Inhaltsverzeichnis

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Inhaltsverzeichnis
1
Zusammenfassung
1
1
Summary
3
2
Einleitung
5
2.1
Pilze als Krankheitserreger
5
2.2
Die Gattung Candida
5
2.2.1
C. albicans
6
2.2.2
C. dubliniensis
8
2.3
Klassische Virulenzfaktoren von C. albicans
2.3.1
Polymorphes Wachstum
2.3.2
Adhärenz, Invasion, Biofilmbildung
2.4
Virulenzfaktor Stresstoleranz
2.5
Grundlagen zellulärer Stresstoleranz am Beispiel spezialisierter
Membrantransportproteine
2.5.1
10
12
12
12
13
2.5.1.2 Sulfitproduktion aus Cystein bei Dermatophyten via CD01 und SSU1
13
Die Superfamilie der ABC-Transporter
14
2.5.2.1 Bedeutsame ABC-Transporter bei C. albicans und C. dubliniensis
15
2.5.2.2 Mitglieder der MDR-Subfamilie bei S. cerevisiae und C. albicans
16
Virulenzfaktor Metabolische Adaptation am Beispiel des Eisenmetabolismus
17
2.6.1
Die Rolle von Spurenelementen beim Menschen und C. albicans
17
2.6.2
Beispiel Eisen: Eisenverfügbarkeit im menschlichen Wirt
17
2.6.3
Eisenaufnahmemechanismen von C. albicans im Wirt
18
2.7
Virulenzfaktor Mikrowelle Kommunikation
19
2.7.1
Bakterielles quorum-sensing
19
2.7.2
Quorum sensing bei C. albicans
20
2.7.3
Inter-kingdom-signalling
20
2.8
3
9
2.5.1.1 Sulfittoleranz bei Saccharoymces cerevisiae via SSU1
2.5.2
2.6
Die Familie der Tellurit-Resistenz/Dicarboxylat-Transporter (TDT)
8
Zielsetzung dieser Arbeit
Material und Methoden
3.1
Verwendete Bakterienstämme und Plasmide
21
23
23
3.1.1
Escherichia coli-K12-Stamm
23
3.1.2
Plasmide
23
3.2
Verwendete Stämme von C. albicans und C. dubliniensis
25
3.2.1
C. albicans
25
3.2.2
C. dubliniensis
27
http://d-nb.info/1070583510
3.2.3
S. cerevisiae
28
3.3
Oligonukleotide
28
3.4
Geräte und Chemikalien
31
3.5
Mikrobiologische Methoden
33
3.5.1
Anzucht von E. coli
33
3.5.2
Anzucht von C. albicans und C. dubliniensis
33
3.5.2.1 Standardmedien
33
3.5.2.2 Selektions- und Screeningmedien
33
3.5.2.3 Medium für die Isolation von „common reference"-RNA aus C. albicans
34
3.5.2.4 Eisenmangelmedium (LIM)
34
3.5.3
Inkubation in Gegenwart von A/-(3-Oxododecanoyl)-L-Homoserinlacton
35
3.5.4
Wachstumsexperimente mit begrenzter Eisenverfügbarkeit +/- HSL
36
3.5.4.1 Eisenfreie Bedingungen
36
3.5.4.2 Vorkulturen / Eisen-Aushungerung von C. albicans-Zellen
37
3.5.4.3 Inkubation +/- HSL in LIMO-Medium
37
3.5.4.4 Wachstumskurvenbestimmung
38
3.5.5
Induktion der Hyphenbildung von C. albicans
38
3.5.6
Fluoreszenzmikroskopie
38
3.6
Molekularbiologische Methoden
39
3.6.1.
Plasmidpräparation
39
3.6.2
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Aufreinigung der PCR-Produkte
39
3.6.3
Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
40
3.6.4
Auftrennung von DNA-Fragmenten mittels Agarose-Gelelektrophorese
41
3.6.5
Herstellung kompetenter E. coli-Zellen
41
3.6.6
DNA-Ligation und Transformation in E. coli
42
3.6.7
DNA-Sequenzierung
42
3.6.8
Transformation von C. albicans durch Elektroporation
43
3.6.9
Isolierung chromosomaler DNA aus C. albicans und C. dubliniensis
45
3.6.10 Southern-Hybridisierung
46
3.6.11 Isolierung von Gesamt-RNA aus C. albicans
47
3.6.12 Northern-Hybridisierung
49
3.6.13 Quantitative real-time reverse Transkriptase-PCR (qRT-PCR)
51
3.7
Biochemische Methoden
52
3.7.1
Nachweis von Sulfit über GC-MS
52
3.7.2
Nachweis von Schwefelwasserstoff mit Bleiacetatsäulen
54
3.7.3
Messung der LDH-Ausschüttung aus humanen Zellen
55
3.8
Infektionsmodelle
56
3.8.1
57
3.8.1.2 Lichtmikroskopische Untersuchung infizierter RHOEs
57
In v/Vo-Experimente im Hühnerei-Modell
Ergebnisse
4.1
56
3.8.1.1 Infektion von RHOE mit C. albicans
3.8.2
4
Rekonstituiertes humanes orales Epithel (RHOE)
59
61
Cysteintoleranz und Sulfitproduktion bei C. albicans vermittelt durch das
Zusammenspiel von SSU1 und CDG1
61
4.1.1
Sulfitproduktion bei C. albicans in Gegenwart von Cystein
61
4.1.2
Induktion der Gene SSU1 und CDG1 in Gegenwart von Cystein
63
4.1.3
Abhängigkeit der Sulfitproduktion in C. albicans von der
Cysteindioxigenase Cdg1 beim Wachstum in Gegenwart von Cystein
64
4.1.4
Zcf2 und Cta4 als Transkriptionsfaktoren von SSU1 und CDG1
66
4.1.5
Inhibition der Hyphenbildung durch Cystein bei cdglA, ssulA und zcf2A
sowie durch Sulfit bei ssulA
4.1.6
68
H2S-Produktion bei cdglA in Gegenwart von Cystein unter hypheninduzierenden Bedingungen
72
4.1.7
Inhibition der Hyphenbildung von C. albicans in Gegenwart von H2S
75
4.1.8
Infektion von RHOE mit cdglA- und ssi/7A-Stämmen
76
4.2
Funktionelle Charakterisierung der Gene für die putativen ABC-Transporter
Mdl1, Mdl2 und Hst6 bei C. albicans und C. dubliniensis
4.2.1
Identifizierung der Gene MDL1, MDL2 und HST6
4.2.2
Homologievergleiche von MDL1, MDL2 und HST6 aus C. albicans mit
putativ-orthologen Genen anderer Organismen
4.2.3
78
78
80
Konstruktion von Überexpressionsstämmen für die C. albicans-Gene
MDL1, MDL2 und HST6 in C. albicans und C. dubliniensis
82
4.2.3.1 Herstellung von DNA-Kassetten zur Überexpression von MDL1, MDL2
und HST6 in C. albicans und C. dubliniensis
83
4.2.3.2 Herstellung der DNA-Kassette für einen PCCMDHrGFP-Stamm in
C. dubliniensis
89
4.3.3.3 Herstellung der Überexpressionsstämme und des P^DHrGFPStamms
90
4.3.3.4 Kontrolle der Überexpressionen in den PADHI-I Petzow-Stämmen
94
4.3.3.5 Phänotypische Charakterisierung der Überexpressionsstämme
96
4.2.4
Konstruktion von Deletionsstämmen zur weiteren funktionellen
Charakterisierung der Gene MDL1, MDL2 und HST6 in C. albicans
98
4.2.4.1 Herstellung von DNA-Kassetten zur Deletion von MDL1, MDL2, HST6
99
4.2.4.2 Herstellung der C. albicans-Einzelgen-Deletionsstämme
102
4.3.4.3 Herstellung der C. albicans-Doppeldeletionsmutante mdllA mdl2A
105
4.3.4.4 Phänotypische Charakterisierung der Deletionsstämme
107
4.3.4.5 Verhalten von mdllA, mdl2A und mdllA mdl2A im HühnereiInfektionsmodell
4.3
Einfluss des bakteriellen quorum sensing-Moleküls A/-(3-Oxododecanoyl)-LHomoserinlacton auf C. albicans
4.3.1
112
Transkriptionelle Reprimierung von SFU1 und Aktivierung von
Eisenaufnahmesystemen
112
4.3.2
Transkriptionelle Reprimierung eisenabhängiger Prozesse
114
4.3.3
Schnelleres Wachstum von C. albicans in LIM 1-Medium nach
Präkultivierung mit A/-(3-Oxododecanoyl)-L-Homoserinlacton
5
110
Diskussion
5.1
Molekulare Grundlagen der Stresstoleranz von C. albicans
5.1.1
5.3
119
120
Funktionelle Charakterisierung der Gene MDL1, MDL2 und HST6 bei
C. albicans und C. dubliniensis
5.2
119
Molekulare Grundlagen und Bedeutung der Cysteintoleranz und
Sulfitproduktion bei C. albicans
5.1.2
117
127
Untersuchungen zum Inter-kingdom Signalling bei C. albicans in Gegenwart
eines bakteriellen quorum sensing-Moleküls
135
Abschließende Wertung und Ausblick
142
Literaturverzeichnis
145
Danksagung
163
Anhang
A
1.
Abkürzungsverzeichnis
A.1
2.
Publikationen
A.2
3.
Erklärungen
A.3
4.
Lebenslauf
A.4
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