Motorische Innervation des Vormagens durch das enterische

Aus dem Veterinär-Physiologischen Institut
der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig
Motorische Innervation des Vormagens
durch das enterische Nervensystem beim Lamm
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Grades eines
Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
durch die Veterinärmedizinische Fakultät
der Universität Leipzig
Eingereicht von
Corinna Rösch
aus Hechingen
Leipzig, 2003
Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig
Dekan: Prof. Dr. med. vet. habil. Gotthold Gäbel
Betreuer: Prof. Dr. med. vet. habil. Gotthold Gäbel
Gutachter: Prof. Dr. med. vet. habil. Gotthold Gäbel
Veterinärphysiologisches Institut
Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig
Prof. Dr. med. vet. habil. Gerald Fritz Schusser
Medizinische Tierklinik
Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig
Prof. Dr. rer. nat. habil. Michael Schemann
Lehrstuhl für Humanbiologie
Technische Universität München
Tag der Verteidigung: 25. Februar 2004
Für meine Familie
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1
2. Literaturübersicht
2
2.1 Aufbau und Funktion des Vormagensystems beim Schaf
2
2.1.1 Das Vormagensystem beim adulten Schaf
2
2.1.2 Besonderheiten des Vormagensystems beim Lamm
2
2.2 Ablauf und Steuerung der Vormagenmotorik
2.2.1 Retikulorumen
4
4
2.2.1.1 Adultes Schaf
4
2.2.1.2 Lamm
7
2.2.2 Schlundrinne
8
2.3 Intrinsische Steuerung des Gastrointestinaltrakts
9
2.3.1 Aufbau des ENS
11
2.3.2 Verbindung ENS – ZNS
12
2.3.3 Klassifizierung enterischer Nervenzellen
13
2.3.3.1 Morphologische Klassifizierung
14
2.3.3.2 Elektrophysiologische Klassifizierung
14
2.3.3.3 Neurochemische Klassifizierung
16
2.3.4 Neurotransmitter im ENS und Bedeutung des neurochemischen
Kodes
16
2.3.5 Projektionsmuster enterischer Nervenzellen
19
2.3.6 Neuronale Plastizität
20
2.3.7 Intrinsische Innervation des Wiederkäuervormagens
20
2.3.7.1 Funktionelle Bedeutung des ENS für die Vormagenfunktion
21
2.3.7.2 Nachweis verschiedener Transmitter im Vormagen
23
2.3.7.3 Wirkung der Transmitter auf die Vormagenmuskulatur
24
2.4 Ziel der vorliegenden Untersuchung
3. Eigene Untersuchungen
25
27
3.1 Versuchstiere und Organentnahme
27
3.2 Gewebekultur und retrogrades Tracing
27
3.2.1 Kultivierung zur Untersuchung des neurochemischen Kodes
29
3.2.2 Kultivierung zur Markierung von Muskelmotoneuronen
30
3.3 Immunhistochemische Färbung der Präparate ohne DiI Markierung
31
3.4 Immunhistochemische Färbung der DiI-markierten Präparate
34
3.5 Spezifität der Antikörper
35
3.6 Auswertung der Präparate
36
3.6.1 Auswertung der Präparate ohne DiI Markierung
37
3.6.2 Auswertung der DiI markierten Präparate
37
3.7 Statistik
39
3.7.1 Statistik an Präparaten ohne DiI Markierung
39
3.7.2 Statistik an Präparaten mit DiI Markierung
39
4. Ergebnisse
4.1 Allgemeine Innervationsmuster
40
40
4.1.1 Gangliongrößen
40
4.1.2 Gangliendichte
41
4.2 Neurochemische Kodierung myenterischer Vormagenneurone
42
4.2.1 Neurochemische Kodierung im Retikulorumen
46
4.2.2 Neurochemische Kodierung in der Schlundrinne
51
4.2.3 Weiterführende Anfärbungen
54
4.2.3.1 Tyrosinhydroxylase
54
4.2.3.2 Calbindin
55
4.3 Zellgrößen
58
4.4 Projektionen und neurochemischer Kode von Muskelneuronen
59
4.4.1 Generelle Verteilung und Projektionsmuster im Retikulorumen
59
4.4.2 Neurochemischer Kode der Muskelneurone im Retikulorumen
60
4.4.3 Projektionslängen DiI markierter Neurone im Retikulorumen
66
4.4.4 Charakterisierung der Muskelmotoneurone in der Schlundrinne
67
5. Diskussion
70
5.1 Allgemeine Methodenkritik
71
5.2 Allgemeine Innervationsmuster im Vormagen
72
5.2.1 Größe und Dichte myenterischer Ganglien
72
5.2.2 Kodierungen und Populationen
76
5.2.2.1 Kolokalisationen
78
5.2.2.2 Anteile der Populationen
5.2.3 Zellgrößen
5.3 Retrogrades Tracing
79
86
86
5.3.1 Methodenkritik
86
5.3.2 Pansen und Haube
87
5.3.2.1 Projektionscharakteristika
87
5.3.2.2 Neurochemischer Kode der DiI markierten Neurone
89
5.3.2.3 Funktionelle Bedeutung der intrinsischen Innervation
im Retikulorumen
5.3.2.4 Mögliche weitere Funktionen myenterischer Vormagenneurone
5.3.3 Schlundrinne
91
92
94
6. Zusammenfassung
96
7. Summary
98
8. Literaturverzeichnis
100
Abkürzungen:
AMCA
7-Amino-4-Methylcumarin-3-Azetat
ChAT
Cholinazetyl-Transferase
Cy 2
Carbocyanin
Cy 3
Carboxymethylindocyanin
Cy 5
Indocarbocyanin
DiI
1,1'-Didodecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanin Perchlorat
DTAF
Dichlortriazinyl-Aminofluorescein
ENS
Enterisches Nervensystem
NOS
Stickstoffmonoxid-Synthase
NPY
Neuropeptid Y
NSE
Neuronenspezifische Enolase
PBS
Phosphat-buffered saline, phosphatgepufferte Kochsalzlösung
SP
Substanz P
Strept-AMCA
Streptavidin-7-Amino-4-Methylcoumarin-3-Acetat
Strept-DTAF
Streptavidin-Dichlortriazinyl-Aminofluorescein
TH
Tyrosinhydroxylase
TX
Triton-X-100
VIP
Vasoaktives Intestinales Peptid
ZNS
Zentrales Nervensystem
1. Einleitung
Das Vormagensystem des Schafes besteht aus funktionell unterschiedlichen
Kompartimenten. Die jeweiligen Funktionen der Kompartimente sind dabei vom Alter
des Tieres abhängig und zeichnen sich durch unterschiedliche Motilitätsmuster aus.
So dienen Pansen und Haube als riesige Gärkammern, in denen der Vormageninhalt
während
seiner
mikrobiellen
Umsetzung
ständig
durchmischt
wird.
Beide
Kompartimente, die funktionell zum Retikulorumen zusammengefasst werden, sind
daher primär beim ruminierenden Schaf von Bedeutung. Beim Sauglamm ist das
Retikulorumen noch kaum entwickelt und spielt für die Verdauung zunächst eine
geringe Rolle. Hier erfüllt vielmehr die Schlundrinne eine lebensnotwendige Funktion.
Infolge des Schlundrinnenreflexes kann die aufgenommene Milch vom Ösophagus
direkt in den Labmagen geleitet werden. Beim abgesetzten, rauhfutterfressenden
Tier hat der Schlundrinnenreflex physiologischerweise keine Bedeutung mehr.
Die Motilitätsmuster, die die beschriebenen Funktionen ermöglichen, werden sowohl
im Retikulorumen als auch in der Schlundrinne durch das autonome Nervensystem
gesteuert.
Diese
Steuerung
erfolgt
einerseits
durch
Parasympathikus
und
Sympathikus, andererseits gibt es aber auch Hinweise darauf, dass myenterische
Neurone des enterischen Nervensystems beteiligt sind. Aus dem Verdauungstrakt
monogastrischer Spezies ist bekannt, dass enterische Nervenzellen spezifische
Innervationsmuster ausbilden, die die Steuerung vieler gastrointestinaler Funktionen
in Unabhängigkeit von äußeren Nerven ermöglichen. Voraussetzung hierfür ist die
Expression
verschiedener
Neurotransmitter
sowie
die
Ausbildung
zielgewebsspezifischer Projektionsmuster durch enterische Neurone.
In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob solche spezifischen
Innervationsmuster auch in den verschiedenen Regionen des Vormagens existieren.
Hierzu wurden zunächst die myenterischen Neurone in den altersabhängig
funktionell verschiedenen Vormagenkompartimenten neurochemisch identifiziert.
Desweiteren wurden die Neurone identifiziert, die direkt zur Muskulatur projizieren
und somit der unmittelbaren intrinsischen Kontrolle der Motorik der einzelnen
Vormagenregionen dienen.
1
2. Literaturübersicht
2.1 Aufbau und Funktion des Vormagensystems beim Schaf
2.1.1 Das Vormagensystem beim adulten Schaf
Der Gastrointestinaltrakt des Schafes und anderer Wiederkäuer unterscheidet sich in
seinem Aufbau und seiner Funktionsweise deutlich von dem anderer Haustiere. Das
beim Wiederkäuer vorhandene Vormagensystem und die darin stattfindende
mikrobielle Fermentation ermöglichen die Nutzung von Substraten, die für den
Monogastrier unverdaulich sind. Durch mikrobielle Enzyme können pflanzliche
Gerüstsubstanzen wie Zellulose aufgespalten werden und so für die Ernährung des
Wiederkäuers verwendet werden (SELLERS u. STEVENS 1966; LEEK 1969b;
FORBES u. BARRIO 1992). Beim Monogastrier dagegen ist die Verwertung von
Zellulose
nur
in
Verdauungsstrategie
beschränktem
der
Maße
Wiederkäuer
möglich
setzt
(HOBSON
anatomische
und
1997).
Die
funktionelle
Besonderheiten voraus. Da die Verdauungsprozesse im Vergleich zum Monogastrier
relativ langsam stattfinden, muss hierfür eine große Fermentationskammer mit
ausreichender Substratmenge zur Verfügung stehen. Dies wird durch die Ausbildung
eines größeren Vormagensystems gewährleistet. Es besteht aus Pansen (Rumen),
Haube (Retikulum) und Blättermagen (Psalter, Omasum) (NICKEL et al. 1995),
wobei die ersten beiden Kompartimente meist funktionell zusammengefasst und als
Retikulorumen bezeichnet werden (LEEK 2001). Während im Retikulorumen die
mikrobielle Fermentation der Nahrung stattfindet, steuert der Blättermagen den
Übertritt der Ingesta in den Labmagen und besitzt zudem eine resorptive Funktion
(FORBES u. BARRIO 1992; YAMAMOTO et al. 1994). Spezifische Motilitätsmuster
am gesamten Vormagensystem gewährleisten die für eine intakte Fermentation
nötige Durchmischung der Ingesta, ihr Regurgitieren zum Wiederkäuen, die
Entfernung der entstandenen Gase über den Ruktus und schließlich den
Weitertransport der Ingesta in den Labmagen.
2.1.2 Besonderheiten des Vormagensystems beim Lamm
Beim neugeborenen Lamm unterscheidet sich die Funktion des Gastrointestinaltrakts
von der des älteren, bereits ruminierenden Schafes. Da sich das Lamm zunächst
ausschließlich von Milch ernährt, findet im Vormagen noch keine mikrobielle
2
Verdauung statt (TITCHEN 1968). Dieser ernährungsphysiologische Unterschied
spiegelt sich in den anatomischen Verhältnissen des Vormagensystems und des
Labmagens wider. Es sind zwar zum Zeitpunkt der Geburt alle vier Abteilungen am
Magen zu unterscheiden, jedoch sind die drei noch funktionslosen Vormägen im
Gegensatz zum Labmagen nur wenig entwickelt. Während beim neonatalen Lamm
nur 45% der gesamten Magenmasse auf die Vormägen entfallen, sind es beim
adulten
Schaf
80–90%
(WARNER
et
al.
1956).
Diese
unterschiedlichen
Größenverhältnisse verdeutlichen die altersabhängige Nutzung der einzelnen
Magenkompartimente.
Die vom Sauglamm aufgenommene Milch wird durch körpereigene Enzyme im
Labmagen verdaut (TITCHEN 1968). Der Labmagen ist im Unterschied zum
Vormagen mit einem Drüsenepithel ausgekleidet und entspricht daher funktionell
dem
Magen
der
Monogastrier
(LEEK
1969b;
LANGER
1984).
Um
die
aufgenommene Milch vom Ösophagus zur Verdauung in den Labmagen zu leiten,
muss das dazwischenliegende, noch funktionslose Vormagensystem umgangen
werden. Diese Umgehung wird durch den Schlundrinnenreflex ermöglicht. Die
Schlundrinne stellt hierbei eine direkte Verbindung zwischen Ösophagus und
Labmagen her (TITCHEN 1968; RUCKEBUSCH et al. 1983; DENAC et al. 1990).
Die Entwicklung des Vormagens zur Fermentationskammer beginnt in der zweiten
bis vierten Lebenswoche, in der das Lamm anfängt, festes pflanzliches Futter
aufzunehmen (LANE et al. 2000). Den Stimulus zur Vormagenentwicklung geben
neben den aufgenommenen, strukturierten Futterpartikel auch die bei der
Fermentation entstehenden kurzkettigen Fettsäuren (TAMATE et al. 1962; LANE u.
JESSE 1997). Die mit der Vormagenausbildung verbundenen Größenzunahmen der
einzelnen Magenabteilung entwickeln sich sehr schnell. So kommt es in den ersten
beiden Lebensmonaten zu einer Gewichtszunahme des Retikulorumens um das
fünfzehnfache, auch sein Volumen ist nach diesem Zeitraum etwa zwanzig mal
größer als das des Labmagens. Diese Proportionen entsprechen bereits denen des
adulten Schafes (WARNER et al. 1956). Neben der Volumenzunahme der einzelnen
Vormägen müssen auch die für die Fermentation benötigten spezifischen
Motilitätsmuster ausgebildet werden.
3
2.2 Ablauf und Steuerung der Vormagenmotorik
2.2.1 Retikulorumen
2.2.1.1 Adultes Schaf
Voraussetzungen für eine intakte Vormagenverdauung sind unter anderem die
ständige Durchmischung der Ingesta, die Resorption der Fermentationsprodukte und
die Entfernung der entstandenen Gase über den Ruktus. Um diese verschiedenen
Aufgaben erfüllen zu können, besitzt das Vormagensystem des ruminierenden
Schafes eine spezifische, zyklische Motorik. Die dabei an Pansen und Haube
auftretenden Kontraktionsfolgen werden als A- und B-Sequenz bzw. primärer und
sekundärer Zyklus (SELLERS u. STEVENS 1966; RUCKEBUSCH 1989) bezeichnet.
Der primäre Zyklus beginnt mit einer biphasischen Haubenkontraktion, an die sich
zunächst eine einphasische Kontraktion des dorsalen Pansensacks und dann des
ventralen Pansensacks anschließt. Die bei diesem Motilitätsmuster ablaufenden
Kontraktionen dienen der Durchmischung und der Überführung der Ingesta in die
Haube und werden daher auch als "mixing contractions" bezeichnet (RUCKEBUSCH
1989). Beim sekundären Zyklus treten die Kontraktionen nur am Pansen auf. Sie
beginnen am kaudoventralen Blindsack, gehen dann in kranialer Richtung auf den
dorsalen Pansensack und schließlich auf den ventralen Pansensack über. In Folge
dieser Pansenbewegungen wird die dorsale Gasblase nach kranial zur Kardia
geschoben, so dass es zu einer Abgabe von Gas über den Ruktus kommen kann
(RUCKEBUSCH 1989).
Essentiell
für
den
regelmäßigen
und
koordinierten
Ablauf
dieser
beiden
Kontraktionszyklen ist eine entsprechende neuronale Steuerung des gesamten
Vormagensystems. Diese Steuerung geschieht durch eine intrinsische und
extrinsische Innervation des Vormagens (LEEK 2001). Während die intrinsische
Steuerung lokal durch das enterische Nervensystem erfolgt (GREGORY 1982),
stellen extrinsische Nerven den zentralen Anteil der Steuerung dar. Obwohl über die
Funktion der intrinsischen Vormageninnervation bislang weniger bekannt ist, scheint
die
Motorik
des
Vormagens
das
Ergebnis
des
Zusammenwirkens
beider
Steuerungsmechanismen zu sein (GREGORY 1982, 1984).
Die extrinsische Innervation des Vormagensystems besteht zum einen aus
parasympathischen Fasern, die mit dem Nervus vagus verlaufen und zum anderen
4
aus sympathischen Fasern des Nervus splanchnicus (LEEK 1969b). Die Steuerung
der zyklischen Vormagenmotorik beruht dabei vorwiegend auf vagovagalen Reflexen
(RUCKEBUSCH
1989).
Der
Nervus
splanchnicus
dagegen
scheint
von
untergeordneter Bedeutung zu sein, da seine Durchtrennung weder akut (IGGO u.
LEEK 1967) noch chronisch zu einer Veränderung der Vormagenmotorik führte
(DUNCAN 1953; GREGORY 1982).
Steuerung durch den Nervus vagus
Der Nervus vagus enthält sensible, motorische und parasympathische Fasern, die
ihren Ursprung in unterschiedlichen Kerngebieten des Gehirns haben (NICKEL et al.
1992). Er innerviert fast alle Organe des Thorax und des Bauchraums. Rechter und
linker Nervus vagus verlassen die Schädelhöhle und ziehen den Hals entlang zum
Thorax. Hier teilen sich beide jeweils in einen dorsalen und ventralen Ast (NICKEL et
al. 1992). Die dorsalen Äste vereinigen sich anschließend zum Dorsalstrang, der
überwiegend Fasern des rechten Nervus vagus enthält. Die ventralen Äste bilden
den Ventralstrang mit einer Dominanz der linken Fasern (RUCKEBUSCH 1989). Der
Dorsalstrang innerviert alle Bereiche des Retikulorumens, der Ventralstrang dagegen
innerviert primär die Haube (RUCKEBUSCH 1989). In beiden Strängen sind
afferente und efferente Fasern im Verhältnis 9:1 enthalten (ROUSSEAU 1984).
Die für die Vormagenbewegungen verantwortlichen, reflexauslösenden Rezeptoren
befinden sich in der Maulhöhle, im Ösophagus, im Vormagen selbst und im
Labmagen (LEEK 1969a; FALEMPIN et al. 1978; RUCKEBUSCH 1989 ). Bei den im
Vormagen
lokalisierten
Rezeptoren
lassen
sich
sowohl
mechanosensitive
Spannungsrezeptoren in der Muskulatur als auch mechano- und chemosensitive
epitheliale Rezeptoren (LEEK 1969a; ROUSSEAU u. FALEMPIN 1985; FORBES u.
BARRIO 1992) unterscheiden. Die Verteilung der Rezeptoren über die einzelnen
Vormagenbereiche ist unterschiedlich. Eine hohe Dichte von Spannungsrezeptoren
befindet sich in Muskulatur der medialen Haubenwand, in den Schlundrinnenlippen,
im kranialen Pansensack und in der Pansen-Haubenfalte (LEEK 1969a). Die
Dehnung dieser Vormagenbereiche führt zu einem Anstieg der Kontraktionszyklen
(ASH u. KAY 1959; TITCHEN 1968) und steigert darüberhinaus die Sekretion der
Speicheldrüsen (ASH u. KAY 1959). Auch die taktile Stimulation des Epithels in
diesen Bereichen führt zu einem Anstieg der Vormagenkontraktionen (ASH und KAY
1959). In diesen sensitiven Gebieten des Vormagens konnten durch Methylenblau5
Färbung nervale Strukturen nachgewiesen werden, die sich bis in das Epithel
erstrecken (HILL 1958). Neben mechanischen Reizen reagieren diese epithelialen
Rezeptoren
auch
auf
chemische
Stimulation.
So
führt
die
Reizung
des
Pansenepithels durch Azetat- oder Butyratlösung mit einem pH-Wert von 4,0 oder
niedriger zu einer Hemmung der Pansen-Hauben-Bewegungen (ASH u. KAY 1959).
REID u. TITCHEN (1965) konnten Pansenkontraktionen auslösen, indem sie nach
einer einseitigen Durchtrennung des Nervus vagus den zum ZNS führenden Stumpf
stimulierten. Dies zeigte, dass die Afferenzen der Rezeptoren mit dem Nervus vagus
verlaufen (REID u. TITCHEN 1965; LEEK 1969a).
Das Reflexzentrum der motorischen Vormagensteuerung liegt im Hirnstamm
innerhalb der Medulla oblongata (TITCHEN 1968; RUCKEBUSCH 1989). Durch
elektrische Reizung bestimmter Hirnstammgebiete (BELL u. LAWN 1955) und durch
Registrierung der Aktivität der Neurone des dorsalen Vaguskerns (BEGHELLI et al.
1963) wurde gezeigt, dass sich das Magenzentrum ("gastric center") in der Medulla
oblongata im dorsalen Vaguskern befindet. Da das Reflexzentrum keine spontane
Aktivität besitzt, ist für die Bildung efferenter vagaler Erregung ein ständiger Input
durch die gastrointestinalen Rezeptoren nötig (LEEK 1969b, 2001). Darüberhinaus
erhält
das
Reflexzentrum
aber
auch
Input
aus
anderen
Bereichen
der
Körperperipherie und des zentralen Nervensystems, wodurch die Vormagenmotilität
beeinflusst werden kann (HARDING u. LEEK 1972).
Die motorischen Efferenzen des Reflexes bestehen aus cholinergen Fasern, die
ebenfalls im Nervus vagus verlaufen. Nach Durchtrennung des Nervs verursachte
die
elektrische
Stimulation
des
peripheren
Stumpfes
frequenzabhängige
Kontraktionen am Vormagen. Während hohe Frequenzen Kontraktionen von Pansen
und Haube, also primäre Zyklen auslösen, führt die Stimulation mit niedrigeren
Frequenzen nur zu einer Kontraktion des dorsalen Pansensacks, die sich kranial
ausbreitet (REID u. TITCHEN 1965).
Steuerung durch den Nervus splanchnicus
Durch In-vivo-Versuche konnte gezeigt werden, dass durch die Verabreichung
verschiedener Sympathomimetika eine Beeinflussung der Motorik möglich ist. So
erhöht sich nach der intravenösen Injektion des alpha1-Agonisten Phenylephrin die
myoelektrische Entladungenfrequenz des Retikulorumens und es treten vermehrt
sekundäre Kontraktionszyklen auf (BRIKAS 1989). Auch die intravenöse Injektion
6
von Adrenalin führt zu vermehrten Kontraktionen der Muskulatur, gleichzeitig werden
aber die primären Kontraktionszyklen des Vormagens gehemmt (LEEK 2001). Da
Adrenalin nicht über die Blut-Hirn-Schranke gelangt, muss dieser Effekt peripher
vermittelt sein. Es ist davon auszugehen, dass Adrenalin durch seine direkte Wirkung
an der Muskulatur die hier vorhandenen Spannungsrezeptoren sensibilisiert. Diese
gesteigerte Aktivierung der Rezeptoren hat zur Folge, dass der vagale Output der
"gastric centers" vermindert wird, was dann zur Hemmung der Kontraktionszyklen
führt (LEEK 2001). Die Applikation von alpha2-Agonisten wie Xylazin dagegen führt
zentral zu einer Hemmung der "gastric centers" und damit zum Sistieren der
primären Kontraktionszyklen (RUCKEBUSCH 1983; LEEK 2001). Während beim
Schaf durch Xylazin auch die sekundären Zyklen blockiert werden, ist beim Rind nur
eine Verminderung dieser Zyklen feststellbar (RUCKEBUSCH u. ALLAL 1987).
Die Stimulation von beta1-Rezeptoren durch Dobutamin verursacht ebenfalls eine
Hemmung der Vormagenmotorik (BRIKAS 1989; LEEK 2001). Da Dobutamin die
Blut-Hirn-Schranke überquert, kann diese Hemmung auch zentral verursacht sein
(CORKERY u. LEEK 1999). Bei der intravenösen Gabe des beta2-Agonisten Ritodrin
konnte kein Effekt auf die Motilität des Vormagens festgestellt werden (BRIKAS
1989; BRIKAS et al. 1989). Von LEEK (2001) dagegen wird durch Ritodrin eine
dosisabhängige Verminderung der Kontraktionen beschrieben, die einerseits durch
die Relaxation der glatten Muskulatur und andererseits durch eine Antagonisierung
der cholinergen Erregung verursacht wird.
Da die Durchtrennung des Nervus splanchnicus zu keiner Veränderung der
Vormagenmotorik führte (DUNCAN 1953; IGGO u. LEEK 1967; GREGORY 1982),
ist
aber
davon
auszugehen,
dass
der
Einfluß
der
sympathischen
Vormageninnervation, trotz der experimentell auslösbaren Effekte der verschiedenen
Adrenorezeptoragonisten, unter physiologischen Bedingungen von untergeordneter
Bedeutung ist.
2.2.1.2 Lamm
Zum Zeitpunkt der Geburt sind Pansen und Haube im Vergleich zum Labmagen
wenig entwickelt (WARNER et al. 1956; RUCKEBUSCH et al. 1983). Da im
Retikulorumen noch keine pflanzliche Nahrung verdaut wird, sind die beim älteren
Tier ausgebildeten Kontraktionszyklen noch nicht vorhanden (RUCKEBUSCH et al.
1983). Zwar sind bei saugenden Kälbern einzelne Haubenkontraktionen zu
7
beobachten, ein regulärer Kontraktionszyklus ist aber erst mit beginnender
Rauhfutteraufnahme feststellbar (TITCHEN 1968). Studien an Kälbern haben
gezeigt, dass die Aufnahme von Rauhfutter die Kontraktionsfähigkeit des Vormagens
steigert. So konnten bei Kälbern, denen während der Säugeperiode bereits Heu
angeboten wurde, durch vagale Stimulation stärkere Vormagenkontraktionen
ausgelöst werden, als bei Kälbern, die ausschließlich durch Milch ernährt wurden
(DZUIK u. SELLERS 1955).
2.2.2 Schlundrinne
Während beim adulten Tier das Retikulorumen essentielle Aufgaben für die
Ernährung erfüllt, spielt beim neugeborenen Sauglamm vor allem die Schlundrinne
eine lebensnotwendige Rolle. Die Schlundrinne geht aus dem am Pansenvorhof
mündenden Ösophagus hervor und besteht aus zwei seitlichen, muskulösen
Schlundrinnenlippen und dem dazwischenliegenden Schlundrinnenboden (NICKEL
et al. 1995). Bei der Aufnahme von Milch kommt es beim Lamm zur reflektorischen
Kontraktion der Lippen. Gleichzeitig relaxiert der Schlundrinnenboden und das
Ostium reticulo-omasicum öffnet sich (NEWHOOK u.TITCHEN 1972; REID u.
TITCHEN 1988). Durch diesen angeborenen Schlundrinnenreflex bildet die
Schlundrinne eine Art Rohr, das wie ein Bypass vom Ösophagus direkt in den
Labmagen führt (TITCHEN 1968; RUCKEBUSCH 1989; DENAC et al. 1990). Die
Funktion der Schlundrinne wurde bereits 1926 von WESTER untersucht. An einem
Kalb mit Pansenfistel konnten die Bewegungen der Schlundrinne manuell palpiert
werden. Während das Kalb Milch trank, kam es zum Schluß der Schlundrinne und
die Milch wurde in den Labmagen geleitet. Bei der Eingabe von Milch per
Nasenschlundsonde in den oberen Ösophagus war dagegen keine Kontraktion der
Schlundrinne feststellbar. Spätere Versuche an Lämmern zeigten, dass ein oral
aufgenommenes Röntgenkontrastmittel (Bariumsulfat) direkt in den Labmagen
gelangt. Wird die selben Substanz aber in den Ösophagus injiziert, gelangt sie ins
Retikulorumen (ORSKOV u. BENZIE 1969). In weiteren Versuchen führte eine durch
Kokainlösung hervorgerufene Lokalanästhesie der Maulschleimhaut zum Ausbleiben
des Reflexes (RUCKEBUSCH 1989). Diese Befunde zeigten, dass sich die
afferenten Nervenendigungen im Bereich der Maulhöhle und des Pharynx befinden
(RUCKEBUSCH 1989). Dass es sich bei der Kontraktion der Schlundrinne um einen
Reflex handelt, wurde von COMLINE und TITCHEN (1951) durch Studien an
8
dezerebrierten Lämmern und Kälbern nachgewiesen. Durch Reizung des zentralen
Endes des Nervus laryngeus recurrens war eine Kontraktion der Schlundrinne
auslösbar. Das Reflexzentrum für den Schlundrinnenreflex befindet sich wie das des
Retikulorumens auch in der Medulla oblongata (COMLINE u. TITCHEN 1951).
Weiterhin zeigten COMLINE und TITCHEN (1951), dass die Efferenz des Reflexes in
cholinergen parasympathischen Fasern des dorsalen abdominalen Strang des
Nervus vagus liegt. Durch die intravenöse Applikation von Atropin wird die
Reflexantwort durch die Schlundrinne nach peripherer Vagusstimulation verhindert
(COMLINE u. TITCHEN 1957; NEWHOOK u. TITCHEN 1974).
Beim adulten Wiederkäuer ist der Schlundrinnenreflex physiologischerweise nicht
mehr vorhanden. Hier gelangt die aufgenommene Flüssigkeit ins Retikulorumen.
Experimentell kann der Reflex beim adulten Schaf aber weiterhin durch die orale
Gabe von Kupfersulfatlösung (TSIAMITAS u. BRIKAS 1981) oder Zinklösung
(SMITH et al. 1977) ausgelöst werden. Beim Rind wurde gezeigt, dass Natriumsalze,
insbesondere NaHCO3, einen Schluß der Schlundrinne bewirken (RIEK 1954).
Neben der beschriebenen extrinsischen Steuerung durch den Nervus vagus exisitiert
auch
eine
intrinsische
Innervation
des
Vormagens
durch
das
enterische
Nervensystem (ENS) (HABEL 1956; GRAU u. WALTER 1957; KITAMURA et al.
1986). Die Funktion des ENS am Gastrointestinaltrakt ist beim Monogastrier
inzwischen sehr ausführlich untersucht worden. Da zur Funktion des ENS am
Wiederkäuermagen bisher vergleichsweise wenige Untersuchungen vorliegen, soll
zunächst eine Überblick über die vom Monogastrier bekannten Kenntnisse zur
Funktionsweise des ENS gegeben werden.
2.3 Intrinsische Steuerung des Gastrointestinaltrakts
Das ENS stellt ein komplexes Nervennetzwerk innerhalb des Gastrointestinaltrakts
dar, das zur Ausbildung eigener Reflexschaltkreise befähigt ist. Dadurch wird der
Ablauf und die Steuerung bestimmter Motilitätsmuster unabhängig vom zentralen
Nervensystem ermöglicht (GERSHON et al. 1994). Das ZNS erhält über viszerale
Afferenzen Informationen über die Abläufe im Gastrointestinaltrakt und kann über
efferente Nervenbahnen steuernde oder modulierende Impulse geben (WOOD
1994).
9
Die funktionelle Bedeutung der intrinsischen Innervation wurde bereits vor über 100
Jahren von BAYLISS und STARLING (1899) erkannt. Durch einen Druckreiz auf die
luminale Darmoberfläche konnten sie eine stereotyp ablaufende Muskelaktivität
auslösen, die sie als Gesetz des Darms ("law of the intestine") bezeichneten.
Während die Darmmuskulatur oral des Reizortes kontrahierte, kam es aboral zur
Relaxation. Da diese Aktivität an isolierten Darmschlingen feststellbar war, wurde ein
"lokaler Nervenmechanismus" als Auslöser vermutet (BAYLISS u. STARLING 1899).
Bei folgenden In-vitro-Versuchen mit Darmstücken weiterer Tierarten wurde dieselbe
Reaktion beobachtet (LANGLEY u. MAGNUS 1905; TRENDELENBURG 1917).
TRENDELENBURG (1917) bezeichnete diese stereotype Aktivität des Darms, die
den aboralen Weitertransport der Ingesta zur Folge hat, als peristaltischen Reflex.
Die Auslösung des Reflexes am isolierten Darm, d.h. von dem alle äußeren Nerven
abgetrennt wurden, setzt voraus, dass sämtliche für die Auslösung eines Reflexes
notwendigen nervalen Strukturen im Darm selbst vorhanden sind. Aufgrund dieser
Unabhängigkeit des Darmnervensystems vom ZNS bezeichnete LANGLEY (1921)
es als dritte Abteilung des autonomen Nervensystems und führte den Begriff des
enterischen Nervensystems ein. Er war davon überzeugt, dass die enterischen
Ganglien einzigartige strukturelle und funktionelle Eigenschaften besitzen, die sie
von anderen autonomen Ganglien außerhalb des Darms unterscheiden (LANGLEY
1921).
Die
Ergebnisse
elektrophysiologischer
moderner
Studien
histologischer,
an
immunhistochemischer
verschiedenen
Spezies
haben
und
Langleys
Vorstellung über die Funktionsweise des ENS bestätigt. Die hierbei am
ausführlichsten untersuchte Tierart ist das Meerschweinchen, es gilt als eine Art
Modelltier für die Forschung am ENS. Aufgrund der bis heute durchgeführten Studien
versteht man das ENS als ein unabhängiges integratives System, das in seinen
strukturellen und funktionellen Eigenschaften denen des ZNS ähnlich ist (WOOD
1994). Es enthält funktionell verschiedene Neurone, die spezifische Aufgaben
erfüllen. So wird ein im Darmlumen vorhandener chemischer oder mechanischer
Reiz durch sensorische Nervenzellen rezipiert. Diese geben die Information an die
Interneurone weiter. Die Interneurone verarbeiten die erhaltene Information und
aktivieren Motoneurone, die schließlich eine Reflexantwort an ihren verschiedenen
Zielgeweben wie Muskel oder Mukosa auslösen (WOOD 1994). Das koordinierte
Verhalten der Darmmuskulatur beim peristaltischen Reflex wird durch polarisierte
10
Projektionen der Muskelmotoneurone ermöglicht. Die am Reizort lokalisierten
exzitatorischen Motoneurone ziehen dabei in orale Richtung und führen zur
Kontraktion, die inhibitorischen Neurone projizieren aboral und bewirken eine
Relaxation der Darmmuskulatur ( COSTA et al. 1991).
2.3.1 Aufbau des ENS
Das
ENS
besteht
aus
zwei
innerhalb der Magen-Darmwand lokalisierten
Nervengeflechten, die schon sehr früh morphologisch beschrieben wurden. Dies sind
zum einen der zwischen Mukosa und Zirkulärmuskulatur gelegene Plexus
submucosus (MEISSNER 1857) und zum anderen der zwischen Zirkulär- und
Longitudinalmuskulatur lokalisierte Plexus myentericus (AUERBACH 1862). Beide
Plexus bestehen aus Ganglien, die Ansammlungen von Neuronenzellkörper
darstellen, und aus interganglionären Fasersträngen, in denen die Fortsätze der
Neuronen verlaufen (GERSHON et al. 1994). Die Nervenzellen beider Plexus
erfüllen unterschiedliche Aufgaben und können daher funktionell in Motoneurone,
Interneurone und sensorische Neurone eingeteilt werden (COSTA et al. 1991;
WOOD 1994; GERSHON et al. 1994; BROOKES 2001b). Die Motoneurone sind
entsprechend
ihres
Zielgewebes
weiterhin
in
Muskel-,
Sekreto-
und
Vasomotoneurone unterteilbar (COSTA et al. 1991; WOOD 1994). Der Anteil der
einzelnen Neuronentypen innerhalb der beiden Plexus ist vom innervierten
Zielgewebe abhängig. So befinden sich die für die Motorik verantwortlichen
Muskelmotoneurone im myenterischen Plexus und stellen hier rund die Hälfte der
myenterischen Neurone dar (COSTA et al. 1991). Ein weiteres Drittel der
myenterischen Neurone scheint sensorische Funktionen zu besitzen (COSTA et al.
1991). Daneben existiert eine Population, die als Interneurone fungiert (COSTA et al.
1991).
Der submuköse Plexus enthält vorwiegend Neurone, die die Mukosafunktionen
koordinieren. So sind die meisten Sekretomotoneurone im submukösen Plexus
lokalisiert (BORNSTEIN u. FURNESS 1988). Weiterhin sind submuköse Neurone
dazu fähig, die lokale Durchblutung zu steuern (NEILD et al. 1990; EKBLAD et al.
1994a; VANNER u. SURPRENANT 1996). Eine weitere Population der Neurone ist
primär afferent und besitzt sensorische Funktion (BORNSTEIN u. FURNESS 1988;
FURNESS et al. 1995; BROOKES 2001b).
11
Die scheinbar getrennten Funktionen der beiden Plexus finden aber nicht
unabhängig voneinander statt, sondern sind miteinander koordiniert (COSTA et al.
1991). Durch elektrophysiologische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass
die submukösen Neurone sowohl exzitatorischen wie auch inhibitorischen Input
durch myenterische Neurone erhalten (BORNSTEIN et al. 1986). Gleichzeitig
projiziert auch ein Teil der submukösen Neurone zum myenterischen Plexus
(FURNESS u. COSTA 1980; KIRCHGESSNER u. GERSHON 1988; BORNSTEIN et
al. 1989). Da sich im submukösen Plexus keine vagalen Efferenzen befinden
(KIRCHGESSNER u. GERSHON 1989; BERTHOUD et al. 1990), eine vagale
Stimulation aber eine prosekretorische Wirkung besitzt, die durch submuköse
Neurone vermittelt wird (GERSHON et al. 1994), ist anzunehmen, dass dieser Effekt
über eine solche Verschaltung beider Plexus erreicht wird.
2.3.2 Verbindung ENS - ZNS
Das ENS ist sowohl in afferenter wie auch in efferenter Richtung mit dem zentralen
Nervensystem verbunden (COSTA et al. 1991).
Durch viszerale Afferenzen erhält das Gehirn Informationen über die im
Magendarmtrakt ablaufenden Verdauungsprozesse. Diese viszeralen afferenten
Fasern verlaufen mit dem Nervus vagus (COSTA et al. 1991) und mit dem Nervus
splanchnicus. Sie stellen periphere Endungen sensorischer Neurone dar, deren
Somata in parasympathischen bzw. sympathischen Ganglien lokalisiert sind. Die
zentralen Endungen der Neurone projizieren zum ZNS, wo eine Verarbeitung der
erhaltenen Information und schließlich die Verschaltung auf efferente Bahnen
stattfindet. Daneben existieren intrinsische Afferenzen. Hierbei handelt es sich um
sogenannte
viszerofugale
Neurone,
die
im
ENS
lokalisiert
sind
und
zu
sympathischen Ganglien projizieren (BROOKES 2001a).
Über efferenten Nervenfasern besitzt das ZNS die Möglichkeit, regulierend und
koordinierend in die Verdauungsvorgänge einzugreifen (KUNZE u. FURNESS 1999).
Die Fasern verlaufen ebenfalls mit dem Nervus vagus und dem Nervus splanchnicus.
Durch die Ausbildung von Synapsen zwischen diesen parasympathischen bzw.
sympathischen Fasern und enterischen Neuronen kann das ZNS über enterische
Bahnen in die Abläufe im Gastrointestinaltrakt eingreifen (FURNESS u. COSTA
1980; COSTA et al. 1991).
12
Frühe anatomische Untersuchungen über die Innervation des Gastrointestinaltrakts
zeigten, dass die Anzahl der Neurone innerhalb des Darms die der vagalen Fasern
weit übersteigt (KUNTZ 1913; LANGLEY 1921). Heute wird die Anzahl der Neurone
im Dünndarm auf mehrere Millionen geschätzt (FURNESS u. COSTA 1980;
HEINICKE et al. 1987; GERSHON et al 1994). Demgegenüber stehen nur wenige
tausend efferente vagale Fasern (HOFFMAN u. SCHNITZLEIN 1969). Diese
unterschiedliche Anzahl der einzelnen nervalen Strukturen ließ vermuten, dass nur
ein Teil der enterischen Neurone direkt durch das zentrale Nervensystem innerviert
wird. Studien mit einem anterogradem Tracingfarbstoff, der in den dorsalen
motorischen Vaguskern injiziert wurde, bestätigten die Vermutung. Hierbei konnten
im ENS nur wenige efferente Vagusfasern mit direkter Verbindung zu enterischen
Neuronen nachgewiesen werden (KIRCHGESSNER u. GERSHON 1989). Die
Anzahl der vagal innervierten Neurone ist dabei in den einzelnen gastrointestinalen
Regionen unterschiedlich. So konnten im Magen mehr vagale Efferenzen als im
Dünndarm
gefunden
werden
(KIRCHGESSNER
u.
GERSHON
1989).
Elektrophysiologische Untersuchungen am Magen des Meerschweinchens haben
dies bestätigt, hier waren mehr als die Hälfte der myenterischen Neurone durch
Stimulation des Nervus vagus erregbar (SCHEMANN u. GRUNDY 1992).
Durch die Injektion von Tracingfarbstoffen ist auch bekannt, dass das Ziel der
vagalen Innervation der myenterische Plexus ist (KIRCHGESSNER u. GERSHON
1989; BERTHOUD et al. 1990). Die vagale Beeinflussung der gastrointestinalen
Funktionen geschieht daher indirekt über enterische Leitungsbahnen. Die vagalen
Fasern aktivieren über die Ausschüttung von Azetylcholin enterische Neurone, die
ihrerseits nun erregend oder inhibitorisch wirkende Transmitter freisetzen und so
eine Wirkung auf ihre Zielgewebe vermitteln (GERSHON u. ERDE 1981). Auch die
sympathische Beeinflussung der gastrointestinalen Funktionen geschieht über die
Leitungsbahnen enterischer Neurone (NORBERG u. SJOQVIST 1966). Durch die
Ausschüttung
von
Noradrenalin
werden
über
alpha-Rezeptoren
die
direkt
innervierten myenterischen und submukösen Neurone aktiviert, die dann eine
Hemmung von Motorik und Sekretion auslösen (HILLSLEY et al. 1992).
2.3.3 Klassifizierung enterischer Nervenzellen
Neben der funktionellen Einteilung der enterischen Neurone in sensorische Neurone,
Inter- und Motoneurone können zur Klassifizierung der Nervenzellen auch
13
morphologische, elektrophysiologische und neurochemische Kriterien herangezogen
werden.
2.3.3.1 Morphologische Klassifizierung
Der
früheste
Versuch,
enterische
Neurone
zu
klassifizieren
beruhte
auf
morphologischen Eigenschaften und geht auf den Neuroanatomen Alexander
Stanislavich Dogiel zurück. Die von ihm beschriebene Einteilung der Neurone in drei
Zelltypen ist bis heute gültig und wurde inzwischen um weitere Typen ergänzt
(STACH 1989). Typ-I-Neurone besitzen einen langen und viele kurze, lamelläre
Fortsätze. Typ-II-Neurone weisen eine glattere Oberfläche auf und besitzen mehrere
lange und kurze Fortsätze. Die Typ-III-Neurone ähneln den Typ-II-Neuronen,
verfügen aber über mehr kürzere Fortsätze (DOGIEL 1899). Die Typen IV bis VI
wurden bisher nur im myenterischen Plexus des Schweins beschrieben (STACH
1989).
2.3.3.2 Elektrophysiologische Klassifizierung
Die
Klassifizierung
enterischer
Nervenzellen
im
Dünndarm
aufgrund
von
elektrophysiologischen Charakteristika geht auf die Untersuchungen von HOLMAN et
al. (1972), NISHI und NORTH (1973) und HIRST et al. (1974) an myenterischen
Neuronen zurück. Hierbei werden Typ2- oder AH-Neurone und Typ1-oder S-Neurone
unterschieden. Typ2-/AH-Neurone besitzen im Vergleich zu Typ1-/S-Neuronen ein
höheres Ruhepotential und zeigen nach einem Aktionspotential eine mehrere
Sekunden
anhaltende,
Nachhyperpolarisation.
durch
Bei
den
den
Einstrom
von
Typ1-/S-Neuronen
Kalziumionen
dagegen
bedingte
tritt
keine
Nachhyperpolarisation auf. Daneben wurden auch myenterische Neurone gefunden,
die aufgrund ihrer elektrophysiologischen Eigenschaften weder zu Typ1-/S- noch zu
Typ2-/AH-Neuronen zuzuordnen waren. An einigen Neuronen konnte durch
depolarisierende Stimulation kein Aktionspotential ausgelöst werden, diese wurden
als Typ3-Neurone definiert. Als Typ4-Neurone werden Nervenzellen bezeichnet, die
den AH-Neuronen ähneln, aber keine Nachhyperpolarisation zeigen (WOOD 1989).
Im
Magen
werden
die
enterischen
Neurone
entsprechend
ihrer
elektrophysiologischen Eigenschaften als tonisch aktive Gastric-I, phasisch aktive
Gastric-II- und unerregbare Gastric-III-Neurone bezeichnet (SCHEMANN u. WOOD
1989a, b; TACK u. WOOD 1992).
14
Korrelation zwischen Morphologie, Elektrophysiologie und Funktion der Neurone
Bereits DOGIEL (1899) ging davon aus, dass die Form einer Nervenzelle eng mit
ihrer Funktion verbunden ist. Durch neuere Untersuchungen, die vorwiegend am
Meerschweinchen durchgeführt wurden, wurde diese Vermutung bestätigt. Demnach
sind sowohl die Morphologie der Neurone als auch ihre elektrophysiologischen
Eigenschaften mit ihrer Funktion korreliert.
So wurde am Dünndarm des Meerschweinchens gezeigt, dass Muskelmotoneurone
morphologisch zum Dogiel-Typ-I gehören (BROOKES u. COSTA 1990, BROOKES
et al. 1992) und elektrophysiologisch Typ1-/S-Neurone sind (FURNESS et al. 1989;
COSTA et al. 1991; BROOKES et al. 1992). Ein Teil der Dogiel-Typ-I-Neurone
scheint aber auch als Interneurone zu fungieren (COSTA et al. 1991). Dogiel-Typ-IINeurone dagegen entsprechen elektrophysiologisch den Typ2-/AH-Neuronen
(HODGKISS u. LEES 1983; ERDE et al. 1985; TAMURA 1992; CLERC et al. 1998a)
und besitzen häufig sensorische Funktionen (IYER et al. 1988; FURNESS et al.
1989). Diese Korrelation zwischen morphologischen und elektrophysiologischen
Eigenschaften der myenterischen Neurone wurde ebenfalls am Kolon des
Meerschweinchens beschrieben (LOMAX et al. 1999).
Eine
Besonderheit
der
Dogiel-Typ-II-
bzw.
der
Typ2-/AH-Neurone
beim
Meerschweinchen ist die Synthese von Calbindin. Dieses kalziumbindende Protein
wird im myenterischen Plexus des Dünndarms von rund 80% der Dogiel-Typ-IINeurone gebildet (IYER et al. 1988; QUINSON et al. 2001). Da Calbindin
ausschließlich von diesem Neuronentyp synthetisiert wird (IYER et al. 1988), wird es
häufig als Marker für Dogiel-Typ-II- bzw. Typ2-/AH-Neurone verwendet (GERSHON
et al. 1994). Die Funktion dieses Neuronentyps wurde unter anderem mit retrograden
Tracingtechniken untersucht. Da Neurone des Dogiel-Typ-II weder zur Zirkulär- noch
zur Längsmuskulatur projizieren (BROOKES u. COSTA 1990, BROOKES et al.
1992), können sie funktionell keine Motoneurone, dafür aber Interneurone oder
sensorische Neurone darstellen. Für beide möglichen Funktionen sind in der Literatur
Belege zu finden. Beispielsweise erhalten alle myenterischen Neurone im Dünndarm
des Meerschweinchens Input von mehreren Typ2-/AH-Neuronen, was auf eine
Funktion als Interneuron hindeutet (BORNSTEIN et al. 1991). Die Untersuchungen
von SONG et al. (1991) dagegen legen eine sensorische Funktion der Dogiel-Typ-IIbzw. Typ2-/AH-Neuronen nahe. Mit Tracingmethoden wurde hier gezeigt, dass die
Mehrzahl der myenterischen Neurone, die zur Mucosa projizieren, Dogiel-Typ-II
15
Morphologie besitzt. In rund zwei Drittel dieser Neurone konnte Calbindin
nachgewiesen werden. Eine weitere Studie belegte, dass 97% aller Calbindinsynthetisierenden Neurone zur Mucosa projizieren (SONG et al. 1994). Infolge dieser
Ergebnisse wurde eine sensorische Funktion für Neurone angenommen, die dem
Dogiel-Typ-II entsprechen bzw. in denen Calbindin nachweisbar ist (SONG et al.
1994).
2.3.3.3 Neurochemische Klassifizierung
Die neurochemische Charakterisierung beruht auf dem Nachweis der von den
Neuronen synthetisierten Neurotransmittern. Die lange geltende Meinung, ein
Neuron synthetisiere nur einen Neurotransmitter, trifft für das ENS nicht zu (COSTA
et al. 1986; FURNESS et al. 1989; GERSHON et al. 1994). Im Unterschied zu
anderen
Neuronen
bilden
enterische
Nervenzellen
eine
Vielzahl
von
Neurotransmittern. Die einzelnen Neurone besitzen hierbei jeweils eine bestimmte
Kombination von Neurotransmittern, die von ihnen synthetisiert werden. Eine solche
Transmitter-Kombination wird als "neurochemischer Kode" eines Neurons bezeichnet
(COSTA et al. 1986; FURNESS et al. 1989). Anhand des neurochemischen Kodes
können verschiedene Subpopulationen enterischer Neurone definiert werden.
Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass die Kodierungen der verschiedenen
Subpopulationen mit spezifischen Funktionen innerhalb der Steuerung des
Gastrointestinaltrakts korreliert sind (LLEWELLYN-SMITH 1987; FURNESS et al.
1995).
2.3.4 Neurotransmitter im ENS und Bedeutung des neurochemischen Kodes
Bis heute sind im ENS rund 25 Transmittersubstanzen bekannt. Bei der von einem
Neuron exprimierten Transmitterkombination stellt zumeist eine Substanz den
primären Transmitter dar, die übrigen sind kolokalisierte sekundäre Transmitter oder
Neuromodulatoren (McCONALOGUE u. FURNESS 1994; FURNESS et al. 1995).
Die wichtigste Rolle spielt der primäre Transmitter durch die schnelle Erzeugung
eines Effekts an der innervierten Zielzelle. Primäre Transmitter sind außerdem
dadurch charakterisiert, dass sie von funktionell gleichartigen Neuronen sowohl in
unterschiedlichen gastrointestinalen Regionen als auch bei unterschiedlichen
Spezies synthetisiert werden. Die Neuromodulatoren dagegen sind nicht in allen
funktionell gleichartigen Neuronen vorhanden (McCONALOGUE u. FURNESS 1994).
16
Von der Gesamtheit der Neurotransmitter scheint nur ein kleiner Teil als primärer
Transmitter zu agieren. So bilden myenterische Neurone im Magendarmtrakt durch
die Expression einer primären Transmittersubstanz zunächst zwei Populationen: Die
Neuronen der cholinergen Population synthetisieren Azetylcholin, die der zweiten
Population
sind
nitrerg
und
setzen
Stickstoffmonoxid
als
Transmitter
frei
(SCHEMANN et al. 1995; COSTA et al. 1996). Anhand der Kolokalisation von
weiteren Transmittern und Neuromodulatoren lassen sich jeweils Subpopulationen
unterscheiden.
Obwohl durch die insgesamt 25 verschiedenen Neurotransmitter rechnerisch sehr
viele Kombinationsmöglichkeiten bestehen, treten tatsächlich nur verhältnismäßig
wenige Kombinationen, also Kodierungen, auf. Die meisten Untersuchungen wurden
hierzu am Meerschweinchen durchgeführt. Hier wurden im Dünndarm etwa 20
Subpopulationen enterischer Neurone ermittelt (COSTA et al. 1996). Allgemein
existieren bezüglich der charakterisierten Subpopulationen einerseits Unterschiede
zwischen den einzelnen Darmabschnitten, andererseits zwischen verschiedenen
Spezies. So weichen beispielsweise die Subpopulationen im submukösen Plexus der
Ratte und des Meerschweinchens voneinander ab (FURNESS et al., 1995).
Während bei der Ratte über 25% der submukösen Neurone den Neurotransmitter
Substanz P exprimieren (PATAKY et al. 1990), sind es beim Meerschweinchen nur
rund 10% (BORNSTEIN u. FURNESS 1988). Neben den unterschiedlichen
prozentualen Anteilen der Transmitter bestehen auch Unterschiede bezüglich ihrer
Kolokalisation bei diesen Tierarten. So werden im Dünndarm der Ratte das
Neuropeptid Y (NPY) und das Vasoaktive Intestinale Polypeptid (VIP) von den
selben submukösen Neuronen synthetisiert (PATAKY et al. 1990; BUCHAN 1991).
Im Darm des Meerschweinchens dagegen sind NPY und VIP nicht kolokalisiert. Hier
ist NPY in cholinergen Neuronen nachweisbar und VIP wird von Neuronen
synthetisiert, die auch Galanin enthalten (BORNSTEIN u. FURNESS 1988). Bei der
Ratte dagegen ist Galanin nur in sehr wenigen Neuronen vorhanden und ist nicht mit
VIP kolokalisiert (PATAKY et al. 1990).
Um vom neurochemischen Kode einer Subpopulation auf ihre Funktion schließen zu
können, muss einerseits die Wirkung der synthetisierten Transmitter, andererseits
das durch die Subpopulation innervierte Zielgewebe bekannt sein. Generell kann an
den verschiedenen Zielgeweben im Gastrointestinaltrakt zwischen exzitatorisch und
inhibitorisch wirkenden Neurotransmittern unterschieden werden. So wirkt das von
17
myenterischen inhibitorischen Neuronen synthetisierte Stickstoffmonoxid relaxierend
auf die glatte Magendarmmuskulatur (HATA et al. 1990; LI u. RAND 1990; TODA et
al. 1990). Da die Relaxation durch Stickstoffmonoxid weder von Adrenalin noch von
Azetylcholin abhängig ist, zählen die synthetisierenden Neurone zu den sogenannten
NANC-Nerven (non-adrenergic, non-cholinergic) (HATA et al. 1990; STARK et al.
1991; RAND 1992; SANDERS u. WARD 1992). Ein weiterer Neurotransmitter mit
inhibitorischer Wirkung auf die glatte Muskulatur ist das Vasoaktive Intestinale
Polypeptid (VIP). Es konnte gezeigt werden, dass diese Substanz nach nervaler
Stimulation im Gastrointestinaltrakt freigesetzt wird und hier einen Effekt auf die
Muskulatur ausübt (FAHRENKRUG et al. 1978; DESAI et al. 1991). Auch bei In-vitroVersuchen mit Magenmuskulatur wurde eine relaxierende Wirkung durch VIP
beobachtet (BITAR u. MAKHLOUF 1982; GRIDER et al. 1985). Bei verschiedenen
Tierarten konnte gezeigt werden, dass Stickstoffmonoxid und VIP häufig kolokalisiert
in inhibitorischen Muskelmotoneuronen vorkommen, wie beispielweise im Darm des
Meerschweinchens (COSTA et al. 1992; CLERC et al. 1998b), der Ratte (AIMI et al.
1993; EKBLAD et al. 1994b), der Maus (SANG u. YOUNG 1996), des Hundes
(WARD et al. 1994) und des Rindes (VITTORIA et al. 2000). VIP wird darüberhinaus
auch von Sekreto- und Vasomotoneuronen synthetisiert (EKBLAD et al. 1985;
NEUNLIST et al. 1998).
Ein wichtiger exzitatorischer Neurotransmitter im ENS ist Azetylcholin (FURNESS u.
COSTA 1980, DANIEL et al. 1989; COSTA et al. 1991). Es wird von
Muskelmotoneuronen gebildet und bewirkt nach seiner Freisetzung eine Kontraktion
der glatten Muskulatur. Azetylcholin wird außerdem auch durch enterische
Interneurone und Sekretomotoneurone synthetisiert (BORNSTEIN u. FURNESS
1988; STEELE et al. 1991; PORTBURY et al. 1995 ). Ebenfalls ein Transmitter mit
erregender Wirkung auf die Muskulatur ist das Neuropeptid Substanz P (SP)
(MORITA et al. 1980). SP ist sowohl in Neuronen des myenterischen als auch des
submukösen Plexus nachweisbar (SCHULTZBERG et al. 1978; FURNESS u.
COSTA 1980; MORITA et al. 1980). Von Muskelmotoneuronen wird SP häufig
kolokalisiert mit Azetylcholin exprimiert (COSTA et al. 1991; STEELE et al. 1991;
FURNESS et al. 1995 ).
Während Azetylcholin und VIP an der glatten Muskulatur einen gegensätzlichen
Effekt besitzen, wirken sie an anderen Zielorganen synergistisch. So sind beide
Substanzen
sowohl
in
exzitatorischen
18
Sekretomotoneuronen
als
auch
in
Vasomotoneuronen nachweisbar und aktivieren hier gemeinsam die sekretorischen
Zellen des Epithels (SONG et al. 1992) bzw. führen zu einer Relaxation der
Blutgefäße (FAHRENKRUG et al. 1978; NEILD et al. 1990; BUNGARDT et al. 1992;
VANNER u. SURPRENANT 1996).
Zum Verständnis der Funktion von Neuronen ist es daher von besonderer
Bedeutung, nicht nur den neurochemischen Kode der einzelnen Subpopulationen zu
kennen, sondern auch ihre Projektionen, also die innervierten Zielgewebe.
2.3.5 Projektionsmuster enterischer Nervenzellen
Um die Projektionen und damit die Zielgewebe von Neuronen zu untersuchen,
wurden retrograde Tracingtechniken mit dem Fluoreszenzfarbstoff DiI entwickelt
(BROOKES u. COSTA 1990). Der Farbstoff wird in vitalen Geweben von
Axonterminalen aufgenommen und retrograd in das Zellsoma transportiert und hier
gespeichert. Anschließend kann immunhistochemisch der neurochemische Kode der
DiI-markierten Nervenzelle bestimmt werden. Mit dieser Methode wurden bisher vor
allem beim Meerschweinchen enterische Projektionen am Gastrointestinaltrakt
untersucht. Durch die Applikation von DiI auf die Zirkulär- bzw. Längsmuskulatur
konnten Innervationsmuster für die beiden Muskelschichten am Dünndarm
beschrieben werden. So besteht die Innervation der Zirkulärmuskulatur aus
polarisierten Projektionen von aszendierenden cholinergen und deszendierenden
nitrergen Neuronen (BROOKES et al. 1991). Dieses Projektionsmuster bildet die
neuronale
Grundlage
des
peristaltischen
Reflexes
und
ist
auch
an
der
Zirkulärmuskulatur des Darms anderer Spezies wie beispielweise des Menschen
(PORTER et al. 1997), des Schweins (TIMMERMANS et al. 1994; BARBIERS et al.
1995) oder der Ratte (EKBLAD et al. 1994a) vorhanden. Diese polarisierten
Projektionen wurden aber nicht nur in der Zirkulärmuskulatur des Darms, sondern
auch in der des Meerschweinchenmagens nachgewiesen (PFANNKUCHE et al.
1998, BROOKES et al. 1998, MICHEL et al. 2000). Auch am Labmagen des Rinds,
der funktionell dem Magen des Monogastriers entspricht, exisitiert an der
Zirkulärmuskulatur ein polarisiertes Projektionsmuster (PFANNKUCHE et al. 2002b).
Anders als die Zirkulärmuskulatur besitzt die Longitudinalmuskulatur nur vereinzelt
polarisierte Projektionen. So sind im Dünndarm des Meerschweinchens die
Projektionen zu dieser Muskelschicht nicht polarisiert (BROOKES et al. 1992). Im
Magen dagegen besteht die Innervation auch in der Longitudinalmuskulatur aus
19
aszendierenden cholinergen und deszendierenden nitrergen Neuronen (MICHEL et
al. 2000).
2.3.6 Neuronale Plastizität
Die bisher beschriebenen Eigenschaften und Fähigkeiten der enterischen Neurone
können in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren wie der gastrointestinalen
Region oder dem Alter des Tiers variieren. Diese Variationsfähigkeit wird auch als
neuronale Plastizität bezeichnet und beschreibt die Fähigkeit der Neurone, sich an
verschiedene äußere Bedingungen anzupassen. Diese neuronale Plastizität ist
sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Veränderungen zu
beobachten (GIARONI et al. 1999).
So ist beispielsweise eine Veränderung der Neuronenzahl in Abhängigkeit vom Alter
des untersuchten Tiers beschrieben. Bei der Ratte steigt die Anzahl myenterischer
Neurone nach der Geburt zunächst stark an (GABELLA 1971), sinkt aber im Laufe
des weiteren Lebens wieder um rund 40% (SANTER u. BAKER 1988). Auch beim
Meerschweinchen ist die Neuronenanzahl beim alten Tier signifikant geringer als
beim Jungtier (GABELLA 1989).
Neben Veränderungen der Neuronenanzahl können aber auch solche der
Neurotransmitter auftreten. So ist bei der Ratte vom Jungtier bis zum adulten Tier ein
Anstieg der nitrergen Neurone im Magendarmtrakt feststellbar (MATINI et al., 1997).
Gleichzeitig nimmt über diesen Zeitraum die Anzahl der cholinergen Neurone ab
(VANNUCCHI u. FAUSSONE-PELLEGRINI 1996).
Die Adaptationsfähigkeit enterischer Neurone wird auch durch Experimente, bei
denen eine extrinsische Denervation vorgenommen wurde, belegt. Innerhalb weniger
Wochen können neue intrinsische Schaltkreise ausgebildet werden, die die fehlende
extrinsische Innervation ausgleichen (GIARONI et al. 1999). So ist bei Ratten nach
einer Vagotomie der Relaxationsreflex des Magens zunächst beeinträchtigt, nach
vier Wochen aber wieder vollständig ausgebildet (TAKAHASHI u. OWYANG 1997).
2.3.7 Intrinsische Innervation des Wiederkäuervormagens
Im Vergleich zum Monogastrier wurden am Wiederkäuer, insbesondere am
Vormagen,
bisher
nur
wenige
Untersuchungen
durchgeführt.
20
zur
Bedeutung
des
ENS
Histologisch wurde schon früh nachgewiesen, dass auch der Vormagen über einen
intramuralen Nervenplexus verfügt (HABEL 1956; GRAU u. WALTER 1957).
MORRISON und HABEL (1964) zeigten etwas später, dass wie im restlichen
Gastrointestinaltrakt nur ein geringer Teil der myenterischen Neurone direkt
synaptisch mit dem Nervus vagus verbunden ist. Sie vermuteten daher, dass diese
wenigen Neuronen die erhaltenen vagalen Impulse an nicht direkt innervierte
Neurone weiterleiten und so die Aktivität der Muskulatur beeinflussen. Eine
besonders dichte vagale Innervation wurde in der Schlundrinne, im dorsalen
Pansensack und in der Fundusregion der Haube festgestellt. Diese Bereiche wurden
als zentrale Regionen bezeichnet, die möglicherweise als Koordinationszentren
dienen (MORRISON u. HABEL 1964). Neben der Weiterleitung extrinsischer Impulse
sind die myenterischen Vormagenneurone aber auch selbst zur Erregungsbildung
fähig. Bei elektrischen Messungen der Vormagenmuskelaktivität zeigten sich
zwischen den mit den biphasischen Kontraktionen assoziierten starken Potentialen
auch Entladungen kleinerer Amplitude. Sie waren regelmäßig vorhanden und traten
an Pansen und Haube mit einer Frequenz von 20-30/min bzw. 15/min auf
(RUCKEBUSCH 1989). Während nach einer Denervation des Retikulorumens die
biphasische, extrinsische Muskelaktivität verschwunden war (DUNCAN 1953;
HARDING u. LEEK 1971), waren diese intrinsischen Entladungen vor und nach einer
Denervation meßbar (LEEK 1969b, 2001).
Eine intrinsische, spontane Aktivität konnte auch bei In-vitro-Versuchen an
Muskelstreifen aus Pansen und Haube festgestellt werden (WONG u. MCLEAY
1988). Es wurde gezeigt, dass die spontane Aktivität der Vormagenmuskulatur durch
die Ausschüttung von Azetylcholin vermittelt wird, denn die Zugabe von Atropin
führte zu einer Reduzierung der Kontraktionen (TANEIKE u. OHGA 1975; WONG u.
MCLEAY 1988).
2.3.7.1 Funktionelle Bedeutung des ENS für die Vormagenfunktion
Die funktionelle Bedeutung der intrinsischen Vormageninnervation beim Wiederkäuer
ist bisher nicht vollständig geklärt. Obwohl die wichtige Rolle des Nervus vagus für
die Vormagenmotorik durch zahlreiche Experimente belegt ist, scheint auch das ENS
essentiell für eine intakte Vormagenfunktion zu sein.
So
konnte
gezeigt
werden,
dass
bei
homozygoten
grauen
und
weißen
Karakullämmern Zahl und Größe myenterischer Ganglien sowie die Anzahl der
21
Neurone in Pansen und Haube im Vergleich zu heterozygoten grauen und
schwarzen Karakullämmern deutlich vermindert ist (GROENEWALD u. BOOTH
1992a). Diese genetische Mutation ist mit schweren Motilitätsstörungen wie
beispielsweise einem fehlenden Schlundrinnenreflex verbunden, so dass die
betroffenen Lämmer kurz nach der Geburt einen gedehnten, Milch enthaltenden
Pansen aufweisen (GROENEWALD u. BOOTH 1989). Folge der Funktionsstörung
ist der Tod der Tiere noch während der Saugperiode (GROENEWALD u. BOOTH
1992b).
Neben diesem pathophysiologischen Befund geben auch Experimente mit
vagotomierten
Schafen
Hinweise
auf
die
funktionelle
Bedeutung
und
Eigenständigkeit des ENS. In vielen Versuchen führte eine totale Vagotomie zum
Sistieren der Vormagenmotorik und damit letztlich zum Tod der Versuchstiere
(HABEL 1956; SELLERS u. STEVENS 1966). Wurde die Ernährung und damit auch
das Überleben der Tiere aber durch eine intraabomasale Fütterung sichergestellt,
entwickelte sich etwa 1–3 Wochen nach der Vagotomie wieder eine Form von
Motilität im Vormagen (DUNCAN 1953; RUCKEBUSCH et al. 1972). Neuere
Untersuchungen der Vormagenmotilität wurden mit Hilfe der Elektromyographie an
chronisch vagotomierten Schafen von GREGORY (1982) durchgeführt. Wie in den
früheren Versuchen auch, kam es direkt nach der Vagotomie zum Sistieren der
Motorik. Innerhalb eines Tages war jedoch wieder eine Aktivität meßbar, die aus
rhythmischen, kleineren Entladungen bestand, die am gesamten Retikulorumen
vorhanden waren (GREGORY 1982). Nach 1–2 Wochen kam es zu kräftigen
Kontraktionen am Retikulorumen, die mit rhythmischen Serien starker Entladungen
assoziiert waren. Sie traten etwa einmal pro Minute auf und waren durch Pausen
voneinander getrennt. Die Kontraktionen traten zeitgleich über dem gesamtem
Retikulorumen auf und verursachten damit einen deutlichen Druckanstieg im
Vormagen (GREGORY 1982). Dieses Motilitätsmuster blieb über einen Zeitraum von
fünf Monaten unverändert erhalten. Taktile Stimulation der Maulhöhle und des
Ösophagus sowie die Fütterung beeinflußten die Motilität des Vormagens nicht. Die
in den ersten Tagen nach der Vagotomie vorhandene Motilität war durch
Hexamethonium nicht zu beeinflussen. Erst nach etwa zwei Wochen war die Motorik
des Retikulorumens durch Atropin und Hexamethonium hemmbar. GREGORY
(1982) schlußfolgerte daraus, dass die Motilität zu diesem Zeitpunkt neurogen
vermittelt ist und durch cholinerge Neurone des myenterischen Plexus koordiniert
22
wird. Da die Entwicklung dieses Motilitätsmusters zwei Wochen dauerte und
anschließend unverändert bestehen blieb, kann vermutet werden, dass sich während
dieses
Zeitraums
die
erforderlichen
neuronalen
Strukturen
innerhalb
des
myenterischen Plexus organisierten.
2.3.7.2 Nachweis verschiedener Transmitter im Vormagen
Grundlage der intrinsischen Aktivität ist das Vorhandensein enterischer Neurone im
Vormagen, die wie im übrigen Gastrointestinaltrakt entsprechende Neurotransmitter
synthetisieren und freisetzen und dadurch eine bestimmte Wirkung an der
Vormagenmuskulatur erzielen.
Die Existenz intrinsischer Neurone wurde von KITAMURA et al. (1986) an
Gewebeproben des Vormagens von Saugkälbern und abgesetzten Kälbern durch
den immunohistochemischen Nachweis der Neuronenspezifischen Enolase (NSE)
gezeigt. Dieses an der Glykolyse beteiligte Enzym wird von allen Neuronen
exprimiert, so dass sein Nachweis als Marker für Nervenzellen gilt (BISHOP et al.
1982). Durch weitere immunhistochemische Untersuchungen an Pansen, Haube und
Schlundrinne zeigten KITAMURA et al. (1986) auch, dass von einem Teil der
Nervenzellen die Neuropeptide VIP und SP synthetisiert werden. Die Anzahl der
peptidergen Neurone variiert dabei sowohl zwischen den beiden untersuchten
Altersstufen als auch zwischen den verschiedenen Vormagenbereichen. So fällt
einerseits bei den Saugkälbern eine dichtere Innervation als bei den abgesetzten
Kälbern auf, andererseits ist die Innervationsdichte im Retikulorumen geringer als in
der Schlundrinne (KITAMURA et al. 1986). Auch vom adulten Rind ist bekannt, dass
die Schlundrinne eine höhere Neuronendichte als der restliche Vormagen besitzt
(TEIXEIRA et al. 1998).
Neben den peptidergen Neuronen konnten im Vormagen des Rinds inzwischen auch
myenterische und submuköse Nervenzellen nachgewiesen werden, die das
Syntheseenzym
für
Stickstoffmonoxid,
die
Stickstoffmonoxidsynthase
(NOS),
exprimieren (BARAHONA et al. 1998; VITTORIA et al. 2000 ).
Die Neuropeptide SP und VIP wurden auch in enterischen Nervenzellen des
Vormagensystems anderer Wiederkäuerspezies wie dem Schaf nachgewiesen
(WATHUTA
1986;
GROENEWALD
1994;
PFANNKUCHE
et
al.
2002a).
Darüberhinaus konnte am Pansen des adulten Schafes gezeigt werden, dass alle
myenterischen
Neurone
entweder
das
23
Enzym
NOS
oder
das
Enzym
Cholinazetyltransferase
(ChAT)
zur
Synthese
von
Azetylcholin
exprimieren
(PFANNKUCHE et al. 2002a). Das Vorhandensein einer nitrergen und einer
cholinergen
Neuronenpopulation
zeigt,
dass
wie
im
Magendarmtrakt
des
Monogastriers auch im Vormagen des Wiederkäuers enterische Neurone mit einer
spezifischen neurochemischen Kodierung existieren. Entsprechend dieser Kodierung
können
die
myenterischen
Neurone
des
Pansens
beim
Schaf
in
drei
Subpopulationen unterteilt werden: die meisten Neurone sind cholinerg, sie besitzen
die Kodierung ChAT/SP oder ChAT/-, rund ein Viertel aller myenterischen Neurone
ist nitrerg und exprimiert NOS und VIP (PFANNKUCHE et al. 2002a). Durch
retrograde Tracingmethoden wurden die zur Muskulatur des Pansens projizierenden
Motoneurone identifiziert und anschließend ihr neurochemischer Kode bestimmt.
Dadurch wurde gezeigt, dass die Muskulatur durch Neurone der Kodierungen
ChAT/SP und NOS/VIP innerviert wird. Die Subpopulation ChAT/- projiziert nicht zur
Muskulatur. Die Innervation der Pansenmuskulatur ist im Gegensatz zu allen
anderen gastrointestinalen Regionen nicht polarisiert (PFANNKUCHE et al. 2002a).
2.3.7.3 Wirkung der Transmitter auf die Vormagenmuskulatur
Der Nachweis, dass die immunohistochemisch gezeigten Neurotransmitter auch eine
spezifische Wirkung auf den Vormagen besitzen, wurde durch verschiedene
funktionelle Studien erbracht.
So wurde von VEENENDAAL et al. (1982) bei In-vivo- und In-vitro-Studien der Effekt
von SP auf die Pansenmuskulatur von Ziegen untersucht. Während SP im In-vitroVersuch exzitatorisch auf die Muskulatur des Pansens wirkt, führt die Injektion von
SP in die Vena jugularis dosisabhängig zur Hemmung der Pansenkontraktionen. Der
in vivo beobachtete Effekt ist möglicherweise durch einen Anstieg des Muskeltonus
des Pansens bedingt, wodurch es zur Hemmung der normalen Reflexaktivität kommt
(VEENENDAAL et al. 1982).
Die exzitatorische Wirkung von Azetylcholin auf die glatte Vormagenmuskulatur
wurde in verschiedenen In-vitro-Studien belegt. Durch elektrische Stimulation
isolierter Pansen- und Haubenmuskulatur bzw. durch die Zugabe von Azetylcholin
auf isolierte Muskelstreifen wurden Kontraktionen ausgelöst (DUNCAN 1954;
SANFORD 1958), die durch den Zusatz von Atropin hemmbar waren (TANEIKE u.
OHGA 1975).
24
Als inhibitorisch wirkender Transmitter am Vormagen hat sich VIP erwiesen. Es
verursacht eine konzentrationsabhängige Reduktion der Azetylcholin-induzierten
Kontraktion der Pansenmuskulatur (DENAC et al. 1987) und kann somit als
relaxierender Transmitter eingestuft werden. An Muskelstreifen aus der Schlundrinne
war derselbe Effekt zu beobachten. Hier war die Wirkung von VIP beim Kalb deutlich
effektiver als beim adulten Rind, darüberhinaus zeigte sich die Zirkulärmuskulatur der
Schlundrinne sensitiver als die Longitudinalmuskulatur (DENAC et al. 1990). Die VIPbedingte Relaxation der Pansen- bzw. der Schlundrinnenmuskulatur konnte nicht
durch den Zusatz von Tetrodotoxin beeinflußt werden, was eine postganglionäre
Wirkung von VIP direkt an der Muskulatur nahelegt (DENAC et al. 1987, 1990). In
vivo führte die intraartierielle Infusion von VIP bei Lämmern zur Relaxation des
Ostium reticulo-omasicum. Eine derartige Relaxation ist physiologischerweise
während des Saugens von Milch zu beobachten (REID u. TITCHEN 1984).
Auch für Stickstoffmonoxid wurde an isolierter Muskulatur der Schlundrinne
(BARAHONA et al. 1998) und des Retikulorumens (SCHNEIDER u. EADES 1998)
eine relaxierende Wirkung beschrieben. An Pansen und Haube konnte eine durch
elektrische Feldstimulation induzierte Relaxation der Muskulatur durch die Zugabe
des Stickstoffmonoxidsynthase-Antagonisten L-NAME (N-Nitro-L-Argininmethylester)
konzentrationsabhängig gehemmt werden (SCHNEIDER u. EADES 1998).
2.4 Ziel der vorliegenden Untersuchung
Die
bislang
durch
funktionelle
und
immunhistochemische
Untersuchungen
gewonnenen Erkenntnisse weisen auf die wichtige Bedeutung des ENS für die
Vormagenfunktion hin. Darüberhinaus existieren Parallelen zwischen dem ENS am
Wiederkäuervormagen
und
am
Gastrointestinaltrakt
des
Monogastriers,
beispielsweise bei der Kolokalisation der Neurotransmitter. Im Vergleich zum
Monogastrier sind aber beim Wiederkäuer deutlich weniger Details über die
Kodierungen und Projektionen und somit auch über die verschiedenen Funktionen
der enterischen Neuronenpopulationen an den einzelnen Vormagenbereichen
bekannt. Da die Kodierung eines Neurons häufig einen Hinweis auf seine Funktion
gibt, war das Ziel der vorliegenden Studie, zunächst die neurochemische Kodierung
myenterischer Neurone in funktionell unterschiedlichen Vormagenbereichen von
Schaflämmern zu untersuchen. Da die einzelnen Abteilungen des Vormagens wie
25
anfangs beschrieben altersabhängig bestimmte Aufgaben erfüllen, wurde die
Untersuchung an Lämmern verschiedenen Alters durchgeführt. Als Altersgruppen
wurden Sauglämmer und ältere Mastlämmer ausgewählt. Während beim Sauglamm
die Schlundrinne eine lebensnotwendige Funktion erfüllt, spielt sie für das ältere
Lamm
nur
noch
eine
untergeordnete
Rolle.
Dagegen
ist
das
zur
Fermentationskammer ausgebildete Retikulorumen bei dem sich bereits von
Rauhfutter ernährenden Mastlamm Voraussetzung für eine intakte Verdauung. Da
also Ernährung, Verdauungsprozesse und somit auch die entsprechenden
Motilitätsmuster altersabhängig unterschiedlich sind, sollte untersucht werden, ob die
stattfindende Entwicklung der einzelnen Vormagenabteilungen auch mit einer
Veränderung der Neuronenpopulationen verbunden ist. Die neurochemische
Kodierung
wurde
daher
an
myenterischen
Pansen-,
Hauben-
und
Schlundrinnenneuronen von Saug- und Mastlämmern untersucht. Darüberhinaus
sollten beim Sauglamm die Projektionsmuster der Muskelmotoneurone in den
genannten Vormagenlokalisationen beschrieben werden. Durch retrogrades Tracing
wurden myenterische Neurone identifiziert, die zur Zirkulär- und Längsmuskulatur der
drei Vormagenbereiche projizieren und somit zur intrinsischen Innervation der
Muskulatur beitragen. Die anschließende neurochemische Charakterisierung der
retrograd markierten Muskelmotoneurone sollte zeigen, ob diese Neurone eine
spezifische neurochemische Kodierung und Projektionspräferenz besitzen.
26
3. Eigene Untersuchungen
3.1 Versuchstiere und Organentnahme
Als Versuchstiere wurden Merinoschaflämmer zweier Altersgruppen verwendet. Die
erste Gruppe bestand aus Sauglämmern, die zwischen einem und sieben Tagen alt
waren. Die zweite Gruppe bildeten die Mastlämmer, die bereits ein Alter von sechs
Monaten erreicht hatten.
Bei den Sauglämmern wurden männliche und weibliche Tiere verwendet, die
größtenteils aus Mehrlingsgeburten stammten. Die Tiere wurden durch Bolzenschuß
betäubt und durch anschließendes Entbluten getötet.1)
Mit einer Schere wurde die Haut im Bereich des Nabels eröffnet und mit einem
Skalpell von der Bauchmuskulatur getrennt. Anschließend wurde mit einer sterilen
Schere die Bauchhöhle entlang der Linea alba und des Rippenbogens geöffnet. Das
komplette Vormagensystem wurde mit einem Scherenschnitt durch den Ösophagus
und den Labmagen aus dem Verdauungstrakt gelöst und in sterile, Carbogen
begaste (95% O2, 5% CO2) Krebslösung (Zusammensetzung in mM: 117 NaCl, 4,7
KCl, 1,2 MgCl2, 1,2 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 2,5 CaCl2, 11,5 Glukose und 1µm
Nifedipin; pH7,4) verbracht.
Die verwendeten Mastlämmer beiderlei Geschlechts wurden durch Bolzenschuß
betäubt und durch anschließendes Entbluten getötet. Nach der Herauslösung des
Vormagensystems
wurden
mit
sterilen
Instrumenten
etwa
5x5
cm
große
Gewebestücke aus der Haube und dem ventralen Pansensack entnommen. Die
Schlundrinne wurde vom Ösophagus aus vollständig vom Vormagensystem
abgetrennt (Abb.1). Die Gewebeproben der Mastlämmer wurden ebenfalls in sterile,
Carbogen begaste Krebslösung überführt.
1)
Die Tötung der Tiere zur Entnahme des Probenmaterials war zuvor beim
Regierungspräsidium Leipzig angezeigt und genehmigt worden (Aktenzeichen 74-9162.1101-T53/01).
27
3.2 Gewebekultur und retrogrades Tracing
Alle für die Gewebekultur verwendeten Bestecke, Petrischalen und Gefäße wurden
zuvor 3 Stunden bei 180°C im Heißluftschrank sterilisiert. Die Krebslösung wurde 20
Minuten bei 121°C autoklaviert. Das Kulturmedium wurde steril filtriert. Die
Krebslösung wurde vor ihrer Verwendung auf 5°C gekühlt und mit Carbogen begast.
Aus den bei den Sauglämmern entnommenen Vormagensystemen wurden zunächst
die einzelnen Probenstücke der verschiedenen Kompartimente gewonnen.
Als Gewebeprobe des Pansens wurden der rechte und linke ventrale Pansensack
entnommen. Hierzu wurde der Pansen an seiner ventralen Kurvatur eröffnet und die
zwischen kranialem Pfeiler und ventralem Kranzpfeiler gelegenene Pansenwand
wurde als Probe entnommen. Die Haube wurde ebenfalls von ventral her eröffnet
und in eine linke und rechte Hälfte geschnitten. Die oralen Seiten der Pansen- und
Haubengewebe wurden durch einen kleinen Einschnitt in die Muskulatur markiert.
Die Schlundrinne wurde an ihrem oralen Ende vom Ösophagus getrennt. In aboraler
Richtung erfolgte die Durchtrennung des Gewebes am Übergang zur Psalterrinne.
Seitlich wurde die Schlundrinne entlang ihrer linken Lippe vom benachbarten
Haubengewebe und entlang ihrer rechten Lippe vom angrenzenden Pansengewebe
abgeschnitten (Abb.1).
Um Reste des Mageninhalts wie beispielsweise Milch bzw. Heupartikel beim
Mastlamm zu entfernen, wurden sämtliche Gewebestücke vor der nun folgenden
Präparation mit Krebslösung gespült.
Zur Vorbereitung für die Kulturperiode musste zunächst von jedem Gewebestück das
Epithel entfernt werden. Hierzu wurden die Gewebe einzeln, mit dem Epithel nach
oben weisend, in sterile Petrischalen gebracht. Der Boden dieser Petrischalen war
mit einer Sylgardschicht bedeckt, so dass die Gewebestücke mit Präpariernadeln
aufgespannt werden konnten. Um während der nun folgenden Präparation den
Stoffwechsel und somit die Vitalität der Gewebe zu erhalten, wurden die Petrischalen
mit Krebslösung gefüllt. Mit Pinzette und Irisschere konnten nun unter einem
Binokular Mukosa und Submukosa von der darunterliegenden Zirkulärmuskulatur
abpräpariert werden. Während des Präparierens wurde die Krebslösung in der
Petrischale alle 10 Minuten gegen frische, Carbogen begaste Lösung ausgetauscht.
An den Gewebeproben der Schlundrinnen wurde neben der Mukosa und der
Submukosa auch anhaftendes Bindegewebe von der serosalen Seite entfernt.
28
Nach der Präparation wurden die Gewebe sechs mal für 10 Minuten in Krebslösung
gewaschen.
Je nach geplantem Verwendungszweck der Gewebe wurde die nun folgende
Kultivierung unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt.
Ösophagus
dorsaler Pansensack
Schlundrinne
Haube
Labmagen
ventraler Pansensack
Abb.1: Schematische Darstellung des Vormagens
Die schraffierten Flächen zeigen die Bereiche des Vormagens, aus denen die Proben
entnommen wurden. Die grauen Linien beschreiben den Verlauf der Schlundrinnenlippen.
Die Lage des Labmagens ist durch die gestrichelte Linie angedeutet.
3.2.1 Kultivierung zur Untersuchung des neurochemischen Kodes
Einige der Gewebestücke von Pansen, Haube und Schlundrinne der Sauglämmer
wurden kultiviert, um anschließend die allgemeine neurochemische Kodierung dieser
Lokalisationen untersuchen zu können. Die von den Mastlämmern gewonnenen
Proben wurden ausschließlich mit der im folgenden beschriebenen Methode
kultiviert.
Die hier verwendeten Präparate wurden nach dem oben beschriebenen Waschen
einzeln in sterilen Petrischalen aufgespannt. Um eine beidseitige Umspülung des
Gewebes mit Kulturmedium und damit seine Ernährung während der Kulturperiode
zu gewährleisten, wurden unter die vier Ecken und vier Seitenränder der
Gewebestücke insgesamt acht, etwa 2 mm hohe Sylgard-Quader gesetzt. Im
Anschluß wurden die aufgespannten Präparate erneut drei mal für 10 Minuten mit
Krebslösung gewaschen. Nach dem letzten Waschen wurden 35 ml Dulbeccos
29
Modified Eagles Kulturmedium (DMEM F-12 Sigma, Deisenhofen, Deutschland) in
jede Petrischale gegeben. Dem Medium (pH 7,4) waren 10% hitzeinaktiviertes
fötales Kälberserum, 100 IU/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 1,24 µg/ml
Amphotericin B, 20 µg/ml Gentamicin, 2,1 mg/ml NaHCO3 und 1µM Nifedipin (alle
Chemikalien von Sigma, Deisenhofen, Deutschland) zugesetzt. Das Medium war
zwei Stunden vor seiner Verwendung im Brutschrank (37°C; 5% CO2) äquilibriert
worden. Dem Medium wurden ebenfalls 40µM Colchizin zugesetzt. Colchizin
verhindert den axonalen Transport und die Abgabe von Neuropeptiden, wodurch
diese sich im Soma der Neurone anreichern und später immunhistochemisch besser
dargestellt werden können. Die einzelnen Petrischalen wurden mit Silikontrichtern
abgedeckt und in den Brutschrank gestellt. Im Brutschrank befanden sich die
Schalen auf einem Horizontalschüttler. Dieser bewegte sich permanent mit einer
Frequenz von ca.1 Hz, so dass die Gewebestücke immer vom Medium umspült
waren. Die Kultivierung dieser Präparate erfolgte bei 37°C und 5% CO2 über einen
Zeitraum von 24 Stunden. Nach der Kulturperiode wurden die Gewebe in
aufgespanntem Zustand mit Zambonis Fixativ (0,1 M Phosphatpuffer mit 4%
Paraformaldehyd und 15% Pikrinsäure) für 24 Stunden bei 4°C fixiert. Die fixierten
Präparate wurden anschließend drei mal für 10 Minuten mit 0,1 M Phosphatpuffer
gewaschen und bis zur weiteren Bearbeitung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung
(PBS: 0,1 M Phosphatpuffer, 0,88% NaCl, pH 7,4), die 0,1% NaN3 enthielt,
aufbewahrt.
Einige Gewebeproben von Pansen, Haube und Schlundrinne wurden direkt nach
ihrer Entnahme, also ohne Kulturperiode, für 24 Stunden bei 5°C mit Zambonis
Fixativ fixiert. Die Behandlung nach der Fixierung dieser Präparate erfolgte wie oben
beschrieben.
3.2.2 Kultivierung zur Markierung von Muskelmotoneuronen
In der Altersgruppe der Sauglämmer wurde ein Teil der entnommenen Proben dazu
verwendet, Neurone zu identifizieren, die an der direkten Innervation der
Vormagenmuskulatur beteiligt sind. Hierzu wurde der retrograder Tracingfarbstoff
1,1`-Didodecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat
(DiI)
(Molecular
Probes, Eugene Oreg., USA) auf die Zirkulär- oder Längsmuskelschicht der Gewebe
appliziert. Da dieser Farbstoff lipophil ist, kann er von den an der Applikationsstelle
30
endenden Axonen aufgenommen und retrograd in die Somata der zugehörigen
Neurone transportiert werden.
Zur Verwendung des Farbstoffes wurde dieser zuvor in einer Konzentration von 1mM
in Methanol gelöst und auf kleine Glasperlen (∅ 200µm) aufgebracht. Pro Präparat
wurde
eine
dieser
beschichteten
Glasperlen
mit
einer
Ethanol
benetzten
Glaskapillare aufgenommen und vorsichtig in der Mitte des Gewebes auf die Zirkuläroder Längsmuskulatur appliziert. Nach der Applikation wurden auch unter die Ecken
und Seitenränder dieser Präparate Sylgard-Quader gesetzt. Anschließend wurden
die aufgespannten Präparate in den Petrischalen drei mal für 10 Minuten mit
Krebslösung gewaschen. Schließlich wurden je 35 ml des oben genannten
Kulturmediums, jedoch ohne den Zusatz von Colchizin, in die Petrischalen gegeben.
Das Medium war vor seiner Verwendung ebenfalls bei 37°C und 5% CO2 äquilibriert
worden. Zur Aufbewahrung im Brutschrank wurden die Petrischalen auch hier mit
einem Silikontrichter bedeckt und auf einen Horizontalschüttler gestellt. Um eine
genügende Aufnahme bzw. Transport des Farbstoffs in die Neurone zu erreichen,
wurden die Präparate mit DiI-Markierung über einen Zeitraum von 5 Tagen kultiviert.
Während dieser Zeit wurde das Kulturmediumedium alle 24 Stunden gegen frisches,
äquilibriertes Medium ausgetauscht. Der Zusatz von 40µM Colchizin zum
Kulturmedium erfolgte hier erst für die letzten 16 Stunden der Kulturperiode. Die
anschließende Fixierung und Aufbewahrung der Präparate erfolgte nach derselben
Methode wie oben beschrieben.
3.3 Immunhistochemische Färbung der Präparate ohne DiI-Markierung
Um die allgemeine Kodierung der myenterischen Neurone zu untersuchen, musste
zunächst der myenterische Plexus isoliert werden. Das fixierte Gewebe wurde hierzu
in einer mit PBS gefüllten Petrischale aufgespannt. Unter einem Binokular wurden
mit einer Pinzette Serosa, Zirkulär- und Längsmuskulatur entfernt und so der
myenterische Plexus freigelegt. Anschließend wurden an den Plexuspräparaten
durch indirekte Immunfluoreszenzfärbungen verschiedene Neurotransmitter bzw.
deren Syntheseenzyme und Neuropeptide dargestellt. Präparate, die für 24 Stunden
mit Colchizin kultiviert worden waren, wurden verwendet, wenn neben den Enzymen
auch Neuropeptide angefärbt werden sollten. Die unmittelbar nach ihrer Entnahme
31
fixierten Gewebe wurden für Untersuchungen genutzt, bei denen ausschließlich
neuronale Enzyme nachgewiesen werden sollten.
Vor der eigentlichen Färbung wurden die Präparate zunächst für eine Stunde in
PBS/NaN3, das 4% Pferde- bzw. Ziegeserum und 0,5% TritonX-100 enthielt, bei
Zimmertemperatur vorinkubiert.
TritonX-100 bewirkt eine Permeabilisierung der Zellmembranen, so dass die Bindung
der Antikörper an die intrazellulär gelegenen, anzufärbenden Enzyme und
Neuropeptide möglich wird. Der Zusatz des Pferde- bzw. Ziegeserum diente dazu,
unspezifische
Bindungsstellen
zu
besetzen.
Die
Pferdeserum
enthaltende
Inkubationslösung wurde bei Färbungen verwendet, in denen die Sekundärantikörper
aus Eseln stammten. Waren die Sekundärantikörper aus Ziegen gewonnen worden,
so wurde Ziegenserum zugesetzt. Die jeweils bei der Vorinkubation verwendete
Lösung wurden auch für die folgende Inkubation mit den primären und sekundären
Antikörper genutzt.
Nach der Vorinkubation wurden die Gewebe für 36 Stunden mit den primären
Antikörpern (Tab. 1) bei Zimmertemperatur inkubiert. Im Anschluß wurden die
Präparate zur Entfernung nicht gebundener primärer Antikörper drei mal 10 Minuten
in PBS gewaschen. Nach dem Waschen folgte eine fünfstündige Inkubation mit den
sekundären Antikörpern. Die sekundären Antikörper waren gegen die Spezies
gerichtet, aus denen die zuvor verwendeten Primärantikörper stammten. Da diese
aus verschiedenen Spezies stammten (Maus, Meerschweinchen, Ratte, Kaninchen),
führte die Bindung der entsprechenden Sekundärantikörper zu einer spezifischen
Markierung der primären Antikörper. Die Sekundärantikörper waren mit den
Fluoreszenzfarbstoffen Carbocyanin Cy2, Cy3 oder Cy5 markiert (Tab. 2). Einige der
verwendeten Sekundärantikörper (Esel-anti-Meerschweinchen, Esel-anti-Kaninchen,
Ziege-anti-Maus) waren mit Biotin gekoppelt. Bei Färbungen, in denen einer dieser
beiden Antikörper verwendet wurde, musste eine zusätzliche Inkubation durchgeführt
werden. Hierbei wurde der Plexus zunächst fünf Stunden in dem Biotin-markierten
Antikörper inkubiert und anschließend drei mal für 10 Minuten in PBS gewaschen.
Danach erfolgte eine erneute fünfstündige Inkubation mit den übrigen sekundären
Antikörpern und den Fluorophoren Streptavidin-7-Amino-4-Methylcoumarin-3-Acetat
(Strept-AMCA) oder Streptavidin-Dichlortriazinyl-Aminofluorescein (Strept-DTAF).
Strept-AMCA und Strept-DTAF dienten der Sichtbarmachung des Biotins. Nach
32
erneutem dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Präparate mit Glyzerollösung
(80% Glyzerol, 0,1% NaN3, 0,5 M NaHCO3/Na2CO3) auf Objektträgern eingedeckt.
Antigen
Herkunft (Tierart)
Verdünnung
Hersteller
Cholinazetyl-
Kaninchen
1:1000
P3YEB, Prof. Dr. M.
Transferase (ChAT)
Schemann,
Deutschland 1)
Stickstoffmonoxid-
Maus
1:40
Synthase (NOS)
N31020,
Transduction
Laboratories, USA
Substanz P (SP)
Ratte
1:1000
10-S015, Fitzgerald,
USA
Vasoaktives
Meerschweinchen
1:1000
Intestinales
GHC7161,
Peninsula, USA
Polypeptid (VIP)
Calbindin
Kaninchen
1:2000
Swant, Bellinzona,
Schweiz
Neuronenspezifische Kaninchen
1:3000
Enolase (NSE)
HuC/D
16625, Polyscience,
USA
Maus
1:200
MoBiTec, Göttingen,
Deutschland
Tyrosinhydroxylase
Maus
1:1000
(TH)
1)
Deutschland
(Schemann et al., 1993)
Tabelle 1: Übersicht über die verwendeten primären Antikörper
Antikörper
Sigma, Deisenhofen,
Fluorophor
Verdünnung
33
Esel-anti-Kaninchen Cy2
1:200
Esel-anti- Maus
Cy3
1:500
Esel-anti-Ratte
Cy5
1:500
Esel-antiMeerschweinchen
1:50
Strept-AMCA
mit Biotin
Esel-anti-Kaninchen Strept-AMCA
1:50
mit Biotin
Ziege-anti-Maus mit Strept-DTAF
1:200
Biotin
Tabelle 2: Übersicht über die verwendeten sekundären Antikörper
Alle verwendete Sekundärantikörper wurden über Dianova, Hamburg, Deutschland bezogen
3.4 Immunhistochemische Färbung der DiI-markierten Präparate
Bei den DiI-markierten Präparaten wurde ebenfalls wie oben beschrieben der
myenterische Plexus isoliert. Da im weiteren Verlauf der Studie die Lage der DiImarkierten Nervenzellen in Bezug auf die Applikationsstelle untersucht werden sollte,
war es notwendig, diese Stelle zu markieren. Dazu wurde vor der Entfernung der
Muskulatur das Gewebe an der Applikationsstelle mit einer Nadel durchstochen.
Durch diesen Stich gelangte das DiI hier direkt an den myenterischen Plexus und
kennzeichnete so die Applikationsstelle.
Nach der Entfernung der Muskulatur konnten die erhaltenen Plexuspräparate gefärbt
werden. Die Permeabilisierung wurde hier mit Glyzerollösungen aufsteigender
Konzentrationen durchgeführt (30 min in 50%, 30 min in 80%, 150 min in 100%
Glyzerol). Eine Permeabilisierung der Gewebe mit TritonX-100 war nicht möglich, da
DiI in TritonX-100 löslich ist und somit das DiI aus den Neuronen ausgewaschen
würde. Nach der Permeabilisierung wurden die Gewebe vier mal 15 Minuten in PBS
gewaschen. Da alle hier angewandten Sekundärantikörper aus Eseln stammten,
wurde die nun folgende einstündige Präinkubation in PBS/NaN3 mit 4% Pferdeserum
durchgeführt. Im Anschluß wurden die Präparate über drei Tage mit den primären
Antikörpern inkubiert. Als primäre Antikörper wurden die selben wie bei den
Geweben ohne DiI-Markierung verwendet (Tab. 1). Nach Ablauf der Inkubationszeit
34
wurden die Präparate drei mal für 10 Minuten in PBS gewaschen und danach für
zwei Tage in dem mit Biotin markierten Antikörper (Esel-anti-Meerschwein) inkubiert.
Nach weiterem, dreimaligem Waschen erfolgte die Inkubation mit den restlichen
sekundären Antikörpern und Strept-AMCA (Tab. 2) Alle hier verwendeten Antikörper
wurden in PBS/NaN3 mit 4% Pferdeserum gelöst. Abschließend wurden die
Präparate erneut gewaschen und mit Glyzerol auf Objektträgern eingedeckt.
3.5 Spezifität der Antikörper
An Plexuspräparaten des ruminierenden Schafes wurde die Spezifität der Antikörper
bereits geprüft. Hier konnte nach der Inkubation (24 Stunden bei 4°C) der
entsprechenden
Antikörper
mit
1µM
ChAT,
VIP
und
SP
keine
positive
Immunreaktivität der Gewebe mehr erreicht werden (PFANNKUCHE et al. 2002a).
Die Spezifität des NOS-Antikörpers wurde durch die NADPH-Diaphorase-Reaktion
ebenfalls nachgewiesen. Hierbei wurde an zuvor gegen NOS gefärbten Geweben
gezeigt, dass durch den NOS-Antikörper und die NADPH-Diaphorase-Reaktion die
selben Neurone markiert werden (PFANNKUCHE et al. 2002a). Auch beim
Sauglamm markierten der NOS-Antikörper und die NADPH-Diaphorase-Reaktion die
selben myenterischen Neurone (Abb. 2).
Die Spezifität der drei anderen Antikörper wurde beim Sauglamm unter den selben
Inkubationsbedingungen wie beim ruminierenden Tier getestet. Die Inkubation mit
1µM bzw. 10µM ChAT, VIP und SP führte auch hier zum Ausbleiben einer
Immunreaktivität der Neurone in Pansen, Haube und Schlundrinne.
A
B
NOS
NADPH
50µm
Abb.2: Ganglion aus der Haube des Sauglammes. Durch die Verwendung des gegen NOS
gerichteten Antikörpers (A) wurden die selben Neurone markiert wie bei einer NADPHFärbung (B).
3.6 Auswertung der Präparate
35
Die
Auswertung
sämtlicher
Immunfluoreszenzfärbungen
erfolgte
mit
einem
Epifluoreszenzmikroskop (IX50, Olympus, Japan). In Tabelle 3 sind die hierbei
verwendeten Filterblöcke dargestellt.
Filterblock1),2) Anregungsfilter Dichroitischer Emissionsfilter Farbstoff
Spiegel
UM41007
U-MNIBA
U-MWU
U-M41008
HQ 545/30x
565DCLP
HQ 610/75M
DiI/Cy3
(530-560 nm)
(565 nm)
(575-645 nm)
(orange)
BP 470-490
DM505
D520
Cy2 /DTAF
(470-490 nm)
(505 nm)
(510-530 nm)
(grün)
BP 330-385
DM400
BP 460-490
AMCA (blau)
(330-385 nm)
(400 nm)
(460-490 nm)
HQ 620/60
Q660 LP
HQ 700/75
(590-650 nm)
(660 nm)
(665-735 nm)
Cy5 (infrarot)
Tabelle 3: Filterblöcke zur Sichtbarmachung der verwendeten Fluorophore
1)
Die Angaben zu den Filtern stammen von der Firma Olympus, Hamburg bzw. Chroma
Technology, Brattelboro, USA
2)
Die Wellenlängenbereiche für Anregungsfilter, Dichroitischen Spiegel und Emmissionsfilter
sind in Klammern unter den Firmenbezeichnungen angegeben
Die
Auswertung
der
Immunfluoreszenzfärbungen
wurde
mit
Hilfe
eines
computergestützten Bildanalysesystems durchgeführt. Die Aufnahmen der Ganglien
und Neurone wurden mit einer digitalen Schwarzweiß-Videokamera (Mod. 4910,
Cohu Inc., San Diego, Californien, USA) angefertigt. Als Software zur Bearbeitung
und weiteren Auswertung der Aufnahmen wurden die Programme Scion Image
(Frederick, Maryland, USA), IPLab Spectrum 3.0 (Signal Analytics, Vienna, Virginia,
USA) und Paint Shop Pro7 (Jasc Software Inc., Eden Prairie, Minnesota, USA)
verwendet.
3.6.1 Auswertung der Präparate ohne DiI-Markierung
36
An den nicht DiI-markierten Plexuspräparaten wurden Untersuchungen zur
neurochemischen Kodierung der myenterischen Neurone durchgeführt. Gleichzeitig
wurden
an
diesen
Präparaten
allgemeine
Innervationsmerkmale
wie
die
Gangliendichte und die Neuronengröße beschrieben.
Zur Bestimmung der existierenden neurochemischen Kodierungen wurden pro
Präparat zwanzig Ganglien ausgewertet. Bei dieser Auswertung wurden die
einzelnen Neurone dieser Ganglien auf ihre Immunreaktivität für die verschiedenen
Neurotransmitter und –peptide überprüft.
Als Gangliendichte wurde die Anzahl der Ganglien auf einer definierten Plexusfläche
bezeichnet. Die Bestimmung der Gangliendichte erfolgte mit Hilfe einer Schablone.
Hierbei wurden alle Ganglien auf einer Fläche von 1cm² gezählt.
Die Messung der Zellgrößen wurde an Aufnahmen von Neuronen mit Hilfe der
Software IPLab Spectrum 3.0 (Signal Analytic, Vienna, Virginia, USA) durchgeführt.
Hierbei wurde auf dem Computermonitor der Umriß einzelner Neuronenzellkörper
markiert. Anschließend wurde die Größe der so entstandenen Fläche berechnet. Die
Fläche der Neuronenfortsätze wurde bei dieser Methode nicht berücksichtigt.
Die Zellgrößen der Neurone wurden in Abhängigkeit von den sich ergebenden
neurochemischen Kodierungen bestimmt. In jedem untersuchten Präparat wurden je
30 Neurone pro Kodierung ausgemessen.
3.6.2 Auswertung der DiI-markierten Präparate
Um die Lage der DiI-markierten Neurone in Bezug zur Applikationsstelle zu
bestimmen, wurde ein digitaler Kreuztisch verwendet. Der Applikationsstelle wurde
dabei der Ursprung eines Koordinatensystems (x=0, y=0) zugeordnet.
Jedes Präparat, auf das DiI appliziert worden war, wurde vollständig auf DiImarkierte Neurone durchmustert. Von jedem DiI-markierten Neuron wurde sowohl
die Lokalisation, d.h. die entsprechenden Koordinaten, als auch die neurochemische
Kodierung bestimmt.
Weiterhin wurden von jedem Präparat die Koordinaten seines Umrißes bestimmt.
Außerdem wurden in Nähe der Applikationsstelle anhand von Bindegewebsresten
37
die Koordinaten der ehemaligen Verlaufsrichtung der Zirkulär- und Längsmuskulatur
registriert.
Alle erhaltenen Koordinaten wurden anschließend mit den Computerprogrammen
Sigma Stat 2.0 und Sigma Plot (Jandel Scientific) ausgewertet. Um dabei die
Projektionsrichtungen der markierten Neurone zu erfassen, wurde in allen
Präparaten der Verlauf der Zirkulärmuskulatur mit der Richtung der y-Achse
gleichgesetzt. Da anfangs bei der Probenentnahme ein Einschnitt in die Muskulatur
gesetzt wurde, war die ehemals orale Seite des Gewebes bekannt. Dadurch war es
möglich, für jedes Präparat eine eigene Kartierung zu erstellen, in der die Lage der
DiI-markierten Neurone und damit ihre Projektionsrichtungen zu erkennen waren
(Abb. 3). DiI-markierte Neurone, die oral der Applikationstelle lokalisiert waren,
wurden dabei als deszendierende Neurone bezeichnet. Entsprechend besaßen die
aboral der Applikationstelle gelegenen Neurone aszendierende Projektionsrichtung.
Verlauf der Zirkulärmuskulatur
orale Seite
Verlauf der Längsmuskulatur
DiI-markierte Muskelneurone
Abb.3: Kartierung der DiI-markierten Präparate
Zur Kartierung wurden zunächst die Koordinaten des Gewebeumrißes sowie der ehemaligen
Verlaufsrichtung der Muskulatur erfaßt. Der zentral gelegenen Applikationsstelle wurde der
Ursprung eines Koordinatensystems zugeordnet. Die an der rechten Seite erkennbare
Einkerbung markiert die orale Seite des Präparates. Die Linien innerhalb des Präparates
entsprechen den Verlaufsrichtung der Muskelschichten. Die Punkte symbolisieren die
Lokalisation der DiI-markierten Neurone.
3.7 Statistik
38
3.7.1 Statistik an Präparaten ohne DiI-Markierung
Für jedes einzelne Präparat wurden die Gangliongrößen sowie die Anzahl der
Neurone der unterschiedlichen Populationen als Medianwerte bestimmt. Die im
folgenden genannten Werte stellen die Mittelwerte ± Standardabweichung der
Medianwerte dar. Die prozentualen Anteile der Populationen wurden anhand der
Medianwerte
errechnet
und
werden
daher
ebenfalls
als
Mittelwerte
±
Medianwert
±
Standardabweichung der einzelnen Medianwerte angegeben.
Die
gemessen
Somagrößen
der
Neurone
werden
als
Standardabweichung angegeben.
Der Vergleich der einzelnen Populationsgrößen innerhalb eines Gewebes und eines
Alters
erfolgte
mit
dem
One-Way-ANOVA-Test.
Bei
Vergleichen
zwischen
verschiedenen Lokalisationen sowie zwischen den Altersgruppen wurde ein TwoWay-ANOVA-Test mit nachfolgenden multiplen Vergleichen (Student-NewmanKeuls) durchgeführt.
Unterschiede wurden als statistisch signifikant gewertet, wenn p<0,05 war.
3.7.2 Statistik an Präparaten mit DiI-Markierung
Für jedes DiI-markierte Präparat wurde der relative Anteil der neurochemisch
charakterisierten Populationen getrennt ausgewertet. Weiterhin wurde für die
Projektionslängen
der Median
für
jedes
einzelne
Präparat
bestimmt.
Alle
angegebenen Werte stellen Mittelwerte ± Standardabweichungen der Medianwerte
dar.
Statistische Vergleiche zwischen Populationen und zwischen Lokalisationen
erfolgten mit dem One-Way-ANOVA-Test. Bei Vergleichen von mehr als zwei
Gruppen wurden nachfolgende multiple Vergleiche mit dem Student-Newman-KeulsTest durchgeführt.
Auch hier wurden Unterschiede als statistisch signifikant gewertet, wenn p<0,05 war.
4. Ergebnisse
39
4.1 Allgemeine Innervationsmuster
In den untersuchten Vormagenbereichen Pansen, Haube und Schlundrinne beider
Altersgruppen war ein myenterischer Plexus nachweisbar. Die Plexus bestanden aus
Nervenzellen, die in Ganglien organisiert waren und aus den dazwischenliegenden,
interganglionären Fasersträngen.
4.1.1 Gangliengrößen
Bezüglich der Größe der Ganglien (=Anzahl der Neurone eines Ganglions) waren
sowohl lokalisations- als auch altersabhängige Unterschiede vorhanden (Tab.4).
Im Pansen des Sauglammes lag die mittlere Gangliengröße bei 104 ± 36 Neuronen
und
unterschied
sich
damit
deutlich
von
der
der
beiden
anderen
Vormagenabteilungen. Während die Ganglien der Haube die meisten Neurone
enthielten, waren die der Schlundrinne signifikant kleiner als die von Pansen und
Haube. Auch beim Mastlamm waren lokalisationsabhängige Unterschiede der
Gangliongröße vorhanden. Wie beim Sauglamm waren auch hier die Ganglien der
Haube am größten. Im Pansen und in der Schlundrinne waren die Ganglien
signifikant kleiner.
Die gegenüber dem Sauglamm signifikant geringere Gangliongröße in Pansen,
Haube und Schlundrinne des Mastlammes zeigte, dass die Anzahl der Neurone
neben der Lokalisation auch mit dem Alter der Tiere korreliert war.
Anzahl
Neurone/Ganglion
Sauglamm
Mastlamm
Pansen
Haube
Schlundrinne
104 ± 36; (11-431)
184 ± 38; (20-701)
47 ± 4; (3-183)
a, *
b, *
c, *
N/n=6/6
N/n=5/5
N/n=4/4
34 ± 11; (7-341)
101 ± 20; (13-362)
12 ± 4; (3-58)
a
b
c
N/n=3/3
N/n=3/3
N/n=3/3
Tabelle 4:
Gangliongrößen (=Anzahl Neurone pro Ganglion) in Pansen, Haube und Schlundrinne beim
Saug- und Mastlamm. Die angegebenen Neuronenzahlen stellen die aus den Medianwerten
40
der einzelnen Präparate errechneten Mittelwerte ± Standardabweichung dar. In Klammern ist
jeweils das kleinste und das größte aller gezählten Ganglien aufgeführt.
a,b,c: Verschiedene Buchstaben stehen für signifikante Unterschiede innerhalb einer
Altersgruppe. So unterscheiden sich die Gangliongrößen von Pansen, Haube und
Schlundrinne in beiden Lämmergruppen signifikant voneinander (p<0,05, One-Way-ANOVA).
* : Der Stern markiert signifikante Unterschiede zwischen Saug-und Mastlamm. In allen drei
Vormagenregionen besaß das Sauglamm größere Ganglien als das Mastlamm (p<0,05,
One-Way-ANOVA).
Die Anzahl der jeweils ausgewerteten Proben wird durch n angegeben. N entspricht der
Anzahl der Tiere, von denen die Proben gewonnen wurden.
4.1.2 Gangliendichte
Als Gangliendichte wurde die Anzahl der Ganglien auf einer definierten Plexusfläche
(1 cm2) bezeichnet. Wie bei der Größe der Ganglien war auch bei ihrer Dichte eine
altersabhängige Veränderung festzustellen (Tab.5). So war die Gangliendichte in
allen drei Vormagenbereichen beim Mastlamm signifikant geringer als beim
Sauglamm. Dagegen ergab die Anzahl der Ganglien in Pansen und Haube innerhalb
einer Alterklasse vergleichbare Werte.
In der Schlundrinne war die Gangliendichte in beiden Lämmergruppen geringer als
im Retikulorumen. Während in der Schlundrinne des Sauglammes etwa halb so viele
Ganglien wie in Pansen und Haube vorhanden waren, war beim Mastlamm die
Anzahl der Ganglien so gering, dass die Bestimmung auf 1 cm2 Plexus nicht möglich
war. Hier wurden stattdessen alle Ganglien im Plexus des Schlundrinnenbodens
gezählt. Die Gesamtfläche entsprach rund 10 cm2 (Breite ca. 2 cm, Länge ca. 5 cm)
und enthielt 19 ± 4 Ganglien. Um die so ermittelte Gangliendichte mit den
Ergebnissen der anderen Lokalisationen vergleichen zu können, wurde die Dichte
pro cm2 anschließend rechnerisch ermittelt.
41
Anzahl
Ganglien/cm2
Sauglamm
Mastlamm
Pansen
Haube
Schlundrinne
140 ± 10; a, *
146 ± 15; a, *
72 ± 21; b, *
N/n=5/8
N/n=5/8
N/n=4/8
10 ± 3; a
11 ± 2; a
1,9 ± 0,4; b
N/n=5/7
N/n=4/5
N/n=4/4
Tabelle 5:
Gangliendichte (=Anzahl der Ganglien pro cm2) in Pansen, Haube und Schlundrinne beim
Saug- und Mastlamm. Aufgrund der geringen Gangliendichte in der Schlundrinne des
Mastlammes wurde hier die Anzahl der Ganglien im gesamten Präparat ermittelt.
a,b: Verschiedene Buchstaben stehen für signifikante Unterschiede innerhalb einer
Altersgruppe. Während die Gangliendichte in Pansen und Haube innerhalb einer Altersstufe
ähnlich war, war die der Schlundrinne jeweils signifikant geringer (p<0,05, One-WayANOVA).
Der Stern (*) steht für signifikante Unterschiede, die zwischen beiden Altersgruppen
vorhanden sind. Beim Sauglamm sind alle Lokalisationen des Vormagens dichter innerviert
als beim Mastlamm (p<0,05, One-Way-ANOVA).
Die Anzahl der jeweils ausgewerteten Proben wird durch n angegeben. N entspricht der
Anzahl der Tiere, von denen die Proben gewonnen wurden.
4.2 Neurochemische Kodierung myenterischer Vormagenneurone
In allen bisher untersuchten Spezies können myenterische Neurone entweder einer
cholinergen oder einer nitrergen Population zugeordnet werden.
Mit Hilfe von Dreifachfärbungen wurde zunächst untersucht, ob dies auch für die
Neurone im Vormagen des Lammes zutrifft. Ein gegen die Neuronen-spezifischeEnolase
(NSE)
gerichteter
Antikörper
diente
hierbei
zur
Markierung
aller
myenterischen Nervenzellen. Zur Bestimmung cholinerger und nitrerger Neurone
wurden die Gewebe gleichzeitig gegen die Cholinazetyltransferase (ChAT) und die
Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS) gefärbt. Diese Dreifachfärbung wurde in beiden
Altersgruppen an je drei Pansen- und Haubenpräparaten durchgeführt (Abb.4 u. 5).
Anschließend wurden in jedem Präparat 300 Neuronen auf ihre Immunreaktivität für
ChAT oder NOS untersucht. Dies ergab, dass nahezu alle Neurone (=99,75%) im
Retikulorumen entweder eine cholinerge oder nitrerge Kodierung besaßen. Lediglich
9 von 3600 NSE markierten Neuronen (=0,25%) wiesen keine Immunreaktivität für
ChAT oder NOS auf. Von diesen 9 Neuronen stammten 5 aus dem Retikulorumen
42
des Mastlammes, die übrigen 4 aus dem Retikulorumen des Sauglammes. Zwischen
Pansen und Haube war jeweils kein Unterschied vorhanden.
A
D
NSE
50 µm
NSE
50 µm
B
ChAT
E
ChAT
C
NOS
F
NOS
Abb.4: Ausschnitt eines myenterischen Ganglions aus der Haube (links, A-C) und dem
Pansen (rechts, D-F) des Sauglammes. Alle in der NSE-Färbung (A bzw. D) markierten
Neurone waren entweder immunreaktiv für ChAT (B bzw. E; weiße Pfeile) oder für NOS (C
bzw. F; schwarze Pfeile). Kolokalisationen von ChAT und NOS waren weder im Pansen
noch in der Haube vorhanden.
43
A
NSE
NSE
D D
100µm
100µm
NSE
NSE
100µm
100µm
B
CHAT
E
ChAT
C
NOS
F
NOS
Abb.5: Ausschnitt eines myenterischen Ganglions aus der Haube (links, A-C) und dem
Pansen (rechts, D-F) des Mastlammes. Wie beim Sauglamm waren auch hier alle in der
NSE-Färbung (A bzw. D) markierten Neurone entweder immunreaktiv für ChAT (B bzw. E;
weiße Pfeile) oder für NOS (C bzw. F; schwarze Pfeile). Kolokalisationen von ChAT und
NOS waren weder im Pansen noch in der Haube vorhanden.
44
In der Schlundrinne war eine Dreifachfärbung gegen NSE, ChAT und NOS nur beim
Sauglamm möglich (Abb.6). Hier wurden in 3 Präparaten insgesamt 900 Neurone
analysiert. Bis auf ein Neuron (=0,11%) waren alle Neurone entweder dem
cholinergen oder nitrergen Typ zuzuordnen (=99,89%). Beim Mastlamm dagegen
konnten weder mit dem anti-NSE- noch mit dem anti-ChAT-Antikörper Nervenzellen
markiert werden. Anstelle des anti-NSE-Antikörpers wurde hier daher ein Antikörper
verwendet, der gegen das neuronale Protein HuC/D gerichtet ist. Dieses Protein wird
ausschließlich von Neuronen synthetisiert, so dass der anti-HuC/D-Antikörper
ebenfalls als genereller Marker für Nervenzellen verwendet werden kann. Zuvor
durchgeführte Färbungen an Schlundrinnen von Sauglämmern hatten bestätigt, dass
durch den anti-NSE- und den anti-HuC/D-Antikörper identische Nervenzellen
markiert werden (Abb.7).
Da in der Schlundrinne des Mastlammes der Nachweis cholinerger Neurone
ebenfalls nicht möglich war, wurden die Neurone hier in eine nitrerge und
nichtnitrerge Population eingeteilt.
NSE
A
B
ChAT
50 µm
NOS
C
A
Abb.6: Myenterisches Ganglion aus
der Schlundrinne des Sauglammes.
Alle in der Schlundrinne des
Sauglammes durch die NSEFärbung (A) markierten Neurone
besaßen entweder cholinerge (B,
weiße Pfeile) oder nitrerge (C,
schwarze Pfeile) Kodierung.
NSE
B
45
HU
Abb.7: In der Schlundrinne des Sauglammes wurden mit der Anfärbung gegen NSE (A) und
gegen HuC/D (B) identische Neurone markiert.
Durch die Verwendung zusätzlicher, gegen die Neuropeptide Substanz P (SP) und
VIP gerichteter Antikörper, wurde eine weitere Unterteilung der cholinergen und
nitrergen Population möglich. So waren in Pansen und Haube beider Altersstufen
drei
verschiedene
Populationen
vorhanden.
Neben
einer
rein
cholinergen
Populationen (ChAT/-) existierte eine weitere cholinerge Population, in der die
Neurone auch SP exprimierten (ChAT/SP). In nahezu allen nitrergen Neuronen des
Retikulorumens war gleichzeitig VIP nachzuweisen (NOS/VIP) (Abb.8, 9). Vereinzelt
waren auch nitrerge Neurone vorhanden, die nicht gleichzeitig für VIP kodierten. Der
Anteil dieser Neurone lag jedoch unter 1%, so dass sie nicht als eigene Population
berücksichtigt wurden. In der Schlundrinne des Sauglammes waren ebenfalls die drei
bereits beschriebenen Populationen nachweisbar. Daneben waren hier deutlich mehr
Neurone nur für NOS immunreaktiv als im Retikulorumen. Es ergab sich daher in der
Schlundrinne eine vierte, rein nitrerge Population (NOS/-).
4.2.1 Neurochemische Kodierung im Retikulorumen
Die Anteile der Neuronenpopulationen in Pansen und Haube zeigten bei beiden
Altersstufen Ähnlichkeiten miteinander und unterschieden sich deutlich von denen
der Schlundrinne. Im Retikulorumen war die Mehrheit der myenterischen Neurone
der cholinergen Population zuzuordnen. Die übrigen Neurone gehörten zur nitrergen
Population, die stets signifikant kleiner war als die cholinerge.
46
In Pansen und Haube des Sauglammes zählten die meisten Neurone zur Population
ChAT/SP (Tab.6,7). Trotz der signifikant geringeren Anzahl der ChAT/SP
kodierenden
Neurone
im
Pansen
bestand
aufgrund
der
unterschiedlichen
Gangliongrößen aber kein prozentualer Unterschied zwischen Pansen und Haube.
In beiden Lokalisationen unterschied sich die Population ChAT/SP signifikant von
den beiden anderen Populationen ChAT/- und NOS/VIP. Die rein cholinerge
Population war in der Haube signifikant größer als die Population NOS/VIP (Tab.7).
Im Pansen dagegen unterschieden sich
diese
voneinander
Populationsgrößen
(Tab.6).
Ein
Vergleich
der
beiden
Populationen
nicht
innerhalb
des
Retikulorumens zeigte, dass die Population ChAT/- in der Haube sowohl absolut als
auch relativ größer war als im Pansen. Bei den nitrergen Neuronen waren
lokalisationsabhängige Unterschiede nur bezüglich der relativen Populationsgröße
ausgebildet.
Neuronenpopulationen
ChAT/SP
im Pansen
absolut
Sauglamm
ChAT/absolut
65 ± 251)
relativ
[%]
63 ± 51)
N/n=6/6
a
Mastlamm
N/n=3/3
NOS/VIP
absolut
20 ± 91)
relativ
[%]
19 ± 31)
17 ± 91)
relativ
[%]
17 ± 51)
A
b
B
b
B
21 ± 82)
61 ± 51)
5 ± 21)
13 ± 41)
8 ± 21)
24 ± 32)
a
A
b
B
b
C
Tabelle 6:
Absolute (=Anzahl Neurone pro Ganglion) und relative (=prozentuale) Anteile der
verschiedenen Neuronenpopulationen im Pansen von Saug- und Mastlamm.
a,b: Verschiedene Buchstaben markieren signifikante Unterschiede der absoluten
Populationsgrößen innerhalb einer Altersgruppe.
A,B,C: Verschiedene Buchstaben markieren signifikante Unterschiede der relativen
Populationsgrößen innerhalb einer Altersgruppe.
1),2)
: die Zahlen stehen für signifikante Unterschiede zwischen Saug- und Mastlamm.
Beispielsweise besteht in der Population ChAT/SP bezüglich der absoluten
Populationsgröße ein signifikanter Unterschied zwischen beiden Altersgruppen. Dagegen ist
in Bezug auf die relative Größe der Population ChAT/SP kein altersabhängiger Unterschied
vorhanden.
Die Anzahl der jeweils ausgewerteten Proben wird durch n angegeben. N entspricht der
Anzahl der Tiere, von denen die Proben gewonnen wurden. (p<0,05,Two-Way-ANOVA).
47
A
ChAT
E
100µm
ChAT
100µm
B
SP
F
SP
C
NOS
G
NOS
D
VIP
H
VIP
Abb.8: Neuronenpopulationen in der Haube (links, A-D) und im Pansen (rechts, E-H) des
Sauglammes.
In
beiden
Vormagenbereichen
waren
drei
verschiedene
Neuronenpopulationen nachweisbar. Die Mehrheit der Neurone war cholinerg und besaß die
Kodierung ChAT/SP (A, B bzw. E, F) (weiße Pfeile). In den Anfärbungen gegen NOS (C bzw.
G) und VIP (D bzw. H) sind diese Neurone nicht markiert. Die weißen Pfeilspitzen zeigen auf
Neurone mit rein cholinerger Kodierung (ChAT/-). Mit den schwarzen Pfeilen sind Neurone
der Population NOS/VIP (C, D bzw. G, H) markiert.
48
A
ChAT
100µm
B
SP
C
NOS
D
VIP
Abb.9: Ausschnitte von Ganglien aus dem Pansen (links, A-D) und aus der Haube (rechts,
E-H) des Mastlammes. Beide Gewebe wurden gegen ChAT (A bzw. E), SP (B bzw. F), NOS
(C bzw. G) und VIP (D bzw. H) angefärbt. Wie beim Sauglamm existieren auch beim
Mastlamm die Populationen ChAT/SP (weiße Pfeile), ChAT/- (weiße Pfeilspitze) und
NOS/VIP (schwarze Pfeile).
49
Auch im Retikulorumen des Mastlammes bildeten die für ChAT und SP
immunreaktiven Nervenzellen die größte Population (Tab.6,7). Die absoluten Größen
der Populationen ChAT/SP und ChAT/- waren dabei im Pansen signifikant geringer
als in der Haube. Beim Vergleich der prozentualen Populationsgrößen dagegen war
nur bei der rein cholinergen Population ein Unterschied zwischen den beiden
Kompartimenten feststellbar.
Gegenüber dem Sauglamm war die absolute Größe der Population ChAT/SP sowohl
im Pansen als auch in der Haube signifikant geringer. Da sich die Gangliongröße
ebenfalls altersabhängig verringerte, führte dies aber nicht zu einer Veränderung des
prozentualen Anteils der Population ChAT/SP (Tab.6,7).
In der Haube des Mastlammes unterschied sich der absolute und relative Anteil der
rein cholinergen Population signifikant von dem der Population ChAT/SP. Zwischen
den Anteilen der rein cholinergen und der nitrergen Population war dagegen kein
Unterschied vorhanden (Tab.7). Auch im Pansen war die Anzahl rein cholinerger
Neurone signifikant geringer als die der Population ChAT/SP. Im Gegensatz zur
Haube war am Pansen ein signifikanter Unterschied zwischen den relativen Anteilen
der Kodierungen ChAT/- und NOS/VIP festzustellen. In Bezug auf die absoluten
Zellzahlen war kein Unterschied feststellbar (Tab.6).
Neuronen-
ChAT/SP
ChAT/-
NOS/VIP
populationen
Sauglamm
118 ± 271)
relativ
[%]
64 ± 21)
N/n=5/5
a
A
b
B
c
C
Mastlamm
63 ± 132)
62 ± 31)
21 ± 32)
21 ± 51)
17 ± 11)
17 ± 42)
N/n=3/3
a
A
b
B
b
B
in der Haube
absolut
absolut
absolut
45 ± 121)
relativ
[%]
24 ± 41)
18 ± 51)
relativ
[%]
10 ± 31)
Tabelle 7:
Absolute (=Anzahl Neurone pro Ganglion) und relative (=prozentuale) Anteile der
verschiedenen Neuronenpopulationen in der Haube von Saug- und Mastlamm.
a,b,c: Verschiedene Buchstaben markieren signifikante Unterschiede der absoluten
Populationsgrößen innerhalb einer Altersgruppe.
A,B,C: Verschiedene Buchstaben markieren signifikante Unterschiede der relativen
Populationsgrößen innerhalb einer Altersgruppe.
1),2)
: die Zahlen stehen für signifikante Unterschiede zwischen Saug- und Mastlamm.
Die Anzahl der jeweils ausgewerteten Proben wird durch n angegeben. N entspricht der
Anzahl der Tiere, von denen die Proben gewonnen wurden. (p<0,05,Two-Way-ANOVA).
50
Ein Vergleich der Neuronenpopulation ChAT/- zwischen Saug- und Mastlamm ergab
im Pansen weder absolute noch relative Unterschiede. In der Haube dagegen war
die absolute Anzahl rein cholinerger Neurone beim Sauglamm signifikant größer als
beim Mastlamm. Der prozentuale Anteil dieser Population unterschied sich jedoch
auch in der Haube nicht.
Die absolute Anzahl der NOS/VIP immunreaktiven Neurone im Retikulorumen war in
beiden
Altersstufen
vergleichbar.
Infolge
der
altersabhängig
veränderten
Gangliongröße war aber der prozentuale Anteile der Population NOS/VIP sowohl im
Pansen als auch in der Haube beim Mastlamm signifikant höher als beim Sauglamm.
4.2.2 Neurochemische Kodierung in der Schlundrinne
Die Schlundrinne bei Saug- und Mastlamm war im Gegensatz zum Retikulorumen
durch eine vorwiegend nitrerge Innervation charakterisiert (Tab.8,9; Abb.10,11).
In der Schlundrinne des Sauglammes waren zwei nitrerge Neuronenpopulationen
vorhanden. Die größere Population wurde von Neuronen gebildet, die neben NOS
auch VIP synthetisierten. Die zweite, kleinere nitrerge Population bestand dagegen
aus Neuronen, die nur für NOS immunreaktiv waren. Die cholinergen Neurone waren
wie im Retikulorumen entweder der Population ChAT/SP oder der rein cholinergen
Population ChAT/- zuzuordnen.
Neuronenpopulationen
in der Schlundrinne
des Sauglammes
absolut
relativ [%]
ChAT/SP
ChAT/-
NOS/VIP
NOS/-
12 ± 1 a
6±1 b
21 ± 1 c
8±2 b
25 ± 1 A
13 ± 3 B
45 ± 1 C
17 ± 3 D
Tabelle 8:
Absolute (=Anzahl Neurone pro Ganglion) und relative (=prozentuale) Anteile der
verschiedenen Neuronenpopulationen in der Schlundrinne des Sauglammes.
a,b,c: Verschiedene Buchstaben markieren signifikante Unterschiede innerhalb der
absoluten Populationsgrößen.
A,B,C,D: Verschiedene Buchstaben markieren signifikante Unterschiede innerhalb der
relativen Populationsgrößen.
Anzahl der untersuchten Proben: N/n=4/4; (p<0,05,One-Way-ANOVA)
51
A
ChAT
C
NOS
SP
D
VIP
100µm
B
Abb.10: Ganglion aus der Schlundrinne des Sauglammes. Die Vierfachfärbung gegen ChAT
(A), SP (B), NOS (C) und VIP (D) zeigte, dass die Neurone vier verschiedenen Populationen
zugeordnet werden können: ChAT/SP (weißer Pfeil), ChAT/- (weiße Pfeilspitze), NOS/VIP
(schwarzer Pfeil) und NOS/- (schwarze Pfeilspitze).
Neuronenpopulationen
in der Schlundrinne
des Mastlammes
absolut
HU/-
HU/VIP
HU/NOS
HU/NOS/VIP
1±1 a
0,3 ± 0,5 a
0,3 ± 0,5 a
10 ± 5 b
relativ [%]
11 ± 13 A
3±5 A
3±5 A
83 ± 15 B
Tabelle 9:
Absolute (=Anzahl Neurone pro Ganglion) und relative (=prozentuale) Anteile der
verschiedenen Neuronenpopulationen in der Schlundrinne des Mastlammes.
Anders als beim Sauglamm waren hier keine Neurone nachweisbar, die immunreaktiv für
ChAT und SP waren. Die Mehrheit der Neurone war nitrerg und besaß die Kodierung
NOS/VIP. Die nichtnitrergen Neurone kodierten entweder nur für HU oder für HU/VIP.
a,b: Verschiedene Buchstaben markieren signifikante Unterschiede innerhalb der absoluten
Populationsgrößen.
A,B: Verschiedene Buchstaben markieren signifikante Unterschiede innerhalb der relativen
Populationsgrößen.
Anzahl der untersuchten Proben: N/n=4/4; (p<0,05,One-Way-ANOVA)
52
Beim Mastlamm unterschied sich die Innervation der Schlundrinne deutlich von der
des
Sauglammes
(Tab.9).
Zwar
dominierte
auch
hier
die
nitrerge
Neuronenpopulation, im Unterschied zum Sauglamm jedoch war in nahezu allen
dieser Nervenzellen auch gleichzeitig VIP nachweisbar. Die rein nitrerge Population
war deutlich kleiner als beim Sauglamm und nur noch vereinzelt vorhanden (0,3 ± 0,5
Neurone/Ganglion) Da keine cholinergen Nervenzellen nachgewiesen werden
konnten, wurde der verbleibende Teil der Neurone als nichtnitrerge Population
bezeichnet. Diese enthielt einerseits Neurone, die nur für VIP kodierten (Abb.11).
Andererseits existierten hier Neurone, die durch den anti-HuC/D-Antikörper markiert
wurden, aber weder für VIP noch für SP immunreaktiv waren. Diese Population
wurde als HU/- bezeichnet.
A
HU
B
NOS
VIP
D
SP
100µm
C
Abb.11: Ganglion aus der Schlundrinne des Mastlammes. Zur generellen Markierung der
Neurone wurde der anti-HuC/D-Antikörper (A) verwendet. Die so detektierten Neurone
besaßen zumeist die Kodierung NOS/VIP (B, C) (schwarzer Pfeil). Daneben existierten
Neurone, die immunreaktiv für VIP (C) waren, nicht aber für NOS (B) ( weißer Pfeil). Mit der
gegen SP (D) gerichtenen Färbung konnten lediglich Nervenfasern aber keine Zellkörper
markiert werden.
53
Anteil Nervenzellen an der Gesamtpopulation [%]
80
*
*
60
*
*
40
*
*
*
*
20
*
*
0
ChAT/-
ChAT/SP
NOS/VIP
NOS/-
Pansen
Haube
Schlundrinne
Abb.12: Prozentuale Verteilung der einzelnen Neuronenpopulationen in Pansen, Haube und
Schlundrinne des Sauglammes. Während im Retikulorumen die Population ChAT/SP am
größten war, dominierten in der Schlundrinne die nitrergen Neurone. Sie besaßen entweder
die Kodierung NOS/VIP oder NOS/-. In Pansen und Haube war der Anteil der rein nitrergen
Neurone kleiner als 1%.
Signifikante Unterschiede (p<0,05, Two-Way-ANOVA) der prozentualen Populationsgrößen
in den verschiedenen Vormagenbereichen sind mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
4.2.3 Weiterführende Anfärbungen
In der Altersklasse der Sauglämmer wurden einige Präparate von Pansen und
Haube auf die Anwesenheit des Enzyms Tyrosinhydroxylase (TH) sowie auf
Calbindin untersucht.
4.2.3.1 Tyrosinhydroxylase
Um möglicherweise im myenterischen Plexus des Vormagens vorhandene
sympathische Neurone zu detektieren, wurden jeweils drei Präparate von Pansen
und Haube mit einem gegen die Tyrosinhydroxylase (TH) gerichteten Antikörper
inkubiert. Dieses Enzym ist an der Synthese von Katecholaminen wie beispielsweise
54
Noradrenalin beteiligt, weshalb es in extrinsischen, sympathischen Nervenzellen
nachgewiesen werden kann.
Sowohl im Pansen als auch in der Haube waren Nervenfasern nachweisbar, die
immunreaktiv für TH waren. Positive Zellkörper waren dagegen in keiner der beiden
Lokalisationen zu finden (Abb.13).
A
TH
B
SP
NOS
D
VIP
50µm
C
Abb.13: Myenterisches Ganglion aus dem Pansen des Sauglammes, angefärbt gegen TH
(A), SP (B), NOS (C) und VIP (D). Mit der Färbung gegen TH, einem Syntheseenzym für
Katecholamine (z.B. Noradrenalin), konnten nur immunreaktive Fasern dargestellt werden.
Immunreaktive Zellkörper wurden nicht markiert.
4.2.3.2 Calbindin
Das Vorhandensein von Calbindin in myenterischen Neuronen wurde in vier Pansenund drei Haubenpräparaten durch Vierfachfärbungen untersucht. Neben Calbindin
wurden gleichzeitig auch SP, VIP und NOS angefärbt (Abb.14).
Für den Pansen wurden vier Präparate dieser Färbung ausgewertet und dabei ein
Anteil von 2 ± 2 Calbindin-positiven Neuronen pro Ganglion ermittelt. Fast alle der
Calbindin-positiven Neurone waren in der hier durchgeführten Färbung allein für
Calbindin immunreaktiv, nur vereinzelt kodierten die Neurone auch gleichzeitig für
55
NOS. Durch die bereits oben beschriebenen Untersuchungen wurde zuvor belegt,
dass jedes myenterische Neuron im Retikulorumen entweder ChAT oder NOS
synthetisiert. Daher konnte davon ausgegangen werden, dass Neurone, die in der
hier durchgeführten Färbung nur für Calbindin immunreaktiv waren, der cholinergen
Population zuzuordnen waren. Diese rein cholinerge Neuronenpopulation, die im
Pansen 20 ± 9 Neurone umfaßte, konnte daher weiter in zwei Subpopulationen
unterteilt werden. Während die meisten der rein cholinergen Neurone weiterhin allein
für ChAT kodierte, war bei 10 ± 10% dieser Nervenzellen aber zusätzlich Calbindin (2
± 2 Neurone) exprimiert.
Da die Kodierung NOS/Calbindin nur vereinzelt auftrat, war der Anteil dieser
Neurone an der gesamten Neuronenpopulation kleiner als 1%. In Bezug auf alle,
insgesamt 238 gezählten Calbindin positiven Neuronen, betrug der Anteil der für
Calbindin und NOS kodierenden Neurone lediglich 5,5% (13 Neurone).
In der Haube waren ebenfalls Calbindin exprimierende Neurone vorhanden. Der
Anteil dieser Neurone an der Gesamtpopulation war in der Haube deutlich geringer
als im Pansen. In den drei ausgewerteten Haubenpräparaten wurden 51 Calbindin
positive Nervenzellen gezählt. In Bezug auf alle myenterischen Nervenzellen
entspricht dies einer Populationsgröße von unter 1%. Der Anteil Calbindin positiver
Neurone, die zur nitrergen Population gehörten, war mit 29% (15 Neurone) in der
Haube deutlich höher als im Pansen. Die übrigen 36 Neurone konnten auch in der
Haube der Kodierung ChAT/Calbindin zugeordnet werden.
56
A
Calb
50µm
E
Calb
50µm
B
NOS
F
NOS
C
VIP
G
VIP
D
SP
H
SP
Abb.14: Ganglion aus dem Pansen (A-D) und der Haube (E-H). Im Pansen waren die
meisten Calbindin positiven Neurone (A) in keiner der drei anderen Färbungen (B-D) zu
sehen. Da zuvor gezeigt wurde, dass alle nicht nitrergen Neurone cholinerge Kodierung
besitzen, wurde den Calbindin positiven Neuronen die Kodierung ChAT/Calbindin
zugeordnet. In der Haube dagegen waren auch Calbindin positive Neurone (E) vorhanden,
die gleichzeitig NOS (F), nicht aber VIP (G) kolokalisierten. Sie besaßen also die Kodierung
NOS/Calbindin.
57
4.3 Zellgrößen
In der Gruppe der Sauglämmer wurde die Größe der neurochemisch unterschiedlich
kodierten Neurone in den verschiedenen Vormagenkompartimenten bestimmt
(Tab.10). Die hier angegebenen Neuronengrößen beziehen sich dabei auf die Fläche
der Neuronensomata. Die Fortsätze der Neuronen wurden bei der durchgeführten
Messung nicht berücksichtigt.
Es fiel auf, dass die nitrergen Neurone in allen Lokalisationen signifikant größer
waren als die cholinergen Neurone. Die nitrergen Neurone in der Haube besaßen
auch ein signifikant größeres Zellsoma als die nitrergen Neurone im Pansen und in
der Schlundrinne.
Bei den cholinergen Neuronen waren keine Größenunterschiede zwischen den
beiden Populationen ChAT/- und ChAT/SP vorhanden. Auch zwischen den einzelnen
Vormagenlokalisationen waren keine Größenunterschiede zwischen den cholinergen
Populationen vorhanden.
Neuronengröße
in µm2
ChAT/ChAT/SP
NOS/VIP
NOS/-
Pansen
Haube
Schlundrinne
292 ± 19
a
310 ± 27
a
434 ± 14
b
311 ± 32
a
335 ± 34
a
622 ± 33
c
---
---
319 ± 12
a
331 ± 36
a
419 ± 49
b
468 ± 31
b
Tabelle 10:
Größe (in µm2) myenterischer Vormagenneurone beim Sauglamm in Abhängigkeit von ihrer
neurochemischen Kodierung.
Die Population NOS/- ist nur in der Schlundrinne vorhanden.
a,b,c: Verschiedene Buchstaben markieren signifikante Unterschiede zwischen den
einzelnen Kodierungen und Lokalisationen. So waren beispielsweise die nitrergen Neurone
im Pansen größer als die Neurone der beiden cholinergen Populationen in diesem Bereich.
Gleichzeitig waren die nitrergen Neurone im Pansen aber signifikant kleiner als die in der
Haube.
Aus jedem Vormagenbereich wurden jeweils drei Präparate untersucht (N/n=3/3).
58
4.4 Projektionen und neurochemischer Kode von Muskelneuronen
4.4.1 Generelle Verteilung und Projektionsmuster im Retikulorumen
Mit der angewandten Methode des retrograden Tracings konnten sowohl im Pansen
als auch in der Haube myenterische Neurone markiert werden, die zur glatten
Muskulatur projizierten.
Im Pansen führte die DiI-Applikation auf die Zirkulär- bzw. Längsmuskulatur von
jeweils vier Präparaten zur Markierung von 30 ± 22 bzw. 31 ± 9 myenterischen
Neuronen. In der Haube dagegen schien die Anzahl der DiI-markierten Neurone in
beiden Muskelschichten höher als im Pansen, was aber aufgrund der hohen
Standardabweichung statistisch nicht zu belegen war (Tab.11). Für die Haube
wurden aus jeder Muskelschicht jeweils drei Präparate ausgewertet.
Anhand ihrer Projektionsrichtungen wurden die DiI-markierten Neurone in eine
aszendierende und in eine deszendierende Subpopulation unterteilt. Da weder im
Pansen noch in der Haube signifikante Unterschiede zwischen den prozentualen
Anteilen der aszendierenden und der deszendierenden Subpopulationen bestanden,
konnte für keinen der beiden Vormagenbereiche eine Projektionspräferenz in orale
oder aborale Richtung nachgewiesen werden.
Pansen
Absolute Anzahl
DiI-Neurone
Relativer Anteil
aszendierender
Neurone [%]
Relativer Anteil
deszendierender
Neurone [%]
Haube
Zirkulärmuskulatur
Längsmuskulatur
Zirkulärmuskulatur
Längsmuskulatur
30 ± 22
31 ± 9
99 ± 58
62 ± 53
40 ± 14
55 ± 24
51 ± 9
56 ± 21
60 ± 14
45 ± 24
49 ± 9
44 ± 21
Tabelle 11:
Absolute Anzahl und räumliche Verteilung (in %) der DiI-markierten Neurone in Pansen und
Haube. Bezüglich der Anzahl markierter DiI-Neurone waren keine signifikanten Unterschiede
vorhanden. (p<0,05, One-Way-ANOVA).
Auch zwischen den Muskelschichten von Pansen und Haube sowie zwischen
aszendierenden und deszendierenden Neuronen waren keine signifikanten Unterschiede
nachweisbar. (p<0,05, Two-Way-ANOVA).
59
4.4.2 Neurochemischer Kode der Muskelneurone im Retikulorumen
Zur Bestimmung des neurochemischen Kodes der DiI-markierten Neurone wurden
Dreifachfärbungen gegen ChAT, SP und VIP (Abb.15, 16) durchgeführt. Da ein
Filterblock des Fluoreszenzmikroskops zur Sichtbarmachung des DiIs benötigt
wurde, konnten nur drei weitere Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden. Da aus
den anfangs durchgeführten Untersuchungen bekannt war, dass die myenterischen
Neurone des Vormagens entweder für ChAT oder für NOS kodierten, wurden die DiImarkierten Präparate gegen ChAT, SP und VIP angefärbt. Für Neurone, die hierbei
keine Immunreaktivität für ChAT zeigten, wurde folglich eine nitrerge Kodierung
angenommen. Darüberhinaus war durch die Untersuchung der allgemeinen
Kodierung bekannt, dass NOS und VIP im Retikulorumen kolokalisiert exprimiert
wurden. DiI-markierte Neurone, die für VIP immunreaktiv waren, wurden demzufolge
als Neurone der Population NOS/VIP bezeichnet.
Bei der Auswertung der DiI-markierten Präparate aus Pansen und Haube zeigten
sich vergleichbare Ergebnisse. Signifikante Unterschiede zwischen den beiden
Vormagenkompartimenten konnten nicht festgestellt werden. Vielmehr ergaben sich
Unterschiede beim Vergleich der Innervation von Längs- und Zirkulärmuskulatur
innerhalb einer Vormagenlokalisation.
Grundsätzlich waren an der Innervation beider Muskelschichten im Retikulorumen
Neurone der drei Kodierungen ChAT/SP, ChAT/- und NOS/VIP beteiligt (Tab.12,13;
Abb.15,16).
Pansen
NOS
gesamt [%]
ChAT
gesamt [%]
Haube
Zirkulärmuskulatur
Längsmuskulatur
Zirkulärmuskulatur
Längsmuskulatur
35 ±17 a
35 ± 22 a
18 ±12 a
30 ± 14 a
65 ± 17 b
65 ± 22 a
82 ± 12 b
70 ± 14 b
Tabelle 12:
Prozentuale Anteile der cholinergen und nitrergen Population innerhalb der DiI-markierten
Neuronen in den Muskelschichten von Pansen und Haube.
a,b: Die Buchstaben markieren signifikante Unterschiede zwischen beiden Populationen.
Zwischen der Zirkulär- und der Längsmuskelschicht beider Vormagenbereiche bestanden
keine signifikanten Unterschiede (p<0,05, Two-way-ANOVA)
60
A
DiI
E
DiI
I
DiI
50µm
50µm
50µm
B
ChAT
F
ChAT
J
ChAT
C
SP
G
SP
K
SP
D
VIP
H
VIP
L
VIP
Abb.15: Muskelneurone aus der Haube des Sauglammes.
A – D: Zirkulärmuskelneuron (A), das immunreaktiv für VIP (D) war. Für ChAT (B) und SP
(C) bestand keine Immunreaktivität. Da alle VIPergen Neurone in der Haube auch für NOS
kodierten, besaß dieses DiI-markierte Neuron die Kodierung NOS/VIP. E – H: Gegen ChAT
(F) und SP (G) immunreaktives DiI-Neuron (E), das zur Zirkulärmuskulatur projizierte. In der
Färbung gegen VIP (H) war keine Immunreaktivität nachweisbar. I – L: Längsmuskelneuron
(I) mit der Kodierung ChAT/- (J). Für SP (K) und VIP (L) war keine Immunreaktivität
vorhanden.
61
A
DiI
E
DiI
50µm
50µm
B
ChAT
F
ChAT
C
SP
G
SP
D
VIP
H
VIP
62
I
DiI
Abb.16: Muskelneurone
Sauglammes.
im
Pansen
des
A - D: Zirkulärmuskelneuron (A) mit der Kodierung
ChAT/SP (B, C). In der Färbung gegen VIP (D)
war keine Immunreaktivität nachweisbar.
50µm
J
ChAT
E – H:. Zwei nitrerge Muskelneurone (E), die nach
DiI-Applikation
auf
die
Längsmuskulatur
identifiziert wurden. Beide Neurone zeigten
Immunreaktivität für VIP (H), nicht aber für ChAT
(F) und SP (G). Da zuvor gezeigt wurde, dass im
Retikulorumen VIP kolokalisiert mit NOS
exprimiert wird, wurde den Neuronen die
Kodierung NOS/VIP zugeordnet.
I – L:. DiI-markiertes Neuron (I), das zur
Längsmuskulatur des Pansens projizierte. Es war
immunreaktiv für ChAT (J), nicht aber für SP (K)
und VIP (L). Das Muskelneuron besaß daher die
Kodierung ChAT/-.
K
SP
L
VIP
63
In der Haube waren an der Innervation beider Muskelschichten signifikant mehr
cholinerge als nitrerge Neurone beteiligt. Im Pansen war nur die Zirkulärmuskulatur
durch
einen
höheren
Anteil
cholinerger
Nervenzellen
innerviert.
In
der
Längsmuskulatur dagegen unterschieden sich der Anteil cholinerger und nitrerger
Neurone nicht voneinander (Tab.12).
Die cholinerge Innervation der Muskulatur des Pansens bestand hauptsächlich aus
Neuronen der Population ChAT/SP. Daneben projizierten auch Nervenzellen der
Kodierung ChAT/- zur Muskulatur. Gegenüber der Population ChAT/SP war der
Anteil der rein cholinergen Neurone in beiden Muskelschichten des Pansens
signifikant geringer. Die übrigen DiI-markierten Neurone gehörten der Population
NOS/VIP an. Für die Zirkulärmuskulatur war der Anteil der nitrergen Population nicht
nur gegenüber allen cholinergen Neuronen sondern auch gegenüber den ChAT/SP
kodierten Neuronen signifikant geringer. In der Longitudinalmuskulatur dagegen war
zwischen den Anteilen dieser beiden Kodierungen kein signifikanter Unterschied
nachweisbar (Tab.13).
Pansen
Haube
Zirkulärmuskulatur
Längsmuskulatur
Zirkulärmuskulatur
Längsmuskulatur
NOS/VIP
35 ±17 a
35 ± 22 a
18 ±12 a
30 ± 14 a
ChAT/SP
63 ± 15 b
61 ±23 a
66 ± 5 b
63 ± 13 b
ChAT/-
2±2 c
5±4 b
16 ± 12 a
7±6 a
Tabelle 13:
Prozentuale Anteile der Population NOS/VIP, CHAT/SP und CHAT/-innerhalb der DiImarkierten Neuronen in den Muskelschichten von Pansen und Haube.
a,b,c: Die Buchstaben markieren signifikante Unterschiede der Populationsgrößen innerhalb
einer Lokalisation.
Zwischen den verschiedenen Lokalisationen waren keine signifikanten Unterschiede der
Populationsgrößen nachweisbar (p<0,05, Two-Way-ANOVA).
64
In beiden Muskelschichten der Haube projizierten signifikant mehr Neurone der
Kodierung ChAT/SP als NOS/VIP zur Muskulatur. Der Anteil der nitrergen Neurone
war sowohl in der Zirkulär- wie auch in der Längsmuskulatur mit dem der rein
cholinergen Nervenzellen vergleichbar. Wie im Pansen waren auch in der Haube
signifikant weniger rein cholinerge Neurone als ChAT/SP kodierende Neurone an der
Innervation der Muskulatur beteiligt (Tab.13).
Neben der generellen prozentualen Ermittlung der verschiedenen beteiligten
Populationen wurden weiterhin ihre jeweiligen Anteile an den aszendierenden und
deszendierenden Neuronen analysiert.
Im übrigen Gastrointestinaltrakt sind aszendierend und deszendierend projizierende
Neurone mit spezifischem neurochemischem Kode für die Bildung bestimmter
Motilitätsmuster von grundlegender Bedeutung. Beispielsweise wird die koordinierte
Motorik des Darms während des peristaltischen Reflexes durch die polarisierten
Projektionen der beteiligten Muskelmotoneurone ermöglicht. Demzufolge sollte auch
für die Vormagenmuskulatur analysiert werden, ob die Muskelmotoneurone ein
entsprechendes Projektionsverhalten aufweisen.
In beiden Muskelschichten der Pansenwand sowie in der Longitudinalmuskulatur der
Haube konnte kein signifikanter Unterschied in den Kodierungen der aszendierenden
und deszendierenden Nervenzellen festgestellt werden (Tab.14).
In der Zirkulärmuskulatur der Haube dagegen waren deutliche Unterschiede in
Bezug auf Kodierung und Projektionsverhalten vorhanden. Hier war sowohl bei den
aszendierenden als auch bei den deszendierenden Neuronen der Anteil der
cholinergen Neurone signifikant höher als der der Neurone mit nitrerger Kodierung.
65
Anteil der
Populationen
[%]
cholinerg
aszendierend
cholinerg
deszendierend
nitrerg
aszendierend
nitrerg
deszendierend
Pansen
Haube
Zirkulärmuskulatur
Längsmuskulatur
Zirkulärmuskulatur
Längsmuskulatur
24 ± 21
36 ± 29
42 ± 5 A
37 ± 12
40 ± 5
29 ± 19
40 ± 16 A
33 ± 15
17 ± 6
19 ± 8
9±4 B
19 ±13
20 ± 16
16 ± 14
10 ± 9 B
11 ±11
Tabelle 14:
Prozentuale Anteile der aszendierend und deszendierend projizierenden Neurone in
Abhängigkeit von ihrer neurochemischen Kodierung in Pansen und Haube. Signifikante
Unterschiede zwischen den verschiedenen Populationen sind mit den Buchstaben A und B
markiert und waren nur in der Zirkulärmuskulatur der Haube nachweisbar. Hier dominieren in
beiden Projektionsrichtungen die cholinergen Neurone.
(p<0,05, Two-Way-ANOVA)
4.4.3 Projektionslängen DiI-markierter Neurone im Retikulorumen
Um mögliche Korrelationen zwischen der ursprünglichen Verlaufsrichtung der
Muskelfasern und der Lokalisation der markierten DiI-Zellen zu untersuchen, wurden
die Projektionslängen der DiI-Neurone in X- und Y-Richtung bestimmt (Tab.15). Wie
bereits beschrieben, war die Richtung der Y-Achse am ehemaligen Verlauf der
Zirkulärmuskulatur orientiert. Die Lage der X-Achse entsprach der früheren
Verlaufsrichtung der Längsmuskelschicht.
Bei
der
Bestimmung
der
Projektionslängen
zeigten
sich
in
beiden
Vormagenbereichen Unterschiede zwischen der Zirkulär- und Längsmuskelschicht.
So waren in der Zirkulärmuskulatur der Haube die Projektionen in Y-Richtung
signifikant länger als in Richtung der X-Achse. Dies zeigte, dass die zur
Zirkulärmuskulatur projizierenden myenterischen Neurone entlang der innervierten
Muskelfasern lokalisiert waren. Für die Zirkulärmuskelschicht des Pansens ist dieses
Innervationsmuster ebenfalls zu vermuten. Die hier ermittelten Projektionslängen
deuten ebenfalls auf eine Lage der Neurone entlang der zirkulären Verlaufsrichtung
hin; statistisch konnte dies aber nicht belegt werden.
In der Longitudinalmuskulatur waren die Ergebnisse von Haube und Pansen
wiederum ähnlich. Die DiI-markierten Neuronen waren gleichmäßig in X- und Y-
66
Richtungen verteilt und ließen daher keine Anordnung entlang der Muskelrichtung
erkennen.
Projektionslängen in mm
Longitudinalrichtung
Zirkulärrichtung
Pansen
Haube
Zirkulärmuskulatur
Längsmuskulatur
Zirkulärmuskulatur
Längsmuskulatur
0,58 ± 0,29
2,11 ± 1,05
0,7 ± 0,35 a
3,5 ± 1,48
3,19 ± 2,14
1,62 ± 1,04
4,55 ± 0,72 b
1,71 ± 0,15
Tabelle 15:
Projektionslängen der Muskelneurone in Pansen und Haube.
Die Longitudinalrichtung beschreibt den Abstand der Neurone von der Applikationsstelle in
orale und aborale Richtung. Als Zirkulärrichtung wurde der Abstand der Neurone von der
Applikationsstelle in dorsale und ventrale Richtung definiert.
a,b: Die Buchstaben markieren signifikante Unterschiede der Projektionslängen in der
Zirkulärmuskulatur der Haube. Die signifikant längeren Projektionen in Zirkulär- als in
Längsrichtung zeigt, dass hier die DiI-markierten Neurone entlang der innervierten
Muskelfaser gelegen waren.
In der Längsmuskulatur der Haube und im Pansen waren keine signifikanten Unterschiede
zwischen beiden Projektionsrichtungen nachweisbar, was auf eine fehlende Anordnung der
Muskelneurone in Abhängigkeit von der Verlaufsrichtung hindeutet.
(p<0,05, One-Way-ANOVA)
4.4.4 Charakterisierung der Muskelmotoneurone in der Schlundrinne
Im Gegensatz zu Pansen und Haube wurden in der Schlundrinne deutlich weniger
Neurone mit DiI markiert. Die Anzahl betrug zwischen 4 und 21 Neurone pro
Präparat. Außerdem konnten für die Schlundrinne insgesamt weniger Präparate als
für den Pansen und die Haube ausgewertet werden. Die geringere Anzahl der
Präparate kann vermutlich auf Probleme, die während der Kultivierung der Gewebe
auftraten, zurückgeführt werden. Genaueres hierzu soll im folgenden Diskussionsteil
der Arbeit dargelegt werden.
Insgesamt standen fünf Schlundrinnenpräparate zur Auswertung zur Verfügung. An
dreien davon waren Neurone von der Längsmuskulatur aus markiert worden, an
zweien von der Zirkulärmuskulatur aus. Infolge dieser Probenanzahl können
allgemeingültige, statistisch belegbare Aussagen nur schwer getroffen werden.
67
Von einer Charakterisierung anhand der bei Pansen und Haube angewandten
Kriterien wurde daher bei der Schlundrinne abgesehen. Im weiteren werden die
vorhandenen Befunde daher lediglich beschreibend dargestellt.
Die beiden Präparate, an denen DiI auf die Zirkulärmuskulatur appliziert worden war,
enthielten 6 bzw. 7 markierte Neurone (Tab. 16). Die neurochemische Kodierung der
DiI-markierten
Neurone
unterschied
sich
deutlich
zwischen
diesen
beiden
Präparaten. Während in einem Präparat alle markierten Neurone cholinerg
(ChAT/SP und ChAT/-) waren, kodierten im anderen Präparat sämtliche Neurone für
NOS und größtenteils auch für VIP (Abb.17).
Bei den Muskelneuronen, die von der Längsmuskulatur aus markiert worden waren,
waren die einzelnen Kodierungen in den drei Präparate in unterschiedlichen Anteilen
vertreten (Tab.16). Über das Vorherrschen der cholinergen oder der nitrergen
Population kann dabei keine Aussage getroffen werden. So dominierten einmal die
cholinergen und einmal die nitrergen Neurone. Im dritten Präparat war der Anteil
beider Populationen ähnlich.
Präparat
Gesamtzahl
markierter ChAT/SP
DiI-Zellen
ChAT/-
NOS/VIP
NOS/-
Fragliche
Neurone
LM 1
16
1
2
11
1
1 NOS,
VIP?
LM 2
21
7
2
3
8
1 NOS,
VIP?
LM 3
4
3
---
1
---
---
ZM 1
6
3
1
---
---
2 ChAT,
SP?
ZM 2
7
---
---
6
---
1 NOS,
VIP?
Tabelle 16:
Übersicht über die DiI-markierten Neurone in der Zirkulär- (ZM) und Longitudinalmuskulatur
(LM) der Schlundrinne. Als fraglich wurden Neurone bezeichnet, deren Immunreaktivität für
SP bzw. VIP nicht eindeutig als positiv oder negativ bewertet werden konnte.
68
A
DiI
E
DiI
DiI
50µm
50µm
50µm
50µm
I
B
ChAT
F
ChAT
J
ChAT
C
SP
G
SP
K
SP
D
VIP
H
VIP
L
VIP
Abb.17: Muskelneurone der Schlundrinne.
A – D: DiI-markiertes Neuron (A), das zur Längsmuskulatur projizierte. Es war weder für
ChAT (B), noch für SP (C), noch für VIP (D) immunreaktiv. Da zuvor gezeigt wurde, dass
nicht cholinerge Neurone Immunreaktivität für NOS besitzen, konnte dem Muskelneuron die
Kodierung NOS/- zugeordnet werden. E – H: Zirkulärmuskelneuron (E), das immunreaktiv für
VIP (H), nicht aber für ChAT (F) und SP (G) war. Es besaß folglich die Kodierung NOS/VIP.
I – L: Längsmuskelneuron (I) der Kodierung ChAT/SP (J, K). Für VIP (L) bestand keine
Immunreaktivität.
69
5. Diskussion
In dieser Studie wurde in allen untersuchten Vormagenbereichen (Pansen, Haube,
Schlundrinne) des Lammes ein ganglionierter myenterischer Plexus gefunden. Die
enthaltenen Neurone konnten mit den eingesetzten Antikörpern markiert und so
neurochemisch charakterisiert werden. Aufgrund ihres neurochemischen Kodes
wurden die Neurone in verschiedene Subpopulationen unterteilt. Die Anzahl und die
Größe der Populationen war dabei zum einen von der Vormagenlokalisation und zum
anderen vom Alter der Lämmer abhängig. Im Retikulorumen beider Lämmergruppen
waren vorwiegend exzitatorische Neurone nachweisbar. In beiden Kompartimenten
konnten zwei cholinerge Neuronenpopulationen (ChAT/SP und ChAT/-) und eine
nitrerge (NOS/VIP) Neuronenpopulation unterschieden werden. In der Schlundrinne
des Sauglammes existierten die selben Populationen wie in Pansen und Haube,
daneben war aber noch eine vierte, rein nitrerge (NOS/-) Population vorhanden.
Beim Mastlamm dagegen waren in der Schlundrinne fast ausschließlich nitrerge bzw.
VIPerge Neurone nachweisbar. Generell konnte in allen drei Vormagenbereichen
eine altersabhängige Zunahme der nitrergen Innervation festgestellt werden. Auch
bei der Größe und Dichte der Ganglien war eine deutliche Altersabhängigkeit
nachweisbar. So waren die Ganglien der Sauglämmer in allen untersuchten
Vormagenbereichen größer und dichter gelegen als dies bei den Mastlämmern der
Fall war. Durch die Anwendung retrograder Tracingtechniken wurden beim
Sauglamm myenterische Neurone identifiziert, die zur Muskulatur des Vormagens
projizierten. In Pansen und Haube war dabei die Anzahl DiI-markierter Neurone
höher als in der Schlundrinne. Die Projektionen der Muskelmotoneurone waren
weder im Retikulorumen noch in der Schlundrinne polarisiert. Die DiI-markierten
Neurone stammten im Retikulorumen primär aus den Populationen CHAT/SP und
NOS/VIP. In der Schlundrinne waren vorwiegend Neurone der beiden nitrergen
Populationen sowie Neurone der Population CHAT/SP an der Innervation der
Muskulatur beteiligt.
70
5.1 Allgemeine Methodenkritik
Die Ergebnisse der allgemeinen Innervationsmuster des Vormagens wurden an
Geweben ermittelt, die entweder nach ihrer Entnahme direkt fixiert wurden oder für
24 Stunden mit 40µM Colchizin kultiviert worden waren. Die DiI-markierten Präparate
dagegen wurden insgesamt über einen Zeitraum von 5 Tagen kultiviert, wobei dem
Kulturmedium erst in den letzten 16 Stunden ebenfalls 40µM Colchizin zugesetzt
wurde. Bezüglich der Gewebekultur stellt sich die Frage, ob durch dieses Vorgehen
eine Veränderung der Transmitterexpression hervorgerufen wird. Am submukösen
Plexus im Dünndarm des Meerschweinchen wurde gezeigt, dass sich während der
Kultivierung Anzahl und neurochemische Kodierung von NPY, VIP und SP positiven
Neuronen gegenüber frischen Kontrollpräparaten nicht veränderten (SONG et al.
1997). Da dies für Präparate gezeigt wurde, die über eine Dauer von drei und fünf
Tagen kultiviert wurden, kann eine entsprechende Veränderung auch bei den mit DiImarkierten Präparaten ausgeschlossen werden.
Der Zusatz von Colchizin zum Kulturmedium dient dazu, den axonalen Transport von
Neuropeptiden zu blockieren (EKBLAD et al. 1996), so dass diese sich im Zellsoma
anreichern. Diese "chemische Axotomie", die vor einigen Jahren am Magendarmtrakt
des
Meerschweinchens
beschrieben
wurde,
führt
zu
einer
verbesserten
immunhistochemischen Darstellbarkeit der Neuropeptide (COSTA et al.1986).
Allerdings ist bekannt, dass der Zusatz von Colchizin auch zu einer veränderten
Expression von Neuropeptiden führen kann. So wurde bei der Ratte durch Colchizin
ein Anstieg von VIP-synthetisierenden, myenterischen und submukösen Neurone
festgestellt (EKBLAD et al. 1996). Dagegen blieb die Anzahl der Neurone, die
immunreaktiv für NOS oder NPY waren trotz der Colchizinbehandlung unverändert.
Da
an
den
Vormagengeweben
des
Lammes,
die
unmittelbar
nach
der
Probenentnahme fixiert worden waren, keine ausreichende Darstellbarkeit der
Neuropeptide erreicht werden konnte, wurde trotz der möglichen Veränderungen
Colchizin zum Kulturmedium zugesetzt. Da die Gewebe aus allen Lokalisationen und
aus beiden Altersgruppen mit Colchizin behandelt wurden, ist davon auszugehen,
dass die ermittelten Werte miteinander vergleichbar sind.
Die Methodenkritik zur angewandten Methode des retrograden Tracings mit dem
Fluoreszenzfarbstoff DiI erfolgt im zweiten Teil dieses Kapitels in Verbindung mit der
Diskussion der entsprechenden Ergebnisse.
71
5.2 Allgemeine Innervationsmuster im Vormagen
Durch die mit dem NSE-Antikörper durchgeführte Färbung der myenterischen Plexus
wurden die hier vorhandenen Neurone dargestellt. Mit Hilfe der NSE-Färbung
konnten zunächst allgemeine Innervationscharakteristika wie Größe und Dichte der
Ganglien in den einzelnen Vormagenkompartimenten beschrieben werden.
Der Nachweis des Enzyms NSE gilt als spezifischer Marker für Nervenzellen
(BISHOP et al. 1982). In verschiedenen anderen Studien wurde die Färbung gegen
NSE bereits zur Markierung von enterischen Neuronen angewandt. So wurde mit
dieser Färbung beispielweise die Gesamtpopulation myenterischer Neurone im
Magendarmtrakt des Meerschweinchens und der Maus dargestellt (SCHEMANN et
al. 1995; SANG u. YOUNG 1996). Auch am Vormagen des Rindes wurde die NSEFärbung bereits verwendet, um myenterische Neurone zu markieren (KITAMURA et
al. 1986).
5.2.1 Größe und Dichte myenterischer Ganglien
Die Gangliengröße war sowohl von der Lokalisation als auch von der untersuchten
Altersklasse abhängig. In beiden Altersstufen enthielten die Ganglien der Haube die
meisten, die der Schlundrinne die wenigsten Neurone.
Grundsätzlich sind solche lokalisationsabhängigen Unterschiede der Gangliongrößen
entlang des Gastrointestinaltrakts bereits beschrieben worden (GABELLA 1990).
Auch zwischen verschiedenen Spezies sind hier Unterschiede vorhanden. So sind
die Ganglien beim Schaf größer und enthalten mehr Neurone als bei der Maus oder
beim Meerschweinchen (GABELLA 1990).
Im
Vergleich
zum
Vormagenkompartimenten
Sauglamm
besaß
deutlich
kleinere
das
Mastlamm
Ganglien.
Dies
in
zeigt
allen
die
Altersabhängigkeit der Gangliongröße. Während die Ganglien der Haube beim
Sauglamm 184 ± 38 Neurone enthielten, waren es beim Mastlamm nur noch 101 ±
20 Nervenzellen. Eine noch stärkere Verminderung der Gangliongröße war in
Pansen und Schlundrinne zu beobachten. Hier besaßen die Ganglien beim
Mastlamm noch etwa ein Drittel der ursprünglichen Größe. Die im Pansen des
Mastlammes ermittelte Gangliongröße ist mit der vergleichbar, die vom Pansen des
adulten Schafes (31 ± 10 Neurone) bekannt ist (PFANNKUCHE et al. 2002a). Diese
Ähnlichkeit der Gangliengröße zwischen adultem Schaf und Mastlamm läßt
72
vermuten, dass die gegenüber dem Sauglamm bestehende Verringerung der Größe
ausschließlich im Laufe der ersten Lebensmonate stattfindet.
Ähnlich wie die Gangliengröße war auch ihre Dichte, also die Ganglienanzahl pro
Flächeneinheit, alters- und lokalisationsabhängig. So besaßen Pansen und Haube
innerhalb einer Altersstufe eine vergleichbare Dichte und waren jeweils deutlich von
der weniger dicht innervierten Schlundrinne zu unterscheiden. In allen drei
Kompartimenten war die Gangliendichte beim jüngeren Tier höher als beim älteren.
Über die Dichte der Ganglien im Pansen des adulten Schafes liegen bisher keine
Angaben vor. Da diesbezüglich aber zwischen den hier untersuchten Altersstufen
deutliche Unterschiede existieren, ist davon auszugehen, dass nicht nur die
geringere Größe sondern auch die geringere Dichte der Ganglien mit der
Entwicklung der Vormagens korreliert sind. Ein genereller Zusammenhang zwischen
Körpergröße, Muskelvolumen der Magendarmwand und Neuronenanzahl wurde von
GABELLA und TRIGG (1984) nach vergleichenden Untersuchungen an Mäusen,
Meerschweinchen und Schafen postuliert. Sie stellten fest, dass die Anzahl
myenterischer Neurone pro Flächeneinheit mit steigender Körpergröße bzw.
steigender Darmlänge deutlich geringer wird. So ist die Anzahl der Neurone pro
Flächeneinheit im Darm der Maus höher als beim Meerschweinchen, das einen
längeren Magendarmtrakt und damit mehr Muskulatur als die Maus besitzt. Beim
Schaf ist die Anzahl der Neurone im Magendarmtrakt wiederum geringer als beim
Meerschweinchen. Gleichzeitig ist am Darm des Schafes mehr Muskulatur als bei
den kleineren Spezies vorhanden. Dies führte weiterhin zu der Annahme, dass der
Muskelbereich, der von einem einzelnen Neuron innerviert wird, sich mit steigender
Körpergröße ebenfalls vergrößert (GABELLA u. TRIGG 1984). Die von GABELLA
und TRIGG (1984) vermutete Korrelation zwischen Körpergröße, Darmlänge und
enterischer Neuronenanzahl beruhte auf Vergleichen zwischen verschiedenen
Spezies. Die vom Lamm vorliegenden Ergebnisse legen nahe, dass diese
Korrelation anscheinend auch während des Heranwachsens innerhalb einer Spezies
besteht.
Rein rechnerisch bedeutet die Abnahme der Gangliendichte und -größe den Verlust
von Nervenzellen pro Flächeneinheit Plexus. Wie groß die Verminderung der
Neuronenzahl am Retikulorumen jedoch wirklich ist, kann aufgrund der hier
73
angewandten
Methode
schwer
abgeschätzt
werden.
Zur
Bestimmung
der
Gangliendichte wurde die Anzahl der Ganglien auf einer Fläche von 1 cm² ermittelt.
Hierbei ist zu beachten, dass diese Fläche beim Sauglamm einen wesentlich
größeren Anteil des Gesamtplexus darstellt, als dies beim ruminierenden Mastlamm
der Fall ist.
Generell ist von anderen Spezies wie beispielweise der Ratte bekannt, dass der
myenterische Plexus beim jungen, wenige Tage alten Tier ein sehr dichtes Netzwerk
darstellt, das dann in den ersten Lebenswochen weitmaschiger wird (SCHÄFER et
al. 1999). Auch beim älteren Meerschweinchen wurde gegenüber den jüngeren
Tieren eine Vergrößerung des Abstands zwischen den myenterischen Ganglien
beschrieben (GABELLA 1989).
Da die Ausweitung des Plexus in den ersten postnatalen Wochen mit der
Längenzunahme des Darms in Verbindung gebracht wird (SCHÄFER et al. 1999),
könnte die geringere Gangliendichte beim ruminierenden Schaf ebenfalls auf eine
Dehnung des Plexus infolge der Größenzunahme des Vormagens zurückgeführt
werden.
Im Gegensatz zur verminderten Gangliendichte scheint die geringere Neuronenzahl
innerhalb eines Ganglions beim Mastlamm einen echten Verlust von Nervenzellen
darzustellen. Es liegen diverse Studien von verschiedenen Spezies vor, in denen der
Verlust
enterischer
Untersuchungen
Nervenzellen
beschreibt
untersucht
allerdings
wurde.
Veränderungen,
Die
die
Mehrzahl
im
dieser
Verlauf
des
Alterungsprozesses eintreten. So ist beispielsweise beim Meerschweinchen und der
Ratte ein altersbedingter Verlust von 40-60% der Neurone beschrieben (SANTER u.
BAKER 1988; GABELLA 1989).
Über den unmittelbar postnatal bis zum Erreichen des Erwachsenenalters
stattfindenen
Verlust
enterischer
Nervenzellen
wurden
dagegen
weniger
Untersuchungen durchgeführt. Die hierzu vorhandenen Studien können allerdings
nur teilweise mit den beim Lamm ermittelten Ergebnissen verglichen werden.
Während beim Lamm die Neuronenzahl pro Ganglion bestimmt wurde, wurden in
anderen Untersuchungen die Neurone auf einer bestimmten Fläche ermittelt. So wird
in einer an der Ratte durchgeführten Studie in den ersten beiden Lebenswochen ein
Absinken der Neuronenanzahl beschrieben. Die Bezugsgröße hierbei war jedoch die
74
Ganglionfläche, d.h. die Fläche in µm², über die sich ein Ganglion erstreckte
(SCHÄFER et al. 1999).
Auch beim Menschen wurde postnatal ein Absinken der Neuronenzahl in allen
Darmabschnitten beschrieben. In dieser Studie wurde gezeigt, dass die Anzahl der
nitrergen Neurone pro cm² Plexusgewebe mit zunehmenden Alter abnimmt
(WESTER et al. 1999). Da die nitrergen Neurone in allen untersuchten Altersstufen
etwa
30-40%
der
Gesamtneuronenpopulation
darstellten,
konnte
davon
ausgegangen werden, dass der Verlust der Neurone die Gesamtheit der enterischen
Nervenzellen betrifft. Die stärkste Verringerung der Neuronenanzahl wurde hierbei
innerhalb der ersten Lebensjahre festgestellt. So betrug die Anzahl nitrerger
Neurone/cm² im proximalen Kolon nach der Geburt etwa 28000 und sank bis zum
zweiten Lebensjahr auf fast 5000 ab (WESTER et al. 1999). Da in der vorliegenden
Arbeit beim Lamm sowohl die Dichte als auch die Größe der Ganglien bestimmt
wurde, kann die Neuronenzahl pro cm² als Produkt aus beiden Werten errechnet
werden. In der Haube beispielsweise ist die ermittelte Neuronenzahl beim Sauglamm
etwa 24mal höher als beim Mastlamm (Sauglamm 26000 Neurone/cm², Mastlamm
1100 Neurone/cm²). Diese Zahlen deuten einen geringeren Neuronenverlust im
Darm des Menschen als im Vormagen des Lammes an. Allerdings muss hierbei auch
das
unterschiedliche
Wachstum
der
entsprechenden
Magendarmabschnitte
berücksichtigt werden. Wie zuvor beschrieben, kann die Abnahme der Neurone/cm²
auch auf eine Weitung der Vormagenwand zurückgeführt werden. Es ist fraglich, in
wie weit diese Weitung mit dem Wachstum des menschlichen Darms vergleichbar ist.
Zur Bedeutung des Neuronenverlusts werden in der Literatur verschiedene
Möglichkeiten diskutiert. Es ist möglich, dass der Verlust der Neurone durch
Apoptose geschieht und dazu dient, Neurone zu beseitigen, die beim erwachsenen
Tier nicht mehr benötigt werden (GABELLA 1989). Desweiteren existieren
Untersuchungen, die zeigen, dass verschiedene Neurotransmitter auch zur
Entwicklung
und
Differenzierung
der
Gewebe
dienen
können.
So
wurde
beispielsweise für SP nachgewiesen, dass es bei kultivierten glatten Muskelzellen
und Fibroblasten dosisabhängig zur Steigerung der DNA-Synthese führt. Für dieses
Neuropeptid wurde daher eine mitogene Wirkung vermutet (NILSSON et al. 1985).
Es wäre somit denkbar, dass mit dem Ende des Wachstums und der Entwicklung
Neurone verloren gehen, die derartige Funktionen erfüllt haben.
75
5.2.2 Kodierungen und Populationen
Zur Untersuchung der neurochemischen Kodierungen wurden die myenterischen
Neurone auf ihre Immunreaktivität für ChAT und NOS überprüft. Alle zuvor mit der
NSE-Färbung markierten Neurone waren entweder ChAT-positiv oder NOS-positiv.
Eine Kolokalisation dieser beiden Syntheseenzyme war in keiner myenterischen
Nervenzelle zu beobachten. Diese strikte Trennung der Neurone in eine
exzitatorische, cholinerge und eine inhibitorische, nitrerge Population scheint ein
allgemeines Prinzip im myenterischen Plexus des ENS zu sein. Diese Aufteilung der
Neurone ist bereits vom Pansen des adulten Schafes (PFANNKUCHE et al. 2002a),
vom Labmagen des Rindes (PFANNKUCHE et al. 2002b) sowie aus dem
Gastrointestinaltrakt monogastrischer Spezies (SCHEMANN et al. 1995; BROOKES
2001b) bekannt.
Der Anteil cholinerger Neurone war im Retikulorumen beider Lämmergruppen
signifikant höher als der der nitrergen Nervenzellen. Die Dominanz cholinerger
Neurone ist bereits aus weiten Teilen des Gastrointestinaltrakts beim Monogastrier
bekannt. Allerdings sind hierbei regionale Unterschiede vorhanden. Sogar innerhalb
des
Magens
bestehen
beim
Meerschweinchen
Unterschiede
in
den
Populationsgrößen der cholinergen Nervenzellen. Während im Korpus 67% der
Neurone cholinerg sind (SCHEMANN et al. 1995), liegt der Anteil im Antrum nur bei
56% (VANDEN BERGHE et al. 1999). Im Dünndarm dagegen ist die Größe der
cholinerge Population (68%) (STEELE et al. 1991) mit der des Korpus vergleichbar.
Desweiteren exisitieren speziesspezifische Unterschiede. So sind auch im
Labmagen des Rindes die Neurone des myenterischen Plexus überwiegend
cholinerg kodiert. Der Anteil liegt hier aber mit 89% (PFANNKUCHE et al. 2002b)
deutlich höher als im Magen monogastrischer Spezies und ist mit dem der Haube
(88%) und des Pansens (82%) beim Sauglamm vergleichbar. Beim Mastlamm
beträgt der Anteil cholinerger Neurone im Pansen 74% und in der Haube 83%, so
dass der Vormagen insgesamt stärker cholinerg innerviert zu sein scheint, als der
Magen und der Dünndarm des Monogastriers.
Im Gegensatz zum Retikulorumen waren in der Schlundrinne des Lammes
vorwiegend nitrerge Neurone
nachweisbar.
Obwohl eine
der
Schlundrinne
vergleichbare Struktur beim Monogastrier nicht existiert, ist es bemerkenswert, dass
hier der Ösophagus stärker nitrerg innerviert ist als andere Bereiche des
76
Magendarmtrakts. Beim Meerschweinchen wurden 54% der myenterischen Neurone
des Ösophagus der nitrergen Population zugeordnet (FURNESS et al. 1994). In
einer anderen Studie am Meerschweinchen wurde sogar bei mehr als zwei Drittel der
Neurone im Ösophagus eine nitrerge Kodierung festgestellt (MORIKAWA u.
KOMURO 1998). In der Speiseröhre des Menschen gehörte rund die Hälfte der
Neurone (55%) zur nitrergen Population (SINGARAM et al. 1994).
Eine ähnlich hohe nitrerge Innervation ist in den distalen Regionen des
Gastrointestinaltrakts nur in den Sphinkteren vorhanden. Bei der Katze wurde die
Verteilung nitrerger Neurone entlang des gesamten Magendarmtrakts untersucht.
Obwohl hierzu keine absoluten Zahlen vorliegen, wurde die höchste Anzahl nitrerger
Neurone hierbei in den Sphinkterregionen gefunden (ALTDORFER et al. 1996). Auch
beim Meerschweinchen war der Anteil nitrerger Neurone in den Sphinkteren höher
als in den angrenzenden Magendarmabschnitten. Im Pylorus beispielsweise
besaßen 36% der myenterischen Neurone eine nitrerge Kodierung, im angrenzenden
Duodenum dagegen lag der Anteil nur bei 17% (WANG et al. 1996).
Die gegenüber dem restlichen Gastrointestinaltrakt stärkere inhibitorische, nitrerge
Innervation in Sphinkteren und Schlundrinne könnte mit den spezifischen Funktionen
dieser Regionen verbunden sein. An den Sphinkteren herrscht im Ruhezustand ein
hoher Muskeltonus. Durch die starke inhibitorische Innervation wird kurzzeitig eine
Relaxation der Ringmuskulatur herbeigeführt. So relaxiert beispielsweise der untere
Ösophagussphinkter während des Abschluckens (BROOKES et al. 1996). Beim
Lamm wird durch das Saugen und Schlucken von Milch eine Relaxation des
Schlundrinnenbodens bei gleichzeitiger Kontraktion der Lippen hervorgerufen
(TITCHEN 1968; RUCKEBUSCH 1989). Diese motorischen Vorgänge stellen sowohl
in der Schlundrinne als auch in den Sphinkteren ein "Öffnen und Schließen" dar. Die
starke inhibitorische Innervation durch nitrerge Neurone könnte ein Hinweis auf die
funktionelle Ähnlichkeit von Schlundrinne und Sphinkteren sein.
Um eine weitere mögliche funktionelle Zuordnung der cholinergen und nitrergen
Neuronenpopulation im Vormagen treffen zu können, wurden die Neurone auch auf
ihre Immunreaktivität für die Neuropeptide SP und VIP untersucht. Das generelle
Vorkommen dieser und anderer Neuropeptide am Wiederkäuervormagen wurde
bereits in früheren Studien gezeigt (WATHUTA 1986; KITAMURA et al. 1986;
GROENEWALD 1994). Detaillierte Untersuchungen zu den Kolokalisationen der
77
peptidsynthetisierenden Neurone sowie zu deren quantitativen Anteilen wurden
dagegen
bisher
lediglich
am
Pansen
des
adulten
Schafes
durchgeführt
(PFANNKUCHE et al. 2002a).
5.2.2.1 Kolokalisationen
Die beim Lamm in Pansen, Haube und Schlundrinne gezeigten Kolokalisationen von
VIP in nitrergen und SP in cholinergen Neuronen des myenterischen Plexus
entsprechen weitgehend den beim Monogastrier bestehenden Verhältnissen.
Allerdings scheinen die an der Innervation des Vormagens beteiligten Populationen
im Vergleich zu anderen gastrointestinalen Regionen weniger differenziert zu sein.
Mit den in dieser Arbeit verwendeten Antikörpern gegen ChAT, NOS, SP und VIP
konnten im Retikulorumen drei und in der Schlundrinne vier verschiedene
Populationen
identifiziert
werden.
Am
Magen
und
am
Dünndarm
des
Meerschweinchens dagegen konnten mit Hilfe dieser Antikörper jeweils fünf
Populationen unterschieden werden (SCHEMANN et al. 1995; BROOKES 2001b).
Für viele monogastrische Spezies wurde die Synthese von VIP in nitrergen
myenterischen
Neuronen
verschiedener
gastrointestinaler
Bereiche
bereits
nachgewiesen (COSTA et al. 1992; EKBLAD et al. 1994a; SANG u. YOUNG 1996).
Aber auch im Gastrointestinaltrakt des Wiederkäuers wurde diese Kolokalisation von
NOS und VIP festgestellt. Sie wurde bisher im Darm des Rindes (VITTORIA et al.
2000) und im Pansen des adulten Schafes beschrieben (PFANNKUCHE et al.
2002a).
Darüberhinaus wurde am Pansen des Schafes gezeigt, dass SP in cholinergen
Neuronen synthetisiert wird (PFANNKUCHE et al. 2002a). Diese Kolokalisation von
ChAT und SP in enterischen Neuronen ist ebenfalls von monogastrischen Spezies
bekannt (STEELE et al. 1991; FURNESS et al. 1995; BROOKES 2001b) und
innerhalb des ENS weitverbreitet.
5.2.2.2 Anteile der Populationen
Sowohl die absoluten Größen als auch die prozentualen Anteile der identifizierten
Neuronenpopulationen waren einerseits von der untersuchten Vormagenregion
(Pansen, Haube und Schlundrinne), andererseits vom Alter des Lammes (Saug-und
Mastlamm) abhängig.
78
Pansen und Haube
In Pansen und Haube beider Lämmergruppen waren die meisten Nervenzellen
immunreaktiv für ChAT/SP, der Anteil der Populationen ChAT/- und NOS/VIP war
deutlich geringer.
Die Ganglien der Haube enthielten zwar insgesamt mehr Neurone als die des
Pansens, prozentuale Unterschiede der Populationsgrößen waren zwischen den
beiden Lokalisationen aber kaum ausgebildet. Die funktionelle Zusammengehörigkeit
der beiden Vormagenbereiche scheint sich somit in einer ähnlichen intrinsischen
Innervation auszudrücken.
Während des Heranwachsens der Lämmer traten im myenterischen Plexus von
Pansen und Haube Veränderungen der Neuronenpopulationen auf. So war in beiden
Kompartimenten beim Mastlamm die absolute Zahl cholinerger Neurone geringer als
beim Sauglamm. Da die Ganglien beim Mastlamm insgesamt kleiner waren als beim
Sauglamm, war der prozentuale Anteil dieser Population aber nicht signifikant
verändert. Im Gegensatz zu den cholinergen Neuronen blieb die absolute Anzahl der
nitrergen Neurone vom Saug- zum Mastlamm konstant, was prozentual einen
Anstieg dieser Population bedeutete. Auch im Pansen des adulten Schafes
entspricht die absolute Anzahl NOS/VIP kodierter Neurone der des Lammes
(PFANNKUCHE et al. 2002a). Die prozentuale Zunahme der nitrergen Population
könnte
funktionell
mit
der
Differenzierung
von
Pansen
und
Haube
zur
Fermentationskammer korreliert sein. Mit einsetzender Rumination müssen Pansen
und Haube beträchtliche Futtermengen aufnehmen, was eine Volumenzunahme der
Kompartimente
und
eine
Relaxation
der
Wandmuskulatur
erfordert.
Da
Stickstoffmonoxid und VIP eine inhibitorische Wirkung auf die Muskulatur des
Pansen ausüben (DENAC et al. 1987; SCHNEIDER u. EADES 1998), ist es denkbar,
dass die relative Zunahme der Population NOS/VIP eine Adaption an diese
Veränderungen darstellt.
Obwohl die vom Pansen des adulten Schafes bekannten Ganglion- und
Populationsgrößen mit denen des Mastlammes vergleichbar sind, besteht jedoch
innerhalb der Populationsgröße der rein cholinergen Neurone ein Unterschied. So
beträgt der prozentuale Anteil der Population ChAT/- beim adulten Tier 5 ± 4%
(PFANNKUCHE et al. 2002a) und ist somit auch signifikant geringer als beim
Mastlamm. Diese prozentuale Abnahme der rein cholinergen Population deutet sich
auch zwischen den hier untersuchten Saug- und Mastlämmern an, was aber
79
statistisch nicht zu belegen war. Ein Vergleich dieser Population bei Sauglamm und
adultem Schaf dagegen zeigt einen signifikanten Unterschied. Die Ursache dieser
altersabhängigen Veränderungen kann einerseits darin begründet sein, dass in
einigen der zunächst rein cholinergen Neurone die Synthese von SP erst später
beginnt. Andererseits besteht die Möglichkeit, dass es zu einem Verlust der rein
cholinergen Neurone kommt. Für letztere Möglichkeit spricht ein Vergleich der
absoluten Zellzahlen bei Mastlamm und adultem Schaf. Während die Anzahl rein
cholinerger Neurone beim adulten Tier (2 ± 2) geringer als beim Mastlamm ist (5 ± 2),
besteht in der absoluten Zahl ChAT/SP kodierter Neurone kein Unterschied. So
enthalten die Ganglien des adulten Schafes 21 ± 9 (PFANNKUCHE et al. 2002a) und
die des Mastlammes 21 ± 8 ChAT/SP positive Neurone. Beim Sauglamm bestanden
beide Populationen noch aus erheblich mehr Neuronen (ChAT/- 20 ± 9; ChAT/SP 65
± 25 Neurone). Die Betrachtung aller drei Altersgruppen zeigt, dass die neuronalen
Veränderungen während der ersten Lebensmonate am stärksten ausgeprägt, aber
noch nicht vollständig abgeschlossen sind.
Schlundrinne
Deutlich abzugrenzen von Pansen und Haube waren die Populationsgrößen in der
Schlundrinne. Wie bereits beschrieben, war hier die Innervation durch nitrerge und
VIPerge Neurone deutlich höher als im Retikulorumen. Auch beim adulten Rind
wurde ein deutlich häufigeres Vorkommen nitrerger Neurone in der Schlundrinne als
in Pansen und Haube beschrieben (VITTORIA et al. 2000). Beim Kalb wurde in der
Schlundrinne eine höhere Dichte VIP-immunreaktiver Fasern als im restlichen
Vormagen beobachtet (KITAMURA et al. 1986).
Die altersabhängigen Veränderungen, die in der Schlundrinne alle Populationen
betrafen, waren ausgeprägter als in Pansen und Haube. Während in der
Schlundrinne des Sauglammes zwei nitrerge (NOS/- und NOS/VIP) und zwei
cholinerge (ChAT/- und ChAT/SP) Populationen unterschieden werden konnten,
besaßen beim Mastlamm fast alle Neurone der Schlundrinne nitrerge und VIPerge
Kodierung. Der prozentuale Anteil der Population NOS/VIP war daher beim
Mastlamm deutlich höher als beim Sauglamm. Diese prozentuale Zunahme kann
vermutlich auf die insgesamt verminderte Gangliongröße und auf den Verlust der rein
nitrergen und der beiden cholinergen Populationen zurückgeführt werden. Wie zuvor
80
beschrieben, scheint im Vormagen generell ein altersabhängiger Verlust von
Nervenzellen stattzufinden. Hiervon scheinen in der Schlundrinne die anfangs
vorhandenen Populationen aber in unterschiedlichem Maße betroffen zu sein.
Während sich die absolute Anzahl NOS/VIP kodierter Neurone etwa um die Hälfte
reduzierte, waren Neurone der drei anderen Kodierungen beim Mastlamm gar nicht
mehr vorhanden. Von anderen Spezies oder anderen gastrointestinalen Regionen ist
ein altersabhängiger Wegfall von Neuronenpopulationen bisher nicht bekannt. Zwar
wurde auch beim Rind eine altersabhängig verminderte Innervationsdichte SPerger
Neurone in der Schlundrinne beschrieben, das vollständige Fehlen immunreaktiver
Nervenzellen konnte hier aber nicht beobachtet werden (KITAMURA et al. 1986).
Lediglich in einer Arbeit wurde bisher ein völliger Verlust der Immunreaktivität für
einen Neurotransmitter publiziert. Hierbei wurde im Ösophagus des Schafes
während der fötalen Entwicklung eine Immunreaktivität für SP festgestellt, die später
beim adulten Tier nicht mehr vorhanden war (WATHUTA u. HARRISON 1987).
Obwohl
beim
Mastlamm
keine
cholinergen
und
SPergen
Neurone
mehr
nachgewiesen werden konnten, waren hier noch immunreaktive Nervenfasern, die in
den Fasersträngen und innerhalb der Ganglien verliefen, nachweisbar. Da
Azetylcholin und SP auch Neurotransmitter außerhalb des ENS sind, könnten diese
immunreaktiven Fasern möglicherweise extrinsischen Ursprungs sein. Während
Azetylcholin
als
Neurotransmitter
in
parasympathischen
Nervenfasern
dient
(GERSHON u. ERDE 1981), ist SP in spinalen Afferenzen nachgewiesen worden
(GREEN u. DOCKRAY 1987). Die mögliche extrinsische Herkunft der Fasern würde
für die bereits von HABEL (1956) beschriebene hohe Innervationsdichte des
Schlundrinnenbodens durch vagale Fasern sprechen. Desweiteren ist es möglich,
dass die beim Lamm nachgewiesenen SPergen Fasern von intrinsischen Neuronen
stammen, deren Somata außerhalb des untersuchten Schlundrinnenbodens
lokalisiert sind. Vom Rind ist bekannt, dass in den generell dichter innervierten
Schlundrinnenlippen auch SP positive Neurone lokalisiert sind (KITAMURA et al.
1986). Auch beim Lamm könnten SPerge Neurone in den Lippen existieren, deren
Axone in den Boden der Schlundrinne projizieren. Andererseits scheint die
Innervation der Schlundrinne bei Schaf und Rind in einigen Punkten stark
voneinander abzuweichen. Im Unterschied zum Lamm enthält die Schlundrinne beim
Kalb weniger VIPerge als SPerge Neurone (KITAMURA et al. 1986). Auch der beim
Lamm beschriebene altersabhängig veränderte Anteil der VIPergen Neurone wurde
81
beim Rind nicht beobachtet. Die Dichte VIPerger Neurone im myenterischen Plexus
abgesetzter Kälber entsprach der der noch saugenden Kälber (KITAMURA et al.
1986). Aufgrund dieser Unterschiede ist fraglich, ob die Innervation durch SPerge
Neurone bei beiden Wiederkäuerarten vergleichbar ist.
Funktionell könnten die in der Schlundrinne des Sauglammes vorhandenen
Neuronenpopulationen für den Schlundrinnenreflex von Bedeutung sein. Dafür
spricht, dass in vitro durch VIP und Stickstoffmonoxid eine Relaxation des
Schlundrinnenbodens ausgelöst werden kann (DENAC et al. 1990; BARAHONA et
al. 1998). Somit könnte die in vivo stattfindende Relaxation durch die Freisetzung
dieser beiden Neurotransmitter aus den myenterischen Neuronen vermittelt sein.
In einer funktionelle Studie, die an der Schlundrinnenmuskulatur adulter Rinder
durchgeführt wurde, konnte durch elektrische Feldstimulation keine neurogen
bedingte Muskelkontraktionen hervorgerufen werden (SAN ANDRES et al. 1994).
Dieses Ergebnis läßt auf das Fehlen intrinsischer exzitatorischer Nerven in der
Schlundrinne
schliessen.
Schlundrinnenreflex
Vom
adulten
physiologischerweise
Schaf
nicht
ist
mehr
bekannt,
dass
der
vorhanden
ist,
aber
experimentell noch ausgelöst werden kann (SMITH et al. 1977; TSIAMITAS u.
BRIKAS 1981). Es ist denkbar, dass das fehlende Reflexverhalten mit dem Verlust
bestimmter Neuronenpopulationen korreliert ist.
Insgesamt zeigen die Ergebnisse aller untersuchten Vormagenkompartimente, dass
die anatomische und funktionelle Differenzierung des Vormagens mit Veränderungen
der Neuronenpopulationen im myenterischen Plexus verbunden sind. Besonders in
der Schlundrinne sind nach dem Ende der Saugperiode massive Veränderungen der
intrinsischen neuronalen Gegebenheiten nachweisbar. Generell ist sowohl im
Retikulorumen als auch in der Schlundrinne eine altersabhängige Zunahme der
nitrergen,
inhibitorischen
Neuronenpopulation
zu
beobachten.
Obwohl
im
Magendarmtrakt des Monogastriers keine derartigen, dem Wiederkäuervormagen
vergleichbaren anatomischen Veränderungen stattfinden, treten hier auch postnatal
Veränderungen der Populationen auf.
Von der Ratte ist bekannt, dass die vollständige neurochemische Differenzierung erst
einige Zeit postnatal erreicht wird (MATINI et al. 1997). Bei dieser Spezies ist in den
ersten Lebenswochen ein prozentualer Anstieg der nitrergen Population beschrieben
82
worden. Erst mit dem Absetzen der Tiere blieb diese Population konstant (MATINI et
al. 1997). In einer weiteren Untersuchung an der Ratte wurde im Kolon ebenfalls ein
Anstieg der nitrergen Neurone gezeigt. Im Ileum dagegen war keine Veränderung
dieser Population nachweisbar (BELAI et al. 1995). Im Magen der Ratte war
ebenfalls keine altersabhängige Zunahme der nitrergen Neurone feststellbar
(TIMMERMANS et al. 1999).
Auch
innerhalb
der
entwicklungsbedingte
cholinergen
Neuronenpopulation
Veränderungen
einzelner
sind
bei
Darmabschnitte
der
Ratte
beschrieben.
Während im Ileum der adulten Ratte signifikant mehr cholinerge Neurone als beim
fünf Tage alten Tier vorhanden waren, blieb die Anzahl im Kolon konstant
(VANNUCCHI u. FAUSSONE-PELLEGRINI 1996).
Calbindin
Von den bisher an vielen anderen Spezies durchgeführten Studien ist bekannt, dass
enterische Neurone häufig mehr als zwei Neurotransmitter synthetisieren (FURNESS
et al. 1995). Beispielsweise existieren im Magen und im Dünndarm des
Meerschweinchens eine große Anzahl myenterischer Neurone, die für ChAT und SP
immunreaktiv sind (SCHEMANN et al. 1995; BROOKES 2001b). Durch den
Nachweis zusätzlicher Substanzen wie Enkephalin oder Calbindin wurde eine
genauere Einteilung der ChAT/SP kodierten Neurone in verschiedene Populationen
möglich. Da auch in einigen myenterischen Neuronen in Pansen und Haube
Calbindin nachzuweisen war, ist davon auszugehen, dass auch am Vormagen die
Anwendung
zusätzlicher
Antikörper
zu
einer
weiteren
Klassifizierung
der
Populationen führen kann.
Gegenüber den vom Meerschweinchen bekannten Verhältnissen bestehen jedoch
beim Lamm einige Unterschiede bezüglich der Calbindin synthetisierenden Neurone.
Zunächst ist der Anteil der Calbindin positiven Neurone beim Lamm sehr gering.
Während beim Meerschweinchen im Magen bis zu 25% und im Dünndarm 30% der
myenterischen Neurone Calbindin synthetisieren (FURNESS et al. 1990, REICHE et
al. 1999), liegt der Anteil im Pansen des Sauglammes bei etwa 2% und in der Haube
unter 1%. Hierbei ist zu bemerken, dass mehrere gegen Calbindin gerichtete
Antikörper existieren, die sich durch ihre Herkunft unterscheiden. Für das
Meerschweinchen wurde belegt, dass die Anzahl markierter Neurone je nach
verwendetem Antikörpers variiert (REICHE et al. 1999). Es ist daher möglich, dass
83
auch im Vormagen die tatsächliche Anzahl Calbindin synthetisierender Neurone
höher ist, als mit dem hier verwendeten Antikörper ermittelt werden konnte.
Auch bezüglich der Morphologie der Calbindin positiven Neurone bestehen
Unterschiede zwischen den Spezies. Während im Darm des Meerschweinchens nur
in Neuronen vom Dogiel-Typ-II Calbindin nachweisbar ist (IYER et al. 1988),
scheinen beim Lamm eher Neurone vom Typ Dogiel-I Calbindin zu synthetisieren (s.
Abb.14).
Entsprechende
morphologische
Unterschiede
gegenüber
dem
Meerschweinchen sind auch bei der Ratte beschrieben. Hier sind sowohl Neurone
des Dogiel-Typ-I als auch des -Typ-II immunreaktiv für Calbindin (GERSHON et al.
1994; SAYEGH u. RITTER 2003).
Die Funktion und neurochemische Kodierung der Calbindin synthetisierenden
Neurone beim Meerschweinchen scheint regional unterschiedlich zu sein. Im
Dünndarm stellen sie funktionell primär afferente bzw. sensorische Nervenzellen dar
und sind der cholinergen Population zuzuordnen (SONG et al. 1994; BROOKES
2001b). Im Magen dagegen wurde in Interneuronen Immunreaktivität für Calbindin
gefunden. Diese Neurone stammten sowohl aus cholinergen wie auch aus nitrergen
Populationen (REICHE et al. 2000).
Auch im Vormagen stammten die Calbindin positiven Neurone sowohl aus der
nitrergen als auch aus der cholinergen Population. Die Mehrzahl der Calbindin
positiven Neurone besaß dabei in beiden Kompartimenten cholinerge Kodierung. Der
Anteil nitrerger Calbindin-Neurone war insgesamt gering, lag in der Haube jedoch
höher als im Pansen. Dies zeigt, dass trotz der funktionellen Zusammengehörigkeit
und den neurochemischen Ähnlichkeiten auch Unterschiede zwischen diesen beiden
Kompartimenten bestehen. Über mögliche Funktionen der Calbindin positiven
Neurone können lediglich Vermutungen angestellt werden. Da die Muskulatur im
Retikulorumen hauptsächlich durch Populationen innerviert wird, die kein Calbindin
synthetisieren, scheinen diese Neurone wie beim Meerschweinchen wahrscheinlich
entweder sensorische Funktion zu besitzen oder als Interneurone zu fungieren.
Tyrosinhydroxylase
Das Enzym Tyrosinhydroxylase ist an der Synthese von Katecholaminen wie
beispielsweise
Noradrenalin
beteiligt
und
kann
sympathischen Nervenzellen nachgewiesen werden.
84
daher
in
extrinsischen,
Weder im Pansen noch in der Haube waren Zellkörper, die für TH immunreaktiv
waren vorhanden. Es konnten aber TH-immunreaktive Nervenfasern, die innerhalb
der myenterischen Ganglien und Faserstränge verliefen, nachgewiesen werden. Das
gleichzeitige Fehlen vom immunreaktiven Zellkörpern wurde auch bereits im Psalter
des Schafes beobachtet (YAMAMOTO et al. 1994) und deutet auf den extrinsischen
Ursprung der nachgewiesenen Fasern hin. Da im Psalter TH-immunreaktive Fasern
häufig perivaskulär gelegen waren, wurde hier eine Beteiligung sympathischer
Nerven an der lokalen Durchblutungsregulation vermutet (YAMAMOTO et al. 1994).
Auch im Magen monogastrischer Tiere konnten bisher mit Hilfe des TH-Nachweises
keine katecholaminergen Neurone im myenterischen Plexus nachgewiesen werden
(SCHEMANN et al. 1995)
Möglichkeit funktioneller Rückschlüsse aus den Anfärbungen
Abschließend
ist
zu
Transmittersubstanzen
bemerken,
keine
dass
vollständige
die
in
dieser
Arbeit
neurochemische
und
untersuchten
funktionelle
Klassifizierung der Neurone erlauben. Beim Meerschweinchen können inzwischen
die meisten Neurone aufgrund ihrer Kodierung und Morphologie einer bestimmten
Funktion
zugeordnet
werden.
Unterschiede
zwischen
den
einzelnen
Neuronenklassen konnten hier häufig erst durch den Nachweis zusätzlicher
Neurotransmitter und anderer Substanzen festgestellt werden. Da auch am
Vormagen des Wiederkäuer bereits Substanzen wie Enkephalin, Somatostatin oder
NPY (KITAMURA et al. 1986; GROENEWALD 1994) nachgewiesen wurden, ist
davon auszugehen, dass auch hier eine weitere Differenzierung der Neurone
getroffen werden kann.
5.2.3 Zellgrößen
In allen untersuchten Vormagenkompartimenten des Lammes besaßen die Neurone
beider cholinergen Populationen eine signifikant kleinere Somafläche als die
nitrergen Neurone. Ein entsprechender Größenunterschied wurde bereits am
Ösophagus und am Magen des Meerschweinchens sowie am Kolon des Menschen
beobachtet (SCHEMANN u. SCHAAF 1995; BROOKES et al. 1996; PORTER et al.
1997; BROOKES et al. 1998). Wie am Magen des Meerschweinchens waren auch
beim Lamm keine Unterschiede der Somagrößen zwischen den Populationen
ChAT/SP und ChAT/- vorhanden (PFANNKUCHE et al. 1998).
85
Der zwischen nitrergen und cholinergen Neuronen bestehende Größenunterschied
kann einen Hinweis auf ein unterschiedliches elektrophysiologisches Verhalten
dieser beiden neurochemisch verschiedenen Neuronentypen sein. Am Magen des
Meerschweinchens wurde beobachtet, dass kleinere, cholinerge Neurone eine
höhere Erregbarkeit besitzen als größere Neurone (REICHE et al. 1998). Vom
Dünndarm des Meerschweinchens ist ebenfalls ein solcher Zusammenhang
zwischen Somagröße und Erregbarkeit der Neurone bekannt (SCHUTTE et al.
1995).
5.3 Retrogrades Tracing
5.3.1 Methodenkritik
Generell ist die hier angewandte Methode des retrograden Tracings mit dem
Farbstoff DiI zur Untersuchung neuronaler Projektionen am ENS etabliert
(BROOKES 2001a). Beim Monogastrier liegen hierzu allerdings weit mehr
Anwendungserfahrungen als beim Wiederkäuer vor. Die erste Anwendung dieser
Methode beim Wiederkäuer erfolgte an adultem Pansen-und Labmagengewebe und
zeigte, dass auch hier eine retrograde Markierung von Muskelmotoneuronen möglich
ist (PFANNKUCHE et al. 2002a, b). Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten
Gewebe vom Vormagen des Sauglammes sind deutlich dünner als die der adulten
Schafe. Dadurch besteht die Möglichkeit, dass der Farbstoff zu tief in die Muskulatur
appliziert wird und so direkt auf den myenterischen Plexus oder die andere
Muskelschicht gelangt. Weiterhin ist es bei der hohen Gangliendichte des
Sauglammes auch denkbar, dass sich die Applikationsstelle genau im Bereich eines
Ganglions befindet. Beides hätte zur Folge, dass auch Muskelneurone, die zur
anderen Muskelschicht projizieren sowie Interneurone mit DiI markiert würden. Um
derartige Unspezifitäten zu vermeiden, wurden bei der Auswertung nur Präparate
berücksichtigt, in denen der Farbstoff nicht direkt über einem Ganglion appliziert
worden war. Weiterhin wurde nach der Applikation auf die Zirkulärmuskulatur
kontrolliert, ob DiI-gefüllte Axone innerhalb der Longitudinalmuskulatur verliefen und
umgekehrt.
Da die Gewebestücke eine Größe von etwa 5x5 cm besaßen und die retrograde
Markierung der Neurone mit einer Geschwindigeit von 6 mm/Tag abläuft (Angabe
des Herstellers, Eugene Oreg., USA), wurden die Gewebe über einen Zeitraum von
86
fünf Tagen kultiviert. Während bei Pansen und Haube eine Kultivierung über diesen
Zeitraum gelang, traten bei der Schlundrinne häufig Probleme auf. Bei einigen
Präparaten gelang es nicht, die Vitalität des Gewebes während der Kulturperiode
aufrechtzuerhalten. Eine mögliche Ursache hierfür kann in der Dicke des Gewebes
liegen. Da die vollständige Schlundrinne einschließlich der Lippen kultiviert wurde,
besaßen die Präparate deutlich dickere Muskelschichten als die von Pansen und
Haube. Dies bedeutete eine vermehrte Stoffwechselintensität und führte vermutlich
zu
starken
Änderungen
des
pH-Werts,
die
die
Vitalität
des
Gewebes
beeinträchtigten. Außerdem waren teilweise Kontaminationen der Gewebe mit
Bakterien oder Hefen vorhanden. Dies kann wahrscheinlich auf Bindegewebsreste,
die der Schlundrinne nach ihrer Entnahme aus dem Vormagenkomplex anhafteten,
zurückgeführt werden. Dadurch bestand bei der Schlundrinne vermutlich eine höhere
Kontamination als bei Pansen und Haube, was dann schließlich zu den genannten
Problemen führte.
5.3.2 Pansen und Haube
5.3.2.1 Projektionscharakteristika
Bezüglich der Anzahl DiI-markierter Neurone bestanden weder im Pansen noch in
der Haube Unterschiede zwischen der Zirkulär- und der Longitudinalmuskulatur.
Auffallend war hierbei aber, dass in der Haube die Anzahl der DiI-markierten
Neurone in beiden Muskelschichten größer zu sein schien als im Pansen. Aufgrund
der großen Standardabweichungen war dieser Unterschied aber statistisch nicht
signifikant. Wie in dieser Studie bereits gezeigt wurde, enthielten die myenterischen
Ganglien der Haube allgemein mehr Neurone als die des Pansens. Dies könnte mit
der höheren Anzahl von Motoneuronen korreliert sein und Ausdruck einer gegenüber
dem Pansen ausgeprägteren intrinsischen Muskelinnervation in der Haube sein.
Die am Pansen des Sauglammes bestehenden Verhältnisse sind mit denen des
adulten Schafes vergleichbar. Auch hier wurden von beiden Muskelschichten aus
eine vergleichbare Anzahl von Neuronen markiert, die aber insgesamt höher war als
beim Sauglamm (PFANNKUCHE et al. 2002a). Beim Vergleich der Neuronenanzahl
muss allerdings berücksichtigt werden, dass die zur Markierung der Muskelneurone
verwendeten Gewebestücke beim Sauglamm und beim adulten Schaf etwa die selbe
Größe besaßen. Das bedeutet, dass beim Sauglamm der ventrale Pansensack fast
vollständig als Gewebeprobe zum retrograden Tracing verwendet wurde, während
87
beim adulten Tier nur ein Bruchteil dieses Bereiches untersucht wurde. Weiterhin
wurden beim erwachsenen Tier im Unterschied zum Lamm insgesamt drei DiI-Beads
auf die Muskulatur appliziert, so dass die Applikationsstelle hier größer war. Da für
beide Muskelschichten des Sauglammes weniger Muskelmotoneurone markiert
wurden, wäre es möglich, dass die intrinsische Innervation der Pansenmuskulatur in
dieser Phase der Vormagenentwicklung noch nicht abgeschlossen ist.
Bezüglich der Projektionslängen der Neurone bestanden ebenfalls Ähnlichkeiten
zwischen beiden Vormagenkompartimenten sowie zwischen Sauglamm und adultem
Schaf (PFANNKUCHE et al. 2002a). In der Zirkulärmuskulatur waren die
Projektionslängen entlang der Verlaufsrichtung der Muskelfasern jeweils größer als
dies
in
der
Longitudinalmuskulatur
der
Fall
war.
Dies
zeigt,
dass
die
Zirkulärmuskulatur von Neuronen innerviert wird, die ihr direkt anliegen, bzw. deren
Axone dem Verlauf der Muskelfasern folgen. Dieses Projektionsverhalten ist auch für
die Zirkulärmuskelschicht des Magens und des Darms beim Monogastrier
beschrieben worden (BROOKES et al. 1998; PFANNKUCHE et al. 1998; BROOKES
2001b). In der Längsmuskulatur von Pansen und Haube dagegen projizierten die
markierten Neurone nicht entlang der Längsmuskelrichtung. Sie waren um die
Applikationsstelle verteilt, ohne eine besondere Anordnung erkennen zu lassen.
Während dies auch für die Longitudinalmuskulatur des adulten Pansens zutrifft
(PFANNKUCHE et al. 2002a), wurde im Magen des Meerschweinchen auch in dieser
Muskelschicht eine Orientierung der Neurone an der Verlaufsrichtung festgestellt
(MICHEL et al. 2000).
5.3.2.2 Neurochemischer Kode der DiI-markierten Neurone
An der Innervation des Retikulorumen waren Neurone aller drei zuvor beschriebenen
Kodierungen beteiligt. Die prozentualen Anteile der einzelnen Populationen
unterschieden sich hierbei aber von denen der allgemeinen Kodierung. So war
innerhalb der DiI-markierten Neurone der Anteil nitrerger Neurone proportional
höher. Während cholinerge und nitrerge Neurone in den myenterischen Ganglien des
Pansens allgemein im Verhältnis 4,8:1 (Haube: 8,8:1) vorliegen, beträgt dieses
Verhältnis innerhalb der DiI-markierten Muskelneurone in beiden Muskelschichten
1,9:1 (Haube: Zirkulärmuskelneurone 4,6:1; Längsmuskelneurone 2,3:1). Der Anteil
der rein cholinergen Neurone war bei der Innervation der Muskulatur verhältnismäßig
geringer als bei der allgemeinen Kodierung. Während im Pansen und in der Haube
88
generell mehr myenterische Neurone für ChAT/- als für NOS/VIP kodierten, war der
Anteil der rein cholinergen Population bei den Muskelmotoneuronen in beiden
Muskelschichten des Pansens sowie in der Längsmuskulatur der Haube signifikant
geringer als der der nitrergen Population.
Insgesamt besaß die Mehrheit der Muskelmotoneurone beider Muskelschichten in
Pansen und Haube die Kodierung ChAT/SP, was den vom Pansen des adulten
Schafes bekannten Verhältnissen entspricht (PFANNKUCHE et al. 2002a). In
funktionellen Studien wurde bereits gezeigt, dass SP und Azetylcholin eine
kontraktile Wirkung auf die glatte Vormagenmuskulatur besitzen (DUNCAN 1954;
SANFORD 1958; VEENENDAAL et al. 1982; WONG u. MCLEAY 1988). Es kann
daher davonausgegegangen werden, dass die Population ChAT/SP exzitatorische
Muskelmotoneurone darstellt.
Im Unterschied zum Pansen des adulten Schafes wurden beim Sauglamm sowohl im
Pansen als auch in der Haube Neurone mit DiI markiert, die nur für ChAT kodierten.
Beim adulten Tier konnten keine Projektionen dieser Neuronenpopulation zur
Muskulatur nachgewiesen werden. Als mögliche Funktion der rein cholinergen
Neurone wurden beim adulten Schaf Projektionen zum Epithel oder zu anderen
Neuronen vermutet (PFANNKUCHE et al. 2002a). Im Pansen des Sauglammes lag
der Anteil der rein cholinergen, DiI-markierten Neurone in der Zirkulärmuskulatur bei
2 ± 2% (Längsmuskulatur 4 ± 4%) und war somit deutlich kleiner als der der beiden
anderen Populationen. Diese Population scheint daher für die Muskelinnervation des
Pansens eher von untergeordneter Bedeutung zu sein. Allgemein ist die Population
ChAT/- im Pansen des adulten Schafes kleiner als beim Sauglamm (PFANNKUCHE
et al. 2002a). Wie anfangs erwähnt, ist es möglich, dass die Synthese von SP in
einigen Neuronen erst im Verlauf der Vormagenentwicklung beginnt, was die
Abwesenheit rein cholinerger Muskelprojektionen im Pansen des adulten Tieres
erklären könnte.
In der Haube des Sauglammes war der Anteil der rein cholinergen Muskelneurone
höher als im Pansen und entsprach in der Zirkulärmuskulatur fast dem der nitrergen
Neurone. Dies deutet auf eine größere Wichtigkeit der rein cholinergen Population für
die Muskelinnervation in der Haube hin. Möglicherweise ist auch der hier allgemein
größere Anteil dieser Population ein Hinweis hierauf. Die Innervation der Muskulatur
durch rein cholinerge Neurone ist auch für den Magen des Meerschweinchens
beschrieben (PFANNKUCHE et al. 1998; MICHEL et al. 2000).
89
Neben den cholinergen Neuronen projizierten auch zu einem großen Teil VIPerge
Neurone zu den Muskelschichten von Pansen und Haube. Da zuvor gezeigt wurde,
dass VIP und NOS kolokalisiert exprimiert werden, können diese Muskelneurone
auch als nitrerg bezeichnet werden. Sowohl für VIP als auch für Stickstoffmonoxid
wurde eine relaxierende Wirkung auf die Muskulatur von Pansen und Haube bereits
nachgewiesen (DENAC et al. 1987; SCHNEIDER u. EADES 1998). Dies zeigt, dass
auch inhibitorisch wirkende Neurone an der Muskelinnervation des Retikulorumen
beteiligt sind.
Während sich in einigen Bereichen des Magendarmtrakts die Innervation der
Zirkulär- und der Längsmuskelschicht deutlich voneinander unterscheiden, war dies
für Pansen und Haube nicht der Fall. So bestanden bezüglich der Anteile der
Populationen keine Unterschiede zwischen den Muskelschichten. Auch am Pansen
des adulten Schafes projizierten sowohl cholinerge als auch nitrerge Neurone zur
Zirkulär- und Längsmuskulatur (PFANNKUCHE et al. 2002a). Vom Labmagen des
Rindes dagegen ist bekannt, dass die Longitudinalmuskulatur fast ausschließlich
durch cholinerge Neurone innerviert ist (PFANNKUCHE et al. 2002b). Am
einhöhligen Magen des Meerschweinchens dagegen ist das Verhältnis cholinerger
und nitrerger Neurone in beiden Muskelschichten ähnlich (MICHEL et al. 2000). Im
Darm
wiederum
sind
deutliche
Unterschiede
vorhanden.
Während
die
Zirkulärmuskulatur zu etwa gleichen Teilen cholinerg und nitrerg innerviert ist
(BROOKES et al. 1991), sind über 97% der Neurone, die zur Longitudinalmuskulatur
projizieren cholinerg (BROOKES 2001a).
Ein deutlicher Unterschied gegenüber den Projektionsmustern am Magendarmtrakt
monogastrischer Tiere ist das Fehlen polarisierter Projektionen am Vormagen. Das
an der Zirkulärmuskulatur ausgeprägte Projektionsverhalten exzitatorischer und
inhibitorischer Neurone in orale bzw. aborale Richtung wurde bisher bei
verschiedenen Spezies beschrieben (BROOKES et al. 1991; PORTER et al. 1997).
Es stellt die neuronale Grundlage für Motilitätsmuster wie den peristaltischen Reflex
dar (BROOKES 2001a). Auch beim Rind wurden in der Zirkulärmuskulatur des
Labmagens
polarisierte
Projektionen
der
myenterischen
Neurone
gefunden
(PFANNKUCHE et al. 2002b). Im einhöhligen Magen ist dieses polarisierte
Projektionsverhalten sogar in beiden Muskelschichten ausgebildet (MICHEL et al.
2000).
90
Das Fehlen dieser Polarität am Vormagen sowohl beim Sauglamm wie auch beim
adulten Schaf verdeutlicht, dass sich die hier stattfindene Motorik deutlich von der
des Labmagens bzw. von der des einhöhligen Magens und des Darms
unterscheidet. Während im Darm der peristaltische Reflex den Transport der Ingesta
in aborale Richtung steuert, findet im Retikulorumen eine Durchmischung des
Vormageninhalts statt. Die hierbei ablaufenden motorischen Muster unterscheiden
sich von denen des Darms und scheinen daher mit unterschiedlichen intrinsischen
Innervationscharakteristika korreliert zu sein.
5.3.2.3 Funktionelle Bedeutung der intrinsischen Innervation im Retikulorumen
Funktionelle
Untersuchungen,
in
denen
Muskelstreifen
aus
verschiedenen
Vormagenbereichen elektrisch stimuliert wurden, ließen die Existenz cholinerger und
nichtcholinerger
exzitatorischer
sowie
nichtadrenerger
inhibitorischer
Nerven
innerhalb der Muskulatur vermuten (TANEIKE u. OHGA 1975; VASSILEVA et al.
1978; WONG u. MCLEAY 1988). Die in dieser Arbeit gezeigten Projektionen
cholinerger, SPerger und nitrerger Neurone zur Muskulatur bestätigen die
Ergebnisse dieser funktionellen Untersuchungen.
Zur physiologischen Bedeutung der intrinsischen Vormageninnervation in vivo
können lediglich Vermutungen angestellt werden. So ist zur Erzeugung und
Steuerung der typischen Vormagenmotorik zwar eine extrinsische Innervation durch
den Nervus vagus notwendig, gleichzeitig ist aber auch eine pathologische
Veränderung der myenterischen Innervation mit funktionellen Störungen der Motorik
verbunden (GROENEWALD u. BOOTH 1992a). Bereits von GREGORY (1982)
wurde vermutet, dass die physiologischerweise vorhandene Motilität des Vormagens
durch das Zusammenspiel zentraler, extrinsischer und lokaler, intrinsischer Nerven
entsteht. Möglicherweise übernehmen die myenterischen Muskelneurone hierbei die
Funktion, den Tonus der Vormagenmuskulatur zu kontrollieren. Während SP in vitro
zur Kontraktion glatter Pansenmuskulatur führte, wurde in vivo eine dosisabhängige
Hemmung der Pansenkontraktionen durch SP festgestellt (VEENENDAAL et al.
1982). Als Ursache hierfür wurde angenommen, dass SP lokal den Tonus der
Muskulatur steigert und damit die intramuskulären Spannungsrezeptoren aktiviert,
was dann reflektorisch zu einer Hemmung der extrinsisch bedingten Kontraktionen
führt (VEENENDAAL et al. 1982).
91
5.3.2.4 Mögliche weitere Funktionen myenterischer Vormagenneurone
Obwohl Neurone aller drei Populationen (ChAT/-, ChAT/SP, NOS/VIP) zur
Muskulatur projizierten, können Projektionen zu anderen Zielgeweben und damit
auch weitere Funktionen der Neurone nicht ausgeschlossen werden. Ein Teil der
Nerven könnte auch Sensoren oder Interneurone darstellen und zum Epithel, zu
Blutgefäßen oder zu anderen Neuronen projizieren.
Der
verhältnismäßig
geringe
Anteil
der
Population
ChAT/SP
an
der
Muskelinnervation läßt darauf schließen, dass gerade diese Neuronenpopulation
weitere Funktionen im Vormagen erfüllt. Beim Rind konnte das Vorkommen von SP
immunreaktiven Nervenfasern im Epithel von Pansen und Haube gezeigt werden
(KITAMURA et al. 1993). Obwohl SP positive Zellkörper in der Mukosa dieser
Vormagenkompartimente nachweisbar waren, kann nicht ausgeschlossen werden,
dass die intraepithelialen Fasern auch von myenterischen oder extrinsischen
Neuronen stammen könnten (KITAMURA et al. 1993). Da SP häufig in sensorischen
Nerven
des
Gastrointestinaltrakts
nachgewiesen
werden
konnte
und
freie,
intraepitheliale Nervenfasern häufig sensorische Funktionen besitzen (BORNSTEIN
et al. 1989), wurde auch für die im Vormagenepithel nachgewiesenen Fasern eine
solche Funktion vermutet (KITAMURA et al. 1993). Mögliche Reize für die SPergen
Fasern könnten chemische oder mechanische Stimuli am Epithel darstellen
(KITAMURA et al. 1993). Für die Existenz von intrinsischen sensorischen Neuronen
sprechen auch die Ergebnisse funktioneller Untersuchungen, die an vagotomierten
Schafen durchgeführt wurden. Hier wurde gezeigt, dass die Vormagenmotorik durch
niedrige pH-Werte gehemmt und durch taktile Stimulation des Epithels gesteigert
werden kann (GREGORY 1984).
Desweiteren war beim vagotomierten Schaf die Motilität des Retikulorumens vom
Grad seiner Dehnung abhängig (GREGORY 1984). So war bei geringer Füllung des
Pansens keine Aktivität der Muskulatur vorhanden. Erst mit Erreichen eines
gewissen Schwellenwertes war eine Muskelaktivität nachweisbar, die sich mit
steigendem Volumen verstärkte (GREGORY 1984). Daraus kann geschlossen
werden, dass in der Muskulatur außer motorischen Fasern auch sensorische
intrinsische Nerven exisitieren müssen. In der vorliegenden Studie wurde Neurone
markiert, die zur Muskulatur projizieren. Ob alle dieser Neurone tatsächlich
motorische oder aber eventuell auch sensorische Funktionen besitzen, bleibt zu
klären.
92
Generell enhält das ENS neben myenterischen Neuronen mit sensorischer und
motorischer
Funktion
auch
Interneurone
(COSTA
et
al.
1991).
Beim
Meerschweinchen wurde beschrieben, dass vorwiegend cholinerge Neurone zu
anderen Nervenzellen projizieren und damit Interneurone darstellen (REICHE et al.
2000; BROOKES 2001b). Wie Muskelneurone können auch Interneurone anhand
ihrer Projektionsrichtungen in aszendierende und deszendierende Neurone unterteilt
werden. Im Magen und im Dünndarm existieren jeweils eine Klasse von
aszendierenden und mehrere Klassen von deszendierenden Interneuronen.
Während die aszendierenden cholinergen Interneurone im Magen Calbindin
kolokalisieren (REICHE et al. 2000), synthetisieren sie im Dünndarm unter anderem
auch SP und Enkephalin (STEELE et al. 1991; BROOKES 2001b). Bei den
deszendierenden
Interneuronen
des
Magens
werden
zwei
cholinerge
(ChAT/Calbindin und ChAT/NPY) und eine nitrerge Population (NOS/Calbindin)
unterschieden (REICHE et al. 2000). Im Dünndarm existieren insgesamt drei
cholinerge und eine nitrerge, VIPerge Klasse von deszendierenden Interneuronen
(STEELE et al. 1991; BROOKES 2001b).
Da der myenterische Plexus von Pansen und Haube einen großen Anteil cholinerger
Neurone enthält, deren Axone scheinbar nicht zur Muskulatur projizieren, ist es
möglich, dass diese Neurone Verbindungen zu anderen Neuronen bilden. Ob die
neurochemisch definierten Interneuronenpopulationen des Meerschweinchen aber
denen des Vormagens entsprechen, bleibt fraglich. Wie in dieser Arbeit beschrieben,
ist die Population Calbindin positiver Neurone im Retikulorumen des Schafes
erheblich kleiner als im Magendarmtrakt des Meerschweinchens (FURNESS et al.
1990, REICHE et al. 1999). Dies bedeutet, dass zumindest der Anteil der Calbindin
positiven Interneurone beim Schaf deutlich geringer wäre. Weiterhin ist in einer
Klasse der deszendierenden Interneurone des Dünndarms neben ChAT auch VIP
nachweisbar (STEELE et al. 1991; BROOKES 2001b). Diese Kolokalisation wurde
weder am Vormagen des Lammes noch des adulten Schafes (PFANNKUCHE et al.
2002a) beobachtet. Die am Vormagen vorhandenen Interneurone scheinen daher
vermutlich andere neurochemische Klassifikationen zu bilden, als dies beim
Meerschweinchen der Fall ist.
93
5.3.3 Schlundrinne
Wie im Retikulorumen wurden auch in der Schlundrinne durch die Applikation von DiI
auf die Muskulatur myenterische Neurone markiert. Die Anzahl markierter Neurone
(4–21 Neurone) war allerdings in beiden Muskelschichten der Schlundrinne deutlich
geringer als in Pansen und Haube. Ein Vergleich von Pansen und Haube zeigte,
dass im Pansen, der generell kleinere Ganglien als die Haube besitzt, auch weniger
Neurone mit DiI markiert wurden als in der Haube. Da in der Schlundrinne die
Ganglien am kleinsten sind und die geringste Anzahl DiI-Neurone vorhanden war,
könnte ein Zusammenhang zwischen der Gangliongröße und der Anzahl von
Muskelneuronen vermutet werden. Andererseits stellt sich die Frage, ob in der
Schlundrinne tatsächlich so wenige Neurone zur Muskulatur projizieren, oder ob
andere Ursachen zu einer verminderten Aufnahme des DiI geführt haben.
Möglicherweise haben die bereits beschriebenen, nicht optimalen Kulturbedingungen
zu einer eingeschränkten Markierung von Neuronen geführt. Weiterhin ist es
denkbar, dass bei der Entnahme der Schlundrinne aus dem Vormagensystem und
ihrer anschließenden Präparation Nervenbahnen verletzt wurden, so dass der
axonale Transport des DiI nicht mehr möglich war.
Die in der Literatur vorliegenden Ergebnisse anderer Tracingstudien sprechen eher
dafür, dass methodische Ursachen zu der geringen Anzahl von DiI-gefärbten
Neuronen geführt haben. So konnten in verschiedenen gastrointestinalen Bereichen
und bei verschiedenen Spezies stets mehr Muskelneurone markiert werden als in der
Schlundrinne des Sauglammes. Im Magen des Meerschweinchens beispielsweise
liegt die Anzahl bei über 100 Neuronen (BROOKES et al. 1998; PFANNKUCHE et al.
1998; MICHEL et al. 2000). Im Kolon des Menschen wurden 70 Neurone markiert,
die zur Zirkulärmuskulatur projizieren (PORTER et al. 1997). Im unteren
Ösophagussphinkter führte die Applikation von drei DiI-Beads zur Markierung von
rund 130 Muskelneuronen (BROOKES et al. 1996). Allerdings wurden in dieser
Studie Präparate, in denen weniger als 10 Neurone DiI-markiert waren, von der
Auswertung ausgenommen. Als Ursache wurde hier ein ungenügender Kontakt
zwischen der Muskulatur und dem applizierten DiI-Bead angenommen (BROOKES
et al. 1996).
Die zur Zirkulär- und Längsmuskulatur der Schlundrinne projizierenden Neurone
stammten aus allen zuvor definierten Populationen. Anders als in Pansen und Haube
94
entsprachen hier die prozentualen Anteile der einzelnen Kodierungen denen der
allgemeinen Populationsgrößen. So beträgt der Anteil der Population NOS/VIP an
der
Gesamtpopulation
45%,
bei
den
DiI-markierten
Neuronen
beider
Muskelschichten besaßen 39% diese Kodierung. Auch der Anteil der Population
ChAT/SP ist bei den Muskelneuronen (26%) mit der allgemeinen Größe dieser
Population vergleichbar (25%). Auch rein cholinerge und rein nitrerge Neurone (9%
bzw. 17%) projizierten zur Schlundrinnenmuskulatur. Mit Ausnahme der rein
nitrergen Population waren bezüglich der Populationsgrößen keine Unterschiede
zwischen den beiden Muskelschichten vorhanden. Während in der Längsmuskulatur
22%
der
Muskelneurone
die
Kodierung
NOS/-
besaßen,
wurden
in
der
Zirkulärmuskulatur keine Neurone dieser Population markiert.
Die räumlichen Anordnung der DiI-positiven Neurone zeigte, dass die meisten aboral
der
Applikationsstelle
lokalisiert
waren
und
damit
eine
aszendierende
Projektionsrichtung besaßen. Auch von anderen Spezies ist bekannt, dass häufig
mehr aszendierende als deszendierende Projektionen vorhanden sind. So ist im
Fundus und im Korpus des Meerschweinchenmagens der Anteil aszendierender
Neurone mit 69% bzw. 63% höher als der der deszendierenden Neurone
(BROOKES et al. 1998; PFANNKUCHE et al. 1998).
Aufgrund der insgesamt geringen Anzahl von Präparaten und Neuronen kann über
die beschriebenen Projektionsmuster keine allgemeingültige Aussage getroffen
werden. Trotz der geringen Neuronenanzahl ist aber davon auszugehen, dass es
sich bei den DiI-markierten Nervenzellen um exzitatorische bzw. inhibitorische
Muskelneurone handelt. Für Azetylcholin und SP wurde bereits eine exzitatorische
Wirkung an der Schlundrinnenmuskulatur von Mastkälbern nachgewiesen. Beide
Substanzen verursachten hier konzentrationsabhängig Kontraktionen an isolierten
Muskelstreifen (OERTLE 1988; MARTI 1988). Die relaxierende Wirkung von
Stickstoffmonoxid und VIP auf die Muskulatur der Schlundrinne wurde ebenfalls in Invitro-Studien nachgewiesen (DENAC et al. 1990; BARAHONA et al. 1998). Im
Vergleich mit dem Retikulorumen fällt in der Schlundrinne eine verhältnismäßig
stärkere Beteiligung der nitrergen und VIPergen Neurone an der Muskelinnervation
auf. Dies könnte Ausdruck des speziellen Motilitätsmusters der Schlundrinne sein. Es
ist möglich, dass die während des Schlundrinnenreflexes stattfindende Relaxation
des Bodens durch die Projektionen inhibitorischer Neurone zur Muskulatur vermittelt
wird.
95
6. Zusammenfassung
Motorische Innervation des Vormagens durch das enterische Nervensystem
beim Lamm
Corinna Rösch
Veterinär-Physiologisches Institut, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig
August 2003
119 Seiten, 17 Abbildungen, 16 Tabellen, 204 Literaturangaben
Ziel dieser Studie war es, die intrinsische Innervation durch das enterische
Nervensystem in den funktionell unterschiedlichen Vormagenbereichen Pansen,
Haube und Schlundrinne beim Saug- und Mastlamm zu charakterisieren.
Im ersten Teil der Arbeit wurden grundsätzliche Innervationsmerkmale wie die
neurochemischen Kodierung der myenterischen Neurone ermittelt. Im zweiten Teil
wurde beim Sauglamm untersucht, ob an der Innervation der Vormagenmuskulatur
myenterische Neurone mit spezifischer neurochemischer Kodierung beteiligt sind.
Beiden
Fragestellungen
wurde
durch
die
Untersuchung
von
kultivierten
Gewebeproben aus Pansen, Haube und Schlundrinne nachgegangen. Zur
Identifizierung der Muskelneurone wurde in Verbindung mit der Gewebekultur eine
retrograde Tracingmethode mit dem Fluoreszenzfarbstoff 1,1`-Didodecyl-3,3,3',3'Tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat (DiI) angewandt.
Zur Bestimmung der neurochemischen Kodierung wurden die Neurone auf ihre
Immunreaktivität für Cholinazetyltransferase (ChAT), Stickstoffmonoxidsynthase
(NOS), Substanz P (SP) und Vasoaktives Intestinales Peptid (VIP) untersucht. Mit
Hilfe dieses Ansatzes konnten die Populationen ChAT/SP, ChAT/-, NOS/VIP und
NOS/- ermittelt werden. Die prozentualen Anteile der einzelnen Populationen wiesen
dabei sowohl lokalisations- als auch altersabhängige Unterschiede auf. Während im
Pansen und in der Haube des Sauglammes die meisten Neurone eine cholinerge
Kodierung besaßen (Pansen: ChAT/SP 63% der Gesamtneuronenpopulation,
ChAT/- 19%, NOS/VIP 17%, NOS/- <1%; Haube: ChAT/SP 64%, ChAT/- 24%,
NOS/VIP 10%, NOS/- <1%), war in der Schlundrinne des Sauglammes die größte
Population nitrerg (NOS/VIP 45%, NOS/- 17%, ChAT/SP 25%, ChAT/- 13%). In
diesem
Bereich
des
Vormagens
traten
die
stärksten
altersabhängigen
Veränderungen der Populationsgrößen auf. So wies in der Schlundrinne des
96
Mastlammes die Population NOS/VIP einen Anteil von 83% auf. Die Populationen
ChAT/SP und ChAT/- waren nicht mehr nachweisbar. Eine moderate Zunahme der
nitrergen Population war altersabhängig auch im Retikulorumen des Mastlammes
feststellbar (Pansen: ChAT/SP 61%, ChAT/- 13%, NOS/VIP 24%, NOS/- <1%;
Haube: ChAT/SP 62%, ChAT/- 21%, NOS/VIP 17%, NOS/- <1%).
Die Applikation des Farbstoffs DiI auf die Vormagenmuskulatur (retrogrades Tracing)
führte
in
allen
drei
untersuchten
Kompartimenten
zur
Markierung
von
Muskelneuronen. Im Pansen besaßen die DiI-markierten Neurone hauptsächlich die
Kodierungen
ChAT/SP
und
NOS/VIP.
In
der
Zirkulär-
und
in
der
Longitudinalmuskulatur waren 65% der Muskelneurone cholinerg und 35% waren
nitrerg. Auch in der Haube wurden beide Muskelschichten vorwiegend durch
Neurone der Population ChAT/SP innerviert (Zirkulärmuskelschicht: ChAT/SP 66%,
NOS/VIP 18%; Längsmuskelschicht: ChAT/SP 63%, NOS/VIP 30%). Anders als im
Pansen projizierte in der Haube ein größerer Anteil der rein cholinergen Neurone zur
Muskulatur (Haube: Zirkulärmuskelschicht: 16%, Längsmuskelschicht: 7%; Pansen:
2% bzw. 5%). Sowohl im Pansen als auch in der Haube waren die markierten
Muskelneurone beider Muskelschichten zu etwa gleichen Anteilen oral und aboral
von der Applikationsstelle lokalisiert. In der Schlundrinne stammten die markierten
Muskelneurone aus allen vier Populationen. Der prozentuale Anteil der nitrergen
Muskelneurone war hier höher als im Retikulorumen (beide Muskelschichten:
NOS/VIP 39%, NOS/- 17%, ChAT/SP 26%, ChAT/- 9%). Die meisten Muskelneurone
waren
aboral
aszendierende
der
Applikationsstelle
Projektionsrichtung.
lokalisiert
Eine
Polarität
und
der
besaßen
daher
eine
aszendierenden
und
deszendierenden Projektionen konnte dabei in keinem der drei Kompartimente
nachgewiesen werden.
Es konnte somit gezeigt werden, dass im Vormagen myenterische Neurone
unterschiedlicher neurochemischer Kodierungen existieren, die auch zur Innervation
der glatten Muskulatur beitragen. Die prozentualen Anteile der einzelnen
Populationen sind dabei von der Lokalisation und dem Alter und somit auch von der
Funktion der einzelnen Vormagenkompartimente abhängig. Die altersabhängig
veränderten Innervationsmuster weisen auf die Fähigkeit der enterischen Nerven hin,
sich
an
die
physiologischen
Besonderheiten
des
Wiederkäuervormagens
anzupassen. Sie spiegeln somit die neuronale Plastizität wieder.
97
7. Summary
Motor innervation of the forestomach by the enteric nervous system in the
lamb
Corinna Rösch
Institute of Physiology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig
August 2003
119 pages, 17 figures, 16 tables, 204 references
The aim of the study was to characterize the intrinsic innervation in the functionally
different compartments rumen, reticulum and oesophageal groove in the suckling
and fattened lamb. The first part of the study determined general innervation
characteristics such as the neurochemical coding of the myenteric neurons. The
second part was to investigate, whether myenteric neurons with a specific coding are
involved in the innervation of the forestomach muscle layers in the suckling lamb.
Both topics were investigated by the examination of cultured specimens taken from
the rumen, reticulum and oesophageal groove. To identify the muscle neurons, a
tissue culture was used in combination with a retrograde tracing technique with the
fluorescent dye 1,1'-Didodecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat (DiI).
To determine the neurochemical coding, the neurons were tested for their
immunoreactivity against choline acetyltransferase (ChAT), nitric oxide synthase
(NOS), substance P (SP) and vasoactive intestinal peptide (VIP). As a result, the
populations ChAT/SP, ChAT/-, NOS/VIP and NOS/- could be determined. The
percentages of these populations showed localisation- as well as age-dependent
differences. Whereas in the rumen and reticulum of the suckling lamb, the majority of
the neurons had cholinergic coding (rumen: ChAT/SP 63% of all myenteric neurons,
ChAT/- 19%, NOS/VIP 17%, NOS/- <1%; reticulum: ChAT/SP 64%, ChAT/- 24%,
NOS/VIP 10%, NOS/- <1%), the largest population was nitrergic in the oesophageal
groove (NOS/VIP 45%, NOS/- 17%, ChAT/SP 25%, ChAT/- 13%). Age-dependent
modifications of the percentages of the populations mainly occurred in this part of the
forestomach. In the oesophageal groove of the fattened lamb, the population
NOS/VIP increased to 83%. Simultaneously, the populations ChAT/SP and ChAT/could not be detected. A slight age-dependent increase of the nitrergic population
was ascertainable in the reticulorumen of the fattened lamb, too (rumen: ChAT/SP
98
61%, ChAT/- 13%, NOS/VIP 24%, NOS/- <1%; reticulum: ChAT/SP 62%, ChAT/21%, NOS/VIP 17%, NOS/- <1%).
The DiI application onto the forestomach muscle (retrograde tracing) resulted in
labelling myenteric neurons in all three examined compartments. In the rumen, the
DiI labeled neurons mainly encoded ChAT/SP and NOS/VIP. In the circular and
longitudinal muscle layer, 65% of the muscle neurons were cholinergic and 35%
were nitrergic. Also in the reticulum, both muscle layers were predominantly
innervated by neurons of the population ChAT/SP (circular muscle layer: CHAT/SP
66%, NOS/VIP 18%; longitudinal muscle layer: ChAT/SP 63%, NOS/VIP 30%).
Unlike in the rumen, in the reticulum a larger proportion of the purely cholinergic
neurons projected to the muscle (reticulum: circular muscle layer: 16%, longitudinal
muscle layer: 7%; rumen: 2% and 5% respectively). Both in the rumen and in the
reticulum, the identified muscle neurons of each muscle layer were distributed in
about equal parts orally and aborally of the DiI application site. In the oesophageal
groove, the identified muscle neurons belonged to all four populations. In this
compartment, the percentage of the nitrergic muscle neurons was higher than in the
reticulorumen (both muscle layers: NOS/VIP 39%, NOS/- 17%, ChAT/SP 26%,
ChAT/- 9%). The majority of the muscle neurons was located aborally of the
application site. Consequently, these neurons projected in ascending direction. The
ascending and descending projections were polarized in none of the three
compartments.
In conclusion, this study revealed the existence of neurochemically different neurons,
which are involved in the innervation of the smooth muscle of the forestomach. The
percentages of each population depend on the localisation and the age and on the
function of each compartment. The age-dependent innervation patterns show the
ability of the enteric nerves to adapt to the physiological peculiarities of the ruminant
forestomach reflecting the neuronal plasticity.
99
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Danksagung
Bei allen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, möchte ich mich recht
herzlich bedanken. Insbesondere gilt mein Dank:
Herrn Prof. Dr. G. Gäbel:
für die Überlassung des Themas und die jederzeit gewährte Betreuung und
Unterstützung bei der Versuchskonzeption sowie bei der Erstellung des Manuskripts.
Frau Dr. H. Pfannkuche:
für die Unterstützung bei der Durchführung der Versuche und der Auswertung der
Daten, für die Beantwortung aller auftretenden Fragen und für die angenehme
„persönliche“ Betreuung.
Herrn Prof. Dr. M. Schemann und seiner ehemaligen Arbeitsgruppe an der
Tierärztlichen Hochschule Hannover:
für das freundliche Angebot, das Fluoreszenzmikroskop und die weitere technische
Ausrüstung der Arbeitsgruppe zu nutzen.
Frau P. Philipp:
für ihre Hilfsbereitschaft bei der Entnahme und Bearbeitung der Gewebeproben,
darüberhinaus für ihre Unterstützung in allen labortechnischen Angelegenheiten.
Hansi:
für seine Computerkenntnisse
Allen Mitarbeitern des Veterinär-Physiologischen Instituts:
für das angenehme Arbeitsklima und die vielfältigen Hilfestellungen während meiner
Zeit als Doktorandin.
Alex, Inken und Patrick:
für die Gewährung von freier Kost und Logis während der Aufenthalte in Hannover.
Meiner Familie und Stephan:
für die Ermöglichung des Studiums und für die Unterstützung während der
Anfertigung dieser Arbeit.