Untersuchung zur Seroprävalenz von Antikörpern gegen Coxiella
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Universitätsklinik Ulm Zentrum für Innere Medizin Klinik für Innere Medizin III Sektion Infektiologie und Klinische Immunologie Prof. Dr. P. Kern Untersuchung zur Seroprävalenz von Antikörpern gegen Coxiella burnetii bei Angehörigen der Bundeswehr in Stetten am kalten Markt Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Peter Stefan Kilb aus Stuttgart 2007 Amtierender Dekan : Prof. Dr. Klaus-Michael Debatin 1. Berichterstatter : Prof. Dr. Peter Kern 2. Berichterstatter : Prof. Dr. Dr. Peter Kimmig Tag der Promotion : 29. Mai 2008 meiner Familie I Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis……………………….………………………………………… II 1 2 3 4 Einleitung ........................................................................................................1 1.1 Allgemeine Einleitung...............................................................................1 1.2 Die Erkrankung Q-Fieber .........................................................................3 1.3 Diagnostik ................................................................................................4 1.4 Epidemiologie ..........................................................................................4 1.5 Ausbruch in Stetten am kalten Markt / Situation vor Ort...........................9 1.6 Fragestellung .........................................................................................11 Material und Methoden..................................................................................12 2.1 Untersuchungspopulation ......................................................................12 2.2 Untersuchungsablauf .............................................................................13 2.3 Untersuchungsmaterial ..........................................................................14 2.4 Serologische Untersuchungen ...............................................................16 2.5 Auswertung der Fragebögen und statistische Verfahren .......................21 Ergebnisse ....................................................................................................23 3.1 Demographische Angaben zum untersuchten Kollektiv .........................23 3.2 Fragebogenangaben zu möglichen Risikofaktoren ................................27 3.3 Statistisch relevante Risikofaktoren .......................................................30 3.4 Ergebnisse der serologischen Tests auf Coxiella burnetii......................33 3.5 Prävalenz spezifischer Antikörper gegen C. burnetii..............................36 Diskussion.....................................................................................................45 4.1 Diskussion der Methoden.......................................................................45 4.2 Diskussion der Ergebnisse.....................................................................49 4.3 Interpretation der Ergebnisse.................................................................54 4.4 Schlussfolgerungen und Ausblick ..........................................................56 5 Zusammenfassung........................................................................................62 6 Literaturverzeichnis .......................................................................................64 Anhang.................................................................................................................71 Danksagung .........................................................................................................84 Tabellarischer Lebenslauf ....................................................................................85 II Abkürzungsverzeichnis C. burnetii Coxiella burnetii ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay ICD-10 International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems (engl.) (Internationale statistische Klassifikation der Krankheiten und verwandter Gesundheitsprobleme", 10. Revision) IfSG Infektionsschutzgesetz IgA Immunglobulin A IgG Immunglobulin G IgM Immunglobulin M IIFT Indirekter Immunfluoreszenztest KBR Komplementbindungsreaktion KI Konfidenzintervall (95%) LGA Landesgesundheitsamt Baden-Württemberg, Stuttgart Mio. Million PCR Polymerasekettenreaktion Ph.1 Phase 1 – Antigen von Coxiella burnetii Ph.2 Phase 2 – Antigen von Coxiella burnetii Q-Fieber query fever (engl.) (unklares Fieber) RKI Robert Koch-Institut, Berlin Stetten a.k.M. Stetten am kalten Markt 1 1 Einleitung 1.1 Allgemeine Einleitung Beim Q-Fieber (Synonyme sind Krim-Fieber, Balkan-Grippe, Pneumorickettsiose) handelt es sich um eine Zoonose, die 1937 von E. H. Derrick in Australien erstmals beschrieben wurde. Ihr Erreger, Coxiella (C.) burnetii, ist ein obligat intrazelluläres, kleines, unbewegliches, polymorphes, ovales bis stäbchenförmiges, gramnegatives Bakterium. Die Stäbchenformen sind 0,2-0,4 µm breit und 0,4-1 µm lang. Aufgrund neuerer Gen-Sequenz-Analysen wird C. burnetii heute in die Nähe der Legionellen (Ordnung Legionellales der γProteobacterien) eingeordnet und stellt die einzige Spezies in der Familie der Coxiellaceae dar. Als engste Verwandte gelten Legionella pneumophila (ein fakultativ intrazellulärer Erreger beim Menschen) und Rickettsiella grylli (ein intrazellulärer Erreger bei Arthropoden) [68, 30]. Einzige Zielzellen für C. burnetii sind bei Mensch und Tier die Zellen des Monozyten-Makrophagen-Systems, in denen der Erreger das saure Milieu (pH 4,7 – 5,2) der Phagolysosomen für seine Stoffwechselaktivität und zur Vermehrung durch Zweiteilung mit einer Verdoppelungszeit von etwa 12-20 Stunden benötigt [2, 68]. Ein Charakteristikum für C. burnetii ist, dass der Erreger durch Veränderungen an der Lipopolysaccharid (LPS)-Membran in zwei antigenen Formen (Phase 1 und Phase 2) existieren kann, was dem Wechsel zwischen Glatt- und Rauhform der Enterobacteriaceen ähnelt und Virulenz und Persistenz beeinflusst. Phase 1 stellt die natürliche hochvirulente Form in Mensch, Tier und den Arthropoden-Vektoren dar und entspricht der Glatt-Form der Enterobakterien. Phase 2 ist die weniger virulente Form, entspricht der Rauh-Form und entwickelt sich nach häufigen Passagen in nicht immunkompetenten Wirten wie Zellkulturen oder befruchteten Hühnereiern. Der Phasenwechsel gilt als irreversibel [16, 30]. Da Antikörper gegen beide Phasen serologisch nachweisbar sind, tragen sie zu Unterscheidung von akuter und chronischer Erkrankung bei, wobei der Erreger in Phase 1 in den Zielzellen überleben kann und somit Antikörper gegen Phase 1 typisch für chronische Verläufe sind [16]. 2 C. burnetii durchläuft einen Entwicklungszyklus, in dem der Erreger in mindestens zwei morphologisch differenzierbaren Formen mit unterschiedlichen Eigenschaften auftritt [2, 68]. Insbesondere in den kleinen, sporenähnlichen Extrazellulärformen widersteht C. burnetii in hohem Maße UV-Bestrahlung, Hitze, Austrocknung, Druck sowie osmotischem und oxidativem Stress [68]. Besonders hoch ist die Widerstandsfähigkeit gegen Austrocknung: Erreger aus Zeckenkot, wie sie an Schafwolle oder in Staub vorkommen, bleiben 1-2 Jahre infektiös. In trockener Erde überleben die Erreger 5 Monate, bei 4-6 °C bis zu 9 Monaten [5]. Neben der außerordentlich hohen Tenazität zeichnet sich C. burnetii durch eine erhebliche Infektiosität aus. Man geht davon aus, dass 1-10 Erreger für eine Infektion ausreichen, eine höhere Infektionsdosis verkürzt die Inkubationszeit [41]. Eine weitere Besonderheit des Erregers stellt sein breites Wirtsspektrum und das Vorhandensein mehrerer Infektionskreisläufe (beispielsweise in Naturherden und dem sogenannten „Haustierzyklus“) dar. Sind übertragende Tiere selbst infiziert, werden sie als aktive Vektoren bezeichnet. Deren Infektion läuft zumeist subklinisch ab, Coxiellen werden von infizierten Tieren über Exkremente, Milch und Geburtsprodukte ausgeschieden [2, 5]. Demgegenüber spricht man von einer passiven Vektorfunktion, wenn die Tiere ohne selbst erkrankt zu sein lediglich C. burnetii, beispielsweise in infektiösem Zeckenkot, an sich tragen. Dieser kann den Erreger in einer Konzentration bis zu 1011 Coxiellen pro Gramm enthalten und aerogene Infektionen bei Tieren und Menschen verursachen. In Mitteleuropa haben Schafe für diese Form der Erregerfreisetzung die größte Bedeutung, dementsprechend stellt die Schafzecke (Dermacentor marginatus) den wichtigsten Vektor unter den weltweit etwa 50 Zeckenspezies, die Q-Fieber verbreiten, dar [55, 29]. Auch bei anderen landwirtschaftlichen Nutztieren, Wildtieren, Vögeln und klassischen Haustieren wurde der Erreger bereits nachgewiesen [17, 29, 5]. Weltweite Bedeutung hat die Zoonose vor allem bei der Landwirtschaft mit Paarhufern, wo die Erkrankung für ihre Folgen wie Infertilität, Fehlgeburten und Entwicklungsverzögerung bekannt ist [5]. Für den Menschen spielen neben der aerogenen Übertragung durch Inhalation erregerhaltiger Stäube andere Infektionswege wie beispielsweise über 3 kontaminierte Nahrungsmittel eine untergeordnete Rolle [81, 9, 5]. Eine Übertragung von Mensch zu Mensch ist beispielsweise im Rahmen einer Schwangerschaft vertikal auf das Kind möglich, jedoch insgesamt auf seltene Ausnahmefälle beschränkt. Die Möglichkeit einer Übertragung über Blut wird durch die höhere Prävalenz des Erregers unter i.v.-Drogenabhängigen und Dialysepatienten nahe gelegt [55, 5]. 1.2 Die Erkrankung Q-Fieber Die Rate inapperent verlaufenden Infektionen liegt bei etwa 60% [2]. Kommt es nach einer durchschnittlichen Inkubationszeit von 2-3 Wochen zu Symptomen, treten am häufigsten plötzlich hohes Fieber bis 40oC mit Schüttelfrost, starke frontale oder retrobulbäre Kopfschmerzen, Abgeschlagenheit, Myalgien und Husten auf. Die weitaus häufigste Verlaufsform ist dabei die einer selbstlimitierenden grippeähnlichen Erkrankung mit spontaner Ausheilung nach 12 Wochen, nur etwa 2 % der akut Erkrankten bedürfen stationärer Behandlung [41, 55]. Die Vielfalt weiterer beschriebener Symptome bei akutem Q-Fieber ist außerordentlich groß. Im Verlauf einer akuten Infektion kann es zu verschiedenen Organmanifestationen kommen, ein signifikanter Unterschied bezüglich der Prognose fand sich zwischen ihnen nicht. Am häufigsten zeigt sich eine atypische Pneumonie [41, 47]. In der Rekonvaleszenzphase nach einer akuten Infektion wird von einem chronischen Erschöpfungssyndrom berichtet [3]. In etwa 1% - 5% der Fälle entsteht eine chronische Infektion, für die eine Letalität von bis zu 10 % angenommen wird [2, 41, 47]. Entscheidend für eine Chronifizierung des Krankheitsverlaufes sind vor allem Wirtsfaktoren: Betroffen sind nahezu ausschließlich Patienten mit vorgeschädigtem Herzen, Immunsupprimierte, Ältere oder Schwangere [47]. Die Endokarditis macht 60 70 % aller Fälle von chronischem Q-Fieber aus, umgekehrt leiten sich etwa 2-5 % aller Endokarditiden ätiologisch aus dieser Zoonose ab [2, 41, 66, 11]. Neben den kardialen Symptomen sind auch beim chronischen Q-Fieber die allgemeinen klinischen Symptome äußerst vielgestaltig und unspezifisch [41]. Die Therapie des akuten Q-Fiebers ist relativ unkompliziert [19, 40], die der chronischen Infektion hingegen ausgesprochen problematisch und langwierig [48, 64, 11, 57]. 4 Die Einordnung der Erkrankung in den ICD 10 erfolgt unter „A 78 Q-Fieber (Balkangrippe, Infektion durch Rickettsia (Coxiella) burnetii, Query-Fieber)“. Gemäß §7 Abs. 1 Nr. 9 des Infektionsschutzgesetzes (IfSG) wird dem Gesundheitsamt der direkte oder indirekte Nachweis von C. burnetii namentlich gemeldet, soweit er auf eine akute Infektion hinweist. Die genauen Kriterien für die Meldung an das zuständige Gesundheitsamt und die für die weitere Übermittlung an die zuständige Landesbehörde relevante Falldefinition wurden ebenfalls im Infektionsschutzgesetz und durch das Robert Koch-Institut veröffentlicht [55]. 1.3 Diagnostik Am gängigsten ist der indirekte Nachweis durch serologische Tests auf spezifische Antikörper gegen die beiden antigenen Formen von C. burnetii, Phase 1 und 2. Mit ELISA und indirektem Immunfluoreszenztest (IIFT) können darüber hinaus unterschiedliche Immunglobulinklassen nachgewiesen werden. Der 1983 erstmals beschriebene ELISA-Test [13] erlaubt einen qualitativen bzw. semiquantitativen Antikörpernachweis und gilt aufgrund seiner Automatisierbarkeit als typischer Screening-Test beispielsweise im Rahmen von Ausbrüchen. Der IIFT gilt als Referenzmethode in der Serodiagnostik für Q-Fieber, vor allem bei Verlaufskontrollen und zum Ausschluss von Chronifizierungen [30]. Darüber hinaus steht seit 1992 auch die Polymerasekettenreaktion (PCR) für die Q-Fieber – Diagnostik zur Verfügung [72], die über einige Vorteile im Vergleich zu den oben genannten Verfahren verfügt [17]. Mit zunehmenden Kenntnissen über das Genom des Erregers wurden in jüngerer Vergangenheit neue Primersequenzen beschrieben, die einen Nachweis mit hoher Sensitivität und Spezifität ermöglichen [16, 83]. 1.4 Epidemiologie Q-Fieber kommt weltweit vor, lediglich die Antarktis und Neuseeland scheinen hier eine Ausnahme zu sein [25]. Einen Überblick über die den deutschen Gesundheitsämtern gemeldeten Fälle von Q-Fieber verschafft das vom Robert Koch – Institut in Berlin herausgegebene Epidemiologische Bulletin. Die Zahlen der Meldungen aus den Jahren 1996 – 5 2006 sind in Abb. 1 grafisch dargestellt. Die hohen Fallzahlen in bestimmten Jahren -beispielsweise 1999, 2001, 2003 und 2005- korrelieren dabei mit dem Auftreten fallstarker Ausbrüche. Auf diesen Zusammenhang wird im Folgenden gesondert eingegangen. Bei einem Vergleich der veröffentlichten Fallzahlen ist zu berücksichtigen, dass erst mit Einführung des Infektionsschutzgesetzes zum 01.01.2001 eine einheitliche Falldefinition eingeführt wurde Somit sind nur die Meldedaten seit Anfang 2001 direkt miteinander vergleichbar [27]. Tendenziell ist, besonders seit Beginn der Neunziger Jahre, eine Zunahme der Meldungen zu verzeichnen. Bei Untersuchungen an Blutspenderseren aus Hessen wurden 1977 mittels KBR keine spezifischen Antikörper nachgewiesen, wohingegen 1986 in einem ähnlichen Kollektiv 15% positiv mittels ELISA getestet wurden. Auch wenn zu berücksichtigen ist, dass hier verschiedene Verfahren angewandt wurden, legen diese Zahlen doch einen möglichen Anstieg der C. burnetii - Infektionen innerhalb dieser 10 Jahre nahe [67]. Dies unterstreicht auch ein Anstieg der mittleren jährlichen Inzidenz: Für die Zeit zwischen 1979 und 1989 betrug diese 0,8/ 1 Million (Mio.), für die Jahre 1990 – 1999 bereits 1,4 / 1 Million. Innerhalb Deutschlands besteht hierbei ein Süd-NordGefälle, die südlichen Bundesländer wie Baden-Württemberg (4,1 / 1Mio.), Hessen (2,8 / 1 Mio.), Rheinland-Pfalz (0,9 / 1 Mio.) und Bayern (0,8 / 1 Mio.) wiesen zwischen 1979 und 1999 die höchsten jährlichen Inzidenzraten auf [24]. Auch in Baden-Württemberg zeigte sich eine deutliche Zunahme der gemeldeten Q-Fieber - Fälle: In den Jahren 1995, 1996 und 1997 waren dies 10, 9 und 10 Fälle, in den Jahren 1998, 1999 und 2000 bereits 130, 116 und 146 gemeldete Neuerkrankungen [36]. Es ist davon auszugehen, dass die tatsächliche Zahl von Neuerkrankungen deutlich höher liegt, als es die Meldungen an die Gesundheitsämter ausweisen. Vor allem sporadisch auftretende Erkrankungen werden aufgrund des Fehlens pathognomonischer Krankheitszeichen wohl häufig nicht als Infektion mit C. burnetii erkannt. 6 Anzahl der gemeldeten Fälle von Q-Fieber in Deutschland 1996 - 2006 Fälle [n] (Quelle: Robert Koch-Institut, Berlin Epidemiologisches Bulletin) 500 400 300 200 100 0 411 386 290 276 150 206 202 184 111 85 65 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Jahr Abbildung 1 Zahl der gemeldeten Fälle von Q-Fieber in Deutschland 1996-2006 Dargestellt ist die Zahl der Meldungen an deutsche Gesundheitsämter, wie sie vom Robert Koch-Institut (RKI), Berlin im Epidemiologischen Bulletin zusammengefasst wurden [56, 59, 61, 62, 63]. Tendenziell ist eine Zunahme der Meldungen zu verzeichnen. Die hohen Fallzahlen in bestimmten Jahren (1999, 2001, 2003, 2005) korrelieren mit dem Auftreten größerer QFieber-Ausbrüche. Bei einem Vergleich der Fallzahlen ist zu berücksichtigen, dass eine einheitliche Falldefinition erst seit Inkrafttreten des Infektionsschutzgesetzes 2001 besteht. Insofern kommt dem Auftreten von Q-Fieber als Gruppenerkrankung oder als Ausbruch besondere Bedeutung zu. Unter solchen Umständen herrscht bei der Diagnosestellung eine größere Sensibilität, Verdachtsfälle werden eher einer serologischen Diagnostik auf Antikörper gegen C. burnetii zugeführt. Da auch die Zahl dieser Ausbrüche seit 1990 deutlich zugenommen hat, ist anzunehmen, dass die beschriebene Zunahme von Q-Fieber-Fällen der Realität entspricht [24]. Etwa 70 % der in Baden-Württemberg im Jahr 2000 gemeldeten Neuerkrankungen ließen sich vier beobachteten Ausbrüchen zuordnen [36]. Für das Jahr 2001 wird von einem vergleichbaren Anteil (71%) der aus Häufungen stammenden Fälle berichtet, im Jahr 2002 waren es 41% und 2003 81 % der Meldungen, die einem Ausbruchsgeschehen zugerechnet werden konnten [55, 59, 27]. Zu einer Reihe der Ausbrüche fanden umfangreiche Untersuchungen statt, in denen Quelle, Verbreitung und Ausmaß des Ausbruchsgeschehens weiter erforscht wurden. Dies ist insofern von besonderem Interesse, als sich 2003 in 7 Soest und 2005 in Jena zwei der weltweit größten dokumentierten Ausbrüche in Deutschland ereigneten [58, 63]. Ein Teil dieser veröffentlichten Ausbruchsuntersuchungen der letzten 10 Jahre ist in Tab. 1 auszugsweise wiedergegeben. Bei mindestens 24 von über 40 dokumentierten Ausbrüchen in Deutschland zwischen 1947 und 1999 bestand eine ursächliche Verbindung zu Schafen [24, 63], auch bei allen in Tab.1 aufgeführten Ausbrüchen konnte ein Zusammenhang zu Schafen als wahrscheinlichste Infektionsquelle hergestellt werden. Daneben gab es wenige Ausbrüche, in denen andere Tiere eine kausale Rolle spielten, darunter Rinder bzw. Kälber [24, 61], Ziegen [60] und Damwild [51]. Bei den als Reservoir bedeutsamen Paarhufern ergaben sich in den letzten Jahren in Deutschland unterschiedlich hohe Nachweisraten für Coxiella burnetii. Unter den untersuchten Schafen waren bis zu 33% der Einzeltiere und 39 % der Herden positiv [20]. Für Rinder fand sich ein positiver Nachweis in bis zu 12 % der Einzeltiere bzw. 27% der Herden [22]. Unter Zootieren betrug die höchste Nachweisrate der letzten fünf Jahre 41 % [21], bei Ziegen waren es in diesem Zeitraum bis zu 15 % [22]. Neben den regionalen Ausbrüchen hat die Erkrankung vor allem Bedeutung bei beruflich exponierten Schlachthöfen, Personen, Molkereien, der beispielsweise aus häuteverarbeitenden der Landwirtschaft, Industrie und dem veterinärmedizinischen Umfeld. Die Gefährdung der letztgenannten Gruppe wird durch die Infektionen bei Laborpersonal an zwei Forschungseinrichtungen (siehe Tab.1) dokumentiert [52, 53]. Ein besonderes Risiko besteht auch bei einer akuten Infektion während einer Schwangerschaft. Dies gilt sowohl für das Kind (Abort, Frühgeburt, Tod des Neugeborenen) und für die Mutter (häufigere Chronifizierung und Reaktivierung während einer nachfolgenden Schwangerschaft) als auch für die Geburtshelfer [47, 2, 55, 57, 50]. In einzelnen Jahren kann eine jahreszeitliche Häufung der gemeldeten Fälle von Q-Fieber beobachtet werden, wobei sich deren Zeitpunkt unterscheidet: Während etwa in den Jahren 2001 und 2004 eine Bevorzugung von Winter und Frühjahr auffiel, waren es in den Jahren 2002 und 2003 vor allem Frühjahr und Sommer, in denen viele der Meldungen eingingen [62, 56, 59, 27]. 8 Unter den in Deutschland gemeldeten Fällen spielen die im Ausland erworbenen Infektionen eine untergeordnete Rolle [59]. Hinsichtlich des Alters fand sich eine Bevorzugung mittlerer Altersgruppen, während die Inzidenz bei Jüngeren und Älteren geringer ist. Die relativ niedrige Inzidenz bei Kindern wird mit einer niedrigeren Rate von Krankheitsmanifestationen in Verbindung gebracht [56, 59]. Bezüglich des Geschlechtes zeigt sich, dass Männer bei ähnlicher Seroprävalenz häufiger symptomatisches Q-Fieber entwickeln als Frauen [37]. Diese geschlechtsspezifisch unterschiedliche Inzidenz zeigte sich in manchen Jahren nur in bestimmten Altersgruppen [27, 59], in anderen Jahren in nahezu jedem Alter [56]. Tabelle 1 Auswahl näher untersuchter Q-Fieber - Ausbrüche in Deutschland 1996-2005 Dargestellt ist Jahr, Ort und Bundesland des Ausbruches, Anzahl der bestätigten Q-Fieber Fälle und Quellenangabe der Ausbruchsuntersuchung. Bei der Interpretation der Fallzahlen ist zu beachten, dass erst seit Einführung des Infektionsschutzgesetzes Anfang 2001 eine einheitliche Falldefinition besteht. Weiter ist zu berücksichtigen, dass die serologische Bestätigung der hier genannten Fälle nicht immer mit den gleichen Testverfahren erfolgte. Bei allen hier genannten Q-Fieber-Ausbrüchen gelten Schafe als wahrscheinlichste Infektionsquelle. Jahr Ort / Bundesland Fälle Quelle 1996 Rollshausen (Hessen) 49 [49] 1997 Gießen (Hessen) * 68 [52] 1998 Freiburg (Baden-Württemberg) 101 [36] 13 [36] Kreis Miltenberg (Bayern) 36 [53] Dortmund (Nordrhein-Westfalen) 60 [53] Ebersberg (Bayern)** 9 [53] Rottweil-Göllsdorf (Baden-Württemberg) 42 [36] Stetten a.k.M. (Baden-Württemberg) 39 [35,36] 1998 / 1999 Dettenhausen (Baden-Württemberg) 1999 2000 / 2001 Hochsauerlandkreis (Nordrhein-Westfalen) / 68 / 23 [54] Landkreis Waldeck-Frankenberg (Hessen) 2003 Landkreis Soest (Nordrhein-Westfalen) 299 [58] 2005 Jena (Thüringen) 331 [63] * Lehr- und Forschungsstation für Tierzucht Stetten a.k.M.: Stetten am kalten Markt ** Tierzuchtanstalt 9 1.5 Ausbruch in Stetten am kalten Markt / Situation vor Ort In den Monaten Juni bis Oktober 1999 fiel in der Gemeinde Stetten am kalten Markt (ca. 5500 Einwohner) und deren näheren Umgebung im Landkreis Sigmaringen eine Häufung hochfieberhafter Erkrankungen auf. Nach Bekanntwerden des Verdachtes auf Q-Fieber wurde den niedergelassenen Ärzten durch das Gesundheitsamt Sigmaringen und das Landesgesundheitsamt BadenWürttemberg in Stuttgart (LGA) serologische Untersuchungen bei Verdachtsfällen angeboten. Darüber hinaus wurde den möglicherweise erkrankten Personen ein standardisierter Fragebogen zugesandt, in dem neben Symptomen, Arztkontakten und Arbeitsunfähigkeitszeiten auch mögliche Risikofaktoren für eine Infektion erfragt wurden. Der Originaltext des damaligen Fragebogens ist im Anhang wiedergegeben. Die statistische Auswertung der Daten durch das LGA umfasste neben deskriptiven Verfahren den Vergleich von Personen mit positiven (Fälle) und negativen (Vergleichsgruppe) Laborergebnissen hinsichtlich der erfragten Risikofaktoren. Insgesamt wurde unter 118 Untersuchten in 39 Fällen eine frische Q-Fieber - Infektion serologisch gesichert. Bezüglich des Erkrankungsbeginnes der Betroffenen zeigte sich ein Verteilungsmuster, das für Ausbrüche mit auslösendem Ereignis typisch ist. Es ergab sich ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen serologisch gesicherter Infektion und Besuch der 1200Jahr - Feier in der Gemeinde Stetten am kalten Markt im Juli 1999. Während der Feierlichkeiten hatte sich eine Schafherde in unmittelbarer Nähe zu den Besuchern aufgehalten, einzelne Tiere wurden im Rahmen einer Vorführung dort geschoren und verblieben nach Ende der Veranstaltung noch etwa 10 Tage auf dem Festgelände im Gemeindezentrum. Ein Zusammenhang zu Schafen als Infektionsquelle erscheint insofern auch für diesen Ausbruch plausibel. Personen mit positivem Laborbefund gaben auch häufiger an, dass sie ein ebenfalls ausgestelltes Ziegengehege besichtigt hatten und/oder Schafe in der Nähe ihrer Wohnung weideten, ein statistisch signifikanter Unterschied zur Vergleichsgruppe bestand für diese Faktoren nicht. Auch für die übrigen im Fragebogen erfragten möglichen Risikofaktoren ließ sich kein statistisch signifikanter Unterschied feststellen. 10 Neben den frischen Fällen von Q-Fieber fielen unter den 118 Untersuchten 52 Personen (44%) auf, bei denen sich ein serologischer Hinweis auf eine länger zurückliegende Infektion fand („Durchseuchungstiter“). Damit lag der Anteil an Personen, die offensichtlich unabhängig von dem Ausbruchsgeschehen bereits zuvor Kontakt mit dem Erreger hatten, überraschend hoch [35, 24]. Auch für diesen Personenkreis besteht möglicherweise ein Zusammenhang zu Schafen als Infektionsquelle, da in der Umgebung von Stetten am kalten Markt viele Flächen von stationären Schäfern und Wanderschäfern als Weiden genutzt werden. Dies gilt auch für das direkt an die Gemeinde angrenzende militärische Sperrgebiet, der Albkaserne mit dem Truppenübungsplatz Heuberg. In der Albkaserne verrichten derzeit etwa 3000 Soldaten und Zivilbeschäftigte der Bundeswehr dauerhaft Ihren Dienst. Zu der Liegenschaft gehört auch das sogenannte „Lager Heuberg“, in dem vorwiegend Truppenteile der Bundeswehr und anderer NATO-Staaten während ihrer Manöver auf dem direkt angrenzenden Truppenübungsplatz Heuberg zeitweise untergebracht sind. Der Truppenübungsplatz selbst umfasst eine Fläche von etwa 4800 Hektar bei einer Ausdehnung von etwa 7,5 x 7 Kilometern und liegt zwischen den Gemeinden Stetten a.k.M. im Südosten und Meßstetten im Nordwesten. Der Truppenübungsplatz wird jährlich im Rahmen verschiedener Übungs- und Ausbildungsvorhaben in einem Umfang von etwa 300.000 Manntagen genutzt [75]. Die Flächen für Übungsvorhaben überschneiden sich dabei teilweise mit den derzeit 10 Weidelosen, also Flächen, die an Schäfer verpachtet sind. 11 1.6 Fragestellung Die durch das Landesgesundheitsamt Baden-Württemberg veröffentlichte Untersuchung zum Q-Fieber – Ausbruch 1999 in Stetten a.k.M. schließt mit der Empfehlung, eine „gesonderte Untersuchung zur Durchseuchung und zur Häufigkeit von entsprechenden Titern anhand einer bevölkerungsbezogenen und regional gegliederten Stichprobe durchzuführen“ und damit „allgemeinere Aussagen zur tatsächlichen Häufigkeit von Q-Fieber - Erkrankungen in BadenWürttemberg“ zu gewinnen [35]. Diese Empfehlung stellte den Anlass zur Durchführung der vorliegenden Arbeit mit folgenden Fragestellungen dar: 1. Lassen sich bestimmte Risikofaktoren für eine Infektion mit Coxiella burnetii ermitteln? 2. Wie hoch ist die Prävalenz spezifischer Antikörper gegen Coxiella burnetii in den untersuchten Gruppen mit unterschiedlich langer Exposition am Standort Stetten am kalten Markt? Im Zusammenhang mit den dazu durchgeführten serologischen Tests Klärung der Frage: Welchen positiv prädiktiven Wert hat der ELISA als typisches Screeningverfahren im Vergleich zum indirekten Immunfluoreszenztest (IIFT) als Goldstandard in der Serodiagnostik des Q-Fiebers? 12 2 Material und Methoden 2.1 Untersuchungspopulation Zur Untersuchung gelangten die Seren von Soldaten und Zivilpersonen, die in der Albkaserne in Stetten am kalten Markt tätig waren. Zum einen waren dies Rekruten, das heißt frisch zur Bundeswehr einberufene Soldaten, die ihren Dienst bei der Bundeswehr am 01.07.2001 bzw. 01.10.2001 neu aufnahmen. Sie stammten aus allen Teilen der Bundesrepublik und hatten sich zuvor nicht im Bereich des militärischen Sperrgebietes Heuberg mit Albkaserne aufgehalten. Die Rekruten waren zuvor bei der Musterungsuntersuchung sowie unmittelbar vor der Blutabnahme bei Dienstantritt im Rahmen der Einstellungsuntersuchung eingehend über ihren Gesundheitszustand befragt und ärztlich untersucht worden. Die Feststellung der Wehrdiensttauglichkeit setzt grundsätzlich voraus, dass keine schwerwiegende akute oder chronische Beeinträchtigung des Gesundheitszustandes besteht. Insofern ist diese Gruppe als klinisch gesund zu werten, Hinweise auf eine frische Q-Fieber - Infektion gab es nicht. Zum anderen wurden Soldaten und Zivilangestellte der Bundeswehr untersucht, die sich zum Untersuchungszeitpunkt bereits länger am Standort Stetten am kalten Markt aufhielten („Nichtrekruten“). Nach der Dauer ihres Aufenthaltes am Standort Stetten a.k.M. zum Zeitpunkt der Befragung wurden die Nichtrekruten in eine Gruppe mit einer Verweildauer von bis zu 36 Monaten und in eine zweite mit einer Aufenthaltsdauer von über 36 Monaten aufgeteilt. Zu diesen Gruppen zählten Zeit- und Berufssoldaten aus militärischen Einheiten, in denen regelmäßig die militärische Grundausbildung von Rekruten durchgeführt wurde. Die Untersuchten nahmen dabei vorwiegend Aufgaben als Ausbilder wahr, wozu auch regelmäßig Aufenthalte auf dem Truppenübungsplatz Heuberg zählten, der direkt an die Kaserne angrenzt. Hinzu kamen Soldaten und Zivilangestellte der Truppenübungsplatzkommandantur Heuberg, die für die Verwaltung und Bewirtschaftung der Einrichtungen des Truppenübungsplatzes, zum Beispiel der Schießanlagen, zuständig ist. Ein Großteil dieser Personen hält 13 sich während der Arbeitstage regelmäßig direkt auf dem Gelände des Truppenübungsplatzes Heuberg auf. Die möglichen Probanden wurden im Vorfeld der Untersuchung sowohl mündlich als auch schriftlich über Ziel, Umfang und Verlauf der Studie sowie über mögliche Belastungen und Risiken aufgeklärt. Ihre Einwilligung zur freiwilligen Teilnahme an der Studie gaben die Probanden nach Klärung eventueller Rückfragen schriftlich. Dabei konnte angegeben werden, ob nach Abschluss der Laboruntersuchungen eine Information über das persönliche Ergebnis gewünscht war und ob die Bereitschaft zu einer eventuellen zweiten Blutentnahme bestand. Die Teilnehmer der Untersuchung erhielten einen standardisierten Fragebogen. Inhaltlich war dieser angelehnt an den Fragebogen, der im Rahmen der Ausbruchsuntersuchung im Jahre 1999 durch das Gesundheitsamt Sigmaringen und das Landesgesundheitsamt zum Einsatz gekommen war Erfragt wurden Angaben zur Person wie beispielsweise Alter, Größe des Wohnortes und Auslandsaufenthalte. Darüber hinaus wurden Fragen zu Risikofaktoren bezüglich eines möglichen Erregerkontaktes gestellt, zum Beispiel über Tierkontakte, Freizeitgewohnheiten und Genuss von Rohmilch. Zentral für die spätere Zuordnung zu einer der Untersuchungsgruppen waren die neu hinzugekommenen Fragen nach Dauer und Häufigkeit eines Aufenthaltes im Bereich des Truppenübungsplatzes Heuberg. Ebenfalls erfragt wurden mögliche frühere Krankheitssymptome, deren Dauer, damit zusammenhängende Arztkontakte sowie eine eventuell bereits bekannte Erkrankung an Q-Fieber. Der Wortlaut der Fragebögen sowohl dieser Arbeit als auch der Ausbruchsuntersuchung von 1999 ist im Anhang wiedergegeben. 2.2 Untersuchungsablauf Einschlusskriterien für die Untersuchung waren allgemein das Vorliegen der unterschriebenen Einverständniserklärung und eines vollständig ausgefüllten Fragebogens sowie die Verwertbarkeit der entnommenen Blutprobe. Darüber hinaus mussten Probanden für die Zuordnung zur Gruppe der Nichtrekruten auf einem Zusatzfragebogen beantworten, wie lange ihre Tätigkeit in Stetten a.k.M. zum Befragungszeitpunkt bereits dauerte. 14 Als Ausschlusskriterien galten neben allgemeinen Kontraindikationen gegen eine Blutentnahme von ca. 10 ml das Fehlen einer unterschriebenen Einverständniserklärung, eines vollständig ausgefüllten Fragebogens oder einer verwertbaren Blutprobe. Als Abbruchkriterien wurden der Widerruf zur freiwilligen Teilnahme an der Studie und die damit verbundene Ablehnung zur Auswertung des bereits gewonnenen Materials festgelegt. Die schriftliche Aufklärung verblieb bei den Studienteilnehmern. Deren schriftliche Einverständniserklärung sowie freiwillige personenbezogene Angaben wurden unmittelbar vor der Blutentnahme von den Fragebögen getrennt, separat gelagert und nach Abschluss der Untersuchung bzw. Ergebnismitteilung an den Probanden vernichtet. Die freiwilligen personenbezogenen Angaben wie beispielsweise die Adresse dienten ausschließlich dazu, auf Wunsch die persönlichen Untersuchungsergebnisse mitteilen zu können. Fragebögen und Probengefäße erhielten eine zufällig ausgewählte dreistellige Codenummer. Die Auswertung der Blutproben und der Fragebögen erfolgte in anonymisierter Form. Die Zuordnung von Angaben in den Fragebögen und zugehörigen Laborergebnissen erfolgte über die Codenummern. Die datenschutzrechtlichen Bestimmungen wurden eingehalten. Die Ethikkommission I der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg, Fakultät Medizin, hat dem Forschungsvorhaben in ihrer Sitzung vom 20. November 2000 zugestimmt. Das Bundesministerium der Verteidigung hat für die Untersuchung am 20.06.01 einen außerplanmäßigen wehrmedizinischen Sonderforschungsauftrag erteilt (Kennziffer 01H1-S-450102). 2.3 Untersuchungsmaterial Die Gewinnung des Untersuchungsmaterials erfolgte bei den Rekruten spätestens zu Beginn ihrer dritten Dienstwoche in Stetten a.k.M. im Rahmen einer routinemäßig durchgeführten Blutentnahme, die der Bestimmung der Blutgruppe dient. So entstand durch die Teilnahme an der Studie keine wesentliche zusätzliche Belastung für die Probanden. 15 Bei der Gruppe der Nichtrekruten fand die Probengewinnung zwischen September 2001 und Dezember 2001 statt. Vor Durchführung der Blutentnahme wurden die Probanden nochmals über Erscheinungen und Verlauf der Erkrankung informiert und gebeten, bei eventuell auftretenden Symptomen den Truppenarzt bzw. den Hausarzt aufzusuchen. Sofern sich in der ersten Serumprobe ein positiver ELISA-Test durch ein positives Ergebnis im IIFT bestätigen ließ, wurde eine zweite Blutentnahme angestrebt. Von den betreffenden Probanden wurde, sofern sie erreichbar waren und sich zu einer zweiten Blutentnahme bereiterklärten, im Zeitraum Juli – September 2002 erneut Untersuchungsmaterial gewonnen. Eine zweite Befragung mittels Fragebogen fand hierbei nicht statt. Bei allen Probanden erfolgte die Blutentnahme nach üblicher Desinfektion und kurzer venöser Stauung durch die Punktion einer peripheren Armvene. Verwendet wurde hierzu ein BD Vacutainer Blutentnahmesystem (Becton Dickinson GmbH, 69126 Heidelberg, Deutschland), bestehend aus BD Precisionglide Kanülen (20 G, Best.-Nr. 360215), Einmalhaltern aus Kunststoff (Best.-Nr. 364887) und Serumröhrchen mit Trenngel (BD SST 9,5 ml, Best.-Nr. 368510). Das Untersuchungsmaterial wurde schnellstmöglich, d.h. innerhalb von maximal 20 Stunden, leicht gekühlt an die untersuchende Einrichtung verbracht. Die weitere Probenaufbereitung und -lagerung sowie die Testdurchführung erfolgte durch die Laborgruppe Medizinischer B-Schutz an der Außenstelle Munster des Zentralen Institutes des Sanitätsdienstes der Bundeswehr München. Sofort nach Eintreffen des Untersuchungsmaterials im Labor, das heißt spätestens 20 Stunden nach Blutentnahme, erfolgte dort die Zentrifugation bei 1800 g für 10 Minuten. Sofern das Material nicht gleich weiter verwendet wurde, erfolgte die Lagerung des Serums bei – 20 + 1°C. 16 2.4 Serologische Untersuchungen Bei allen Serumproben wurde zunächst ein ELISA-Test zum Nachweis von Antikörpern der Klassen IgG und IgM gegen Phase 2-Antigen von Coxiella burnetii durchgeführt. Bei Seren mit positivem Nachweis schloss sich als Bestätigungstest ein indirekter Immunfluoreszenztest (IIFT) gegen Phase 2 an. Außerdem wurde bei diesen Seren eine Komplementbindungsreaktion (KBR) gegen Phase 1 und Phase 2 durchgeführt. Seren, die nach oben genannten Kriterien im Rahmen einer zweiten Blutabnahme gewonnen wurden, wurden mittels ELISA auf Antikörper der Klassen IgG und IgA gegen Phase I-Antigen untersucht. Darüber hinaus wurden bei diesen Proben ein Teil der Tests (ELISA gegen Phase 2 IgG und IgM) wiederholt, um eine Aussage über die Konstanz der Antikörpernachweise zu ermöglichen. 2.4.1 ELISA Verwendete Testsysteme und Geräte: Zum Einsatz kamen kommerzielle Testsysteme der Firma Institut Virion\Serion GmbH, 97072 Würzburg, Deutschland. Hierbei handelte es sich für die Bestimmung der spezifischen Antikörper gegen Phase 2 um den IgG-Kit (quantitativ) Best.-Nr. ESR 1312G und um den IgM-Kit Best.-Nr. ESR 1312M. Zum Nachweis der Phase I-Antikörper gegen C. burnetii wurden der IgG-Kit Best.Nr. ESR 1311G, sowie der IgA-Kit Best.-Nr. ESR 1311A verwendet. Sämtliche für den Testansatz erforderlichen Reagenzien sind in der jeweiligen Testpackung enthalten und werden deshalb nicht gesondert aufgeführt. Um eine Verfälschung der Ergebnisse bei dem Nachweis spezifischer IgMAntikörper durch eventuell im Serum vorhandene Rheumafaktoren der Klasse IgM zu vermeiden, wurden die Seren für diesen Nachweis entsprechend vorbehandelt. Hierzu kam gebrauchsfertiges, flüssiges Rheumafaktor-Absorbens (Institut Virion\Serion GmbH, 97072 Würzburg, Deutschland, Best.-Nr. Z 100/Z200) zur Anwendung. Darüber hinaus verwendete Materialien wie Präzisionspipetten, Papiertücher, Aqua dest. etc. entsprachen dem gängigen Laborbedarf. 17 Zur Inkubation zwischen den einzelnen Testabschnitten wurden ein Inkubator (Heraeus, 63450 Hanau, Nr. B61020) und eine feuchte Kammer (Kunststoffschale mit Deckel) benutzt. Bei dem zur Extinktionsmessung verwendeten Photometer handelte es sich um das Gerät Modell Sunrise RC (Nr. F039300, TECAN, 74564 Crailsheim) Testprinzip des indirekten ELISA: Sofern im getesteten Serum spezifische Antikörper vorliegen, binden diese an die im Testkit festphasenfixierten Antigene. Im weiteren Verlauf werden Nachweisantikörper eingesetzt, die mit alkalischer Phosphatase enzymatisch markiert sind und an die antigengebundenen Serumantikörper binden. Durch Zugabe eines Substrates (para-Nitrophenylphosphat, pNPP) erfolgt letztlich eine Enzym-Substrat-Reaktion zu einem gelbgefärbten Endprodukt. Die Intensität der Gelbfärbung wird photometrisch bestimmt und ist dem Gehalt an spezifischen Antikörpern im getesteten Serum proportional. Testauswertung: Die Auswertung wurde für den Nachweis der Phase 2 IgM-Antikörper sowie der Phase 1 IgG- und IgA- Antikörper als Cut-off-Bewertung durchgeführt: Zur Bestätigung der Verwertbarkeit des Testansatzes wurde nach Überprüfung auf korrekte Reaktion der positiven und negativen Kontrollseren sichergestellt, dass die einzelnen Messwerte für das mitgelieferte Cut-off-Serum nicht mehr als 20% voneinander abweichen. Des Weiteren wurde anhand der mitgelieferten, chargenabhängigen Prüfprotokolle überprüft, ob die ermittelten Werte für Positivkontrolle und Cut-off-Serum im Gültigkeitsbereich lagen. Die Interpretation der Messergebnisse erfolgte dann nach Abzug des Substratleerwertes von den Messergebnissen im Vergleich zu dem gemessenen OD-Wert für das Cut-off-Serum. Proben, deren Messwert mehr als 10 % über dem des Cut-off-Serums lagen, wurden als positiv bewertet. Ein negatives Ergebnis wurde für Proben festgestellt, deren Wert mehr als 10 % unter der OD des Cut-off-Serums lagen. Werte, die weniger als 10 % über oder unter dem Cutoff-Wert lagen, wurden als grenzwertig angesehen. 18 Die Testauswertung für die quantitative Bestimmung der Phase 2 IgG-Antikörper umfasste folgende Schritte: Nachdem sichergestellt wurde, dass der Mittelwert der gemessenen Extinktionen für das Standardserum innerhalb des vom Hersteller angegebenen Toleranzbereiches lag, wurde der Faktor “F“ als Quotient aus angegebenem Sollwert und dem gemessenen Mittelwert der Extinktion des Standardserums ermittelt. Der Faktor „F“ korrigiert die Tagesschwankungen und ermöglicht die stufenlose Bestimmung der Antikörperaktivitäten mittels Standardkurve. Von den für die Proben erhaltenen Messwerten wurde jeweils der Substratleerwert abgezogen, der erhaltene Wert mit dem Faktor „F“ multipliziert. Über die dadurch erhaltenen korrigierten Messwerte konnte dann anhand der vorliegenden Standardkurven die zugehörigen Antikörperaktivitäten in U/ml abgelesen werden. 2.4.2 Indirekter Immunfluoreszenztest (IIFT) Verwendetes Testsystem und Geräte: Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Bestellnummern auf Produkte der Firma bioMérieux Deutschland GmbH, 72622 Nürtingen, Deutschland. Im Einzelnen handelt es sich hierbei um Coxiella burnetii-Spot IF (Coxiella burnetii auf Vero-Zellen gezüchtet und auf Objektträgern fixiert, Best.-Nr. 75921), Floureszein-markierte Konjugate (FITC) von der Ziege, Fluoline „H“, Antihuman Globulin , polyvalent (Best.-Nr. 75603), Evans-Blau-Lösung (1% in Aqua dest., Best.-Nr. 75491), Fluoprep Eindeckflüssigkeit (Best.-Nr. 75521), Deckgläser 60x24mm (VWR, 85737 Ismaning, Best.-Nr. 631Q9488), PBS-Tween (Sigma, P3563). Darüber hinaus verwendete Materialien wie Präzisionspipetten, Papiertücher, Aqua dest. etc entsprachen dem gängigen Laborbedarf. Zur Inkubation zwischen den einzelnen Testabschnitten wurde ein Inkubator (s.o.) in einer feuchten Kammer (s.o.) benutzt. Bei dem eingesetzten Fluoreszenzmikroskop handelt es sich um ein Olympus BX41 System-Mikroskop mit Fluoreszenzeinrichtung (Olympus, 20097 Hamburg). 19 Testprinzip des IIFT: Die im Testserum vorhandenen spezifischen Antikörper reagieren mit dem auf einem Objektträger fixierten Antigen der Phase 2. Die bei einer positiven Reaktion entstehenden Immunkomplexe werden durch ein mit Floureszein markiertes Antihuman-Globulin im UV-Licht nachgewiesen. Bei einer Fluoreszenz ab einer Verdünnung von 1:80 kann das Serum als positiv bezeichnet werden. In dieser Arbeit wurde der Test als qualitative Bestimmung in dieser Verdünnung durchgeführt. Testauswertung des IIFT: Nach Durchführung des Testes gemäß geltender Testvorschrift wurde die Auswertung unter einem Fluoreszenz-Mikroskop mit UV-Licht bei 400-facher Vergrößerung vorgenommen (10x Okular und 40x Objektiv). Zunächst wurde die Leerwertkontrolle auf eine korrekte negative Reaktion, das heißt keine Fluoreszenz überprüft, wobei eine geringe Grünfärbung der Coxiellen auch bei negativen Seren auftritt. Als positive Reaktion wurde eine klare Fluoreszenz von Coxiella gewertet. Nicht eindeutig positive Proben wurden vom Labor als grenzwertig bezeichnet. 2.4.3 Komplementbindungsreaktion (KBR) Verwendete Testsysteme und Geräte: Zur Verwendung gelangten ausschließlich normierte Reagenzien der Firma Institut Virion\Serion GmbH, 97072 Würzburg, Deutschland, so dass Vorversuche zur Einstellung entfielen. Im einzelnen handelte es sich bei den Testsystemen gegen Phase 1und Phase 2 um Antigen (Best.-Nr. Phase 1: 1227, Phase 2: 1123), Kontrollantigen (Best.-Nr. Phase 1: 2227, Phase 2: 2123), Kontrollserum positiv (Best.-Nr. Phase 1: 3227, Phase 2: 3123), Kontrollserum negativ (Best.-Nr. Phase 1: 4227, Phase 2: 4123), gebrauchsfertiges Hämolytisches System (Best.-Nr. 9000), stabilisiertes Komplement (Best.-Nr. 9001) und Veronal-Puffer (Best.-Nr. 9003). Bei den Mikrotestplatten handelte es sich um Platten mit u-förmigem Boden (Greiner bio-one, 72636 Frickenhausen Best. Nr. 650101). Darüber hinaus 20 verwendete Materialien wie Präzisionspipetten, Papiertücher, Aqua dest. etc entsprachen dem gängigen Laborbedarf. Testprinzip der Komplementbindungsreaktion: Unter Komplement versteht man ein funktionelles System von Proteinen im Serum und auf Zelloberflächen, das als unspezifischer Reaktand des humoralen Abwehrsystems fungiert. Nach Aktivierung des Systems entweder durch direkten Antigenkontakt oder durch Immunkomplexe der IgG1-, IgG2-, IgG3- und IgMKlasse wirkt Komplement lytisch bzw. aktivierend auf Immunzellen. Im Testverfahren wird dem komplementinaktivierten Testserum ein spezifisches Antigen zugegeben. Sind im Serum Antikörper gegen das Antigen vorhanden, bilden sich Immunkomplexe aus. Eine definierte Menge zugeführten Komplementes wird von diesen Immunkomplexen aktiviert und dabei verbraucht. Die Messung des Komplementverbrauches wird durch dosierte Zugabe eines standardisierten hämolytischen Systemes von sensibilisierten, d.h. antikörperbeladenen Erythrozyten möglich: Wenn noch genügend Komplement vorhanden ist, d.h. im Testserum keine Immunkomplexe gebildet wurden, werden die Erythrozyten lysiert (negatives Testergebnis). Wurde das Komplement durch vorhandene Immunkomplexe verbraucht, bleiben die Erythrozyten intakt und ergeben nach Sedimentation ein Knöpfchen (Hämolyse-Hemmung) am Boden der Mikrotiterplatte (positives Testergebnis). Eine semi-quantitative Bestimmung der Konzentration vorhandener AK im Serum wird durch Endpunkttitration des Serums ermöglicht Die KBR wird als eine Mikromethode nach der KOLMER-Technik (Kältebindung bei 2-8 °C über Nacht) entsprechend DIN 58 969 und den Empfehlungen der Sachverständigenkommission der WHO durchgeführt. Testauswertung der KBR: Vor der Auswertung des Testes wurde der Ansatz gemäß der vom Hersteller vorgegebenen Kriterien mit Hilfe der Kontrollen auf seine Gültigkeit hin überprüft. Sofern diese gegeben war, wurde beim Ablesen eine 100%ige HämolyseHemmung mit 4, eine 75%ige mit 3, eine 50%ige mit 2 und eine 25%ige mit 1 21 bewertet. Spuren von Hämolyse-Hemmung wurden mit +/-, eine komplette Hämolyse mit 0 bezeichnet. Ein positives Ergebnis lag bei einem Ergebnis von 3 und 4 in der jeweiligen Verdünnungsstufe (zum Beispiel 1:40) vor. 2.5 Auswertung der Fragebögen und statistische Verfahren Die Dateneingabe und Validierung der mittels Fragenbogen erhobenen Daten sowie der in den serologischen Untersuchungen erhaltenen Ergebnisse erfolgte mit Hilfe des Programms EpiInfo Version 1.1.2 (CDC, Atlanta, Georgia, USA). Die statistischen Analysen wurden in Kooperation mit dem Landesgesundheitsamt Baden-Württemberg, Stuttgart, unter Verwendung des Statistikpakets SAS 9.1.3 (SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, USA) durchgeführt. Die Untersuchung war primär angelegt als Seroprävalenzstudie an drei Gruppen, die sich anhand ihrer unterschiedlich langen Exposition in einem räumlich definierten Bereich mit Nähe zu Schafen und deren Weideflächen – hier der Bundeswehrliegenschaft Albkaserne mit dem Truppenübungsplatz Heuberg in Stetten a.k.M. – differenzieren ließen. In dem Gruppenvergleich galten die Rekruten ohne dort vorangegangenen Aufenthalt als Referenzgruppe, während die beiden anderen Gruppen unterschiedlich lange exponiert waren (Nichtrekruten mit bis zu 36 Monaten bzw. mit über 36 Monaten Aufenthaltsdauer am Standort). Zum Vergleich der Anteile positiver Laborergebnisse in den drei Gruppen wurde der Chiquadrattest als Unabhängigkeitstest durchgeführt. Nullhypothese war die Annahme, dass sich die Anteile in den drei Gruppen nicht unterscheiden. Als Signifikanzniveau wurde vorab α = 0,05 festgelegt. Neben der deskriptiven Darstellung der Ergebnisse zur Verteilung möglicher Risikofaktoren wurden anhand von Chiquadrattests auch die Zusammenhänge zwischen möglichen Risikofaktoren und Laborergebnissen untersucht. Der Chiquadrattest ist ein adäquates Verfahren zur Auswertung von Kontingenztafeln (hier: 3x2- bzw. 3xkx2-Tafeln). Darüberhinaus wurde auch eine Schätzung des positiv prädiktiven Wertes des Screeningtests (ELISA) gemessen an den Resultaten des Bestätigungstests 22 (IIFT) vorgenommen, die jedoch wegen des begrenzten Stichprobenumfangs eher einen orientierenden Charakter hat. Die Ergebnisse wurden tabellarisch oder grafisch dargestellt 23 3 Ergebnisse 3.1 Demographische Angaben zum untersuchten Kollektiv Nach persönlicher und schriftlicher Aufklärung über Ziel und Ablauf der Untersuchung konnten insgesamt 509 Personen im Standortbereich der Albkaserne Stetten am kalten Markt für eine Teilnahme gewonnen werden. Von den 509 abgegebenen Fragebögen wurden zwei ausgeschlossen: Zu einem wurde kein Blut abgegeben, der andere war aufgrund fehlender Angaben keiner der Gruppen zuzuordnen. Darüber hinaus kamen keine weiteren Ausschlussoder Abbruchkriterien zur Anwendung. Somit standen letztlich n=507 Fragebögen mit jeweils dazugehöriger Blutprobe zur Auswertung zur Verfügung. Alle ausgewerteten Seren stammten von Männern. Der Geburtsort der Probanden befand sich zum größten Teil in Deutschland, wie Tab. 2 zeigt. Tabelle 2 Häufigkeit der Angaben zu der Frage: „Wo liegt Ihr Geburtsort?“ Dargestellt ist die absolute Zahl der Antworten sowie deren prozentualer Anteil an der Gesamtzahl der Fragebogenangaben (n=505, keine Angabe: 2 Probanden). Die Mehrheit der Probanden ist demnach in Deutschland geboren, die Geburtsorte der anderen Probanden liegen etwa zu gleich Teilen in- und außerhalb Europas. In Deutschland n = 450 89,1 % In Europa n = 30 5,9 % Außerhalb Europas n = 25 5,0 % Die Altersverteilung der Probanden ist in Abb.2 dargestellt, für zwei Personen lag dabei keine Altersangabe vor. Eine Häufung fand sich in den Altersklassen unter 25 Jahren, denen sich etwa 84% der Probanden zuordnen ließen. Nach den Fragebogenangaben zur Dauer ihres Aufenthaltes in Stetten am kalten Markt wurden die Probanden in die drei Untersuchungsgruppen eingeteilt (Tab.3): Rekruten ohne vorherigen Aufenthalt, Nichtrekruten mit einer Aufenthaltsdauer von bis zu 36 Monaten und Nichtrekruten mit über 36 Monaten Aufenthaltsdauer am Standort bezogen auf den Zeitpunkt der ersten Blutentnahme. 24 Anzahl Probanden [n] Altersverteilung der Probanden 300 250 200 150 100 50 0 < 20 20-24 25-29 30-34 35-39 40-44 45-49 > 49 Alter [Jahre] Abbildung 2 Altersverteilung der Probanden Dargestellt ist die Verteilung der Probanden auf Altersklassen nach den Angaben in den Fragebogen. Etwa 84% der Probanden sind unter 25 Jahren alt, der Rest verteilt sich relativ gleichmäßig auf die übrigen Altersstufen. (n=505, keine Altersangabe: 2 Probanden) Die Gruppe der Rekruten bestand dabei aus Wehrpflichtigen, die zum 01.07. bzw. 01.10.2001 ihren Wehrdienst in Stetten a.k.M. antraten, die beiden Gruppen der Nichtrekruten setzten sich aus Zeit- und Berufssoldaten sowie Zivilbeschäftigten der Bundeswehr zusammen. Tabelle 3 Einteilung in Untersuchungsgruppen Dargestellt ist die Verteilung der n=507 Probanden auf die untersuchten Gruppen. Kriterium für die Zuordnung zu den Untersuchungsgruppen und deren Benennung waren die Fragebogenangaben zur Dauer des Aufenthaltes am Standort Stetten a.k.M. zum Zeitpunkt der ersten Blutabnahme. Mehr als drei Viertel (78%) der Probanden sind Rekruten, die zuvor keine wesentlichen Aufenthaltszeiten am Standort hatten. (Stetten a.k.M. = Stetten am kalten Markt) Aufenthaltsdauer in Stetten Gruppe a.k.M. zum Zeitpunkt der Anteil an Anzahl ersten Blutabnahme Rekruten Nichtrekruten bis 36 Monate Aufenthalt Nichtrekruten über 36 Monate Aufenthalt untersuchtem Kollektiv (n=507) ≤ 21 Tage n=396 78,1 % ≤ 36 Monate n=47 9,3 % > 36 Monate n=64 12,6 % 25 Die Altersverteilung innerhalb der Untersuchungsgruppen ist Abb.3 zu entnehmen. Der Einberufungspraxis für Wehrpflichtige entsprechend sind in der Gruppe der Rekruten fast ausschließlich Probanden mit einem Alter bis 25 Jahre vertreten. Auch in der Gruppe der Nichtrekruten mit einer Aufenthaltsdauer in Stetten a.k.M. von bis zu 36 Monaten ordnen sich die Untersuchten mehrheitlich den jüngeren Altersklassen zu, während in der Gruppe mit der längsten Aufenthaltsdauer am Standort (>36 Monate) die Anzahl der Probanden mit steigendem Alter zunimmt. Der höhere Anteil von Rekruten (n=396) im Vergleich zu der Gruppe der Nichtrekruten (n=111) im untersuchten Kollektiv erklärt die zuvor beschriebene Häufung in den Altersklassen bis 25 Jahren (Abb.2). 26 Gruppe der Rekruten Anteil an Gruppe [%] 70 60 50 40 30 20 10 0 unter 20 20-24 25-29 30-34 35-39 40-44 45-49 über 49 40-44 45-49 über 49 40-44 45-49 über 49 Alter [Jahre] Anteil an Gruppe [%] Gruppe der Nichtrekruten bis 36 Monate Aufenthalt am Standort Stetten a.k.M. 70 60 50 40 30 20 10 0 unter 20 20-24 25-29 30-34 35-39 Alter [Jahre] Anteil an Gruppe [%] Gruppe der Nichtrekruten über 36 Monate Aufenthalt am Standort Stetten a.k.M. 30 25 20 15 10 5 0 unter 20 20-24 25-29 30-34 35-39 Alter [Jahre] Abbildung 3 Altersverteilung in den Untersuchungsgruppen Dargestellt ist der prozentuale Anteil der Altersklassen an der jeweiligen Untersuchungsgruppe. In der Rekrutengruppe (n=396) sind fast ausschließlich die beiden jüngsten Altersklassen vertreten, was der Einberufungspraxis für Wehrpflichtige geschuldet ist. Auch in der Gruppe der Nichtrekruten bis 36 Monate Aufenthaltsdauer am Standort Stetten a.k.M. (n=47) dominieren die jüngeren Probanden, während in der Gruppe mit der längsten Aufenthaltsdauer (n=64) der Anteil von Probanden mit zunehmendem Alter ansteigt (n=505, keine Altersangabe: 1 Rekrut, 1 Nichtrekrut mit bis zu 36 Monaten Aufenthalt. Stetten a.k.M. = Stetten am kalten Markt) 27 3.2 Fragebogenangaben zu möglichen Risikofaktoren Im Folgenden sind die Fragebogenangaben der Probanden zu möglichen Risikofaktoren für eine Q-Fieber - Infektion tabellarisch bzw. grafisch dargestellt. Aufgeführt sind jeweils die absoluten Zahlen in den genannten Rubriken sowie deren prozentualer Anteil bezogen auf alle Antworten zu der jeweiligen Frage. Da nicht alle n=507 Probanden zu jedem Item eine Angabe gemacht haben, ergaben sich zum Teil unterschiedliche Gesamtzahlen von Antworten, die jeweils angegeben sind. Zusätzlich zu den möglichen Risikofaktoren wurden in den Fragebögen Angaben zu eventuellen Krankheitssymptomen erhoben. Diese hätten gegebenenfalls Aufschluss über typische klinische Verläufe geben können. Aufgrund der geringen Zahl von serologischen Hinweisen auf eine mögliche frische Infektion (n=5) wird auf deren Darstellung verzichtet. Für alle nachfolgend genannten Faktoren ließ sich kein statistisch signifikanter Zusammenhang zu einer nachgewiesenen Q-Fieber - Infektion ermitteln. Tabelle 4 Häufigkeit der Angaben zu der Frage: „Haben Sie in den letzten 6 Monaten eine Auslandsreise unternommen?“ (Gesamtzahl der Antworten n=506, keine Angabe: 1 Proband) Auslandsreise ja n=226 Tabelle 5 nein 44,7 % n=280 55,3 % Häufigkeit der Angaben zu der Frage: „Haben Sie sich in den letzten 6 Monaten an einem der folgenden Orte aufgehalten?“ (Gesamtzahl der Antworten n=506, keine Angabe: 1 Proband) Orte ja nein weiß nicht Bauernhof n=187 37,0 % n=287 56,7 % n=32 6,3 % Reiterhof n=74 14,6 % n=419 82,8 % n=13 2,6 % Schlachthof n=31 6,1 % n=467 92,3 % n=8 1,6 % Schafweide n=184 36,4 % n=280 55,3 % n=42 8,3 % Schafschur n=12 2,4 % n=472 93,3 % n=22 4,3 % 28 Tabelle 6 Häufigkeit der Angaben zu der Frage: „Haben Sie in den letzten 6 Monaten Vorzugsmilch oder nicht erhitzte Rohmilch (direkt vom Bauern) getrunken?“ (Gesamtzahl der Antworten n=506, keine Angabe: 1 Proband) Vorzugsmilch ja n=66 Tabelle 7 nein 13,0 % n=387 weiß nicht 76,5 % n=53 10,5 % Häufigkeit der Angaben zu der Frage: „Haben Sie Haustiere?“ (Gesamtzahl der Antworten n=507) Haustiere ja nein Hund(e) n=105 20,7 % n=402 79,3 % Katze(n) n=148 29,2 % n=359 70,8 % Vogel / Vögel n=47 9,3 % n=460 90,7 % Ziege(n) n=8 1,6 % n=499 98,4 % Tabelle 8 Häufigkeit der Angaben zu der Frage: „Befinden sich in Sichtweite Ihres Heimatwohnortes Weideflächen für folgende Tiere?“ Gesamtzahl der durch die Fragenbögen erhaltenen Antworten für Items „Rinder“ und „Ziegen“ n=507) Tiere ja nein weiß nicht Ziegen n=70 13,8 % n=403 79,5 % n=34 6,7 % Rinder n=213 42,0 % n=267 52,7 % n=27 5,3 % Tabelle 9 Häufigkeit der Angaben zu der Frage: „Befinden sich in Sichtweite Ihres Arbeitsplatzes der letzten 6 Monate (für Rekruten: Arbeitsplatz vor der Bundeswehr) Weideflächen für folgende Tiere?“ (Gesamtzahl der Antworten n=505, keine Angabe: 2 Probanden) Tiere ja nein weiß nicht Ziegen n=42 8,3 % n=388 76,8 % n=75 14,9 % Rinder n=82 16,2 % n=358 70,9 % n=65 12,9 % 29 16 Häufigkeit [%] 14 12 10 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Zeit im Freien [Stunden] Abbildung 4 Häufigkeit der Angaben zu der Frage: „Wie viel Zeit haben Sie in den letzten 6 Monaten durchschnittlich pro Tag im Freien verbracht?“ Dargestellt ist die prozentuale Häufigkeit der Stundenangaben. (Gesamtzahl der Antworten n=505, keine Angabe: 2 Probanden) Tabelle 10 Häufigkeit der Angaben zu der Frage: „Haben Sie sich in den letzten 6 Monaten in Bereichen aufgehalten, wo Schafkot lag?“ (Gesamtzahl der Antworten n=507) ja n = 300 59,2 % nein n = 115 22,7 % weiß nicht n = 92 18,0 % Tabelle 11 Häufigkeit der Angaben zu der Frage: „Wie viele Einwohner hat der Ort, in dem Sie wohnen?“ (Gesamtzahl der Antworten n=505, keine Angaben: 2 Probanden) Einwohnerzahl Unter 1000 Einwohner n = 86 17,0 % 1000 – 5000 Einwohner n = 169 33,5 % 5000 – 10000 Einwohner n = 76 15,0 % 10000 – 50000 Einwohner n = 104 20,6 % Über 50000 Einwohner n = 70 13,9 % 30 3.3 Statistisch relevante Risikofaktoren In der Folge sind diejenigen Faktoren aus den Fragebögen dargestellt, für die sich in der statistischen Prüfung ein Zusammenhang mit einer serologisch gesicherten zurückliegenden Infektion mit C. burnetii ergab. Kriterium hierfür war die Bestätigung eines positiven Screeningtests (IgG-ELISA gegen Phase 2) durch ein positives Ergebnis im indirekten Immunfluoreszenztest (IIFT gegen Phase 2). Durchgeführt wurde ein Chi-Quadrat-Test, als Signifikanzniveau wurde dabei festgelegt α = 0,05. Tabelle 12 Zusammenhang zwischen zurückliegender Infektion und der Frage: „Haben Sie Haustiere?“ Dargestellt sind die Fragebogenangaben und deren Zusammenhang mit den Ergebnissen im indirekten Immunfluoreszenztest (IIFT) jeweils in absoluten Zahlen und als Prozentangaben. Zwischen der Haltung von Schafen als Haustiere und einem positiven Testergebnis im IIFT ergab sich ein statistisch signifikanter Zusammenhang (p=0,01). (Gesamtzahl der Antworten n=507) IIFT IIFT ja negativ n=5 positiv n=4 Reihenprozent nein 55,6 % n = 431 44,4 % n = 67 100 % n = 498 Reihenprozent Summe 86,5 % n = 436 13,5 % n = 71 100 % n = 507 Reihenprozent 86 % 14 % 100 % Schaf(e) als Haustier(e): Chi-Quadrat: 10,54 Summe n=9 p = 0,01 Ein deutlicher Zusammenhang zwischen bestätigtem Titer für spezifische Antikörper gegen Phase 2 von C. burnetii und Angaben aus dem Fragebogen bestand demnach bei Fragen, die inhaltlich einen engen Bezug zu Schafen hatten: Die Haltung von Schafen als Haustiere sowie das Vorhandensein von Weideflächen in näherer Umgebung des Wohnortes bzw. des Arbeitsplatzes erwiesen sich als statistisch signifikante Risikofaktoren (p=0,01). Ein tendenzieller Zusammenhang zeichnete sich darüber hinaus ab für die Haltung von Hund(en) als Haustier(e) (p=0,02) und für den Aufenthalt auf einem Bauernhof (p=0,04), wie nachfolgend dargestellt. 31 Tabelle 13 Zusammenhang zwischen zurückliegender Infektion und der Frage: „Befinden sich in Sichtweite Ihres Arbeitsplatzes der letzten 6 Monate (Für Rekruten: Arbeitsplatz vor der Bundeswehr) Weideflächen für (…) Schafe?“ Dargestellt sind die Fragebogenangaben und deren Zusammenhang mit den Ergebnissen im indirekten Immunfluoreszenztest (IIFT) jeweils in absoluten Zahlen und als Prozentangaben. Zwischen dem Vorhandensein von Schafweiden in Sichtweite des Arbeitsplatzes und einem positiven Testergebnis im IIFT ergab sich ein statistisch signifikanter Zusammenhang (p=0,01). (Gesamtzahl der Antworten n=505, keine Angaben: 2 Probanden) IIFT IIFT Schafweide in Arbeitsplatznähe: ja negativ n = 118 positiv n = 32 Reihenprozent nein 78,7 % n = 268 21,3 % n = 34 100 % n = 302 Reihenprozent weiß nicht 88,7 % n = 48 11,3 % n=5 100 % n = 53 Reihenprozent Summe 90,6 % n = 434 9,4 % n = 71 100 % n = 505 Reihenprozent 85,9 % 14,1 % 100 % Chi-Quadrat: 16,43 Tabelle 14 Summe n = 150 p = 0,01 Zusammenhang zwischen zurückliegender Infektion und der Frage: „Befinden sich in Sichtweite Ihres Heimatwohnortes Weideflächen für (…) Schafe?“ Dargestellt sind die Fragebogenangaben und deren Zusammenhang mit den Ergebnissen im indirekten Immunfluoreszenztest (IIFT) jeweils in absoluten Zahlen und als Prozentangaben. Zwischen dem Vorhandensein von Schafweiden in Sichtweite des Wohnortes und einem positiven Testergebnis im IIFT ergab sich ein statistisch signifikanter Zusammenhang (p=0,01). (Gesamtzahl der Antworten n=506, keine Angaben: 1 Proband) IIFT IIFT ja negativ n = 146 positiv n = 38 Reihenprozent nein 79,3 % n = 250 20,7 % n = 30 100 % n = 280 Reihenprozent weiß nicht 89,3 % n = 39 10,7 % n=3 100 % n = 42 Reihenprozent Summe 92,9 % n = 435 7,1 % n = 71 100 % n = 506 Reihenprozent 86 % 14 % 100 % Schafweide in Wohnortnähe: Chi-Quadrat: 16,93 Summe n = 184 p = 0,01 32 Tabelle 15 Zusammenhang zwischen zurückliegender Infektion und der Frage: „Haben Sie Haustiere (…) Hund(e)?“ Dargestellt sind die Fragebogenangaben und deren Zusammenhang mit den Ergebnissen im indirekten Immunfluoreszenztest (IIFT) jeweils in absoluten Zahlen und als Prozentangaben. Zwischen der Haltung von Hund(en) als Haustier(e) und einem positiven Testergebnis im IIFT ergab sich ein statistisch signifikanter Zusammenhang (p=0,02). (Gesamtzahl der Antworten n=507) IIFT IIFT ja negativ n = 84 positiv n = 21 Reihenprozent nein 80 % n = 352 20 % n = 50 100 % n = 402 Reihenprozent Summe 87,6 % n = 436 12,4 % n = 71 100 % n = 507 Reihenprozent 86 % 14 % 100 % Hund(e) als Haustier(e): Chi-Quadrat: 9,42 Tabelle 16 Summe n = 105 p = 0,02 Zusammenhang zwischen zurückliegender Infektion und der Frage: „Haben Sie sich in den letzten 6 Monaten an einem der folgenden Orte (…Bauernhof) aufgehalten?“ Dargestellt sind die Fragebogenangaben und deren Zusammenhang mit den Ergebnissen im indirekten Immunfluoreszenztest (IIFT) jeweils in absoluten Zahlen und als Prozentangaben. Zwischen dem Aufenthalt auf einem Bauernhof in den zurückliegenden 6 Monaten und einem positiven Testergebnis im IIFT ergab sich ein Hinweis auf einen Zusammenhang (p=0,04). (Gesamtzahl der Antworten n=506, keine Angaben: 1 Proband) IIFT IIFT ja negativ n = 150 positiv n = 37 Reihenprozent nein 80,2 % n = 255 19,8 % n = 32 100 % n = 287 Reihenprozent weiß nicht 88,9 % n = 30 11,1 % n=2 100 % n = 32 Reihenprozent Summe 93,7 % n = 435 6,3 % n = 71 100 % n = 506 Reihenprozent 86 % 14 % 100 % Aufenthalt auf Bauernhof: Chi-Quadrat: 13,03 Summe n = 187 p = 0,04 33 3.4 Ergebnisse der serologischen Tests auf Coxiella burnetii 3.4.1 Ergebnisse der Komplementbindungsreaktion (KBR) In den Fällen mit einem positiven IgG-Titer gegen Phase 2 im ELISA wurde neben dem Bestätigungstest IIFT zusätzlich eine Komplementbindungsreaktion (KBR) gegen Phase 2 durchgeführt. Tendenziell ließen sich höhere Titer in der KBR gegen Phase 2 bei Seren beobachten, bei denen auch höhere ELISA Titer gemessen wurden. Allerdings bestand lediglich eine Übereinstimmung von etwa 22 % zwischen den beiden Verfahren, das heißt, von 147 Proben mit einem IgG-Titer im ELISA reagierten 32 Seren auch in der KBR gegen Phase 2 positiv. Diese zeigten zu 97 % (n=31) auch im IIFT ein positives Ergebnis. In der darüber hinaus durchgeführten KBR gegen Phase 1 wurde bei 5 Proben (3,4% von 147 Proben mit positiven IgG-ELISA) ein positiver Titer ermittelt. Auf eine ausführlichere Darstellung der Ergebnisse für die Komplementbindungsreaktion wird verzichtet, da deren Durchführung keinen Zugewinn an Information zu den Ergebnissen von ELISA und IIFT ergab. 3.4.2 Wiederholungsuntersuchungen und Titerverläufe Von den Probanden mit gesicherter abgelaufener Infektion hatten n=25 einer zweiten Blutentnahme zugestimmt und waren für diese erreichbar. Bei diesen wurden mit Ausnahme des IIFT alle bereits in der ersten Untersuchung verwendeten Testverfahren nach 9-12 Monaten wiederholt, um eine Aussage über die Konstanz der Antikörpernachweise zu ermöglichen. In allen n=25 Fällen, in denen in der ersten Untersuchung im ELISA IgGAntikörper gegen Phase 2 nachgewiesen wurden, war dies auch in der zweiten Untersuchung der Fall. Auch wenn ein direkter Vergleich der absolut gemessenen Werte in U/ml methodenbedingt nur bedingt möglich ist, können Tendenzen beschrieben werden: Seren mit hohen Titern in der ersten Untersuchung hatten im Vergleich zu anderen Proben auch beim erneuten Test die höchsten Werte. Die Mehrheit der Seren (21 von 25 Proben) zeigten bei der zweite Untersuchung geringere Titer. 34 Von den vier Proben mit den höchsten Titern im ersten ELISA-Test (Probanden mit Code Nr. 229, 263, 313, 333: jeweils 500 U/ml) bestätigen sich diese bei dreien auf gleicher Höhe. Dies waren gleichzeitig die Seren, bei denen der Verdacht auf eine chronische Infektion bestand (siehe 3.4.4) In allen Fällen, in denen in der ersten Untersuchung mittels ELISA IgM-Antikörper gegen Phase 2 nachgewiesen wurden und die zu der zweiten Untersuchung zur Verfügung standen (n=3), konnte dies bestätigt werden (Proben mit Code-Nr. 263, 328, 332). Zwei Studienteilnehmer (Code-Nummern 230 und 313) hatten im Fragebogen die Frage nach einer bereits bekannten, serologisch gesicherten Q-Fieber - Infektion bejaht. Beide Betroffenen waren Zeit- bzw. Berufssoldaten und gehörten der Gruppe der mit über 36 Monaten am längsten in Stetten Exponierten an. Zeitpunkte der Erstdiagnose waren August und September 1999, so dass die Vermutung eines Zusammenhanges zu dem Q-Fieber - Ausbruch in Stetten nahe liegt. Damit fanden die hier durchgeführten serologischen Tests in diesen beiden Fällen etwa 2 und 3 Jahre nach dem vermutlichen Infektionsereignis statt. Bei beiden Proben waren jeweils IgG-Antikörper gegen Phase 2 auf konstantem Niveau nachweisbar und mittels IIFT zu bestätigen, im Falle des Serums mir der Code-Nummer 230 mit geringerer Titerhöhe (jeweils unter <100U/ml), im Falle der Probe Nr. 313 mit konstant hohem Titer (jeweils 500 U/ml). Für letztere bestand auch der Verdacht auf eine chronische Infektion (siehe 3.4.4) 3.4.3 Untersuchungen auf mögliche frische Q-Fieber - Infektion Bei etwa 1% (n=5) der Probanden ließen sich mittels ELISA IgM-Antikörper gegen Phase 2 nachweisen, was auf eine mögliche Infektion mit Coxiella burnetii innerhalb der letzten 6 Monate vor der Untersuchung hinweisen kann. Je zwei dieser Personen gehörten zur Gruppe der Rekruten bzw. zur Gruppe derer mit einer Aufenthaltsdauer über 36 Monate, eine Person zur Gruppe mit unter 36 Monaten Verweildauer in Stetten. In jedem der n=5 Fälle mit Nachweis von IgM-Antikörpern konnte auch ein positiver IgG-Titer gegen Phase 2 im ELISA nachgewiesen werden. 35 3.4.4 Untersuchungen auf mögliche chronische Q-Fieber - Infektion Um Hinweise auf eine mögliche chronische Infektion zu erhalten, wurde bei n=25 Probanden mit bestätigter zurückliegender Infektion im Rahmen der zweiten Untersuchung ein ELISA-Test auf IgG- und IgA- Antikörper gegen Phase 1 durchgeführt. Alle n=25 Probanden stammten aus der Gruppe der Nichtrekruten, 23 davon aus der Gruppe mit der längsten Aufenthaltsdauer am Standort. Unter Vernachlässigung der grenzwertigen Testergebnisse wurden in n=9 von 25 Seren IgG und / oder IgA gegen Ph.1 nachgewiesen, wie die Übersicht in Tab.17 zeigt. Tabelle 17 Nachweise von Antikörpern gegen Phase 1 von C. burnetii im ELISA Untersucht wurden n=25 Probanden mit gesicherter zurückliegender Infektion (ELISA IgG Ph.2 und IIFT Ph.2 positiv), die für eine zweite Blutabnahme erreichbar waren und dieser zugestimmt hatten. In 36 % dieser Proben (n=9) wurden im ELISA IgG und/oder IgA gegen Ph.1 nachgewiesen, grenzwertige Fälle wurden nicht berücksichtigt. Die angegebenen Prozentwerte bei positiven Ergebnissen entsprechen der Abweichung des Messwertes der jeweiligen Probe zum Messwert des verwendeten Cut-off Serums. In mindestens 4 Fällen (*) besteht nach Konsultation des Referenzlabors aufgrund der Titerhöhe bzw. wegen des Nachweises beider Antikörperklassen der Verdacht auf eine chronische Q-Fieber-Infektion: Code-Nummer 263, 313, 331 und 333. * = Hinweis auf chronische Infektion (C. burnetii = Coxiella burnetii, ELISA = Enzyme-linked immunosorbent assay, IIFT = Indirekter Immunfluoreszenztest, IgG/A = Immunglobuline der Klasse G/A, Ph = Phase) IgG – ELISA IgA – ELISA gegen Phase 1 gegen Phase 1 263 * Positiv (+200 %) Positiv (+424 %) 287 Positiv (+13 %) Negativ 294 Positiv (+14 %) Negativ 313 * Positiv (+122 %) Negativ 327 Negativ Positiv (+18 %) 328 Positiv (+69 %) Negativ 331 * Positiv (+15 %) Positiv (+52 %) 332 Positiv (+34 %) Negativ 333 * Positiv (+185 %) Positiv (+599 %) Code-Nummer 36 Nach Konsultation des Referenzlabors für Q-Fieber am Landesgesundheitsamt Baden-Württemberg in Stuttgart besteht in mindestens 4 dieser Fälle (*) aufgrund der Titerhöhe bzw. wegen des Nachweises beider Immunglobulinklassen der Verdacht auf eine chronische Infektion mit Coxiella burnetii: Dies gilt für die Probanden mit den Code-Nummern 263, 313, 331 und 333. Diese vier auf eine chronische Verlaufsform verdächtigen Seren stammten alle von Personen aus der Gruppe der Probanden mit der längsten Aufenthaltsdauer in Stetten a.k.M. 3.5 Prävalenz spezifischer Antikörper gegen C. burnetii 3.5.1 Ergebnisse des Screeningtests (IgG-ELISA gegen Phase 2) Bei allen (n=507) Studienteilnehmern wurde eine ELISA-Untersuchung auf Antikörper der Klasse IgG gegen Phase 2-Antigen von Coxiella burnetii durchgeführt. Diese ergab bei insgesamt 29 % (n=147) einen positiven Wert. Ein positives Testergebnis weist auf einen möglicherweise stattgehabten Erregerkontakt hin, die Möglichkeit falsch-positiver Ergebnisse erfordert jedoch eine Bestätigung positiver ELISA-Resultate durch ein geeignetes Testverfahren. Bereits die ELISA-Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Prävalenz der IgGAntikörper gegen Phase 2 eine Abhängigkeit von der Untersuchungsgruppe und damit von der Dauer des Aufenthaltes am Standort Stetten a.k.M. zeigt: Der Anteil von Probanden mit serologischem Hinweis auf möglichen Erregerkontakt beträgt in der Gruppe der Rekruten 24% (96 von 396 Seren positiv). Innerhalb der Rekrutengruppe bestand dabei kein wesentlicher Unterschied zwischen den aus dem Landkreis Sigmaringen stammenden (27 % seropositiv) und den übrigen Probanden (24 % seropositiv). Demgegenüber lassen sich diese Antikörper in der Gruppe der Nichtrekruten in 45,9 % (51 von 111 Seren) nachweisen. Der Unterschied zwischen der Gruppe der Rekruten und der Gruppe der Nichtrekruten ist signifikant (p<0,01, Chi-Quadrat-Test). Auch zwischen den Untergruppen der Nichtrekruten existieren deutliche Unterschiede: Während sich der Anteil von Untersuchten mit serologischem Hinweis auf Erregerkontakt in der Gruppe der Nichtrekruten mit bis zu 36 Monaten Aufenthaltsdauer mit 23 % (11 von 47 Seren positiv) praktisch nicht von 37 dem Ergebnis für die Rekrutengruppe (24 % seropositiv) unterscheidet, wurden bei nahezu zwei Dritteln (63 %, 40 von 64 Seren) aller Personen aus der Gruppe mit über 36-monatiger Verweildauer in Stetten a.k.M. IgG-Antikörper gegen Phase 2 im ELISA nachgewiesen. Diese Verteilung ist in Tab.18 dargestellt. Der Unterschied zwischen den drei untersuchten Gruppen ist ebenfalls signifikant (p<0,01, Chi-Quadrat-Test). Darüber hinaus zeigte die Höhe der gemessenen IgG-Titer [U/ml] einen Zusammenhang mit der Aufenthaltsdauer in Stetten a.k.M., mit zunehmender Aufenthaltsdauer kamen dabei tendenziell höhere Antikörpertiter vor. Tabelle 18 Ergebnisse des Screeningtestes auf Q-Fieber (IgG ELISA gegen Phase 2) Dargestellt sind die Ergebnisse für den ELISA-Test auf IgG gegen Phase 2 nach Gruppen. Der Anteil seropositiver Probanden unterscheidet sich zwischen der Gruppe der Rekruten (24 %) und der Gruppe der Nichtrekruten mit bis zu 36 Monaten Aufenthaltsdauer (23 %) kaum. Ein signifikanter Unterschied besteht hingegen zur Gruppe der Nichtrekruten mit einer über 36-monatigen Aufenthaltsdauer: Hier waren 63 % der Probanden seropositiv (p<0,01, Chi-Quadrat-Test). Somit zeigten bereits die Ergebnisse des als Screeningtest eingesetzten ELISA auf IgG gegen Phase 2 eine Abhängigkeit von der Gruppenzugehörigkeit und damit von der Aufenthaltsdauer am Standort. Ein positives Ergebnis in diesem häufig als Screeningverfahren eingesetzten Test weist auf eine mögliche Infektion hin, muss aber durch ein geeignetes Verfahren, hier einen indirekten Immunfluoreszenztest (IIFT), bestätigt werden. (ELISA = Enzyme-linked immunosorbent assay, IgG = Immunglobuline der Klasse G) ELISA ELISA IgG Phase 2 IgG Phase 2 negativ positiv n = 300 n = 96 n = 396 75,8 % 24,2 % 100 % n = 36 n = 11 n = 47 Reihenprozent 76,6 % 23,4 % 100 % über 36 Monate Aufenthaltsdauer n = 24 n = 40 n = 64 Reihenprozent 37,5 % 62,5 % 100 % n = 360 n = 147 n = 507 71,0 % 29 % 100 % Summe Rekruten Reihenprozent Nichtrekruten bis 36 Monate Aufenthaltsdauer Nichtrekruten Summe Reihenprozent 38 3.5.2 Ergebnisse des Bestätigungstestes (IIFT gegen Phase 2) In den Fällen, in denen die ELISA-Untersuchung gegen Phase 2 – Antigen einen positiven IgG – Titer ergeben hatte, schloss sich ein indirekter Immunfluoreszenztest (IIFT) gegen Phase 2 als Bestätigungstest an. Bezogen auf alle n=507 getesteten Seren fiel dieser in 14 % positiv aus (60 eindeutig positive und 11 grenzwertige Seren). In diesen Fällen ist eine zurückliegende Infektion mit C. burnetii als gesichert anzusehen. Bezogen auf die Gruppen gilt dies nur für 9 % der untersuchten Rekruten (37 von 396 Seren) bzw. für 6 % der Nichtrekruten mit einer Aufenthaltsdauer bis zu 36 Monaten (3 von 47 Seren). Dagegen kann bei nahezu der Hälfte der Gruppe mit über 36-monatigem Aufenthalt am Standort sicher von einem Kontakt mit C. burnetii ausgegangen werden: Ein positiver IIFT-Test lag hier in 48% aller Fälle (31 von 64 Seren) vor. Der Unterschied in der Verteilung positiver IIFT-Testergebnisse zwischen der Gruppe der Rekruten und der der Nichtrekruten insgesamt ist statistisch signifikant (p<0,05). Ebenso besteht eine statistisch signifikante Differenz zwischen den Rekruten und der Gruppe mit der längsten Aufenthaltsdauer von über 36 Monaten (p<0,05). Dem gegenüber ließ sich zwischen den Rekruten und den Probanden mit einer Aufenthaltsdauer von bis zu 36 Monaten kein Unterschied feststellen. Die Verteilung der positiven und negativen IIFT-Tests auf die Untersuchungsgruppen ist in Tab.19 dargestellt. Eine grafische Zusammenfassung der Prävalenz spezifischer Antikörper gegen C. burnetii in Screening- und Bestätigungstest vermittelt Abb.5. Die Häufigkeit einer zurückliegenden Q-Fieber - Infektion und damit die Durchseuchung mit C. burnetii ist demnach stark abhängig von der jeweiligen Untersuchungsgruppe und damit von der Aufenthaltsdauer am Standort Stetten a.k.M. Diese Abhängigkeit zeigt sich sowohl für den Nachweis spezifischer IgGAntikörper gegen Phase 2 im ELISA (Screeningtest) als auch für die Verteilung positiver Testergebnisse im IIFT gegen Phase 2 (Bestätigungstest). 39 Auch die Häufigkeit, mit der ein auffälliges Screeningergebnis im IIFT bestätigt werden konnte, zeigte diesen Zusammenhang, auf den im Folgenden gesondert eingegangen wird. Tabelle 19 Ergebnisse des Bestätigungstestes (IIFT gegen Phase 2) Dargestellt ist die Verteilung positiver und negativer Ergebnisse im indirekten Immunfluoreszenztest (IIFT) gegen Phase 2 nach Gruppen. Für 14% aller n=507 Untersuchten konnte der IgG-Nachweis gegen Ph.2 im ELISA (Screeningtest) durch ein positives Resultat im IIFT bestätigt werden. Eine zurückliegende Q-Fieber - Infektion gilt bei diesen Probanden als gesichert. Die Häufigkeit ist dabei stark von der Gruppenzugehörigkeit abhängig: So gilt dies in der Gruppe der Rekruten (9%) und der Nichtrekruten bis 36 Mon. Aufenthaltsdauer (6%) jeweils nur für einen relativ kleinen Teil der Probanden. Dem gegenüber zeigte etwa die Hälfte (48%) der Probanden mit der längsten Aufenthaltsdauer von über 36 Monaten am Standort ein positives IIFT-Ergebnis und hatte demzufolge einen gesicherten Erregerkontakt. Der Unterschied zwischen den Gruppen ist statistisch signifikant (p<0,05). (IIFT = Indirekter Immunfluoreszenztest) IIFT IIFT Phase 2 Phase 2 negativ positiv Summe n = 359 n = 37 n = 396 90,7 % 9,3 % 100 % n = 44 n=3 n = 47 Reihenprozent 93,6 % 6,4 % 100 % über 36 Monate Aufenthaltsdauer n = 33 n = 31 n = 64 Reihenprozent 51,6 % 48,4 % 100 % n = 436 n = 71 n = 507 86,0 % 14,0 % 100 % Rekruten Reihenprozent Nichtrekruten bis 36 Monate Aufenthaltsdauer Nichtrekruten Summe Reihenprozent 40 Prävalenz spezifischer Antikörper gegen C. burnetii in Screeningtest (ELISA) und Bestätigungstest (IIFT) nach Gruppenzugehörigkeit Anteil[%] 80 60 40 20 0 Rekruten Nichtrekruten bis 36 Mon Nichtrekruten über 36 Mon Untersuchungsgruppen IgG Ph. 2 ELISA (Screeningtest) Abbildung 5 IIFT Ph.2 (Bestätigungstest) Prävalenz spezifischer Antikörper gegen C. burnetii in Screeningtest (ELISA) und Bestätigungstest (IIFT) nach Gruppenzugehörigkeit. Die Verteilung der Ergebnisse beider Testverfahren zeigt eine deutliche Abhängigkeit von der untersuchten Gruppe. Positive Ergebnisse kamen in der Gruppe mit der längsten Aufenthaltsdauer am Standort am häufigsten vor, der Unterschied zu den anderen Gruppen erwies sich als statistisch signifikant (p<0,05). Die Unterschiede zwischen der Rekrutengruppe und der Gruppe der Nichtrekruten mit einer Aufenthaltsdauer von bis zu 36 Monaten sind dagegen gering und statistisch nicht signifikant. Weiter ist zu erkennen, dass der Anteil bestätigter positiver Screeningergebnisse und damit der positiv prädiktive Wert des ELISA in der Gruppe mit der längsten Aufenthaltsdauer deutlich höher ist als in den anderen beiden Gruppen. Die Häufigkeit einer zurückliegenden Q-Fieber - Infektion und damit die Durchseuchung mit C. burnetii zeigte in dieser Untersuchung einen deutlichen Zusammenhang zur Aufenthaltsdauer am Standort Stetten a.k.M. (C. burnetii = Coxiella burnetii, Mon.= Monate, ELISA = Enzyme-linked immunosorbent assay, IIFT = Indirekter Immunfluoreszenztest, IgG= Immunglobulin Klasse G, Ph. =Phase) 3.5.3 Positiv prädiktiver Wert (PPV) des ELISA als Screeninguntersuchung Von 147 im ELISA positiven Seren reagierten 41% (n=60) im IIFT eindeutig positiv, in weiteren 7% (n=11) ergab sich ein grenzwertiges Testergebnis. In diesen Fällen ließ sich das positive Screeningergebnis bestätigen. Für eine Aussage zur Größenordnung des positiv prädiktiven Wertes (PPV) des ELISA gemessen am als Goldstandard geltenden IIFT wurde der PPV einmal ohne und einmal mit den grenzwertigen Ergebnissen bestimmt. Da der PPV im allgemeinen von der Prävalenz der Infektion abhängt und diese zwischen den Untersuchungsgruppen variierte, zeigte sich anhand der 41 vorliegenden Daten auch eine Abhängigkeit des positiv prädiktiven Wertes von der untersuchten Gruppe. In der Gruppe der Rekruten und in der Gruppe der Nichtrekruten bis 36 Monate Aufenthaltsdauer ließ sich jeweils weniger als ein Drittel der IgG-Titer aus der ELISA-Untersuchung durch ein eindeutig positives Ergebnis im IIFT bestätigen (28% bzw. 27%). Unter Berücksichtigung der grenzwertigen Werte erhöht sich der Anteil in der Rekrutengruppe auf 39%, da in dieser Gruppe die meisten grenzwertigen Reaktionen im IIFT vorkamen. In der Gruppe mit der längsten Aufenthaltsdauer von über 36 Monaten ließen sich etwa drei Viertel der IgG-Antikörpernachweise gegen Phase 2 aus dem ELISA bestätigen: Im IIFT ergaben sich 75% eindeutig positive Ergebnisse, unter Einbeziehung der grenzwertigen Testergebnisse erhöhte sich deren Anteil 78%. Die Häufigkeit, mit der ein positives Screeningergebnis (ELISA IgG Ph.2 positiv) in den Untersuchungsgruppen bestätigte werden konnte (ELISA IgG Ph.2 positiv und IIFT Ph.2 positiv), ist in Tab.20 dargestellt. Die grafische Darstellung des positiv prädiktiven Wertes des ELISA gemessen am Standardverfahren IIFT für die einzelnen Gruppen liefert Abbildung 6. Für die Wahrscheinlichkeit, mit der ein positiver Antikörpernachweis im ELISA mittels IIFT bestätigt werden kann, zeigte sich neben der Abhängigkeit von der untersuchten Gruppe ein Zusammenhang mit der Titerhöhe im ELISA auf IgG gegen Phase 2: Je höher der im ELISA gemessene Titer von IgG-Antikörpern gegen Phase 2 war, desto eher fiel auch der Bestätigungstest IIFT positiv aus: Nach Angaben des Herstellers gilt ein Ergebnis zwischen 20-30 U/ml als grenzwertig, als positiv gilt der ELISA gegen Phase 2 IgG bei Antikörperaktivitäten >30 U/ml. Nur etwa ein Fünftel der niedrigtitrigen positiven ELISA- Untersuchungen (bis 50 U/ml) ließen sich im IIFT bestätigen, für Titerhöhen zwischen >50 und 110 U/ml liegt der Anteil zwischen zwei Dritteln und 100 %. Titer >110 U/ml im Screeningtest ELISA konnten zu 100% mittels einer positiven Reaktion im indirekten Immunfluoreszenztest bestätigt werden. 42 Tabelle 20 Häufigkeit bestätigter Screeningtests nach Untersuchungsgruppen Dargestellt ist der Anteil positiv bestätigter Screeningtests (IIFT Ph.2 positiv) in den Untersuchungsgruppen bei insgesamt n=147 Probanden mit positivem Screeningergebnis (ELISA IgG Ph.2 positiv). Hierbei wurden einmal die n=11 grenzwertig positiven IIFTErgebnisse zu den eindeutig positiven gezählt und einmal nicht berücksichtigt. Der prozentuale Anteil der Bestätigten unter den positiven ELISA-Tests erlaubt eine Aussage zum positiv prädiktiven Wert (PPV) des ELISA als Screeningverfahren verglichen mit dem IIFT als Goldstandard. Der PPV hing von der betrachteten Gruppe ab und betrug in der Rekrutengruppe zwischen 28% und 39%, in der Gruppe der Nichtrekruten mit einer Aufenthaltsdauer von bis zu 36 Monaten 27 %. Dem gegenüber lag der Anteil bestätigter positiver Screeningstests in der Gruppe mit der längsten Aufenthaltsdauer am Standort je nach Betrachtungsweise zwischen 75% und 78%, damit war der PPV des IgG-ELISA gegen Ph.2 als Screeningverfahren in dieser Gruppe am höchsten. Zusätzlich dargestellt sind die 95%- Konfidenzintervalle (KI) für die PPV-Schätzer. (KI = 95%-Konfidenzintervall, ELISA = Enzyme-linked immunosorbent assay, IIFT = Indirekter Immunfluoreszenztest, IgG = Immunglobuline der Klasse G, Ph. = Phase) Bestätigte Screeningtests (ELISA IgG Ph.2 positiv + IIFT Ph.2 positiv) Probanden mit Ohne Mit positivem Screeningtest grenzwertig positive grenzwertig positiven (ELISA IgG Ph.2 positiv) IIFT-Ergebnisse IIFT-Ergebnissen Rekruten n = 27 n = 37 28,1 % 38,5 % (n=96) (KI: 18,6 %-37,6 %) (KI: 28,3 %-48,8 %) Nichtrekruten n=3 n=3 bis 36 Monate Aufenthaltsdauer 27,3 % 27,3 % (n=11) (KI: 0 % - 58,1 %) (KI: 0 % - 58,1%) Nichtrekruten n = 30 n = 31 über 36 Monate Aufenthaltsdauer 75,0 % 77,5 % (n=40) (KI: 60,3 %-89,7 %) (KI: 63,3 %-91,7 %) 43 Positiv prädiktiver Wert (PPV) des Screenigtests (IgG-ELISA gegen Phase 2) gemessen am Bestätigungstest (IIFT) in Abhängigkeit von der Untersuchungsgruppe PPV in Prozent 100 80 60 40 20 0 Rekruten Nichtrekruten bis 36 Monate Nichtrekruten über 36 Monate Untersuchungsgruppe Abbildung 6 Positiv prädiktiver Wert (PPV) des Screeningtests (IgG-ELISA, Phase 2) gemessen am Bestätigungstest (IIFT) Dargestellt ist der positiv prädiktive Wert (PPV) als Boxplot in Abhängigkeit von der Untersuchungsgruppe. Die Linien beschreiben den Bereich von der unteren 95%Konfidenzgrenze bei Berechnung ohne grenzwertige IIFT bis zur oberen 95%Konfidenzgrenze bei Berechnung mit grenzwertigen IIFT. Die Box beschreibt den Bereich vom geschätzten PPV ohne grenzwertige IIFT bis zum PPV mit grenzwertigen IIFTErgebnissen. Es zeigte sich eine Abhängigkeit des PPV von der untersuchten Gruppe. Allgemein ist der PPV eines Testverfahrens abhängig von der Prävalenz der untersuchten Erkrankung im betrachteten Kollektiv. Da die Seroprävalenz für spezifische Antikörper gegen C. burnetii signifikante Unterschiede zwischen den Untersuchungsgruppen aufwies (s. Abb. 5), bestand dieser Zusammenhang auch für den PPV des Screeningverfahrens ELISA gemessen am Bestätigungstest IIFT. (PPV = positiv prädiktiver Wert, ELISA = Enzyme-linked immunosorbent assay, IIFT = Indirekter Immunfluoreszenztest, IgG = Immunglobuline der Klasse G) Eine grafische Zusammenfassung des Untersuchungsablaufes und der serologischen Ergebnisse zur Seroprävalenz spezifischer Antikörper gegen C. burnetii ist in Abb. 7 dargestellt. 44 Probanden n = 507 Rekruten: n= 396 NR≤ 36 Mon.: n= 47 NR> 36 Mon.: n= 64 Negativ : Kein Hinweis auf Erregerkontakt ELISA IgG Ph.2 Negativ : ELISA IgM Ph.2 Kein Hinweis auf frische Infektion Positiv: Positiv : Hinweis auf zurückliegenden Erregerkontakt Hinweis auf frische Infektion 29 % (n=147) 1% (n=5) Rekruten: 24% NR≤ 36 Mon.: 23% NR> 36 Mon.: 63% (p< 0,01, Chi-Quadrat-Test) Negativ : Falsch-positives Screeningergebnis IIFT Ph. 2 Positiv: Seroprävalenz spezifischer Antikörper gegen C. burnetii 14 % (n=71) Rekruten: NR≤ 36 Mon.: NR> 36 Mon.: 9% 6% 48% (p< 0,01, Chi-Quadrat-Test) Abbildung 7 Untersuchungsablauf und -ergebnisse zur Seroprävalenz von spezifischen Antikörpern gegen C. burnetii Dargestellt ist die Reihenfolge von Screeningtest (ELISA IgG, Ph.2) und Bestätigungstest (IIFT, Ph.2) sowie die dabei erhaltenen Ergebnisse insgesamt und nach Untersuchungsgruppen aufgeschlüsselt. Die Unterschiede der Seroprävalenz zwischen den Gruppen erwiesen sich als signifikant. (NR ≤36 / >36 Mon. = Gruppe der Nichtrekruten mit Aufenthaltsdauer von bis zu / über 36 Monaten, IgG / IgM = Immunglobulin G / M, Ph. 2 = Phase 2 von C. burnetii, C. burnetii = Coxiella burnetii, ELISA = Enzyme-linked immunosorbent assay, IIFT = Indirekter Immunfluoreszenztest, pos.= positiv, neg.= negativ) 45 4 Diskussion Im Folgenden sollen zuerst methodische Aspekte der Arbeit diskutiert werden, um dann die Ergebnisse vor dem Hintergrund existierender Literatur einzuordnen und mögliche Schlussfolgerungen zu erörtern. 4.1 Diskussion der Methoden 4.1.1 Untersuchungspopulation und Verteilung auf Untersuchungsgruppen Im Unterschied zu bereits existierenden Seroprävalenzstudien an größeren Kollektiven wie Blutspendern wurden in dieser Untersuchung zusätzlich persönliche Angaben der Probanden mittels Fragebogen erhoben und ausgewertet. Hierdurch sollten mögliche Risikofaktoren für eine Q-Fieber Infektion ermittelt werden. Die Aufenthaltsdauer am Standort Stetten a.k.M. zum Zeitpunkt der ersten Blutabnahme stellte das wesentliche Kriterium für die Zuordnung zu den Untersuchungsgruppen dar. Alle n=507 Probanden waren Männer, so dass etwaige Einflüsse durch geschlechtsspezifische Unterschiede [37, 27, 59, 56] nicht auftreten konnten. Die Zuordnung zur Gruppe der Rekruten beinhaltete, dass die Blutabnahme spätestens in der dritten Woche nach Eintreffen der Probanden in Stetten a.k.M. durchgeführt wurde. Dies war insofern von Bedeutung, als die Probengewinnung vor einer eventuellen Serokonversion durch einen dortigen Erregerkontakt stattfand und die Laborergebnisse damit den Antikörperstatus vor Dienstantritt widerspiegelten. Ein Einfluss durch eine möglicherweise bestehende klinisch manifeste Infektion wurde bei der unmittelbar zuvor durchgeführten ärztlichen Einstellungsuntersuchung ausgeschlossen. Die Altersverteilung in der Rekrutengruppe erwies sich als homogen. Die Rekruten können damit als Referenzgruppe ohne vorangegangene Exposition am Standort gelten und Rückschlüsse auf die allgemeine Durchseuchung mit C. burnetii in einem Kollektiv ohne besondere Infektionsrisiken zulassen. Die am Standort exponierte Gruppe der Nichtrekruten wurde nach den Fragebogenangaben in eine Gruppe mit bis zu 36 Monaten und in eine Gruppe mit über 36 Monaten Aufenthaltsdauer unterteilt. Insbesondere in letzterer ist die 46 Altersverteilung uneinheitlicher, es dominieren eher die höheren Altersklassen, wobei dieser Effekt naturgemäß mit der Dauer des Aufenthaltes korreliert. Die Verfügbarkeit gleich großer Untersuchungsgruppen wäre grundsätzlich wünschenswert, die limitierte Zahl in Frage kommender Probanden mit längeren Aufenthaltszeiten am Standort ließ dies jedoch nicht zu. Der Fragebogen war inhaltlich an den der Ausbruchsuntersuchung von 1999 angelehnt [35]. Zusätzlich zu den damals erfragten möglichen Risikofaktoren wurden Fragen aufgenommen, die sich aus anderen Veröffentlichungen ergaben. Dies galt beispielsweise für die Frage nach der Bedeutung von Haustieren als Erregerreservoir bzw. Vektor von C. burnetii [79, 32]. Fragen nach Krankheitssymptomen wurden belassen, um im Fall einer Häufung akuter Infektionen deren klinischen Verlauf beschreiben zu können. Aufgrund der geringen Zahl von serologischen Hinweisen auf eine mögliche frische Infektion (n=5) erwiesen sich diese Fragen in Nachhinein jedoch als nicht relevant. 4.1.2 Auswahl der serologischen Untersuchungsverfahren Serologische Verfahren wurden in der Vergangenheit wiederholt auf ihre Tauglichkeit und Aussagefähigkeit in der Diagnostik von Q-Fieber untersucht. Die als etabliert und zuverlässig geltenden [14, 16, 6, 45] wurden auch in der vorliegenden Arbeit durchgeführt: Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA), indirekter Immunfluoreszenztest (IIFT) und Komplementbindungsreaktion (KBR). Alle erlauben die Unterscheidung von Antikörpern gegen Phase 1 bzw. Phase 2, ELISA und IFT darüber hinaus den Nachweis unterschiedlicher Immunglobulinklassen. Die objektive Testauswertung mit möglicher Standardisierung zwischen unterschiedlichen Laboratorien, die Möglichkeit zur Automatisierung und die hohe Spezifität für den IgG-Nachweis auch Jahre nach einer Infektion machen den ELISA zum diagnostischen Verfahren der Wahl für epidemiologische Screeninguntersuchungen. Da auch geringe Antikörperkonzentrationen erfasst werden, bietet sich dieser Test zur Frühdiagnostik in nur einer Serumprobe an, wenn der Verdacht auf eine frische Infektion besteht. Die Möglichkeit falsch-positiver Ergebnisse macht es empfehlenswert, positive Testresultate einem Bestätigungstest beispielsweise mittels IIFT zu unterziehen 47 [15, 33, 14, 16, 34, 77, 45]. In diesem Sinne wurden in der vorliegenden Arbeit alle Seren zunächst einem ELISA auf IgG- und IgM-Antikörper gegen Phase 2 unterzogen. In positiven Fällen erfolgte die weitere Untersuchung mittels IIFT als Bestätigungstest. Der IIFT gilt als Referenzmethode in der Serodiagnostik für Q-Fieber, der eine Sensitivität von bis zu 100 % erreicht. Nachteilig ist, dass der Einsatz des IIFT ein spezielles Fluoreszenzmikroskop und erfahrene Untersucher für die subjektive Auswertung erfordert. Auch beim IIFT sind falsch-positive Testresultate durch Rheumafaktor im Serum oder Kreuzreaktionen mit anderen Erregern möglich [14, 15, 16]. In dieser Untersuchung wurde der IIFT als qualitative Bestimmung in der Verdünnung 1:80 durchgeführt. Die Aussagefähigkeit ließe sich durch eine quantitative Durchführung mit Angabe einer Titerhöhe verbessern. Ergänzend zum IIFT wurde bei den in der Screeninguntersuchung auffälligen Proben eine KBR auf Phase 2 und Phase 1 durchgeführt. Die KBR ist das in der Serodiagnostik von Q-Fieber am längsten angewendete Verfahren. Die KBR gilt als hochspezifisch, jedoch weniger sensitiv als der IIFT oder ELISA, vor allem in frühen Infektionsstadien. Der Nachweis von Antikörpern sowohl gegen Phase 1 als auch gegen Phase 2 ist möglich, allerdings ist keine Differenzierung von Antikörperklassen möglich und zur Interpretation des Ergebnisses sind gepaarte Seren erforderlich. Aufgrund der Mängel in der Akutdiagnostik wurde bereits 1992 vorgeschlagen, auf die KBR zugunsten von ELISA und IIFT zu verzichten [14, 16, 6]. Bezüglich der Sensitivität erwiesen sich sowohl IIFT als auch ELISA der KBR deutlich überlegen [14, 45, 51], daher lösten diese Verfahren in der Praxis die KBR zunehmend ab. Auch in der vorliegenden Arbeit erbrachte die Durchführung der KBR keine relevanten Zusatzinformationen. Allgemein verschlechtert sich die Spezifität serologischer Tests durch eventuell vorkommende Kreuzreaktionen. Im Falle von Q-Fieber sind falsch-positive IgMNachweise in IIFT und ELISA aufgrund vorhandener Rheumafaktoren beschrieben, wobei dieser Effekt vor allem in Seren von Patienten mit chronischem Q-Fieber zutage treten soll [14, 43, 46]. 48 Da Rheumafaktoren bei vielen Infektionskrankheiten auftreten, werden sie in der Routinediagnostik für den IgM-Nachweis mittels eines Adsorbens aus dem Testserum entfernt, so auch in dieser Arbeit. Weitere Kreuzreaktionen für IgM-, IgG bzw. IgA-ELISA sind beschrieben für Seren von Patienten mit Leptospirose [14, 15] und bei Infektionen mit EBV, Mycoplasma pneumoniae und Bordetella pertussis [7], sowie für IgG-Nachweise gegen Legionella micdadei [42]. Für andere Erreger wie CMV, Mykoplasmen, Brucellen oder Chlamydien scheint dies nicht der Fall zu sein [14, 15]. Letztlich ist das wahre Ausmaß und damit die Bedeutung einer Kreuzreaktivität zu anderen Erregern in der Serodiagnostik von Q-Fieber noch nicht geklärt, sollte aber grundsätzlich als mögliche Fehlerquelle bedacht werden [14]. Dies gilt insbesondere im klinischen Bereich, wo die genaue Erregerdifferenzierung für eine effektive Therapie unerlässlich ist [42]. 4.1.3 Statistische Verfahren Die Ergebnisse wurden im Wesentlichen deskriptiv dargestellt. Mit Hilfe von Chiquadrattests ließen sich mögliche Risikofaktoren identifizieren. Die Ergebnisse bestätigen Hinweise aus Untersuchungen von Q-Fieber - Ausbrüchen und deuten deshalb wahrscheinlich auf reale Risikofaktoren hin. Eine der Untersuchung zugrundeliegende Annahme war, dass mit zunehmender Expositionsdauer gegenüber einem erhöhten Infektionsrisiko durch die Nähe zu Schafen und deren Weideflächen–hier durch den Aufenthalt am Standort Stetten approximiert – auch die Seroprävalenz von Antikörpern gegen den Erreger von Q-Fieber zunimmt. Dementsprechend wurden die drei Gruppen nach Dauer ihres Aufenthaltes am Standort aufgeteilt und hinsichtlich der Seroprävalenz verglichen. Die hier vorgestellten Ergebnisse haben wegen der relativ kleinen länger am Standort exponierten Gruppen eher orientierenden Charakter. Anstrebenswert wäre es, diese Resultate in weiteren Studien an größeren Fallzahlen zu bestätigen und die untersuchten Studienpopulationen auf andere Altersgruppen und größere Regionen zu erweitern. Wegen der zum Teil kleinen Fallzahlen je Gruppe wurde hier auch auf mehrdimensionale Analysen verzichtet, da die Besetzung einzelner Zellen für stärker stratifizierte Auswertungen im Allgemeinen nicht ausreichte. 49 4.2 Diskussion der Ergebnisse Risikofaktoren für eine Q-Fieber - Infektion Die Auswertung der Fragebögen zu möglichen Risikofaktoren für eine Q-Fieber Infektion legt nahe, dass diese umso wahrscheinlicher ist, je enger der Kontakt zu Schafen oder deren Weiden ist und je länger die Exposition in einem solchen Umfeld andauert. Die Intensität der Exposition wurde im Fragebogen ermittelt durch die Fragen nach der Haustierhaltung von Schafen sowie nach dem Vorhandensein ihrer Weideflächen in Sichtweite des Wohnortes bzw. des Arbeitsplatzes. Für diese Fragen ließ sich ein statistisch relevanter Zusammenhang mit einer zurückliegenden Q-Fieber - Infektion ermitteln (jeweils p=0,01). Bereits bei der Untersuchung des Ausbruches in Stetten a.k.M. 1999 hatten seropositive Personen häufiger angegeben, dass Schafe in der Nähe ihres Wohnortes weideten. Ein statistisch signifikantes Risiko für eine akute Infektion hatte sich damals jedoch nur für einen Aufenthalt auf dem Fest in der Gemeinde ergeben [35]. Ein tendenzieller Zusammenhang zeichnete sich in der vorliegenden Arbeit darüber hinaus ab für die Haltung von Hund(en) als Haustier(e) (p=0,02) und für den Aufenthalt auf einem Bauernhof (p=0,04). Für Hunde wurde bereits ein möglicher Zusammenhang mit humanen Q-Fieber - Fällen beschrieben [79]. Der zumindest angedeutete Einfluss der Variable Bauernhof ist insofern erklärlich, als in einem solchen Umfeld mehrere mögliche Vektoren existieren. Die Tätigkeit als Landwirt zeigte jüngst in einer großen Seroprävalenzstudie in Süddeutschland als einzige Variable einen statistisch signifikanten Zusammenhang zu dem Nachweis spezifischer Antikörper gegen C. burnetii [18]. Wie schon in der Stettener Ausbruchsuntersuchung 1999 ließ sich auch in der vorliegenden Arbeit für die darüber hinaus erfragten Faktoren kein statistisch bedeutsamer Einfluss für eine Q-Fieber - Infektion ermitteln. Prävalenz spezifischer Antikörper gegen C. burnetii Zu der Seroprävalenz von Q-Fieber in bestimmten Ländern und Regionen liegen vielfältige Publikationen vor, die dort genannten Zahlen sind jedoch untereinander 50 nur schwer vergleichbar. Zum einen wurden diese teilweise mit unterschiedlichen serologischen Verfahren ermittelt, zum anderen sind unter Umständen auch bei gleichem Testprinzip die Cut-off-Werte zwischen den Labors nicht standardisiert [33]. Unter Berücksichtigung der jeweils angewandten Methode korrelieren die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung gut mit bereits veröffentlichten Daten. Im IgG-ELISA gegen Phase 2 („Screeningtest“) wurde in dieser Arbeit bei etwa 24% der Rekruten ein positives Ergebnis ermittelt. Dies deckt sich mit bereits bekannten Ergebnissen von ELISA-Tests auf IgGAntikörper gegen Coxiella burnetii in Deutschland: Bei zwei Untersuchungen an jeweils über 1600 Blutspenderseren aus allen Bundesländern wurden in der Vergangenheit jeweils 22 % positiv getestet [80, 66]. Wie bei den Rekruten kann bei den Seren von Blutspendern davon ausgegangen werden, dass keine klinischen Infektionszeichen oder besondere Risikofaktoren bezüglich Q-Fieber vorlagen und diese insofern eine realistische Einschätzung der Situation in der „Normalbevölkerung“ erlauben. Dem stehen in dieser Arbeit die Ergebnisse der Nichtrekruten mit der längsten Aufenthaltsdauer am Standort von über 36 Monaten gegenüber: Hier fielen 63% der ELISA-Tests auf IgG gegen Phase 2 positiv aus. Auch dieser Wert zeigt eine gute Korrelation zu bereits vorliegenden Untersuchungen an einem Personenkreis mit einem potentiell erhöhten Infektionsrisiko: Unter Beschäftigten aus Landwirtschaft und Veterinärmedizin waren in der Vergangenheit 65 % positiv getestet worden [66]. Im Gegensatz zu den genannten vorangegangenen Untersuchungen wurden in dieser Arbeit positive ELISA-Titer für IgG gegen Phase 2 einem Bestätigungstest mit dem IIFT unterzogen. Während ein positives Screeningergebnis im ELISA lediglich einen serologischen Hinweis auf einen stattgehabten Erregerkontakt gibt, kann dieser durch eine Bestätigung im IIFT als nahezu gesichert angesehen werden. Die Seroprävalenz spezifischer Antikörper gegen C. burnetii, die eine zurückliegende Infektion anzeigen, betrug in dieser Arbeit 14 % bezogen auf alle n=507 Probanden. Dabei existierte ein statistisch signifikanter Unterschied 51 zwischen den Antikörpernachweisen in der Gruppe der Rekruten (ca. 9%) und der Gruppe mit der längsten Aufenthaltsdauer am Standort (ca. 48 %). Die Seroprävalenz der Rekrutengruppe ohne bekannte Risikofaktoren korreliert mit den aktuellen Ergebnissen einer bevölkerungsbezogenen Seroprävalenzstudie des Landesgesundheitsamtes aus Leutkirch, wo in den zurückliegenden 5 Jahren kein Fall von Q-Fieber gemeldet worden war. Hier wurde bei 2447 Probanden eine Seroprävalenz von 7,4 % für spezifische IgG-Antikörper gegen Phase 2 ermittelt, wobei dabei ebenfalls ein IIFT zum Einsatz kam [18]. Eine ähnliche Studie an 376 Personen in Österreich beziffert die Prävalenz von Antikörpern gegen C. burnetii auf 6% [69]. In einem Kollektiv ohne bekannte Risikofaktoren für eine Q-Fieber - Infektion scheint diesen Daten zufolge eine Seroprävalenz von 6-9 % realistisch zu sein. In Studien aus Deutschland, denen ein Ausbruch vorausging, wurde mit 19 % [23] bzw. 23 % [39] ein deutlich größerer Anteil seropositiver Probanden ermittelt. Bei längerer Exposition gegenüber bekannten Risikofaktoren kann die Durchseuchung deutlich ansteigen. So wurde die in der Ausbruchsuntersuchung von 1999 ermittelte Seroprävalenz von 44% in der Stettener Bevölkerung [35] in der vorliegenden Arbeit durch das Ergebnis für die dort am längsten exponierten Gruppe (48 %) auf nahezu gleicher Höhe bestätigt. Hinweis auf frische Infektionen Ein serologischer Hinweis auf eine frische Infektion fand sich in etwa 1% aller Probanden. Diese n=5 Fälle mit Nachweis von IgM-Antikörpern gegen Phase 2 im ELISA verteilten sich gleichmäßig auf die Untersuchungsgruppen, bei allen war zusätzlich ein IgG-Titer gegen Phase 2 nachweisbar. Dies ist eine Konstellation, die eine frische Infektion innerhalb der letzten 6 Monate nahe legt [47, 77, 8]. In der Literatur ist für Nachweise von IgM gegen Phase 2 mittels ELISA eine Sensitivität von 92% - 99% verglichen mit der Referenzmethode beschrieben [14, 76], die Herstellerangaben für den hier verwendeten Test beschreiben eine Sensitivität von 93% bei einer Spezifität von 100% bezogen auf den IIFT [26]. IgM-Antikörper gegen Phase 2 können mittels IIFT und ELISA frühestens 7 Tage nach Symptombeginn nachgewiesen werden, IgG-Antikörper gegen Phase 2 treten einige Tage später auf [44, 43, 30]. 52 Die Inkubationszeit ist dosisabhängig und liegt bei 1-5 Wochen, durchschnittlich bei 2-3 Wochen, so dass mit dem Auftreten von Antikörpern frühestens 3-4 Wochen nach Infektion zu rechnen ist [67, 82]. Da die erste Blutabnahme bereits in der dritten Woche nach Dienstantritt der Rekruten in Stetten a.k.M. durchgeführt wurde, kann davon ausgegangen werden, dass der ursächliche Erregerkontakt für eine eventuelle frische Infektion in den genannten Fällen bereits vor Beginn des Aufenthaltes in Stetten a.k.M. stattgefunden hat und von diesem unabhängig ist. Der Anteil von etwa 1% der Probanden mit serologischem Hinweis auf eine frische Infektion erscheint angesichts vergleichbarer Zahlen aus der Querschnittsstudie in Leutkirch ebenfalls plausibel. Dort wurden bei etwa 0,8% der Untersuchten IgM-Antikörpern gegen Phase 2 nachgewiesen [18]. Hinweis auf chronische Infektion Bei n=25 seropositiven Probanden wurde nach 9-12 Monaten im Rahmen einer zweiten Blutentnahme ein ELISA auf IgG- und IgA-Antikörper gegen Phase 1 von C. burnetii durchgeführt, um eventuelle Hinweise für eine chronische Infektion zu erhalten [46]. In mindestens 4 Fällen bestand dieser Verdacht, allerdings erlauben die Ergebnisse aufgrund der geringen Probenanzahl nur eine orientierende Aussage. Allgemein können niedrige Titer für IgA oder IgG gegen Phase 1 nicht grundsätzlich als Hinweis auf eine Chronifizierung gewertet werden, da sich in der Rekonvaleszenz regelmäßig unspezifische niedrige IgG-Titer gegen Phase 1, in etwa 20% auch IgA gegen Phase 1 nachweisen lassen. Der Verdacht auf eine Chronifizierung besteht erst bei Vorliegen hoher IgG-Antikörpertiter gegen Phase 1 und Phase 2, wobei diese erst spät auftreten. Ein früherer Hinweis könnte deren Anstieg Wochen oder Monate post infectionem sein, wobei dann für Nachweis oder Ausschluss eines chronischen Q-Fiebers mindestens 3 Kontrollen nach 3, 6 und 9 Monaten erforderlich wären [30, 78]. Andere Autoren hingegen gehen davon aus, dass bei hohen Titern gegen Phase 1 auch eine einzige Serumprobe zur Unterscheidung von akuter und chronischer Infektion ausreichen kann [47]. Persistenz von Antikörpern Bei allen n=25 Seren, die nach 9-12 Monaten erneut untersucht wurden, konnten IgG-Antikörper auch zum Zeitpunkt der zweiten Untersuchung nachgewiesen 53 werden. In n=2 Fällen mit vorangegangener, serologisch gesicherten Q-Fieber Infektion war dies auch über 3 Jahre nach der Erstdiagnose noch der Fall. Diese Beobachtung deckt sich mit Literaturangaben, nach denen ein Nachweis von IgGAntikörpern gegen Phase 2 mittels ELISA noch 5 – 10 Jahren nach Infektion möglich ist [77, 67, 43]. Zum Nachweis einer solch langen Persistenz der Antikörper wären weitere Folgeuntersuchungen erforderlich, vorzugsweise mit Bestätigung durch einen IIFT-Test, bei dem Antikörper vom IgG-Typ ähnlich lange (7-10 Jahre) in konstanter Höhe nachweisbar sein sollen [67]. Die bisherigen veröffentlichten Angaben zur Dauer der Nachweisbarkeit von IgMAntikörpern gegen Phase 2 im ELISA schwanken: Im Allgemeinen sollen sie etwa 3-5 Monate nachweisbar sein [10], in einem geringen Prozentsatz der Fälle persistieren sie aber auch bis zu einem Jahr, in Einzelfällen sogar bis über 5 Jahre nach Auftreten der klinischen Symptome [77, 67, 43, 13]. Nach den hier vorliegenden Ergebnissen kann von einer Persistenz über mindestens 9 – 12 Monate ausgegangen werden, da sich nach dieser Zeit auch der Nachweis von IgM gegen Phase 2 mittels ELISA in den verfügbaren Proben reproduzieren ließ. Leistungskenndaten der serologischen Tests Die Ergebnisse der hier durchgeführten Tests legen die Vermutung nahe, dass es einen unter Umständen erheblichen Teil von falsch-positiven Nachweisen für IgG gegen Phase 2 im ELISA gibt, wenn man diese mit dem derzeitigen Goldstandard IIFT vergleicht. Der positiv prädiktive Wert (PPV) des typischen Screeningtests zeigte dabei eine deutliche Abhängigkeit von der untersuchten Gruppe, was durch die unterschiedliche Prävalenz von Q-Fieber erklärbar war [16, 33]. Ähnliches scheint auch für den Nachweis von IgM gegen Phase 2 zu gelten [18]. Bereits veröffentlichte Daten zur Antikörperprävalenz, die wie obengenannte lediglich auf ELISA-Untersuchungen beruhen, lägen damit zumindest in Populationen ohne besondere Risiken für Q-Fieber deutlich zu hoch. Darüber hinaus fiel ein Zusammenhang zwischen Titerhöhe im ELISA und einer Bestätigung im IIFT auf, wobei sich höhere Titer für IgG gegen Phase 2 öfter im IIFT bestätigen ließen als niedrige. Der Hersteller gibt für den in dieser Arbeit als Screeningtest verwendeten IgGELISA gegen Phase 2 eine Sensitivität von 100% an, evaluiert mit dem als 54 Goldstandard angesehenen IIFT [26]. Diese liegt deutlich über den Vergleichsangaben in der Literatur, die für andere ELISA-Tests eine Sensitivität von 71% im Vergleich zum IIFT beschreiben [15]. Im Gegensatz dazu liegen die Herstellerangaben zur Spezifität mit 97% im Bereich der Angaben für einen anderen ELISA-Test, der über eine Spezifität von 96% verfügt [15]. Zu beiden Leistungskenndaten kann anhand der in dieser Arbeit gewonnenen Daten keine Aussage getroffen werden, da der IIFT als reiner Bestätigungstest durchgeführt wurde. Daher wurden nur Proben mit einer positiven Reaktion im ELISA einem IIFT unterzogen, die Bewertung einer im ELISA seronegativen Probe als „falsch negativ“ bzw. „richtig negativ“ konnte somit nicht erfolgen. Um eine Aussage zu den Herstellerangaben zu Sensitivität und Spezifität des als Screeningtest eingesetzten ELISA zu ermöglichen, sollte an einem größeren Kollektiv eine Untersuchung auch ELISA-negativer Seren mittels IIFT erfolgen. 4.3 Interpretation der Ergebnisse Die Ergebnisse dieser Untersuchung weisen auf einen engen Zusammenhang zwischen der räumlichen Nähe zu Schafen bzw. Schafweideplätzen und einer QFieber - Infektion hin, wie er bereits in anderen Veröffentlichungen beobachtet wurde [39, 84]. Am Beispiel des fallstarken Ausbruches in Jena 2005 wurde deutlich, dass das relative Risiko für eine Infektion mit zunehmender Entfernung zur Schafweide abnimmt [63], in anderen Fällen wurde eine Abhängigkeit des Infektionsrisikos von der hauptsächlich vorherrschenden Windrichtung beschrieben [36]. Im Bereich des Truppenübungsplatzes Stetten a.k.M. entsprechen militärisch genutzte Flächen zumindest teilweise den an Schäfer verpachteten Weideflächen. Besonders relevant ist dies aufgrund der hohen Tenazität des Erregers für die Probanden mit der längsten Aufenthaltsdauer am Standort, von denen mehr als die Hälfte (52%) sich nach Fragebogenangaben nahezu jeden Arbeitstag auf dem Übungsplatzgelände aufhält. Insofern ist ein sehr häufiger, enger und bei einigen Probanden langjähriger Kontakt zu einer bekannten Infektionsquelle gegeben, der einen Antikörpernachweis bei nahezu der Hälfte dieser Personen erklären kann. Der hohe Anteil seropositiver Probanden in dieser Gruppe kann zum Teil auch als Folge des Q-Fieber - Ausbruches in Stetten a.k.M. aus dem Jahr 1999 gewertet 55 werden. Fast genau 2 Jahre nach dem Ausbruch wurden die ersten, etwa 3 Jahre danach die letzten Seren zur Durchführung der vorliegenden Arbeit gewonnen. Die Probanden mit der längsten Aufenthaltsdauer befanden sich also zum Zeitpunkt des Ausbruches bereits am Standort. Das militärische Sperrgebiet mit Kaserne und Truppenübungsplatz grenzt, nur durch eine Straße getrennt, direkt an die Gemeinde an. Es ist zu vermuten, dass die im Zentrum der Gemeinde ausgestellten Schafe vor und/oder nach dem Fest zumindest eine Zeit lang auf den umliegenden Weideflächen gehalten wurden. Untersuchungen zu einem Ausbruch nahe Freiburg aus dem Jahre 1998 zeigten, dass sich infektiöse Partikel auf dem Luftwege bis zu 2 km ausgebreitet haben [84]. Diese Erfahrungen lassen eine Kontamination von Flächen des militärischen Sperrgebietes im Rahmen des Stettener Ausbruches als zumindest möglich, wenn nicht wahrscheinlich erscheinen. Insofern ist davon auszugehen, dass gerade die Gruppe mit der über 36-monatigen Aufenthaltsdauer am Standort nach dem Ausbruch über längere Zeit einem erhöhten Expositionsrisiko ausgesetzt war. Gestützt wird diese Annahme durch die Q-Fieber - Infektion zweier Soldaten des Standortes, die nicht an dem Gemeindefest teilgenommen hatten. Eine gezielte Untersuchung von Bundeswehrangehörigen fand im Rahmen der Ausbruchsuntersuchung jedoch nicht statt. Die enge Nachbarschaft von beweidetem Übungsplatz und Gemeinde kann auch die in der Ausbruchsuntersuchung des Landesgesundheitsamtes beobachtete auffällig hohe Durchseuchung bei Bürgerinnen und Bürgern aus Stetten a.k.M. und den Nachbargemeinden erklären [35]. Diskussionswürdig ist das Ergebnis der Nichtrekruten mit einer Aufenthaltsdauer von bis zu 36 Monaten. Dies unterscheidet sich nicht wesentlich von der Seroprävalenz in der Rekrutengruppe, jedoch signifikant von dem Resultat der Gruppe mit dem längsten Aufenthalt in Stetten am kalten Markt. Mehr als die Hälfte (55%) der Probanden mit bis zu 36 Monaten Aufenthalt hielt sich zum Zeitpunkt der ersten Blutabnahme maximal 18 Monate am Standort auf, zwischen dem Ausbruch 1999 und deren Eintreffen am Standort lag also mindestens ein halbes Jahr. Zu vermuten ist, dass die Kontamination des Geländes mit virulenten 56 Erregern nach dieser Zeit bereits rückläufig war und der Effekt des Ausbruches von 1999 geringer ausfällt als in der Gruppe mit über 36-monatiger Aufenthaltsdauer. Diese Vermutung wird gestützt durch die Ergebnisse von Bodenproben des Übungsplatzes in Sontra. Dort konnte bereits 6 Monate nach einer massiven Kontamination durch erregerhaltige Geburtsprodukte keine Coxiellen-DNA mehr nachgewiesen werden [74]. Darüber hinaus ist dies die Untersuchungsgruppe mit der niedrigsten Fallzahl, so dass ein möglicher geringer Unterschied zur Rekrutengruppe unter Umständen nicht abgebildet werden kann. Grundsätzlich kann davon ausgegangen werden, dass das Risiko für eine QFieber - Infektion an einem bestimmten Ort nicht konstant ist, sondern vielfältigen Einflüssen unterliegt, beispielsweise Jahreszeit, Witterung, Windrichtung und anderen. Der Einfluss dieser Schwankungen auf ein individuelles Infektionsrisiko nimmt ab, je länger sich eine Person dort aufhält. Dieser Effekt tritt in der Gruppe der Nichtrekruten mit bis zu 36-monatiger Aufenthaltsdauer ähnlich wie in der Rekrutengruppe weniger deutlich zu Tage als bei den am längsten Exponierten. Außerdem besteht vor allem bei den Personen mit den längsten Aufenthaltszeiten die Möglichkeit, dass über die Jahre immer wieder neue Erregerkontakte -zum Beispiel im Rahmen kleinerer oder nicht entdeckter Ausbrüche- stattfanden, die jedoch bedingt durch die teilweise jahrelange Persistenz der Antikörper serologisch nicht unterschieden werden können. 4.4 Schlussfolgerungen und Ausblick Zwei Personen, die nach dem Besuch eines Bauernmarktes in Bad Sassendorf im Jahr 2003 an Q-Fieber erkrankt waren, hatten die Landwirtschaftskammer als Besitzer der als Infektionsquelle geltenden Schafe auf Schmerzensgeld verklagt. Die Klage wurde mit der Begründung abgewiesen, dass es sich bei Q-Fieber um ein allgemeines „Lebensrisiko“ handle. Diese Ansicht kann nach den Ergebnissen dieser Arbeit und denen vorangegangener Seroprävalenzstudien insoweit bestätigt werden, als es offensichtlich eine gewisse Häufigkeit von Kontakten mit C. burnetii in der Allgemeinbevölkerung gibt. Wenn allerdings besondere Risikofaktoren vorliegen, häufig in Form eines engen Kontaktes zu Schafen, steigt das Infektionsrisiko 57 deutlich an. Ziel von Präventivmaßnahmen muss es daher sein, Situationen mit einem besonders hohen Infektionsrisiko zu vermeiden. Im Zentrum stehen aufgrund der Infektionskreisläufe und der typischen Übertragungswege vor allem Maßnahmen zur frühzeitigen Erkennung bzw. Behandlung von als Vektoren fungierenden Tieren, insbesondere Nutztieren. Da es sich bei Q-Fieber um eine Zoonose handelt, die Tiere und Menschen gleichermaßen betrifft, ist eine Kooperation von humanmedizinischen und veterinärmedizinischen Behörden erforderlich. Unter dieser Prämisse wurde in Zusammenarbeit verschiedener Institutionen ein Maßnahmenkatalog veröffentlicht, der als Richtschnur für ein einheitliches Vorgehen bei Verdacht auf einen Q-Fieber - Ausbruch gelten soll [29]. Derartige Maßnahmen zur Eindämmung bzw. Vermeidung solcher Ereignisse wurden anlässlich einzelner QFieber – Ausbrüche in Deutschland wiederholt als Empfehlung veröffentlicht [63, 58, 55, 56, 53, 52, 49]. In einem konkreten Fall wurden Schäfern in Form einer Ordnungsverfügung durch die zuständige Behörde bestimmte Hygiene- und Verhaltensregeln auferlegt [54]. Die Pachtverträge des Bundes über Schafweidenutzung auf Truppenübungsplätzen enthalten Regelungen, die der Prävention von Zoonosen dienen und sich zum Teil an oben genannten Empfehlungen orientieren. Unter anderem muss vor der Beweidung durch ein amtstierärztliches Zeugnis nachgewiesen werden, dass das Vorhandensein einer meldepflichtigen Tierkrankheit wie Q-Fieber in der Herde nicht bekannt ist. Der Tierbesitzer ist verpflichtet, Nachgeburtsmaterial unschädlich nachfolgende zu beseitigen und Untersuchungen eventuell anfallendes sicherzustellen. Für die Abortmaterial Ablammung für sind bestimmte Areale ausgewiesen, die frühestens 4 Wochen nach Ende der Ablammphase wieder für den Übungsbetrieb zur Verfügung stehen. Darüber hinaus ist geregelt, dass von Schafen beweidete Flächen für mindestens 14 Tage nach der Beweidung vom infanteristischen Übungs- und Ausbildungsbetrieb auszuschließen sind [31]. In der Realität müssen diese Flächen jedoch unter Umständen zumindest überquert werden, um andere Bereiche des Übungsgeländes zu nutzen. Die Verbreitung infektiöser Stäube auf dem Luftwege vergrößert darüber hinaus den 58 Gefahrenbereich deutlich über die beweidete Fläche hinaus. Ein praktikabler Lösungsansatz mag sein, den Tierbestand regelmäßigen gezielten Untersuchungen auf Q-Fieber zu unterziehen und im Bedarfsfall die potentiell kontaminierten Flächen konsequent für die Nutzung durch Menschen zu sperren, wobei diese Maßnahme in zeitlicher wie räumlicher Ausdehnung den Besonderheiten des Erregers Rechnung tragen müsste. Dies gilt umso mehr, als der Frauenanteil in den Streitkräften in der jüngeren Vergangenheit deutlich angestiegen ist und gerade für den Fall einer oft nicht sicher auszuschließenden Schwangerschaft besonders schwerwiegende Verläufe bekannt sind [57, 50]. Es ist davon auszugehen, dass durch die Doppelnutzung von Flächen als Weideund Übungsgelände ein gegenüber der Allgemeinheit erhöhtes Expositions- und Infektionsrisiko für Bundeswehrangehörige besteht. Dies zeigt exemplarisch der 1993 durch eine Wanderschafherde ausgelöste Ausbruch im Bereich des Truppenübungsplatzes Sontra in Nordhessen. In dessen Verlauf wurden mindestens 84 Soldaten infiziert, mehr als die Hälfte zeigte klinische Symptome die häufig zur Arbeitsunfähigkeit führten, 6 Soldaten mussten stationär behandelt werden [73]. Bei Untersuchungen an Zecken von Übungsplätzen der Bundeswehr wurde die besondere Bedeutung der Schafzecke Dermacentor (D.) marginatus belegt [74]. Für die Truppenübungsplätze erscheint daher eine Fortführung der bisherigen Beweidungspraxis problematisch, wenngleich diese aus wirtschaftlichen Erwägungen Sinn macht, da sonst riesige Areale mit großem personellen und maschinellen Aufwand gepflegt und gemäht werden müssten. Diesen Überlegungen steht die Fürsorgepflicht des Bundes seinen Soldaten und Angestellten gegenüber. Hieraus ergeben sich unter Umständen rechtliche Ansprüche. In der Vergangenheit bildeten Fälle von mutmaßlich während der Dienstzeit bei der Bundeswehr erworbenen Q-Fieber - Infektionen bereits den Gegenstand von Eingaben an den Wehrbeauftragten des Deutschen Bundestages. Weitere Bedeutung für die Soldaten der Bundeswehr erfährt Q-Fieber im Rahmen der Auslandseinsätze. Diese finden teilweise in Regionen mit bekanntermaßen erhöhtem Infektionsrisiko statt, in der jüngeren 59 Vergangenheit kam es auch zu Ausbrüchen bei dort stationierten Streitkräften [70]. Dies trifft beispielsweise für die Regionen des ehemaligen Jugoslawien zu, wo die bereits während des Zweiten Weltkrieges gehäuft aufgetretenen fieberhaften Infektionen das Synonym „Balkangrippe“ geprägt haben. In der Vergangenheit wurde Bundeswehrsoldaten bei der Rückkehr aus dem Einsatzland daher auf freiwilliger Basis ein serologischer Test auf Q-Fieber angeboten. Analog zu einer möglicherweise strikteren Auslegung der Präventivmaßnahmen im Verantwortungsbereich des Bundes sollte allgemein die Exposition von Risikopersonen -also Immungeschwächten, Patienten mit Herzklappenanomalien und Schwangeren- gegenüber Tieren mit besonderer Vektorfunktion wie beispielsweise Schafen so weit als möglich vermieden werden. Dies setzt allerdings eine umfassende Aufklärung von medizinischem Personal, Risikogruppen und Betreibern entsprechender Einrichtungen wie Streichelzoos oder ähnlichen voraus. Daten aus Australien, wo seit 1989 ein Impfstoff gegen Q-Fieber erfolgreich eingesetzt wird, deuten auf einen möglichen zusätzlichen präventiven Effekt hin, der gerade Risikopersonen zu Gute kommen könnte [1, 28, 41]. Für die Diagnostik des Q-Fiebers lässt sich aus den in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnissen fordern, dass positive Ergebnisse einer typischerweise mittels ELISA durchgeführten Screeninguntersuchung durch einen IIFT-Test bestätigt werden sollten, die zusätzliche Durchführung einer KBR scheint in der Routinediagnostik verzichtbar zu sein. Weitergehende Informationen kann hingegen die Durchführung einer Polymerasekettenreaktion (PCR) bringen, die sich in der Vergangenheit bereits als hoch sensitiv in der Diagnostik des Q-Fiebers erwiesen hat [9, 81]. Um die diagnostische Lücke in der Frühphase einer Infektion zu verkleinern, wurde die Kombination aus serologischen Verfahren und PCR empfohlen [17, 83], auch zur Diagnose einer chronischen Infektion [12, 38] oder zur Therapiekontrolle bei QFieber [4, 83] kann sie angewendet werden. Weitere Einsatzmöglichkeiten ergeben sich in der Veterinärmedizin, wo die Frage nach der individuellen Erregerbelastung eines Tieres bzw. von Tierprodukten von großer 60 epidemiologischer Wichtigkeit ist [7]. Dies gilt auch für größer angelegte Untersuchungen an Zeckenpopulationen in Endemiegebieten, wo adulte Dermacentor marginatus - Zecken eine entscheidende Rolle in der Aufrechterhaltung von Naturherden spielen. Die Vergangenheit zeigt, dass ein hoher Anteil der Meldungen von Q-Fieber Fällen im Zusammenhang mit Ausbrüchen steht. Dies ist zum einen durch die tatsächliche regionale und zeitliche Häufung der Infektionen zu erklären. Zum anderen ist zu vermuten, dass in einer solchen Situation eine erhöhte Sensibilität vorherrscht und mehr Verdachtsfälle aber auch klinisch Gesunde einer spezifischen Untersuchung zugeführt werden. Dies kann bei dem bekannt hohen Anteil asymptomatischer Verläufe ein wichtiger Hinweis auf das tatsächliche Ausmaß der Prävalenz von Antikörpern sein, wie dies auch in der Untersuchung des Ausbruchs in Stetten a.k.M. der Fall war. Neben der Verbesserung der diagnostischen Möglichkeiten in den letzten Jahren spielen weitere Faktoren eine Rolle in der Wahrnehmung von Q-Fieber als mögliche Differentialdiagnose. Die hohe Prävalenz akuter Erkrankungen in Frankreich mag zum Teil auch daher rühren, dass in der Vergangenheit eine Sensibilisierung durch die Arbeiten der Gruppe um Raoult stattgefunden hat und Untersuchungen in einem spezialisierten Labor mit großer Erfahrung durchgeführt werden können. Eine ähnliche Entwicklung ist in Deutschland nach Etablierung des Konsiliarlaboratoriums für Q-Fieber am Landesgesundheitsamt BadenWürttemberg in Stuttgart denkbar und wünschenswert. Eine verstärkte Information kurativ tätiger Ärzte kann und sollte künftig dazu beitragen, dass pathologischen das akute Q-Fieber in Fällen von Leberwerten, schweren grippeähnlichen unklarem Fieber, Symptomen oder „Sommergrippe“ differentialdiagnostisch berücksichtigt wird. Auch im Fall eines der größten weltweit dokumentierten Ausbrüche in Jena 2005 wurde der erste Verdacht durch einen Hausarzt geäußert [63]. Die Bedeutung einer entsprechenden Sensibilisierung zeigt sich insbesondere bei einer Häufung solcher Fälle in Risikogebieten, zumal wenn anamnestisch verdächtige Tierkontakte bestanden. Der hohe Anteil (36%) von IgM-seropositiven Personen unter Patienten mit ätiologisch unklarem Fieber unterstreicht die mögliche 61 Bedeutung von Q-Fieber in solchen Fällen [66]. Analog gilt dies für chronisches Q-Fieber bei Patienten mit Endokarditis - Symptomatik und sterilen Blutkulturen [65, 41, 16]. Wenn die Möglichkeit einer Infektion mit Coxiella burnetii häufiger bedacht wird und demzufolge auch die Zahl der serologischen Untersuchungen steigt, werden auch zunehmend realistischere Angaben zur Einschätzung der tatsächlichen Häufigkeit von Q-Fieber möglich sein. Bis dahin sollten Seroprävalenzstudien an größeren Kollektiven und Maßnahmen der aufsuchenden Epidemiologie eine Abschätzung der Prävalenz von Q-Fieber ermöglichen. Weitere Forschungen zu Genetik und Virulenzfaktoren dieses einzigartigen Erregers werden die Verbesserung von Präventivmaßnahmen und Therapiemöglichkeiten begünstigen. 62 5 Zusammenfassung Diese Untersuchung galt der Seroprävalenz spezifischer Antikörper gegen Coxiella (C.) burnetii, dem Erreger des Q-Fiebers. Sie wurde an n=507 Personen durchgeführt, die unterschiedlich lange Aufenthaltszeiten am Bundeswehrstandort Stetten am kalten Markt (a.k.M.) aufwiesen. In dem Gruppenvergleich mit drei Gruppen galten die Rekruten ohne vorangegangenen Aufenthalt vor Ort als Referenzgruppe, während die beiden Gruppen der Nichtrekruten sich zuvor bis zu 36 Monate beziehungsweise über 36 Monate am Standort aufgehalten hatten. Folgende Fragen sollten beantwortet werden: 1. Lassen sich bestimmte Risikofaktoren für eine Infektion mit C. burnetii ermitteln? 2. Wie hoch ist die Prävalenz spezifischer Antikörper gegen C. burnetii in den untersuchten Gruppen mit unterschiedlicher Expositionsdauer in Stetten a.k.M? Zu 1: Zur Identifizierung möglicher Risikofaktoren für eine Q-Fieber - Infektion erfolgte ein Befragung mittels Fragebogen. Es ergaben sich folgende Ergebnisse: Die Faktoren „Haustierhaltung von Schaf(en)“ sowie „Vorhandensein von Schafweiden in Sichtweite des Wohnortes und/oder des Arbeitsplatzes“ zeigten einen statistisch signifikanten Zusammenhang zu einer serologisch gesicherten zurückliegenden Infektion (jeweils p=0,01; Chi-Quadrat-Test). Ein tendenzieller Zusammenhang ergab sich für die „Haltung von Hund(en) als Haustier(e)“ (p=0,02) und für den „Aufenthalt auf einem Bauernhof (p=0,04)“. Zu 2: Zur Erfassung der Durchseuchung kam als Screeningverfahren ein kommerzieller Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) auf IgG-Antikörper gegen Phase 2 zum Einsatz, positive Ergebnisse wurden einem indirekten Immunfluoreszenztests (IIFT) als Bestätigungstest unterzogen. In der Gruppe der Rekruten waren in 9 % der Fälle IgG-Antikörper gegen Phase 2 nachweisbar, die Gruppe mit einer Aufenthaltsdauer von bis zu 36 Monaten unterschied sich mit einem Anteil von 6 % davon nur geringfügig. 63 In der Gruppe mit der längsten Aufenthaltsdauer (über 36 Monate) am Standort Stetten a.k.M. wurde eine zurückliegende Infektion serologisch bei 48 % der untersuchten Probanden nachgewiesen. Der Unterschied in der Durchseuchung der untersuchten Gruppen erwies sich als statistisch signifikant (p<0,05). Der im Zusammenhang mit diesen Untersuchungen geschätzte positiv prädiktive Wert des IgG-ELISA gegen Phase 2 verglichen mit dem Goldstandard IIFT lag abhängig von der Gruppe zwischen 28 % (95%-Konfidenzintervall, KI: 18,6 % 37,6 %) und 75% (KI: 60,3 % - 89,7 %). Wegen der relativ kleinen Zahl positiver Testergebnisse haben diese Schätzungen eher orientierenden Charakter, die Notwendigkeit einer Bestätigung positiver Screeningergebnisse im ELISA beispielsweise mittels IIFT war jedoch erkennbar. Über die Prävalenzuntersuchungen hinaus wurden mit dem Testsystem auch orientierende serologische Untersuchungen zu möglichen frischen und chronischen Infektionen sowie zur Persistenz der Antikörper durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass es in der Bevölkerung eine gewisse Durchseuchung mit C. burnetii gibt, die bei Vorliegen besonderer Risikofaktoren deutlich ansteigen kann. Ein wesentliches Risiko scheint die länger andauernde räumliche Nähe zu Schafen und deren Weiden darzustellen, wie sie für Bundeswehrangehörige durch die Schafbeweidung von Truppenübungsplätzen entstehen kann. Angesichts der möglichen schweren Folgen vor allem einer chronischen Infektion mit Q-Fieber sollten bei einer unvermeidlichen Exposition von Personen in derartigen Risikobereichen die bekannten Präventivmaßnahmen eingehalten werden, regelmäßige Untersuchungen des Tierbestandes können eine weitergehende Abschätzung des jeweils aktuellen Infektionsrisikos erlauben. Weitere Untersuchungen zur Seroprävalenz von Antikörpern gegen C. burnetii an größeren Kollektiven sollten dazu beitragen, die tatsächliche Häufigkeit von Q-Fieber und damit die differentialdiagnostische Bedeutung dieser Zoonose realistisch einzuschätzen. 64 6 Literaturverzeichnis 1) Ackland JR, Worswick DA, Marmion BP: Vaccine Prophylaxis of Q Fever. Follow-Up Study of the Efficacy of Q-Vax (CSL) 1985-1990. 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Bedanken darf ich mich zuvorderst bei Herrn Prof. Dr. P. Kern für seine Bereitschaft, die Betreuung der extern begonnenen Arbeit zu übernehmen und mit seinen wertvollen Anregungen deren Fertigstellung erst zu ermöglichen. Gleichermaßen gilt mein Dank Herrn Prof. Dr. Dr. P. Kimmig, der in der sehr bereichernden Zusammenarbeit mit dem Landesgesundheitsamt Baden- Württemberg in Stuttgart federführend war. Er war mir nicht nur durch sein fachliches Wissen, sondern auch durch seine Art des persönlichen Umganges eine große Hilfe und Ermutigung. Für die Beratung und Betreuung in statistischen Fragen darf ich mich bei Frau Dr. I. Zöllner vom Landesgesundheitsamt, Referat Epidemiologie und Gesundheitsberichterstattung, bedanken. Sie hat diese Arbeit am längsten begleitet und war mir von Anfang an immer ein engagierter, kompetenter und geduldiger Ratgeber weit über ihren originären Fachbereich hinaus. Ohne jeglichen Zweifel wäre ohne sie diese Arbeit nie fertig geworden. Gedankt sei allen Dienststellen der Bundeswehr, die zum Gelingen der praktischen Untersuchungen beigetragen haben. Insbesondere gilt dies für Herrn Dr. A. Binder, Laborgruppe Medizinischer B-Schutz an der Außenstelle Munster des Zentralen Institutes des Sanitätsdienstes der Bundeswehr München. Die Finanzierung der Untersuchungen wurde ermöglicht durch die Erteilung eines außerplanmäßigen wehrmedizinischen Sonderforschungsauftrages durch das Bundesministerium der Verteidigung. Mein größter und persönlichster Dank ist Martina und Leonie für ihre Geduld mit mir vorbehalten. 85 Tabellarischer Lebenslauf Name: Peter Stefan Kilb Geburtsdatum, -ort: 12. Dezember 1968 in Stuttgart Wohnort: Ziegelstrasse 41/1, 73642 Welzheim Familienstand: verheiratet Ehefrau: Martina Kilb, geb. Ostrowski, Krankenschwester Kind: Leonie Aimée, geb. 02.06.2004 Schulabschluss: allgemeine Hochschulzugangsreife, Mai 1988, Staufer - Gymnasium, Waiblingen Sprachkenntnisse: Englisch, Französisch, Latein, Spanisch Berufsausbildung: Eintritt in die Bundeswehr als Sanitätsoffiziersanwärter am 01.07.1988 Studium: Studium der Humanmedizin an der Universität Ulm, Wintersemester 1989/90 bis Sommersemester 1996 Studienabschluss: dritter Abschnitt der ärztlichen Prüfung am 24. April 1996, akademisches Lehrkrankenhaus Heidenheim, Note „Sehr Gut“ Abschluss des Studiums, Gesamtnote „Gut“ ärztliche Tätigkeit: 01.05.96 – 31.05.97 01.06.97 – 30.11.97 01.11.97 01.12.97 – 31.05.98 01.06.98 – 30.11.98 01.12.98 – 28.02.99 01.03.99 – 28.11.99 Arzt im Praktikum, Abt. Innere Medizin, Bundeswehrkrankenhaus Ulm Arzt im Praktikum, Abt. Chirurgie, Bundeswehrkrankenhaus Ulm Vollapprobation Assistenzarzt, Abt. Anästhesiologie, Bundeswehrkrankenhaus Ulm Allgemeinmedizinischer Weiterbildungsassistent, Praxis Dr. Klett, Ulm Weiterbildungsassistenz Naturheilverfahren, Praxis Dr. Klett, Ulm Truppenarzt Standortsanitätszentrum Stetten a.k.M. dabei 6 Monate Weiterbildung Allgemeinmedizin 86 29.11.99 – 30.06.04 30.06.04 01.07.04 – 30.09.04 01.10.04 - 31.12.04 Leiter der Außenstelle Sigmaringen, stellv. Leiter des Standortsanitätszentrums Stetten Ausscheiden aus der Bundeswehr als Oberstabsarzt nicht ärztlich tätig Übergangsassistent Praxis Dr. Pfeiffer, 73642 Welzheim seit 01.01.05 tätig in eigener allgemeinmedizinischer Praxis, Joh.-v.-Hieber-Str. 23, 73642 Welzheim Fachrichtung: Facharzt für Allgemeinmedizin Chirotherapie, Naturheilverfahren, Ernährungsbeauftragter Arzt Zusatzqualifikationen: Psychosomatische Grundversorgung, Neuraltherapie, Ärztliche Osteopathie Abgeschlossene Kursweiterbildung Arbeitsmedizin 73642 Welzheim, den 01.10.2007
