbung wurden alle Zellen in den Tumorschnitten markiert, die sich nicht im G0-Stadium befanden, um die Proliferationsrate in den Tumoren festzustellen. In den [D]-K4H2L9-Tumoren befanden sich durchschnittlich 70,18 Ki67-positive Zellen pro Sichtfeld in der 400-fachen Vergrößerung und in der Kontrollgruppe 83,09 (Abb. 4.10). So ist eine Woche nach Therapieende ein antiproliferativer Effekt des Peptids festzustellen, der allerdings nicht signifikant ist (p≈0,42). Abb. 4.10 Immunhistochemische Anfärbung proliferierender Zellen im Tumorgewebe. Mit Hilfe eines Anti-Ki67-Antikörpers wurden alle sich proliferierenden Zellen markiert. Ihre Zellkerne sind in den repräsentativen Bildern braun angefärbt. Die Quantifizierung fand in 400-facher Vergrößerung statt. Der Maßstab in den histologischen Bildern entspricht 50 µm. 54 4.3.2 Hemmung der Angiogenese Mit der CD31 Anfärbung wurden die Endothelzellen in den Tumorschnitten gekennzeichnet. Schließlich wurden die Gefäßanschnitte pro Sichtfeld in 400-facher Vergrößerung gezählt. Die nicht behandelten Tumore wiesen dabei konstant höhere Werte und damit hoch signifikant (p<0,01) mehr Gefäßanschnitte (23,44) auf als die behandelten Tumore (18,48) (Abb. 4.11). Diese sich hier manifestierende antiangiogenetische Wirkung von [D]-K4H2L9 entspricht der makroskopischen Beobachtung, die bei der Tumorentnahme stattfand. Abb. 4.11 Immunhistochemische Anfärbung der Gefäßanschnitte im Tumorgewebe. Die Gefäßanschnitte wurden durch einen Anti-CD31-Antikörper, der an die Endothelzellen bindet, markiert. Sie sind hier braun dargestellt. Der Unterschied in der Gefäßanzahl zwischen den beiden Gruppen erreichte ein hoch signifikantes (**, p<0,01) Niveau. Der Maßstab in den histologischen Bildern entspricht 50 µm. 55 4.3.3 Rekrutierung von T-Zellen Die T-Zellen wurden über das Oberflächenmolekül CD3 angefärbt. Erfasst wurden so unter anderem CD8-positive zytotoxische T-Zellen und CD4-positive T-Helferzellen. Die Auswertung der Anzahl der CD3-positiven Zellen pro Sichtfeld in der 400-fachen Vergrößerung ergab durchschnittlich 74,45 T-Zellen pro Sichtfeld in den Tumorschnitten der behandelten Tumore und nur 37,75 T-Zellen pro Sichtfeld in der Kontrollgruppe. Dieser Unterschied ist hoch signifikant (p<0,0000001) (Abb. 4.12). Abb. 4.12 Immunhistochemischer Nachweis von T-Zellen im Tumorgewebe. Die über das Oberflächenmolekül CD3 markierten T-Zellen werden hier in braun dargestellt. Der Unterschied der TZellzahl zwischen den beiden Versuchsgruppen erreichte ein hoch signifikantes (**, p<0,001) Niveau. Der Maßstab in den 400-fach vergrößerten histologischen Bildern entspricht 50 µm und der Maßstab in den 1000-fach vergrößerten Ausschnitten 20 µm. 4.3.4 Rekrutierung von Makrophagen Die F4/80-Färbung markiert die murinen Makrophagen über das gleichnamige Glykoprotein. Die Auszählung der Makrophagenzahl erfolgte hier in einer 1000-fachen Vergrößerung. Die verstärkte Migration der murinen Makrophagen in das Tumorgewebe nach der Therapie mit [D]-K4H2L9 erfolgte hoch signifikant (p<0,001). 56 So waren in den behandelten Tumoren durchschnittlich 77,48 Makrophagen pro Sichtfeld zählbar und in den Tumoren der Kontrollgruppe nur 52,96 (Abb. 4.13). Abb. 4.13 Immunhistochemischer Nachweis von Makrophagen im Tumorgewebe. Die Makrophagenzahl in den Tumorschnitten wurde mit Hilfe des Anti-F4/80-Antikörpers bestimmt. Der Unterschied in der Makrophagenzahl erreicht ein statistisch hoch signifikantes (**, p<0,001) Niveau. Die Auszählung der in braun dargestellten Makrophagen fand in der 1000-fachen Vergrößerung statt. Der Maßstab in den histologischen Bildern entspricht 20 µm. 4.4 Genexpressionsanalyse nach dem Einfluss von [D]-K4H2L9 Die BrdU-Assays, der in vivo-Versuch und die immunhistochemische Analyse des Tumorgewebes legten eine antiproliferative und eine antiangiogenetische Wirkung des Host Defense Peptids [D]-K4H2L9 offen. Auch eine verstärkte Migration von Immunzellen durch den Einfluss des HDPs wurde festgestellt. Anschließend wurde die Genexpression von acht Zytokinen analysiert, um herauszufinden, ob diese an der Vermittlung der beobachteten Wirkungen beteiligt sind. Mittels RT-PCR konnte die relative Menge der Transkriptionsprodukte der jeweiligen Zytokine quantifiziert werden. 57 Eine anschließende Gelelektrophorese wies nach, dass nur die DNA der gewünschten Zytokine amplifiziert und quantifiziert wurde und nicht andere unspezifische Genprodukte. So entstand pro Versuchsansatz nur eine spezifische Bande. Die Bande, die bei manchen Negativkontrollen zu sehen ist, wird von Primerdimeren dargestellt. Lediglich bei der Positivkontrolle des IFN-γ-Ansatzes sind noch zwei weitere Banden angedeutet. Diese sind auf Grund ihres schwachen Signals und der geringeren Ausprägung jedoch vernachlässigbar und auch die Messdaten der PCR bestätigen die Amplifikation von nur einem Genprodukt. Die Spezifität der gemessenen Genprodukte wurde zudem über die Verwendung von Sonden gesichert (Abb. 4.14). Abb. 4.14 Gelelektrophorese der PCR-Ansätze. Pro Zytokin wurden je 3 µl eines PCR-Ansatzes und rechts davon 3 µl der zugehörigen Negativkontrolle auf ein Gel aufgetragen und eine Gelelektrophorese zur Analyse der entstehenden Amplifikate durchgeführt. Ein Basenpaar-Marker (m) zeigt, dass die entstandenen Amplifikate aus circa 100 Basenpaaren bestehen so wie das am weitesten gewanderte und kürzeste Marker-Fragment. Der Faktor NOV (Nephroblastom überexprimiertes Gen) wirkt unter anderem antiproliferativ. Antiangiogenetisch wirken die Zytokine IGFbp-3 (Insulin-ähnlicherWachstumsfaktor bindendes Protein 3), IFN-γ (Interferon-gamma), IP-10 (Interferongamma induziertes Protein 10) und MIG (Monokin induziert durch Interferon-gamma). Chemotaxis und beziehungsweise oder eine Aktivierung der Immunzellen vermitteln die Zytokine IFN-γ, IL-12 (Interleukin 12), IL-16 (Interleukin 16), IP-10, MCP-1 (Monozyten chemotaktisches Protein 1) und abermals MIG. In den BFS-1-Tumoren zeigte die Behandlungsgruppe 75 % der NOV-Expression der Kontrollgruppe. Das untersuchte Host Defense Peptid [D]-K4H2L9 beeinflusste die Expression nicht in signifikantem Ausmaß (p≈0,51). Die Expression des Zytokins IGFbp-3 erfolgte in den behandelten Tumoren etwas geringer (ca. 0,8-fach) als in den nicht behandelten Tumoren (p≈0,38). IP-10 wurde in den mit dem Host Defense Peptid behandelten Tumoren 2,12-fach höher exprimiert im Vergleich zu den Tumoren der Kontrollgruppe, ohne dass dieses Ergebnis eine statistische Signifikanz erreichte 58 (p≈0,13). Die IFN-γ Expression in den behandelten Tumoren war fast doppelt so hoch (ca. 1,7-fach) wie die Expression in den Tumoren der Kontrollgruppe. Mit einem pWert von 0,064 erreichen diese Expressionsunterschiede nur fast ein signifikantes Niveau. Die Genexpression von IL-12 in der Therapie- und der Kontrollgruppe unterschieden sich nicht deutlich. Es wurden nur geringfügig erhöhte Werte in der Therapiegruppe gemessen (1,34-fach; p≈0,37). Das Chemokin IL-16 wird nur 1,47-fach in den Tumoren der Therapiegruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe exprimiert (p>0,2). Auch auf die Expression von MCP-1 scheint [D]-K4H2L9 keinen Einfluss auszuüben mit einem Expressionsunterschied von 10 % (p≈0,76). Die MIG-Expression in den behandelten Tumoren ist 2,42-mal so hoch wie in den nicht behandelten Tumoren. Dieser Expressionsunterschied erreicht eine hohe Signifikanz (p<0,01) (Abb. 4.15). Abb. 4.15 Genexpression einiger Zytokine eine Woche nach Therapieende. Die Genexpression einiger Zytokine wurde mittels Realtime-PCR quantifiziert. Die Expressionsniveaus der Behandlungsgruppe wurde in Relation zu den Expressionsniveaus der Kontrollgruppe dargestellt. Singulär wurde eine hoch signifikante (**, p<0,01) stärkere Expression nach HDP-Therapie auffällig. (IFN-γ Interferon-gamma, IGFbp-3 Insulin-ähnlicher-Wachstumsfaktor 3, IL Interleukin, IP-10 Interferon-gamma induziertes Protein 10, MCP-1 Monozyten chemotaktisches Protein 1, MIG Monokin induziert durch Interferon-gamma, NOV Nephroblastom überexprimiertes Gen). Die punktuelle Genexpressionsanalyse von Zytokinen ergab, dass die Zytokine NOV, IGFbp-3, IL-12, IL-16 und MCP-1 eine Woche nach Therapieende nicht signifikant unterschiedlich in den beiden Gruppen exprimiert wurde. Die Zytokine IP-10 und INF-γ werden deutlich stärker in der Therapiegruppe exprimiert, wenn dieser Unterschied auch kein signifikantes Niveau erreicht. Nur das Chemokin MIG zeigt eine hochsignifikante stärkere Expression nach Peptidgabe. 59 Die Genexpressionsanalyse der Zytokine MIG, IFN-γ und IP-10 in kultivierten BFS-1Zellen zeigte eine Basalexpression dieser Zytokine durch die Tumorzellen. Bezogen auf die Expression im Tumorgewebe betrug die Expression von MIG in den kultivierten BFS-1-Zellen 0,01 %, von IFN-γ 2,60 % und von IP-10 257 %. 60 5 Diskussion Die Tumortherapie nimmt in der Medizin eine zentrale Rolle ein, die mit der steigenden Lebenserwartung der Bevölkerung auf Grund einer entsprechend steigenden Lebenszeitprävalenz von Tumorerkrankungen weiter an Bedeutung zunehmen wird. So wird auch die Inzidenz der Weichteilsarkome zunehmen, die insgesamt 1 % der gesamten Tumorerkrankungen darstellen (Nielsen et al., 2002). Das Bedürfnis nach effektiven therapeutischen Maßnahmen wird folglich weiter wachsen. Die Rezidivrate von 22-60 % nach erfolgreicher Therapie und eine fünf-Jahre-Überlebensrate von 75 % bei Patienten mit Tumoren im ersten Dedifferenzierungsstadium, erfordern eine schnelle Entwicklung potenter Behandlungsmethoden (Kotilingam et al., 2006; Worth, 2005). Die Tumorexstirpation, die Strahlentherapie mit teilweise unzureichendem Erfolg und die Chemotherapie mit geringen Ansprechraten, erreichen insgesamt keine zufriedenstellenden Ergebnisse. Die Ansätze hochfrequente fokussierte Ultraschallstrahlen gegen Sarkome einzusetzen oder die Kombination von elektrischen Reizen mit Chemotherapeutika zur verbesserten Medikamentenaufnahme werden nur für oberflächlich liegende Tumore eine Behandlungsalternative werden können (Chida et al., 2009; Sersa et al., 2010). Mit der Entdeckung der onkolytischen Host Defense Peptide und der Möglichkeit deren Eigenschaften über die Herstellung synthetischer Varianten zu verbessern, bieten sich aussichtsreiche neue Therapeutika dar, die über eine systemische Applikation auch tiefgelegene Weichteilsarkome beziehungsweise okkulte Metastasen erreichen können. Eine Schwierigkeit bei der Anwendung der bisher erforschten onkolytischen HDPs besteht in den engen therapeutischen Fenstern, die zwischen den verschiedenen Tumorentitäten variieren. Das 15-mer kationische Peptid [D]-K4H2L9 erzielte bereits im Einsatz gegen Prostatakarzinome und in Vorversuchen zum Einsatz des Peptids gegen Weichteilsarkome vielversprechende Ergebnisse (Mersch, 2010). So erreicht das HDP eine Verminderung der Angiogenese sowie eine Verminderung des Tumorwachstums im athymischen Tierversuch. Das dort verwendete humane Synovialsarkom zeigte in 50 % eine Teilremission und in 20 % eine Vollremission. Eine hämolytische Wirkung auf humanes oder murines Blut konnte nicht beobachtet werden. Im Hinblick auf einen klinischen Einsatz des Peptids galt es nun den Wirkmechanismus genauer zu untersuchen, das hieß zunächst dessen Wirksamkeit im immunkompetenten Organismus 61 zu erforschen. Auf diese Weise konnte eine Wirkung des Peptids bei regelrecht funktionierendem Immunsystem beurteilt und einzelne Interaktionen mit diesem beobachtet werden. Für den durchgeführten in vivo-Versuch wurden immunkompetente C57Bl/6-Mäuse und das syngene murine Fibrosarkom BFS-1 wt gewählt. Darüber hinaus fanden die ersten Versuche einer Kombinationstherapie von [D]-K4H2L9 mit dem klassischen Chemotherapeutikum Doxorubicin, auf der Suche nach einer effizienten und verträglichen onkolytischen Therapie der Weichteilsarkome, statt. Zunächst zeigte die Analyse der antiproliferativen Wirkung von [D]-K4H2L9 eine deutliche Einschränkung der Replikationsrate und damit eine Einschränkung der Vermehrung der Sarkomzellen (Abb. 4.1). Hier verdeutlichte sich die Heterogenität der Weichteilsarkome, die zwischen den Subtypen besteht. So zeigten sich die BFS-1Zellen sehr sensibel gegenüber dem Host Defense Peptid und wiesen schon ab einer Konzentration von 12,5 µM nur noch eine Proliferationsrate von 4,2 % auf, während eine ähnliche Hemmung der Proliferation der SW982-Zellen erst bei einer Konzentration von 62,5 µM erreicht wurde. Diese uneinheitliche Wirkung wird auf Unterschiede zwischen den Sarkomsubtypen zurückgeführt. Die Unterschiede bestehen beispielsweise in der Zellmembranzusammensetzung, die auch die Ladung der Membran und damit die elektrostatischen Anziehungskräfte zu den HDPs beeinflussen, oder in abweichenden Genexpressionsprofilen, wie in etwa einer Überexpression von dem anti-apoptotischen Faktor bcl-xL, die eine höhere Dosis eines HDPs für die selbe hemmende Wirkung erforderlich machen (Mader et al., 2005). [D]-K4H2L9 zeigte sich weniger effizient gegen die nicht malignen HFB-Zellen, allerdings wird auch die Zellproliferation dieser Zellen bei einer Konzentration von 12,5 µM einmalig über mehr als 80 % gehemmt. Der anfängliche Anstieg der Replikationsrate von Fibroblasten und murinen Fibrosarkomzellen, der bei niedrigen Peptidkonzentrationen beobachtet wurde, ist am ehesten als Folge eines Stressmetabolismus bei Zugabe des zytotoxischen Peptids zu verstehen. Ein Metabolit, der dieses Phänomen mitverantworten könnte, ist das Wasserstoffperoxid. Dieses radikale Sauerstoffspezies wird vermehrt in Krebszellen synthetisiert, von Makrophagen in Stresssituationen freigesetzt und auch von onkolytischen Medikamenten zur Vermittlung von Zytotoxizität genutzt. Während es in niedrigen Konzentrationen die Zellproliferation stimuliert, induziert es in höheren Konzentrationen die Apoptose (Lopez-Lazaro, 2007; Schumacker, 2006). So können geringe Konzentrationen des HDPs [D]-K4H2L9 über ihre onkolytische Wirkung einen geringen metabolischen Stress 62 mit geringer Wasserstoffperoxidfreisetzung verursachen, welche dann zu einem Proliferationsanstieg Konzentrationen der und Versuchszellen starker führt, während metabolischer sich Stress hohe mit HDPhohen Wasserstoffperoxidkonzentrationen zytotoxisch auf die Versuchszellen auswirken. Die spezifische Zytotoxizität von [D]-K4H2L9 wurde durch den Vergleich mit dem ähnlichen Peptid scP-K3H3L9 nachgewiesen. Letzteres rief eine Stimulation der Proliferation der Zellen hervor, statt diese zu mindern (Abb. 4.2). So scheint es die primäre Aminosäuresequenz von [D]-K4H2L9 zu sein, die auch die Basis für die Sekundärstruktur darstellt, sowie die Selektivität-erhöhenden D-konfigurierten Aminosäuren, die den zytotoxischen Effekt vermitteln. Eine in vivo-Anwendung des scP-K3H3L9 steht noch aus. Bei dem Einsatz des klassischen Chemotherapeutikums Doxorubicin zeigten sich die SW982-Zellen am sensitivsten. Bei den BFS-1-Zellen wurde erst bei der doppelten Konzentration keine Proliferation mehr festgestellt. Die gesunden HFB-Zellen erwiesen sich als etwas resistenter gegen diese zytotoxische Substanz (Abb. 4.3). Das HDP [D]-K4H2L9 zeigte sich bei einem physiologischen pH-Wert von 7,3, bei dem der Einfachheit halber alle beschriebenen Versuche durchgeführt wurden, in einem Konzentrationsbereich von 37,5-87,5 µM deutlich zytotoxischer gegenüber den malignen Zellen als gegenüber den Kontrollzellen. So wurde die Zellproliferation der malignen Zellen bei gleicher [D]-K4H2L9-Konzentration um mindestens 12-20 % stärker eingeschränkt als die der Kontrollzellen. Das Doxorubicin wirkte in dem Konzentrationsbereich von 2,5-5 nM auch zytotoxischer auf die malignen Zellen als auf die Kontrollzellen. So wurde die Zellproliferation der malignen Zellen hier um mindestens 8-15 % stärker supprimiert als die der Fibroblasten. Die Peptidbehandlung erwies sich in den Versuchen folglich als die spezifischere Therapieoption gegen die Sarkomzellen. Diese Spezifität, die sich in bestimmten Konzentrationsintervallen zeigt, weist auf zu beachtende therapeutische Fenster des HDPs [D]-K4H2L9 hin. In Vorversuchen wurde bereits gezeigt, dass das Peptid im sauren Tumormilieu (pH 6,3) noch einmal deutlich spezifischer gegenüber entarteten Zellen als gegenüber gesunden Zellen wirkt (Abb. 1.2). Daher ist auch davon auszugehen, dass die in vitro durchgeführten Versuche zur Einschränkung der Zellproliferationsrate (Abschnitt 4.1.1) unter realen Bedingungen, das heißt einer Haltung der Sarkomzellen im sauren Milieu, eine noch spezifischere Wirkung des HDPs zeigen würden. 63 Das typisch saure Milieu von Malignomen entsteht, wenn die Blutversorgung für die schnell proliferierenden Tumorzellen insuffizient wird und bei niedrigen Sauerstoffkonzentrationen und hohem Glukosemetabolismus vermehrt saure Metabolite wie Laktat anfallen. Während die Tumorzellen die Funktion ihrer Plasmaenzyme durch alkalisierende Regulationsmechanismen schützen, wird die Extrazellularmatrix geschädigt und ein invasives Wachstum der Tumoren begünstigt. Ein Angreifen von Immunzellen oder von basischen Chemotherapeutika ist in dem sauren Milieu erschwert (Chiche et al., 2009). Die Wirkung von [D]-K4H2L9 hingegen wird in dem sauren Milieu der Tumore durch eine Protonierung der Histidine in dessen elektrostatischen Anziehungskräften zu den Krebszellen verstärkt (Makovitzki et al., 2009). Das HDP wirkt daher bei niedrigem pH-Wert noch spezifischer onkolytisch als bereits bei physiologischem pH-Wert. Je spezifischer sich die onkolytische Wirkung von [D]K4H2L9 auf die Sarkomzellen richtet, desto weniger Nebenwirkungen sind bei einer Therapie zu erwarten. Für eine gute Verträglichkeit des Peptids spricht auch die Tatsache, dass bei der stärksten Proliferationshemmung der Krebszellen durch [D]K4H2L9 die Fibroblastenproliferation nur um 71 % gehemmt wird, jedoch bei der Doxorubicin-Therapie in dem Fall sogar um 92 %. Auf der Suche nach einer potenten verträglichen Therapie der Weichteilsarkome wird auch über eine Kombination der Host Defense Peptide mit den klassischen Chemotherapeutika nachgedacht. Dabei sollen die Peptide die Durchlässigkeit der Zellmembranen für die Chemotherapeutika verbessern und durch eine Erhöhung der Akkumulation des Chemotherapeutikums in der Zelle eine Dosisreduktion und somit auch eine Reduktion der Nebenwirkungen ermöglichen (Held-Kuznetsov et al., 2009). Die Ergebnisse der diesbezüglich durchgeführten Experimente sind Erfolg versprechend (Abb. 4.4) Die Hemmung der Zellproliferation der BFS-1-Zellen über 90 %, die mit entweder 2,5 µM Doxorubicin oder mit 12,5 µM [D]-K4H2L9 erreicht wird, wird mit der Kombination von 40 nM Doxorubicin und 6,25 µM [D]-K4H2L9 erzielt. Ein SynergieEffekt wurde auch bei dem Einsatz der Kombinationstherapie gegen die SW982-Zellen beobachtet. Dieser war jedoch weniger stark. Bei den HFB-Zellen blieb der Effekt einer Kombinationstherapie unterhalb dem eines Addition-Effekts. Die maximale Hemmung, die durch die Kombination der Therapeutika erreicht wurde betrug 38,6 %. Der deutliche Synergie-Effekt der Kombinationstherapie bei den malignen Zelllinien und die geringe Hemmung der Zellproliferation der gutartigen Zellen sind Wirkungen, die den Ansprüchen einer klinisch einsetzbaren Behandlungsmethode entsprechen. 64 Diese Ergebnisse befürworten eine weitere Erforschung des Mechanismus der Wirkverstärkung der beiden Substanzen und eine Untersuchung der Kombinationstherapie in vivo, erst lokal und dann im Metastasenmodell auch systemisch. Der in vivo-Versuch dieser Arbeit belegt mit dem deutlich verringertem Tumorwachstum der behandelten Mäuse die Wirksamkeit des Peptids [D]-K4H2L9 im immunkompetenten Organismus (Abb 4.5 ff.). Die Ulzera der behandelten Tumore weisen dabei auf eine Verursachung von nekrotischen Prozessen hin. Nekrotische Prozesse korrelieren bei den meisten Weichteilsarkomsubtypen mit einer schlechten Prognose (Engellau et al., 2005; Gustafson, 1994). Werden die Nekrosen jedoch nach einer Therapie beobachtet, können sie als Zeichen der Wirksamkeit der Therapie auch mit einer guten Prognose korrelieren (Picci et al., 1997). Letzterem entsprechend traten die Nekrosen in den beschriebenen Versuchen nach der Peptid-Therapie auf und gingen mit einer Volumenreduktion des Tumors einher. Allerdings wurde im Rahmen der nekrotischen Prozesse auch gesunde Haut zerstört. Bei einer Schädigung der bestehenden Blutgefäße erhöht sich die Gefahr, dass Tumorzellen in den Blutkreislauf eintreten. Spätfolgen hiervon, wie in etwa solide Metastasen, konnten nach abgelaufenem Versuch jedoch nicht festgestellt werden. Zu prüfen bleibt, ob die Zerstörung der Haut durch das Peptid verursacht wurde oder durch andere Stoffwechselprodukte, die bei den nekrotischen Prozessen freigesetzt wurden. Die Nekrose könnte das HDP mit der Oberflächenladung von +4 bis +6 durch eine direkte Lyse der negativ geladenen Membranen der entarteten Zellen herbeigeführt haben. Die Hemmung der Angiogenese durch das Peptid, die selbst makroskopisch beobachtet wurde, verstärkte währenddessen den anaeroben Stoffwechsel und damit wiederum die nekrotischen Prozesse. Die Tumore, deren Volumen nach den neun Dosen [D]-K4H2L9 à 150 µg größer als 90 mm3 waren, nahmen nach dem Absetzen der Therapie ein exponentielles Wachstum durch eine rasche Proliferation der verbliebenen Tumorzellen auf. Die kleineren Tumore zeigten kein weiteres Wachstum, sondern eher eine Volumenreduktion nach beendeter Therapie, die am ehesten auf eine Resorption des nekrotischen Gewebes zurückzuführen ist. Der zeitige Wiederanstieg des Tumorvolumens der größeren Tumore nach Therapieende entspricht den Beobachtungen, die nach einem abgeschlossenen Zyklus der Chemotherapie beobachtet werden (Katz et al., 2000). 65 Es bleibt zu klären, warum die Therapie bei einigen Tumoren nicht angeschlagen hat, das heißt welchem Wirkmechanismus des Peptids die Tumorzellen durch welche Umstände entgehen konnten. Bei Tumoren, die sich zum Zeitpunkt des Therapiestartes bereits in der exponentiellen Wachstumsphase befanden, wäre wahrscheinlich eine höhere Dosis des zytotoxischen HDPs indiziert gewesen, um die sich schnell vermehrenden Tumorzellen in die Apoptose zu leiten oder deren Nekrose herbeizuführen. Es ist zum aktuellen Zeitpunkt noch schwer vorstellbar, wie Tumorzellen über Mutationen den multimodalen Wirkungsmechanismen der HDPs entgehen können. Insgesamt sind die Ergebnisse der [D]-K4H2L9-Therapie im ersten immunkompetenten Tiermodell vielversprechend mit einer partiellen Ansprechrate von 40 % und einer Komplettremission in 20 % der Fälle. Im Vergleich dazu erreicht das bereits langjährig eingesetzte Doxorubicin, eines der wirksamsten Chemotherapeutika in der Sarkomtherapie, Ansprechraten von bis zu 26 % (Lehnhardt et al., 2005). Mit der immunhistochemischen Analyse der Tumorschnitte ließ sich eine Woche nach Therapieende zwar noch ein antiproliferativer Effekt nachweisen, aber die Ergebnisse erreichten kein signifikantes Niveau mehr (Abb. 4.10). Dies entspricht der Wachstumskurve des in vivo-Versuchs, die einen Anstieg der Proliferationsrate von einigen Tumoren nach Absetzen der Therapie suggeriert. Es wäre sinnvoll, bei einer Wiederholung des Versuchs bereits während der laufenden Therapie oder bei Therapieende Tumore zu entnehmen und histologische Schnitte von ihnen anfertigen zu lassen, um die Proliferationsaktivität der Tumorzellen nach unmittelbarem [D]-K4H2L9Einfluss zu untersuchen. Die mikroskopische Bestätigung der antiangiogenetischen Wirkung (Abb. 4.11) ist bedeutsam, da den Sarkomen eine besondere Abhängigkeit von einer guten Vaskularisierung zugesprochen wird (Saenz et al., 1998) und mehrere Studien zeigen konnten, dass eine Hemmung der Angiogenese mit einem vermindertem Tumorwachstum einhergeht. Dies stimmt mit der Beobachtung überein, dass bei den Tumoren der [D]-K4H2L9-Therapie die Sichtung von makroskopisch gut ausgebildeten Gefäßen und eine verminderte Hemmung des Tumorwachstums koinzidieren. Es ist davon auszugehen, dass in diesen Tumoren die membranolytische und die antiangiogenetische Wirkung des HDPs unzureichend waren, in etwa durch eine zu geringe Dosierung bei bereits sehr aktiven Tumorzellen. Eine fehlende Hemmung der Angiogenese erlaubte in diesen Fällen eine gute Versorgung und damit wiederum eine ungehinderte Proliferation der Tumorzellen. 66 Deutlich war auch die vermehrte Migration von Immunzellen in das Tumorgewebe nach der Therapie mit [D]-K4H2L9, die hier für T-Zellen und Makrophagen immunhistochemisch nachgewiesen wurde (Abb 4.12 und Abb. 4.13). So waren eine Woche nach Behandlungsende zum Zeitpunkt der Tumorentnahme diese deutlich zahlreicher in den behandelten Tumoren vorhanden, wo sie im Rahmen der unspezifischen Immunantwort die Tumorzellen phagozytierten oder aber eine spezifische zelluläre sowie humorale zytotoxische Immunantwort vermittelten. Eine weitere Analyse der eingewanderten Immunzellen in die Tumorareale sollte nun dahingehend geführt werden, ob das 15-mer HDP auch die Migration von Immunzellen fördert, die ein Milieu schaffen, in dem die Tumorzellen sich verbessert vermehren können oder ob sie ausschließlich eine zytotoxische Immunantwort zu der Bekämpfung der Tumorzellen begünstigen. So zeichnen sich die M1-Phänotyp-Makrophagen durch ihre inflammatorische Immunantwort mit der Generierung von radikalen Sauerstoffspezies aus und zeigen eine antibakterielle und onkolytische Wirkung. Die M2-Phänotyp-Makrophagen hingegen wirken über die Expression von bestimmten Zytokinen anti-inflammatorisch und immunsuppressiv, fördern die Angiogenese und durch die Hochregulation von Metalloproteinasen das invasive Tumorwachstum. Tumor-assoziierte-Makrophagen (TAM) sind oftmals vom M2-Phänotyp (Biswas et al., 2008; Halin et al., 2009). Die chemotaktische Wirkung des HDP [D]-K4H2L9 könnte durch Migrationsassays genauer erfasst werden. Auf der Suche nach den Transmittern der beobachteten Effekte wurde auch die Genexpression der Zytokine IFN-γ, IGFbp-3, IL-12, IL-16, IP-10, MCP-1, MIG und NOV eine Woche nach dem Abschluss der HDP-Therapie analysiert (Abb. 4.15). Da die Expression der Zytokine NOV, IGFbp-3 und MCP-1 nicht mit der Gabe des HDPs [D]-K4H2L9 korrelierte, wird nicht von einer Vermittlung der onkolytischen Wirkungen des HDPs durch diese Zytokine ausgegangen Die Rolle des untersuchten Zytokins Nephroblastom überexprimiertes Gen (NOV) in Tumoren ist laut Literatur sehr heterogen. So korreliert eine erhöhte NOV-Konzentration in Osteosarkomen mit einer schlechten Prognose (Perbal et al., 2008). In Gliomen hingegen geht eine erhöhte NOVExpression mit einem reduzierten Tumorwachstum einher. Diese wachstumshemmende Wirkung wurde in vitro und in vivo mehrfach bestätigt (Bleau et al., 2007; Sin et al., 2008). Das Zytokin IGFbp-3 hemmt die Expression von angiogenetischen Faktoren wie dem vaskulären-endothelialen Wachstumsfakor (VEGF) und Interleukin 8 und wirkt sich ungünstig auf das Tumorwachstum aus (Han et al., 2011). Das Chemokin MCP-1 67 ist ein starker Chemoattraktor für Monozyten und Makrophagen an Entzündungsherden oder in Neoplasien. Die onkolytische Wirkung schließt beispielsweise eine gesteigerte Stickstoffmonoxidproduktion in den aktivierten Makrophagen ein (Biswas et al., 2001). Das Interferon-gamma induzierte Protein 10 (IP-10) wird unter anderem von Makrophagen, Endothelzellen und Fibroblasten produziert. Seine Produktion wird hauptsächlich durch IFN-γ stimuliert. Neben der antiangiogenetischen Wirkung, hemmt es auch das Tumorwachstum und zieht Monozyten, Makrophagen und T-Zellen an (Angiolillo, 1995; Gasperini et al., 1999; Luster and Leder, 1993). Die Erhöhung der IP10-Expression auf das 2,12-fache nach [D]-K4H2L9-Therapie erreicht zwar keine Signifikanz, könnte aber darauf hindeuten, dass das Zytokin während der Behandlung die Vaskularisierung der behandelten Tumore negativ beeinflusst hat. IP-10 wäre in diesem Fall auch mit für die erhöhte Zahl von Monozyten, Makrophagen und T-Zellen und das geringere Wachstum der behandelten Tumore verantwortlich. Auch die leichte Erhöhung der Expression der Chemokine IFN-γ, IL-12 und IL-16 können auf eine noch stärkere Erhöhung während der [D]-K4H2L9-Therapie hinweisen. Interferon-γ wird durch Natürliche Killerzellen und T-Zellen sezerniert und fördert wiederum die Differenzierung von T-Zellen. Über ein positives Feedback unterstützt es die eigene Produktion. Das Zytokin verstärkt direkt die Immunogenität von Tumoren und ermöglicht so eine bessere Bekämpfung von entarteten Zellen durch das Immunsystem (Schoenborn and Wilson, 2007). Über eine Stimulation der IP-10-Produktion, kann es auch einen hemmenden Einfluss auf die Angiogenese nehmen. Das Interleukin 12, das nur leicht vermehrt in der Therapiegruppe nachgewiesen werden konnte, wird von Makrophagen und B-Zellen produziert und stimuliert eine zellvermittelte Immunantwort durch eine Förderung der Th1-T-Zell-Differenzierung. Es bewirkt eine Erhöhung der Zellproliferation und der Zytotoxizität der Natürlichen Killer-T-Zellen und T-Zellen. Über die Th1-T-Zell-Differenzierung fördert es die IFN-γ-Produktion und kann somit die Verstärkung der Immunogenität von Tumoren einleiten und wiederum auch eine IP10-Produktion begünstigen (Bellone and Trinchieri, 1994; D'Andrea et al., 1993; Hsieh et al., 1993; Mosmann and Sad, 1996). Das Interleukin 16 besitzt eine starke chemoattraktive Wirkung auf CD4-positive T-Zellen, Monozyten, Eosinophile und Dendritische Zellen. In Kombination mit anderen Zytokinen unterstützt IL-16 auch die Zellproliferation der Immunzellen und die T-Zell-Differenzierung zu Th1-T-Zellen ebenso wie das IL-12 (Cruikshank et al., 2000). 68 Das von den Makrophagen nach IFN-γ-Stimulation produzierte Chemokin MIG zieht vor allem Makrophagen und T-Zellen an. Es erwies sich als potentes Zytokin zur Unterbindung der Neovaskularisation und damit nachfolgend des Tumorwachstums und der Metastasenstreuung (Addison et al., 2000). Zusammen mit IP-10 vermittelt es einige onkolytische Prozesse, die von IL-12 über IFN-γ eingeleitet werden (Kanegane et al., 1998). Eine Beteiligung des Zytokin MIG an der antiangiogenetischen Wirkung des HDPs und dessen Förderung der Migration von Immunzellen in das Tumorgewebe, ist wahrscheinlich auf Grund der hoch signifikant erhöhten Expression (p<0,01) nach [D]K4H2L9-Einfluss. Die Expressionsniveaus der letztgenannten Zytokine präsentieren sich wie folgt kohärent: Die 1,7-fach höhere IFN-γ-Expression in den behandelten Tumoren, die sich nahe der statistischen Signifikanzgrenze befindet (p=0,064), bedingt die 2,42-fache Erhöhung der MIG-Expression und die 2,12-fache Erhöhung der IP-10-Expression in den behandelten Tumoren, da diese Zytokine von IFN-γ induziert werden. Die davor geschalteten Zytokine IL-12 und IL-16, die die Differenzierung von Th1-T-Zellen bewirken und teilweise auch Natürliche Killer T-Zellen stimulieren, die wiederum IFNγ produzieren, zeigten sich ebenso leicht erhöht. Eine höhere Fallzahl und eine Untersuchung der Tumore während beziehungsweise direkt bei Abschluss der [D]K4H2L9-Therapie sind hier angezeigt, um genauer zu prüfen, ob das HDP das Tumorwachstum auch über die Induktion von IL-12 und IL-16 über IFN-γ und IP-10 bekämpft. Eine Untersuchung in bestimmten Abständen während der Therapie würde darüber Aufschluss geben, ob verschiedene Zytokine zu verschiedenen Zeitpunkten hochreguliert werden. Auch ein zeitlicher Verlauf der Infiltration durch Immunzellen ist von Interesse. Um die Wirkungsweise des HDPs und sein Eingreifen in die Immunantwort noch besser zu verstehen, müssen zudem Genexpressionsanalysen weiterer Zytokine durchgeführt werden. Die Analyse der Genexpression der in vitro-kultivierten Fibrosarkomzellen bestätigte, dass das in den Tumoren gemessene MIG, fast ausschließlich durch die Immunzellen produziert worden ist, da die Fibrosarkomzellen dieses Zytokin in Relation gesehen nur kaum nachweislich synthetisieren. Auch die Interferon-gamma Produktion fand hauptsächlich durch die Immunzellen statt und in den Tumorzellen nur zu einem sehr geringen Anteil. Die IP-10-Produktion der BFS-1-Zellen zeigte sich hingegen höher als die durchschnittliche IP-10-Produktion des Tumorgewebes, allerdings war die Standardabweichung des Durchschnittes relativ hoch (Abb. 4.15). Die hohe IP-1069 Produktion der Fibrosarkomzellen ist am ehesten auf die Tatsache zurückzuführen, dass gesunde Fibroblasten eine der IP-10-produzierenden Zellarten sind, und die Fibrosarkomzellen Eigenschaften der Ursprungszellen beibehalten, sofern sie nicht vollständig dedifferenziert sind. Bemerkenswert ist, dass die Tumorzellen auch Zytokine, die ihre Wachstumsbedingungen negativ beeinflussen, sezernieren. Welche Zytokine sie im Einzelnen exprimieren, unter welchen Bedingungen und mit welchen Auswirkungen, muss zeitnah erforscht werden, um die therapeutischen Strategien dementsprechend anzupassen. Eine noch genauere Untersuchung der Wirkweise des Peptids und dessen Einfluss auf das Immunsystem, werden weitere Schritte sein auf dem Weg dieses oder ein anderes Peptid eines Tages in der Behandlung von Weichteilsarkompatienten erfolgreich einsetzen zu können. 70 6 Zusammenfassung Aufgrund der demographisch bedingten steigenden Inzidenz der Weichteilsarkome ist die Forschung bemüht, die aktuellen Behandlungsergebnisse durch spezifischere und nebenwirkungsärmere Therapeutika mit höheren Ansprechraten weiter zu verbessern. Das synthetische Host Defense Peptid [D]-K4H2L9 zeigte in dieser Arbeit vorteilhafte Wirkungsweisen als Therapeutikum gegen Weichteilsarkome. Neben einer bekannten Hemmung der Zellvitalität und einer spezifischen Wirkung gegen maligne Zellen, vor allem im sauren Tumormilieu, hemmt es auch die Zellproliferation in vitro und in vivo. Dabei konnte diese Wirkung des kationischen 15mer Peptids [D]-K4H2L9 auf dessen Sequenz und den Anteil an D-Aminosäuren zurückgeführt werden. Eine erste therapeutische Kombination mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin zeigte einen Synergie-Effekt im Einsatz gegen Weichteilsarkomzelllinien und stellt somit eine aussichtsreiche neue Therapieoption dar. In vivo hemmte [D]-K4H2L9 deutlich das Tumorwachstum im immunkompetenten Mausmodell und erzielte in 40 % eine Teil- und in weiteren 20 % eine Vollremission. Die Migration der Immunzellen in das Tumorgewebe und die Hemmung der Angiogenese korrelierten mit dem Behandlungserfolg. Als ein möglicher Vermittler einer chemotaktischen Wirkung und einer Hemmung der Neovaskularisation konnte bis jetzt nur das Chemokin MIG identifiziert werden, auf dessen Genexpression [D]K4H2L9 Einfluss nahm. 71 7 Literatur Addison, C.L., Arenberg, D.A., Morris, S.B., Xue, Y.Y., Burdick, M.D., Mulligan, M.S., Iannettoni, M.D., Strieter, R.M. (2000). The CXC chemokine, monokine induced by interferon-gamma, inhibits non-small cell lung carcinoma tumor growth and metastasis. Hum. Gene. Ther. 11(2), 247-261 Angiolillo, A.L., Sgadari, C., Taub, D.D., Liao, F., Farber, J.M., Maheshwari, S., Kleinman, H.K., Reaman, G.H., Tosato, G. (1995). Human interferon-inducible protein 10 is a potent inhibitor of angiogenesis in vivo. Journal of Experimental Medicine 182, 155-162 Bechinger, B. and Lohner, K. (2006). Detergent-like actions of linear amphipathic cationic antimicrobial peptides. Biochim. Biophys. Acta 1758(9), 1529-1539 Bellone, G. and Trinchieri, G.(1994). 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Nature 415(6870), 389-395 78 Danksagung Für das Gelingen meiner Doktorarbeit möchte ich mich bei allen herzlich bedanken, die direkt oder indirekt dazu beigetragen haben. Beim Erstellen dieser Dissertation erlernte ich Wissenschaftliches Arbeiten und Denken und wurde mit der Vielfalt der aktuellen Forschungsmethoden konfrontiert. Diese neuen Erfahrungen und die wertvollen menschlichen Kontakte, die sich durch die Doktorarbeit ergaben, sind für mich eine große Bereicherung. Herrn Professor Dr. med. Lars Steinsträßer danke ich für die Möglichkeit, in seiner Arbeitsgruppe „Molekulare Onkologie und Wundheilung“ experimentell zu forschen und über ein aktuelles und spannendes Thema zu promovieren sowie für die berufliche Förderung und Beratung während der gesamten Zeit. Dr. phil. nat. Frank Jacobsen danke ich für die stete Bereitschaft, das Projekt durch Beratung zu unterstützen, und für das Korrekturlesen dieser Arbeit. Für ihre grenzenlose Hilfsbereitschaft und ihre Freundschaft danke ich den Mitgliedern der Arbeitsgruppe mit Mustafa Becerikli, Dr. med. Bassem Mikhail, Simon Pfaffe, Matthias Schulte und Raphael Tsoukas. Mein besonderer Dank gilt Dr. rer. nat. Jennifer Hauk und Andrea Rittig für das umfangreiche Einarbeiten, die exzellente Betreuung und auch für das Korrekturlesen dieser Arbeit. Dem Evangelischen Studienwerk e.V. Villigst danke ich für die finanzielle Ermöglichung des Forschungssemesters. Bei meiner Familie und meinen Freunden bedanke ich mich für ihre Unterstützung und für ihren Glauben in mich. DANKE Curriculum vitae Name Corinn Isabel MATA MERA Geburtsdatum und -ort 10.12.1987 in Bonn * Schulausbildung 1994-1998 Erich-Kästner-Grundschule Bonn 1998-2006 Friedrich-Ebert-Gymnasium Bonn Schulabschluss Abitur 2006 International Baccalaureate 2006 * Studium Studium der Humanmedizin an der RuhrUniversität Bochum seit 2006 Physikum 2008 Studium an der Partneruniversität Université de Strasbourg, Frankreich (09/2008-06/2009) Forschungssemester in der Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte in der Arbeitsgruppe „Molekulare Onkologie und Wundheilung“ am Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikum Bergmannsheil in Bochum im Rahmen der eigenen Promotion (09/201003/2011) Beginn des Praktischen Jahres des Medizinstudiums 02/2012 Voraussichtlicher Zeitpunkt des Studienabschlusses Juni 2013 (2. Staatsexamen)
