HER2/neu-Expression und

Aus dem Institut für Pathologie
der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. A. Feller
HER2/neu-Expression und -Genamplifikation in
muskelinvasiven Urothelkarzinomen der Harnblase
Inauguraldissertation
zur
Erlangung der Doktorwürde
der
Universität zu Lübeck
- aus der Medizinischen Fakultät -
vorgelegt von
Karl Georg Weitsch
aus Halle/Saale
Lübeck 2005
1. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. med. Stefan Krüger
2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Dieter Jocham
Tag der mündlichen Prüfung:
18.07.2005
Zum Druck genehmigt. Lübeck, d. 18.07.2005
2
INHALTSVERZEICHNIS
Seite
1.
Einführung
4
1.1.
Epidemiologie des Harnblasenkarzinoms
4
1.2.
Ätiologie
5
1.3.
Pathogenese
6
1.4.
Histologischer Malignitätsgrad und Tumorstadium
7
1.5.
Therapie
9
1.6.
Prognosefaktoren
9
1.6.1.
Etablierte Prognosefaktoren
1.6.2.
HER2/neu als potenzieller neuer Prognosefaktor
1.7.
2.
Fragestellung
11
Material und Methodik
12
2.1.
Material
12
2.2.
Immunhistochemische Färbemethodik und Auswertung
12
2.3.
FISH-Analyse
17
2.4.
Statistische Auswertung
20
3.
Ergebnisse
21
3.1.
Immunhistochemische HER2/neu-Expression
21
3.2.
HER2/neu-Genamplifikation
23
3.3.
Analyse der Überlebensraten
23
3.4.
Beantwortung der unter 1.7. gestellten Fragen
28
4.
Diskussion
30
4.1.
Immunhistochemischer HER2/neu-Status
30
4.2.
FISH-Analyse und Genamplifikation
31
4.3.
Therapeutische Möglichkeiten
32
5.
Zusammenfassung
33
6.
Literaturverzeichnis
35
7.
Danksagung
43
8.
Lebenslauf
45
9.
Publikationen
46
3
1. Einführung
1.1. Epidemiologie des Harnblasenkarzinoms
Das Harnblasenkarzinom ist eine der häufigsten Krebserkrankungen überhaupt. Beim Mann
macht das Harnblasenkarzinom in Deutschland derzeit etwa 8% aller bösartigen Neubildungen aus steht somit nach dem Prostata-, Lungen- und Dickdarmkarzinom an vierter Stelle
aller Malignome (Arbeitsgemeinschaft bevölkerungsbezogener Krebsregister in Deutschland,
2002). Nachdem seit Mitte des 20. Jahrhunderts eine weltweite Zunahme an Neuerkrankungen zu verzeichnen war, wurde in den 1990er Jahren ein leichter Rückgang sowohl in
Deutschland (Arbeitsgemeinschaft bevölkerungsbezogener Krebsregister in Deutschland,
2002) als auch in den Vereinigten Staaten (Ries et al., 2000) registriert.
Allgemein gilt, dass Männer von Krebserkrankungen der Harnblase drei- bis fünfmal häufiger
betroffen sind als Frauen. Jährlich treten in der Bundesrepublik 12.500 Erkrankungsfälle bei
Männern und 5.100 bei Frauen auf. In weniger als 20% der Fälle erkranken Männer vor dem
Erreichen des 60. Lebensjahres. Bei Frauen liegt der Anteil bei 2 bis 3% aller bösartigen
Neubildungen, wobei zwischen 10 und 15% dieser Fälle vor dem 60. Lebensjahr auftreten.
Diese Schätzungen basieren auf Hochrechnungen, die auf der Grundlage von ländereigenen
Krebsregistern durchgeführt wurden (Arbeitsgemeinschaft bevölkerungsbezogener Krebsregister in Deutschland, 2002).
Der überwiegende Teil der neudiagnostizierten Harnblasenkarzinome befindet sich noch in
einem nicht-invasiven Tumorstadium (pTa). Dies erklärt den Befund, dass die Mortalitätsrate
weitaus niedriger als die Inzidenzrate ist. In Zahlen ausgedrückt bedeutet dies, dass in
Deutschland jährlich ungefähr 6,0 Männer und 1,6 Frauen/100.000 Einwohner an einem
Harnblasenkarzinom versterben (Becker und Wahrendorf, 1998), wobei die Rate der
Neuerkrankungen bei 28,4/100.000 Einwohnern liegt (Arbeitsgemeinschaft bevölkerungsbezogener Krebsregister in Deutschland, 2002). Für die Vereinigten Staaten liegen ganz
ähnliche Werte vor: Die Rate der Neuerkrankungen beträgt dort 27,2/100.000 Einwohner, und
es sterben jährlich 5,6 Männer und 1,7 Frauen/100.000 Einwohner an einem Karzinom der
Harnblase (Ries et al., 2000). Untersuchungen aus den USA lassen auch eine häufigere
Inzidenz bei Menschen weißer Hautfarbe im Gegensatz zu Menschen afro-amerikanischer
4
Herkunft erkennen (Harris et al., 1990). Interessant ist, dass in den Vereinigten Staaten nur
jeder 5. Weisse, aber jeder 3. Farbige am Harnblasenkarzinom verstirbt (Ries et al., 2000).
Warum dies so ist, ist derzeit ungeklärt.
1.2. Ätiologie
Bei der Kanzerogenese wird von einem polyätiologischen Prozess ausgegangen (Malone et
al., 1987; Brandau und Böhle, 2001). Es existiert eine beträchtliche Anzahl von Stoffen, die
als Kanzerogene oder Kokanzerogene mit dem Harnblasenkarzinom in Verbindung gebracht
werden. Als Karzinogene sind vor allem aromatische Amine, die oft als Bestandteil von
Färbemitteln oder die wie Nitrosamine und 2-Naphthylamin im Tabakrauch vorkommen,
entlarvt worden. Weiterhin muss bei den Stoffen Xenylamin, Benzidin und 4-AminoBiphenyl ebenfalls von einem karzinogenetischen Effekt ausgegangen werden (Schubert,
1997). Die Tatsache, dass ferner Steinkohleteer, Ruß- und Gasprodukte als Auslöser
fungieren können, macht eine eindeutige Abgrenzung zwischen Lebens- und
Arbeitsbedingungen beinahe unmöglich. Insbesondere die Lebensgewohnheiten scheinen
eine bedeutsame Rolle bei der Entstehung des Harnblasenkrebses zu spielen. In diesem
Zusammenhang gilt die Annahme, dass Kaffeekonsum an der Karzinogenese beteiligt ist, als
umstritten (Rübben und Otto, 2001). Dagegen kommt dem Tabakrauchen eine unumstrittene
ätiologische Rolle bei der Entstehung des Harnblasenkrebses zu: Raucher erkranken etwa 2,5mal häufiger an einem Harnblasenkarzinom als Nichtraucher (Castelao et al., 2001).
Bei beruflicher Exposition ist die Erhebung präziser Daten dadurch erschwert, dass in der
Regel eine mehrere Jahrzehnte umfassende Zeitspanne zwischen Karzinogenkontakt und
Tumormanifestation liegt (Otto und Rübben, 2003). Eine 2003 veröffentlichte Metaanalyse
gibt den Anteil der durch berufliche Exposition verursachten Karzinome bei Männern in den
Risikoberufsgruppen Metallarbeiter, Maschinisten, Transportarbeiter und Bergleute für das
westliche Europa mit 5-10 % an (Kogevinas et al., 2003). Dabei sind, wie bereits oben
erwähnt, aromatische Amine (4-Amino-Biphenyl, Benzidine, 2-Naphthylamin), die beispielsweise bei der Farbenherstellung verwendet werden, als Karzinogene nachgewiesen (Schubert,
1997). Auch industrielle Prozesse, bei denen Mischexpositionen auftreten (wie beispielsweise
die Magentaherstellung) werden als humankarzinogen eingestuft. Interessant ist in diesem
5
Zusammenhang, dass eine bakterielle Zersetzung von Azofarbstoffen diese nicht unschädlich
macht: Die Inzidenz von Harnblasenkarzinomen ist erhöht bei japanischen Kimonomalern,
die ihre Pinsel ablecken und auf diese Weise Azofarbstoffe über den Darm aufnehmen (Otto
und Rübben, 2003). Weiterhin wird das regelmäßige Einatmen von Dieselruß mit der
Entwicklung eines Harnblasenkarzinoms in Zusammenhang gebracht, was vor allem das
erhöhte Risiko bei Transportarbeitern erklären dürfte (Kogevinas et al., 2003). Ferner konnten
Phenazetin beziehungsweise phenazetinhaltige Arzneimittel und Zyklophosphamid als
urothelkanzerogene Stoffe identifiziert werden (Rübben und Otto, 2001)
Die Infektion mit Schistosoma haematobium, dem Erreger der Bilharziose, gilt als
bedeutendster ätiologischer Faktor für die Entstehung von Harnblasenkarzinomen in Entwicklungsländern, wobei insbesondere Plattenepithelkarzinome vorgefunden werden (Rübben
und Otto, 2001). Da Plattenepithelkarzinome der Harnblase ohne vorausgegangene
Bilharziose selten sind, ist ihr Anteil in Deutschland gering.
1.3. Pathogenese
Nahezu 98 % aller Tumoren der ableitenden Harnwege gehen vom Epithel aus und sind in
fast derselben Häufigkeit Karzinome. Etwa 90 % der Harnblasenkarzinome sind
Urothelkarzinome (Murphy et al., 1994). In den westlichen Industrienationen sind andere
Differenzierungsformen wie z.B. reine Plattenepithelkarzinome (mit einem Anteil von 3 %)
oder Adenokarzinome (mit einem Anteil von 2 %) eher selten (Kantor et al., 1988). Andere
Differenzierungsformen (z. B. kleinzellige Karzinome) sind als ausgesprochene Raritäten
anzusehen. Mischdifferenzierungen zwischen verschiedenen histologischen Typen werden
gelegentlich beobachtet (Murphy et al., 1994).
Papilläre Urothelkarzinome entstehen in der Regel nicht aus gutartigen Vorläuferstufen
(Papillomen), sondern meist aus primär unauffälliger urothelialer Schleimhaut. Bei der
Entwicklung eines invasiven Karzinoms sind prinzipiell zwei Wege möglich: Einerseits das
Entstehen aus einem Carcinoma in situ, zum anderen das Entstehen aus einem nicht-invasiven
papillären Urothelkarzinom heraus. Wesentliche molekulare Mechanismen bei der Karzinogenese bis zum invasiven Urothelkarzinom sind ein Chromosom 9-Defekt und eine Mutation
des p53-Tumorsupressorgens auf Chromosom 17 (Brandau und Böhle, 2001). Mit zunehmen-
6
der Aggressivität und Progression finden weitere chromosomale Veränderungen statt, zu
denen Defekte des Retinoblastomgens, des H-ras Genes, des HER2/neu-Genes, sowie weitere
chromosomale Veränderungen zählen (Lee und Droller, 2000). Im Zuge dieser weiteren
Veränderungen nimmt der Tumor meist ein muskelinvasives Stadium (pT≥2) an und wird
somit zu einer lebensbedrohlichen Krankheit, die entsprechend aggressiv zu therapieren ist.
1.4. Histologischer Malignitätsgrad und Tumorstadium
Im Jahre 1998 wurde von der World Health Organization (WHO) und der Internationalen
Gesellschaft für Urologische Pathologie (ISUP) eine Konsensusklassifikation zur
Bestimmung des histologischen Malignitätsgrades (Gradings) vorgestellt (Epstein et al.,
1998), die bisherige Unschärfen in der vorhergehenden WHO-Klassifikation von 1973
(Mostofi et al., 1973) beseitigen sollte. Nach dieser WHO/ISUP-Klassifikation werden
urotheliale Tumoren der Harnblase in vier Gruppen eingeteilt: Hyperplasien, flache
intraurotheliale Neoplasien, papilläre urotheliale Neoplasien und invasive Tumoren. Lediglich
die drei letztgenannten Gruppen stellen echte Neoplasien dar. Bei den papillären urothelialen
Neoplasien werden gemäß der WHO/ISUP-Klassifikation solche mit niedrigem
Malignitätspotential („papillary urothelial neoplasia with low malignant potential“, abgekürzt
PUNLMP) sowie sogenannte „low grade“ und „high grade“ Karzinome unterschieden. Zu den
flachen intraurothelialen Neoplasien zählen die einfache Urotheldysplasie und das urotheliale
Carcinoma in situ. Bei den invasiven Karzinomen werden lediglich „low grade“ und „high
grade“ Karzinome unterschieden. Die morphologischen Kriterien von „low grade“- und „high
grade“ Urothelkarzinomen werden im Folgenden näher geschildert:
low grade:
Histologie: geringe, geschmolzene, verzweigte Papillae; Vorherrschen leicht
ungeordneter Architekturmuster; Verlust von Polarität und Kohäsion
Zytologie: leichte bis mäßige Kernpleomorphie, viele Mitosen, große Nucleoli.
high grade:
Histologie: vollständiges Fehlen einer Regelmäßigkeit der Anordnung, Verlust
der superfizialen Zellen, Verlust der zellulären Kohäsion
Zytologie: starke Kernpleomorphie, zahlreiche irregulär verteilte Mitosen
7
Die Einteilung des Tumorstadiums (Stagings) erfolgt nach den Kriterien der „Union
International Contre le Cancer“ (UICC) wie folgt (Hermanek et al., 1997):
Tabelle 1: Stadieneinteilung des Harnblasenkarzinoms nach der UICC
T1
Tumor infiltriert das subepitheliale Bindegewebe
T2a
Tumor infiltriert die Lamina muscularis propria mit einer
maximalen Eindringtiefe von nicht mehr als 50% der Dicke dieser
Schicht
T2b
Tumor infiltriert die Lamina muscularis propria mit einer
maximalen Eindringtiefe von mehr als 50% der Dicke dieser
Schicht
T3a
Tumor infiltriert mikroskopisch sichtbar in das perivesikale Fett
T3b
Tumor infiltriert makroskopisch sichtbar in das perivesikale Fett
T4a
Tumor infiltriert Prostata, Uterus, Vagina oder wächst frei ins
Becken
T4b
Tumor durchbricht die Bauchwand oder die Beckenwand
8
1.5. Therapie
Es werden blasenerhaltende und nicht-blasenerhaltende operative Therapieformen unterschieden. Unter einer nicht blasenerhaltenden Therapie versteht man die radikale Zystektomie,
welche bei muskelinvasiven Tumoren (Stadium pT>2) mittlerweile als GoldstandardTherapie angesehen wird (Stein et al., 2001). Zu den blasenerhaltenden Therapien zählen in
erster Linie die transurethrale Resektion (TUR), während partielle Zystektomien nur in
Ausnahmefällen durchgeführt werden. Unter den nichtoperativen Therapieformen sind die
Radiotherapie, die Chemotherapie sowie die intravesikale Therapie mit Zytostatika (z.B.
Mitomycin C, Doxorubicin) oder immunmodulatorisch wirksamen Substanzen (z.B. Bacillus
Calmette-Guérin, BCG) von Bedeutung. Unter den genannten Therapieoptionen scheint die
Erhaltungstherapie („maintenance therapy“) mit BCG besonders effektiv zur Progressionsprophylaxe von oberflächlichen Harnblasenkarzinomen geeignet zu sein (Böhle und Bock, 2004).
Auch stellt die BCG-Therapie zur Rezidivprophylaxe des urothelialen Carcinoma in situ ein
Mittel der Wahl dar. Weiterhin werden derzeit neuere Therapieansätze mit Interferonen und
Interleukinen durchgeführt.
1.6. Prognosefaktoren
1.6.1. Etablierte Prognosefaktoren
Beim Harnblasenkarzinom gelten derzeit das Tumorstadium, der Lymphknotenstatus und
der histologische Malignitätsgrad (Grading) als allgemein anerkannte, etablierte Prognosefaktoren. Alleine mit Hilfe dieser drei Kriterien ist die Vorhersagbarkeit des biologischen
Verlaufes der Tumoren allerdings meist nicht ausreichend (Stein et al., 1998). Daher werden
weltweit intensive Anstrengungen bei der Identifizierung weiterer Prognosefaktoren
unternommen, wobei insbesondere immunhistochemische Marker im Zentrum des Interesses
liegen. In diesem Zusammenhang wurde bereits für einige Marker eine Assoziation mit dem
klinischen Verlauf von Harnblasenkarzinomen beschrieben, so z.B. für das Ki-67 Antigen
(Korkolopoulou et al., 1997; Oosterhuis et al., 2000), das „proliferating cell nuclear antigen“
(PCNA) (Korkolopoulou et al., 1997), das p53-Tumorsuppressorprotein (Raitanen et al.,
1997; Bernardini et al., 2001), das p21-Tumorsuppressorprotein (Liukkonen et al., 2000) oder
das Zyklus-regulierende Cyclin D1-Protein (Tut et al., 2001; Sgambato et al., 2002).
9
1.6.2. HER2/neu als potenzieller neuer Prognosefaktor
Beim Mammakarzinom wurde in den letzten 15 Jahren die Expression des HER2/neuWachstumsfaktorrezeptors intensiv erforscht und auch als prognostischer Indikator
beschrieben. Das HER2/neu-Protein wird durch das auf dem Chromosom 17 lokaliserte
HER2/neu-Onkogen (auch c-erbB2-Onkogen genannt) kodiert und stellt ein 185 kDa großes
Glykoprotein dar, das als transmembranöser Tyrosinkinaserezeptor vom Typ des Epidermalgrowth-factor-Rezeptors (EGFR) fungiert (Wiethege et al., 2000). Eine durch LigandenRezeptor-Bindung aktivierte Tyrosinkinase setzt intrazelluläre Signalübertragungen in Gang,
welche Einfluss auf das Wachstum, Differenzierung und Überleben der Zelle nehmen.
Überexpression von HER2/neu ist assoziiert mit einer erhöhten Proliferationsrate der Zellen,
einem erhöhten angiogenetischen Potential und verminderter Zelladhäsion. Beim Mammakarzinom konnt gezeigt werden, dass in ungefähr 30 % Prozent der Fälle eine Überexpression
des HER2/neu-Gens vorliegt, welche auch mit einem schlechteren klinischen Verlauf
korreliert (Tzahar et al., 1996). Daher wird die Überexpression von HER2/neu als wichtiger
prognostischer Faktor insbesondere bei Patientinnen, die bereits Lymphknotenmetastasen
entwickelt haben, angesehen (Toikkanen et al., 1992). Weiterhin konnte am Mammakarzinom
die Wirksamkeit einer Kombinationstherapie mit dem monoklonalen Antikörper Transtuzumab (Herceptin ) und einem Chemotherapeutikum bei HER2/neu überexprimierenden
Tumoren gezeigt werden (Slamon et al., 2001; Ranson und Shiwkowski, 2002). Somit ist
denkbar, dass auch beim Harnblasenkarzinom die Möglichkeit eines therapeutischen Nutzens
besteht. Erste klinische Studien hierzu sind bereits angelaufen (Small et al., 2003).
Die bisher publizierten Ergebnisse über die HER2/neu-Expression beim Harnblasenkarzinom
(McCann et al., 1990; Zhau et al., 1990; Moriyama et al., 1991; Wood et al., 1991; Wright et
al., 1991; Lipponen et al., 1991; Sato et al., 1992; Coombs et al., 1993; Fossa et al., 1993;
Sauter et al., 1993; Gorgoulis et al., 1995; Underwood et al., 1995; Mellon et al., 1996;
Ravery et al., 1997; Korkolopoulou et al., 1997; Vollmer et al., 1998; Ioachim et al., 2000;
Jiminez et al., 2001; Latif et al., 2003; Latif et al., 2004; Pinieux et al., 2004; Krüger et al.,
2004) sind recht uneinheitlich, was vor allem auf unterschiedliche Testmethoden
zurückzuführen sein dürfte. Inzwischen sind für die HER2/neu-Analyse beim
Mammakarzinom mehrere standardisierte Tests erhältlich, um reproduzierbare Ergebnisse
liefern zu können. Der von der amerikanischen Food and Drug Administration (FDA)
10
zugelassene HercepTest® (DAKO, Glostrup, Dänemark) ist in Mitteleuropa einer der am
meisten verbreiteten Test. Ein standardisierter und ebenfalls von der FDA zugelassener Test
zum Nachweis von Amplifikationen des HER2/neu-Gens (PathVysion®) wird von der Firma
Abbott-Vysis (Wiesbaden) vertrieben. Sowohl der HercepTest® als auch der PathVysion®
Test kamen in der vorliegenden Arbeit zur Anwendung.
1.7. Fragestellung
Dieser Arbeit liegt die folgende Fragestellung zugrunde:
A. Wie hoch ist der Anteil muskelinvasiver Harnblasenkarzinome, bei denen sich mit dem
HercepTest® eine Überexpression des HER2/neu-Proteins feststellen lässt?
B. Wie hoch ist der Anteil muskelinvasiver Harnblasenkarzinome, bei denen sich mit dem
PathVysion®-Färbekit eine Amplifikation des HER2/neu-Gens feststellen lässt?
C. Ist die Überexpression des HER2/neu-Proteins mit einer Amplifikation des HER2/neuGens assoziiert?
D. Besteht bei muskelinvasiven Harnblasenkarzinomen ein Zusammenhang zwischen einer
HER2/neu-Überexpression bzw. einer HER2/neu-Genamplifikation der Tumoren und dem
krankheitsbezogenen Überleben der Patienten? Stellt die HER2/neu-Überexpression bzw. die
HER2/neu-Genamplifikation möglicherweise einen Parameter mit prognostischer Aussagekraft dar?
11
2. Material und Methodik
2.1. Material
Untersucht wurden Tumorexzisate von 203 Patienten mit muskelinvasivem Urothelkarzinom
der Harnblase. Alle Patienten wurden zwischen 1990 und 1999 an der Klinik für Urologie der
Universität zu Lübeck durch radikale Zystektomie behandelt, wobei jeweils eine vollständige
Tumorexzision erfolgte (R0). Angaben zum Verlauf der Patienten wurden freundlicherweise
aus dem Krankenblattarchiv der Klinik für Urologie (UK-SH, Campus Lübeck) zur
Verfügung gestellt. Der Endpunkt der Verlaufsanalyse wurde mit dem 31.12.2000 terminiert.
Die im Instiut für Pathologie (UK S-H, Campus Lübeck) gestellte histologische Diagnose
lautete in allen Fällen „Urothelkarzinom der Harnblase“. Das Tumorstadium wurde nach den
Richtlinien der „Union Internationale contre le Cancer“ (UICC) angegeben (Hermanek et al.,
1997). In der überwiegenden Zahl der Patienten (54 %) wurde ein Tumor gefunden, dessen
maximale Organinfiltration auf die Lamina muscularis propria der Harnblase beschränkt war,
entsprechend dem Stadium „pT2“. Lymphknotenmetastasen waren in 31 Fällen (15 %) histologisch nachweisbar. Hinsichtlich des Gradings, das nach der Klassifikation der World Health
Organisation/ International Society of Urological Pathology (WHO/ISUP) vorgenommen
wurde (Epstein et al., 1998), entsprachen 190 der 203 Tumoren (= 93,6 %) einem „high
grade“ und 13 Tumoren (= 6,4 %) einem „low grade“ Karzinom. Darüber hinaus wurden die
Harnblasenkarzinome nach einer kürzlich von Jiminez et al. (2000) vorgestellten Einteilung
der Tumoren nach ihrem Wachstumstyp (nodulär, trabekulär oder infiltrativ) klassifiziert.
Etwas mehr als die Hälfte der Tumoren (103/203, = 50,7 %) war dem infiltrativen Typ zuzuordnen, während 49,3 % der Tumoren einen nodulären bzw. trabekulären Wachstumstyp
aufwiesen.
2.2. Immunhistochemische Färbemethodik und Auswertung
Von Paraffinblöcken mit repräsentativem Tumorgewebe wurden 5 µm dicke Schnitte
angefertigt. Die immunhistochemische Färbung erfolgte mit dem HercepTest® der Firma
DAKO (Glostrup, Dänemark). Die Färbung wurde unter genauer Beachtung der
Färberichtlinien des Herstellers durchgeführt. Das membranständige HER2/neu-Protein
12
wurde dabei mit dem polyklonalen Kaninchen-Primärantikörper A0485 nachgewiesen. Der
weitere immunhistochemische Prozess zum Nachweis des HER2/neu Proteins mittels
HercepTest® erfolgte nach einem standardisierten Meerrettichperoxidase-Verfahrens unter
Verwendung von Diaminobenzidin (DAB) als Farbstoff. Dabei war die Meerrettichperoxidase
an einen sekundären Antikörper gekoppelt, welcher an den zuvor aufgebrachten primären
Antikörper bindet. Das Enzym Meerettichperoxidase bildete im nächsten Schritt einen
Komplex mit seinem Substrat Wasserstoffperoxid. Dieser Komplex reagierte mit DAB,
welches durch Oxidation polymerisiert wurde. An der Stelle des Zielantigens, dem
HER2/neu-Transmembranprotein, bildete sich ein unlösliches, braunes Polymer, welches
schon makroskopisch sichtbar war.
Die einzelnen Arbeitsschritte lauteten wie folgt:
1. Erwärmen der Schnitte auf 60 °C
2. Entparaffinieren und Rehydrieren der Schnitte durch Baden in
2 x Xylol (100 %), je 5 Minuten
2 x Ethanol (95 %), je 3 Minuten
2 x Ethanol (70 %), je 3 Minuten
anschließendes Spülen in Aqua dest. für ca. 30 Sekunden
3. Antigendemaskierung
40 minütige Inkubation der Schnitte in Antigendemaskierungslösung („epitope
retrieval solution“; im HercepTest®-Kit mitgeliefert) in einem 96 °C warmen Wasserbad, anschließendes Abkühlen und Waschen in Waschpuffer (im HercepTest®-Kit
enthalten)
4. Blocken der Peroxidase
Behandlung der Schnitte mit je 100 µl Peroxidase-Blockungsreagenz (im
HercepTest®-Kit enthalten) für 5 Minuten bei Raumtemperatur, danach ca. 1 Minute
in Aqua dest., danach 5 Minuten in frischem Waschpuffer spülen
13
5. Aufbringen des Primärantikörpers bzw. der Negativ-Kontrollreagenz
(Kaninchen Anti-Human HER2 Primärantikörper bzw. Negativ-Kontrollreagenz des
HercepTest®-Kits), je 100 µl pro Schnitt wurden aufgetragen, bei einer
Inkubationszeit von 30 Minuten. Erneutes Spülen in frischem Waschpuffer für
zunächst 1 Minute, danach in wiederum frischem Waschpuffer 5 Minuten baden.
6. Behandlung mit Detektionsreagenz
Pro Schnitt werden 100 µl der im HercepTest®-Kit beigefügten Lösung aufgetragen,
die den sekundären Brückenantikörper enthält. Man lässt diese dann für 30 Minuten
bei Raumtemperatur inkubieren.
Anschließend Schnitte in frischen Waschpuffer ca. 1 Minute, in nochmals frischen 5
Minuten stellen.
7. Aufbringen der DAB Substrat-Chromogenlösung
Diese wird am Tage der Färbung aus 30 µl DAB-Chromogen und 1 ml gepuffertem
Substrat (beide Reagenzien sind Bestandteile des HercepTest®-Kits) hergestellt.
Pro Schnitt werden 100 µl der DAB Substrat-Chromogenlösung aufgebracht, und
diese lässt man für 30 Minuten inkubieren. Danach wird die DAB SubstratChromogenlösung vom Schnitt entfernt. Die Schnitte werden durch zweimaliges
Baden in Aqua dest. gereinigt.
8. 4 Minuten Gegenfärben mit Hämatoxylin
9. Eindecken der Schnitte in permanentem Eindeckmedium
Bei jeder Färbung wurden Positivkontrollen, die dem HercepTest® beilagen, mitgeführt.
Diese bestanden aus Objektträgern, auf die per Zytospin-Verfahren drei verschiedene humane
Mammakarzinomzelllinien mit unterschiedlichem HER2/neu-Status (Scores 3+, 1+ und 0)
aufgebracht worden waren. Ferner wurde bei jeder Färbung eine Negativkontrolle mitgeführt,
indem auf einem Objektträger anstelle des HER2/neu-Antikörpers ein ebenfalls im
HercepTest® enthaltenes „Negativkontroll-Reagens“ aufgebracht wurde.
14
Alle immunhistochemisch gefärbten Schnitte wurden an einem Lichtmikroskop bei 400facher Vergrößerung ausgewertet. Da Vorversuche gezeigt hatten, dass das HER2/neuFärbeverhalten innerhalb eines Tumors im invasiven und im nicht-invasiven Bereich meist
unterschiedlich ausgeprägt war, wurde jeweils ausschließlich der invasive Anteil ausgewertet.
Die Evaluation der HER2/neu-Proteinexpression erfolgte gemäß den Richtlinien des
Herstellers des HercepTests®. Demnach war die Einteilung in die Scores 3+ bis 0 durch
folgende Kriterien definiert (Tabelle 2):
Tabelle 2: Kriterien der Scoreeinteilung bei der Auswertung der immunhistochemischen
HER2/neu-Färbung
Score
Membranfärbung
HER2/neu-Status
0
weniger als 10% der Tumorzellen zeigen eine Mem- negativ
branfärbung
1+
unvollständige Färbung der Membran
negativ
bei mehr als 10% der Tumorzellen
2+
leichte bis mäßige, komplette Färbung der
Membran bei mehr als 10% der Tumorzellen
3+
starke und komplette (ringförmige) Färbung bei
mehr als 10% der Tumorzellen
schwache HER2/neuÜberexpression
starke HER2/neuÜberexpression
Beispiele für den lichtmikroskopischen Aspekt der vier unterschiedlichen Färbescores sind in
der nachstehenden Abb. 1 illustriert.
15
Abb. 1: Immunhistochemische HER2/neu-Färbeergebnisse bei vier verschiedenen muskelinvasiven Harnblasenkarzinomen mit den Scores 0 (links oben), 1+ (rechts oben), 2+
(links unten) und 3+ (rechts unten; Originalvergrößerung: jeweils 600x)
Laut Herstellerangaben sind die HER2/neu-Scores 2+ und 3+ als „positiv“ zu werten.
In der vorliegenden Studie wurde den Harnblasenkarzinomen, die mit einem Score von 3+
bewertet wurden, besonderes Augenmerk geschenkt, da – nach den Erfahrungen am
Mammakarzinom – diese Tumoren generell als für eine Herceptin®-Therapie geeignet gelten.
Zur Vereinfachung des Sprachgebrauchs werden daher in dieser Studie Tumoren mit einem
Score von 3+ als „HER2/neu überexprimierend“ anstelle von „stark HER2/neu überexprimierend“ bezeichnet.
16
2.3. FISH-Analyse
Um quantitative Nachweise eines Gens in Zellkernen durchführen zu können, hat sich die
Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) als geeignetes Verfahren erwiesen. Als in situHybridisierung bezeichnet man Verfahren, die den in situ-Nachweis von DNA-Sequenzen auf
einem Chromosomenpräparat erlauben. Hierbei müssen die auf einem Objektträger fixierten
Zellen zuerst denaturiert werden, um die doppelsträngige DNA in Einzelstrang-DNA zu
überführen. Anschließend erfolgt die eigentliche Hybridisierung mit der komplementären
DNA-Sequenz auf dem Metaphasepräparat. Diese Sonden können entweder durch weitere
Antikörperbindungen in einem weiteren Schritt sichtbar gemacht werden oder, wie in diesem
Fall, direkt eine Fluorochrommarkierung tragen. Die fluoreszenzmarkierten Sonden sind unter
einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar, welches die Signale verstärkt. Um den Nachweis einer
spezifischen Genamplifikation durchführen zu können, ist es wichtig, dass nicht nur eine
Sonde für das nachzuweisende Gen, sondern auch eine Sonde für das zugehörige Chromosom
enthalten ist. Hierbei hat sich als wirkungsvoll erwiesen, eine Sonde zu wählen, mit der die
Zentromerregion des Chromosoms markiert wird. So wird es möglich, die Häufigkeit beider
Signale zu bestimmen und den Quotienten zu ermitteln. Ein Quotient von > 2,0 entspricht
definitionsgemäß einer Genamplifikation.
In der vorliegenden Arbeit wurde nur an einem repräsentativen Teil der Tumoren (N = 42)
eine FISH-Färbung durchgeführt, wobei das durch die amerikanische FDA zugelassene
PathVysion-Färbekit (Abbott-Vysis, Wiesbaden) zur Anwendung kam. Die Färbung der
Paraffinschnitte erfolgte unter genauer Beachtung der Färbeanleitung des Herstellers.
Die einzelnen Arbeitsschritte des 1. Färbetages lauteten:
1. Erwärmen der Schnitte auf 60°C
2. Entparaffinieren der Schnitte durch Baden in
2 x Xylol (100 %), je 15 Minuten
2 x Ethanol (100 %), je 5 Minuten
17
Anschließend für ca. 3 Minuten im Ofen bei 50 °C lufttrocknen
3. Vorbehandlung der Schnitte in 0,2 N HCl für 20 Minuten,
danach zuerst 3 Minuten in Aqua dest., dann 3 Minuten in Waschpuffer (im
PathVysion Kit enthaltenen Lösung wird am Tage der Färbung auf pH 7,0 geeicht,
ist dann gebrauchsfertig) spülen
4. Inkubation in Pretreatment-Lösung (im PathVysion Kit enthalten) über einen
Zeitraum von 30 Minuten in einem 80 °C Wasserbad. Danach werden die Schnitte erst
für 1 Minute in Aqua dest., dann für 5 Minuten im ersten Waschpuffer und schließlich
für 5 Minuten im zweiten Waschpuffer gewaschen.
5. Behandlung im Proteasebad bei 37 °C (10 min). Die im PathVysionKit enthaltene
Proteasepufferlösung wird mittels 1 N Salzsäure bzw. 1 N Natriumhydroxid auf einen
pH-Wert von 2,0 eingestellt und auf 37 °C vorgewärmt; erst kurz vor Gebrauch
werden 25 mg Protease (2500-3000 U/mg, im PathVysion Kit enthalten) hinzugegeben. Danach werden die Schnitte 5 Minuten lang im ersten Waschpuffer, dann 5
Minuten lang im zweiten Waschpuffer gereinigt. Die Schnitte werden anschließend
für 3 Minuten in einem 50 °C warmen Ofen luftgetrocknet.
6. Fixieren des Materials in PBS-gepuffertem Formalin (enthält 4% Formaldehyd),
wobei wichtig ist, die im PathVysion Kit enthaltene Lösung auf pH 7,0 zu
kalibrieren. Nun werden die Schnitte wiederum 5 Minuten im ersten, dann 5 Minuten
im zweiten Waschpuffer inkubiert, anschließend im 50 °C warmen Ofen
luftgetrocknet.
7. Inkubation in Denaturierungslösung (5 min) in einer Küvette im Wasserbad bei 72 °C,
wobei eine Küvette (entsprechend 70 ml Füllung) nicht mehr als 6 Schnitte beinhalten
darf. Die Denaturierungslösung des PathVysion Kit enthält zu 70% Formamid, der
pH-Wert hat zwischen 7,0 und 8,0 zu liegen. Nach diesem Vorgang werden die
Schnitte bei Raumtemperatur gewaschen in:
Ethanol, 70 %, 1 Minute
Ethanol, 85 %, 1 Minute
Ethanol, 100 %, 1 Minute;
anschließendes Lufttrocknen in einem 50 °C warmen Ofen.
18
8. Hybridisieren: Aufbringen von jeweils 10 µl Hybridisierungslösung (im PathVysion
Kit enthalten) auf ein 22 x 22 mm großes Areal der Schnitte. Die Hybridisierugslösung stellt eine Mixtur aus 2 Sonden dar: eine mit „Spectrum Orange“ Fluorochrommarkierte DNA-Sonde, die an die HER2/neu-Genregion (17q11.2-q12) bindet, und
eine mit „Spectrum Green“ Flurochrom-markierte DNA-Sonde, die an die AlphaSatelliten-Region des Chromosoms 17 bindet.
Anschließend luftblasenfreise Eindecken mit Fixogum und Lagern über Nacht (für
14 bis 18 Stunden) bei 37°C in einer feuchten Dunkelkammer.
Die Arbeitsschritte des 2. Färbetages lauteten:
1. Objektträger bei 72 °C in Posthybridisierungspuffer (aus PathVysion Kit) für 30
Minuten inkubieren. Dies geschieht nach vorsichtigem Ablösen der Deckgläschen im
Wasserbad.
2. Gegenfärben der Kerne mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI): Pro Schnitt werden
10 µl DAPI-Lösung (im PathVysion Kit enthalten) aufgetragen, wobei Handschuhe
getragen werden sollten, da DAPI toxisch ist. Die Schnitte werden nun mit einem 22
x 22 mm messenden Deckgläschen eingedeckt, mit Fixogum abgedichtet und
danach bis zur Auswertung im Kühlschrank bei 8 oC dunkel gelagert.
Bei allen Färbevorgängen wurden Positivkontrollen (Paraffinschnitte von Mammakarzinomen
mit bekannter HER2/neu-Genamplifikation oder vom Hersteller mitgelieferte ProbeCheck®Kontrollschnitte) mitgeführt.
Die Signalauswertung erfolgte ohne Kenntnis der Ergebnisse der immunohistochemischen
Färbeergebnisse an einem Fluoreszenzmikroskop AXIOPLAN der Firma Zeiss (Göttingen),
das mit einem geeigneten Rot- und Grün-Multi-Bandpass-Filterset ausgestattet war. Bei
jedem Präparat wurden 60 Tumorzellkerne bei 1000-facher Vergrößerung (in Ölimmersion)
evaluiert, indem in jedem Zellkern die Anzahl roter und grüner Signale gezählt wurde. Dabei
entsprach jeweils ein rotes Signal einem HER2/neu-Genlokus, ein grünes Signal dagegen
markierte jeweils die Zentromerregion des zugehörigen Chromosoms 17. Eine HER2/neu19
Genamplifikation lag definitionsgemäß dann vor, wenn der durchschnittliche Quotient von
roten zu grünen Signalen (bezogen auf alle 60 ausgewerteten Zellen) größer als 2,0 war. Auf
diese Weise wurden alle Fälle entweder als positiv oder als negativ hinsichtlich einer
HER2/neu-Genamplifikation klassifiziert. Ein Beispiel für ein Harnblasenkarzinom mit
positiver HER2/neu-Genamplifikation ist in der nachstehenden Abb. 2 illustriert.
Abb. 2: Harnblasenkarzinomzellkern mit per FISH-Technik nachweisbarer HER2/neuGenamplifikation. Die HER2/neu-Genkopien sind durch rote, die Zentromerregionen
des Chromosoms 17 durch grüne Signale dargestellt. Die zahlreichen, teilweise in
Clustern gelegenen roten Signale deuten eine HER2/neu-Genamplifikation an (Originalvergößerung: 2000x).
2.4. Statistische Auswertung
Alle statistischen Berechnungen erfolgten mit Hilfe des SPSS®-Statistikprogramms (SPSS,
München). Das Signifikanzniveau (p) betrug jeweils <0,05. Die Zusammenhänge zwischen
den immunhistochemischen Ergebnissen und anderen klinisch-pathologischen Parametern
wurden in Kreuztabellen unter Verwendung des Pearson-χ2-Tests auf statistische Signifikanz
geprüft. Nach Anfertigung von Kaplan-Meier-Überlebenskurven wurden Gruppenvergleiche
unter Verwendung des log-rank Testes vorgenommen. In diesem Zusammenhang wurden
ferner univariate und multivariate Cox-Regresssionsanalysen durchgeführt, wobei für jeden
Paremeter das Relative Risiko (RR) und das 95%-Konfizenzintervall (95% CI) berechnet
20
wurde. In die Multivariat-Analyse wurden nur diejenigen Parameter eingeschleust, die in der
Univariat-Analyse einen p-Wert von <0,10 erzielt hatten.
3. Ergebnisse
3.1. Immunhistochemische HER2/neu-Expression
Eine Score von 3+, entsprechend einer starken Überexpression des HER2/neu-Proteins,
konnte in 76 der 203 Fälle nachgewiesen werden. Dies entsprach einem Anteil von 37%. Der
Score 2+ wurde in 37 Fällen (18%), der Score 1+ in 46 Fällen (23%) und der Score 0 in 44
Fällen (22%) festgestellt.
Ein Vergleich des immunhistochemischen HER2/neu-Status mit verschiedenen klinischpathologischen Parametern (Tabelle 3) zeigte, dass eine HER2/neu-Überexpression
signifikant häufiger in der Gruppe der „high grade“ Karzinome (76/190 Fälle, = 40%) als in
der Gruppe der „low grade“ Karzinome (0/13 Fälle, = 0%) vorzufinden ist (p = 0,004).
Ebenfalls bestand ein signifikanter Zusammenhang mit dem Wachstumstyp: Eine HER2/neuÜberexpression konnte bei einem Großteil der Tumoren vom infiltrativen Wachstumstyp
(81/103, = 79%) beobachtet werden, hingegen bei einem deutlich geringeren Teil (46/100, =
46%) der Tumoren vom nicht-infiltrativen (nodulären oder trabäkulären) Wachstumstyp (p =
0,0001). Eine entsprechende Analyse des Patientenalters, des Geschlechts, des Tumorstadiums und des Lymphknotenstatus zeigte keinen statistisch signifikanten Unterschied. Lediglich
eine Tendenz bezüglich des Lymphknotenstatus war feststellbar: Fälle mit positivem
Lymphknotenbefall zeigen eine häufigere HER2/neu-Überexpression (16/31 Fälle, = 52 %)
als Fälle mit negativem Lymphknotenbefall (60/172 Fälle, =35%; p = 0,077).
In der nachstehenden Tabelle werden die Ergebnisse des Vergleichs von immunhistochemischem HER2/neu-Status und verschiedenen klinisch-pathologischen Parametern wiedergegeben.
21
Tabelle 3: Vergleich zwischen immunhistochemischem HER2/neu-Status und klinischpathologischen Parametern
HER2/neuMerkmal
Gesamtheit
(N = 203)
Anzahl
Überexpression
(N = 76)
Anzahl
keine HER2/neu-
Statistischer Ver-
Überexpression
gleich (Überexpres-
(N = 127)
(%)
Anzahl
sion versus keine
(%)
Überexpression)
Alter (Jahre)
Median
64
63
65
nicht signifikant
Streuung
29-87
29-87
38-79
p = 0,531
Geschlecht
männlich
127
31
(24,4)
96
(75,9)
nicht signifikant
weiblich
76
15
(19,7)
61
(80,3)
p = 0,443
low grade
13
0
(0)
13
(100)
signifikant
high grade
190
76
(40,0)
114
(60,0)
p = 0,004
109
40
(36,7)
69
(63,3)
nicht signifikant
94
36
(38,3)
58
(61,7)
p = 0,815
172
60
(34,9)
112
(65,1)
nicht signifikant
31
16
(51,6)
15
(48,8)
p = 0,077
103
54
(54,0)
46
(46,0)
signifikant
nichtinfiltrativ 100
22
(21,4)
81
(78,6)
p = 0,0001
Grading
Tumorstadium
pT2
pT3/pT4
Lymphknotenstatus
pN0
pN1/pN2
Wachstumstyp
infiltrativ
(nodulär/trabäkulär)
22
3.2. FISH-Ergebnisse
Die FISH-Untersuchung wurde nur exemplarisch an 42 repräsentativen Tumoren
durchgeführt. Dabei entsprachen 7 der Schnitte dem Score 0, 9 Schnitte einem Score 1+, 10
einem Score 2+ und 16 einem Score von 3+ in der immunhistochemischen Färbung. Eine
HER2/neu-Genamplifikation konnte nur bei zwei Harnblasenkarzinomen (= 5 %) nachgewiesen werden. Beide Tumoren entstammten der Gruppe der immunhistochemisch mit einer
Score 3+ eingestuften Tumoren. Eine detaillierte Auflistung der Ergebnisse findet sich in der
nachstehenden Tabelle 4.
Tabelle 4: Häufigkeit einer HER2/neu-Genamplifikation (mittels FISH-Technik
evaluiert) bei 42 muskelinvasiven Urothelkarzinomen der Harnblase
Keine HER2/neu-
Score 0
Score 1+
Score 2+
Score 3+
(N = 7)
(N = 9)
(N = 10)
(N = 16)
7
9
10
14
(100%)
(100%)
(100%)
(87,5%)
0
0
0
2
(0%)
(12,5%)
Genamplifikation
(%)
HER2/neuGenamplifikation
(%)
(0%)
(0%)
3.3. Analyse der Überlebensraten
In 147 der insgesamt 203 Fälle (72 %) ließen sich Daten zum krankheitsbezogenen Überleben
der Patienten ermitteln. Im Durchschnitt betrug die Dauer der Verlaufskontrolle 50 Monate
(Median 41 Monate, Spannweite: 6 - 134 Monate). Im Verlauf starben nach einem Zeitraum
von durchschnittlich 21 Monaten (Median 14 Monate, Spannweite: 5 - 67 Monate) 35
23
Patienten (24 %) mit oder an ihrem Tumorleiden. 72 Patienten (49 %) starben entweder an
Ursachen, die nicht in Verbindung mit dem Harnblasenkrebs standen oder waren zum
Endpunkt der Studie noch am Leben. 40 Patienten (27 %) waren nach einer Zeitspanne von
durchschnittlich 37 Monaten (Median 30 Monate; Spannweite: 6 - 111 Monate) dem Followup aus unbekannten Gründen nicht mehr zugänglich. Diese Fälle wurden als „zensierte“
Daten betrachtet und bei den Kaplan-Meier-Überlebenskurven mit kleinen vertikalen Strichen
im Kurvenverlauf gekennzeichnet.
Insgesamt ließ sich feststellen, dass das krankheitsbezogene Überleben bei HER2/neuüberexprimierenden Tumoren im Vergleich zu Tumoren ohne Überexpression signifikant
schlechter war (p = 0,0346; Abb. 3). Eine univariate Cox-Regressionsanalyse bestätigt diese
Beobachtung (p = 0,039; Tabelle 5).
Erwartungsgemäß sind auch das Tumorstadium (log-rank Test: p = 0,0038; univariate CoxAnalyse: p = 0,006; Abb. 4) und der Lymphknotenstatus (log-rank Test: p = 0,00001;
univariate Cox-Analyse: p = 0,0001; Abb. 5) für das krankheitsbezogene Überleben
Prädiktoren von hoher statistischer Signifikanz. Auch das Geschlecht hat bei univariabler
Analyse einen statistisch signifikanten Einfluss (log-rank Test: p = 0,0379; univariate CoxAnalyse: p = 0,043; Abb. 6) insofern, als Frauen einen schlechteren klinischen Verlauf als
Männer aufweisen. Weiterhin ist der Wachstumstyp des Karzinoms von Belang bezüglich des
krankheitsbezogenen Überlebens, denn Tumoren von einem infiltrativen Wachstumstyp
zeigten einen signifikant schlechteren Verlauf als nicht-infiltrativ wachsende Tumoren (logrank Test: p = 0,404; univariate Cox-Analyse: p = 0,046; Abb. 7).
Bei Durchführung einer multivariaten Cox-Regressionsanalyse erwiesen sich der
Lymphknotenstatus (p = 0,0001), das Tumorstadium (p = 0,028) und der immunhistochemische HER2/neu-Status (p = 0,030) als Faktoren mit unabhängiger prognostischer Bedeutung
(Tabelle 5).
24
Tabelle 5: Univariate und multivariate Cox-Regressionsanalyse zum krankheitsbezogenen Überleben von 147 Patienten mit muskelinvasivem Harnblasenkarzinom
Univariate Analyse
Multivariate Analyse
Parameter
RR
0.95 KI
p
RR
0.95 KI
p
Alter
1,28
0,66-2,50
0,464
1,34
0,71-2,77
0,334
2,09
1,02-4,26
0,043
1,55
0,74-3,27
0,247
1,59
0,22-11,65
0,646
0,73
0,09-5,85
0,768
1,44
1,01-2,06
0,046
1,15
0,76-1,72
0,510
2,68
1,33-5,39
0,006
2,21
1,09-4,48
0,028
2,39
1,69-3,38
0,0001
2,35
1,65-3,36
0,0001
2,02
1,04-3,95
0,039
2,12
1,08-4,48
0,030
( ≤ 64 vs. > 64 Jahre)
Geschlecht
(männlich vs. weiblich)
Grade
(low grade vs. high grade)
Wachstumstyp
(infiltrativ vs. nicht-infiltrativ)
pT Status
(pT2 vs. pT3/4)
pN Status
(pN0 vs. pN1/2)
HER2/neu-Status
(Überexprimierend vs.
nicht-überexprimierend)
In den nachstehenden Abbildungen 3 bis 7 sind die Kaplan-Meier-Überlebenskurven für diejenigen Parameter, die in der univariaten Cox-Analyse einen signifikanten p-Wert erzielt
hatten, wiedergegeben.
25
krankheitsbezogenes Überleben (%)
100
Stadium pT2 (n=83)
80
Stadium pT3/4 (n=64)
60
40
p = 0,0038
(log-rank Test)
20
20
40
60
80
100
120
Zeitspanne Zystektomie / tumorbedingtes Ableben (Monate)
krankheitsbezogenes Überleben (%)
100
keine HER2/neu Überexpression
(n=86)
80
HER2/neu Überexpression
(n=61)
60
40
p = 0,0346
(log-rank Test)
20
20
40
60
80
100
120
Zeitspanne Zystektomie / tumorbedingtes Ableben (Monate)
Abb. 3 (oben) und Abb. 4 (unten): Kaplan-Meier-Überlebenskurven zum krankheitsbezogenen Überleben von Patienten mit muskelinvasivem Harnblasenkarzinom, aufgeschlüsselt nach dem immunhistochemischen HER2/neu-Status (Abb. 3) und dem
Tumorstadium (Abb. 4)
26
krankheitsbezogenes Überleben (%)
100
ohne LymphknotenMetastasen (n=124)
80
p = 0,00001
(log-rank Test)
60
mit LymphknotenMetastasen (n=23)
40
20
20
40
60
80
100
120
Zeitspanne Zystektomie / tumorbedingtes Ableben (Monate)
krankheitsbezogenes Überleben (%)
100
Männer (n=118)
80
60
Frauen (n=29)
40
p = 0,0379
(log-rank Test)
20
20
40
60
80
100
120
Zeitspanne Zystektomie / tumorbedingtes Ableben (Monate)
Abb. 5 (oben) und Abb. 6 (unten): Kaplan-Meier-Überlebenskurven zum krankheitsbezogenen Überleben von Patienten mit muskelinvasivem Harnblasenkarzinom, aufgeschlüsselt nach dem Lymphknotenstatus (Abb. 5) und dem Geschlecht (Abb. 6)
27
krankheitsbezogenes Überleben (%)
100
80
nicht-infiltrativer Typ
(n=67)
60
infiltrativer Typ
(n=80)
40
p = 0,0404
(log-rank Test)
20
20
40
60
80
100
120
Zeitspanne Zystektomie / tumorbedingtes Ableben (Monate)
Abb. 7: Kaplan-Meier-Überlebenskurve zum krankheitsbezogenen Überleben von
Patienten mit muskelinvasivem Harnblasenkarzinom, aufgeschlüsselt nach dem histologischen Wachstumsmuster
3.4. Beantwortung der unter 1.7. genannten Fragen
Die unter 1.7. gestellten Fragen lassen sich wie folgt beantworten:
A. Der Anteil muskelinvasiver Harnblasenkarzinome, bei denen eine mit dem HercepTest®
ermittelte HER2/neu-Proteinüberexpression (entsprechend dem immunhistologischen Score
3+) vorliegt, beträgt 37 %. Dies ist ein relativ hoher Anteil, der in der gleichen Größenordnung liegt wie beispielsweise beim Mammakarzinom.
B. Der Anteil muskelinvasiver Harnblasenkarzinome, bei denen eine mit dem PathVysion®Test ermittelte HER2/neu-Genamplifikation vorliegt, beträgt 5 % innerhalb des Gesamtkollektivs. Dieser Prozentsatz liegt deutlich niedriger als vergleichsweise beim Mammakarzinom.
28
C. Zwischen der HER2/neu-Proteinüberexpression und der -Genamplifikation besteht insofern ein Zusammenhang, als die wenigen Tumoren, die eine HER2/neu-Genamplifikation aufweisen (in der vorliegenden Studie: N = 2), gleichzeitig auch eine HER2/neu-Proteinüberexpression zeigen. Umgekehrt besteht allerdings nur bei 12 % der Tumoren mit HER2/neuProteinüberexpression auch eine Amplifikation des entsprechenden Gens. Dies bedeutet, dass
bei HER2/neu-überexprimierenden Tumoren die HER2/neu-Überexpression in einem großen
Teil der Fälle nicht auf eine HER2/neu-Genamplifikation zurückzuführen ist.
D. Die HER2/neu-Proteinüberexpression eines Harnblasenkarzinoms ist mit einem signifikant
schlechteren krankheitsbezogenen Überleben des betroffenen Patienten assoziiert. Insofern
stellt die immunhistochemische Evaluation des HER2/neu-Status eine potenziell geeignete
Methode dar, um nähere Informationen über den biologischen Verlauf eines muskelinvasiven
Harnblasenkarzinoms zu gewinnen. Die exakte Rolle des HER2/neu-Status als Prognosefaktor ist allerdings noch in weiteren prospektiven Studien näher zu validieren.
In der vorliegenden Studie ließ sich eine Korrelation zwischen HER2/neu-Genamplifikation
und klinischem Verlauf nicht bestimmen, da die Amplifikation nur bei insgesamt zwei
Tumoren nachweisbar war und diese kleine Fallzahl eine statistische Analyse nicht erlaubte.
Aufgrund des geringen Anteils an Harnblasentumoren mit HER2/neu-Genamplifikation
scheint dieser Parameter als prognostischer Faktor nicht geeignet zu sein.
29
4. Diskussion
4.1. Immunhistochemischer HER2/neu-Status
Seit Mitte der 1990er Jahre ist bekannt, dass die Expression von HER2/neu beim Mammakarzinom ein unabhängiges prognostisches Kriterium darstellt (Slamon et al., 1989; Fisher et
al., 1990; Lonn et al., 1995). Dies konnte inzwischen auch für andere maligne Tumoren wie
beispielsweise Karzinome der Zervix uteri (Niibe et al., 2003), des Corpus uteri (Rolitsky et
al., 1999), des Ovars (Slamon et al., 1989), der Prostata (Ross et al., 1997; Fossa et al., 2002),
der Lunge (Micke et al., 2001; Cox et al., 2001), der Speicheldrüsen (Muller et al., 1994;
Press et al., 1994), des Magens (Yonemura et al., 1998) oder des Kolons (Osako et al., 1998)
gezeigt werden.
Auch am Harnblasenkarzinom wurde in zahlreichen Studien der immunhistochemische
HER2/neu-Status untersucht. Die dabei publizierten Ergebnisse sind recht uneinheitlich: So
schwankt der Anteil der als HER2/neu-überexprimierend beschriebenen Harnblasentumoren
zwischen 2 % (McCann et al., 1990) und 74 % (Zhau et al., 1990). Diese großen
Schwankungen sind in erster Linie durch Unterschiede im Studiendesign, in der
immunhistochemischen Färbetechnik und in der Auswertungsmethodik zu erklären.
Bezüglich der prognostischen Bedeutung des HER2/neu-Status wird in einzelnen Studien ein
Zusammenhang zwischen einer HER2/neu-Überexpression und einer schlechteren Prognose
berichtet (Korkolopoulou et al., 1997; Miyamoto et al., 2000; Chow et al., 2001; Krüger et al.,
2004). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die HER2/neu-Überexpression beim Harnblasenkrebs mit einem höheren Grading und Staging korreliert (Lipponen et al., 1991; Ohta et
al., 2001). Die Ergebnisse der genannten Studien werden allerdings durch die Tatsache beeinträchtigt, dass in ihnen meist keine standardisierten immunhistochemischen Färbetests wie
z.B. der HercepTest® verwendet wurden. Mit Hilfe eines derartigen Tests sind die
immunhistochemischen Färbeergebnisse unabhängig vom medizinisch-technischen Labor
deutlich besser reproduzierbar.
30
Die vorliegenden, mit dem HercepTest® gewonnenen Ergebnisse deuten an, dass der immunhistochemische HER2/neu-Status beim muskelinvasiven Harnblasenkarzinom einen unabhängigen prognostischen Parameter darstellt. Vor diesem Hintergrund erscheint es in Zukunft
sinnvoll, muskelinvasive Harnblasenkarzinome generell hinsichtlich ihres HER2/neu-Status
mittels eines standardisierten Verfahrens zu untersuchen, um dem behandelnden Kliniker
zusätzliche Informationen zum biologischen Verhalten des Tumors aufzuzeigen.
4.2. HER2/neu-Genamplifikation
Die häufigsten Mechanismen, die einer Überexpression eines Onkogens auf molekularer
Ebene zugrunde liegen, sind Genamplifikation, Punktmutation, Translokation oder transkriptionelle Hochregulation. Beim Mammakarzinom liegt der Grund für eine Überexpression des
HER2/neu-Proteins fast immer in einer Amplifikation des HER2/neu-Gens (Slamon et al.,
1989). Beim Harnblasenkarzinom ist allerdings in verschiedenen Studien berichtet worden,
dass eine HER2/neu-Genamplifikation im Vergleich zur HER2/neu-Überexpression eher
selten ist. So fanden Mellon und Mitarbeiter (1996) mittels Southern Blot-Technik eine
HER2/neu-Genamplifikation nur in 4 % der Tumoren. Sowohl Miyamoto et al. (2000) als
auch Underwood et al. (1996) beobachteten mittels semiquantitativer Polymerase-KettenReaktion (PCR) eine HER2/neu-Genamplifikation in 32 % bzw. in 9 % der untersuchten
Tumoren. Der letztgenannte Wert liegt in derselben Größenordnung wie die von Sauter et al.
(1993) und Latif et al. (2003) genannten, mittels FISH-Technik ermittelten Werte (13 % bzw.
7 %). Auch der in der vorliegenden Arbeit gefundene Anteil von 5 % passt in diesen
Größenbereich. Angesichts eines derartig niedrigen Anteils von Harnblasenkarzinomen, die
eine HER2/neu-Genamplifikation aufweisen, erscheint der durch FISH-Technik ermittelte
HER2/neu-Genstatus bei dieser Tumorart als prognostischer Faktor ungeeignet. Darüber
hinaus ist auch zu erwähnen, dass die FISH-Analyse der HER2/neu-Genkopienzahl im
Vergleich zur immunhistochemischen Analyse der HER2/neu-Proteinexpression um ein
Mehrfaches teurer ist und somit alleine aus Kostengründen in der Routinediagnostik nur in
sehr eingeschränktem Umfang einsetzbar ist.
31
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass nur bei einem kleinem Anteil der
Harnblasentumoren, die eine HER2/neu-Überexpression aufweisen, der Grund für die Überexpression in einer HER2/neu-Genamplifikation zu suchen ist. Als Ursache für die Überexpression des HER2/neu-Proteins werden andere Mechanismen, die sich sowohl auf der Transkriptionsebene als auch auf der Posttranskriptionsebene abspielen, verantwortlich gemacht
(Latif et al., 2003).
Der in der vorliegenden Studie ermittelte Befund eines fehlenden Zusammenhanges zwischen
HER2/neu-Überexpression und HER2/neu-Genamplifikation deckt sich mit den Ergebnissen
anderer Autoren (Zhau et al., 1990; Sauter et al., 1993; Underwood et al., 1995; Latif et al.,
2003) und steht im Widerspruch zu der beim Mammakarzinom vorgefundenen Situation, die
durch eine sehr enge Korrelation zwischen HER2/neu-Überexpression und HER2/neuGenamplifikation gekennzeichnet ist (Slamon et al., 1989). Somit scheinen beim Harnblasenkarzinom offenbar andere Mechanismen eine Rolle bei der Tumorprogression zu spielen als
beim Mammakarzinom.
4.3. Therapeutische Möglichkeiten
Seit einigen Jahren ist beim Mammakarzinom bekannt, dass im fortgeschrittenen (metastasierten) Status die Kombinationsbehandlung von Trastuzumab (Herceptin®) und einem
Chemotherapeutikum den betroffenen Patientinnen einen Überlebensvorteil verschafft
(Slamon et al., 2001; Ranson und Sliwkowski, 2002). Die Therapie mit Herceptin® ist an
verschiedene Voraussetzungen gebunden. In den aktuellen Behandlungsrichtlinien (Piccart et
al., 2001) wird eine solche Behandlung nur dann empfohlen, wenn immunhistochemisch ein
HER2/neu-Score von 3+ oder mittels FISH-Technik bei Fällen mit einem immunhistochemischen Score 2+ eine HER2/neu-Genamplifikation nachgewiesen werden kann. Wie im vorangegangenen Abschnitt dargelegt wurde, bestehen hinsichtlich der Frequenz der HER2/neuGenamplifikation zwischen Mamma- und Harnblasenkarzinom erhebliche Unterschiede.
Daher erscheint es zweifelhaft, ob die für das Mammakarzinom geltenden Herceptin®Behandlungsrichtlinien ohne weiteres auch auf das Harnblasenkarzinom übertragbar sind. In
dieser Hinsicht ist noch einige Forschungsarbeit zu leisten. Nichtsdestoweniger wird der
therapeutische Einsatz von Herceptin® bereits bei Patienten mit metastasiertem
Harnblasenkarzinom bereits klinisch untersucht (Small et al., 2003).
32
5. Zusammenfassung
In der vorliegenden Studie wurde der Frage nachgegangen, in welchem quantitativen Ausmaß
bei muskelinvasiven Harnblasenkarzinomen eine HER2/neu-Überexpression und eine
HER2/neu-Genamplifikation vorkommt. Darüber hinaus sollte der Zusammenhang zwischen
HER2/neu-Überexpression und HER2/neu-Genamplifikation untersucht werden. Weiterhin
sollte überprüft werden, ob die HER2/neu-Überexpression bzw. -Genamplifikation einen
Einfluss auf die Prognose der betroffenen Patienten besitzt. Die immunhistochemische
Analyse wurde mittels eines standardisierten Färbetests (HercepTest®) an einem großen
Kollektiv von insgesamt 203 muskelinvasiven Harnblasenkarzinomen durchgeführt, welche
jeweils durch radikale Zystektomie behandelt worden waren. In 147 Fällen standen Angaben
zum klinischem Verlauf der Patienten zur Verfügung (mittleres Follow-up: 50 Monate). Die
FISH-Analyse wurde an einem kleineren, repräsentativen Kollektiv von 42 Tumoren
ebenfalls mittels eines standardisierten Tests (PathVysion®-Test) vorgenommen.
Es zeigte sich, dass ein beträchtlicher Anteil von 37 % der Tumoren eine Überexpression des
HER2/neu-Proteins aufwies. Dagegen konnte eine HER2/neu-Genamplifikation nur bei 2 der
42 untersuchten Tumoren (= 5 %) gefunden werden. Beide Tumoren mit HER2/neu-Genamplifikation waren auch mit einer Überexpression des HER2/neu-Proteins assoziiert. Umgekehrt zeigte unter den HER2/neu-überexprimierenden Tumoren nur ein Anteil von 12 % eine
HER2/neu-Genamplifikation, sodass schlussgefolgert werden konnte, dass in der Mehrzahl
der Tumoren andere molekulare Mechanismen als die Genamplifikation für die HER2/neuProteinüberexpression verantwortlich sein mussten. Aufgrund der kleinen Fallzahl der
Tumoren mit HER2/neu-Genamplifikation war eine statistische Analyse der Korrelation dieses Parameters mit dem klinischen Verlauf nicht möglich.
Bei Tumoren, die immunhistochemisch eine HER2/neu-Überexpression aufwiesen, war eine
signifikante Korrelation mit einem höheren Grading, einem „infiltrativen“ histologischen
Wachstumsmuster sowie einem schlechteren krankheitsbezogenen Überleben zu beobachten.
In der univariaten Cox-Regressionsanalyse erwiesen sich außer dem immunhistochemischen
HER2/neu-Status auch das Geschlecht, der histologische Wachstumstyp, der Lymphknotenstatus und das Tumorstadium als Faktoren mit signifikanter prognostischer Relevanz.
33
In der multivariaten Cox-Analyse konnten dagegen lediglich der Lymphknotenstatus und das
Tumorstadium sowie der immunhistochemische HER2/neu-Status als Faktoren mit unabhängiger prognostischer Aussagekraft identifiziert werden. Die beiden erstgenannten Parameter
sind schon lange als prognostische Faktoren des Harnblasenkarzinoms bekannt. Dagegen
wurde eine unabhängige prognostische Relevanz des immunhistochemischen HER2/neuStatus in der Literatur bislang noch nicht beschrieben. Sollte sich dieser Befund auch in
prospektiven Validierungsstudien bestätigen, so könnte sich der HER2/neu-Status als Prognosefaktor beim muskelinvasiven Harnblasenkarzinom etablieren.
Darüber hinaus besitzt die immunhistochemische Evaluation des HER2/neu-Status auch einen
therapeutischen Aspekt. In Analogie zum Mammakarzinom, wo Patientinnen im metastasierten Status bereits seit einigen Jahren erfolgreich mit dem gegen den HER2/neu-Rezeptor
gerichteten Antikörper Trastuzumab (Herceptin®) behandelt werden, könnte diese Therapie
auch bei Harnblasenkarzinompatienten im fortgeschrittenen Krankheitsstadium einen lebensverlängernden Effekt haben. Angesichts der hier beschriebenen Tatsache, dass beim muskelinvasiven Harnblasenkrebs ein relativ hoher Anteil von 37 % eine HER2/neu-Überexpression
aufweist, erscheint diese Krebsart für eine Herceptin®-Behandlung besonders geeignet.
Weltweit sind bereits mehrere Studien, in denen die Effektivität dieser neuen Therapieform
bei Harnblasentumoren getestet wird, angelaufen.
34
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7. Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bedanken bei Prof. Dr. med. Alfred C. Feller, Direktor des
Instituts für Pathologie für die Bereitschaft, die Experimente in seinem Labor durchführen zu
lassen, sowie für die Bereitstellung der zum Teil recht kostenintensiven Materialien.
Ich danke ebenfalls den MTAs im Ecklabor des Instituts für Pathologie, insbesondere Ilona
Schliephake, Katharina Vogel und Christoph Kroll, für die Hilfestellung bei der Einarbeitung
in immunhistologischen Färbetechniken.
Prof. Dr. med. Andreas Böhle danke ich für die Bereitstellung von Daten über den klinischen
Verlauf aus den Krankenakten der Klinik für Urologie.
Mein besonderer Dank gilt PD Dr. med. Stefan Krüger, für die Überlassung des Themas, die
Koordinierung der Arbeit, die Veröffentlichungen und seine Ratschläge und Hilfestellungen,
wann immer ich sie brauchte.
44
8. Lebenslauf
Personalia
Name:
Karl Georg Weitsch
Geboren:
7.5.1978 in Halle an der Saale
Staatsangehörigkeit: deutsch
Anschrift:
Luisenstraße 14, 06618 Naumburg
Familie:
Vater Facharzt für Allgemeinmedizin;
Mutter diakonische Heilpädagogin, als Arzthelferin tätig
1 Schwester
Schulbildung
01.09.1984
Juri-Gagarin-OS in Naumburg
01.09.1991
Dom-Gymnasium, Naumburg
01.09.1996
Abitur
Medizinische Ausbildung
seit
01.08.1996 bis
Zivildienst abgeleistet am Malteser-Krankenhaus in Bonn
31.08.1997
als Pflegekraft in der Hand- und plastischen Chirurgie
15.10.1997
Studium der Medizin an der Universität zu Lübeck
05.2001
50 Stunden Kurs Traditionelle Chinesische Medizin am
Johanniter-Krankenhaus Bramsche
03.09.2001 bis
Studium der Medizin an der Rijksuniversiteit Groningen
28.03.2002
als Teilnehmer des Erasmus-Programms der EU und
Famulaturen in Groningen
03.2003
II. Staatsexamen abgelegt
05.2003 bis
am Sint-Elisabeth-Hospital in Willemstad, Curaçao,
08.2003
N.A. einen Abschnitt des praktischen Jahres abgeleistet
05.10.2004
III. Staatsexamen abgelegt
07.11.2004
als Arzt approbiert
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9. Publikationen
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden im Jahre 2002 in den beiden nachstehenden
Publikationen veröffentlicht:
Krüger S, Weitsch G, Büttner H, Matthiensen A, Böhmer T, Marquardt T, Sayk F, Feller AC,
Böhle A (2002) HER2 overexpression in muscle-invasive urothelial carcinoma of the bladder:
prognostic implications. Int J Cancer 102: 514-518.
Krüger S, Weitsch G, Büttner H, Matthiensen A, Böhmer T, Marquardt T, Sayk F, Feller AC,
Böhle A (2002) Overexpression of c-erbB-2 oncoprotein in muscle-invasive bladder carcinoma: relationship with gene amplification, clinicopathological parameters and prognostic outcome. Int J Oncol 21: 981-987.
46