Inhaltsverzeichnis
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Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung 1 1 Summary 3 2 Einleitung 5 2.1 Pilze als Krankheitserreger 5 2.2 Die Gattung Candida 5 2.2.1 C. albicans 6 2.2.2 C. dubliniensis 8 2.3 Klassische Virulenzfaktoren von C. albicans 2.3.1 Polymorphes Wachstum 2.3.2 Adhärenz, Invasion, Biofilmbildung 2.4 Virulenzfaktor Stresstoleranz 2.5 Grundlagen zellulärer Stresstoleranz am Beispiel spezialisierter Membrantransportproteine 2.5.1 10 12 12 12 13 2.5.1.2 Sulfitproduktion aus Cystein bei Dermatophyten via CD01 und SSU1 13 Die Superfamilie der ABC-Transporter 14 2.5.2.1 Bedeutsame ABC-Transporter bei C. albicans und C. dubliniensis 15 2.5.2.2 Mitglieder der MDR-Subfamilie bei S. cerevisiae und C. albicans 16 Virulenzfaktor Metabolische Adaptation am Beispiel des Eisenmetabolismus 17 2.6.1 Die Rolle von Spurenelementen beim Menschen und C. albicans 17 2.6.2 Beispiel Eisen: Eisenverfügbarkeit im menschlichen Wirt 17 2.6.3 Eisenaufnahmemechanismen von C. albicans im Wirt 18 2.7 Virulenzfaktor Mikrowelle Kommunikation 19 2.7.1 Bakterielles quorum-sensing 19 2.7.2 Quorum sensing bei C. albicans 20 2.7.3 Inter-kingdom-signalling 20 2.8 3 9 2.5.1.1 Sulfittoleranz bei Saccharoymces cerevisiae via SSU1 2.5.2 2.6 Die Familie der Tellurit-Resistenz/Dicarboxylat-Transporter (TDT) 8 Zielsetzung dieser Arbeit Material und Methoden 3.1 Verwendete Bakterienstämme und Plasmide 21 23 23 3.1.1 Escherichia coli-K12-Stamm 23 3.1.2 Plasmide 23 3.2 Verwendete Stämme von C. albicans und C. dubliniensis 25 3.2.1 C. albicans 25 3.2.2 C. dubliniensis 27 http://d-nb.info/1070583510 3.2.3 S. cerevisiae 28 3.3 Oligonukleotide 28 3.4 Geräte und Chemikalien 31 3.5 Mikrobiologische Methoden 33 3.5.1 Anzucht von E. coli 33 3.5.2 Anzucht von C. albicans und C. dubliniensis 33 3.5.2.1 Standardmedien 33 3.5.2.2 Selektions- und Screeningmedien 33 3.5.2.3 Medium für die Isolation von „common reference"-RNA aus C. albicans 34 3.5.2.4 Eisenmangelmedium (LIM) 34 3.5.3 Inkubation in Gegenwart von A/-(3-Oxododecanoyl)-L-Homoserinlacton 35 3.5.4 Wachstumsexperimente mit begrenzter Eisenverfügbarkeit +/- HSL 36 3.5.4.1 Eisenfreie Bedingungen 36 3.5.4.2 Vorkulturen / Eisen-Aushungerung von C. albicans-Zellen 37 3.5.4.3 Inkubation +/- HSL in LIMO-Medium 37 3.5.4.4 Wachstumskurvenbestimmung 38 3.5.5 Induktion der Hyphenbildung von C. albicans 38 3.5.6 Fluoreszenzmikroskopie 38 3.6 Molekularbiologische Methoden 39 3.6.1. Plasmidpräparation 39 3.6.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Aufreinigung der PCR-Produkte 39 3.6.3 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen 40 3.6.4 Auftrennung von DNA-Fragmenten mittels Agarose-Gelelektrophorese 41 3.6.5 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen 41 3.6.6 DNA-Ligation und Transformation in E. coli 42 3.6.7 DNA-Sequenzierung 42 3.6.8 Transformation von C. albicans durch Elektroporation 43 3.6.9 Isolierung chromosomaler DNA aus C. albicans und C. dubliniensis 45 3.6.10 Southern-Hybridisierung 46 3.6.11 Isolierung von Gesamt-RNA aus C. albicans 47 3.6.12 Northern-Hybridisierung 49 3.6.13 Quantitative real-time reverse Transkriptase-PCR (qRT-PCR) 51 3.7 Biochemische Methoden 52 3.7.1 Nachweis von Sulfit über GC-MS 52 3.7.2 Nachweis von Schwefelwasserstoff mit Bleiacetatsäulen 54 3.7.3 Messung der LDH-Ausschüttung aus humanen Zellen 55 3.8 Infektionsmodelle 56 3.8.1 57 3.8.1.2 Lichtmikroskopische Untersuchung infizierter RHOEs 57 In v/Vo-Experimente im Hühnerei-Modell Ergebnisse 4.1 56 3.8.1.1 Infektion von RHOE mit C. albicans 3.8.2 4 Rekonstituiertes humanes orales Epithel (RHOE) 59 61 Cysteintoleranz und Sulfitproduktion bei C. albicans vermittelt durch das Zusammenspiel von SSU1 und CDG1 61 4.1.1 Sulfitproduktion bei C. albicans in Gegenwart von Cystein 61 4.1.2 Induktion der Gene SSU1 und CDG1 in Gegenwart von Cystein 63 4.1.3 Abhängigkeit der Sulfitproduktion in C. albicans von der Cysteindioxigenase Cdg1 beim Wachstum in Gegenwart von Cystein 64 4.1.4 Zcf2 und Cta4 als Transkriptionsfaktoren von SSU1 und CDG1 66 4.1.5 Inhibition der Hyphenbildung durch Cystein bei cdglA, ssulA und zcf2A sowie durch Sulfit bei ssulA 4.1.6 68 H2S-Produktion bei cdglA in Gegenwart von Cystein unter hypheninduzierenden Bedingungen 72 4.1.7 Inhibition der Hyphenbildung von C. albicans in Gegenwart von H2S 75 4.1.8 Infektion von RHOE mit cdglA- und ssi/7A-Stämmen 76 4.2 Funktionelle Charakterisierung der Gene für die putativen ABC-Transporter Mdl1, Mdl2 und Hst6 bei C. albicans und C. dubliniensis 4.2.1 Identifizierung der Gene MDL1, MDL2 und HST6 4.2.2 Homologievergleiche von MDL1, MDL2 und HST6 aus C. albicans mit putativ-orthologen Genen anderer Organismen 4.2.3 78 78 80 Konstruktion von Überexpressionsstämmen für die C. albicans-Gene MDL1, MDL2 und HST6 in C. albicans und C. dubliniensis 82 4.2.3.1 Herstellung von DNA-Kassetten zur Überexpression von MDL1, MDL2 und HST6 in C. albicans und C. dubliniensis 83 4.2.3.2 Herstellung der DNA-Kassette für einen PCCMDHrGFP-Stamm in C. dubliniensis 89 4.3.3.3 Herstellung der Überexpressionsstämme und des P^DHrGFPStamms 90 4.3.3.4 Kontrolle der Überexpressionen in den PADHI-I Petzow-Stämmen 94 4.3.3.5 Phänotypische Charakterisierung der Überexpressionsstämme 96 4.2.4 Konstruktion von Deletionsstämmen zur weiteren funktionellen Charakterisierung der Gene MDL1, MDL2 und HST6 in C. albicans 98 4.2.4.1 Herstellung von DNA-Kassetten zur Deletion von MDL1, MDL2, HST6 99 4.2.4.2 Herstellung der C. albicans-Einzelgen-Deletionsstämme 102 4.3.4.3 Herstellung der C. albicans-Doppeldeletionsmutante mdllA mdl2A 105 4.3.4.4 Phänotypische Charakterisierung der Deletionsstämme 107 4.3.4.5 Verhalten von mdllA, mdl2A und mdllA mdl2A im HühnereiInfektionsmodell 4.3 Einfluss des bakteriellen quorum sensing-Moleküls A/-(3-Oxododecanoyl)-LHomoserinlacton auf C. albicans 4.3.1 112 Transkriptionelle Reprimierung von SFU1 und Aktivierung von Eisenaufnahmesystemen 112 4.3.2 Transkriptionelle Reprimierung eisenabhängiger Prozesse 114 4.3.3 Schnelleres Wachstum von C. albicans in LIM 1-Medium nach Präkultivierung mit A/-(3-Oxododecanoyl)-L-Homoserinlacton 5 110 Diskussion 5.1 Molekulare Grundlagen der Stresstoleranz von C. albicans 5.1.1 5.3 119 120 Funktionelle Charakterisierung der Gene MDL1, MDL2 und HST6 bei C. albicans und C. dubliniensis 5.2 119 Molekulare Grundlagen und Bedeutung der Cysteintoleranz und Sulfitproduktion bei C. albicans 5.1.2 117 127 Untersuchungen zum Inter-kingdom Signalling bei C. albicans in Gegenwart eines bakteriellen quorum sensing-Moleküls 135 Abschließende Wertung und Ausblick 142 Literaturverzeichnis 145 Danksagung 163 Anhang A 1. Abkürzungsverzeichnis A.1 2. Publikationen A.2 3. Erklärungen A.3 4. Lebenslauf A.4
