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Immunhistologie und digitale Bildverarbeitung in
der Neurobiologie
I. Immuncytochemie von Transmittern und Peptiden im Gehirn
der Schabe Leucophaea maderae
7.–25. Mai 2007
Zeitplan
Gruppen
Tag
A1, A2
B1, B2
1. Experiment
a-Tachykinin/a-Serotonin/aSAP47
2. Experiment
Backfill kontralateral/a-PDF/a- a-Allatotropin/a-Serotonin/aSynapsin
PDF
Vorlesung
(8:00 – 9:45)
Gruppen A1, A2
(ab 10:00)
Backfill kontralateral/a-PDF/aBruchpilot
Gruppen B1, B2
(ab 10:00)
Präparation, Fixierung 2 h,
Backfill
Präparate einbetten
Mo, 07.05.
Einführung
Di, 08.05.
Technik Immuncy- Schneiden, blocken, 1. + 2. + Präparation, Fixierung 2 h,
tochemie I
3. primäres Antiserum
Präparate einbetten
Mi, 09.05.
Bildverarbeitung
Do, 10.05.
Neuroanatomie
Fr, 11.05.
Technik ImmuncyBackfill
tochemie II
Waschen, 1. + 2. + 3. sekundäres Antiserum, Schnitte aufziehen
Auswertung am Fluoreszenzmikroskop (A1 Vormittag, A2
Nachmittag)
Schneiden, blocken, 1.+ 2.
primäres Antiserum + Streptavidin
Waschen, 1. + 2. sekundäres
Antiserum, Schnitte aufziehen
Auswertung am Fluoreszenzmikroskop (B1 Vormittag, B2
Nachmittag)
Präparation, Fixierung 2 h,
Präparate einbetten
Sa, 12.05.
X
Sonntag
Mo, 14.05.
Di, 15.05.
Mi, 16.05.
Do, 17.05.
Fr, 18.06.
Schneiden, blocken, 1.+ 2.
primäres Antiserum + StreptaCircadiane RhythPräparation, Fixierung 2 h,
vidin.
mik
Präparate einbetten
Auswertung am Fluoreszenzmikroskop
Schneiden, blocken, 1. + 2. +
Waschen, 1. + 2. sekundäres 3. primäres Antiserum.
Mikroskopie
Antiserum, Schnitte aufziehen Auswertung am Fluoreszenzmikroskop
Waschen, 1. + 2. + 3. sekunAuswertung KLSM (A1 VormitKonfokale LSM
däres Antiserum, Schnitte auftag, A2 Nachmittag)
ziehen
X
X
Auswertung KLSM (B1 Vormittag, B2 Nachmittag)
Bildverarbeitung
Kurs Bildverarbeitung
Mo, 21.05. –
Bildverarbeitung
Do, 24.05.
Kurs Bildverarbeitung
Wochenende
Fr, 25.05.
Vormittag: Letzte Gelegenheit zur Vorbereitung der Abschlußpräsentationen
Abschlußpräsentationen ab 14:00
1
Vorbemerkung
Die Neurobiologie ist eine der am schnellsten wachsenden Teildisziplinen in der Biologie.
Sie beschäftigt sich mit einer der ungelösten Grundfragen unserer Zeit: Wie funktioniert
das Gehirn? Da das Gehirn des Menschen und anderer Säugetiere äußerst komplex ist,
werden für viele Fragestellungen die Gehirne einfacher organisierter Tiere herangezogen.
Viele auch für das Verstehen des menschlichen Gehirnes wichtige Sachverhalte konnten
nur so aufgeklärt werden; auch die Chronobiologie liefert hierfür eindrucksvolle Beispiele.
Darüber hinaus ist für den Zoologen der Vergleich von besonderer Bedeutung: Ist das gerade beobachtete Phänomen ein Sonderfall oder kann man es generalisieren? Wie haben
sich Nervensysteme in der Evolution entwickelt? Aus diesen und anderen Gründen sind
Insekten in der Neurobiologie sehr populär geworden. Die Erkenntnisse und Methoden,
die Sie in diesem Praktikum vermittelt bekommen, werden Ihnen sicher nicht nur in der
Neurobiologie, sondern auch in anderen Teildisziplinen der Zoologie und Biologie zustatten kommen.
In diesem Teil des Praktikums lernen Sie
• Grundlagen der Chronobiologie,
• wie das Zentralnervensystem der Insekten aufgebaut ist,
• wie Sie immuncytochemische Verfahren anwenden,
• wie Sie ein Mikroskop benutzen,
• wie ein konfokales Laserscan-Mikroskop funktioniert, was Sie damit tun können und was
nicht,
• wie Sie an eine wissenschaftliche Fragestellung herantreten und diese bearbeiten.
Da Sie auch lernen sollen, Ihre Ergebnisse in angemessener Weise zu präsentieren, wird
jede Gruppe am Ende der Veranstaltung in einem 30minütigen Vortrag ihre Ergebnisse
vor dem Hintergrund der vorliegenden Fragestellung darstellen und diskutieren. Ferner
werden Sie ein Protokoll erstellen, das, aufgebaut in der klassischen Form wissenschaftlicher Publikationen, in der Lage ist, sowohl Ihnen selbst noch nach Jahren als auch dem
fremden Leser Ihre Versuche und Ergebnisse mitzuteilen.
Die theoretischen Hintergründe zu diesem Praktikumsteil erarbeiten Sie sich Mithilfe dieses
Skripts, der ausliegenden Literatur sowie der begleitenden Vorlesungsreihe, die ab 8:00 Uhr
s.t. jeden Kurstag einläutet. Ab 10:00 s.t. werden Sie sich dann auf Ihre Versuche stürzen.
Die Dauer jedes Kurstages wird von Ihrem jeweiligen Versuchsprogramm und Ihrem Geschick bestimmt. Bitte richten Sie sich darauf ein, daß es auch mal später werden kann. Die
Ergebnisse Ihrer Experimente werden in Form von digitalen Bildern am Mikroskop und
am Laserscan-Mikroskop dokumentiert, und dienen auch als Grundlage für den Kursteil
„digitale Bildverarbeitung“.
Der immunhistologische Teil des Praktikums wurde in früheren Jahren von Herrn Prof.
Dr. F.-W. Schürmann durchgeführt und nun von Dr. Thomas Reischig übernommen. Dabei wurden Schwerpunkte geändert sowie dieses Skript entworfen. Nichts ist von Anfang
an perfekt; bitte helfen Sie uns daher durch konstruktive Kritik, das Praktikum zu verbessern!
Viel Erfolg und Freude am Praktikum wünschen Ihnen
Thomas Reischig, Heribert Gras, Margret Winkler, Patrizia Sprysch und Oliver Mai
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Neuroanatomie der Insekten
Allgemeine Bemerkungen zum Nervensystem
Das Nervengewebe, das das Nervensystem aufbaut, gehört zu den vier Grundgeweben des
tierischen Organismus (daneben: Epithelien, Muskel- und Bindegewebe). Nervensysteme
haben in Tieren die Aufgabe, sowohl Umweltinformationen als auch Informationen über
innere Zustände, die über Rezeptoren gesammelt werden, zu verarbeiten und in sinnvolles
Verhalten umzusetzen. Nervenzellen (Neurone) sind wahrscheinlich schon sehr früh in
der Evolution der Eumetazoa aus sekretorischen Zellen entstanden und sind auch heute
noch als solche aufzufassen. Ihr für ihre Funktion wichtigstes Merkmal ist der Besitz von
spannungsabhängigen Kationenkanälen in genügend hoher Dichte, um regenerative Depolarisationen (Aktionspotentiale) zu ermöglichen und weiterzuleiten. Neurone treten zu anderen Neuronen, aber auch anderen Zellen (Sinneszellen, Muskelzellen) über Synapsen
zur Informationsweiterleitung in Kontakt. Elektrische Synapsen erlauben den Austausch
von kleinen Ionen zwischen den Zellen. Potentialänderungen können damit sehr schnell
weitergeleitet werden, aber eine Modulation des Signals ist kaum möglich; zudem kann das
Signal nicht gerichtet werden. Chemische Synapsen hingegen, die über Transmitterausschüttung funktionieren, erlauben dagegen den Durchgang des Signals nur in eine Richtung,
nämlich von der prä- zur postsynaptischen Seite. Daneben haben viele Neurone die Möglichkeit zur Bildung und Sekretion von längerfristig wirkenden Neuromodulatoren.
Das Neuron enthält die üblichen Bestandteile einer tierischen Zelle, wie Zellmembran, Nukleus, Cytopolasma, Golgiapparat, endoplasmatisches Retikulum, Mitochondrien, Cytoskelett etc. Meist lernt man die Morphologie der Neurone in der klassischen Dreigliederung
kennen: Zellkörper (Soma, Perikaryon), Dendrit und Axon. Dendriten und Axone sind
verzweigte Fortsätze, die aus dem Soma entspringen. Dendriten erhalten synaptische Eingänge von anderen Neuronen, wobei synaptische Potentiale entstehen, die passiv (elektrotonisch) weitergeleitet werden. Führt die Summe aller synaptischen Potentiale zu einer genügend hohen Depolarisation an einer bestimmten Stelle des Neuron, der aktionspotentialgenerierenden Zone, kann ein Aktionspotential ausgelöst werden, das nun aktiv über das
Axon zu den Zielzellen weitergeleitet wird. Dieser Grundtypus des Neurons wird aber oft
abgewandelt, wie später zu sehen sein wird.
Neben den Neuronen finden sich im Nervengewebe die Gliazellen, die einige sehr wichtige Aufgaben im Nervengewebe übernehmen. Sie regulieren den Ionenhaushalt des extrazellulären Raumes in Nervengewebe, versorgen Neurone mit Nährstoffen und beseitigen
Abfallstoffe, arbeiten als Immunsystem etc. Die wirkliche Bedeutung der Gliazellen für die
Funktion des Nervensystems wird heute noch wenig verstanden und viel unterschätzt.
Bau und Entwicklung des Insekten-Nervensystems
Das ZNS der Insekten entsteht wie auch bei den Wirbeltieren aus dem Ektoderm, allerdings nicht durch Einfaltung, sondern durch Wanderung von ventralen Ektodermzellen in
die Tiefe, wo sie als Neuroblasten zwei parallele Neuralwülste bilden. Reifere Neuroblasten
teilen sich asymmetrisch in weitere Neuroblasten und Ganglienmutterzellen; letztere differenzieren sich schließlich nach symmetrischer Teilung zu Neuronen.
3
Das Nervensystem der Insekten besteht aus einem zentralen und peripheren Nervensystem, wobei letzteres aus dem zentralen Nervensystem hervorgeht und dieses einerseits mit
den Sinnesorganen (afferente Bahnen), andererseits mit Effektoren wie Muskeln und
Drüsen (efferente Bahnen) verbindet. Das Zentralnervensystem (ZNS) hat den charakteristischen strickleiterförmigen Aufbau, wie er auch bei Krebstieren (Crustacea) und Ringelwürmern (Annelida) bekannt ist. Die wahrscheinliche phylogenetische Entstehung diese
Aufbaues ist in Abb. 1 erläutert: Aus eiAbb. 1. Modell der Evonem an der Basis der Epidermis (basielution des Zentralnerpithelial) gelegenen diffusen Nervennetz,
vensystems (ZNS) der
wie
es heute noch bei Hohltieren (CnidaInsekten. A Diffuses basiepitheliales Nervennetz
ria; Quallen, Seeanemonen etc.) vor(Cnidarier). B Subepithekommt, entwickelte sich durch zunehliales Orthogon (Plathelmende Kondensation der Nervenzellen
minthes). C Tetraneurales ZNS (Anneliden, Mol(Neurone) und ihrer Ausläufer ein subelusken) mit zunehmender
pitheliales, gitterartiges Orthogon, besteKondensation
im
hend aus längs- und querverlaufenden
Bauchmark (D). E Strickleiternervensystem
urMarksträngen1 sowie einem vorderen
sprünglicher Insekten. F
Schlundring. Durch weitere Kondensation
Kondensation von Oberund Zentralisation, ein wichtiger Trend in
und
Unterschlundganglien sowie der Thoder Evolution von immer beweglicheren
rakal- und AbdominalTieren mit hochentwickelten Sinnesorgaganglien
abgeleiteter
nen und komplexem Verhalten, entstand
Insektengruppen.
daraus über die Stufe des tetraneuralen
(viersträngigen)
Nervensystems
das
bauchwärts (ventral) gelegene Strickleiternervensystem. Dieses besteht aus Ganglienpaaren, von denen ursprünglich je eines in jedem Segment liegt. Die beiden Ganglien innerhalb eines Segmentes sind untereinander durch Kommissuren, und mit den auf gleicher
Seite liegenden Ganglien des jeweils vorne und hinten anschließenden Segmentes durch
Konnektive verbunden (Abb. 2).
Bei den Vorfahren der Insekten verschmolzen die drei (nach manchen Autoren vier) vordersten Ganglienpaare zum Oberschlundganglion (Cerebral- oder Supraoesophagealganglion), die folgenden drei zum Unterschlundganglion (Suboesophagealganglion), wobei
beide durch die den Schlund (Oesophagus) umgreifenden Schlundkonnektive untereinander verbunden sind. Die darauffolgenden Ganglienpaare (die man wegen ihrer starken
Verschmelzung an den Konnektiven oft nur mit dem Singular als Ganglion bezeichnet)
werden entsprechend ihrer Lage als Thorakalganglien (mit Pro-, Meso- und Metathorakalganglion) und Abdominalganglien bezeichnet. Insekten haben ursprünglich elf Abdominalsegmente, deren Zahl aber durch Verschmelzung und Reduktion bei den abgeleiteten
Gruppen meist reduziert ist. Entsprechend reduziert sich auch die Anzahl der Abdominalganglien; selbst ursprüngliche Insekten haben nur acht Abdominalganglien, wobei das letzte davon aus der Verschmelzung der Abdominalganglien VIII–XI entstand. Bei manchen
Insekten wie den Fliegen sind schließlich alle Thorakal- und Abdominalganglien zu einer
Ganglienmasse vereint, wobei äußerlich kaum mehr ein Hinweis auf den ursprünglichen
strickleiterartigen Aufbau zu finden ist. Auch Ober- und Unterschlundganglion zeigen
Tendenz zur Verschmelzung bei abgeleiteten Insektentaxa. Während diese bei den orthopteroiden Insekten wie den Schaben noch deutlich separiert sind, bilden sie etwa bei den
Lepidoptera (Schmetterlingen), Hymenoptera (Hautflüglern) und Diptera (Fliegen) eine
Markstränge enthalten sowohl die Zellkörper der Neurone als auch deren Ausläufer; es gibt noch keine Separation des Nervengewebes in Ganglien und Nerven.
1
4
Abb. 2. Schema des Nervensystems eines ursprünglichen geflügelten Insekts.
zusammenhängende Masse mit Schlundloch als Durchtrittspforte für den Oesophagus.
Ober- und Unterschlundganglion werden zusammen oft und mit einiger Berechtigung als
„Gehirn“ bezeichnet; manchmal wird allerdings bei Insekten mit deutlich separiertem Unterschlundganglion nur das Cerebralganglion so benannt.
Das Unterschlundganglion gliedert sich in Mandibular-, Maxillar- und Labialganglion
und innerviert die Mundwerkzeuge. Unser Interesse gilt hier aber dem Cerebralganglion
mit seinen drei Abschnitten, dem Proto-, Deuto- und Tritocerebrum, und den beiden
lateral am Protocerebrum angesetzten optischen Loben. Das Protocerebrum gilt als der
Sitz der höheren integrativen und assoziativen Leistungen des Insekten-ZNS. Der Bau des
Cerebralganglions wird im nächsten Abschnitt eingehender besprochen.
Funktionell vergleichbar mit den Wirbeltieren, gibt es auch bei Insekten neben dem somatischen Nervensystem, das die Umsetzung von über Sinnesorgane vermittelten Umweltreizen in adäquates Verhalten bewerkstelligt, auch noch ein viscerales (sympathisches bzw.
vegetatives) Nervensystem (Abb. 3), das die inneren Zustände des Organismus reguliert.
Es gliedert sich in drei Teilsysteme: dem stomatogastrischen Nervensystem, dem unpaaren Ventralnerv (Leydigscher Nerv; innerviert die Stigmen) und dem caudalem visceralem Nervensystem (innerviert hinteren Darmabschnitt und Gonaden). Das stomatogastrische Nervensystem, dessen Zentrum das Frontalganglion ist, ist mehrfach mit dem
Gehirn und auch dem endokrinen System verbunden. Von letzterem werden uns häufig
zwei paarige, posterior dem Gehirn und am Vorderende der Aorta gelegene Neurohämalorgane auffallen, die Corpora cardiaca und Corpora allata. Während erstere im Gehirn
gebildete Hormone freisetzt (Neurohormone), erzeugen die C. allata selbst Hormone (ver5
Abb. 3.
gleichbar der Aufteilung der Hypophyse in Neurohypophyse und Hypophysenvorderlappen bei den Wirbeltieren).
Feinbau des Nervensystems
Das Neuron als Grundeinheit des Nervensystems ist bei Insekten fast stets pseudounipolar
aufgebaut, im Gegensatz zu den meist multipolaren Nervenzellen der Wirbeltiere, die Ihnen aus Lehrbuchabbildungen vertraut sind. Dies bedeutet, daß immer nur ein Fortsatz
(primärer Neurit; Neurit = Gesamtheit der Fortsätze des Neurons) aus dem Soma austritt,
der sich dann später in dendritische und axonale Bereiche verzweigen kann. Die Richtung
der Erregungsleitung im Neuriten und damit die Determination in dendritische und axonale Bereiche entsteht durch den Besatz der Fasern mit post- oder präsynaptischen Strukturen. Vielfach befinden sich die dendritischen Bereiche näher am Soma als die axonalen.
Dendritische Bereiche sind häufig weniger verzweigt und erscheinen glatter als axonale, die
letzteren sind oft in den Terminalbereichen feiner verzweigt und besitzen dort perlschnurartige Verdickungen (synaptische Boutons oder Varikositäten). Letztgültig können aber
dendritische und axonale Bereiche nur durch elektronenmikroskopische Beobachtungen
identifiziert werden; ferner können auch sowohl Eingangs- als auch Ausgangssynapsen
dicht nebeneinander auf derselben Terminale vorkommen.
Eine weitere Besonderheit der Insektenneurone gegenüber Wirbeltierneuronen ist die hohe
morphologische Komplexität vieler Neurone. Da das Insektengehirn wesentlich kleiner ist
als das der meisten Wirbeltiere (Biene: ca. 1 Mio. Neuronen), Insekten aber andererseits
vergleichbar komplexe Lern- und Verhaltensleistungen erbringen können, müssen Aufgaben, die bei Wirbeltieren von einer Vielzahl von Neuronen übernommen wird, bei Insekten
von wenigen oder auch einzelnen von einzelnen Neuronen bewältigt werden. Für den Neurophysiologen ergibt sich der Vorteil, daß kleine Neuronengruppen oder sogar einzelne
Neurone individuell erkennbar sind und zwischen den Individuen einer Art, manchmal sogar zwischen den Arten, vergleichend untersucht werden können.
Der pseudounipolare Bau der Insektenneurone ist die Grundlage für den besonderen Bau
des Insektenganglions (und auch der Ganglien anderer Wirbelloser mit diesem Neuronentyp). Hier sind die Somata der Neurone in einer äußeren Schicht konzentriert, die man als
Cortex bezeichnet (nicht zu verwechseln mit der gleichnamigen, aber völlig anders aufgebauten Struktur im Wirbeltiergehirn; cortex [lat.] = Rinde). Dort sind die einzelnen Somata
mit meist mehreren Schichten von flächigen Gliazellfortsätzen voneinander separiert. Der
6
Abb. 4. 3D-Modell und Schema des Cerebralganglions mit den prominentesten Neuropilen der Schabe
Leucophaea maderae.
Cortex umgibt eine zentrale Struktur, das Neuropil. Dieses besteht zum größten Teil aus
den Neuriten der Neurone im Cortex, aber auch aus Fortsätzen von Gliazellen. Synaptische Interaktionen zwischen den Neuronen finden ausschließlich im Neuropil statt, d.h. bei
Insekten kommen auch keine axo-somatischen Synapsen wie bei Wirbeltieren vor. Im Neuropil selbst gibt es Bereiche mit mehr oder weniger intensiven synaptischen Interaktionen,
aber auch Bereiche, in denen Bündel aus Neuriten (Trakte) verlaufen und wo kaum Synapsen zu finden sind. Innerhalb der Neuropilmasse des Cerebralganglions findet man
auch deutlich abgesetzte prominente Strukturen, die sich durch einen besonderen Grad an
räumlicher Ordnung der dort befindlichen Neuriten kennzeichnen, die oft auch durch
Gliahüllen von der umliegenden Neuropilmasse abgegrenzt sind, und mehr oder weniger
gut bestimmten Funktionszusammenhängen zuordenbar sind. Man bezeichnet sie, sprachlich kaum vom Gesamtneuropil abgegrenzt, als Neuropile. Im optischen Lobus und auch
anderen Bereichen des Gehirns sind manche Neuropile durch nach innen eingewachsene
Cortexbereiche separiert. Die prominentesten Neuropile des Cerebralganglions der Schabe
sind in Abb. 4 wiedergegeben.
Im Folgenden werden einige wichtige Neuropile kurz beschrieben:
Antennallobus
Der Antennallobus nimmt den größten Platz im Deutocerebum ein. Er ist die erste Schaltstation für die Verarbeitung olfaktorischer Information, die über Sinneszellen an der An7
tenne aufgefangen werden. Diese Rezeptorneurone projizieren über den Antennalnerv in
den Antennallobus, wo sie auf Interneurone und Projektionsneurone verschalten. Die Projektionsneurone leiten die Informationen in das Zentralhirn, weiter vor allem zu den Pilzkörpern und in das laterale Protocerebrum. Das Neuropil des Antennallobus ist selbst wieder in globuläre Strukturen unterteilt, den Glomeruli.
Die folgenden Neuropile sind alle Teil des Protocerebrums:
Pilzkörperkomplex
Der Pilzkörperkomplex (oder auch einfach Pilzkörper) besteht aus mehreren abgrenzbaren Einheiten. Seine Hauptmasse besteht aus den Neuriten der Kenyonzellen; dies sind
Neurone, deren zahlreiche kleine, dicht gepackte Somata im Cortex des dorsalen Protocerebrum liegen. Direkt unterhalb liegen die Pilzkörperbecher oder Calyces. Hier haben die
Neuriten der Kenyonzellen ihre dendritischen Regionen und bekommen Eingänge vor allem von olfaktorischen Projektionsneuronen. Die Calyces haben eine auffällige Glomerulistruktur. Die Axone der Kenyonzellen projizieren weiter in den Stiel (Pedunculus) des
Pilzkörpers. An dessen Basis verzweigen sie sie sich, wobei ein Ast in den Alpha-Lobus,
der andere in den Beta-Lobus zieht. Abweichungen von diesem Grundschema sind bei
anderen Insektengruppen möglich. Pedunculus, Alpha- und Beta-Lobus des Protocerebrums werden auch von anderen Neuronen des Protocerebrums innerviert (extrinsische
Neurone), die dort mit den intrinsischen Kenyonneuronen verschalten. Die Pilzkörper sind
maßgeblich am olfaktorischen Lernen der Insekten beteiligt und werden auch mit anderen
Assoziationsleistungen des Insektengehirnes sowie der Koordination der Motorik in Verbindung gebracht (Strausfeld et al. 1998).
Zentralkörperkomplex
Der Zentralkörperkomplex (oder Zentralkomplex) setzt sich zusammen aus dem eigentlichen, unpaaren Zentralkörper mit oberer und unterer Einheit, der ebenfalls unpaaren
Protocerebralbrücke, und den paarigen, posterior des Zentralkörpers gelegenen Noduli.
Die lateralen akzessorischen Loben sind mit dem Zentralkörperkomplex eng verbunden, werden meist aber nicht zu diesem hinzugezählt. Charakteristisch für Protocerebralbrücke und Zentralkörper ist der Aufbau in 16 nebeneinanderliegende Kolumnen, die im
Lichtmikroskop gut zu erkennen sind. Diese Kolumnen werden von verschiedenen Neuronen des medianen Protocerebrums tangential innerviert, d.h. miteinander verbunden.
Der präzise topographische Aufbau des Zentralkomplexes hängt eng mit seiner Funktion
zusammen. Diese liegt sehr wahrscheinlich in der Rechts-Links-Orientierung sowie in der
Koordination motorischer Aktivitätsmuster (laufen, fliegen). Starke Hinweise gibt es auch
für eine Rolle in der Orientierung im Raum und in der Navigation nach dem Polarisationsmuster des blauen Himmels (Homberg 2004).
Neuropile der optischen Loben
Lamina, Medulla und Lobula sind die drei großen Neuropile der optischen Loben, welche seitlich aus dem Protocerebrum entspringen. Hier finden die ersten wichtigen Schritte
zur Verarbeitung visueller Informationen aus den Komplexaugen statt, die dann an das
Zentralhirn weitergegeben werden. Die Komplexaugen bestehen aus einzelnen Ommatidien, von denen jedes acht Photorezeptorzellen enthält, die mit R1-R8 bezeichnet sind. Die
Rezeptoren R1-R6 terminieren im ersten Neuropil, das direkt unterhalb der Retina liegt,
der Lamina. Dort verschalten sie auf sogenannte Monopolare oder Lampenbürstenneurone, deren Somata distal der Lamina liegen und von denen es mehrere Typen gibt. Die Rezeptoren je eines Ommatidiums sind dabei mit je einem Set von Monopolaren Neuronen
verbunden. Dabei entstehen regelmäßige sich wiederholende Einheiten aus einem bestimmten Satz von Neuronen, den sogenannten optic cartridges, wobei jede dieser Einheiten
8
einem Ommatidium zugeordnet ist und dabei die räumliche Anordnung der Ommatidien
beibehält. Eine solche topographische Entsprechung von neuronalen Einheiten und zugehörigen Photorezeptoren nennt man Retinotopie und ist ein universelles Bauprinzip in
allen Zentralnervensystemen, die räumliche visuelle Information verarbeiten können.
Durch Querverbindung der neuronalen Einheiten mit Tangentialneuronen entsteht der
für die optischen Neuropile typische morphologische Aufbau in Kolumnen und Schichten,
der aber in der Lobula nicht mehr so deutlich zu Tage tritt.
Die Monopolaren Neurone der Lamina projizieren weiter in die Medulla, wo sie durch die
zahlreichen Medulla-Tangentialneurone verbunden werden. Beim Übergang von der Lamina zur Medulla überkreuzen sich die Fasern an der vertikalen Achse (1. optisches Chiasma).
Das 2. optische Chiasma entsteht analog zwischen Medulla und Lobula. In der Medulla,
und zwar in ihren mittleren Schichten (serpentine layer), terminieren auch noch die Fasern der
Rezeptoren R7 und R8. Bestimmte Neurone verbinden beide Medullae über kommissurale
Trakte, die durch das Zentralhirn laufen. Ein großer Teil dieser Neurone hat Verzweigungen in der akzessorischen Medulla, einem kleinen Neuropilbereich in der ventromedialen
Medulla. Die akzessorische Medulla enthält circadiane Schrittmacherneurone und steht in
Zusammenhang mit der tageszeitlichen Koordination des Verhaltens.
Die Lobula ist bei vielen schnellfliegenden Insekten (Diptera, Lepidoptera) zweigeteilt in
die eigentliche Lobula und die Lobulaplatte. Auffällige große Tangetialneurone der Lobulaplatte bei Fliegen sind derzeit Gegenstand von Untersuchungen zur neuronalen Kodierung
von räumlicher und von Bewegungsinformation. Über die Bau und Funktion der Lobula
bei orthopteroiden Insekten wie der Schabe ist derzeit wenig bekannt.
Transmitter und Peptide im Insektengehirn
Die Erregungsweiterleitung von einem Neuron zum nächsten über chemische Synapsen
funktioniert über Ausschüttung (Sekretion) eines Neurotransmitters in die extrazelluläre
Matrix, wo der Transmitter an Rezeptoren auf der Zielzelle binden und dort eine Änderung
des Membranpotentials hervorrufen kann. Die Erregungsweiterleitung über eine chemische
Synapse ist immer gerichtet (von der prä- zur postsynaptischen Zelle) und das Signal kann
auf vielfache Art und Weise moduliert werden (im Gegensatz zur elektrischen Synapse).
Es gibt nur eine sehr beschränkte Anzahl von Neurotransmittern. Dies sind relativ kleine
Moleküle, die drei Stoffklassen zugeordnet werden können:
•
Aminosäuren u. Derivate: Glutamat, Asparagin, Glycin, ?-Aminobuttersäure (GABA)
•
Biogene Amine: Dopamin, Octopamin, Adrenalin1, Noradrenalin1 (=Catecholamine), Histamin, Serotonin
•
Choline: Acetylcholin
Meist (aber keineswegs immer!) kommt nur einer dieser Stoffe in einem bestimmten Neuron vor. Transmitter werden vom Neuron gebildet, in kleine Vesikel (ca. 20–30 nm) verpackt und zur Synapse transportiert. Erhöhung des intrazellulären Calziumspiegels an der
Präsynapse, meist verursacht durch ein Aktionspotential des Neurons, führt zur Fusion
von Vesikeln mit der Membran und Ausschüttung des Transmitters in den synaptischen
Spalt. An diesen bisher nur zum Teil aufgeklärten Mechanismen sind eine Reihe von Proteinen beteiligt, die entweder an der präsynaptischen Membran Komplexe bilden, welche
Adrenalin und Noradrenalin spielen bei Insekten wohl eher eine untergeordnete oder gar keine Rolle. Als
„Streßtransmitter“ dient bei ihnen Octopamin.
1
9
auch im Elektronenmikroskop erkennbar sind (Syntaxin, Neurexin, SNAP-25), oder in der
Vesikelmembran lokalisiert sind (Synaptobrevin, Synaptotagmin). Der Transmitter diffundiert durch synaptischen Spalt, den extrazellulären Raum zwischen der Prä- und Postsynapse, und dockt an der Postsynapse an spezifische Rezeptoren. Die weitere Wirkung
hängt von der Art der Rezeptoren ab; es gibt viel mehr verschiedene Rezeptoren als Neurotransmitter. Ionotrope Rezeptoren sind selbst ein Ionenkanal, metabotrope Rezeptoren
vermitteln die Öffnung von Kanälen über second-messenger-Systeme (vergleichen Sie die gegensätzliche Funktion von nikotinischen und muskarinischen Acetylcholinrezeptoren, die
Sie aus dem Grundstudium kennen!). Je nach Art der Kanäle, die geöffnet wurden, treten
auf der postsynaptischen Seite exzitatorische postsynaptische Potentiale (EPSPs) oder inhibitorische postsynaptische Potentiale (IPSPs) auf. Im Zentralnervensystem der Insekten
treten Acetylcholin meist als erregender, GABA meist als hemmender Transmitter auf.
Dachte man einst (zumindest theoretisch), die Funktion des Gehirns verstehen zu können,
wenn nur die Gesamtheit aller seiner synaptischen Verschaltungen bekannt wäre, wurde
man eines Besseren belehrt, als zunehmend die Bedeutung der Neuromodulation klar wurde. Viele Neurone haben die Fähigkeit zur Bildung und Sekretion von Neuromodulatoren.
Dies sind Peptide (Neuropeptide) mit meist etwa 5–20 Aminosäuren, die in der Zelle in
Vesikeln verpackt vorliegen, die nicht direkt an Synapsen ausgeschüttet werden, die über
längere Distanzen wirken können, und meist eine längere Wirkdauer an den Zielzellen entfalten als klassische Neurotransmitter. Neurosekretorische Vesikel sind im elektronenmikroskopischen Bild von synaptischen Vesikeln durch ihre Größe (ca. 50–200 nm) und ihren elektronendichten und daher dunkel erscheinenden Inhalt zu unterscheiden (dense core
vesicles). Es gibt sehr viel mehr neuroaktive Peptide als Transmitter (bis jetzt mehr als 60 bei
Insekten bekannt), und immer noch werden neue entdeckt. Dazu gehört natürlich noch
eine vergleichbare Anzahl an spezifischen Rezeptoren. Neuropeptide lassen sich in Peptidfamilien gruppieren; manche stellen auch Isoformen eine precursor-Gens dar, die durch alternatives splicing entstehen. Spezifische Neuropeptide werden von bestimmten Untergruppen von Neuronen exprimiert; ihre Zahl und Verbreitung variiert erheblich zwischen den
einzelnen Peptiden. Ein einzelnes Neuropeptid kann sehr verschieden Funktionen einnehmen; so kann dasselbe Peptid von bestimmten Neuronen in den interzellulären Raum
freigesetzt werden, wo es zu benachbarten Zielzellen diffundiert (parakrine Wirkung), von
anderen Neuronen in den Blutkreislauf entlassen und als Hormon (endokrin) wirken. Insekten haben im Protocerebrum zwei große Gruppen von neurosekretorischen Neuronen
(in der Pars intercerebralis und im lateralen Protocerebrum), die über Trakte (Nervus corporis
cardiaci) in die Corpora cardiaca projizieren und dort Neuropeptide in die Blutbahn freisetzen. Innerhalb des zentralen Nervensystems hängt die Wirkung eines bestimmten Neuropeptids auch noch davon ab, von welchen Zellen es produziert, wo es freigesetzt wird, und
welches die spezifischen Zielzellen sind, die den richtigen Rezeptor dafür haben. Über die
Wirkung der meisten Neuropeptide im zentralen Nervensystem ist noch wenig bekannt.
Viele werden offenbar gleichzeitig mit der synaptischen Aktivität des Neurons freigesetzt
und modulieren so die kurzzeitige Wirkung der synaptischen Übertragung mit einer längerfristigen, von der freigesetzten Peptidmenge abhängigen Wirkung.
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Die folgende Tabelle gibt noch einmal eine kurzen Überblick über die Unterschiede der
Funktionsweisen von Neurotransmittern und Neuromodulatoren:
Mechanismus
Neurotransmitter
Neuromodulatoren
Direkt
Indirekt
Geschwindigkeit Schnell
Langsam
Wirkort
Lokal an der Synapse
In Diffusionsreichweite
Wirkdauer
Kurze Wirkung
(Millisekunden)
Mittel- bis langfristige Wirkung
(Sekunden – Stunden)
Rezeptoren
Kanal- oder second-messenger- second-messenger-gekoppelt (megekoppelt (ionotrop oder tabotrop)
metabotrop)
11
Circadiane Rhythmik und Neurobiologie
Die zeitliche Ordnung von Verhalten und physiologischen Vorgängen wird von äußeren
und inneren Rhythmen organisiert. Einer der auffälligsten äußeren Rhythmen ist der tägliche Wechsel von Tag und Nacht, der, bedingt durch die Rotationsgeschwindigkeit der Erde, 24 Stunden beträgt. Bis auf wenige Ausnahmen sind alle Organismen diesem Rhythmus
unterworfen. Es hat sich schon sehr früh in der Evolution des Lebens bezahlt gemacht,
wenn Organismen nicht nur passiv auf den Tagesrhythmus reagieren, sondern regelmäßige
Vorgänge vorwegnehmen können. Daher haben sich biologische Mechanismen entwickelt,
die endogen einen etwa 24stündigen Rhythmus (circadianer Rhythmus) produzieren und
somit als Innere Uhr wirken. Zwar sind bei höheren Tieren viele Zellen fähig, einen circadianen Rhythmus zu produzieren, meist befinden sich aber circadiane Schrittmacher in
spezialisierten Regionen des Zentralnervensystems und fungieren dort als Hauptschrittmacher (zumindest für die Steuerung des Verhaltens). Innere Uhren sind zwar sehr präzise,
haben aber keinen exakt 24stündigen Rhythmus (daher der Begriff: circa [lat.] ungefähr, dies
[lat.] der Tag); die mittlere circadiane Periode schwankt zwischen den Arten von meist 22–
25 Stunden. Daher muß der Gang der Inneren Uhr täglich aufs Neue an den realen Tag
abgestimmt (synchronisiert) werden. Der wichtigste Zeitgeber ist dabei das Licht. Es verwundert daher nicht, daß die der Inneren Uhr zugrundeliegenden Strukturen oft eng mit
den Zentren der Verarbeitung visueller Informationen assoziiert sind. Oft sind es spezifische Photorezeptoren, die über entrainment pathways der Inneren Uhr Informationen über
den Zeitpunkt der Wechsel zwischen Tag und Nacht geben. Der circadiane Schrittmacher
wiederum gibt seine Zeitinformation über Effektorbahnen an den Organismus weiter.
Es ist eine der Hauptaufgaben der Chronobiologie, Innere Uhren in verschiedenen Organismen zu lokalisieren, und ihre Funktion sowie auch die Arbeitsweisen von Synchronisation und Übermittlung von Zeitfunktion aufzuklären. Die Madeiraschabe, mit der Sie sich
im Kurs beschäftigen, war das erste Tier, bei dem eine Innere Uhr im Gehirn lokalisiert
werden konnte. Sie liegt in den optischen Loben in einem Bereich der ventromedialen Medulla. Dort liegt die akzessorische Medulla (AMe), und es mehren sich die Hinweise, daß
dieses Neuropil an der zeitlichen Koordination von Verhalten beteiligt ist. Die AMe besteht aus den Fortsätzen bestimmter Neuronen, von denen ein Teil circadiane Schrittmacherneurone sind. In der akzessorischen Medulla der Schabe verzweigen etwa 16 Neurone,
die das Neuropeptid pigment-dispersing factor (PDF; oft auch pigment-dispersing hormone, PDH,
genannt) enthalten. Es weist inzwischen viel darauf hin, daß diese oder zumindest eine Untergruppe davon die gesuchten Schrittmacherneurone sind. Sie gehen innerhalb der AMe
mannigfaltige Interaktionen mit anderen Neuronen ein, z.B. lokalen Interneuronen, Neuronen des entrainment pathway, bilateralen Kopplungsneuronen, oder Ausgangsneuronen.
Diese Interaktionen aufzuklären bedeutet, das neuronale Netzwerk der Inneren Uhr zu
entschlüsseln, und ist auch Gegenstand Ihres Praktikums.
Die Taufliege Drosophila melanogaster ist ein weiteres populäres Modelltier in der Chronobiologie. An ihr wurden in den letzten 15 Jahren bahnbrechende Entdeckungen über den molekularen Mechanismus des circadianen Rhythmus einzelner Neurone gemacht. Als man
danach die beteiligten Komponenten bei Säugetieren und so auch beim Menschen suchte,
wurde man sehr schnell fündig und fand heraus, daß die molekularen Funktionsweisen der
Inneren Uhren sehr ähnlich sind. Dies ist ein echtes Paradebeispiel für die Bedeutung der
Insektenneurobiologie zum Verständnis des menschlichen Gehirns.
12
Immuncytochemie
Immuncytochemische (oder immunhistochemische) Färbemethoden wurden vor mehr als
30 Jahren zum ersten Mal angewandt und erfahren seither eine beständige Weiterentwicklung. Sie haben Entdeckungen in vielen Bereichen der Biologie ermöglicht, wo immer es
gilt, Substanzen in Geweben aufzuspüren und zu lokalisieren. Die Beherrschung immuncytochemischer Methoden gehört heute zum Standardrepertoire histologischer Labors in
Forschung und Klinik. Zwar werden viele Verfahren heute routinemäßig abgewickelt, teilweise kann man auch fertige Kits kaufen. Um jedoch wirklich vom Potential dieser Methoden profitieren zu können, aber auch die Grenzen der Interpretationsmöglichkeiten eigener
und fremder Ergebnisse zu wissen, ist einiges an Kenntnissen und Erfahrungen notwendig.
Einiges davon soll Ihnen dieser Kurs vermitteln.
Das Verfahren der Immuncytochemie besteht im wesentlichen darin, ein Antiserum gegen
die gesuchte Substanz auf Gewebepräparate aufzubringen, wo die Antikörper an das Antigen binden können. Der Antikörper kann nun direkt mit einer farbgebenden Substanz
(Fluoreszenzfarbstoffe, Enzyme u.a.) markiert sein, der die Bindestellen und damit die Lokalisation des Antigens im Gewebe sichtbar macht. Aus mehreren Gründen wird diese direkte Methode nur selten durchgeführt. Meistens verwendet man den Antikörper als primären Antikörper ohne Farbstoffdotierung und setzt, nachdem man das primäre Antiserum
vom Gewebe heruntergewaschen hat, ein sekundäres Antiserum hinzu, das aus einer anderen
Spezies als das primäre Antiserum gewonnen wurde und dessen Antikörper gegen das FcFragment des primären Antikörpers gerichtet sind. Hierbei ist der sekundäre Antikörper
mit einem Farbstoff konjugiert. Dabei gibt es verschiedene Verfahren, die sich in der Art
der verwendeten Antikörper oder Antikörpermarkierungen unterscheiden. Bei manchen
Methoden wird auch noch ein tertiäres Antiserum eingesetzt. Die gebräuchlichen Methoden
werden im Kurs eingehender besprochen. Die 2-Schritt oder 3-Schritt-Methoden haben
vor allem zwei Vorteile: Zum einen erreicht man einen Verstärkung des Färbesignals dadurch, daß mehrere Antikörper des sekundären Antiserums an einen primären Antikörper
binden können. Zum anderen ist es praktischer und auch kostengünstiger, wenn man nicht
jedes primäre Antiserum mit Farbstoff markieren muß, sondern nur wenige Antiseren, die
gegen die Fc-Regionen der Antikörper bestimmter, zur Immunisierung verwendeter Spezies gerichtet sind, und universal einsetzbar sind. Durch Verwendung von mehreren primären Antiseren, die aus unterschiedlichen Tieren gewonnen wurden, und deren spezifischer
sekundärer Antiseren, die mit voneinander unterscheidbaren Farbstoffen dotiert sind, können Mehrfachmarkierungen erzielt werden. Inzwischen gibt es auch Methoden, zwei verschiedene Antiseren aus der gleichen Spezies getrennt voneinander zu detektieren.
Antikörper
Antikörper (Immunglobuline, Ig) sind die zentralen Reagenzien aller immuncytochemischer Experimente. Von den Hauptklassen der Immunglobuline (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM)
sind für die Immuncytochemie meist nur das IgG (G für Gamma) von Bedeutung;
manchmal werden auch IgM verwendet. Ein Ig-Molekül besteht aus zwei identischen
schweren (H) und zwei identischen leichten (L) Ketten; die strukturellen Eigenschaften der
H-Ketten bestimmen die Klasse des Moleküls. Die H-Ketten werden untereinander als
auch mit den L-Ketten über Disulfidbrücken verbunden und führen so zur Ausbildung der
charakteristischen Y-Form (Abb. 5). Zahlreiche weitere Disulfidbrücken bestimmen die
Tertiärstruktur der Ketten.
IgG können durch Proteasen an bestimmten Stellen gespalten werden. Papain zerstört eine
dagegen empfindliche Bindung N-terminal der Disulfidbrücke zwischen den H-Ketten (der
N-Terminus liegt an den Enden der Schenkel des Y). Dadurch entstehen zwei monovalente Fragmente (Fab), die die spezifischen Antigen-Bindungseigenschaften des Ig behalten,
13
und ein Fragment bestehend aus dem Stiel des Y (Fc). Pepsin dagegen spaltet die H-Ketten
C-terminal zur Disulfidbrücke, wodurch ein bivalentes Fragment (Fab´)2 entsteht, die FcAbschnitte werden hierbei zerstört. Nicht nur ganze IgG, sondern auch Fab und F(ab´)2Fragmente werden in der Immuncytochemie eingesetzt.
Sowohl H- als auch L-Ketten bilden variable (N-terminal; VH und VL) und konstante Domänen aus (C-terminal; CH und CL). Innerhalb der variablen Domänen liegen noch mehrere
hypervariable Regionen. Zusammen bilden VH und VL den Antigen-Bindungsbereich. Antikörper werden von einem bestimmten Typ weißer Blutzellen gebildet, den BLymphozyten. Während der Entstehung eines B-Lymphocyten durch asymmetrische Teilung blutbildender Stammzellen kommt es durch Rekombination und Splicing zu einer zufälligen Umordnung des Genabschnittes, der für die die variablen Domänen kodiert. Da es
viele Millionen Möglichkeiten der Anordnung der Aminosäuren in den variablen Regionen
gibt, produziert daher jeder B-Lymphozyt seinen individuellen Antikörper. Paßt dieser Antikörper zufällig auf ein körperfremdes Protein, so daß es dort zu nicht-kovalenten Bindungen mit hoher Affinität kommt, vermehrt sich der zugehörige B-Lymphocyt und es
kommt zu einer vermehrten Produktion dieses Antikörpers und seiner Freisetzung in das
Blutserum.
Abb. 5. Schema eines Immunglobulins (Antikörper) mit den verschiedenen Domänen und durch Enzymspaltung erhaltbaren Fragmenten. S? S = Disulfidbrücken.
Antikörper gegen ein bestimmtes Antigen (die Substanz, die von dem Antikörper erkannt
wird) gewinnt man durch Immunisierung von Tieren, meist Kaninchen, gegen dieses Antigen. Nach einer initialen Injektion des Antigens folgen im Abstand von mehreren Wochen
sogenannte Booster-Injektionen zur Steigerung der Antikörperproduktion. Diese liegen dann
als IgG im Blutserum vor und können daraus aufgereinigt werden. Durch AffinitätsChromatographie werden antigen-spezifische Antikörper von anderen Immunglobulinen
isoliert. Da bei einer solchen Immunisierung stets mehrere B-Lymphocyten-Klone Antikörper produzieren, nennt man das Endprodukt polyklonales Antiserum.
Antikörper, die von bestimmten B-Lymphocyten produziert werden, erkennen jeweils nur
bestimmte Regionen des Antigen, sogenannte Epitope. Man kann nun monoklonale Antikörper, die auch nur ein bestimmtes Epitop des Antigens erkennen, dadurch gewinnen, daß
man einem immunisierten Tier (fast immer Mäuse) B-Lymphocyten entnimmt und mit
Maus-Tumorzellen (Myelom-Zellen) fusioniert. Dadurch enstehen Hybridomzellen, die
potentiell unsterblich sind; vermehrt man nun eine einzige dieser Hybridomzellen (entweder in Mäusen oder in Zellkultur), erzeugen sie einen einzigen Antikörpertyp und man gewinnt ein monoklonales Antiserum.
14
Antikörper-Markierung
Es gibt verschiedene Methoden, Antikörper zu markieren:
Fluoreszenzfarbstoffe: Dies sind Stoffe, die reich an Doppelbindungen sind und daher
Licht bestimmter Wellenlängen (Anregungslicht) absorbieren. Dadurch werden Elektronen kurzzeitig auf eine höhere Energiestufe angehoben; bei Zurückfallen des Elektrons auf
die ursprüngliche Energiestufe wird ein Photon abgegeben (Emissionslicht), dessen Wellenlänge etwas unterhalb der des Anregungslichtes liegt (die verbleibende Energiedifferenz
wird in kinetische Energie [vulgo: Wärme] umgewandelt). Im Gewebe können diese Farbstoffe mit Auflicht-Fluoreszenzmikroskopen, die Anregungs- und Emissionslicht trennen
können, oder konfokalen Laserscanmikroskopen sichtbar gemacht werden. Diese Methode
ist besonders für Mehrfachmarkierungen geeignet.
Die folgende Tabelle zeigt einige gebräuchliche Fluoreszenzfarbstoffe:
EmmissionsAnregungsmaximum (nm) maximum (nm)
Farbe
Farbstoff
Abkürzung
FluoresceinIsothiocyanat
FITC
495
515
gelb-grün
Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat
TRITC
575
600
rot
595
615
rot
Cy2
490
508
grün
Cy3
550
570
rot
Cy5
650
675
tiefrot
Texasrot
PhycoerythrinCyanine
Die relativ neuen Alexa®-Farbstoffe der Firma Molecular Probes haben eine besonders hohe Beständigkeit gegen Ausbleichen, sind aber auch entsprechend teuer.
Enzymatische Markierung: In der Immuncytochemie vier Enzyme gebräuchlich (Peroxidase, alkalische Phosphatase, Glucoseoxidase, Mikroperoxidase), die bei Zufügen geeigneter Substrate diese zu einem unlöslichen Farbstoff umwandeln, der sich im Gewebe am
Ort der Reaktion niederschlägt. Im Kurs verwenden wir Meerettichperoxidase. Sie überträgt Protonen aus Wasserstoffdonoren auf Wasserstoffperoxid (H2O2), wobei Wasser entsteht. Bei Zugabe von 3,3´-Diaminobenzidin (DAB) zusammen mit H2O2 wird das DAB
zu einem braunen, polymeren Farbstoff oxidiert. Der Vorteil dieser Methode ist, daß man
dauerhafte, archivierbare Präparate bekommt, die mit einem gewöhnlichen Lichtmikroskop
betrachtet werden können und nicht ausbleichen. Zudem erreicht man eine bessere Signalverstärkung als mit Fluoreszenzmarkern, welche durch Intensivierung mit NickelAmmoniumsulfat nochmals erhöht werden kann.
Markierung mit Biotin: Das Vitamin Biotin wird mit hoher Affinität von Avidin, einem
basischen Glykoprotein mit vier Bindungsstellen für Biotin, gebunden. Biotin läst sich sehr
leicht an Antikörper und Enzyme binden, so daß wiederum Enzyme über Avidin an den
Antikörper geheftet werden können. Aus praktischen Gründen verwendet man meist
Streptavidin aus dem Bakterium Streptomyces avidinii.
Kolloidales Gold: Antikörper können mit 10–40 nm großen Goldkügelchen markiert
werden. Diese sind im Elektronenmikroskop sichtbar und werden häufig für diese Technik
verwendet, können aber mit der Silberverstärkungstechnik, die zu einem grauschwarzen
Reaktionsprodukt führt, auch im Lichtmikroskop sichtbar gemacht werden.
15
Fixierung
Der erste und auch kritische Schritt eines immuncytochemischen Experiments ist immer
die sachgerechte Präparation des Gewebes und dessen anschließende Fixierung zur Konservierung. Ein Ziel ist dabei die möglichst originalgetreue Erhaltung der Morphologie und
der zellulären Strukturen des Gewebes, als auch das Festlegen des Antigens an seinem ursprünglichen Ort. Es gibt physikalische und chemische Fixiermethoden, die auch miteinander kombiniert werden können. Physikalische Methoden sind einfrieren oder trocknen
(letzteres nur bei Blut- oder Gewebsabstrichen). Chemische Fixative bilden meist Quervernetzungen zwischen den Proteinen des Gewebes. Dadurch wird einerseits der Zellinhalt
bzw. der Zellzusammenhalt verfestigt; andererseits werden Proteasen inaktiviert, die ansonsten die Autolyse des Gewebes vorantreiben würden. Der letzte Punkt zeigt aber auch
schon das damit verbundene Dilemma an: Durch die Veränderung der Proteine verändert
sich auch ihr antigenes Profil; ist die Veränderung zu stark, werden Antigene nicht mehr
von Antikörpern erkannt und es kommt zu unbefriedigenden Färberesultaten oder gar keiner Färbung. Bei zu milder Fixierung ist aber oft der Erhalt des Gewebes ungenügend.
Manchmal muß das für ein bestimmtes Antigen geeignete Fixans durch Versuchsreihen
ermittelt werden. Beliebte und bewährte Fixiermittel in der Immuncytochemie sind z.B.
Formaldehyd, Glutaraldehyd oder Pikrinsäure bzw. Gemische davon in gepufferter Lösung. Manchmal wird die Wahl des richtigen Fixans dadurch bestimmt, daß Antiseren nicht
gegen das reine Antigen, sondern Konjugate aus Antigen und Trägerprotein gewonnen
wurden (bei Neurotransmitter- und Peptid-Antiseren). Ist das Brückenmolekül, mit dem
die Konjugation hergestellt wurde, z.B. Glutaraldehyd, muß die Fixierlösung auch Glutaraldehyd enthalten.
Gewebeaufbereitung
Nach der Fixierung wird das Gewebe gründlich gewaschen und, falls es sich nicht um sehr
kleine Proben handelt, mit einem Mikrotom in dünne Scheiben (meist etwa 1–100 µm) geschnitten. Um es überhaupt schneiden zu können, muß das Gewebe gehärtet (teilweise
schon durch die Fixierung geschehen) und in ein Medium eingebettet werden, dessen Härtegrad schließlich etwa dem des Gewebes nach der Prozedur entspricht. Zur Gewebeeinbettung werden hauptsächlich drei Verfahren verwendet:
Paraffineinbettung: Dies ist sehr häufig verwendetes Verfahren, das nicht nur in der Forschung, sondern vor allem auch in der klinischen Praxis (Histologie, Pathologie) routinemäßig eingesetzt wird. Das Gewebe wird über eine aufsteigende Alkoholreihe entwässert
und mit einem Lösungsmittel (Benzol, Toluol) infiltriert. Danach kann es über aufsteigende
Gemische aus Lösungsmittel und geschmolzenem Paraffin (56–60°C) in reines Paraffin
überführt werden. Nach Erkalten und Zutrimmen der Proben können diese mit Rotationsoder Schlittenmikrotom in 5–20 µm dicke Scheiben geschnitten werden, die im Idealfall
zusammenhängende Bändchen ergeben, und dann auf Objektträger aufgebracht und angetrocknet. Da das Paraffin vollständig das vorher vorhandene Wasser im Gewebe ersetzt
hat, muß es vor der immuncytochemischen Färbung mit Lösungsmittel entfernt werden.
Darauf werden die Präparate in einer absteigenden Alkoholreihe rehydriert und sind nun
bereit für die Färbung, die direkt auf dem Objektträger (on slide) erfolgt. Die fertigen Präparate werden wieder dehydriert und in einem Einschlußmedium unter einem Deckglas abgedeckt.
Kunstharzeinbettung: Sie funktioniert ähnlich wie die Paraffineinbettung, statt Paraffin
wird aber ein flüssiges Kunstharz (z.B. Epon, Araldit etc.) eingesetzt, das unter Wärme
oder UV-Bestrahlung zu einer sehr harten Substanz auspolymerisiert. Hierbei kann eine
bessere Strukturerhaltung erreicht werden als bei Paraffineinbettungen und das Gewebe
kann dünner geschnitten werden (1–10 µm). Das notwendige Herauslösen des Kunstharzes
mit aggressiven Substanzen zerstört aber häufig die Antigenizität des zu färbenden Prote16
ins. Dies und der hohe Arbeitsaufwand bedingen, daß die Methode seltener eingesetzt
wird.
Agarose- und Gelatineeinbettung: In diesem Kurs werden Sie ausschließlich eine dieser
beiden Methoden einsetzen. Sie bietet gegenüber der Paraffineinbettung den Vorteil, daß
dickere Schnitte hergestellt werden können, was die Auswertung mit dem konfokalen Laserscanmikroskop erleichtert. Weiter wird das Gewebe geschont; die Entwässerung, Behandlung mit Lösungsmitteln und Erwärmung des Präparates bedingen, daß viele Antiseren gar nicht oder nur schlecht bei der Paraffinmethode einsetzbar sind. Bei beiden Methoden werden die Präparate werden nach gründlicher Abtrocknung (aber ohne Austrocknung!) in geschmolzener Agarose (einem Polysaccharid) oder einem Gelatine/AlbuminGemisch eingebettet. Nach Erkalten ist die Agarose fest genug, um mit dem Vibratom (einem speziellen Mikrotom mit schwingendem Messer) in kalter Pufferlösung geschnitten
werden zu können. Die Schnitte werden einzeln abgesammelt und zu mehreren zusammen
in kleinen Behältnissen (z.B. Blockschälchen) mit den immuncytochemischen Lösungen
inkubiert (free floating). Bei der Gelatine-Einbettung muß das Einbettmedium aber noch
durch Nachfixierung ausgehärtet werden, bevor es geschnitten werden kann; tendenziell
haften die Schnitte allerdings besser im Einbettmedium. Für die Fluoreszenzmikroskopie
werden die Schnitte nach Beendigung der Färbung in dem vorgesehenen Einschlußmedium
(hier ein Gemisch aus Glycerin und Phosphatpuffer) inkubiert und auf einem Objektträger
aufgereiht; für unsere Untersuchungen ist es dazu von Bedeutung, die richtige Reihenfolge
der Schnitte wieder herzustellen. Dies ist anfangs ein mühsames Unterfangen, es erleichtert
aber die Orientierung im Präparat und damit die mikroskopische Auswertung ganz erheblich. Danach werden die Schnitte vorsichtig und luftblasenfrei mit einem Deckglas abgedeckt und sind nun fertig für die Mikroskopie. Bei diesem Verfahren erhärtet das Einschlußmedium aber nicht und die Präparate sind nur begrenzt haltbar. Für die Herstellung
von Dauerpräparaten nach enzymatischer Färbereaktion werden die Schnitte auf Chromalaun/Gelatine-beschichteten Objektträgern aufgetrocknet und wie bei der Paraffineinbettung entwässert und in einem aushärtenden Einschlußmedium (z.B. Entellan) mit einem
Deckglas abgedeckt.
Die Details zu den einzelnen immuncytochemischen Färbemethoden und deren praktischer Anwendung werden Ihnen im Verlauf des Kurses nähergebracht; sehen Sie sich bitte
auch die Rezepte Ihrer Versuche und die der anderen Gruppen an.
Hintergrundfärbung
Ein Problem immuncytochemischer Färbungen sind oft mehr oder weniger stark auftretende Hintergrundfärbungen, die manchmal die eigentliche spezifische Färbung völlig maskieren oder zumindest schwache Signale undeutlich werden lassen können. Hierfür gibt es
drei Hauptgründe:
•
Im Gewebe befindet sich noch soviel Fixans, daß Antikörper (die ja Proteine sind) unspezifisch an das Gewebe gebunden werden. Gegenmaßnahmen: Gründliches Waschen
nach der Fixierung, Abdecken (blocken) der freien Bindungsstellen des Fixativs mit
Normalserum oder Serumproteinen, chemische Spaltung des Fixativs.
•
Proteine des Gewebes, vor allem solche mit geladenen Aminosäuren, binden unspezifisch und nicht-kovalent andere Proteine und damit auch Antikörper. Gegenmaßnahmen:
Blocken mit Normalserum oder Serumproteinen.
•
Es befinden sich noch ungebundene primäre Antikörper im Gewebe, die mit sekundären Antikörpern präzipitieren, oder auch ungebundene sekundäre Antikörper. Gegenmaßnahmen: Gründliches Waschen.
17
Achtung: Bei der Verwendung von Normalseren zum Blocken muß das Normalserum aus
der gleichen Tierart wie das sekundäre Antiserum stammen. Andernfalls kann es durch
Kreuzreaktivität zwischen den Immunglobulinen des Normalserums und des sekundären
Antiserums wieder zu erhöhtem Färbehintergrund kommen.
Kontrollexperimente
In manchen Fällen erkennen sekundäre Antikörper nicht nur die Fc-Regionen der primären Antikörper, sondern auch irgendwelche andere Epitope im Gewebe, die zufällig eine
ähnliche Struktur haben wie Epitope des eigentlichen Antigens (Kreuzreaktivität). Dies
führt zu falsch positiven Färbesignalen. Einfache Kontrollexperimente, die exakt so durchgeführt werden wie die eigentlichen Färbungen, nur daß das primäre Antiserum weggelassen wird, schaffen hier schnell Klarheit.
Kreuzreaktivität gibt es auch bei Antikörpern des primären Antiserums, die dann nicht nur
an das spezifische Antigen, sondern auch an andere Substanzen mit ähnlichen Epitopen
binden. Bei polyklonalen Antiseren ist es manchmal nur eine Fraktion von Antikörpern des
Serums, die Kreuzreaktivität verursachen. Prinipiell kann man hier zwei Fälle unterscheiden: 1. Aus einem polyklonalen Antiserum, das ja Antikörper aus mehreren B-Zellklonen
enthält, reagieren Antikörper eines oder mehrerer Klone nicht mit dem gesuchten, sondern
einem anderen Antigen. 2. Auch ein Antikörper, der spezifisch das gesuchte Antigen enthält, kann trotzdem zusätzlich mit einem anderen Antigen regieren, das zufällig strukturähnliche Epitope enthält; im schlimmsten Fall erkennt der Antikörper überhaupt nicht das
gesuchte Antigen (hierzu kann es verschiedene Gründe geben), sondern nur ein fremdes.
Letzteres kann auch bei einem monoklonalen Antiserum passieren, bei einem polyklonalen
Antiserum können natürlich auch beide Fälle gleichzeitig vorkommen.
Kreuzreaktivität des primären Antiserums ist die größte Hürde bei der korrekten Interpretation immuncytochemischer Färbungen. In Kontrollexperimenten werden häufig primäre
Antiseren mit Proben des spezifischen Antigen versetzt, das dann an die variablen Regionen des Antikörpers bindet (blocken des primären Antikörpers). Dieses geblockte Serum,
dessen Antikörper eigentlich nicht mehr an das Antigen binden sollten, da ja die Bindungsstellen besetzt sind, wird dann wie normales primäres Antiserum in der Immuncytochemie
eingesetzt. Ist danach immer noch eine Färbung möglich (bei polyklonalem Antiserum
kann vielleicht auch nur eine Teilmenge der vorher beobachteten Färbung zu sehen sein),
liegt Kreuzreaktivität vor. Eine zufriedenstellende Interpretation der Versuchsergebnisse ist
dann meist nicht mehr möglich, man kann dann nur noch versuchen auf andere Antiseren
(sofern vorhanden) auszuweichen. Ferner bietet auch dieses beschriebene Kontrollexperiment keine absolute Sicherheit, da Fall 2 der oben beschriebenen Möglichkeiten der Kreuzreaktivität hier auch nicht ausgeschlossen werden kann, selbst wenn nach Blocken keine
Färbung mehr sichtbar sein sollte. Daher sind, vor allem bei wenig charakterisierten Antiseren, meist weitere Experimente nötig, um die Identität der immunmarkierten Substanzen
zu klären. Dazu gehören etwa Immunoblots (Westernblots), ELISA- (enzyme-linked immunosobent assay)-Experimente oder gar biochemische Aufreinigung und Charakterisierung des
Antigens.
Im Kurs werden wir aus Zeitgründen keine Kontrollexperimente durchführen. In der Praxis wird aber keine immuncytochemische Forschungsarbeit akzeptiert, die nicht die notwendigen Kontrollen enthält oder an anderer Stelle nachweist! Auch wenn unsere verwendeten Antisera gut charakterisiert sind, diskutieren Sie bitte diese Problematik in Ihren Protokollen!
18
Konfokale Laserscan-Mikroskopie
Bei der konventionellen Fluoreszenz-Lichtmikroskopie wird ein Präparat großflächig mit
dem Licht einer UV-Lampe beleuchtet und das entstehende Fluoreszenzbild wird über einen Filter mit dem Auge oder mit einer Kamera betrachtet. Demgegenüber setzt die konfokale Mikroskopie eine "punktförmige" Lichtquelle (Laser) ein. Um ein zweidimensionales
Bild zu erstellen, muß eine Scan-Vorrichtung den Lichtpunkt zeilenweise über das Präparat
führen. Die am jeweils beleuchteten Bildpunkt entstehende Fluoreszenz wird über einen
Photomultiplier detektiert und es wird im Computer zeilenweise ein Bild aufgebaut. Die
direkte Betrachtung eines Präparates durch die Okulare des Mikroskops während der Messung ist damit nicht möglich.
Der Vorteil der konfokalen Mikroskopie gegenüber der konventionellen FluoreszenzMikroskopie liegt in der räumlichen Auflösung von Fluoreszenz-Signalen. Bei der Anregung von 3-dimensionalen Präparaten mit Licht kommt es immer auch zu Signalen aus
fluoreszierenden Präparate-Bereichen, die nicht in der Fokus-Ebene des LichtStrahlenganges liegen. Dieses störende Licht kann bei der konfokalen Mikroskopie durch
Einführung einer Blende vor dem Detektionssystem ausgeblendet werden. Die Bilder eines
konfokalen Mikroskops zeigen damit nur Fluoreszenzlicht aus der Fokusebene des Präparates.
A
B
A. Prinzip der konfokalen Mikroskopie
B. Schematischer Aufbau eines konfokalen Mikroskops
Durch die Bewegung des Objekttisches mit einem Schrittmotor können von einem Präparat optische Schnitte in definiertem Abstand erstellt werden. Aus solchen Bildserien läßt
sich dann mit Hilfe eines Computers ein dreidimensionales Bild des Präparates rekonstruieren.
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Praktischer Teil, Rezepte
Allgemein
Dieses Ihnen vom Zoologischen Institut angebotene Praktikum ist finanziell und personell
sehr aufwendig, zudem arbeiten Sie sehr dicht am „Puls der Forschung“ in der Neurobiologie und Chronobiologie der Insekten. Wir bitten Sie daher, in Ihrem und unserem Interesse
• alle Arbeiten mit Sorgfalt und Bedacht auszuführen,
• den Weisungen des betreuenden Personals zu folgen,
• sich Ihre Arbeitsanleitungen und auch die der anderen Gruppen genau durchzulesen und
durchzudenken,
• alle Ihre Arbeitsschritte sorgsam zu protokollieren,
• Fragen zu stellen, wann immer Sie sich über irgend etwas im Unklaren sind,
• Geräte nur nach vorheriger Einweisung zu benutzen,
• Chemikalien, vor allem Antikörperlösungen, sparsam einzusetzen und nicht zu verunreinigen,
• die Sicherheitsbestimmungen im Umgang mit Chemikalien und Geräten zu beachten,
• und, nicht zuletzt, bei allem, was Sie tun, beobachten und interpretieren, Ihren gesunden
Menschenverstand einzusetzen.
Die meisten angegebenen Inkubationszeiten in den Arbeitsanleitungen sind Mindestzeiten,
d.h. sie sollten nicht unterschritten werden, können aber in den meisten Fällen etwas (wenn
auch nicht beliebig) verlängert werden.
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Gruppen A1 und A2, 1. Experiment
Dreifachmarkierung mit anti-Tachykinin, anti-Serotonin und anti-SAP47 im Cerebralganglion der Schabe Leucophaea maderae.
Hintergrund:
Die akzessorische Medulla (AMe) ist ein Neuropil, dessen Funktion in für Neuropile des optischen
Systems ungewöhnlichem Maße auf Modulation durch Neuropeptide beruht (dies hat sie übrigens
mit dem suprachiasmatischen Nukleus, dem circadianen Schrittmacher der Säugetiere, gemein). Bis
jetzt wurden 11 Neuropeptide in der AMe von L. maderae immuncytochemisch gefunden, drei weitere in der AMe der Wanderheuschrecke. Insgesamt kennt man bisher 40–50 Neuropeptide in Insekten; es ist daher sehr wahrscheinlich, daß noch weitere Peptide, wie etwa Tachykinin-verwandte
Peptide (Tachykinin-related peptides, TRPs), in der AMe der Schabe vorkommen.
TRPs bilden die größte Peptid-Familie mit bisher über 40 Mitgliedern, die in unterschiedlichen
Gruppen des Tierreiches, wie auch Insekten, isoliert wurden. Sie kommen dort in geringen Mengen
in nicht-neuronalen Geweben wie Speicheldrüsen vor, hauptsächlich aber in Neuronen des zentralen und peripheren Nervensystems. Durch TRPs, die von peripheren Neuronen im Enddarm von
Schaben freigesetzt werden, wird eine Kontraktion des Darmes herbeigeführt. Die Funktion der
Tachykinine in zentralen Neuronen ist hingegen weitgehend ungeklärt, hängt aber im Einzelfall
sicher von der Funktion der freisetzenden Neurone, deren Effektorneuronen und den Eigenschaften ihrer Tachykinin-Rezeptoren ab. In diesem Experiment werden wir erfahren, ob Tachykinine in
der AMe der Schabe vorkommen; dies wurde bisher noch nicht gezeigt.
Der Neurotransmitter Serotonin wurde in Neuronen der akzessorischen Medulla und damit in der
Inneren Uhr der Schabe bereits nachgewiesen (Petri et al. 1995). Eine Untergruppe von serotoninimmunreaktiven (-ir) Neuronen der AMe sind offensichtlich lokale Interneurone der AMe, eine
andere nimmt Kontakt zu der Lamina auf. In unserem Versuch wird auch mit einem Antikörper
gegen Serotonin gefärbt; dabei sollen die serotonin-ir Neurone mit eventuell gefundenen TRP-ir
Neuronen hinsichtlich Lage und Beschaffenheit miteinander verglichen werden.
In unseren Versuchen zur Färbung bestimmter Neurone wird zusätzlich das gesamte Neuropil
sichtbar gemacht, indem es mit dem monoklonalen Antiserum MAB (mouse antibody) nc46 markiert wird. MAB nc46 bindet an das synapse associated protein of 47 kDa (SAP47), welches in den Synapsen (und damit im Neuropil) verschiedener (vielleicht aller) Insekten vorkommt. Homologe
davon finden sich in allen Tiergruppen. Eine hohe SAP47-Immunreaktivität in einzelnen neuronalen Terminalen läßt auf eine hohe synaptische Aktivität dieser Neurone schließen; dies wollen wir
uns vor allem in den serotonin- und eventuellen TRP-ir Neuronen der AMe ansehen.
Fragen für die Auswertung:
Beschreiben Sie Ihre Färbungen und illustrieren Sie sie mit entsprechenden Abbildungen, wobei
besonders auf folgende Fragen eingegangen werden soll: In welchen Neuropilen des Gehirns sind
TRP- u. Serotonin-ir Fasern zu finden? Wo liegen die dazugehörigen Somata? Wie sehen TRP-ir u.
serotonin-ir Terminalen aus, was läßt sich daraus funktionell ableiten? War TRP-ir in Neuronen der
AMe zu finden? Wenn ja, wie viele Somata und wo liegen sie? Wie sehen TRP-ir Verzweigungen in
der AMe aus? Gibt es Kolokalisation von TRP- u. Serotonin-Immunreaktivität in Neuronen der
AMe oder anderen Neuronen des Protocerebrums? Gibt es auffallend viel oder wenig SAP47-ir in
TRP- u. serotonin-ir Terminalen und was läßt sich daraus funktionell ableiten? Diskutieren Sie auch
die möglichen Fallstricke bei der Beurteilung von Kolokalisationen.
Methode:
Anfertigung von 50 µm-Schnitten des Cerebralganglions der Schabe, Markierung mit antiTachykinin (a-Lem-TRP1, polyklonales Antiserum aus Kaninchen), anti-Serotonin (polyklonales
Antiserum aus Ziegen) und anti-SAP47 (monoklonales Antiserum aus Mäusen). Detektion der primären Antikörper mit donkey anti-rabbit Cy2 (für Tachykinin), donkey anti-goat Cy5 (für Serotonin)
und donkey anti-mouse Cy3 (für SAP47).
21
Vorgehen:
1. Präparation des Cerebralganglions
2. Fixierung in Zambonis Lösung (4 % Paraformaldehyd + 0,2 % Pikrinsäure in Phosphatpuffer 0,1 M, pH 7,4 [PB])
2–3h
3. 3x spülen in PB
2x kurz,
1x ca. 10 min
4. Einbettung in Gelatine/Albumin
5. Nachfixierung in 4 % Paraformaldehyd in PB 0,1 M, pH 7,4
über Nacht
6. Schneiden mit dem Vibratom (50 µm), Schnitte in Well-Platten
mit PB, 2 Wells pro Hirn
7. 3x spülen mit PB
je ca. 10 min
8. Präinkubation: 5 % Normales Eselserum (normal donkey serum, NDS) in
saline-substituted tris buffer (SST) 0,1 M, pH 7,4 mit 0,5 % Triton X-100
(TrX)
1h
9. 1. + 2. + 3. primäres Antiserum: a-Tachykinin (LemTRP1, Kaninchen)
1:1.000, a-Serotonin (Ziege) 1:500, a-SAP47 (Maus) 1:50 in SST mit
TrX 0,5 % + 1 % NDS
über Nacht
10. 3x spülen in SST mit 0,1 % TrX
je ca. 10 min
11. 1. + 2. + 3. sekundäres Antiserum: Donkey anti-rabbit Cy2 1:300 + donkey
anti-goat Cy5 in 1:300 + donkey anti-mouse Cy3 1:300 in SST mit TrX 0,5
% + 1 % NDS
1h
12. 3x spülen mit PB
je ca. 10 min
13. Inkubation mit Glycerin/PB 1:1
30 min
14. Schnitte in frischem Glycerin/PB 1:1 auf Objektträger der Reihe nach
anordnen, Deckglas
15. Auswertung mit Fluoreszenzmikroskop und KLSM
(Literatur: Homberg et al. 2003; Petri et al. 1995; Nässel and Winther 2002; Reischig and Stengl
2003)
22
Gruppe A1 und A2, 2. Experiment
Backfill mit Neurobiotin ausgehend vom Stumpf eines abgetrennten optischen Lobus der
Schabe Leucophaea maderae; Gegenfärbung mit anti-PDF und anti-Synapsin.
Hintergrund:
In beiden optischen Loben der Schabe ist je ein zentraler circadianer Schrittmacher lokalisiert, den
wir inzwischen auf Neurone der akzessorischen Medulla (AMe) begrenzen können, wobei die AMe
selbst offenbar als Integrationszentrum für Zeitinformation fungiert. Beide Schrittmacher müssen
sich natürlich gegenseitig synchronisieren, um zusammen ein einheitliches circadianes Ausgangssignal zu produzieren. Es ist seit längerem bekannt, daß diese Synchronisation über direkte neuronale
Bahnen zwischen den optischen Loben verläuft. Aufgrund kommissuraler (über die Mittellinie des
Gehirns ziehende) Verzweigungen wurden die PDF-Neurone der Insekten seit ihrer Entdeckung
1991 nicht nur als circadiane Schrittmacher- und Ausgangsneurone, sondern auch als Synchronisationsneurone diskutiert. Allerdings war nicht wirklich klar, ob kommissurale PDF-Neurone auch
wirklich die kontralaterale (der Seite des Somas gegenüberliegende) AMe erreichen. Dies konnte
erst später mit Injektionen eines neuronalen Tracers (Dextran konjugiert mit einem Fluoreszenzfarbstoff) und anschließender anti-PDF-Färbung gezeigt werden (Reischig et al. 2004).
Bei diesen Experimenten wurden maximal drei PDF-Neurone gefunden, die die kontralaterale AMe
erreichen. Ein viertes kontralateral projizierendes Neuron aus der Gruppe, der die PDF-Neurone
angehören (peptidergic protocerebral projection neurons of the optic lobe, PPPNs) war nicht PDFir, ebenso wie zwei andere kontralateral projizierende Neuronengruppen der AMe. Zwischenzeitlich
wurde aber auch herausgefunden, daß einige kontralateral projizierende Neurone aus der Gruppe
der PPPNs sich auch mit Antiseren gegen FMRFamid und Orcokinin anfärben lassen. Hierbei stellen sich folgende Fragen: Enthält das vierte kontralateral projizierende PPPN FMRFamid und/oder
Orcokinin? Kolokalisieren FMRFamid und/oder Orcokinin in einigen der kontralateral projizierenden PDF-Neurone? Gibt es vielleicht sogar noch mehr kontralateral projizierende PDFNeurone oder andere aus der Gruppe der großen peptidergen Projektionsneurone, als mit den Dextran-Injektionen gefunden wurden? Es stellte sich in letzter Zeit heraus, daß Neurobiotin als neuronaler Tracer bei der Schabe besser funktioniert als Dextran. Kann Neurobiotin auch bei der Identifikation kontralateraler AMe-Neurone angewendet werden? Könnten mit Neurobiotin vielleicht
mehr kontralateral projizierende Neurone gefunden werden? Die Klärung dieser Fragen könnte viel
zur Analyse des circadianen Synchronisationsweges der Schabe beitragen.
In diesen Versuchen wird zusätzlich das gesamte Neuropil sichtbar gemacht, indem es mit dem
monoklonalen Antiserum MAB (mouse antibody) 3C11 markiert wird. MAB 3C11 bindet an das
das Protein Synapsin, welches in den Synapsen (und damit im Neuropil) der Insekten und anderer
Tiere vorkommt. Eine hohe Synapsin-Immunreaktivität in einzelnen neuronalen Terminalen läßt
auf eine hohe synaptische Aktivität dieser Neurone schließen.
Fragen für die Auswertung:
Beschreiben Sie Ihre Färbungen und illustrieren Sie sie mit entsprechenden Abbildungen, wobei
besonders auf folgende Fragen eingegangen werden soll: Wie viele Gruppen kontralateral projizierender Neuronengruppen der AMe können Sie unterscheiden und wie viele Somata enthalten sie?
Wie verzweigen diese Neuronen in der AMe, wie sehen die Terminalen aus? Gibt es auffallend viel
oder wenig Synapsin-Immunreaktivität in Terminalen kontralateraler PDF-ir Neurone der AMe
und zentralen PDF-ir Neuronen, und was läßt sich daraus funktionell ableiten?
Methode:
Der neuronale Tracer Neurobiotin wird mittels einer Saugpipette auf den Stumpf eines abgeschnittenen optischen Lobus appliziert. Dort kann es über Nacht einwirken. Darauf erfolgt die immuncytochemische Färbung von 50 µm-Schnitten des Cerebralganglions mit anti-PDF (aus Kaninchen)
und anti-Synapsin (monoklonal, aus Mäusen), welche mit goat anti-rabbit Cy5 und goat anti-mouse Cy3
detektiert werden. Neurobiotin wird mit FITC-gekoppeltem Streptavidin detektiert.
23
Vorgehen:
1. Backfill mit 5 % Neurobiotin in Phosphatpuffer 0,1 M, pH 7,4 (PB)
über Nacht
2. Präparation des Cerebralganglions
3. Fixierung in Zambonis Lösung (4 % Paraformaldehyd + 0,2 % Pikrinsäure in PB)
2–3h
4. 3x spülen in PB
2x kurz,
1x ca. 10 min
5. Einbettung in Gelatine/Albumin
6. Nachfixierung in 4 % Paraformaldehyd in PB
über Nacht
7. Schneiden mit dem Vibratom (50 µm), Schnitte in Well-Platten
mit PB, 2 Wells pro Hirn
8. 3x spülen mit PB
je ca. 10 min
9. Präinkubation: 5 % Normal goat serum (NGS) in saline-substituted
tris buffer (SST) 0,1 M, pH 7,4 mit 0,5 % Triton X-100 (TrX)
1h
10. 1. + 2. primäres Antiserum: a-ß-PDF 1:15.000 + a-Synapsin 1:10 in SST
mit TrX 0,5 % + 1 % NGS
über Nacht
11. 3x spülen in SST mit 0,1 % TrX
je ca. 10 min
12. 1. + 2. sekundäres Antiserum, Streptavidin: Goat anti rabbit Alexa 633
1:300, goat anti-mouse Cy3 1:300, Streptavidin-FITC 1:100 in SST mit TrX
0,5 % + 1 % NGS
1h
13. 3x spülen in PB
je ca. 10 min
14. Inkubation mit Glycerin/PB 1:1
30 min
15. Schnitte in frischem Glycerin/PB 1:1 auf Objektträger anordnen,
Deckglas
16. Auswertung mit Fluoreszenzmikroskop und KLSM
(Literatur: Leitinger et al. 2004; Homberg et al. 2003; Reischig et al. 2004)
24
Gruppen B1 und B2, 1. Experiment
Backfill mit Neurobiotin ausgehend vom Stumpf eines abgetrennten optischen Lobus der
Schabe Leucophaea maderae; Gegenfärbung mit anti-PDF und anti-Bruchpilot.
Hintergrund:
In beiden optischen Loben der Schabe ist je ein zentraler circadianer Schrittmacher lokalisiert, den
wir inzwischen auf Neurone der akzessorischen Medulla (AMe) begrenzen können, wobei die AMe
selbst offenbar als Integrationszentrum für Zeitinformation fungiert. Beide Schrittmacher müssen
sich natürlich gegenseitig synchronisieren, um zusammen ein einheitliches circadianes Ausgangssignal zu produzieren. Es ist seit längerem bekannt, daß diese Synchronisation über direkte neuronale
Bahnen zwischen den optischen Loben verläuft. Aufgrund kommissuraler (über die Mittellinie des
Gehirns ziehende) Verzweigungen wurden die PDF-Neurone der Insekten seit ihrer Entdeckung
1991 nicht nur als circadiane Schrittmacher- und Ausgangsneurone, sondern auch als Synchronisationsneurone diskutiert. Allerdings war nicht wirklich klar, ob kommissurale PDF-Neurone auch
wirklich die kontralaterale (der Seite des Somas gegenüberliegende) AMe erreichen. Dies konnte
erst später mit Injektionen eines neuronalen Tracers (Dextran konjugiert mit einem Fluoreszenzfarbstoff) und anschließender anti-PDF-Färbung gezeigt werden (Reischig et al. 2004).
Bei diesen Experimenten wurden maximal drei PDF-Neurone gefunden, die die kontralaterale AMe
erreichen. Ein viertes kontralateral projizierendes Neuron aus der Gruppe, der die PDF-Neurone
angehören (peptidergic protocerebral projection neurons of the optic lobe, PPPNs) war nicht PDFir, ebenso wie zwei andere kontralateral projizierende Neuronengruppen der AMe. Zwischenzeitlich
wurde aber auch herausgefunden, daß einige kontralateral projizierende Neurone aus der Gruppe
der PPPNs sich auch mit Antiseren gegen FMRFamid und Orcokinin anfärben lassen. Hierbei stellen sich folgende Fragen: Enthält das vierte kontralateral projizierende PPPN FMRFamid und/oder
Orcokinin? Kolokalisieren FMRFamid und/oder Orcokinin in einigen der kontralateral projizierenden PDF-Neurone? Gibt es vielleicht sogar noch mehr kontralateral projizierende PDFNeurone oder andere aus der Gruppe der großen peptidergen Projektionsneurone, als mit den Dextran-Injektionen gefunden wurden? Es stellte sich in letzter Zeit heraus, daß Neurobiotin als neuronaler Tracer bei der Schabe besser funktioniert als Dextran. Kann Neurobiotin auch bei der Identifikation kontralateraler AMe-Neurone angewendet werden? Könnten mit Neurobiotin vielleicht
mehr kontralateral projizierende Neurone gefunden werden? Die Klärung dieser Fragen könnte viel
zur Analyse des circadianen Synchronisationsweges der Schabe beitragen.
In diesen Versuchen wird zusätzlich das gesamte Neuropil sichtbar gemacht, indem es mit dem
monoklonalen Antiserum MAB (mouse antibody) nc82 markiert wird. MAB nc82 bindet an das
Protein Bruchpilot, welches in den Synapsen (und damit im Neuropil) der Insekten vorkommt. Eine hohe Bruchpilot-Immunreaktivität in einzelnen neuronalen Terminalen läßt auf eine hohe synaptische Aktivität dieser Neurone schließen.
Fragen für die Auswertung:
Beschreiben Sie Ihre Färbungen und illustrieren Sie sie mit entsprechenden Abbildungen, wobei
besonders auf folgende Fragen eingegangen werden soll: Wie viele Gruppen kontralateral projizierender Neuronengruppen der AMe können Sie unterscheiden und wie viele Somata enthalten sie?
Wie verzweigen diese Neuronen in der AMe, wie sehen die Terminalen aus? Gibt es auffallend viel
oder wenig Bruchpilot-Immunreaktivität in Terminalen kontralateraler PDF-ir Neurone der AMe
und zentralen PDF-ir Neuronen, und was läßt sich daraus funktionell ableiten?
Methode:
Der neuronale Tracer Neurobiotin wird mittels einer Saugpipette auf den Stumpf eines abgeschnittenen optischen Lobus appliziert. Dort kann es über Nacht einwirken. Darauf erfolgt die immuncytochemische Färbung von 50 µm-Schnitten des Cerebralganglions mit anti-PDF (aus Kaninchen)
und anti-Bruchpilot (monoklonal, aus Mäusen), welche mit goat anti-rabbit Cy5 und goat anti-mouse
Cy3 detektiert werden. Neurobiotin wird mit FITC-gekoppeltem Streptavidin detektiert.
25
Vorgehen:
1. Backfill mit 5 % Neurobiotin in Phosphatpuffer 0,1 M, pH 7,4 (PB)
über Nacht
2. Präparation des Cerebralganglions
3. Fixierung in Zambonis Lösung (4 % Paraformaldehyd + 0,2 % Pikrinsäure in PB)
2–3h
4. 3x spülen in PB
2x kurz,
1x ca. 10 min
5. Einbettung in Gelatine/Albumin
6. Nachfixierung in 4 % Paraformaldehyd in PB 0,1 M, pH 7,4
über Nacht
7. Schneiden mit dem Vibratom (50 µm), Schnitte in Well-Platten
mit PB, 2 Wells pro Hirn
8. 3x spülen mit PB
je ca. 10 min
9. Präinkubation: 5 % Normal goat serum (NGS) in saline-substituted
tris buffer (SST) 0,1 M, pH 7,4 mit 0,5 % Triton X-100 (TrX)
1h
10. 1. + 2. primäres Antiserum: a-ß-PDF 1:15.000 + a-Bruchpilot 1:10
in SST mit TrX 0,5 % + 1 % NGS
über Nacht
11. 3x spülen in SST mit 0,1 % TrX
je ca. 10 min
12. 1. + 2. sekundäres Antiserum, Streptavidin: Goat anti rabbit Alexa 633
1:300, goat anti-mouse Cy3 1:300, Streptavidin-FITC 1:100 in SST mit TrX
0,5 % + 1 % NGS
1h
13. 3x spülen in PB
je ca. 10 min
14. Inkubation mit Glycerin/PB 1:1
30 min
15. Schnitte in frischem Glycerin/PB 1:1 auf Objektträger anordnen,
Deckglas
16. Auswertung mit Fluoreszenzmikroskop und KLSM
(Literatur: Homberg et al. 2003; Reischig et al. 2004; Wagh et al. 2006)
26
Gruppen B1 und B2, 2. Experiment
Dreifachmarkierung mit anti-Allatotropin, anti-Serotonin und anti-PDF im Cerebralganglion der Schabe Leucophaea maderae.
Hintergrund:
Die akzessorische Medulla (AMe) ist ein Neuropil, dessen Funktion in für Neuropile des optischen
Systems ungewöhnlichem Maße auf der Modulation durch Neuropeptide beruht. Unter diesen Peptiden befinden sich auch PDF und Allatotropin. Allatotropin war ursprünglich bekannt als Hormon, das von den Corpora allata der Insekten freigesetzt wird und eine wichtige Rolle in der Regulation der Häutung spielt. Es kommt aber auch als neuroaktives Peptid in zentralen Neuronen vor,
unter anderem auch in Neuronen der AMe. Physiologische Experimente deuten stark auf eine
Funktion allatotropin-immunreaktiver (-ir) Neurone im Lichtsynchronisationsweg des circadianen
Schrittmachers der Schabe hin (Petri et al. 2002). Eine Untergruppe der allatotropin-ir Neurone der
AMe besteht offenbar aus lokalen Interneuronen, die dicht im Kern-Neuropil der AMe verzweigen.
Womöglich vermitteln sie zwischen Neuronen, die Lichtinformation in die AMe bringen, und den
eigentlichen Schrittmacherneuronen (wahrscheinlich die PDF-Neurone).
Der Neurotransmitter Serotonin wurde in Neuronen der akzessorischen Medulla und damit in der
Inneren Uhr der Schabe bereits nachgewiesen (Petri et al. 1995). Eine Untergruppe von serotonin-ir
Neuronen der AMe sind, wie auch eine Untergruppe der allatotropin-ir Neurone, wahrscheinlich
lokale Interneurone der AMe und gehören zu denselben morphologischen Gruppen (distale u. mediale Gruppe frontoventraler Neurone der AMe, DFVNe u. MFVNe; Reischig und Stengl 2003).
Dies legt den Verdacht nahe, daß allatotropin-ir DFVNe u. MFVNe vielleicht (zumindest teilweise)
mit serotonin-ir DFVNe identisch sind. In diesem Fall müßten wir in unserem Färbeexperiment
Kolokalisation von Allatotropin- u. Serotonin-Immunreaktivität in einzelnen Neuronen finden.
Sie haben PDF-ir Neurone schon im vorherigen Versuch gefärbt. In diesem Versuch bekommen
Sie ein anderes Antiserum gegen PDF, welches aus Mäusen gewonnen wurde. Es wurde bisher bei
der Schabe Periplaneta americana erfolgreich getestet, nicht aber bei L. maderae. Da die meisten Peptid-Antiseren aus Kaninchen stammen, wäre das PDF-Antiserum aus Mäusen ein ideales Werkzeug,
um Kolokalisation weiterer neuroaktiver Substanzen in PDF-Neuronen nachzuweisen. Vielleicht
gibt es bei diesem Versuch noch eine weitere Überraschung: Petri et al. 1995 hatten keine Kolokalisation von PDF-Immunreaktivität mit Serotonin- oder Allatotropin-Immunreaktivität gefunden.
Bei der damals angewandten Methode wurde aber eine Unterpopulation von 3-6 schwach färbenden, kleinen PDF-Neuronen nicht gefärbt, die ebenfalls zur Gruppe der DFVNe gehören.
Fragen für die Auswertung:
Beschreiben Sie Ihre Färbungen und illustrieren Sie sie mit entsprechenden Abbildungen, wobei
besonders auf folgende Fragen eingegangen werden soll: In welchen Neuropilen des Gehirns sind
allatotropin- u. serotonin-ir Fasern zu finden? Wo liegen die dazugehörigen Somata? Wie sehen
allatotropin-ir u. serotonin-ir Terminalen aus, was läßt sich daraus funktionell ableiten? Wie viele
allatotropin-ir u. serotonin-ir Somata gibt es bei der AMe und welche Untergruppen lassen sich unterscheiden? Wie sehen allatotropin-ir u. serotonin-ir Verzweigungen in der AMe aus? Gibt es Kolokalisation von Allatotropin- u. Serotonin-Immunreaktivität in Neuronen der AMe oder anderen
Neuronen des Protocerebrums? Wie sieht anti-PDF-Färbung aus im Vergleich zum vorherigen Experiment? Gibt es Kolokalisation von PDF-Immunreaktivität mit Allatotropin- und/oder Serotonin-Immunreaktivität? Diskutieren Sie auch die möglichen Fallstricke bei der Beurteilung von Kolokalisationen.
Methode:
Anfertigung von 50 µm-Schnitten des Cerebralganglions der Schabe, Markierung mit antiAllatotropin (polyklonales Antiserum aus Kaninchen), anti-Serotonin (polyklonales Antiserum aus
Ziegen) und anti-PDF (monoklonales Antiserum aus Mäusen). Detektion der primären Antikörper
mit donkey anti-rabbit Cy2 (Allatotropin), donkey anti-goat Cy5 (Serotonin) und donkey anti-mouse Cy3
(PDF).
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Vorgehen:
1. Präparation des Cerebralganglions
2. Fixierung in Zambonis Lösung (4 % Paraformaldehyd + 0,2 % Pikrinsäure in Phosphatpuffer 0,1 M, pH 7,4 [PB])
2–3h
3. 3x spülen in PB
2x kurz,
1x ca. 10 min
4. Einbettung in Gelatine/Albumin
5. Nachfixierung in 4 % Paraformaldehyd in PB 0,1 M, pH 7,4
über Nacht
6. Schneiden mit dem Vibratom (50 µm), Schnitte in Well-Platten
mit PB, 2 Wells pro Hirn
7. 3x spülen mit PB
je ca. 10 min
8. Präinkubation: 5 % Normal donkey serum (NDS) in saline-substituted tris
buffer (SST) 0,1 M, pH 7,4 mit 0,5 % Triton X-100 (TrX)
1h
9. 1. + 2. + 3. primäres Antiserum: a-Allatotropin 1:1.000, a-Serotonin
1:500 und a-PDF (Maus) 1:5 in SST mit TrX 0,5 % + 1 % NDS
über Nacht
10. 3x spülen in SST mit 0,1 % TrX
je ca. 10 min
11. 1. + 2. + 3. sekundäres Antiserum: Donkey anti-rabbit Cy2 1:300 + donkey
anti-goat Cy5 1:300 + donkey anti-mouse Cy3 in SST mit TrX 0,5 % + 1 %
NDS
1h
12. 3x spülen mit PB
je ca. 10 min
13. Inkubation mit Glycerin/PB 1:1
30 min
14. Schnitte in frischem Glycerin/PB 1:1 auf Objektträger der Reihe nach
anordnen, Deckglas
15. Auswertung mit Fluoreszenzmikroskop und KLSM
(Literatur: Homberg et al. 2003; Petri et al. 1995; Petri et al. 2002; Reischig and Stengl 2003)
28
Literatur
Homberg U (2004) In search of the sky compass in the insect brain. Naturwissenschaften 91:199-208
Homberg U, Reischig T, Stengl M (2003) Neural organization of the circadian system of the cockroach Leucophaea maderae. Chronobiol Int 20:577-591
Leitinger G, Pabst MA, Rind FC, Simmons PJ (2004) Differential expression of synapsin in visual neurons of
the locust Schistocerca gregaria. J Comp Neurol 480:89-100
Nässel DR, Winther AM (2002) Neuronal co-localization of different isoforms of tachykinin-related peptides
(LemTRPs) in the cockroach brain. Cell Tissue Res 308:225-239
Petri B, Homberg U, Loesel R, Stengl M (2002) Evidence for a role of GABA and Mas-allatotropin in photic
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Petri B, Stengl M, Würden S, Homberg U (1995) Immunocytochemical characterization of the accessory medulla in the cockroach Leucophaea maderae. Cell Tissue Res 282:3-19
Reischig T, Petri B, Stengl M (2004) Pigment-dispersing hormone (PDH)-immunoreactive neurons form a
direct coupling pathway between the bilaterally symmetric circadian pacemakers of the cockroach Leucophaea
maderae. Cell Tissue Res 318:553-564
Reischig T, Stengl M (2003) Ultrastructure of pigment-dispersing hormone-immunoreactive neurons in a
three-dimensional model of the accessory medulla of the cockroach (Leucophaea maderae). Cell Tissue Res
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Strausfeld NJ, Hansen L, Li YS, Gomez RS, Ito K (1998) Evolution, discovery, and interpretations of arthropod mushroom bodies. Learning & Memory 5:11-37
Wagh DA, Rasse TM, Asan E, Hofbauer A, Schwenkert I, Durrbeck H, Buchner S, Dabauvalle MC, Schmidt
M, Qin G, Wichmann C, Kittel R, Sigrist SJ, Buchner E (2006) Bruchpilot, a protein with homology to
ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron
49:833-844
29
Anhang
Rezepturen verwendeter Lösungen:
30