ATP-TCA

Aus der
Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte,
Handchirurgiezentrum
der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil - Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. Hans-Ulrich Steinau
Prätherapeutische Zytostatikatestung mittels ATPTumorchemosensitivitätsassay (ATP-TCA) bei Weichgewebssarkomen
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Daniel Stephan James Brett
aus Bochum
2005
Dekan:
Prof. Dr. med. Gert Muhr
Referent:
Prof. Dr. med. Hans-Ulrich Steinau
Korreferent: PD Dr. med. Holger Sudhoff
Tag der mündlichen Prüfung:
07. Februar 2006
2
Inhaltsverzeichnis
Verwendete Abkürzungen
5
1. Einleitung
7
1.1. Einführung
7
1.2. Entwicklung der prätherapeutischen Zytostatikatestung
8
1.3. Entscheidung für den ATP-TCA
9
2. Fragestellung der Arbeit
12
3. Material und Methoden
13
3.1. Tumormaterial
13
3.2. Patientenkollektiv
13
3.3. Probengewinnung
14
3.4. Der Adenosintriphosphat-Tumorchemosensitivitätsassay (ATP-TCA) 15
3.4.1. Prinzip des ATP-TCA
15
3.4.2. Inhalt des Testbestecks
16
3.4.3. Vorbereitung der Proben
17
3.4.4. Vorbereitung der Zytostatika
17
3.4.5. Verteilung der Tumorzellen auf die Platten
19
3.4.6. Extraktion und Messung
19
3.4.7. ATP-Standardkurve
19
3.4.8. Auswertung
20
3.4.9. Interpretation der Testergebnisse
22
3.5. Verwendete Zytostatika
22
3.6. Statistik
24
4. Ergebnisse
25
4.1. Testsystem des ATP-TCA
25
4.1.1. Auswertbarkeit des ATP-TCA
25
3
4.1.2. Testversager
25
4.1.3. Dosisantwortkurven
26
4.2. Monosubstanzen
27
4.3. Zytostatikakombinationen
30
4.4. Octenidin-Hydrochlorid (Octenisept®)
32
4.5. Chemosensitivität unterschiedlicher Subentitäten von
Weichteilsarkomen
32
4.6. Chemosensitivität von Weichteilsarkomen unterschiedlichen
Differenzierungsgrades
35
4.7. Unterschiede in der Chemosensitivität von Primärtumoren und
Tumorrezidiven
36
4.8. Individualität der Ergebnisse des ATP-TCA
38
5. Diskussion
42
5.1. Epidemiologie, Ätiologie, Risikofaktoren und Pathomorphologie
Von Weichteilsarkomen
42
5.2. Stadieneinteilung von Weichteilsarkomen
43
5.3. Prognose von Weichteilsarkomen
45
5.4. Therapie von Weichteilsarkomen
45
5.5. Chemotherapie bei Weichteilsarkomen
46
5.6. Neue Strategien in der Behandlung von Weichteilsarkomen
48
5.7. Stellenwert des ATP-TCA in der Chemosensitivitätstestung bei
Weichteilsarkomen
49
5.8. Chemotherapie und Überlebensrate
51
5.9. Monosubstanzen und Kombinationspräparate
51
5.10. Einfluss von Staging und Grading
53
5.11. Einfluss des ATP-TCA auf zukünftige Studien
54
6. Zusammenfassung
56
7. Literaturverzeichnis
59
8. Lebenslauf
72
4
Verwendete Abkürzungen
ADP
Adenosindiphosphat
AMP
Adenosinmonophosphat
ATP
Adenosintriphosphat
AJCC
American Joint Committee on Cancer
AUIC
Area Under Inhibition Curve
bzw.
beziehungsweise
CAM
Complete Assay Medium
CYVADIC
Zytostatikakombination (Cyclophosphamid, Vincristin,
Doxorubicin, Dacarbazin)
IC
Inhibitory Concentration
i.v.
intravenös
G
Grading
Gy
Gray
h
Stunde
lg
logarithmisch
M0
Kontrolle ohne Zytostatikazusatz
MI
Maximum Inhibitor
mg
Milligramm
ml
Milliliter
MPNST
Maligner Peripherer Nervenscheidentumor
µg
Mikrogramm
ng
Nanogramm
NOS
not otherwise specified
p
p-Wert
PPC
Plasma Peak Concentration
RLU
Relative Light Units
SI
Sensitivitätsindex
TCA
Tumor Chemosensitivity Assay
TDC
Test Drug Concentration
TGI
Tumor Growth Inhibition
pTNM
postoperative Tumorklassifikation (T=Primärtumor, N=Lymphknoten, M=Fernmetastasierung)
5
U
Unit
ÜF
Überlebensfraktion
UICC
Union Internationale Conter le Cancer
VAC
Zytostatikakombination (Vincristin, Actinomycin D,
Cyclophosphamid)
vs.
versus
6
1. Einleitung
1.1. Einführung
Seit vielen Jahren ist die Sensitivitäts- und Resistenzbestimmung von
Mikroorganismen in der Therapie von Infektionskrankheiten verwirklicht
(Bronzwaer
et
al.,
2004).
Eine
individuelle,
patientenbezogene
Chemotherapie bei Tumorerkrankungen konnte sich bis heute nicht
etablieren. Obwohl geeignete Testverfahren mittlerweile zur Verfügung
stehen, hat sich die prätherapeutische Zytostatikatestung im klinischen Alltag
bisher nicht durchsetzen können und bleibt auf Studien bzw. wenige
Entitäten, wie das rezidivierende Mammakarzinom, beschränkt (Norton et al.,
1999). Mit ca. 1-2% Anteil an allen malignen Neoplasien, einer Inzidenz von
2-6 auf 100.000 Einwohner (2.500-3.000 Neuerkrankungen/Jahr in der BRD)
und einem Auftreten von bundesweit ca. 600 Lokalrezidiven jährlich stellen
Weichgewebssarkome eine seltene Tumorerkrankung dar, die darüber
hinaus eine große Heterogenität, sowohl in Bezug auf ihre Morphologie, als
auch im Hinblick auf ihr biologisches Verhalten zeigt (Singer et al., 2000). Es
existieren zahlreiche Entitäten von Weichgewebssarkomen, die sich
ihrerseits in verschiedene Subtypen unterteilen. Die Gesamtzahl beläuft sich
auf über 50 (Enzinger et al., 2001). Die onkologisch adäquate Resektion weit
im
Gesunden
(R0-Resektion)
stellt
die
wichtigste
Maßnahme
im
multidisziplinären Behandlungskonzept der Weichteilsarkome dar (Enzinger
& Weiss, 2001). Während noch vor zwei Jahrzehnten hauptsächlich die
Amputation der betroffenen Extremität im Vordergrund der Therapie stand,
ergaben nachfolgend durchgeführte, extremitätenerhaltende Kompartmentund Kompartimentresektionen identische Überlebensraten (Colucci 1998;
Singer et al., 1995; Steinau et al., 1985; Steinau et al., 1988a; Steinau et al.,
2001; Valle & Kraybill, 1996). Neoadjuvante und adjuvante Chemotherapien
zeigen bei Weichteilsarkomen durchschnittliche Ansprechraten nicht über 1520% und werden deshalb standardisiert im Erwachsenenalter nicht
eingesetzt (Clarkson & Ferguson, 2004; Cormier et al., 2004c; Reichardt
2002a). In der mehr als 50 Subtypen umfassenden Gruppe der
7
Weichteilsarkome gehört eine solche Testung bisher nicht zum Standard
(Chao et al., 2002). Dies liegt neben der Seltenheit dieser Tumoren vor allem
an den relativ schlechten Ansprechraten auf verschiedenste Zytostatika
(Bramwell et al., 2003; Fahn et al., 2004). Die Zytostatikatherapie wird bei
primär inoperablen Weichteilsarkomen und vor allem bei fortgeschrittenen
Tumorstadien eingesetzt und kann hier die rezidivfreie Zeit nach operativer
Tumorresektion verlängern und die Lebensqualität verbessern (Frustaci et
al., 2001). Eine Lebensverlängerung wird durch die Chemotherapie nicht
erreicht.
Trotz der ausgesprochenen Heterogenität der Wechteilsarkome
werden bezüglich der systemischen Therapien kaum Unterschiede zwischen
den
einzelnen
Subentitäten
gemacht.
Mit
dem
ATP-
Tumorchemosensitivitätsassay steht ein Testsystem zur Verfügung, dessen
Ergebnisse sich in Studien an anderen soliden Tumoren, insbesondere bei
Mamma- und Ovarialkarzinomen, bereits bewährt haben und sich als
reproduzierbar und valide zeigten (Andreotti et al., 1995). Es basiert auf dem
Nachweis von ATP, dem primären Energielieferanten der Zelle. Die
Chemosensitivität wird mittels eines Lumineszenzmessgerätes quantifiziert,
welches das proportional zum ATP-Gehalt der Zelle emittierte Licht misst.
1.2. Entwicklung der prätherapeutischen Zytostatikatestung
Der Gedanke, verschiedene antineoplastische Substanzen vor ihrem
klinischen Einsatz in ihrer Wirksamkeit zu überprüfen, ist nicht neu. In der
Vergangenheit wurde eine Reihe von Testsystemen entwickelt, die zu
diesem Zweck eingesetzt wurden.
In vitro Assays:
HTCA:
Human Tumor Clonogenic Assay (Hamburger et al., 1977)
Vorteile: Gut untersuchter Test mit hoher Aussagekraft für
Resistenz
Nachteile: Relativ geringe Voraussagekraft für Sensibilität,
biologische Aktivität der Stammzellen fraglich, Verfügbarkeitsrate niedrig
DISC:
Differential Staining Cytotoxity Assay (Weisenthal et al., 1991)
8
Vorteile: Hohe Voraussagekraft für Resistenz
Nachteile: Bisher fast nur Daten von hämatologischen
Neoplasien
Kern/Volm: Kern-Assay bzw. Volm-Assay (Kern et al., 1985)
Vorteile: Schnell durchführbar, hohe Voraussagekraft für
Resistenz
Nachteile: Geringe Voraussagekraft für Sensibilität, nur
Bestimmung von proliferierenden Zellen (S-Phase)
CAM:
Cell-adhesive Matrix, Life Trac (Baker et al., 1986)
Vorteile: Einfaches Monolayersystem
Nachteile: Wachstum nicht neoplastischer Zellen ungenügend
unterdrückt
FCA:
Fluorescent Cytoprint Assay (Rotman et al., 1988)
Vorteile: “Microorgans” erhalten Tumorintegrität
Nachteile: Art der Zellzerstörung nicht vorhersehbar, keine
Kontrollproben
ATP-CVA/
Adenosin Triphosphate Cell Viability Assay (Sevin et al., 1988)
1.3. Entscheidung für den ATP-TCA
Die Methode basiert auf der Messung des intrazellulären ATP, welches mit
Hilfe einer Lumineszenzreaktion bestimmt wird. Das emittierte Licht ist dabei
proportional zum ATP-Gehalt der Zelle. Aus intraoperativ gewonnenem
Tumormaterial wird eine Zellsuspension angefertigt und mit verschiedenen
Zytostatika oder deren Kombinationen inkubiert. Nach sechs Tagen wird das
Zellwachstum über den ATP-Gehalt der Probe ermittelt, mit einer nicht
behandelten Probe verglichen und die Ergebnisse graphisch dargestellt.
Vorteile des Verfahrens sind seine bisher gemessene hohe Sensitivität und
Spezifität von 98% (O’Meara et al., 2001; Sharma et al., 2003). Der ATPTCA ist selektiv für maligne Zellen, da das Wachstum störender Zellen durch
9
die Verwendung von Selektivmedien unterdrückt wird. Auch aufgrund der
hohen Auswertbarkeitsrate von über 90% hat sich das Verfahren als wenig
störanfällige Methode zur Überprüfung der Chemosensitivität von Zelllinien
und nativen Tumoren etablieren können (Hunter et al., 1993, Kurbacher et
al., 1995). Bei verschiedenen Tumorerkrankungen wurde der ATP-TCA
bisher erfolgreich angewendet. Vor allem im Bereich der gynäkologischen
Onkologie lieferte die Methode bereits gute Ergebnisse (Kurbacher et al.,
1996, Untch et al., 1993). Hier wurde der Test zunächst hauptsächlich an
Ovarialkarzinomen eingesetzt und zeigte eine gute Korrelation der in vitro
Ergebnisse
mit
den
klinisch
beobachteten
Ansprechraten.
Neuere
Untersuchungen an Ovarialkarzinomen zeigen eine Auswertbarkeit der
Testansätze in über 90% der Fälle und ein individuelles Ansprechverhalten
der Tumorproben auf die eingesetzten Medikamente (Sharma et al., 2003).
Untersuchungen an nativen Proben von Mammakarzinom-Patientinnen
lieferten ähnlich gute Ergebnisse. Die Arbeitsgruppe um Kurbacher und
Untch konnte die Methode erfolgreich zur Chemosensitivitätstestung und
Entwicklung neuer innovativer Zytostatikaregimes in der Behandlung vor
allem des metastasierten Mammakarzinoms einsetzen (Kurbacher et al.,
2003; Untch et al., 2003).
Mehrere
Untersuchungen
an
gastrointestinalen
Tumoren
zeigten
Verfügbarkeitsraten des ATP-TCA von 85% - 87% (Kim et al., 2003; Knight
et
al.,
2004).
Es
wurden
Proben
von
Oesophaguskarzinomen,
Magenkarzinomen, Kolonkarzinomen und Rektumkarzinomen untersucht.
Auch hier konnten die Ergebnisse bestätigen, dass die Methode das
Ansprechen von Malignomen auf eine Chemotherapie vorhersagen kann
(Kawamura et al., 1997, Mercer et al., 1997, Whitehouse et al., 2003a,
Whitehouse et al., 2003b).
Mittels ATP-TCA wurden außerdem bisher Maligne Melanome der Haut
getestet (Neuber et al., 1999). Die Therapie dieser Tumore ist aufgrund
schlechter Ansprechraten auf eine systemische Therapie limitiert, die
Überlebenszeiten sind gering (Chung et al., 2004; Neale et al., 2001; Stone
et al., 2004; ). Eine prätherapeutische Zytostatikatestung könnte auch hier zu
einem Therapieerfolg und zu einem längeren tumorfreien Überleben
beitragen.
10
Gegenstand weiterer Studien waren Melanome der Uvea (Myatt et al., 1997)
und der Choroidea (Neale et al., 1999). Die Forschungsgruppe um Myatt
konnte mittels ATP-TCA zeigen, dass eine Kombinationstherapie aus
Gemcitabin oder Arabinosid mit Treosulfan erfolgreich sein könnte, obwohl
diese Tumoren einer Chemotherapie nur bedingt zugänglich sind. Auch die
medikamentöse Therapie der Choroidealmelanome verläuft eher insuffizient
und weist Ansprechraten von nur 1% auf.
Auf der Grundlage der Ergebnisse d i e s e r Studien begründet sich die
vorliegende
Arbeit,
in
der
mittels
ATP-TCA
die
prätherapeutische
Chemosensitivitätstestung von Weichteilsarkomen untersucht wurde. Ziel
dieser Arbeit war eine erste Bewertung der Durchführbarkeit und des
V o r h e r s a g e w e r t e s e i n e r individuellen sensitivitätsadaptierten
prätherapeutische Chemosensitivitätstestung bei Patienten mit malignen
Weichgewebstumoren.
11
2. Fragestellung der Arbeit
Ziel
der
vorliegenden
prätherapeutischen
Studie
ist
es, d i e Durchführbarkeit einer
Chemosensitivitätstestung
an
frischen
Weichgewebssubtypen zu prüfen.
Im einzelnen wurden folgende Studienziele formuliert:
·
Einsatzmöglichkeit/Durchführbarkeit einer Chemosensitivitätstestung
bei
Weichgewebssarkomen
mittels A d e n o s i n t r i p h o s p h a t-
Tumorchemosensitivitätsassay (ATP-TCA)
·
Darstellung der präklinischen Ansprechraten des ATP-TCA bei
bekannten Substanzkombinationen und Monosubstanzen
·
Vergleich unterschiedlicher Tumorsubtypen
·
Vergleich unterschiedlicher Differenzierungsgrade (GII vs. GIII)
·
Vergleich
von
Primärtumoren
vs.
Tumorrezidiven
in
ihrem
Ansprechverhalten auf eine Zytostatikatherapie
·
Einsatz des ATP-TCA als Entscheidungshilfe zur Festlegung einer
individuellen Chemotherapie
12
3. Material und Methoden
3.1. Tumormaterial
Für die Untersuchungen wurden Proben von Patienten verwendet, die im
Zeitraum von August 2 0 0 2 b i s Juni 2004 an der Klinik für Plastische
Chirurgie in Bochum an einem Primär- oder Rezidivweichteilsarkom operiert
wurden. Insgesamt wurden 53 Proben verwendet. 50 Tumorproben lieferten
verwertbare Ergebnisse (94,3%).
Bei 21 Patienten (42%) wurden die Untersuchungen am Primärtumor
durchgeführt,
bei
29
Patienten
(58%)
erfolgte
die
Testung
am
Rezidivgewebe.
Tabelle 1: Charakteristika der mit dem ATP-TCA untersuchten Tumorproben
(n=50)
Tumor
Anzahl
in %
Primärtumor
21
42
Rezidivtumor
29
58
Gesamt
50
100
3.2. Patientenkollektiv
Bei den 50 Weichgewebsarkomen handelte es sich um 17 Liposarkome
(34%), 16 N O S / Maligne Fibröse Histiozytome (32%), 8 Extraskelettale
Chondrosarkome (16%), 5 Rhabdomyosarkome (10%), 4 Maligne periphere
Nervenscheidentumore (8%) (Tab.2).
Das klinische Staging wurde entsprechend den Kriterien des American Joint
Committee on Cancer (AJCC) durchgeführt (Ramanathan et al., 1999). 17
Tumorproben (34%) waren mäßig differenziert (GII), 33 Tumorproben (66%)
waren niedrig differenziert (GIII).
13
GI-Tumoren wurden nicht untersucht, da in der Regel bei solchen Tumoren
keine Chemotherapie durchgeführt wird (Eilber et al., 2004).
Das mittlere Alter der Patienten betrug 65 Jahre (32-76 Jahre).
Keiner der Patienten erhielt eine adjuvante Chemotherapie vor der
Tumorresektion, 15 Patienten mit einem Rezidivtumor unterzogen sich einer
Strahlentherapie nach Entfernung des Primärtumors (51,7%). Diese erfolgte
mit durchschnittlich 60,4Gy (55,5-66,3Gy).
Tabelle 2: Charakteristika der Patienten mit Weichteilsarkomen (n=50)
n
Alter
Primär-
Rezidiv-
tumor
tumor
G2
G3
Liposarkome
17 61 (32-73)
9
8
6
11
NOS-Sarkome/MFH
16 64 (42-69)
7
9
7
9
Extraskelettale
8
65 (62-72)
1
7
2
6
Rhabdomyosarkome
5
68 (64-76)
4
1
1
4
MPNST
4
59 (55-67)
0
4
1
3
Chondrosarkome
3.3. Probengewinnung
Die Probenentnahme erfolgte unter sterilen Bedingungen im Operationssaal
aus dem Randbereich des Tumors. Die etwa 1cm3 großen Proben wurden
unter sterilen Bedingungen in einem Zellkulturmedium (DMEM, Sigma,
Germany) mit Antibiotika (100U/ml Penicillin und 100µg/ml Streptomycin,
Gibco BRL, Germany) bei 4°C ins Labor transportiert und vorbereitet, um die
Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten und eine mikrobielle Kontamination zu
vermeiden.
14
3.4. Der Adenosintriphosphat-Tumorchemosensitivitätsassay (ATP-TCA)
3.4.1. Prinzip des ATP-TCA
Der ATP-TCA beruht auf der Messung des zellulären ATP-Gehaltes und
bestimmt damit indirekt den Energieladungszustand der Zelle quantitativ
(Andreotti et al., 1991, Bellamy et al., 1992, Hunter et al., 1993). Mit
Erreichen des statischen Zustandes der Zelle sinkt der ATP-Gehalt und fällt
bei Zelltod auf Null. Lysosomale ATPasen steuern diesen Vorgang. Der ATPGehalt der Probe wird bioluminometrisch über einen Bereich von 5
Größenordnungen bestimmt. So werden nur relativ geringe Zellmengen
benötigt (ca. 15.000-25.000 Zellen pro Vertiefung (well) der Pipettier/ELISAplatte).
Der Test ist mit einzelnen Zytostatika oder Zytostatikakombinationen
durchführbar und zeigt für die eingesetzte Substanz oder Kombination eine
Dosis-Wirkungsbeziehung (Bruckner et al., 1993, Untch et al., 1993). Sowohl
proliferierende als auch nicht-proliferierende Tumorzellen werden erfasst,
während Erythrozyten und Makrophagen das Ergebnis nicht beeinflussen
sollen. Zytologische Studien haben gezeigt, dass benigne Zellen nicht in dem
Maße durch das Kulturmedium zum Wachstum angeregt werden wie maligne
Zellen. Zur Bestimmung der Sensitivität oder Resistenz werden Tumorzellen
enthaltende Proben für 6-7 Tage in vitro unter Zusatz verschiedener
Konzentrationen einzelner Zytostatika oder Zytostatikakombinationen
kultiviert. Dazu wird ein für Tumorzellen selektives Medium („Complete Assay
Medium“; CAM) mit einer 96-well Mikrotiterplatte verwendet. Jedes
Testbesteck ist für die Bestimmung von acht Zytostatika oder Kombinationen
ausgelegt (Abb.1).
Die Wachstumshemmung wird mittels eines Lumineszenzmeßgerätes
(Dynatech ML 1000) quantifiziert. Es misst das Licht, das bei der
Biolumineszenzreaktion in Gegenwart von Luziferin und Luziferase
proportional zum Gehalt an ATP emittiert wird:
15
ATP + D-Luziferin + O2 › AMP + 2Pi + CO2 + Licht
Die Versuchsdurchführung erfolgte unter Verwendung des kommerziell
erhältlichen Testkits TCA-1 0 0 ( D C S © innovative Diagnostik-Systeme,
Hamburg)
Abbildung
1:
Prinzip
der
Chemosensitivitätstestung
mittles
ATP-
Lumineszenzmethode (ATP-TCA), (TDC, test drug concentration)
3.4.2. Inhalt des Testbestecks
Das Testbesteck enthält zwei sterile Skalpelle zur Zerkleinerung und
Vorbereitung der Tumorprobe für die enzymatische Verdauung, eine 10 ml
Spritze und ein 0,22 mm Filter zur Sterifiltration der TumordissoziationsEnzymlösung. 250 ml Complete Assay Medium (CAM) steht gebrauchsfertig
zur Verfügung (Lagerung bei 4-8°C). Das Tumordissoziationsreagenz
besteht aus lyophilisierten Enzymen zur Bindegewebsverdauung. Zwei sterile
96-Loch Mikrotiterplatten zur Kultur sind im Testkit vorhanden. Ein steriler
ATP-Inhibitor (4ml) wird zur Negativkontrolle eingesetzt. Für die Lösung des
16
ATP aus kultivierten Proben wird ein Tumor-Extraktionsreagenz für die
Extraktion, für die quantitative Messung des ATP-Gehaltes ein LuziferinLuziferase-Reagenz
verwendet.
Verschiedene
ATP-Standardlösungen
dienen der Erstellung von Eichkurven, zur Kalibrierung des Systems und
Validierung der Ergebnisse.
Weitere benötigte Materialien und Geräte: Sterile Pinzette und Schere, sterile
Zentrifugenröhrchen, sterile Pipetten für 1, 5, 10 ml, einstellbare Pipetten 0200
µl,
200-1000
µl
mit
sterilen
Spitzen,
Neubauer-Zählkammer,
Methylenblau oder Gentianaviolett.
3.4.3. Vorbereitung der Proben
Als erstes erfolgte die manuelle Zerkleinerung ( m echanische Dissoziation)
der Tumorprobe mit Skalpell oder Schere. Sobald 1-2 mm große
Tumorfragmente vorlagen, konnten diese mit der Tumordissoziationslösung
gemischt werden. Die Tumorproben wurden bei 37°C für 4-6 Stunden
inkubiert, bis eine Einzelzellsuspension vorlag (enzymatische Dissoziation).
Die Tumorzellpräparation wurde dann zentrifugiert und der Überstand
abgezogen. Das Sediment anschließend resuspendiert, erneut zentrifugiert,
und nach Wiederholung des gesamten Vorgangs in das CAM-Medium
aufgenommen. Die Anzahl und Fraktion der lebenden Zellen wurden mit der
Trypanblau-Methode bestimmt. Abgestorbene Zellen stellen sich bei dieser
Methode blau dar, vitale Zellen bleiben farblos.
Eine zusätzliche Auszählung erfolgte vollautomatisch mittels eines C ell
Counter (CASY, Fa. Schärfe, Deutschland).
Der Lebendzellanteil sollte mindestens 75% der Gesamtzellzahl betragen,
um valide Aussagen zu erhalten.
3.4.4. Vorbereitung der Zytostatika
Zytostatika oder Zytostatikakombinationen wurden jeweils in sechs
verschiedenen Konzentrationen entsprechend 200%, 100%, 50%, 25%,
17
12,5%, 6,25% der in vivo Bezugswerte (Test drug concentration, TDC)
verwendet. Das Profil von 200% bis 6,25% wurde in Dreifachwerten
angesetzt. Acht Zytostatika oder Kombinationen konnten mit den z w e i
mitgelieferten 96-Loch-Mikrotiterplatten getestet werden, die verbliebenen
Vertiefungen wurden für die M0-Kontrollen (Zellen ohne Zytostatikum) und
MI-Kontrollen (Maximum-Inhibitor, Zellen ohne ATP = Blindwert) verwendet.
Nach ihrer Herstellung wurden die Stammlösungen der Zytostatika oder ihre
Kombinationen entsprechend verdünnt. Nach Vorbereitung der MI- und M0Kontrollen erfolgte dann die Anfertigung einer Verdünnungsreihe der
Zytostatika.
Die
Referenzkonzentrationen
Herstellerangaben
der
Applikation.
Ergebnisse
Die
(100%
TDC) e n t s p r i c h t n a c h
Plasmaspitzenkonzentration
wurden
in
nach
Triplikaten
intravenöser
mit
je
sechs
Konzentrationen pro Therapeutikum dargestellt. Das Pipettierschema stellte
sich wie folgt dar:
Tabelle 3: Pipettierschema für 4 Zytostatika zur Testung von 6,25-200% TDC
A
B
C
D
E
F
G
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Med1
Med1
Med1
Med2
Med2
Med2
Med3
Med3
Med3
Med4
Med4
Med4
200%
200%
200%
200%
200%
200%
200%
200%
200%
200%
200%
200%
Med1
Med1
Med1
Med2
Med2
Med2
Med3
Med3
Med3
Med4
Med4
Med4
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Med1
Med1
Med1
Med2
Med2
Med2
Med3
Med3
Med3
Med4
Med4
Med4
50%
50%
50%
50%
50%
50%
50%
50%
50%
50%
50%
50%
Med1
Med1
Med1
Med2
Med2
Med2
Med3
Med3
Med3
Med4
Med4
Med4
25%
25%
25%
25%
25%
25%
25%
25%
25%
25%
25%
25%
Med1
Med1
Med1
Med2
Med2
Med2
Med3
Med3
Med3
Med4
Med4
Med4
12,5%
12,5%
12,5%
12,5%
12,5%
12,5%
12,5%
12,5%
12,5%
12,5%
12,5%
12,5%
Med1
Med1
Med1
Med2
Med2
Med2
Med3
Med3
Med3
Med4
Med4
Med4
6,25%
6,25%
6,25%
6,25%
6,25%
6,25%
6,25%
6,25%
6,25%
6,25%
6,25%
6,25%
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
Kontr
Kontr
Kontr
Kontr
Kontr
Kontr
Kontr
Kontr
Kontr
Kontr
Kontr
Kontr
MI
MI
MI
MI
MI
MI
MI
MI
MI
MI
MI
MI
Kontr
Kontr
Kontr
Kontr
Kontr
Kontr
Kontr
Kontr
Kontr
Kontr
Kontr
Kontr
(Med: Medikament; Kontr: Kontrolle; M0: Zellen ohne Zytostaitkum; MI:
Maximum-Inhibitor, Zellen ohne ATP = Blindwert)
18
3.4.5. Verteilung der Tumorzellen auf die Platten
15.000 bis 20.000 lebende Zellen/well wurden pipettiert (Tabelle 3). Die
Platten wurden abgedeckt und im Inkubator bei 37°C, 5% CO2 und >95%
relativer Luftfeuchtigkeit für 6-7 Tage inkubiert. Die relative Feuchtigkeit sollte
>95% betragen, um ein Austrocknen vor allem am Rand der Platten zu
vermeiden.
3.4.6. Extraktion und Messung
Zuerst wurde das Tumorzell-Extraktionsreagenz zu den MI- und M0Kontrollen gegeben, anschließend zu den Tumorproben. Dann folgte das
Einsetzen der lysierten Proben in den Luminometer, Luziferin-LuziferaseGemisch wurde hineinpipettiert und sofort die Lumineszenz bestimmt. Die
freigesetzte Lichtmenge wurde nach Zugabe von Luziferin-Luziferase in
Relative Light Units (RLU=Photonen/10) über einen Zeitraum von 10s
bestimmt. Die Überlebensfraktion (ÜF) in Prozent pro Medikament sowie die
Konzentration wurde nach folgender Formel errechnet:
ÜFx(%) = (RLUx - RLUmi) / (RLUmo - RLUmi) x 100
MI = Durchschnitt der zwölf Maximum Inhibitor-Kontrollen
M0 = Durchschnitt der Kontrollen ohne Zytostatika-Zusatz
3.4.7. ATP-Standardkurve
Zur Überprüfung der Linearität der Messergebnisse in Abhängigkeit vom
ATP-Gehalt der Probe diente die ATP-Standardkurve. Der Verlauf der
Ergebniskurven wurde aufgrund dieser Kurven interpretiert.
19
ATP Standard ng/mL
Mean Luminometer Counts
10000000
1000000
100000
10000
1000
0
01
3
0,
03
8
0,
11
4
0,
34
3
0,
02
9
1,
08
6
3,
25
9
9,
77
8
2,
,3
3
83
25
0
100
ATP Standard ng/mL
Abbildung 2: ATP-Standardkurve für einen ATP-TCA Test
3.4.8. Auswertung
Die Wachstumshemmung (TGI = Tumor Growth Inhibition) der Tumorprobe
für jede Konzentration (TDC) einzelner Medikamente oder Kombinationen
wurde nach folgender Gleichung berechnet:
1,0 – (TEST – MI) / (M0 – MI) = TGI x 100% = TGI in %
TEST = Durchschnitt der drei Messwerte pro Konzentration eines
Zytostatikums
MI = Durchschnitt der zwölf Maximum Inhibitor-Kontrollen
M0 = Durchschnitt der zwölf Kontrollen ohne Zytostatika-Zusatz
Die TGI-Werte für jede Zytostatika-Konzentration können mit Hilfe der dem
Test beiliegenden Software (Excel-sheet) der Firma DCS© automatisch
kalkuliert werden. Basierend auf den TGI-Werten berechnet die Software vier
weitere im folgenden dargestellte Parameter:
20
AUIC Area Under Inhibition Curve, berechnet mittels Trapezregel für den
X/Y-Verlauf % TDC gegen % TGI
IC50
Durch Interpolation ermittelte Zytostatika-Konzentration, die zu 50 %
TGI führt (IC = Inhibitory Concentration)
IC90
Durch Interpolation ermittelte Zytostatika-Konzentration, die zu 90 %
TGI führt (IC = Inhibitory Concentration)
S.I.
Sensitivitäts-Index
Es wurde
die ATP-Produktion für jede therapierte Probe mit der
nichttherapierten Probe (Kontrolle) verglichen und der Prozentsatz der
überlebenden bzw. abgestorbenen Zellen berechnet und graphisch
dargestellt. Ein niedriger ATP-Gehalt entsprach hierbei einer hohen
zytostatischen Wirkung, ein hoher ATP-Gehalt
einer
nur
geringen
zytostatischen Potenz des Medikaments. Individuelle Sensitivitätsindizes für
die einzelnen Zytostatika oder Kombinationen wurden aus den vorliegenden
Daten berechnet, indem die TGI-Raten (in%) für jede ZytostatikaKonzentration (6,25%, 12,5%, 25%, 50%, 100%, 200%) addiert und von 600
subtrahiert wurden.
TCA-Index = 600 – Summe (% TGI 200…6,25)
Ein Sensitivitätsindex von 600 entspricht ungehinderten Tumorwachstum
und minimaler Chemosensitivität, während ein Sensitivitätsindex von 0 eine
komplette Inhibition des Tumorwachstums darstellt.
Die nachfolgenden Richtlinien wurden zur Bestimmung von Sensitivität und
Resistenz eines Zytostatikums zugrundegelegt:
Die Sensitivität wurde durch hohe TGI- bzw. AUIC-Werte und niedrige
IC50/IC90 Index-Werte angezeigt. Hohe Sensitivität wird durch erhöhte TGIund AUIC-Werte auch im unteren Konzentrationsbereich wiedergegeben.
Die Resistenz wurde durch niedrige TGI- bzw. AUIC-Werte und hohe
IC50/IC90 Index-Werte angezeigt. Starke Resistenz wird durch niedrige TGIund AUIC-Werte auch im hohen Konzentrationsbereich wiedergegeben.
21
3.4.9. Interpretation der Testergebnisse
In Anlehnung an die Klassifikation von Hunter und Mitarbeiter (Hunter et al.,
1993) wurden vier Sensitivitätstypen definiert, nach denen die Ergebnisse
dieser Arbeit ausgewertet wurden (Tabelle 4).
Tabelle 4: Klassifikation der Testergebnisse des ATP-TCA
(TGI, Tumor Growth Inhibition; TDC, Test Drug Concentration)
TGI bei 200% TDC
Hohe
TGI bei 25% TDC
>95%
>70%
>95%
50-70%
Geringe
>95%
<50%
Sensitivität
<95%
>50%
Resistenz
<95%
<50%
Sensitivität
Partielle
Sensitivität
Als in vitro Responserate wurde der Anteil an Tumoren mit hoher Sensitivität,
partieller und schwacher Sensitivität an der Gesamtzahl auswertbarer
Ansätze angesehen.
3.5. Verwendete Zytostatika
Für die Untersuchungen wurden kommerziell erhältliche Lösungen der
Substanzen verwendet. Die Medikamente wurden von der Apotheke des
Universitätsklinikums Bergmannsheil Bochum zur Verfügung gestellt.
Es wurden handelsübliche Formulierungen der untersuchten Zytostatika und
des getesteten Schleimhautdesinfektionsmittels verwendet. Die Lagerung
von Stammlösungen erfolgte unter Berücksichtigung der Herstellerangaben
und nach Literaturhinweisen (Andreotti et al., 1995, Hunter et al., 1994).
Die Medikamente wurden von der Apotheke des Universitätsklinikums
Bergmannsheil Bochum entsprechend der Herstellerangeben in gleicher
22
Weise wie für die Verabreichung an Patienten am Untersuchungstag
vorbereitet.
Die getesteten Zytostatika wiesen verschiedene Wirkmechanismen auf:
·
Alkylantien (reagieren leicht mit Phosphatgruppen, hemmen so die
Zellteilung und damit das Tumorwachstum): Ifosfamid
·
Antibiotika mit zytostatischer Wirkung (interkalierende Wirkung):
Adriamycin (Doxorubicin), Epirubicin, Actinomycin D
·
Alkaloide (Kernspindelgifte, Hemmung der Mitose): Vincristin
·
Platinverbindungen (Reaktion mit zellulärer DNS): Cisplatin
·
Dacarbazin (DTIC)
(Tabelle 5)
Unmittelbar vor Gebrauch wurden die Stammlösungen in CAM (Complete
Assay Medium) bis auf 800% Testkonzentration (TDC) verdünnt. Hierbei
wurden die Medikamentenkombinationen durch einfache Mischung der
Einzelkomponenten in CAM hergestellt. Getestete Kombinationen waren
CYVADIC (Cyclophosphamid/Ifosfamid, Vincristin, Doxorubicin, Dacarbazin)
und VAC (Vincristin, Actinomycin D, Cyclophosphamid/Ifosfamid) . D a
Ifosfamid in der Leber zu seinem aktiven Analog metabolisiert wird, wurde
entsprechend der Herstellerangaben des Test-Kits Mafosfamid verwendet.
Die Titrierung der endgültigen Testkonzentration von 6,25% - 200% TDC
erfolgte direkt auf den Mikrotiterplatten durch sterile Verdünnungen der
Ausgangslösungen von 800% TDC im Verhältnis 1:1 in CAM. Um sowohl
therapeutische, d.h. intratumoral erreichbare, als auch supratherapeutische
Konzentrationen zu erreichen, wurde der Konzentrationsbereich von 6,25%
bis 200% entsprechend der Herstellerangaben des Test-Kits gewählt. Hierbei
entsprach die Referenzkonzentration von 100% TDC entweder der
Plasmaspitzenkonzentration (Plasma peak concentration PPC) oder einem
Äquivalent der Fläche unter der Plasmaeliminationskurve.
Weiter testeten wir an jeweils zehn Tumorproben das Schleimhautdesinfektionsmittel Octenisept® (Octenidinhydrochlorid) in linearer und
logarithmischer
Verdünnung
(1:1 – 1 : 1 0 6).
Dies geschah mit dem
Hintergrund, dass nach erfolgten Tumorresektionen die resultierenden
Wundhöhlen in unserer Klinik mit Octenisept gespült werden.
23
Pro
Tumorprobe
konnten
wir
sieben
Einzelsubstanzen,
zwei
Zweierkombinationen und zwei Mehrfachkombinationen (CYVADIC, VAC)
testen. Eine Übersicht der Monopräparate gibt folgende Tabelle:
Tabelle 5: Übersicht der getesteten Monosubstanzen
(TDC, Test Drug Concentration)
Medikament
Doxorubicin
100% TDC µg/ml
Stammlösung mg/ml
0,5
2,0
Epirubicin
0,5
2,0
Ifosfamid (Mafosfamid)
3,0
5,0
20,0
10,0
Actinomycin D
0,1
8,0
Cisplatin
3,8
2,0
Vincristin
0,4
1,0
(Adriamycin)
Dacarbazin (DTIC)
Octenisept® (Octenidin-
0,1g/250ml (0,1%)
Hydrochlorid)
lg (10-1 – 10-6)
3.6. Statistik
Die Statistische Signifikanz der Unterschiede in der Chemosensitivität
zwischen den Subentitäten der Weichteilsarkome, der unterschiedlichen
Differenzierungsgrade und im Vergleich zwischen Primärtumoren und
Tumorrezidiven wurde mittels Mann-Whitney-U-Test und dem Chi-QuadratTest kalkuliert. Ein p-Wert <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Die statistische Auswertung erfolgte in Kooperation mit dem Institut für
Medizinische Informatik, Biometrie und Epidemiologie der Ruhr-UniversitätBochum (Leiter: Univ.-Prof. Dr. H.-J. Trampisch).
24
4. Ergebnisse
4.1. Testsystem des ATP-TCA
4.1.1. Auswertbarkeit des ATP-TCA
In der Zeit von August 2 0 0 2 b i s Juni 2004 wurden insgesamt 53
Weichteilsarkomproben von 53 Patienten unter Verwendung des ATP-TCA
untersucht. 50 der 53 Ansätze waren (94%) auswertbar, so dass die
erhaltenen Ergebnisse statistisch ausgewertet werden konnten.
4.1.2. Testversager
Der Hauptgrund für das Testversagen von drei Proben war der zu geringe
Gehalt an vitalen Tumorzellen in den verarbeiteten Weichteilsarkomproben.
Bei der enzymatischen Dissoziation zeigte sich hier ein vergleichsweise
großer
Anteil
an
festem,
zellarmen
Bindegewebe
oder
eine
überdurchschnittliche Menge nekrotischen Areals. Eine Gesamtzellzahl von
<100.000 Zellen/ml nach der Resuspension in CAM führte nicht zu
auswertbaren Ergebnissen am Ende der jeweiligen Testreihe (n=3, 6%)
Weitere mögliche Gründe für einen Ausschluß der Probe aus der Testung
sind
eine bakterielle Kontamination der Zellkultur oder ein mangelhaftes
oder fehlendes Anwachsen der Tumorzellen. Keiner dieser Gründe traf
jedoch bei unseren Untersuchungen zu.
25
4.1.3. Dosisantwortkurven
Das folgende Diagramm zeigt beispielhaft die originalen Dosisantwortkurven
des ATP-TCA vier verschiedener Zytostatika bei einem Liposarkom. Die
Monosubstanzen Epirubicin, Doxorubicin, Ifosfamid (Mafosfamid) und
Cisplatin wurden eingesetzt. Die Zytostatika wurden in sechs verschiedenen
Konzentrationen getestet: 6,25% bis 200% der TDC (Test Drug
Concentration). Epirubicin und Doxorubicin zeigen sich hier in hohen
Dosierungen als wirksamste Chemotherapeutika für diese Probe, da bei
100% TDC (entspricht der maximal erreichbaren Plasmakonzentration) 90%
der Tumorzellen abgetötet werden. Ifosfamid/Mafosfamid zeigt in dieser
Probe für submaximale Plasmakonzentrationen bessere Wirkungen. Bei bis
zu 75% TDC liegt hier die Wirksamkeit über der von Epirubicin und
Doxorubicin. Cisplatin hat in diesem Fall die geringste Wirkung.
100
% tumor growth inhibition
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
6,25
12,5
25
50
100
200
% test drug concentration
Epirubicin
Doxorubicin
Abbildung 3: Dosisantwortkurve des ATP-TCA
26
Mafosfamid
Cisplatin
Abgebildet sind die Dosiswirkungskurven der Zytostatika bei verschiedenen
Konzentrationen. Auf der y-Achse ist die Tumorwachstumshemmung in %,
auf der x-Achse die Zytostatikakonzentration in vitro in % dargestellt.
Aus dem Diagramm lassen sich direkt die TGI-Werte (Tumor Growth
Inhibition) bei 200% TDC und 25% TDC (Test Drug Concentration) ablesen
und die Sensitivität klassifizieren (Tabelle 4).
4.2. Monosubstanzen
Alle
sieben
Monosubstanzen
wurden
50mal
getestet.
Das
Schleimhautantiseptikum Octenisept® wurde 10x in linearer Verdünnung,
aufgrund der starken zytotoxischen Wirkung zusätzlich 10x in logarithmischer
Verdünnung (1:10-1 – 1:10-6) getestet.
I n T a b elle 12 sind die Ergebnisse der 50 Monosubstanzen nach
Wirkklassifikation dargestellt. Der Sensitivitätsindex stellt Mittelwerte der
individuellen
Chemosensitivitätsindizes
jeder
einzelnen
getesteten
Monosubstanz dar, berechnet durch Addition der TGI (Tumor Growth
Inhibition) für jede Zytostatikakonzentration und Subtraktion von 600. Ein
Sensitivitätsindex
von
600
bedeutet
hierbei
ein
ungehindertes
Tumorwachstum und minimale Chemosensitivität, ein Sensitivitätsindex von
0
spiegelt
komplette
Tumorwachstumshemmung
Chemosensitivität wieder.
27
und
maximale
Tabelle 6: Übersicht über die mittels ATP-TCA getesteten Monosubstanzen
bei 50 Patienten mit Weichteilsarkomen
Medikament
Resistenz
Geringe
Partielle
Hohe
Mittlerer
Sensitivität
Sensitivität
Sensitivität
Sensitivitäts
Index
Actinomycin
00/50
10/50
03/50
37/50
D
(00%)
(20%)
(06%)
(74%)
Doxorubicin
03/50
02/50
10/50
35/50
(Adriamycin)
(06%)
(04%)
(20%)
(70%)
Ifosfamid
16/50
00/50
02/50
32/50
(Mafosfamid) (32%)
(00%)
(04%)
(64%)
Epirubicin
08/50
00/50
12/50
30/50
(16%)
(00%)
(24%)
(60%)
39/50
11/50
00/50
00/50
(78%)
(22%)
(00%)
(00%)
45/50
05/50
00/50
00/50
(95%)
(05%)
(00%)
(00%)
42/50
08/50
00/50
00/50
(84%)
(16%)
(00%)
(00%)
00/10
00/10
00/10
10/10
(00%)
(00%)
(00%)
(100%)
Octenisept®
00/10
00/10
00/10
10/10
(lg)
(00%)
(00%)
(00%)
(100%)
Cisplatin
Dacarbazin
Vincristin
Octenisept®
137
140
234
245
444
532
513
-------
Die stärkste Chemoresistenz zeigten die eingesetzten Monosubstanzen
Dacarbazin (95% der Proben waren resistent), Vincristin (84% Resistenz)
und Cisplatin (82% Resistenz). Dies lässt sich auch in der graphischen
Darstellung der Ergebnisse ablesen, in der diese drei Zytostatika eine
konkave Dosiswirkungskurve zeigen (Abbildung 4).
Die höchsten Ansprechraten fanden wir für Actinomycin D. Es zeigte sich
eine hohe Chemosensitivität bei allen Weichteilsarkomen von insgesamt
74%. Kein Tumor zeigte Resistenz. Hohe Chemosensitivität zeigte sich auch
28
für die getesteten Monosubstanzen Doxorubicin (Adriamycin) (70% hohe
Sensitivität, 6% Resistenz) und Ifosfamid (Mafosfamid) (64% hohe
Sensitivität, 32% Resistenz). Für diese Zytostatika ergab die Graphische
Darstellung der Ergebnisse eine konvexe Kurve für alle Patienten (Abbildung
4).
Die Unterschiede im Ansprechverhalten der Tumorzellen auf Dacarbazin,
Vincristin und Cisplatin verglichen mit Actinomycin D, Doxorubicin und
Ifosfamid waren statistisch signifikant (p<0,05).
Epirubicin zeigte in gleicher Dosierung einen deutlich geringeren Effekt auf
die Tumorwachstumshemmung (60% hohe Sensitivität, 16% Resistenz) als
Doxorubicin (p<0,05).
110
100
90
% tumor growth inhibition
80
70
60
50
40
30
20
10
0
6,25
Actinomycin D
12,5
25
50
% test drug concentration
Doxorubicin
Ifosfamide
Epirubicin
100
Cisplatin
Vincristine
200
Dacarbazine
Abbildung 4: Graphische Darstellung der mittels ATP-TCA erhobenen
Orginaldaten für die 50 Weichteilsarkome. Für jede TDC (Test Drug
Concentration)
sind
die
Testergebnisse der s i e b e n Monosubstanzen
aufgeführt.
29
4.3. Zytostatikakombinationen
Mit
dem
ATP-TCA
testeten
wir
außerdem
vier
verschiedene
Zytostatikakombinationen. Darunter befanden sich das bis in die 90er Jahre
als Standardtherapie eingesetzte CYVADIC-Schema (Cyclophosphamid,
Vincristin, Doxorubicin und Dacarbazin) und die VAC-Kombination (Vincristin,
Actinomycin D und Cyclophosphamid). Weiterhin testeten wir die ZweifachKombination aus Doxorubicin und Ifosfamid (Mafosfamid) sowie die
Zweifach-Kombination aus Actinomycin und Ifosfamid (Mafosfamid) an
jeweils 50 Tumorproben. Einen Überblick gibt Tabelle 7.
Tabelle
7:
Übersicht
über
die
mittels
ATP-T C A g e t e steten
Zytostatikakombinationen bei 50 Patienten mit Weichteilsarkomen
Medikament Resistenz
Geringe
Partielle
Hohe
Mittlerer
Sensitivität
Sensitivität
Sensitivität
Sensitivitäts
Index
Doxorubicin
03/50
00/50
11/50
36/50
+ Ifosfamid
(06%)
(00%)
(22%)
(72%)
Actinomycin 01/50
08/50
03/50
38/50
D
(02%)
(16%)
(06%)
(76%)
03/50
05/50
07/50
35/50
(06%)
(10%)
(14%)
(70%)
02/50
00/50
15/50
33/50
(04%)
(00%)
(30%)
(66%)
139
163
+ Ifosfamid
VAC
CYVADIC
218
255
Das CYVADIC-Schema (Cyclophosphamid, Vincristin, Doxorubicin und
Dacarbazin) zeigte die stärkste Chemoresistenz (66% hohe Sensitivität, 4%
Resistenz), gefolgt von der VAC-Kombination (Vincristin, Actinomycin D und
Cyclophosphamid) (70% hohe Sensitivität, 6% Resistenz). Die beiden
Zweifachkombinationen lieferten insgesamt bessere Ansprechraten. Die
Kombination aus Doxorubicin und Ifosfamid (72% hohe Sensitivität, 6%
30
Resistenz) war der Kombination aus Actinomycin D und Ifosfamid (76% hohe
Sensitivität, 2% Resistenz) leicht unterlegen.
Die
Unterschiede
im
Ansprechverhalten
auf
die
verschiedenen
Mehrfachkombinationen (CYVADIC vs. VAC) waren nicht statistisch
signifikant (p>0,05). Auch der Vergleich der Ansprechverhalten auf die
verschiedenen
Zweichfachkombinationen
ergab
keinen
signifikanten
Unterschied (p>0,05) (Abbildung 5).
100
90
% tumor growth inhibition
% tumor growth inhibition
80
70
60
50
40
30
20
10
0
6,25
12,5
Doxorubicin+Ifosfamide
25
50
% test drug concentration
Actinomycin D+Ifosfamide
100
VAC
200
CYVADIC
Abbildung 5: Graphische Darstellung der mittels ATP-TCA erhobenen
Orginaldaten für die 50 Weichteilsarkome. Für jede TDC (Test Drug
Concentration) sind die Testergebnisse der vier Kombinationen aufgeführt.
31
4.4. Octenidin-Hydrochlorid (Octenisept®)
Jeweils 10 Tumorproben wurden mit dem Schleimhautantiseptikum in
linearer und logarithmischer Verdünnung getestet.
In jeder Verdünnungsstufe zeigte sich bei allen Tumoren eine komplette
Hemmung des Tumorzellwachstums (100% Hohe Sensitivität, 0% Resistenz)
(Tabelle 6). Dies entspricht einer Tumorzellwachstumshemmung von 100%
bei jeder Verdünnung und resultiert in der graphischen Darstellung in einer
waagerechten Kurve bei 100% TGI (Tumor Growth Inhibition) für die lineare
Verdünnung. Für die logarithmische Verdünnung ergibt sich eine konvexe
Kurve.
4.5. Chemosensitivität unterschiedlicher Subtypen von Weichteilsarkomen
Die 50 getesteten Weichteilsarkomproben ließen sich in acht verschiedene
Subtypen einteilen. Der ATP-TCA
wurde
an siebzehn Liposarkomen,
sechzehn N O S -Sarkomen/MFH (NOS, not otherwise specified; MFH,
Malignes
Fibröses
Histiozytom),
acht
Chondrosarkomen,
fünf
Rhabdomyosarkomen und vier MPNST (MPNST, Maligner Peripherer
Nervenscheidentumor) durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Chemosensitivität innerhalb der einzelnen
Subklassen tendenziell ähnlich ist. Fasst man jedoch diese Daten
zusammen, so zeigt sich, dass das Ansprechverhalten der einzelnen
Subtypen auf die unterschiedlichen Zytostatika signifikant unterschiedlich ist.
Wir haben dies für die bei unseren Testergebnissen wirksamsten
Substanzen Actinomycin D (74% hohe Sensitivität, 0% Resistenz) und
Doxorubicin (70% hohe Sensitivität, 6% Resistenz) im folgenden dargestellt.
Für die Therapie mit Actinomycin D wird deutlich, dass die fünf getesteten
Rhabdomyosarkome im Mittel chemoresistent gegen dieses Medikament
waren, während alle anderen Tumorsubentitäten eine ähnlich hohe
Chemosensitivität
aufwiesen
(p<0,05).
Die
Testergebnisse
für
Rhabdomyosarkome lagen durchweg unter denen anderer Sarkomsubtypen
(Abb.6).
32
110
100
% tumor growth inhibition
% tumor growth inhibition
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
6,25
Liposarcoma
12,5
25
50
% test drug concentration
% test drug concentration
NOS-sarcoma
Rhabdomyosarcoma
100
MPNST
200
Chondrosarcoma
Abbildung 7: Effekt von Actinomycin D als Einzelsubstanz, Ergebnisse des
ATP-TCA bei unterschiedlichen Subklassen von Weichteilsarkomen
(p<0,05)
33
Ähnliche Ergebnisse zeigten sich im Vergleich der verschiedenen
Subklassen von Weichteilsarkomen in ihrem Ansprechverhalten auf die
getestete Monosubstanz Doxorubicin . Die acht getesteten Chondrosarkome
zeigten eine signifikant höhere Resistenz gegen Doxorubicin als die übrigen
Subklassen, die eine ähnlich hohe Chemosensitivität aufwiesen (p<0,05). Die
Testergebnisse für Chondrosarkome lagen durchweg unter denen der
anderen Sarkomsubentitäten. Die maximal erreichbare Hemmung des
Tumorzellwachstums lag unter 75% (Abb.7).
110
100
90
% tumor growth inhibition
% tumor growth inhibition
80
70
60
50
40
30
20
10
0
6,25
12,5
Liposarcoma
25
50
% drug
test drug
concentration
% test
concentration
NOS-sarcoma
Rhabdomyosarcoma
100
MPNST
200
Chondrosarcoma
Abbildung 6: Effekt von Doxorubicin (Adriamycin) als Einzelsubstanz,
Ergebnisse
des
ATP-TCA
bei
unterschiedlichen
Weichteilsarkomen (p<0,05)
34
Subklassen
von
4.6.
Chemosensitivität
von
Weichteilsarkomen
unterschiedlichen
Differenzierungsgrades
Von den 50 getesteten Weichteilsarkomproben waren 17 mäßig (GII, n=17,
34%) und 33 niedrig (GIII, n=33, 66%) differenziert.
Wir haben die Chemosensitivität von GII-differenzierten Tumoren gegenüber
Actinomycin D, Doxorubicin und Ifosfamid mit der Chemosensitivität von GIIIdifferenzierten Tumoren gegenüber diesen drei Monosubstanzen verglichen.
Es zeigten sich signifikant bessere Ansprechraten der niedrig differenzierten
Tumoren auf alle drei Zytostatika im Vergleich zu den mäßig differenzierten
Tumoren (p<0,05). Die maximale Hemmung des Tumorzellwachstums lag
bei den GII-Tumoren bei 80%, während die Maximale Hemmung der GIIITumoren über 90% lag. In Abbildung 8 sind die Ergebnisse der schlecht
differenzierten Tumoren denen der mäßig differenzierten
gegenübergestellt (GII: n=17, GIII: n=33):
35
Tumoren
110
% tumor growth inhibition
% tumor growth inhibition
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
6,25
12,5
25
50
100
200
testdrug
drugconcentration
concentration
%%test
Actinomycin D/GII
Actinomycin D/GIII
Ifosfamide/GII
Ifosfamide/GIII
Doxorubicin/GII
Doxorubicin/GIII
Abbildung 8: Chemosensitivitätsprofile von 50 Weichteilsarkomen, eingeteilt
in verschiedene Differenzierungsgrade (GII, n=17; GIII, n=33),
Ergebnisse für Actinomycin D, Doxorubicin und Ifosfamid (p<0,05)
4.7. Unterschiede in der Chemosensitivität von Primärtumoren und
Tumorrezidiven
Bei den uns zur Verfügung stehenden Weichteilsarkomproben handelte es
sich in 42% der Fälle um einen Primärtumor (n=21) und in 58% der Fälle um
ein
Tumorrezidiv
(n=29).
Wir
haben
die
Primärtumoren
und
die
Tumorrezidive jeweils mit den drei wirksamsten Substanzen Actinomycin D,
Doxrubicin (Adriamycin) und Ifosfamid getestet und die Ergebnisse
36
v e r g l i c h e n . D a b e i zeigte s i c h , d ass
Rezidivtumoren
bei
Verdünnungsstufen
allen
höher
drei
war
das
Ansprechverhalten
getesteten
als
das
der
Zytostatika
in
der
allen
Primärtumoren.
Die
Chemosensitivität der Rezidivtumoren lag bei allen drei Substanzen um etwa
15-20% über der Chemosensitivität der Primärtumoren (Abbildung 9).
Die Ergebnisse waren statistisch signifikant (p<0,05).
110
% tumor growth inhibition
% tumor growth inhibition
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
6,25
12,5
25
50
100
200
% test drug concentration
% test drug concentration
Actinomycin D/primary tumors
Actinomycin D/recurrent tumors
Doxorubicin/primary tumors
Doxorubicin/recurrent tumors
Ifosfamide/primary tumors
Ifosfamide/recurrent tumors
Abbildung 9: Chemosensitivitätsprofile der 50 Weichteilsarkomen, eingeteilt
in Primärtumore (n=21) und Tumorrezidive (n=29),
Ergebnisse dargestellt für Actinomycin D, Doxorubicin und Ifosfamid (p<0,05)
37
4.8. Individualität der Ergebnisse des ATP-TCA
Anhand von zwei Fallbeispielen soll die Möglichkeit dargestellt werden, den
ATP-T C A a l s Entscheidungshilfe für den Einsatz einer individuellen
Chemotherapie bei Patienten mit Weichteilsarkomen zu nutzen.
Bei Patient 1 handelt es sich um einen 46-jährigen Mann mit einem
rundzelligen Liposarkom am Oberschenkel ventral, TNM-Klassifikation: pT2,
N0, M0, G3, R0. Dargestellt ist die Testung der Monosubstanzen Epirubicin,
Doxorubicin, Ifosfamid und Cisplatin (Tabelle 8, Abbildung 10).
Bei Patient 2 handelt es sich um einen 72-jährigen Mann mit einem Rezidiv
eines myxoiden extraskelettalen Chondrosarkoms retroperitoneal, T N M Klassifikation: pT2, N1 (Lymphangiosis blastomatosa), pM1 (Haemangiosis
blastomatosa, pulmonale Metastasierung), G3, R0. Dargestellt ist auch hier
die Testung der oben genannten Monosubstanzen (Tabelle 9, Abbildung 11).
Es zeigen sich deutliche Unterschiede im Ansprechverhalten auf die
unterschiedlichen Zytostatika. Die erste Tumorprobe (Liposarkom, G3) zeigt
eine geringe Sensitivität gegenüber Epirubicin und Doxorubicin und i s t
resistent gegenüber Cisplatin und Ifosfamid (nur geringe Wirkung). Die
zweite Tumorprobe zeigt eine geringe Sensitivität gegenüber Cisplatin, ist
jedoch resistent gegenüber Epirubicin und Doxorubicin (nur geringe
Wirkung). Ifosfamid wirkt in diesem Falle nicht (Vergleiche hierzu auch
Tabelle
4).
Für
die
anderen
untersuchten
Monosubstanzen
Zytostatikakombinationen ergeben sich analoge Dosisantwortkurven.
38
und
Tabelle 8: Sensitivitätsindizes für Epirubicin, Doxorubicin, Ifosfamid und
Cisplatin bei Patient 1 (Liposarkom, G3, Primärtumor)
Medikament
Sensitivitätsindex
Epirubicin
277
Doxorubicin
290
Ifosfamid
576
Cisplatin
440
Tabelle 9: Sensitivitätsindizes für Epirubicin, Doxorubicin, Ifosfamid und
Cisplatin bei Patient 2 (Myxoides Chondrosarkom, G3, Tumorrezidiv)
Medikament
Sensitivitätsindex
Epirubicin
438
Doxorubicin
415
Ifosfamid
600
Cisplatin
264
39
Patient 1
100
% tumor growth inhibition
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
-10
6,25
12,5
25
50
100
200
% test drug concentration
Epirubicin
Abbildung
10:
Doxorubicin
Mafosfamid
Dosisantwortkurve des ersten P a tienten
Liposarkom, G3, Primärtumor
40
Ifosfamid
mit
einem
Patient 2
100
% tumor growth inhibition
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
-10
6,25
12,5
25
50
100
200
% test drug concentration
Epirubicin
Doxorubicin
Mafosfamid
Cisplatin
Abbildung 11: Dosisantwortkurve des zweiten Patienten mit einem Myxoiden
Chondrosarkom, G3, Rezidivtumor
41
5. Diskussion
5.1. Epidemiologie, Ätiologie, Risikofaktoren und Pathomorphologie von
Weichteilsarkomen
Weichteilsarkome gehören zu den seltenen neoplastischen Erkrankungen
(1% aller soliden Tumore, für Kinder 6,5%) mit einer Inzidenz von 2-3 Fällen
pro 100.000 Einwohner. Altersgipfel sind die Adoleszenz und die Zeit
zwischen dem 45. und 55. Lebensjahr (Hoos et al., 2000).
Die Ätiologie der sehr heterogenen Subtypen ist weitgehend unklar. Eine
virale Ursache wird für einige Subklassen diskutiert, nachgewiesen ist jedoch
das gehäufte Auftreten von malignen Fibrösen Histiozytomen (70%),
Osteosarkomen, Fibrosarkomen und anderer nach Bestrahlungen (Brady et
al., 1992). Weitere mögliche Ursachen sind karzinogene Substanzen wie
Arsen und Polyvinylchlorid, Asbest, Herbizide und Chlorophenole. In
Einzelfällen ließ sich eine genetische Disposition nachweisen (Toguchida et
al., 1992)
Insgesamt gibt es mehr als 50 Subtypen von Weichgewebssarkomen (Singer
et al., 2000). Die häufigsten Weichteilsarkome sind Liposarkome (19%),
Fibrosarkome (18%), und Maligne Fibröse Histiozytome, MFH (11%), gefolgt
von Synovialsarkomen (7%) und Leiomyosarkomen (7%). Betrachtet man
nur die Weichteilsarkome der Extremitäten ist die Reihenfolge wie folgt:
Liposarkom, MFH, Fibrosarkom und Synovialsarkom. Die meisten Sarkome
sind mesodermalen Ursprungs, lediglich die neurogenen Sarkome und
wahrscheinlich das Ewing-Sarkom stammen vom Ektoderm ab. Sie können
ubiquitär im Körper entstehen, am häufigsten ist jedoch die Lokalisation an
der unteren Extremität (46%), gefolgt vom Stamm (19%), der oberen
Extremität (14%), dem Retroperitoneum (13%), Hals oder Kopf (8%) (Nielsen
et al., 2002).
42
5.2. Stadieneinteilung von Weichteilsarkomen
Die gebräuchlichste Stadieneinteilung nach AJCC (American Joint
Committee on Cancer) (1997) und UICC (Union Internationale Contre le
Cancer) kombiniert das TNM-System (Tabelle 10) mit dem histologischen
Grading als wichtigem prognostischen Faktor (Cormier et al., 2004) (Tabelle
11).
Tabelle 10: TNM-Klassifikation für Weichteilsarkome (1997)
T – Primärtumor
Tx
Primärtumor kann nicht beurteilt werden
T0
Kein Anhalt für einen Primärtumor
T1
Tumor 5 cm oder weniger in größter Ausdehnung
T1a
Oberflächlicher Tumor
T1b
Tiefer Tumor
T2
Tumor mehr als 5 cm in größter Ausdehnung
T2a
Oberflächlicher Tumor
T2b
Tiefer Tumor
N – Regionäre
Lymphknoten
Nx
Reginonäre Lymphknoten können nicht beurteilt
werden
N0
Keine regionären Lymphknotenmetastasen
N1
Regionäre Lymphknotenmetastasen
M – Fernmetastasen
Mx
Fernmetastasen können nicht beurteilt werden
M0
Keine Fernmetastasen
M1
Fernmetastasen
p: postoperativ
y: Z.n. Chemo-/Strahlentherapie
r: Rezidivtumor
PE oder Stanze bekommt keine TNM
43
Das histopathologische Grading (G) gliedert sich wie folgt:
Gx: Differenzierungsgrad kann nicht beurteilt werden
G1: Gut differenziert
G2: Mäßig differenziert
G3: Schlecht differenziert
G4: Undifferenziert
Beurteilt werden Zellreichtum, Zellpleomorphie, mitotische Aktivität und
Nekroseanteil innerhalb des Tumors. Die Menge an Interzellularsubstanz wie
Kollagen oder mukoides Material soll als günstiger Faktor gewertet werden.
Tabelle 11: Stadiengruppierung von Weichteilsarkomen nach AJCC (1997)
Stadium
GTNM-Klassifikation
Definition
IA
G1,2 T1a N0 M0
Grad 1-2, Tumor <5 cm, oberflächlich
G1,2 T1b N0 M0
oder tief, keine Lymphknoten- o d e r
Fernmetastasen
IB
Wie Stadium Ia, jedoch Tumor 5 cm
G1,2 T2a N0 M0
und nur oberflächlich gelegen
IIA
Tumor 5 cm, tief gelegen, ohne
G1,2 T2b N0 M0
regionäre LK- oder Fernmetastasen
IIB
G3,4 T1a N0 M0
Tumor <5 cm, oberflächlich oder tief
G3,4 T1b N0 M0
gelegen,
ohne
regionäre LK- o d e r
Fernmetastasen
IIC
Wie Stadium IIb, jedoch Tumor 5 cm,
G3,4 T2a N0 M0
nur oberflächlich gelegen
III
Wie Stadium IIc, jedoch Tumor tief
G3,4 T2b N0 M0
gelegen
IV
jedes G jedes T N1 M0
Tumor
jedes G jedes T jedes N M1
Fernmetastasen
44
mit
Lymphknoten- u n d / o d e r
5.3. Prognose von Weichteilsarkomen
Die wichtigsten prognostischen Faktoren sind das histologische Grading, das
Ausmaß der operativen Radikalität, die Größe des Primärtumors, seine
Lokalisation, der histologische Subtyp und das Stadium (Coindre et al.,
1996). Das AJCC-Stadium korreliert gut mit der Prognose, wobei für die
Stadien I – IV 5-Jahresüberlebensraten von 80%, 60%, 40% und 10%
erwartet werden können. Gegenwärtig sterben etwa 30% - 50% der
Patienten innerhalb von 5 Jahren nach Diagnosestellung, meist aufgrund zu
diesem Zeitpunkt bereits vorhandener Fernmetastasen. 40% - 60 % der
Patienten mit einem höhergradigen Weichteilsarkom entwickeln in dieser Zeit
trotz erfolgreicher lokaler Tumorbehandlung Fernmetastasen, hauptsächlich
im Bereich der Lungen (Chao et al., 2002). Die mittlere Überlebenszeit bei
bereits metastasiertem Weichteilsarkom beträgt etwa acht bis zwölf Monate
vom Zeitpunkt der Diagnose (Chao et al., 2002; Reichardt, 2002).
5.4. Therapie von Weichteilsarkomen
Die onkologiegerechte komplette Resektion des Tumors weit im Gesunden in
Kombination mit adjuvanter Strahlentherapie stellt die Therapie der Wahl für
Weichteilsarkome dar (Reichardt, 2002; Steinau et al., 2001). Es wird
empfohlen, die Resektion m it einem Sicherheitsabstand von 2cm zur Tiefe
und 5cm zur Seite durchzuführen. Reihenuntersuchungen zu erforderlichen
Mindestabständen existieren aber bis heute nicht (Lehnhardt 2004). Da nur
etwa 2–3% der Weichteilsarkome in regionäre Lymphknoten metastasieren,
wird eine Lymphadenektomie nur bei klinisch positiven Lymphknoten
durchgeführt (Kawaguchi et al., 2004).
Die adjuvante (postoperative) Strahlentherapie (55 – 70 Gy) senkt das lokale
Rezidivrisiko, eine Verlängerung der Überlebenszeit konnte jedoch bisher
nicht nachgewiesen werden (Wang et al., 1997). Bei einem Lokalrezidiv
sollte bei Fehlen von Metastasen eine erneute radikale Operation
durchgeführt werden (Stoeckle et al., 2004; Bonvalot et al., 2004).
45
5.5. Chemotherapie bei Weichteilsarkomen
Weichteilsarkome sind eine Tumorentität, die in konventioneller Dosierung
eine
hohe
Resistenz
gegenüber
antineoplastischen Medikamenten
aufweisen (Donato Di Paola & Nielsen, 2002). Dabei sind Grad-2- und Grad3-Tumoren wesentlich chemo- und radiosensitiver als G-1-Sarkome. Nur
wenige
Zytostatika
zeigen
Ansprechraten
über
15%,
unter
den
Monosubstanzen sind die wirksamsten Doxorubicin, Epirubicin und Ifosfamid
mit Responseraten von 18% - 29% in der Behandlung von Primärtumoren
(Frustaci et al., 2003; Frustaci et al., 1993). Epirubicin und Doxorubicin sind
dann ebenbürtig, wenn eine äquitoxische Dosierung gewählt wird. Weniger
wirksam in der Monotherapie von Weichteilsarkomen sind Dacarbazin (17%)
und Actinomycin D (17%) (Tabelle 12).
Tabelle 12: Therapieschema für die Doxorubicinmonotherapie
Doxorubicinmonotherapie
Doxorubicin
70mg/m²
i.v.
Kurzinfusion
Tag 1
Wiederholung Tag 22
In den ersten 2 Zyklen Dosissteigerung um 10 mg/m² pro Zyklus, wenn Leukozytennadir
über 3000/µg.
Bei Einsatz von Epirubicin (statt Doxorubicin): 100 – 130 mg/m² streng i.v.
Tabelle 13: Therapieschema für die wöchentliche Doxorubicinmonotherapie
Doxorubicinmonotherapie wöchentlich
Doxorubicin
12 – 15 mg/m²
i.v.
usw. fortlaufend wöchentlich, mindestens 6 Wochen
46
Bolus
Tag 1, 8, 15
Tabelle 14: Therapieschema für die Ifosfamidmonotherapie
Ifosfamidmonotherapie
(van Oosterom et al., 1998)
Ifosfamid
3g/m²
i.v.
4-h-Infusion
Tag 1, 2, 3
Mesna
1g/m²
i.v.
Bolus, 0, 4, 8 h
Tag 1, 2, 3
Ifosfamid
5g/m²
i.v.
24-h-Infusion
Tag 1
Mesna
5g/m²
i.v.
36-h-Infusion
Tag 1, 2
Wiederholung Tag 22
Der
Einsatz
von
Zweifach-
oder
Mehrfachkombination e n b e i
Weichteilsarkomen kann die Ansprechraten steigern. Die Kombination aus
Anthrazyklinen
(Doxorubicin
oder
Epirubicin)
und
Ifosfamid
zeigt
Ansprechraten von bis zu 40% - 50% (Fernberg et al., 2004). 10% der
zytostatisch induzierten kompletten Responder sind nach sechs Jahren noch
tumorfrei (Frustaci et al., 2001), bei partieller Remission sollte allerdings nach
Möglichkeit eine chirurgische Resektion mit dem Ziel der Tumorfreiheit
angestrebt
werden.
Durch
die
Behandlung
mit
modernen
Zweifachkombinationen kann über die komplette Remission der Erkrankung
eine Verlängerung der Überlebenszeit oder sogar eine Heilung erreicht
werden (Eilber et al., 2003). Eine signifikant bessere Wirkung der
zytostatischen
Kombinationstherapie
gegenüber
der
Therapie
mit
Monosubstanzen bei Primärtumoren konnte bisher jedoch noch nicht
nachgewiesen werden (Knight et al., 2004). Es zeigte sich keine
Verlängerung der absoluten Überlebenszeit, lediglich eine Verlängerung der
rezidivfreien Zeit (Hoos et al., 2000) (Tabelle 15).
47
Tabelle 15: Therapieschema für Kombination Ifosfamid/Doxorubicin
Ifosfamid/Doxorubicin
Ifosfamid
Doxorubicin
Mesna
(Steward et al., 1993)
5g/m²
i.v.
24-h-Infusion
Tag 1
75mg/m²
i.v.
Kurzinfusion
Tag 1
3g
i.v.
24-h-Infusion
Tag 1
1,5g
i.v.
12-h-Infusion
Tag 2
Wiederholung Tag 22 mindestens, maximal 6 Zyklen
Zeigt
die Behandlung mit Anthrazyklin-Derivaten
(Doxorubicin
oder
Epirubicin) keine Wirkung, erfolgt oftmals ein Therapieversuch mit Ifosfamid.
Studien
konnten
hier
Ansprechraten
von
bis
zu
30%
aufzeigen.
Darüberhinaus konnte die Behandlung mit hoch dosiertem Ifosfamid als
Therapieoption nach einer Vorbehandlung der Tumorerkrankung mit einer
konventionellen Ifosfamiddosis nachgewiesen werden (Ansprechraten von
bis zu 50%) (Frustaci et al., 2003; Reichardt, 2002).
Zur Zeit sind eine Vielzahl verschiedener Chemotherapeutika für die
Therapie bösartiger Weichgewebstumoren bekannt. O bwohl diese Gruppe
mehr als 50 Subtypen umfasst, werden nach wie vor viele Patienten mit den
gleichen Zytostatikaregimes behandelt. Auch der Einfluss der Lokalisation
des Tumors, sein Differenzierungsgrad und seine Größe, die die Prognose
wesentlich mitbestimmen, werden standadisiert nicht mit in die Auswahl der
Chemotherapie einbezogen (Bui et al., 2002; Donato Di Paola & Nielsen,
2002).
5.6. Neue Strategien in der Behandlung von Weichteilsarkomen
In jüngerer Zeit wurden wiederholt neue Strategien für die adäquate
Behandlung auch der einzelnen Subklassen von Weichteilsarkomen
entwickelt. Ein Beispiel ist der erfolgreiche Einsatz von Imatinib-Hydrolase,
einem
spezifischen
Tyrosinkinase-Inhibitor
48
in
der
Behandlung
von
Gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) (De Giorgi & Verweij, 2005;
Demetri, 2002; Hartmann & Patel, 2005; Ryan et al., 2002).
Weitere
vielversprechende Medikamente wie Exatecan, TZT 1027, Trofosfamid und
Topotecan sind Teil experimenteller und klinischer Studien (Budd et al.,
2002; Reichardt et al., 2003; Ruyman & Grovas, 2000; van Oosterom &
Verweij, 1995).
Ein speziell für die Behandlung von Weichteilsarkomen hoffnungsvoller
Ansatz sind die Studien mit dem Medikament ET-743 (Ecteinascidin 743),
welches in klinischen Studien Ansprechraten von bis zu 50% bei nicht
vorbehandelten und bis zu 20% bei bereits vorbehandelten Patienten aufwies
(Demetri, 2002). Mehr als 50% aller untersuchten Patienten zeigten im
Verlauf eine dauerhafte Stabilisierung ihres Krankheitsverlaufs (Bui et al.,
2002; Chao et al., 2002; Ryan et al., 2001; Svancarova et al., 2002).
5.7. Stellenwert des ATP-TCA in der Chemotherapie bei Weichteilsarkomen
Die Chemosensitivitätstestung an Weichteilsarkomen könnte aufgrund der
unbefriedigenden Ansprechraten auf Standard-Chemotherapieprotokolle um
20% zukünftig an Bedeutung gewinnen (Chao et al., 2002; Donato Di Paola
& Nielsen, 2002; Morioka et al., 2001).
Hierzu wird ein zuverlässiges in vitro Testsystem benötigt, welches genaue
Informationen über das Chemosensitivitätsprofil von Weichteilsarkomproben
liefert,
und
dessen
Ansprechverhalten
der
Ergebnisse
zusätzlich
Patienten
mit
gut
mit
dem i n v i v o
Weichteilsarkomen
auf
eine
Chemotherapie korrelieren. Zahlreiche vorangegangene experimentelle und
klinische Studien haben bewiesen, dass der ATP-TCA diese Anforderungen
erfüllen kann. In der Gynäkologischen Onkologie lieferte der ATP-TCA
Ergebnisse mit hohem Vorhersagewert für das Ansprechverhalten auf
verschiedene
metastasierten
Chemotherapieprotokolle
Mammakarzinoms
in
(Untch
der
et
al.,
Behandlung
2003)
und
des
des
rezidivierenden Ovarialkarzinom (Kurbacher et al., 2003). Die Arbeitsgruppen
49
konnten
zeigen,
dass
das
Ansprechverhalten
auf
Standard-
Zytostatikakombinationen signifikant unterschiedlich war, und dass individuell
erstellte Kombinationen teilweise bessere Ergebnisse lieferten. So zeigte
sich ein signifikant unterschiedliches Ansprechverhaltern von duktalen bzw.
lobulären Mammakarzinomen auf die gleichen Zytostatikakombinationen,
außerdem bessere Ergebnisse bei der Wirkung neuerer Zytostatika und
Zytostatikakombinationen bei Ovarialkarzinomen.
Ein weiterer Vorteil des ATP-TCA ist die hohe Reproduzierbarkeit der mit
dieser
Methode
erzielten
Ergebnisse,
die
sowohl
innerhalb
eines
Testansatzes als auch zwischen verschiedenen Testansätzen um weniger
als 15% variieren. Die Auswertung der Testansätze mit dem Luminometer ist
eine äußerst sensitive Methode und liefert präzise direkt auswertbare
Ergebnisse. Wichtig
für die Interpretation der Ergebnisse ist das
nachgewiesene selektive Wachstum maligner Zellen in einem speziellen
Kulturmedium, welches durch das mitgelieferte CAM (Complete Assay
Medium) gewährleistet ist (Cree & Kurbacher, 1999).
Auch in der vorliegenden Studie hat sich der
ATP-TCA als effektives
Verfahren zur Untersuchung der Chemosensitivität von Weichteilsarkomen
erwiesen, das in 94% der Fälle auswertbare Ergebnisse lieferte (50 der 53
Testansätze). Die erhobenen Daten zeigen, dass der ATP-TCA eine wenig
störanfällige Methode zur Einschätzung der ex vivo Chemosensitivität von
bösartigen Weichteiltumoren ist.
Die Ergebnisse
belegen, dass Weichteilsarkome ein ausgeprägt
heterogenes Antwortmuster auf die Behandlung mit Monosubstanzen und
Kombinationspräparaten zeigen. Die Unterschiede im Ansprechverhalten auf
die verschiedenen getesteten Zytostatika waren großteils signifikant. Die
Ergebnisse stehen im Einklang mit den Resultaten vorangegangener
klinischer Studien an anderen Tumoren (Coley, 1997; Le Cesne, 1995;
Mattern & Volm, 1992; Morioka et al., 2001; Murata et al., 2000) und
verdeutlichen, dass bei der Heterogenität der
Weichteilsarkome eine
Individualisierung der Chemotherapie vorteilhaft sein könnte.
50
5.8. Chemotherapie und Überlebensrate
Trotz
verschiedener
Fortschritte
in
der
Chemotherapie
von
Weichteilsarkomen konnten Zytostatikaprotokolle für neoadjuvante und
adjuvante
Chemotherapie
mit
Monosubstanzen
oder
Kombinationspräparaten die Überlebenszeit der Patienten bisher nicht
signifikant verlängern (DeLaney et al., 2003; Mori et al., 2003; Rouesse &
Tubiana-Hulin,
1988).
Einzig
die
rezidivfreie
Zeit
nach
radikaler
Tumorresektion konnte durch adjuvante Therapieformen verlängert werden.
Aufgrund durchschnittlicher Ansprechraten von nur etwa 15% - 25% (Chao et
al., 2002; Morioka et al., 2001) hat sich die Chemotherapie bisher nicht
standardisiert in der Therapie von Weichteilsarkomen etablieren können und
bleibt sowohl neoadjuvant als auch adjuvant auf klinische Studien begrenzt
(Reichardt, 2002). Bisher wird sie nur in fortgeschrittenen Stadien, bei
Vorhandensein von Fernmetastasen oder lokal nicht kurativ resektablen
Tumoren, also vor allem im palliativen Bereich, eingesetzt (Fahn et al.,
2004).
5.9. Monosubstanzen und Kombiantionspräparate
Die niedrige Inzidenz und große Heterogenität der Weichgewebssarkome
lässt eine Testung und Entwicklung neuer Chemotherapie-Regimes mit
besserer Hemmwirkung auf das Tumorzellwachstum als bisher bekannter
Therapieprotokolle schwierig erscheinen (Skubitz et al., 2004; Steinau et al.,
2001).
Eines der am häufigsten in der Therapie von Weichteilsarkomen
angewandten Monotherapie-Regimes ist die Behandlung mit Doxorubicin
(Adriamycin). Klinische Studien belegen Ansprechraten von 17% -26%, vor
allem in der Erstbehandlung (first line therapy) (Bramwell et al., 2003). In
unseren Untersuchungen war Doxorubicin mit einer hohen Sensitivität von
70% das zweitwirksamste Medikament unter den mittels ATP-TCA
getesteten Monosubstanzen. Die höchste Chemosensitivität konnten wir für
Actinomycin D belegen (74% hohe Sensitivität, keine Resistenz). Bisherige
51
klinische Studien berichteten über Ansprechraten auf die Therapie mit
Actinomycin D von durchschnittlich 17%, weshalb es als Monosubstanz in
der Chemotherapie von Weichteilsarkomen kaum Verwendung findet
(Koscielniak et al., 1999; Ruymann & Grovas, 2000).
Die Ansprechraten für Ifosfamid werden mit 24% - 50% angegeben (Cartei et
al., 2003; Frustaci et al., 2003; Phan & Patel, 2003; Schlemmer et al., 2003;
Wall & Starkhammar, 2003, van Oosterom & Verweij, 1995). Vor allem
hochdosiertes Ifosfamid (high dose ifosfamide) stellt eine Alternative in der
Therapie bereits zytostatisch vorbehandelter Weichteilsarkome dar (second
line therapy). Es werden Ansprechraten von bis zu 50% angegeben,
allerdings wird Ifosfamid dann auch als „High dose“ in wesentlich höheren
Konzentrationen verabreicht (Tursz, 1996). In unseren Untersuchungen
zeigte sich unter
Aktivität
(64%
Verwendung der Standarddosierung eine geringere
hohe
Sensitivität,
32%
Resistenz)
als
bei
den
Monosubstanzen Doxorubicin und Actinomycin D.
Interessant erscheinen die Dosisantwortkurven für die unterschiedlichen
histologischen Subtypen der untersuchten
Weichteilsarkomproben. Im
Gegensatz zur klinischen Praxis, in der kaum Unterschiede zwischen
verschiedenen Subentitäten von Weichteilsarkomen ablesen lassen, fanden
wir
bei
unseren
Antwortmuster
Chondrosarkomen.
Untersuchungen
von
signifikante
Rhabdomyosarkomen
Während
die
meisten
Abweichungen
im
und extraskelettalen
histologischen Subtypen
annähernd gleich auf Actinomycin D reagierten, zeigten Rhabdomyosarkome
eine deutlich stärkere Chemoresistenz (Abbildung 6). Weiterhin zeigten
extraskelettale Chondrosarkome eine deutlich stärkere Chemoresistenz
gegenüber Doxorubicin (Abbildung 7). Die Gründe für diese Ergebnisse sind
unklar. Vor allem Actinomycin D gehört als Monosubstanz oder in
Kombination zur Standardtherapie von Rhabdomyosarkomen im Kindesalter
und wird für die Hyperthermie bzw. Isolierte Extremitätenperfusion eingesetzt
(Koscielniak et al., 2002; Lethi et al., 1986; Ruymann, 2003; Ruymann &
Grovas 2000).
Weitere
Studien
müssen
der
Frage
nachgehen,
ob
zukünftige
Chemotherapieprotokolle die Unterschiede der histologischen Subtypen
stärker einbeziehen sollten. In Hinsicht auf unsere Studienergebnisse könnte
52
eine individualisierte Chemotherapie für Patienten mit Weichteilsarkomen zu
höheren Ansprechraten führen.
Hierzu bedarf es allerdings der Korrelation mit klinischen Daten, da nur so
der Vorteil der ATP-TCA gestützten individuellen Chemotherapie belegt
werden kann. Aufgrund des geringen Zeitfensters erfolgte eine solche
Korrelation hier nicht.
Der ATP-TCA bestätigte die starke Chemoresistenz von Weichteilsarkomen
gegenüber Vincristin, Cisplatin und Dacarbazin als Monosubstanzen, die
schon aus früheren klinischen Studien bekannt ist (Mori et al., 2003; Phan &
Patel, 2003; Reichardt, 2002).
Nach Einführung der Kombiantionschemotherapie mit Adriamycin und
Dacarbazin durch Gottlieb 1972 (Gottlieb et al., 1972) wurde das CYVADICSchema (Cyclophosphamid, Vincristin, Doxorubicin, Dacarbazin) entwickelt
und
zur
Standardtherapie
in
der
Behandlung
bösartiger
Weichgewebstumoren über mehr als ein Jahrzehnt (Frustaci et al., 1989).
Wir testeten vier verschiedene Zytostatikakombinationen, darunter die VACKombination (Vincristin, Actinomycin D, Cyclophosphamid) und die
Zweifachkombinationen aus Actinomycin D mit Ifosfamid und Doxorubicin mit
Ifosfamid. Das CYVADIC-Schema zeigte hierbei die größte Chemoresistenz
im Vergleich mit des anderen Testgruppen (Abbildung 5), während die
Kombination aus Actinomycin D und Ifosfamid die höchste Chemosensitivität
aufwies (76% hohe Sensitivität, 2% Resistenz). In der klinischen Onkologie
wird heute die Zweifachkombination aus Doxorubicin und Ifosfamid
bevorzugt (Issels et al., 2002).
5.10. Einfluss von Staging und Grading
Der ATP-TCA lieferte weiterhin interessante Ergebnisse hinsichtlich der
unterschiedlichen Differenzierungsgrade der untersuchten Tumoren (G2:
n=17, G3: n=33). Während die mäßig differenzierten Tumoren (G2) im
Durchschnitt eine relativ hohe Chemoresistenz aufwiesen, zeigten die
schlecht
differenzierten
Tumoren
(G3)
eine
signifikant
höhere
Chemosensibilität (Abbildung 8). Die Gründe für diese Ergebnisse könnten in
53
der höheren mitotischen Aktivität der G3-Tumoren liegen. Dies bestätigt die
Hypothese, dass der Differenzierungsgrad eines Tumors Einfluss auf sein
Ansprechverhalten auf eine Chemotherapie hat (van Glabbecke et al., 1999).
Der histologische Differenzierungsgrad sollte als ein Untersuchungsaspekt in
zukünftige Studien einfließen (Mori et al., 2003; van Haelst-Pisani et al.,
1991).
B e i d e n d u r c h g e f ü h r t e n Untersuchungen
fanden
sich signifikante
Unterschiede im Antwortverhalten von Primärtumoren und Tumorrezidiven.
Die Rezidivtumoren waren bei unseren Untersuchungen empfindlicher für die
getesteten
Zytostatika
als
die
Primärtumoren,
dargestellt
für
die
Monosubstanzen Actinomycin D, Doxorubicin und Ifosfamid in Abbildung 9.
Die Gründe hierfür bleiben ebenfalls unklar. Obwohl ein Auftreten von lokalen
Rezidivtumoren die Prognose der Erkrankung deutlich verschlechtert, fanden
wir eine höhere Chemosensitivität bei den Tumorrezidiven als bei den
Primärtumoren (Hoos et al., 2000; Issels et al., 2001; Issels & Schlemmer,
2002; Wang et al., 1997; Wendtner et al., 2001).
Auch hier könnte eine höhere mitotische Aktivität der Grund sein, da
Rezidive nicht selten schneller und aggressiver wachsen als die
Primärtumore (Bonvalot et al., 2004).
5.11. Einfluss des ATP-TCA auf zukünftige Studien
Neue antiproliferativ wirksame Medikamente wie Exatecan, TZT 1027 und
Trofosfamid sind mittlerweile nach Abschluss klinischer Phase II-Studien
erhältlich und bieten teilweise gute antineoplastische Aktivität durch
unterschiedliche
Wirkmechanismen
bei
einem insgesamt günstigen
Nebenwirkungsprofil (Bui et al., 2002; Chao et al., 2002; Singer et al., 2000;
van Oosterom & Verweij, 1995; Wall & Starkhammar, 2003).
Um die Entwicklung solcher Medikamente weiter voranzutreiben, kann der
ATP-TCA als einfaches und zuverlässiges In-vitro-Testsystem verwendet
werden.
In unseren Studien konnten wir zeigen, dass der ATP-TCA zur Testung der
individuellen prätherapeutischen Chemosensitivität von Weichteilsarkomen
54
geeignet ist. Dies unterstreicht, dass die Chemosensitivitätstestung
durchführbar ist und dazu genutzt werden kann, das Verständnis für das
Ansprechverhalten und die Resistenz von Weichteilsarkomen gegenüber
Zytostatika
zu
verbessern und mögliche neue Therapiestrategien zu
entwickeln.
55
6. Zusammenfassung
Einleitung und Zielsetzung
Weichteilsarkome sind eine seltene (1% aller soliden Malignome) u n d
heterogene
Gruppe
von
Erkrankungen
(mehr
als 50 Subtypen).
Gegenwärtige Standardtherapie ist die onkologiegerechte Resektion weit im
Gesunden in Kombination mit Strahlentherapie. Die Chemotherapie ist bisher
nicht erfolgreich in die Therapie aufgenommen und auf Studien beschränkt.
Nur wenige Zytostatika, unter ihnen Doxorubicin (Adriamycin), Epirubicin und
Ifosfamid, zeigen Ansprechraten über 20%. Aktuelle ChemotherapieProtokolle unterscheiden kaum hinsichtlich verschiedener histologischer Subtypen bei Erwachsenen.
Ziel der Untersuchungen war die Etablierung einer prätherapeutischen
Chemosensitivitätstestung an Weichteilsarkomen.
Material und Methoden
Zur Bewertung eines in vitro Test-Systems, welches Informationen über das
Chemosensitivitätsprofil individueller Weichteilsarkome liefern soll, haben wir
an Tumorproben von 50 Weichgewebssarkompatienten, die im Zeitraum von
August 2 0 0 2 b i s Juni 2004 an der Klinik für Plastische Chirurgie des
Universitätsklinikums Bergmannsheil Bochum operiert wurden, sieben
Zytostatika einzeln oder in verschiedenen Kombinationen und ein
Schleimhautdesinfektionsmittel (Octenisept®) mittels eines ATP-basierenden
Chemosensitivitätsassays (ATP-TCA) getestet. Das Prinzip des ATP-TCA
beruht auf der Messung des intrazellulären ATP, welches ein Parameter für
die Anzahl lebender Zellen darstellt. Das Tumorgewebe wird dazu in eine
Einzelzellsuspension überführt, für 6-7 T a ge mit den Chemotherapeutika
inkubiert und anschließend der ATP-Gehalt der Probe gemessen. Die
Chemosensitivität lässt sich direkt aus dem ATP-Gehalt ablesen und wurde
mittels eines Luziferin-Luziferase-basierenden Lumineszenzassays bewertet,
welches individuelle Chemosensitivitätsindizes für die einzelnen Zytostatika
liefert.
Die
Unterschiede
in
der
Sarkomproben waren signifikant.
56
Chemosensitivität
der
getesteten
Ergebnisse
1.)
Der ATP-TCA liefert bei Weichgewebssarkomen valide Ergebnisse.
Unsere Untersuchungen zeigen, dass die in vitro Testergebnisse auswertbar
und reproduzierbar sind.
2.)
Sowohl
für
die
Zytostatikakombinationen
Einzelmedikamente
fanden
wir
als
insgesamt
auch
für
die
unterschiedliche
Ansprechraten. Die höchste Sensitivität zeigte sich für Actinomycin D als
Einzelmedikament mit hoher Sensitivität bei 74% der Tumorproben (20%
geringe Sensitivität, keine Resistenz) und in Kombination mit Ifosfamid (76%
hohe Sensitivität, 2% Resistenz), gefolgt von Doxorubicin (Adriamycin) (70%
hohe Sensitivität, 6% Resistenz) einzeln oder in Kombination mit Ifosfamid
(72% hohe Sensitivität, 6% Resistenz). Dabei zeigten sich für diese
Zweifachkombination bessere Ansprechraten als für die etablierten
Standardtherapien wie die CYVADIC- (66% hohe Sensitivität, 4% Resistenz)
oder die VAC-Kombination (70% hohe Sensitivität, 6% Resistenz).
3.) Es ließen sich signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen
untersuchten
histologischen
Subtypen
ermitteln.
Die
getesteten
Rhabdomyosarkome des Erwachsenenalters wiesen eine signifikant höhere
Chemoresistenz gegen Actinomycin D auf als die anderen getesteten
Subentitäten. Gegen Doxorubicin zeigten die getesteten extraskelettalen
Chondrosarkome eine höhere Resistenz als die anderen getesteten
Weichgewebssarkome.
4.) Es fanden sich signifikante Unterschiede in der Chemosensitivität von
Tumoren verschiedener Differenzierung (GII vs. GIII). Im Vergleich der
Ansprechraten gegenüber Actinomycin D, Doxorubicin und Ifosfamid wiesen
die niedrig differenzierten Tumoren insgesamt höhere Ansprechraten als die
mäßig differenzierten Tumoren auf.
5.) Im Vergleich von Primärtumoren mit Tumorrezidiven zeigte sich ein
höheres
Ansprechverhalten
der
Rezidivtumoren
Primärtumoren.
57
gegenüber
den
Schlussfolgerung
Die Chemosensitivitätstestung ist bei Weichteilsarkomen durchführbar. Sie
kann verwendet werden, um unser Verständnis für das Ansprechen oder die
Resistenz
einer
Chemotherapie
zu
verbessern,
oder
neue
Zytostatikakombinationen zu entwickeln. Die vorliegenden Daten lassen
weiterhin erkennen, dass der ATP-TCA zur Identifizierung solcher Patienten
verwendet werden kann, die möglicherweise von einer individuell
angepassten zytostatischen Therapie profitieren. Ziel der klinischen
Onkologie sollte es nun sein, die Voraussetzungen für die Weiterentwicklung
des Konzeptes der prätherapeutischen Chemosensitivitätstestung im
klinischen Alltag zu schaffen.
58
7. Literaturverzeichnis
AJCC Cancer Staging Manual (1997). 5th Edition, Lippincott-Raven,
Philadelphia, New York
Andreotti, P.E., Cree, I.A., Kurbacher, C.M., Hartmann, D.M., Linder, D.,
Harel, G., Gleiberman, I., Caruso, P.A., Ricks, S.H., Untch, M. & et al. (1995).
Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine
triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance
of ovarian carcinoma. Cancer Res, 55, 5276-82.
Andreotti, P.E., Thornthwaite, J.T., Morse, I.S. (1991). ATP Tumor
Chemosensitivity Assay. In: Stanley, P.E., L.J. Kricka (eds.) Bioluminescence
and Chemoluminescence: Current Status. Chichester, J. Willey & Sons 417420.
Baker, F.L., Spitzer, G., Ajani, J.A., Brock, W.A., Lukeman, J., Pathak, S.,
Tomasovic, B., Thilvoldt, D., Williams, M., Vines, C., Tofilon, P. (1986). Drug
and radiation sensitivity measurements of succesfull primary monolayer
culturing of human tumor cells using cell-adhesive matrix and supplemened
medium. Cancer Res. 46, 1263-1274.
Bellamy, W.T. (1992). Prediction of Response to Drug Therapy of Cancer, A
Review of In Vitro Assays. Drugs 44, 5: 690-708.
Bonvalot, S., Vanel, D., Terrier, P., Robert, C., Le Cesne, A., Le Pechoux, C.
(2004). Management of recurrent soft tissue sarcoma of the retroperitoneum.
Bull Cancer 91 , 11: 845-52.
Bramwell, V.H., Anderson, D. & Charette, M.L. (2003). Doxorubicin-based
chemotherapy for the palliative treatment of adult patients with locally
advanced or metastatic soft tissue sarcoma. Cochrane Database Syst Rev,
CD003293.
59
Brady, M.S., Gaynor, J.J., Brennan, M.F. (1992). Radiation-associated
sarcoma of bone and soft tissues. Arch Surg 127:1379-1385.
Bronzwaer, S., Lonnroth, A., Haigh R. (2004). The European Community
strategy against antimicrobial resistance. Euro Surveill, 9, 1: 1-3.
Budd, G.T., Rankin, C., Hutchins, L.F., Wong, L., Petruska, P.J. & Antman,
K. (2002). Phase II trial of topotecan by continuous infusion in patients with
advanced soft tissue sarcomas, a SWOG study. Southwest Oncology Group.
Invest New Drugs, 20, 129-32.
Bui, B.N., Tabrizi, R., Dagada, C., Trufflandier, N., St ckle, E. & Coindre, J.M.
(2002). Update on soft tissue sarcomas. Bull Cancer, 89, 100-7.
Cartei, G., Clocchiatti, L., Sacco, C., Pella, N., Bearz, A., Mantero, J.,
Pastorelli, D., Salmaso, F & Zustovich, F. (2003). Dose finding of ifosfamide
administered with a chronic two-week continuous infusion. Oncology, 65, 316.
Chao, C., McMasters, K.M. & Edwards, M.J. (2002). Advances in the
treatment of soft-tissue sarcomas. J Ky Med Assoc, 100, 10-6.
Chung, E.S., Sabel, M.S., Sondak, V.K. (2004). Current state of treatment for
primary cutaneous melanoma. Clin Exp Med, 4, 2: 65-77.
Coindre, J.M., Terrier, Ph., Binh Bui, N. (1996). Prognostic factors in adult
Patients with locally controlled soft tissue sarcoma: A study of 546 Patients
from the French Federation of Cancer Center Sarcoma Group. J Clin 14 (3):
869-877
Coley, H.M. (1997). Drug resistance studies using fresh human ovarian
carcinoma and soft tissue sarcoma samples. Keio J Med, 46, 142-7.
60
Cormier, J.N., Pollock, R.E. (2004). Soft tissue sarcomas. CA Cancer J Clin,
54, 2: 94-109.
Cree, I.A. & Kurbacher, C.M. (1999). ATP-based tumor chemosensitivity
testing: assisting new agent development. Anticancer Drugs, 10, 431-5.
DeGiorgi,U., Verweij, J. (2005). Imatinib and gastrointestinal stromal tumors:
Where do we go from here? Mol Cancer Ther., 4(3): 495-501.
DeLaney, T.F., Spiro, I.J., Suit, H.D., Gebhardt, M.C., Hornicek, F.J., Mankin,
H.J., Rosenberg, A.L., Rosenthal, D.I., Miryousefi, F., Ancukiewicz, M. &
Harmon, D.C. (2003). Neoadjuvant chemotherapy and radiotherapy for large
extremity soft-tissue sarcomas. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 56, 1117-27.
Demetri, G.D. (2002). ET-743: the US experience in sarcomas of soft tissues.
Anticancer Drugs, 13 Suppl 1, S7-9.
Donato Di Paola, E. & Nielsen, O.S. (2002). The EORTC soft tissue and
bone sarcoma group. Eur J Cancer, 38 Suppl 4, 138-41.
Eilber, F.C., Eilber, F.R., Eckardt, J., Rosen, G., Riedel, E., Maki, R.G.,
Brenner, M.F., Singer, S. (2004). The impact of chemotherapy on the survival
os patients with high grade primary extremity liposarcoma. Ann Surg, 240, 4:
686-95, discussion 695-7.
Fahn, W., Issels, R.D. (2004). Emerging treatments for soft tissue sarcoma of
adults. Expert Opin Emerg Drugs, 9, 313-34.
Fernberg, J.O., Hall, K.S. (2004). Chemotherapy in soft tissue sarcoma. The
Scandinavian Sarcoma Group experience. Acta Orthop Scand Suppl., 75,
311: 77-86.
61
Frustaci, S., De Paoli, A., Bidoli, E., La Mura, N., Berretta, M., Buonadonna,
A., Boz, G. & Gherlinzoni, F. (2003). Ifosfamide in the adjuvant therapy of
soft tissue sarcomas. Oncology, 65, 80-4.
Frustaci, S., Foladore, S., Buonadonna, A., De Paoli, A., Crivellari, D.,
Carbone, A., Sorio, R., Morassut, S. & Monfardini, S. (1993). Epirubicin and
ifosfamide in advanced soft tissue sarcomas. Ann Oncol, 4, 669-72.
Frustaci, S., Gherlinzoni, F., De Paoli, A., Bonetti, M., Azzarelli, A.,
Comandone, A., Olmi, P., Buonadonna, A., Pignatti, G., Barbieri, E., Apice,
G., Zmerly, H., Serraino, D. & Picci, P. (2001). Adjuvant chemotherapy for
adult soft tissue sarcomas of the extremities and girdles: results of the
Italian randomized cooperative trial. J Clin Oncol, 19, 1238-47.
Frustaci, S., Lo Re, G., Crivellari, D., De Paoli, A., Galligioni, E., Franchin, G.,
Tumolo, S. & Monfardini, S. (1989). Retrospective analysis of the CYVADIC
regimen in advanced soft tissue sarcomas. Tumori, 75, 1525.
Gottlieb, J.A., Baker, L.H., Quagliana, J.M., Luce, J.K., Whitecar, J.P., Jr.,
Sinkovics, J.G., Rivkin, S.E., Brownlee, R. & Frei, E., 3rd. (1972).
Chemotherapy of sarcomas with a combination of adriamycin and dimethyl
triazeno imidazole carboxamide. Cancer, 30, 1632-8.
Gravis, G., Mousseau, M., Douillard, J.Y., Dorval, T., Fabbro, M., Escudier,
B., Mignot, L. & Viens, P. (2001). Can interleukin-2 reverse anthracyclin
chemoresistance in metastatic soft tissue sarcoma patients. Results of a
prospective phase II clinical trial. Eur Cytokine Netw, 12, 239-43.
Gravis, G., Viens, P., Delva, R., Baume, D., Blaise, D., Ternier, F.,
Houvenaeghel, G., Brandely, M., Resbeut, M. & Maraninchi, D. (1998). rIL-2
in metastatic soft tissue sarcomas refractory to chemotherapy: response and
enhancement of further chemosensitivity. Anticancer Res, 18, 3699-704.
62
Hamburger, A.W., Salmon, S.E. (1977). Primary bioassay of human tumor
stern cells. Science, 197, 161-163.
Hartmann, J.T., Patel, S. (2005). New drug developments for patients with
metastatic soft tissue sarcoma. Curr Oncol Rep, 7(4): 300-6.
Hoos, A., Lewis, J.J. & Brennan, M.F. (2000). Weichgewebssarkome:
Prognostische Faktoren und Multimodale Behandlung. Chirurg, 71, 787-94.
Hunter, E.M., Sutherland, L.A., Cree, I.A., Dewar, J.A., Preece, P.E.,
Andreotti, P.E. (1993). Heterogenity of chemosensitivity in human breast
carcinoma: use of an adenosine triphosphate (ATP) chemoluminescence
assay. European Journal of Surgical Oncology 19, 242-249.
Hunter, E.M., Sutherland, L.A., Cree, I.A., Subedi, A.M.C., Hartmann, D.,
Linder, D., Andreotti, P.E. (1994). The influence of storage on cytostatic drug
activity in an ATP-based chemosensitivity assay. Anti-Cancer Drugs 5, 171176.
Issels, R.D., Abdel-Rahman, S., Wendtner, C., Falk, M.H., Kurze, V., Sauer,
H., Aydemir, U. & Hiddemann, W. (2001). Neoadjuvant chemotherapy
combined with regional hyperthermia (RHT) for locally advanced primary or
recurrent high-risk adult soft-tissue sarcomas (STS) of adults: long-term
results of a phase II study. Eur J Cancer, 37, 1599-608.
Issels, R.D. & Schlemmer, M. (2002). Current trials and new aspects in soft
tissue sarcoma of adults. Cancer Chemother Pharmacol, 49 Suppl 1, S4-8.
Kawaguchi, N., Ahmed, A.R., Matsumoto, S., Manabe, J., Matsushita, Y.
(2004). The concept of curative margin in surgery for bone and soft tissue
sarcoma. Clin Orthop, 419: 165-72.
Kawamura, H., Ikeda, K., Takiyama, I., Terashima, M. (1997). The
usefulness of the ATP assay with a serum-free culture for chemosensitivity
testing of gastrointestinal cancer. Eur J Cancer, 33 (6), 960-966.
63
Kern, D.H., Drogemuller, C.R., Kennedy, M.C., Hildebrand-Zanki, S.U.,
Tanigawa, N., Sondak, V.K. (1985). Development of a miniturized, improved
nucleic acid-precurser incorporation assay using suprapharmacologic drug
exposures. Cancer Research, 45, 5436-5441
Kim, R., Emi, M., Tanabe, K., Uchida Y., Toge, T. (2003). Chemosensitivity
testing for gastrointestinal cancer: survival benefit potential and limitations.
Anticancer Drugs, 14, 9:715-23.
Knight, L.A., Di Nicolantonio, F., Whitehouse, P., Mercer, S., Sharma, S.,
Glaysher, S., Johnson, P., Cree, I.A. (2004). The in vitro effect of gefinitib
('Iressa') alone and in combination with cytotoxic chemotherapy on human
solid tumors. BMC Cancer, 4, 1:83
Koscielniak, E., Harms, D., Henze, G., Jurgens, H., Gadner, H., Herbst, M.,
Klingebiel, T., Schmidt, B.F., Morgan, M., Knietig, R. & Treuner, J. (1999).
Results of treatment for soft tissue sarcoma in childhood and adolescence: a
final report of the German Cooperative Soft Tissue Sarcoma Study CWS-86.
J Clin Oncol, 17, 3706-19.
Koscielniak, E., Morgan, M. & Treuner, J. (2002). Soft tissue sarcoma in
children: prognosis and management. Paediatr Drugs, 4, 21-8.
Kurbacher, C.M., Grecu, O.M., Stier, U., Gilster, T.J., Janat, M.M., Untch, M.,
Konecny, G., Bruckner, H.W. & Cree, I.A. (2003). ATP chemosensitivity
testing in ovarian and breast cancer: early clinical trials. Recent Results
Cancer Res, 161, 221-30.
Kurbacher, C.M., Mallmann, P., Kurbacher, J.A., Hubner, H. & Krebs, D.
( 1 9 9 6 ) . Chemosensitivitätstestung in der Gynäkologischen Onkologie.
Erfahrungen
mit
einem A T P
Biolumineszenzassay.
Frauenheilkd, 56, 708.
64
Geburtshilfe
Langer, E. (2001). Dissertation über die Prätherapeutische Zytostatikatestung mit dem Adenosintriphosphat-Tumorchemosensitivitätsassay beim
Mammakarzinom. Ludwig-Maximilians-Universität, München.
Le Cesne, A. (1995). Chemotherapy of metastatic soft tissue sarcoma.
Presse Med, 24, 1214 20. Lehti, P.M., Moseley, H.S., Janoff, K., Stevens, K.
& Fletcher, W.S. (1986). Improved survival for soft tissue sarcoma of the
extremities by regional hyperthermic perfusion, local excision and radiation
therapy. Surg Gynecol Obstet, 162, 149-52.
Mattern, J. & Volm, M. (1992). Prediction of drug resistance in human tumors
using immunohistochemical techniques. Anticancer Res, 12, 413-8.
Mercer, S.J., Somers, S.S., Knight, L.A., Whitehouse, P.A., Sharma, S., Di
Nicolantonio, F., Glaysher, S., Toh, S. & Cree, I.A. (2003). Heterogeneity of
chemosensitivity of esophageal and gastric carcinoma. Anticancer Drugs, 14,
397-403.
Mori, S., Apice, G., Ottaiano, A., De Chiara, A., Germano, A., Botti, G., De
Rosa, V., Ravo, V., Morrica, B. & Mozzillo, N. (2003). Role of neoadjuvant
chemotherapy in intermediate/high-grade soft-tissue sarcomas in the adult.
Tumori, 89, 267-8.
Morioka, H., Yabe, H., Morii, T., Yamada, R., Kato, S., Yuasa, S. & Yano, T.
(2001). In vitro chemosensitivity of human soft tissue sarcoma. Anticancer
Res, 21, 4147-51.
Murata, H., Kusuzaki, K., Takeshita, H., Hirata, M., Hashiguchi, S., Emoto,
K., Ashihara, T. & Hirasawa, Y. (2000). Assessment of chemosensitivity in
patients with malignant bone and soft tissue tumors using thallium-201
scintigraphy and doxorubicin binding assay. Anticancer Res, 20,
3967-70.
65
Myatt, N., Cree, I.A., Kurbacher, C.M., Foss, A.J., Hungerford, J.L. &
Plowman, P.N. (1997). The ex vivo chemosensitivity profile of choroidal
melanoma. Anticancer Drugs, 8, 756-62.
Neale, M.H., Myatt, N., Cree, I.A., Kurbacher, C.M., Foss, A.J., Hungerford,
J.L., Plowmann, P.N. (1999). Combination Chemotherapy for choroidal
melanoma: ex vivo sensitivity to trosulfan with gemcitabine or cytosin
arabinoside. Br J Cancer Mai, 79 (9-10), 1487-93.
Neale, M.H., Myatt, M.E., Khoury, G.G., Weaver, P., Lamont, A., Hungerford,
J.L., Kurbacher, C.M., Hall, P., Corrie, P.G., Cree, I.A. (2001). Comparison of
the ex vivo chemosensitivity of uveal and cutaneous melanoma. Merlanoma
Res, 11, 6:601-9.
Neuber, K., tom Dieck, A., Blodorn-Schlicht, N., Itschert, G., Karnbach C.
(1999). Treosulfan is an effective alkylating cytostatic for malignant
melanoma in vitro and in vivo. Melanoma Resp Apr, 9 (2), 125-132.
Nielsen, T.O., West, R.B., Linn, S.C., Alter, O., Knowling, M.A., O'Connell,
J.X., Zhu, S., Fero, M., Sherlock,G., Pollack, J.R., Brown, P.O., Botstein, D.
& van de Rijn, M. (2002). Molecular characterisation of soft tissue tumours: a
gene expression study. Lancet, 359, 1301-7.
Norton L. (1999). Adjuvant breast cancer therapy: current status and future
strategies -- growth kinetics and the improved drug therapy of breast cancer.
Semin Oncol, 26 (1 Suppl 3): 1-4.
O'Meara, A.T., Sevin, B.U. (2001). Predictive value of the ATP
chemosensitivity assay in epithelian ovarian cancer. Gynecol Oncol, 8, 33442.
Phan, A. & Patel, S. (2003). Advances in neoadjuvant chemotherapy in soft
tissue sarcomas. Curr Treat Options Oncol, 4, 433-9.
66
Ramanathan, R.C., A'Hern, R., Fisher, C., Thomas, J.M. (1999). Modified
staging system for extremity soft tissue sarcomas. Ann Surg Oncol, 6, 1: 5769.
Reichardt, P. (2002). High-dose chemotherapy in adult soft tissue sarcoma.
Crit Rev Oncol Hematol, 41,157-67.
Reichardt, P., Oechsle, K., Pink, D., Bokemeyer, C., Schneller, F., Issels, R.,
Kanz, L. & Hartmann, J.T. (2003). An open label, non-comparative phase II
study of topotecan as salvage treatment for patients with soft tissue sarcoma.
Invest New Drugs, 21, 481-6.
Rotman, B., Teplitz, C., Dickinson, K. (1988). Individual human tumors in
short-term micro-organ cultures: chemosensitivity testing by fluorescent
cytoprinting. In Vitro Cell. Dev. Biol., 38, 1137-1145
Rouesse, J. & Tubiana-Hulin, M. (1988). Chemotherapy of sarcomas in the
adult. Bull Cancer, 75, 483-92
Ruymann, F.B. (2003). The development of VAC chemotherapy in
rhabdomyosarcoma: what does one do for an encore? Curr Oncol Rep, 5,
505-9.
Ruymann, F.B. & Grovas, A.C. (2000). Progress in the diagnosis and
treatment of rhabdomyosarcoma and related soft tissue sarcomas. Cancer
Invest, 18, 223-41.
Ryan, D.P., Puchalski, T., Supko, J.G., Harmon, D., Maki, R., GarciaCarbonero, R., Kuhlman, C., Winkelman, J., Merriam, P., Quigley, T.,
Jimeno, J., Manola, J. & Demetri, G.D. (2002). A phase II and
pharmacokinetic study of ecteinascidin 743 in patients with gastrointestinal
stromal tumors. Oncologist, 7, 531-8.
67
Ryan, D.P., Supko, J.G., Eder, J.P., Seiden, M.V., Demetri, G., Lynch, T.J.,
Fischman, A.J., Davis, J., Jimeno, J. & Clark, J.W. (2001). Phase I and
pharmacokinetic study of ecteinascidin 743 administered as a 72-hour
continuous intravenous infusion in patients with solid malignancies. Clin
Cancer Res, 7, 231-42.
Schlemmer, M., Wendtner, C.M. & Issels, R.D. (2003). Ifosfamide with
regional hyperthermia in soft-tissue sarcomas. Oncology, 65, 76-9.
Sevin, B.U., Peng, Z.L., Perras, J.P., Ganjei, P., Penalver, M., Averette, H.E.
(1988). Application of an ATP-Bioluminescence assay in human tumor
chemosensitivity testing. Gynecol Oncol, 31, 191-204.
Sharma, S., Neale, M.H., Nicolantonio, D.F., Knight, L.A., Whitehouse, P.A.,
Mercer, S.J., Higgins, B.R., Lamont, A., Osborne, R., Hindley, A.C.,
Kurbacher, C.M. & Cree, I.A. (2003). Outcome of ATP-based tumor
chemosensitivity assay directed chemotherapy in heavily pretreated recurrent
ovarian carcinoma. BMC Cancer, 3, 19.
Singer, S., Demetri, G.D., Baldini, E.H. & Fletcher, C.D. (2000). Management
of soft-tissue sarcomas: an overview and update. Lancet Oncol, 1, 75-85.
Skubitz, K.M., Skubitz, A.P. (2004). Characterization of sarcomas by means
of gene expression. J Lab Clin Med., 144, 2: 78-91.
Steinau, H.U., Homann, H.H., Drucke, D., Torres, A., Soimaru, D. & Vogt, P.
(2001).
Resektionsmethodik
und
funktionelle
Wiederherstellung
bei
Weichgewebssarkomen der Extremitäten. Chirurg, 72, 501-13.
Steward, W.P., Verweij, J.,Somers, R. (1993). Granolucyte-macrophage
colony-stimulating factor allows safe escalation of dose-intensity of
chemotherapy in metastatic soft tissue sarcoma: A study of the European
organization for research an treatment of cancer in soft tissue an bone
sarcoma group. J Clin Oncol, 11, 15-21.
68
Stoeckle, E., Kantor, G., Thomas, L., Coindre J.M., Bui B.N. (2004). [Surgery
of recurrent soft tisuue sarcoma of the extremities and the trunk wall: a
comparison to primary sarcoma]. Bull Cancer, 91, 11: 853-60.
Stone, A., Cooper, J., Koenig, K.L., Golfinos, J.G., Oratz, R. (2004). A
comparison of survival rates for treatment of melanoma metastatic to the
brain. Cancer Invest, 22, 4:492-7.
Svancarova, L., Blay, J.Y., Judson, I.R., van Hoesel, Q.G., van Oosterom,
A.T., le Cesne, A., Keizer, H.J., Hermans, C., van Glabbeke, M., Verweij, J.,
Hogendoorn, P.C. & Nielsen, O.S. (2002). Gemcitabine in advanced adult
soft-tissue sarcomas. A phase II study of the EORTC Soft Tissue and Bone
Sarcoma Group. Eur J Cancer, 38, 556-9.
Toguchida, J., Toshikazu, Y., Dayton, S.H. (1992). Prevalence an spectrum
of germline mutations of the p53 gene among patients with sarcoma. N Engl
J Med, 326, 1301-1308.
Tursz, T. (1996). High-dose ifosfamide in the treatment of advanced soft
tissue sarcomas. Semin Oncol, 23, 34-9.
Untch, M., Ditsch, N., Langer, E., Kurbacher, C., Crohns, C., Konecny, G.,
Kahlert, S., Bauerfeind, I. & Hepp, H. (2003). Chemosensitivity testing in
gynecologic oncology--dream or reality? Recent Results Cancer Res, 161,
146-58.
Untch, M., Sevin, B.U., Untch, A., Konecny, G., Nestle-Kramling, C., Korell,
M. & Hepp, H. (1993). Chemosensitivitätstestung in Karzinomzellinien und
gynäkologischen Tumoren mit dem ATP-Assay. Gynakol Geburtshilfliche
Rundsch, 33, 311-3.
van Glabbecke M., van Oosterom, A.T., Oosterhuis, J.W., Mouridsen, H.,
Crowther, D., Somers, R., Verweij, J., Santoro, A., Buesa, J., Tursz, T.
69
(1999). Prognostic factors for the outcome ofchemotherapy in advanced soft
tissue sarcoma: an analysis of 2,185 patients treated with anthracyclinecontaining first-line regimens--a European Organization for Research of
Cancer Soft Tissue and Bone Sarcoma Group Study. J Clin Oncol,17 (1),
150-7.
van Haelst-Pisani, C.M., Buckner, J.C., Reiman, H.M., Schaid, D.J.,
Edmonson, J.H. & Hahn, R.G. (1991). Does histologic grade in soft tissue
sarcoma influence response rate to systemic chemotherapy? Cancer, 68,
2354-8.
van Oosterom, A.T. (1998). Final results of a randomized phase II study of
the EORTC soft tissue and bone sarcoma (STSBS) group comparing two
different ifosfamide (IF) regimes in chemotherapy untreated advanced soft
tissue sarcoma (STS) patients (pts.). Proc Am Soc Clin Oncol, 5520.
van Oosterom, A.T. & Verweij, J. (1995). New drugs for the treatment of
sarcomas. Hematol Oncol Clin North Am, 9, 909-25.
Wall, N. & Starkhammar, H. (2003). Chemotherapy of soft tissue sarcoma--a
clinical evaluation of treatment over ten years. Acta Oncol, 42, 55-61.
Wang, Y., Liu, S. & Mo, S. (1997). Management and prognosis of patients
with locally recurrent soft tissue sarcomas. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi, 19,
231-4.
Weisenthal, L.M., Kern, D.H. (1991). Prediction of drug resistance in cancer
therapy: The Kern and DISC assays. Oncology, 5, 93-101.
Wendtner, C., Abdel-Rahman, S., Baumert, J., Falk, M.H., Krych, M., Santl,
M., Hiddemann, W. & Issels, R.D. (2001). Treatment of primary, recurrent or
inadequately resected high-risk soft-tissue sarcomas (STS) of adults: results
of a phase II pilot study (RHT-95) of neoadjuvant chemotherapy combined
with regional hyperthermia. Eur J Cancer, 37, 1609-16.
70
Whitehouse, P.A., Knight, L.A., Di Nicolantonio, F., Mercer, S.J., Sharma, S.
& Cree, I.A. (2003a). Heterogeneity of chemosensitivity of colorectal
adenocarcinoma
determined
by
a
modified
ex
vivo
ATP
tumor
chemosensitivity assay (ATP-TCA). Anticancer Drugs, 14, 369-75.
Whitehouse, P.A., Mercer, S.J., Knight, L.A., Di Nicolantonio, F.,
O'Callaghan, A. & Cree, I.A (2003b). Combination chemotherapy in
advanced gastrointestinal cancers: ex vivo sensitivity to gemcitabine and
mitomycin C. Br J Cancer, 89, 2299-304.
71
8. Lebenslauf
Persönliches
Name:
Vorname:
Geburtsdatum:
Adresse:
Familienstand:
Staatsangehörigk.:
Brett
Daniel Stephan James
30.10.78
Schnatstr. 18 b
D-44795 Bochum
ledig
Deutsch
Schulische Ausbildung
1984 – 1988
1988 – 1997
26.05.1997
Dietrich Bonhoeffer-Grundschule, Bochum
Märkisches Gymnasium, Bochum-Wattenscheid
Zeugnis der Allgemeinen Hochschulreife
01.07.1997 – 31.07.1998 Zivildienst in der Zentralen Notfallaufnahme der
Berufsgenossenschaftlichen Kliniken
Bergmannsheil, Bochum
Akademische Ausbildung
seit 01.10.1998
11.09.2000
28.08.2001
22.09.2003
Studium der Humanmedizin an der
Ruhruniversität Bochum
Zeugnis über die Ärztliche Vorprüfung
Zeugnis über der Ersten Abschnitt der Ärztlichen
Prüfung
Zeugnis über den Zweiten Abschnitt der Ärztlichen
Prüfung
20.10.2003 - 19.09.2004 Praktisches Jahr
1. Tertial
Innere Medizin
Medizinische Klinik, Pneumologie, Berufsgenossenschaftliche Kliniken Bergmannsheil, Bochum
(Prof. Dr. med. G. Schulze-Werninghaus)
2. Tertial
Chirurgie
Chirurgische Universitäts- und Poliklinik, Berufsgenossenschaftliche Kliniken Bergmannsheil,
Bochum (Prof. Dr. med. G. Muhr)
3. Tertial
Plastische Chirurgie
Klinik für Plastische Chirurgie, Berufsgenossenschaftliche Kliniken Bergmannsheil, Bochum
(Prof. Dr. med. H.-U. Steinau)
30.11.2004
Approbation als Arzt
72
seit 15.12.2004
Wissenschaftlicher Mitarbeiter in der Chirurgischen Klinik und Poliklinik der BG-Kliniken Bergmannsheil Bochum, Universitätsklinik
73