Industrie-Applikationen

Industrie-Applikationen
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Herstellung monoklonaler Antikörper mittels
Ligation
genetischer Immunisierung
Pipettierschema:
Komponenten
Unter Verwendung eines neuartigen Membrandeckelgefäßes „LidBac“ zur Bakterienanzucht
Sandra Neckermann, Genovac AG
Volumen
geV Vektor
1 µl
ag113
1,5 µl
dH2O
7,5 µl
2x Quick Ligase Buffer (NEB) 10 µl
Einleitung
Anfang der 90er Jahre wurde
die Entdeckung gemacht, dass
man in vivo Zellen mit „nackter“
DNA transfizieren kann und in
Folge eine Immunantwort ausgelöst wird (TANG et al., 1992).
Dieses Verfahren der sogenannten genetischen Immunisierung
beruht auf einem eukaryotischen Expressionsplasmid, welches die für ein Protein kodierende cDNA enthält. Nach Injektion beispielsweise in Maus
gelangt die DNA in eine Wirtszelle, in welcher das Protein exprimiert und eine Immunantwort ausgelöst wird.
Im Vergleich zur klassischen
Immunisierung, bei der eine
Immunantwort durch Injektion
eines Proteins induziert wird,
bietet die genetische Immunisierung zahlreiche Vorteile. Zum
einen ist die Herstellung eines
solchen Expressionsplasmids relativ einfach und schnell, die Lagerung unproblematisch. Zum
anderen fallen keine zeitintensiven Aufreinigungsschritte, die
zusätzlich die Gefahr einer Änderung der Protein-Konformation in sich bergen, an. Des weiteren liegt bei der genetischen
Immunisierung aufgrund der in
vivo Expression das Protein mit
größter Wahrscheinlichkeit in
seiner natürlichen Konformation
vor. Dies ist insbesondere dann
der Fall, wenn es sich um Transmembran- und/oder posttranslational modifizierte Proteine handelt. Dieser Vorteil ist vor allem
für die Herstellung von hochspezifischen und hochaffinen
Antikörpern von Bedeutung und
daher besonders für die klinische Forschung (Diagnostik,
Therapie) interessant.
Die Genovac AG hat eine
Technologie auf Basis der gene-
tischen Immunisierung entwickelt, welche mit hoher Zuverlässigkeit polyklonale Antikörper generiert. Darüber hinaus
wurde ein patentgeschütztes
Verfahren entwickelt, welches
die Identifikation und die Spezifitätstestung monoklonaler Antikörper ermöglicht, ohne das
entsprechende Protein aufreinigen zu müssen.
Abb. 1: Restriktionsanalyse. Das
Gelfoto zeigt das Ergebnis des pUrag113 Verdaus. Die cDNA ag113
wurde erfolgreich vom Vektor pUr
isoliert.
Restriktionsanalyse:
Komponenten
Volumen
pUr-ag113 (50 ng/µl)
10 µl
Puffer P1
2 µl
BSA
0,2 µl
Kpn I (NEB)
1 µl
Xho I (NEB)
1 µl
dH2O
5,8 µl
∑
20 µl
21 µl
Transformation
Material und Methoden:
a) Restriktionsansatz von pUrag113
Vektor: pUr-ag113 (Ursprungsvektor eines Kunden, in dem
die für ein Antigen kodierende cDNA, ag113 vorliegt)
1 µl
∑
Die Ligation erfolgte für 5
Minuten bei Raumtemperatur.
Für die Negativkontrolle wurde
anstelle des ag113 Fragmentes
dH2O eingesetzt.
Ziel
Im folgenden werden die Vorarbeiten für die Immunisierung
von Mäusen mit cDNA beschrieben. Bei den Vorarbeiten
wurde unter anderem die Eignung des Membrandeckelgefäßes LidBac für die Bakterienanzucht untersucht.
Quick Ligase (NEB)
Komponenten
Volumen
geV Vektor (1µg/µl)
3 µl
Puffer P1
2 µl
BSA
0,2 µl
Kpn I (NEB)
2,4 µl
Xho I (NEB)
2,4 µl
dH2O
10 µl
∑
20 µl
Die Transformation der Ligationsansätze erfolgte in XL-1
blue Bakterien (Stratagene) und
wurde nach Herstellerprotokoll
durchgeführt. Vom Transformationsansatz wurden 50 µl auf
LBAmp- Selektionsplatten (Luria
Bertani/ Ampicilin) ausplattiert
und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Bakterienanzucht
Die Bakterienanzucht erfolgte
im Eppendorf LidBac-System,
das aus einem 2,0 ml Safe-Lock
Reaktionsgefäß und einem bakteriendichten, gasdurchlässigen
hydrophoben Membrandeckel
besteht. Das Gefäß wurde ohne
vorheriges Sterilisieren mit 2 ml
LBAmp Medium befüllt. Nach
Nach 1h bei 37° C wurden die
Proben mittels eines 1%igem
TAE-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und die entsprechenden Banden aus dem Gel ausgeschnitten.
Gel Extraktion
b) Restriktionsansatz Expressionsvektor
Vektor: geV-Vektor (hauseigener, patentgeschützter Vektor,
der speziell für genetische
Immunisierungen optimiert
wurde)
Nach Ausschneiden des ag113
und des geV Vektor Fragmentes aus dem Gel, wurde die
DNA mittels des Gel Cleanup
Kits (Eppendorf) extrahiert. Die
Durchführung erfolgte nach
Herstellerangaben.
Abb. 2: Restriktionsanalyse. Das
Gelfoto zeigt das Ergebnis des
Kontrollverdaus. In jeder Spur
befindet sich eine bezüglich der
Schnittstelle und der Größe des
Inserts positive Plasmid-DNA.
BIOspektrum · 5/02 · 8. Jahrgang
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der Inokulation wurden die
LidBac-Gefäße mit ihrem Membrandeckel verschlossen und im
Thermomixer comfort (Eppendorf) bei 1.400 rpm und 37 °C
über Nacht inkubiert.
Plasmidpräperation
Zur Isolierung der Plasmid DNA
wurde der Perfectprep Plasmid
Mini kit (Eppendorf) verwendet. Die Durchführung erfolgte
nach Herstellerangaben.
Sequenzierung
Die Sequenzierreaktionen wurden von der Firma MWG-Biotech mit den geV spezifischen
Primern, geV for und geV rev
durchgeführt.
Transfektion
Die Transfektionen wurden in
einer Säugerzelllinie durchgeführt. Es handelt sich dabei um
eine semiadhärente Zelllinie, die
als Monolayer am Boden spezieller Kulturflaschen wächst. Die
Kultivierung erfolgte im Brutschrank bei 37°C und einer Atmosphäre von 10 % CO2-Gehalt.
Die Säugerzellen wurden unter Verwendung des Transfektionsreagenz Lipofektamin (Invitrogen) nach Herstellerprotokoll in 6 Well-Zellkulturplatten
(Greiner) transfiziert.
Zellmedien: Dulbecco’s MEM
(Biochrom AG) mit 10 % FCS
(PAA Laboratories) und 1 % Penicillin/Streptamycin (Biochrom
AG).
Fluoreszenz-aktivierter
Zellsortierer (FACScan-Analyse)
Die transfizierten und abgelösten Säugerzellen wurden nach
24 Stunden in PBS (Gibco) mit
3 % FCS aufgenommen und auf
eine Zellzahl von 20000 Zellen/µl eingestellt. Von dieser
Zellsuspension wurden pro Probe je 10 µl in eine 96 Well-Mikrotiterplatte (Greiner) pipettiert, anschließend wurden 25 µl
des ersten Antikörpers (c=30
µg/µl in PBS/3% FCS) in jedes
Well dazugegeben. Nach 30 Minuten bei 4 °C wurden die Proben mit PBS/ 3% FCS gewaBIOspektrum · 5/02 · 8. Jahrgang
Abb 3: FACScan-Analyse. Rot :
irrelevanter Antikörper
Grün: relevanter Antikörper
Es zeigt sich eine deutliche
Verschiebung der grünen zur roten
Kurve, d.h. ag113 wird auf der
Säugerzelllinie exprimiert.
viele Kolonien zu identifizieren,
wohingegen auf der Negativplatte keine Kolonien vorhanden
waren.
Diskussion
1.3 Kontroll-Restriktion und Sequenzanalyse
Nach der Plasmidpräparation
wurde ein Kontrollverdau mit
den Enzymen der Klonierungsschnittstellen durchgeführt.
Die Sequenzanalyse von geVag113 Klon 1 ergab, dass die
cDNA keine Mutationen enthält
und korrekt über die entsprechenden Schnittstellen in den
geV Vektor kloniert wurde.
Die ag113 DNA konnte erfolgreich ohne Mutationen in den
geV Vektor kloniert werden.
Für die Bakterienanzucht
konnte das LidBac-System erfolgreich eingesetzt werden.
2. Expressionsanalyse von geVag113 in Säugerzellen
schen. Hierfür wurden pro Well
200 µl PBS/ 3% FCS zugegeben
und die Mikrotiterplatte bei
480 x g und 4°C für 5 Minuten
zentrifugiert. Der Überstand
wurde durch Ausschlagen entfernt. Anschließend wurden in
jedes Well 25 µl des RPE markierten zweiten Antikörper
(c=10 µg /µl in PBS/ 3% FCS)
pipettiert. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten bei 4°C
wurde jede Probe wie oben beschrieben 2x gewaschen. Die
Zellen wurden in 200 µl PBS 3%
FCS resuspendiert und zum
Messen in FACS-Röhrchen (Sarstedt) überführt.
Ergebnisse
1. Klonierung einer Antigen kodierenden cDNA in den geV Vektor
1.1 Restriktionsverdau
Die für ein Antigen kodierende
cDNA (hier: ag 113), muss
zunächst in den für genetische
Immunisierungen optimierten
geV-Vektor kloniert werden.
Hierfür wurde die ag113 cDNA
aus ihrem Ursprungsvektor pUrag113 mittels Verdau mit entsprechenden Restriktionsenzymen und elektrophoretischer
Auftrennung isoliert.
1.2 Ligation und Transformation
Der geV Vektor und die ag113
cDNA wurden nach den unter
Material und Methoden aufgeführten Protokollen ligiert und
transformiert. Auf der entsprechenden LBAmp-Platte waren
Die Expressionsanalyse ist im
Vorfeld der genetischen Immunisierung von großer Bedeutung.
Im Verlauf der Immunisierung
wird das Serum der Mäuse mehrere Male getestet. Dieser Serentest erfolgt mittels FACScanAnalyse auf Zellen, die mit der
cDNA des Antigens transfiziert
wurden. Ist das Serum positiv,
werden die Maus B-Zellen mit
SP210 Zellen fusioniert und
anschließend die spezifischen
Hybridome identifiziert. Ist das
Serum negativ, wird die Immunisierung mit modifizierter Strategie weitergeführt. Aufgrund
dieses Nachweisverfahrens wird
vor dem Start einer Immunisierung die Exprimierbarkeit der
Antigen-cDNA überprüft. Da
die Exprimierbarkeit einer cDNA einen ganz entscheidenden
Schritt im Verlauf des Produktionsprozesses darstellt, würde
bei einem negativen Ergebnis
eine Optimierung der Transfektion der Expression durchgeführt.
Für die Expressionsanalyse
von geV-ag113 wurden Säugerzellen chemisch transfiziert und
die Expression im FACS analysiert. Abbildung 3 zeigt die sehr
gute Exprimierbarkeit der geVag113 DNA.
1. Klonierung der ag113 DNA in
den geV Vektor
2. Expressionsanalyse
Es konnte gezeigt werden, dass
sich die geV-ag113 DNA sehr gut
in den verwendeten Säugerzellen exprimieren lässt (siehe Abb.
3). Daher sind keine weiteren
Optimierungsschritte für eine
verbesserte Transfektion/Expressionsstrategie nötig. Die
DNA kann direkt zur genetischen Immunisierung eingesetzt
werden.
Literatur
Tang DC, DeVit M, Johnston SA. Genetic immunization is a simple method for
eliciting an immune response. Nature
1992; 356: 152–154
Korrespondenzadresse:
Genovac AG
Waltershofener Str. 17
D-79111 Freiburg
Tel.: 0761/45636-0
[email protected]
www.genovac.com