Aus der Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte, Handchirurgiezentrum der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil - Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. Hans-Ulrich Steinau Prätherapeutische Zytostatikatestung mittels ATPTumorchemosensitivitätsassay (ATP-TCA) bei Weichgewebssarkomen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Daniel Stephan James Brett aus Bochum 2005 Dekan: Prof. Dr. med. Gert Muhr Referent: Prof. Dr. med. Hans-Ulrich Steinau Korreferent: PD Dr. med. Holger Sudhoff Tag der mündlichen Prüfung: 07. Februar 2006 2 Inhaltsverzeichnis Verwendete Abkürzungen 5 1. Einleitung 7 1.1. Einführung 7 1.2. Entwicklung der prätherapeutischen Zytostatikatestung 8 1.3. Entscheidung für den ATP-TCA 9 2. Fragestellung der Arbeit 12 3. Material und Methoden 13 3.1. Tumormaterial 13 3.2. Patientenkollektiv 13 3.3. Probengewinnung 14 3.4. Der Adenosintriphosphat-Tumorchemosensitivitätsassay (ATP-TCA) 15 3.4.1. Prinzip des ATP-TCA 15 3.4.2. Inhalt des Testbestecks 16 3.4.3. Vorbereitung der Proben 17 3.4.4. Vorbereitung der Zytostatika 17 3.4.5. Verteilung der Tumorzellen auf die Platten 19 3.4.6. Extraktion und Messung 19 3.4.7. ATP-Standardkurve 19 3.4.8. Auswertung 20 3.4.9. Interpretation der Testergebnisse 22 3.5. Verwendete Zytostatika 22 3.6. Statistik 24 4. Ergebnisse 25 4.1. Testsystem des ATP-TCA 25 4.1.1. Auswertbarkeit des ATP-TCA 25 3 4.1.2. Testversager 25 4.1.3. Dosisantwortkurven 26 4.2. Monosubstanzen 27 4.3. Zytostatikakombinationen 30 4.4. Octenidin-Hydrochlorid (Octenisept®) 32 4.5. Chemosensitivität unterschiedlicher Subentitäten von Weichteilsarkomen 32 4.6. Chemosensitivität von Weichteilsarkomen unterschiedlichen Differenzierungsgrades 35 4.7. Unterschiede in der Chemosensitivität von Primärtumoren und Tumorrezidiven 36 4.8. Individualität der Ergebnisse des ATP-TCA 38 5. Diskussion 42 5.1. Epidemiologie, Ätiologie, Risikofaktoren und Pathomorphologie Von Weichteilsarkomen 42 5.2. Stadieneinteilung von Weichteilsarkomen 43 5.3. Prognose von Weichteilsarkomen 45 5.4. Therapie von Weichteilsarkomen 45 5.5. Chemotherapie bei Weichteilsarkomen 46 5.6. Neue Strategien in der Behandlung von Weichteilsarkomen 48 5.7. Stellenwert des ATP-TCA in der Chemosensitivitätstestung bei Weichteilsarkomen 49 5.8. Chemotherapie und Überlebensrate 51 5.9. Monosubstanzen und Kombinationspräparate 51 5.10. Einfluss von Staging und Grading 53 5.11. Einfluss des ATP-TCA auf zukünftige Studien 54 6. Zusammenfassung 56 7. Literaturverzeichnis 59 8. Lebenslauf 72 4 Verwendete Abkürzungen ADP Adenosindiphosphat AMP Adenosinmonophosphat ATP Adenosintriphosphat AJCC American Joint Committee on Cancer AUIC Area Under Inhibition Curve bzw. beziehungsweise CAM Complete Assay Medium CYVADIC Zytostatikakombination (Cyclophosphamid, Vincristin, Doxorubicin, Dacarbazin) IC Inhibitory Concentration i.v. intravenös G Grading Gy Gray h Stunde lg logarithmisch M0 Kontrolle ohne Zytostatikazusatz MI Maximum Inhibitor mg Milligramm ml Milliliter MPNST Maligner Peripherer Nervenscheidentumor µg Mikrogramm ng Nanogramm NOS not otherwise specified p p-Wert PPC Plasma Peak Concentration RLU Relative Light Units SI Sensitivitätsindex TCA Tumor Chemosensitivity Assay TDC Test Drug Concentration TGI Tumor Growth Inhibition pTNM postoperative Tumorklassifikation (T=Primärtumor, N=Lymphknoten, M=Fernmetastasierung) 5 U Unit ÜF Überlebensfraktion UICC Union Internationale Conter le Cancer VAC Zytostatikakombination (Vincristin, Actinomycin D, Cyclophosphamid) vs. versus 6 1. Einleitung 1.1. Einführung Seit vielen Jahren ist die Sensitivitäts- und Resistenzbestimmung von Mikroorganismen in der Therapie von Infektionskrankheiten verwirklicht (Bronzwaer et al., 2004). Eine individuelle, patientenbezogene Chemotherapie bei Tumorerkrankungen konnte sich bis heute nicht etablieren. Obwohl geeignete Testverfahren mittlerweile zur Verfügung stehen, hat sich die prätherapeutische Zytostatikatestung im klinischen Alltag bisher nicht durchsetzen können und bleibt auf Studien bzw. wenige Entitäten, wie das rezidivierende Mammakarzinom, beschränkt (Norton et al., 1999). Mit ca. 1-2% Anteil an allen malignen Neoplasien, einer Inzidenz von 2-6 auf 100.000 Einwohner (2.500-3.000 Neuerkrankungen/Jahr in der BRD) und einem Auftreten von bundesweit ca. 600 Lokalrezidiven jährlich stellen Weichgewebssarkome eine seltene Tumorerkrankung dar, die darüber hinaus eine große Heterogenität, sowohl in Bezug auf ihre Morphologie, als auch im Hinblick auf ihr biologisches Verhalten zeigt (Singer et al., 2000). Es existieren zahlreiche Entitäten von Weichgewebssarkomen, die sich ihrerseits in verschiedene Subtypen unterteilen. Die Gesamtzahl beläuft sich auf über 50 (Enzinger et al., 2001). Die onkologisch adäquate Resektion weit im Gesunden (R0-Resektion) stellt die wichtigste Maßnahme im multidisziplinären Behandlungskonzept der Weichteilsarkome dar (Enzinger & Weiss, 2001). Während noch vor zwei Jahrzehnten hauptsächlich die Amputation der betroffenen Extremität im Vordergrund der Therapie stand, ergaben nachfolgend durchgeführte, extremitätenerhaltende Kompartmentund Kompartimentresektionen identische Überlebensraten (Colucci 1998; Singer et al., 1995; Steinau et al., 1985; Steinau et al., 1988a; Steinau et al., 2001; Valle & Kraybill, 1996). Neoadjuvante und adjuvante Chemotherapien zeigen bei Weichteilsarkomen durchschnittliche Ansprechraten nicht über 1520% und werden deshalb standardisiert im Erwachsenenalter nicht eingesetzt (Clarkson & Ferguson, 2004; Cormier et al., 2004c; Reichardt 2002a). In der mehr als 50 Subtypen umfassenden Gruppe der 7 Weichteilsarkome gehört eine solche Testung bisher nicht zum Standard (Chao et al., 2002). Dies liegt neben der Seltenheit dieser Tumoren vor allem an den relativ schlechten Ansprechraten auf verschiedenste Zytostatika (Bramwell et al., 2003; Fahn et al., 2004). Die Zytostatikatherapie wird bei primär inoperablen Weichteilsarkomen und vor allem bei fortgeschrittenen Tumorstadien eingesetzt und kann hier die rezidivfreie Zeit nach operativer Tumorresektion verlängern und die Lebensqualität verbessern (Frustaci et al., 2001). Eine Lebensverlängerung wird durch die Chemotherapie nicht erreicht. Trotz der ausgesprochenen Heterogenität der Wechteilsarkome werden bezüglich der systemischen Therapien kaum Unterschiede zwischen den einzelnen Subentitäten gemacht. Mit dem ATP- Tumorchemosensitivitätsassay steht ein Testsystem zur Verfügung, dessen Ergebnisse sich in Studien an anderen soliden Tumoren, insbesondere bei Mamma- und Ovarialkarzinomen, bereits bewährt haben und sich als reproduzierbar und valide zeigten (Andreotti et al., 1995). Es basiert auf dem Nachweis von ATP, dem primären Energielieferanten der Zelle. Die Chemosensitivität wird mittels eines Lumineszenzmessgerätes quantifiziert, welches das proportional zum ATP-Gehalt der Zelle emittierte Licht misst. 1.2. Entwicklung der prätherapeutischen Zytostatikatestung Der Gedanke, verschiedene antineoplastische Substanzen vor ihrem klinischen Einsatz in ihrer Wirksamkeit zu überprüfen, ist nicht neu. In der Vergangenheit wurde eine Reihe von Testsystemen entwickelt, die zu diesem Zweck eingesetzt wurden. In vitro Assays: HTCA: Human Tumor Clonogenic Assay (Hamburger et al., 1977) Vorteile: Gut untersuchter Test mit hoher Aussagekraft für Resistenz Nachteile: Relativ geringe Voraussagekraft für Sensibilität, biologische Aktivität der Stammzellen fraglich, Verfügbarkeitsrate niedrig DISC: Differential Staining Cytotoxity Assay (Weisenthal et al., 1991) 8 Vorteile: Hohe Voraussagekraft für Resistenz Nachteile: Bisher fast nur Daten von hämatologischen Neoplasien Kern/Volm: Kern-Assay bzw. Volm-Assay (Kern et al., 1985) Vorteile: Schnell durchführbar, hohe Voraussagekraft für Resistenz Nachteile: Geringe Voraussagekraft für Sensibilität, nur Bestimmung von proliferierenden Zellen (S-Phase) CAM: Cell-adhesive Matrix, Life Trac (Baker et al., 1986) Vorteile: Einfaches Monolayersystem Nachteile: Wachstum nicht neoplastischer Zellen ungenügend unterdrückt FCA: Fluorescent Cytoprint Assay (Rotman et al., 1988) Vorteile: “Microorgans” erhalten Tumorintegrität Nachteile: Art der Zellzerstörung nicht vorhersehbar, keine Kontrollproben ATP-CVA/ Adenosin Triphosphate Cell Viability Assay (Sevin et al., 1988) 1.3. Entscheidung für den ATP-TCA Die Methode basiert auf der Messung des intrazellulären ATP, welches mit Hilfe einer Lumineszenzreaktion bestimmt wird. Das emittierte Licht ist dabei proportional zum ATP-Gehalt der Zelle. Aus intraoperativ gewonnenem Tumormaterial wird eine Zellsuspension angefertigt und mit verschiedenen Zytostatika oder deren Kombinationen inkubiert. Nach sechs Tagen wird das Zellwachstum über den ATP-Gehalt der Probe ermittelt, mit einer nicht behandelten Probe verglichen und die Ergebnisse graphisch dargestellt. Vorteile des Verfahrens sind seine bisher gemessene hohe Sensitivität und Spezifität von 98% (O’Meara et al., 2001; Sharma et al., 2003). Der ATPTCA ist selektiv für maligne Zellen, da das Wachstum störender Zellen durch 9 die Verwendung von Selektivmedien unterdrückt wird. Auch aufgrund der hohen Auswertbarkeitsrate von über 90% hat sich das Verfahren als wenig störanfällige Methode zur Überprüfung der Chemosensitivität von Zelllinien und nativen Tumoren etablieren können (Hunter et al., 1993, Kurbacher et al., 1995). Bei verschiedenen Tumorerkrankungen wurde der ATP-TCA bisher erfolgreich angewendet. Vor allem im Bereich der gynäkologischen Onkologie lieferte die Methode bereits gute Ergebnisse (Kurbacher et al., 1996, Untch et al., 1993). Hier wurde der Test zunächst hauptsächlich an Ovarialkarzinomen eingesetzt und zeigte eine gute Korrelation der in vitro Ergebnisse mit den klinisch beobachteten Ansprechraten. Neuere Untersuchungen an Ovarialkarzinomen zeigen eine Auswertbarkeit der Testansätze in über 90% der Fälle und ein individuelles Ansprechverhalten der Tumorproben auf die eingesetzten Medikamente (Sharma et al., 2003). Untersuchungen an nativen Proben von Mammakarzinom-Patientinnen lieferten ähnlich gute Ergebnisse. Die Arbeitsgruppe um Kurbacher und Untch konnte die Methode erfolgreich zur Chemosensitivitätstestung und Entwicklung neuer innovativer Zytostatikaregimes in der Behandlung vor allem des metastasierten Mammakarzinoms einsetzen (Kurbacher et al., 2003; Untch et al., 2003). Mehrere Untersuchungen an gastrointestinalen Tumoren zeigten Verfügbarkeitsraten des ATP-TCA von 85% - 87% (Kim et al., 2003; Knight et al., 2004). Es wurden Proben von Oesophaguskarzinomen, Magenkarzinomen, Kolonkarzinomen und Rektumkarzinomen untersucht. Auch hier konnten die Ergebnisse bestätigen, dass die Methode das Ansprechen von Malignomen auf eine Chemotherapie vorhersagen kann (Kawamura et al., 1997, Mercer et al., 1997, Whitehouse et al., 2003a, Whitehouse et al., 2003b). Mittels ATP-TCA wurden außerdem bisher Maligne Melanome der Haut getestet (Neuber et al., 1999). Die Therapie dieser Tumore ist aufgrund schlechter Ansprechraten auf eine systemische Therapie limitiert, die Überlebenszeiten sind gering (Chung et al., 2004; Neale et al., 2001; Stone et al., 2004; ). Eine prätherapeutische Zytostatikatestung könnte auch hier zu einem Therapieerfolg und zu einem längeren tumorfreien Überleben beitragen. 10 Gegenstand weiterer Studien waren Melanome der Uvea (Myatt et al., 1997) und der Choroidea (Neale et al., 1999). Die Forschungsgruppe um Myatt konnte mittels ATP-TCA zeigen, dass eine Kombinationstherapie aus Gemcitabin oder Arabinosid mit Treosulfan erfolgreich sein könnte, obwohl diese Tumoren einer Chemotherapie nur bedingt zugänglich sind. Auch die medikamentöse Therapie der Choroidealmelanome verläuft eher insuffizient und weist Ansprechraten von nur 1% auf. Auf der Grundlage der Ergebnisse d i e s e r Studien begründet sich die vorliegende Arbeit, in der mittels ATP-TCA die prätherapeutische Chemosensitivitätstestung von Weichteilsarkomen untersucht wurde. Ziel dieser Arbeit war eine erste Bewertung der Durchführbarkeit und des V o r h e r s a g e w e r t e s e i n e r individuellen sensitivitätsadaptierten prätherapeutische Chemosensitivitätstestung bei Patienten mit malignen Weichgewebstumoren. 11 2. Fragestellung der Arbeit Ziel der vorliegenden prätherapeutischen Studie ist es, d i e Durchführbarkeit einer Chemosensitivitätstestung an frischen Weichgewebssubtypen zu prüfen. Im einzelnen wurden folgende Studienziele formuliert: · Einsatzmöglichkeit/Durchführbarkeit einer Chemosensitivitätstestung bei Weichgewebssarkomen mittels A d e n o s i n t r i p h o s p h a t- Tumorchemosensitivitätsassay (ATP-TCA) · Darstellung der präklinischen Ansprechraten des ATP-TCA bei bekannten Substanzkombinationen und Monosubstanzen · Vergleich unterschiedlicher Tumorsubtypen · Vergleich unterschiedlicher Differenzierungsgrade (GII vs. GIII) · Vergleich von Primärtumoren vs. Tumorrezidiven in ihrem Ansprechverhalten auf eine Zytostatikatherapie · Einsatz des ATP-TCA als Entscheidungshilfe zur Festlegung einer individuellen Chemotherapie 12 3. Material und Methoden 3.1. Tumormaterial Für die Untersuchungen wurden Proben von Patienten verwendet, die im Zeitraum von August 2 0 0 2 b i s Juni 2004 an der Klinik für Plastische Chirurgie in Bochum an einem Primär- oder Rezidivweichteilsarkom operiert wurden. Insgesamt wurden 53 Proben verwendet. 50 Tumorproben lieferten verwertbare Ergebnisse (94,3%). Bei 21 Patienten (42%) wurden die Untersuchungen am Primärtumor durchgeführt, bei 29 Patienten (58%) erfolgte die Testung am Rezidivgewebe. Tabelle 1: Charakteristika der mit dem ATP-TCA untersuchten Tumorproben (n=50) Tumor Anzahl in % Primärtumor 21 42 Rezidivtumor 29 58 Gesamt 50 100 3.2. Patientenkollektiv Bei den 50 Weichgewebsarkomen handelte es sich um 17 Liposarkome (34%), 16 N O S / Maligne Fibröse Histiozytome (32%), 8 Extraskelettale Chondrosarkome (16%), 5 Rhabdomyosarkome (10%), 4 Maligne periphere Nervenscheidentumore (8%) (Tab.2). Das klinische Staging wurde entsprechend den Kriterien des American Joint Committee on Cancer (AJCC) durchgeführt (Ramanathan et al., 1999). 17 Tumorproben (34%) waren mäßig differenziert (GII), 33 Tumorproben (66%) waren niedrig differenziert (GIII). 13 GI-Tumoren wurden nicht untersucht, da in der Regel bei solchen Tumoren keine Chemotherapie durchgeführt wird (Eilber et al., 2004). Das mittlere Alter der Patienten betrug 65 Jahre (32-76 Jahre). Keiner der Patienten erhielt eine adjuvante Chemotherapie vor der Tumorresektion, 15 Patienten mit einem Rezidivtumor unterzogen sich einer Strahlentherapie nach Entfernung des Primärtumors (51,7%). Diese erfolgte mit durchschnittlich 60,4Gy (55,5-66,3Gy). Tabelle 2: Charakteristika der Patienten mit Weichteilsarkomen (n=50) n Alter Primär- Rezidiv- tumor tumor G2 G3 Liposarkome 17 61 (32-73) 9 8 6 11 NOS-Sarkome/MFH 16 64 (42-69) 7 9 7 9 Extraskelettale 8 65 (62-72) 1 7 2 6 Rhabdomyosarkome 5 68 (64-76) 4 1 1 4 MPNST 4 59 (55-67) 0 4 1 3 Chondrosarkome 3.3. Probengewinnung Die Probenentnahme erfolgte unter sterilen Bedingungen im Operationssaal aus dem Randbereich des Tumors. Die etwa 1cm3 großen Proben wurden unter sterilen Bedingungen in einem Zellkulturmedium (DMEM, Sigma, Germany) mit Antibiotika (100U/ml Penicillin und 100µg/ml Streptomycin, Gibco BRL, Germany) bei 4°C ins Labor transportiert und vorbereitet, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten und eine mikrobielle Kontamination zu vermeiden. 14 3.4. Der Adenosintriphosphat-Tumorchemosensitivitätsassay (ATP-TCA) 3.4.1. Prinzip des ATP-TCA Der ATP-TCA beruht auf der Messung des zellulären ATP-Gehaltes und bestimmt damit indirekt den Energieladungszustand der Zelle quantitativ (Andreotti et al., 1991, Bellamy et al., 1992, Hunter et al., 1993). Mit Erreichen des statischen Zustandes der Zelle sinkt der ATP-Gehalt und fällt bei Zelltod auf Null. Lysosomale ATPasen steuern diesen Vorgang. Der ATPGehalt der Probe wird bioluminometrisch über einen Bereich von 5 Größenordnungen bestimmt. So werden nur relativ geringe Zellmengen benötigt (ca. 15.000-25.000 Zellen pro Vertiefung (well) der Pipettier/ELISAplatte). Der Test ist mit einzelnen Zytostatika oder Zytostatikakombinationen durchführbar und zeigt für die eingesetzte Substanz oder Kombination eine Dosis-Wirkungsbeziehung (Bruckner et al., 1993, Untch et al., 1993). Sowohl proliferierende als auch nicht-proliferierende Tumorzellen werden erfasst, während Erythrozyten und Makrophagen das Ergebnis nicht beeinflussen sollen. Zytologische Studien haben gezeigt, dass benigne Zellen nicht in dem Maße durch das Kulturmedium zum Wachstum angeregt werden wie maligne Zellen. Zur Bestimmung der Sensitivität oder Resistenz werden Tumorzellen enthaltende Proben für 6-7 Tage in vitro unter Zusatz verschiedener Konzentrationen einzelner Zytostatika oder Zytostatikakombinationen kultiviert. Dazu wird ein für Tumorzellen selektives Medium („Complete Assay Medium“; CAM) mit einer 96-well Mikrotiterplatte verwendet. Jedes Testbesteck ist für die Bestimmung von acht Zytostatika oder Kombinationen ausgelegt (Abb.1). Die Wachstumshemmung wird mittels eines Lumineszenzmeßgerätes (Dynatech ML 1000) quantifiziert. Es misst das Licht, das bei der Biolumineszenzreaktion in Gegenwart von Luziferin und Luziferase proportional zum Gehalt an ATP emittiert wird: 15 ATP + D-Luziferin + O2 › AMP + 2Pi + CO2 + Licht Die Versuchsdurchführung erfolgte unter Verwendung des kommerziell erhältlichen Testkits TCA-1 0 0 ( D C S © innovative Diagnostik-Systeme, Hamburg) Abbildung 1: Prinzip der Chemosensitivitätstestung mittles ATP- Lumineszenzmethode (ATP-TCA), (TDC, test drug concentration) 3.4.2. Inhalt des Testbestecks Das Testbesteck enthält zwei sterile Skalpelle zur Zerkleinerung und Vorbereitung der Tumorprobe für die enzymatische Verdauung, eine 10 ml Spritze und ein 0,22 mm Filter zur Sterifiltration der TumordissoziationsEnzymlösung. 250 ml Complete Assay Medium (CAM) steht gebrauchsfertig zur Verfügung (Lagerung bei 4-8°C). Das Tumordissoziationsreagenz besteht aus lyophilisierten Enzymen zur Bindegewebsverdauung. Zwei sterile 96-Loch Mikrotiterplatten zur Kultur sind im Testkit vorhanden. Ein steriler ATP-Inhibitor (4ml) wird zur Negativkontrolle eingesetzt. Für die Lösung des 16 ATP aus kultivierten Proben wird ein Tumor-Extraktionsreagenz für die Extraktion, für die quantitative Messung des ATP-Gehaltes ein LuziferinLuziferase-Reagenz verwendet. Verschiedene ATP-Standardlösungen dienen der Erstellung von Eichkurven, zur Kalibrierung des Systems und Validierung der Ergebnisse. Weitere benötigte Materialien und Geräte: Sterile Pinzette und Schere, sterile Zentrifugenröhrchen, sterile Pipetten für 1, 5, 10 ml, einstellbare Pipetten 0200 µl, 200-1000 µl mit sterilen Spitzen, Neubauer-Zählkammer, Methylenblau oder Gentianaviolett. 3.4.3. Vorbereitung der Proben Als erstes erfolgte die manuelle Zerkleinerung ( m echanische Dissoziation) der Tumorprobe mit Skalpell oder Schere. Sobald 1-2 mm große Tumorfragmente vorlagen, konnten diese mit der Tumordissoziationslösung gemischt werden. Die Tumorproben wurden bei 37°C für 4-6 Stunden inkubiert, bis eine Einzelzellsuspension vorlag (enzymatische Dissoziation). Die Tumorzellpräparation wurde dann zentrifugiert und der Überstand abgezogen. Das Sediment anschließend resuspendiert, erneut zentrifugiert, und nach Wiederholung des gesamten Vorgangs in das CAM-Medium aufgenommen. Die Anzahl und Fraktion der lebenden Zellen wurden mit der Trypanblau-Methode bestimmt. Abgestorbene Zellen stellen sich bei dieser Methode blau dar, vitale Zellen bleiben farblos. Eine zusätzliche Auszählung erfolgte vollautomatisch mittels eines C ell Counter (CASY, Fa. Schärfe, Deutschland). Der Lebendzellanteil sollte mindestens 75% der Gesamtzellzahl betragen, um valide Aussagen zu erhalten. 3.4.4. Vorbereitung der Zytostatika Zytostatika oder Zytostatikakombinationen wurden jeweils in sechs verschiedenen Konzentrationen entsprechend 200%, 100%, 50%, 25%, 17 12,5%, 6,25% der in vivo Bezugswerte (Test drug concentration, TDC) verwendet. Das Profil von 200% bis 6,25% wurde in Dreifachwerten angesetzt. Acht Zytostatika oder Kombinationen konnten mit den z w e i mitgelieferten 96-Loch-Mikrotiterplatten getestet werden, die verbliebenen Vertiefungen wurden für die M0-Kontrollen (Zellen ohne Zytostatikum) und MI-Kontrollen (Maximum-Inhibitor, Zellen ohne ATP = Blindwert) verwendet. Nach ihrer Herstellung wurden die Stammlösungen der Zytostatika oder ihre Kombinationen entsprechend verdünnt. Nach Vorbereitung der MI- und M0Kontrollen erfolgte dann die Anfertigung einer Verdünnungsreihe der Zytostatika. Die Referenzkonzentrationen Herstellerangaben der Applikation. Ergebnisse Die (100% TDC) e n t s p r i c h t n a c h Plasmaspitzenkonzentration wurden in nach Triplikaten intravenöser mit je sechs Konzentrationen pro Therapeutikum dargestellt. Das Pipettierschema stellte sich wie folgt dar: Tabelle 3: Pipettierschema für 4 Zytostatika zur Testung von 6,25-200% TDC A B C D E F G H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Med1 Med1 Med1 Med2 Med2 Med2 Med3 Med3 Med3 Med4 Med4 Med4 200% 200% 200% 200% 200% 200% 200% 200% 200% 200% 200% 200% Med1 Med1 Med1 Med2 Med2 Med2 Med3 Med3 Med3 Med4 Med4 Med4 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% Med1 Med1 Med1 Med2 Med2 Med2 Med3 Med3 Med3 Med4 Med4 Med4 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% Med1 Med1 Med1 Med2 Med2 Med2 Med3 Med3 Med3 Med4 Med4 Med4 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% Med1 Med1 Med1 Med2 Med2 Med2 Med3 Med3 Med3 Med4 Med4 Med4 12,5% 12,5% 12,5% 12,5% 12,5% 12,5% 12,5% 12,5% 12,5% 12,5% 12,5% 12,5% Med1 Med1 Med1 Med2 Med2 Med2 Med3 Med3 Med3 Med4 Med4 Med4 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 Kontr Kontr Kontr Kontr Kontr Kontr Kontr Kontr Kontr Kontr Kontr Kontr MI MI MI MI MI MI MI MI MI MI MI MI Kontr Kontr Kontr Kontr Kontr Kontr Kontr Kontr Kontr Kontr Kontr Kontr (Med: Medikament; Kontr: Kontrolle; M0: Zellen ohne Zytostaitkum; MI: Maximum-Inhibitor, Zellen ohne ATP = Blindwert) 18 3.4.5. Verteilung der Tumorzellen auf die Platten 15.000 bis 20.000 lebende Zellen/well wurden pipettiert (Tabelle 3). Die Platten wurden abgedeckt und im Inkubator bei 37°C, 5% CO2 und >95% relativer Luftfeuchtigkeit für 6-7 Tage inkubiert. Die relative Feuchtigkeit sollte >95% betragen, um ein Austrocknen vor allem am Rand der Platten zu vermeiden. 3.4.6. Extraktion und Messung Zuerst wurde das Tumorzell-Extraktionsreagenz zu den MI- und M0Kontrollen gegeben, anschließend zu den Tumorproben. Dann folgte das Einsetzen der lysierten Proben in den Luminometer, Luziferin-LuziferaseGemisch wurde hineinpipettiert und sofort die Lumineszenz bestimmt. Die freigesetzte Lichtmenge wurde nach Zugabe von Luziferin-Luziferase in Relative Light Units (RLU=Photonen/10) über einen Zeitraum von 10s bestimmt. Die Überlebensfraktion (ÜF) in Prozent pro Medikament sowie die Konzentration wurde nach folgender Formel errechnet: ÜFx(%) = (RLUx - RLUmi) / (RLUmo - RLUmi) x 100 MI = Durchschnitt der zwölf Maximum Inhibitor-Kontrollen M0 = Durchschnitt der Kontrollen ohne Zytostatika-Zusatz 3.4.7. ATP-Standardkurve Zur Überprüfung der Linearität der Messergebnisse in Abhängigkeit vom ATP-Gehalt der Probe diente die ATP-Standardkurve. Der Verlauf der Ergebniskurven wurde aufgrund dieser Kurven interpretiert. 19 ATP Standard ng/mL Mean Luminometer Counts 10000000 1000000 100000 10000 1000 0 01 3 0, 03 8 0, 11 4 0, 34 3 0, 02 9 1, 08 6 3, 25 9 9, 77 8 2, ,3 3 83 25 0 100 ATP Standard ng/mL Abbildung 2: ATP-Standardkurve für einen ATP-TCA Test 3.4.8. Auswertung Die Wachstumshemmung (TGI = Tumor Growth Inhibition) der Tumorprobe für jede Konzentration (TDC) einzelner Medikamente oder Kombinationen wurde nach folgender Gleichung berechnet: 1,0 – (TEST – MI) / (M0 – MI) = TGI x 100% = TGI in % TEST = Durchschnitt der drei Messwerte pro Konzentration eines Zytostatikums MI = Durchschnitt der zwölf Maximum Inhibitor-Kontrollen M0 = Durchschnitt der zwölf Kontrollen ohne Zytostatika-Zusatz Die TGI-Werte für jede Zytostatika-Konzentration können mit Hilfe der dem Test beiliegenden Software (Excel-sheet) der Firma DCS© automatisch kalkuliert werden. Basierend auf den TGI-Werten berechnet die Software vier weitere im folgenden dargestellte Parameter: 20 AUIC Area Under Inhibition Curve, berechnet mittels Trapezregel für den X/Y-Verlauf % TDC gegen % TGI IC50 Durch Interpolation ermittelte Zytostatika-Konzentration, die zu 50 % TGI führt (IC = Inhibitory Concentration) IC90 Durch Interpolation ermittelte Zytostatika-Konzentration, die zu 90 % TGI führt (IC = Inhibitory Concentration) S.I. Sensitivitäts-Index Es wurde die ATP-Produktion für jede therapierte Probe mit der nichttherapierten Probe (Kontrolle) verglichen und der Prozentsatz der überlebenden bzw. abgestorbenen Zellen berechnet und graphisch dargestellt. Ein niedriger ATP-Gehalt entsprach hierbei einer hohen zytostatischen Wirkung, ein hoher ATP-Gehalt einer nur geringen zytostatischen Potenz des Medikaments. Individuelle Sensitivitätsindizes für die einzelnen Zytostatika oder Kombinationen wurden aus den vorliegenden Daten berechnet, indem die TGI-Raten (in%) für jede ZytostatikaKonzentration (6,25%, 12,5%, 25%, 50%, 100%, 200%) addiert und von 600 subtrahiert wurden. TCA-Index = 600 – Summe (% TGI 200…6,25) Ein Sensitivitätsindex von 600 entspricht ungehinderten Tumorwachstum und minimaler Chemosensitivität, während ein Sensitivitätsindex von 0 eine komplette Inhibition des Tumorwachstums darstellt. Die nachfolgenden Richtlinien wurden zur Bestimmung von Sensitivität und Resistenz eines Zytostatikums zugrundegelegt: Die Sensitivität wurde durch hohe TGI- bzw. AUIC-Werte und niedrige IC50/IC90 Index-Werte angezeigt. Hohe Sensitivität wird durch erhöhte TGIund AUIC-Werte auch im unteren Konzentrationsbereich wiedergegeben. Die Resistenz wurde durch niedrige TGI- bzw. AUIC-Werte und hohe IC50/IC90 Index-Werte angezeigt. Starke Resistenz wird durch niedrige TGIund AUIC-Werte auch im hohen Konzentrationsbereich wiedergegeben. 21 3.4.9. Interpretation der Testergebnisse In Anlehnung an die Klassifikation von Hunter und Mitarbeiter (Hunter et al., 1993) wurden vier Sensitivitätstypen definiert, nach denen die Ergebnisse dieser Arbeit ausgewertet wurden (Tabelle 4). Tabelle 4: Klassifikation der Testergebnisse des ATP-TCA (TGI, Tumor Growth Inhibition; TDC, Test Drug Concentration) TGI bei 200% TDC Hohe TGI bei 25% TDC >95% >70% >95% 50-70% Geringe >95% <50% Sensitivität <95% >50% Resistenz <95% <50% Sensitivität Partielle Sensitivität Als in vitro Responserate wurde der Anteil an Tumoren mit hoher Sensitivität, partieller und schwacher Sensitivität an der Gesamtzahl auswertbarer Ansätze angesehen. 3.5. Verwendete Zytostatika Für die Untersuchungen wurden kommerziell erhältliche Lösungen der Substanzen verwendet. Die Medikamente wurden von der Apotheke des Universitätsklinikums Bergmannsheil Bochum zur Verfügung gestellt. Es wurden handelsübliche Formulierungen der untersuchten Zytostatika und des getesteten Schleimhautdesinfektionsmittels verwendet. Die Lagerung von Stammlösungen erfolgte unter Berücksichtigung der Herstellerangaben und nach Literaturhinweisen (Andreotti et al., 1995, Hunter et al., 1994). Die Medikamente wurden von der Apotheke des Universitätsklinikums Bergmannsheil Bochum entsprechend der Herstellerangeben in gleicher 22 Weise wie für die Verabreichung an Patienten am Untersuchungstag vorbereitet. Die getesteten Zytostatika wiesen verschiedene Wirkmechanismen auf: · Alkylantien (reagieren leicht mit Phosphatgruppen, hemmen so die Zellteilung und damit das Tumorwachstum): Ifosfamid · Antibiotika mit zytostatischer Wirkung (interkalierende Wirkung): Adriamycin (Doxorubicin), Epirubicin, Actinomycin D · Alkaloide (Kernspindelgifte, Hemmung der Mitose): Vincristin · Platinverbindungen (Reaktion mit zellulärer DNS): Cisplatin · Dacarbazin (DTIC) (Tabelle 5) Unmittelbar vor Gebrauch wurden die Stammlösungen in CAM (Complete Assay Medium) bis auf 800% Testkonzentration (TDC) verdünnt. Hierbei wurden die Medikamentenkombinationen durch einfache Mischung der Einzelkomponenten in CAM hergestellt. Getestete Kombinationen waren CYVADIC (Cyclophosphamid/Ifosfamid, Vincristin, Doxorubicin, Dacarbazin) und VAC (Vincristin, Actinomycin D, Cyclophosphamid/Ifosfamid) . D a Ifosfamid in der Leber zu seinem aktiven Analog metabolisiert wird, wurde entsprechend der Herstellerangaben des Test-Kits Mafosfamid verwendet. Die Titrierung der endgültigen Testkonzentration von 6,25% - 200% TDC erfolgte direkt auf den Mikrotiterplatten durch sterile Verdünnungen der Ausgangslösungen von 800% TDC im Verhältnis 1:1 in CAM. Um sowohl therapeutische, d.h. intratumoral erreichbare, als auch supratherapeutische Konzentrationen zu erreichen, wurde der Konzentrationsbereich von 6,25% bis 200% entsprechend der Herstellerangaben des Test-Kits gewählt. Hierbei entsprach die Referenzkonzentration von 100% TDC entweder der Plasmaspitzenkonzentration (Plasma peak concentration PPC) oder einem Äquivalent der Fläche unter der Plasmaeliminationskurve. Weiter testeten wir an jeweils zehn Tumorproben das Schleimhautdesinfektionsmittel Octenisept® (Octenidinhydrochlorid) in linearer und logarithmischer Verdünnung (1:1 – 1 : 1 0 6). Dies geschah mit dem Hintergrund, dass nach erfolgten Tumorresektionen die resultierenden Wundhöhlen in unserer Klinik mit Octenisept gespült werden. 23 Pro Tumorprobe konnten wir sieben Einzelsubstanzen, zwei Zweierkombinationen und zwei Mehrfachkombinationen (CYVADIC, VAC) testen. Eine Übersicht der Monopräparate gibt folgende Tabelle: Tabelle 5: Übersicht der getesteten Monosubstanzen (TDC, Test Drug Concentration) Medikament Doxorubicin 100% TDC µg/ml Stammlösung mg/ml 0,5 2,0 Epirubicin 0,5 2,0 Ifosfamid (Mafosfamid) 3,0 5,0 20,0 10,0 Actinomycin D 0,1 8,0 Cisplatin 3,8 2,0 Vincristin 0,4 1,0 (Adriamycin) Dacarbazin (DTIC) Octenisept® (Octenidin- 0,1g/250ml (0,1%) Hydrochlorid) lg (10-1 – 10-6) 3.6. Statistik Die Statistische Signifikanz der Unterschiede in der Chemosensitivität zwischen den Subentitäten der Weichteilsarkome, der unterschiedlichen Differenzierungsgrade und im Vergleich zwischen Primärtumoren und Tumorrezidiven wurde mittels Mann-Whitney-U-Test und dem Chi-QuadratTest kalkuliert. Ein p-Wert <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die statistische Auswertung erfolgte in Kooperation mit dem Institut für Medizinische Informatik, Biometrie und Epidemiologie der Ruhr-UniversitätBochum (Leiter: Univ.-Prof. Dr. H.-J. Trampisch). 24 4. Ergebnisse 4.1. Testsystem des ATP-TCA 4.1.1. Auswertbarkeit des ATP-TCA In der Zeit von August 2 0 0 2 b i s Juni 2004 wurden insgesamt 53 Weichteilsarkomproben von 53 Patienten unter Verwendung des ATP-TCA untersucht. 50 der 53 Ansätze waren (94%) auswertbar, so dass die erhaltenen Ergebnisse statistisch ausgewertet werden konnten. 4.1.2. Testversager Der Hauptgrund für das Testversagen von drei Proben war der zu geringe Gehalt an vitalen Tumorzellen in den verarbeiteten Weichteilsarkomproben. Bei der enzymatischen Dissoziation zeigte sich hier ein vergleichsweise großer Anteil an festem, zellarmen Bindegewebe oder eine überdurchschnittliche Menge nekrotischen Areals. Eine Gesamtzellzahl von <100.000 Zellen/ml nach der Resuspension in CAM führte nicht zu auswertbaren Ergebnissen am Ende der jeweiligen Testreihe (n=3, 6%) Weitere mögliche Gründe für einen Ausschluß der Probe aus der Testung sind eine bakterielle Kontamination der Zellkultur oder ein mangelhaftes oder fehlendes Anwachsen der Tumorzellen. Keiner dieser Gründe traf jedoch bei unseren Untersuchungen zu. 25 4.1.3. Dosisantwortkurven Das folgende Diagramm zeigt beispielhaft die originalen Dosisantwortkurven des ATP-TCA vier verschiedener Zytostatika bei einem Liposarkom. Die Monosubstanzen Epirubicin, Doxorubicin, Ifosfamid (Mafosfamid) und Cisplatin wurden eingesetzt. Die Zytostatika wurden in sechs verschiedenen Konzentrationen getestet: 6,25% bis 200% der TDC (Test Drug Concentration). Epirubicin und Doxorubicin zeigen sich hier in hohen Dosierungen als wirksamste Chemotherapeutika für diese Probe, da bei 100% TDC (entspricht der maximal erreichbaren Plasmakonzentration) 90% der Tumorzellen abgetötet werden. Ifosfamid/Mafosfamid zeigt in dieser Probe für submaximale Plasmakonzentrationen bessere Wirkungen. Bei bis zu 75% TDC liegt hier die Wirksamkeit über der von Epirubicin und Doxorubicin. Cisplatin hat in diesem Fall die geringste Wirkung. 100 % tumor growth inhibition 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 6,25 12,5 25 50 100 200 % test drug concentration Epirubicin Doxorubicin Abbildung 3: Dosisantwortkurve des ATP-TCA 26 Mafosfamid Cisplatin Abgebildet sind die Dosiswirkungskurven der Zytostatika bei verschiedenen Konzentrationen. Auf der y-Achse ist die Tumorwachstumshemmung in %, auf der x-Achse die Zytostatikakonzentration in vitro in % dargestellt. Aus dem Diagramm lassen sich direkt die TGI-Werte (Tumor Growth Inhibition) bei 200% TDC und 25% TDC (Test Drug Concentration) ablesen und die Sensitivität klassifizieren (Tabelle 4). 4.2. Monosubstanzen Alle sieben Monosubstanzen wurden 50mal getestet. Das Schleimhautantiseptikum Octenisept® wurde 10x in linearer Verdünnung, aufgrund der starken zytotoxischen Wirkung zusätzlich 10x in logarithmischer Verdünnung (1:10-1 – 1:10-6) getestet. I n T a b elle 12 sind die Ergebnisse der 50 Monosubstanzen nach Wirkklassifikation dargestellt. Der Sensitivitätsindex stellt Mittelwerte der individuellen Chemosensitivitätsindizes jeder einzelnen getesteten Monosubstanz dar, berechnet durch Addition der TGI (Tumor Growth Inhibition) für jede Zytostatikakonzentration und Subtraktion von 600. Ein Sensitivitätsindex von 600 bedeutet hierbei ein ungehindertes Tumorwachstum und minimale Chemosensitivität, ein Sensitivitätsindex von 0 spiegelt komplette Tumorwachstumshemmung Chemosensitivität wieder. 27 und maximale Tabelle 6: Übersicht über die mittels ATP-TCA getesteten Monosubstanzen bei 50 Patienten mit Weichteilsarkomen Medikament Resistenz Geringe Partielle Hohe Mittlerer Sensitivität Sensitivität Sensitivität Sensitivitäts Index Actinomycin 00/50 10/50 03/50 37/50 D (00%) (20%) (06%) (74%) Doxorubicin 03/50 02/50 10/50 35/50 (Adriamycin) (06%) (04%) (20%) (70%) Ifosfamid 16/50 00/50 02/50 32/50 (Mafosfamid) (32%) (00%) (04%) (64%) Epirubicin 08/50 00/50 12/50 30/50 (16%) (00%) (24%) (60%) 39/50 11/50 00/50 00/50 (78%) (22%) (00%) (00%) 45/50 05/50 00/50 00/50 (95%) (05%) (00%) (00%) 42/50 08/50 00/50 00/50 (84%) (16%) (00%) (00%) 00/10 00/10 00/10 10/10 (00%) (00%) (00%) (100%) Octenisept® 00/10 00/10 00/10 10/10 (lg) (00%) (00%) (00%) (100%) Cisplatin Dacarbazin Vincristin Octenisept® 137 140 234 245 444 532 513 ------- Die stärkste Chemoresistenz zeigten die eingesetzten Monosubstanzen Dacarbazin (95% der Proben waren resistent), Vincristin (84% Resistenz) und Cisplatin (82% Resistenz). Dies lässt sich auch in der graphischen Darstellung der Ergebnisse ablesen, in der diese drei Zytostatika eine konkave Dosiswirkungskurve zeigen (Abbildung 4). Die höchsten Ansprechraten fanden wir für Actinomycin D. Es zeigte sich eine hohe Chemosensitivität bei allen Weichteilsarkomen von insgesamt 74%. Kein Tumor zeigte Resistenz. Hohe Chemosensitivität zeigte sich auch 28 für die getesteten Monosubstanzen Doxorubicin (Adriamycin) (70% hohe Sensitivität, 6% Resistenz) und Ifosfamid (Mafosfamid) (64% hohe Sensitivität, 32% Resistenz). Für diese Zytostatika ergab die Graphische Darstellung der Ergebnisse eine konvexe Kurve für alle Patienten (Abbildung 4). Die Unterschiede im Ansprechverhalten der Tumorzellen auf Dacarbazin, Vincristin und Cisplatin verglichen mit Actinomycin D, Doxorubicin und Ifosfamid waren statistisch signifikant (p<0,05). Epirubicin zeigte in gleicher Dosierung einen deutlich geringeren Effekt auf die Tumorwachstumshemmung (60% hohe Sensitivität, 16% Resistenz) als Doxorubicin (p<0,05). 110 100 90 % tumor growth inhibition 80 70 60 50 40 30 20 10 0 6,25 Actinomycin D 12,5 25 50 % test drug concentration Doxorubicin Ifosfamide Epirubicin 100 Cisplatin Vincristine 200 Dacarbazine Abbildung 4: Graphische Darstellung der mittels ATP-TCA erhobenen Orginaldaten für die 50 Weichteilsarkome. Für jede TDC (Test Drug Concentration) sind die Testergebnisse der s i e b e n Monosubstanzen aufgeführt. 29 4.3. Zytostatikakombinationen Mit dem ATP-TCA testeten wir außerdem vier verschiedene Zytostatikakombinationen. Darunter befanden sich das bis in die 90er Jahre als Standardtherapie eingesetzte CYVADIC-Schema (Cyclophosphamid, Vincristin, Doxorubicin und Dacarbazin) und die VAC-Kombination (Vincristin, Actinomycin D und Cyclophosphamid). Weiterhin testeten wir die ZweifachKombination aus Doxorubicin und Ifosfamid (Mafosfamid) sowie die Zweifach-Kombination aus Actinomycin und Ifosfamid (Mafosfamid) an jeweils 50 Tumorproben. Einen Überblick gibt Tabelle 7. Tabelle 7: Übersicht über die mittels ATP-T C A g e t e steten Zytostatikakombinationen bei 50 Patienten mit Weichteilsarkomen Medikament Resistenz Geringe Partielle Hohe Mittlerer Sensitivität Sensitivität Sensitivität Sensitivitäts Index Doxorubicin 03/50 00/50 11/50 36/50 + Ifosfamid (06%) (00%) (22%) (72%) Actinomycin 01/50 08/50 03/50 38/50 D (02%) (16%) (06%) (76%) 03/50 05/50 07/50 35/50 (06%) (10%) (14%) (70%) 02/50 00/50 15/50 33/50 (04%) (00%) (30%) (66%) 139 163 + Ifosfamid VAC CYVADIC 218 255 Das CYVADIC-Schema (Cyclophosphamid, Vincristin, Doxorubicin und Dacarbazin) zeigte die stärkste Chemoresistenz (66% hohe Sensitivität, 4% Resistenz), gefolgt von der VAC-Kombination (Vincristin, Actinomycin D und Cyclophosphamid) (70% hohe Sensitivität, 6% Resistenz). Die beiden Zweifachkombinationen lieferten insgesamt bessere Ansprechraten. Die Kombination aus Doxorubicin und Ifosfamid (72% hohe Sensitivität, 6% 30 Resistenz) war der Kombination aus Actinomycin D und Ifosfamid (76% hohe Sensitivität, 2% Resistenz) leicht unterlegen. Die Unterschiede im Ansprechverhalten auf die verschiedenen Mehrfachkombinationen (CYVADIC vs. VAC) waren nicht statistisch signifikant (p>0,05). Auch der Vergleich der Ansprechverhalten auf die verschiedenen Zweichfachkombinationen ergab keinen signifikanten Unterschied (p>0,05) (Abbildung 5). 100 90 % tumor growth inhibition % tumor growth inhibition 80 70 60 50 40 30 20 10 0 6,25 12,5 Doxorubicin+Ifosfamide 25 50 % test drug concentration Actinomycin D+Ifosfamide 100 VAC 200 CYVADIC Abbildung 5: Graphische Darstellung der mittels ATP-TCA erhobenen Orginaldaten für die 50 Weichteilsarkome. Für jede TDC (Test Drug Concentration) sind die Testergebnisse der vier Kombinationen aufgeführt. 31 4.4. Octenidin-Hydrochlorid (Octenisept®) Jeweils 10 Tumorproben wurden mit dem Schleimhautantiseptikum in linearer und logarithmischer Verdünnung getestet. In jeder Verdünnungsstufe zeigte sich bei allen Tumoren eine komplette Hemmung des Tumorzellwachstums (100% Hohe Sensitivität, 0% Resistenz) (Tabelle 6). Dies entspricht einer Tumorzellwachstumshemmung von 100% bei jeder Verdünnung und resultiert in der graphischen Darstellung in einer waagerechten Kurve bei 100% TGI (Tumor Growth Inhibition) für die lineare Verdünnung. Für die logarithmische Verdünnung ergibt sich eine konvexe Kurve. 4.5. Chemosensitivität unterschiedlicher Subtypen von Weichteilsarkomen Die 50 getesteten Weichteilsarkomproben ließen sich in acht verschiedene Subtypen einteilen. Der ATP-TCA wurde an siebzehn Liposarkomen, sechzehn N O S -Sarkomen/MFH (NOS, not otherwise specified; MFH, Malignes Fibröses Histiozytom), acht Chondrosarkomen, fünf Rhabdomyosarkomen und vier MPNST (MPNST, Maligner Peripherer Nervenscheidentumor) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Chemosensitivität innerhalb der einzelnen Subklassen tendenziell ähnlich ist. Fasst man jedoch diese Daten zusammen, so zeigt sich, dass das Ansprechverhalten der einzelnen Subtypen auf die unterschiedlichen Zytostatika signifikant unterschiedlich ist. Wir haben dies für die bei unseren Testergebnissen wirksamsten Substanzen Actinomycin D (74% hohe Sensitivität, 0% Resistenz) und Doxorubicin (70% hohe Sensitivität, 6% Resistenz) im folgenden dargestellt. Für die Therapie mit Actinomycin D wird deutlich, dass die fünf getesteten Rhabdomyosarkome im Mittel chemoresistent gegen dieses Medikament waren, während alle anderen Tumorsubentitäten eine ähnlich hohe Chemosensitivität aufwiesen (p<0,05). Die Testergebnisse für Rhabdomyosarkome lagen durchweg unter denen anderer Sarkomsubtypen (Abb.6). 32 110 100 % tumor growth inhibition % tumor growth inhibition 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 6,25 Liposarcoma 12,5 25 50 % test drug concentration % test drug concentration NOS-sarcoma Rhabdomyosarcoma 100 MPNST 200 Chondrosarcoma Abbildung 7: Effekt von Actinomycin D als Einzelsubstanz, Ergebnisse des ATP-TCA bei unterschiedlichen Subklassen von Weichteilsarkomen (p<0,05) 33 Ähnliche Ergebnisse zeigten sich im Vergleich der verschiedenen Subklassen von Weichteilsarkomen in ihrem Ansprechverhalten auf die getestete Monosubstanz Doxorubicin . Die acht getesteten Chondrosarkome zeigten eine signifikant höhere Resistenz gegen Doxorubicin als die übrigen Subklassen, die eine ähnlich hohe Chemosensitivität aufwiesen (p<0,05). Die Testergebnisse für Chondrosarkome lagen durchweg unter denen der anderen Sarkomsubentitäten. Die maximal erreichbare Hemmung des Tumorzellwachstums lag unter 75% (Abb.7). 110 100 90 % tumor growth inhibition % tumor growth inhibition 80 70 60 50 40 30 20 10 0 6,25 12,5 Liposarcoma 25 50 % drug test drug concentration % test concentration NOS-sarcoma Rhabdomyosarcoma 100 MPNST 200 Chondrosarcoma Abbildung 6: Effekt von Doxorubicin (Adriamycin) als Einzelsubstanz, Ergebnisse des ATP-TCA bei unterschiedlichen Weichteilsarkomen (p<0,05) 34 Subklassen von 4.6. Chemosensitivität von Weichteilsarkomen unterschiedlichen Differenzierungsgrades Von den 50 getesteten Weichteilsarkomproben waren 17 mäßig (GII, n=17, 34%) und 33 niedrig (GIII, n=33, 66%) differenziert. Wir haben die Chemosensitivität von GII-differenzierten Tumoren gegenüber Actinomycin D, Doxorubicin und Ifosfamid mit der Chemosensitivität von GIIIdifferenzierten Tumoren gegenüber diesen drei Monosubstanzen verglichen. Es zeigten sich signifikant bessere Ansprechraten der niedrig differenzierten Tumoren auf alle drei Zytostatika im Vergleich zu den mäßig differenzierten Tumoren (p<0,05). Die maximale Hemmung des Tumorzellwachstums lag bei den GII-Tumoren bei 80%, während die Maximale Hemmung der GIIITumoren über 90% lag. In Abbildung 8 sind die Ergebnisse der schlecht differenzierten Tumoren denen der mäßig differenzierten gegenübergestellt (GII: n=17, GIII: n=33): 35 Tumoren 110 % tumor growth inhibition % tumor growth inhibition 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 6,25 12,5 25 50 100 200 testdrug drugconcentration concentration %%test Actinomycin D/GII Actinomycin D/GIII Ifosfamide/GII Ifosfamide/GIII Doxorubicin/GII Doxorubicin/GIII Abbildung 8: Chemosensitivitätsprofile von 50 Weichteilsarkomen, eingeteilt in verschiedene Differenzierungsgrade (GII, n=17; GIII, n=33), Ergebnisse für Actinomycin D, Doxorubicin und Ifosfamid (p<0,05) 4.7. Unterschiede in der Chemosensitivität von Primärtumoren und Tumorrezidiven Bei den uns zur Verfügung stehenden Weichteilsarkomproben handelte es sich in 42% der Fälle um einen Primärtumor (n=21) und in 58% der Fälle um ein Tumorrezidiv (n=29). Wir haben die Primärtumoren und die Tumorrezidive jeweils mit den drei wirksamsten Substanzen Actinomycin D, Doxrubicin (Adriamycin) und Ifosfamid getestet und die Ergebnisse 36 v e r g l i c h e n . D a b e i zeigte s i c h , d ass Rezidivtumoren bei Verdünnungsstufen allen höher drei war das Ansprechverhalten getesteten als das der Zytostatika in der allen Primärtumoren. Die Chemosensitivität der Rezidivtumoren lag bei allen drei Substanzen um etwa 15-20% über der Chemosensitivität der Primärtumoren (Abbildung 9). Die Ergebnisse waren statistisch signifikant (p<0,05). 110 % tumor growth inhibition % tumor growth inhibition 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 6,25 12,5 25 50 100 200 % test drug concentration % test drug concentration Actinomycin D/primary tumors Actinomycin D/recurrent tumors Doxorubicin/primary tumors Doxorubicin/recurrent tumors Ifosfamide/primary tumors Ifosfamide/recurrent tumors Abbildung 9: Chemosensitivitätsprofile der 50 Weichteilsarkomen, eingeteilt in Primärtumore (n=21) und Tumorrezidive (n=29), Ergebnisse dargestellt für Actinomycin D, Doxorubicin und Ifosfamid (p<0,05) 37 4.8. Individualität der Ergebnisse des ATP-TCA Anhand von zwei Fallbeispielen soll die Möglichkeit dargestellt werden, den ATP-T C A a l s Entscheidungshilfe für den Einsatz einer individuellen Chemotherapie bei Patienten mit Weichteilsarkomen zu nutzen. Bei Patient 1 handelt es sich um einen 46-jährigen Mann mit einem rundzelligen Liposarkom am Oberschenkel ventral, TNM-Klassifikation: pT2, N0, M0, G3, R0. Dargestellt ist die Testung der Monosubstanzen Epirubicin, Doxorubicin, Ifosfamid und Cisplatin (Tabelle 8, Abbildung 10). Bei Patient 2 handelt es sich um einen 72-jährigen Mann mit einem Rezidiv eines myxoiden extraskelettalen Chondrosarkoms retroperitoneal, T N M Klassifikation: pT2, N1 (Lymphangiosis blastomatosa), pM1 (Haemangiosis blastomatosa, pulmonale Metastasierung), G3, R0. Dargestellt ist auch hier die Testung der oben genannten Monosubstanzen (Tabelle 9, Abbildung 11). Es zeigen sich deutliche Unterschiede im Ansprechverhalten auf die unterschiedlichen Zytostatika. Die erste Tumorprobe (Liposarkom, G3) zeigt eine geringe Sensitivität gegenüber Epirubicin und Doxorubicin und i s t resistent gegenüber Cisplatin und Ifosfamid (nur geringe Wirkung). Die zweite Tumorprobe zeigt eine geringe Sensitivität gegenüber Cisplatin, ist jedoch resistent gegenüber Epirubicin und Doxorubicin (nur geringe Wirkung). Ifosfamid wirkt in diesem Falle nicht (Vergleiche hierzu auch Tabelle 4). Für die anderen untersuchten Monosubstanzen Zytostatikakombinationen ergeben sich analoge Dosisantwortkurven. 38 und Tabelle 8: Sensitivitätsindizes für Epirubicin, Doxorubicin, Ifosfamid und Cisplatin bei Patient 1 (Liposarkom, G3, Primärtumor) Medikament Sensitivitätsindex Epirubicin 277 Doxorubicin 290 Ifosfamid 576 Cisplatin 440 Tabelle 9: Sensitivitätsindizes für Epirubicin, Doxorubicin, Ifosfamid und Cisplatin bei Patient 2 (Myxoides Chondrosarkom, G3, Tumorrezidiv) Medikament Sensitivitätsindex Epirubicin 438 Doxorubicin 415 Ifosfamid 600 Cisplatin 264 39 Patient 1 100 % tumor growth inhibition 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10 6,25 12,5 25 50 100 200 % test drug concentration Epirubicin Abbildung 10: Doxorubicin Mafosfamid Dosisantwortkurve des ersten P a tienten Liposarkom, G3, Primärtumor 40 Ifosfamid mit einem Patient 2 100 % tumor growth inhibition 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10 6,25 12,5 25 50 100 200 % test drug concentration Epirubicin Doxorubicin Mafosfamid Cisplatin Abbildung 11: Dosisantwortkurve des zweiten Patienten mit einem Myxoiden Chondrosarkom, G3, Rezidivtumor 41 5. Diskussion 5.1. Epidemiologie, Ätiologie, Risikofaktoren und Pathomorphologie von Weichteilsarkomen Weichteilsarkome gehören zu den seltenen neoplastischen Erkrankungen (1% aller soliden Tumore, für Kinder 6,5%) mit einer Inzidenz von 2-3 Fällen pro 100.000 Einwohner. Altersgipfel sind die Adoleszenz und die Zeit zwischen dem 45. und 55. Lebensjahr (Hoos et al., 2000). Die Ätiologie der sehr heterogenen Subtypen ist weitgehend unklar. Eine virale Ursache wird für einige Subklassen diskutiert, nachgewiesen ist jedoch das gehäufte Auftreten von malignen Fibrösen Histiozytomen (70%), Osteosarkomen, Fibrosarkomen und anderer nach Bestrahlungen (Brady et al., 1992). Weitere mögliche Ursachen sind karzinogene Substanzen wie Arsen und Polyvinylchlorid, Asbest, Herbizide und Chlorophenole. In Einzelfällen ließ sich eine genetische Disposition nachweisen (Toguchida et al., 1992) Insgesamt gibt es mehr als 50 Subtypen von Weichgewebssarkomen (Singer et al., 2000). Die häufigsten Weichteilsarkome sind Liposarkome (19%), Fibrosarkome (18%), und Maligne Fibröse Histiozytome, MFH (11%), gefolgt von Synovialsarkomen (7%) und Leiomyosarkomen (7%). Betrachtet man nur die Weichteilsarkome der Extremitäten ist die Reihenfolge wie folgt: Liposarkom, MFH, Fibrosarkom und Synovialsarkom. Die meisten Sarkome sind mesodermalen Ursprungs, lediglich die neurogenen Sarkome und wahrscheinlich das Ewing-Sarkom stammen vom Ektoderm ab. Sie können ubiquitär im Körper entstehen, am häufigsten ist jedoch die Lokalisation an der unteren Extremität (46%), gefolgt vom Stamm (19%), der oberen Extremität (14%), dem Retroperitoneum (13%), Hals oder Kopf (8%) (Nielsen et al., 2002). 42 5.2. Stadieneinteilung von Weichteilsarkomen Die gebräuchlichste Stadieneinteilung nach AJCC (American Joint Committee on Cancer) (1997) und UICC (Union Internationale Contre le Cancer) kombiniert das TNM-System (Tabelle 10) mit dem histologischen Grading als wichtigem prognostischen Faktor (Cormier et al., 2004) (Tabelle 11). Tabelle 10: TNM-Klassifikation für Weichteilsarkome (1997) T – Primärtumor Tx Primärtumor kann nicht beurteilt werden T0 Kein Anhalt für einen Primärtumor T1 Tumor 5 cm oder weniger in größter Ausdehnung T1a Oberflächlicher Tumor T1b Tiefer Tumor T2 Tumor mehr als 5 cm in größter Ausdehnung T2a Oberflächlicher Tumor T2b Tiefer Tumor N – Regionäre Lymphknoten Nx Reginonäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden N0 Keine regionären Lymphknotenmetastasen N1 Regionäre Lymphknotenmetastasen M – Fernmetastasen Mx Fernmetastasen können nicht beurteilt werden M0 Keine Fernmetastasen M1 Fernmetastasen p: postoperativ y: Z.n. Chemo-/Strahlentherapie r: Rezidivtumor PE oder Stanze bekommt keine TNM 43 Das histopathologische Grading (G) gliedert sich wie folgt: Gx: Differenzierungsgrad kann nicht beurteilt werden G1: Gut differenziert G2: Mäßig differenziert G3: Schlecht differenziert G4: Undifferenziert Beurteilt werden Zellreichtum, Zellpleomorphie, mitotische Aktivität und Nekroseanteil innerhalb des Tumors. Die Menge an Interzellularsubstanz wie Kollagen oder mukoides Material soll als günstiger Faktor gewertet werden. Tabelle 11: Stadiengruppierung von Weichteilsarkomen nach AJCC (1997) Stadium GTNM-Klassifikation Definition IA G1,2 T1a N0 M0 Grad 1-2, Tumor <5 cm, oberflächlich G1,2 T1b N0 M0 oder tief, keine Lymphknoten- o d e r Fernmetastasen IB Wie Stadium Ia, jedoch Tumor 5 cm G1,2 T2a N0 M0 und nur oberflächlich gelegen IIA Tumor 5 cm, tief gelegen, ohne G1,2 T2b N0 M0 regionäre LK- oder Fernmetastasen IIB G3,4 T1a N0 M0 Tumor <5 cm, oberflächlich oder tief G3,4 T1b N0 M0 gelegen, ohne regionäre LK- o d e r Fernmetastasen IIC Wie Stadium IIb, jedoch Tumor 5 cm, G3,4 T2a N0 M0 nur oberflächlich gelegen III Wie Stadium IIc, jedoch Tumor tief G3,4 T2b N0 M0 gelegen IV jedes G jedes T N1 M0 Tumor jedes G jedes T jedes N M1 Fernmetastasen 44 mit Lymphknoten- u n d / o d e r 5.3. Prognose von Weichteilsarkomen Die wichtigsten prognostischen Faktoren sind das histologische Grading, das Ausmaß der operativen Radikalität, die Größe des Primärtumors, seine Lokalisation, der histologische Subtyp und das Stadium (Coindre et al., 1996). Das AJCC-Stadium korreliert gut mit der Prognose, wobei für die Stadien I – IV 5-Jahresüberlebensraten von 80%, 60%, 40% und 10% erwartet werden können. Gegenwärtig sterben etwa 30% - 50% der Patienten innerhalb von 5 Jahren nach Diagnosestellung, meist aufgrund zu diesem Zeitpunkt bereits vorhandener Fernmetastasen. 40% - 60 % der Patienten mit einem höhergradigen Weichteilsarkom entwickeln in dieser Zeit trotz erfolgreicher lokaler Tumorbehandlung Fernmetastasen, hauptsächlich im Bereich der Lungen (Chao et al., 2002). Die mittlere Überlebenszeit bei bereits metastasiertem Weichteilsarkom beträgt etwa acht bis zwölf Monate vom Zeitpunkt der Diagnose (Chao et al., 2002; Reichardt, 2002). 5.4. Therapie von Weichteilsarkomen Die onkologiegerechte komplette Resektion des Tumors weit im Gesunden in Kombination mit adjuvanter Strahlentherapie stellt die Therapie der Wahl für Weichteilsarkome dar (Reichardt, 2002; Steinau et al., 2001). Es wird empfohlen, die Resektion m it einem Sicherheitsabstand von 2cm zur Tiefe und 5cm zur Seite durchzuführen. Reihenuntersuchungen zu erforderlichen Mindestabständen existieren aber bis heute nicht (Lehnhardt 2004). Da nur etwa 2–3% der Weichteilsarkome in regionäre Lymphknoten metastasieren, wird eine Lymphadenektomie nur bei klinisch positiven Lymphknoten durchgeführt (Kawaguchi et al., 2004). Die adjuvante (postoperative) Strahlentherapie (55 – 70 Gy) senkt das lokale Rezidivrisiko, eine Verlängerung der Überlebenszeit konnte jedoch bisher nicht nachgewiesen werden (Wang et al., 1997). Bei einem Lokalrezidiv sollte bei Fehlen von Metastasen eine erneute radikale Operation durchgeführt werden (Stoeckle et al., 2004; Bonvalot et al., 2004). 45 5.5. Chemotherapie bei Weichteilsarkomen Weichteilsarkome sind eine Tumorentität, die in konventioneller Dosierung eine hohe Resistenz gegenüber antineoplastischen Medikamenten aufweisen (Donato Di Paola & Nielsen, 2002). Dabei sind Grad-2- und Grad3-Tumoren wesentlich chemo- und radiosensitiver als G-1-Sarkome. Nur wenige Zytostatika zeigen Ansprechraten über 15%, unter den Monosubstanzen sind die wirksamsten Doxorubicin, Epirubicin und Ifosfamid mit Responseraten von 18% - 29% in der Behandlung von Primärtumoren (Frustaci et al., 2003; Frustaci et al., 1993). Epirubicin und Doxorubicin sind dann ebenbürtig, wenn eine äquitoxische Dosierung gewählt wird. Weniger wirksam in der Monotherapie von Weichteilsarkomen sind Dacarbazin (17%) und Actinomycin D (17%) (Tabelle 12). Tabelle 12: Therapieschema für die Doxorubicinmonotherapie Doxorubicinmonotherapie Doxorubicin 70mg/m² i.v. Kurzinfusion Tag 1 Wiederholung Tag 22 In den ersten 2 Zyklen Dosissteigerung um 10 mg/m² pro Zyklus, wenn Leukozytennadir über 3000/µg. Bei Einsatz von Epirubicin (statt Doxorubicin): 100 – 130 mg/m² streng i.v. Tabelle 13: Therapieschema für die wöchentliche Doxorubicinmonotherapie Doxorubicinmonotherapie wöchentlich Doxorubicin 12 – 15 mg/m² i.v. usw. fortlaufend wöchentlich, mindestens 6 Wochen 46 Bolus Tag 1, 8, 15 Tabelle 14: Therapieschema für die Ifosfamidmonotherapie Ifosfamidmonotherapie (van Oosterom et al., 1998) Ifosfamid 3g/m² i.v. 4-h-Infusion Tag 1, 2, 3 Mesna 1g/m² i.v. Bolus, 0, 4, 8 h Tag 1, 2, 3 Ifosfamid 5g/m² i.v. 24-h-Infusion Tag 1 Mesna 5g/m² i.v. 36-h-Infusion Tag 1, 2 Wiederholung Tag 22 Der Einsatz von Zweifach- oder Mehrfachkombination e n b e i Weichteilsarkomen kann die Ansprechraten steigern. Die Kombination aus Anthrazyklinen (Doxorubicin oder Epirubicin) und Ifosfamid zeigt Ansprechraten von bis zu 40% - 50% (Fernberg et al., 2004). 10% der zytostatisch induzierten kompletten Responder sind nach sechs Jahren noch tumorfrei (Frustaci et al., 2001), bei partieller Remission sollte allerdings nach Möglichkeit eine chirurgische Resektion mit dem Ziel der Tumorfreiheit angestrebt werden. Durch die Behandlung mit modernen Zweifachkombinationen kann über die komplette Remission der Erkrankung eine Verlängerung der Überlebenszeit oder sogar eine Heilung erreicht werden (Eilber et al., 2003). Eine signifikant bessere Wirkung der zytostatischen Kombinationstherapie gegenüber der Therapie mit Monosubstanzen bei Primärtumoren konnte bisher jedoch noch nicht nachgewiesen werden (Knight et al., 2004). Es zeigte sich keine Verlängerung der absoluten Überlebenszeit, lediglich eine Verlängerung der rezidivfreien Zeit (Hoos et al., 2000) (Tabelle 15). 47 Tabelle 15: Therapieschema für Kombination Ifosfamid/Doxorubicin Ifosfamid/Doxorubicin Ifosfamid Doxorubicin Mesna (Steward et al., 1993) 5g/m² i.v. 24-h-Infusion Tag 1 75mg/m² i.v. Kurzinfusion Tag 1 3g i.v. 24-h-Infusion Tag 1 1,5g i.v. 12-h-Infusion Tag 2 Wiederholung Tag 22 mindestens, maximal 6 Zyklen Zeigt die Behandlung mit Anthrazyklin-Derivaten (Doxorubicin oder Epirubicin) keine Wirkung, erfolgt oftmals ein Therapieversuch mit Ifosfamid. Studien konnten hier Ansprechraten von bis zu 30% aufzeigen. Darüberhinaus konnte die Behandlung mit hoch dosiertem Ifosfamid als Therapieoption nach einer Vorbehandlung der Tumorerkrankung mit einer konventionellen Ifosfamiddosis nachgewiesen werden (Ansprechraten von bis zu 50%) (Frustaci et al., 2003; Reichardt, 2002). Zur Zeit sind eine Vielzahl verschiedener Chemotherapeutika für die Therapie bösartiger Weichgewebstumoren bekannt. O bwohl diese Gruppe mehr als 50 Subtypen umfasst, werden nach wie vor viele Patienten mit den gleichen Zytostatikaregimes behandelt. Auch der Einfluss der Lokalisation des Tumors, sein Differenzierungsgrad und seine Größe, die die Prognose wesentlich mitbestimmen, werden standadisiert nicht mit in die Auswahl der Chemotherapie einbezogen (Bui et al., 2002; Donato Di Paola & Nielsen, 2002). 5.6. Neue Strategien in der Behandlung von Weichteilsarkomen In jüngerer Zeit wurden wiederholt neue Strategien für die adäquate Behandlung auch der einzelnen Subklassen von Weichteilsarkomen entwickelt. Ein Beispiel ist der erfolgreiche Einsatz von Imatinib-Hydrolase, einem spezifischen Tyrosinkinase-Inhibitor 48 in der Behandlung von Gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) (De Giorgi & Verweij, 2005; Demetri, 2002; Hartmann & Patel, 2005; Ryan et al., 2002). Weitere vielversprechende Medikamente wie Exatecan, TZT 1027, Trofosfamid und Topotecan sind Teil experimenteller und klinischer Studien (Budd et al., 2002; Reichardt et al., 2003; Ruyman & Grovas, 2000; van Oosterom & Verweij, 1995). Ein speziell für die Behandlung von Weichteilsarkomen hoffnungsvoller Ansatz sind die Studien mit dem Medikament ET-743 (Ecteinascidin 743), welches in klinischen Studien Ansprechraten von bis zu 50% bei nicht vorbehandelten und bis zu 20% bei bereits vorbehandelten Patienten aufwies (Demetri, 2002). Mehr als 50% aller untersuchten Patienten zeigten im Verlauf eine dauerhafte Stabilisierung ihres Krankheitsverlaufs (Bui et al., 2002; Chao et al., 2002; Ryan et al., 2001; Svancarova et al., 2002). 5.7. Stellenwert des ATP-TCA in der Chemotherapie bei Weichteilsarkomen Die Chemosensitivitätstestung an Weichteilsarkomen könnte aufgrund der unbefriedigenden Ansprechraten auf Standard-Chemotherapieprotokolle um 20% zukünftig an Bedeutung gewinnen (Chao et al., 2002; Donato Di Paola & Nielsen, 2002; Morioka et al., 2001). Hierzu wird ein zuverlässiges in vitro Testsystem benötigt, welches genaue Informationen über das Chemosensitivitätsprofil von Weichteilsarkomproben liefert, und dessen Ansprechverhalten der Ergebnisse zusätzlich Patienten mit gut mit dem i n v i v o Weichteilsarkomen auf eine Chemotherapie korrelieren. Zahlreiche vorangegangene experimentelle und klinische Studien haben bewiesen, dass der ATP-TCA diese Anforderungen erfüllen kann. In der Gynäkologischen Onkologie lieferte der ATP-TCA Ergebnisse mit hohem Vorhersagewert für das Ansprechverhalten auf verschiedene metastasierten Chemotherapieprotokolle Mammakarzinoms in (Untch der et al., Behandlung 2003) und des des rezidivierenden Ovarialkarzinom (Kurbacher et al., 2003). Die Arbeitsgruppen 49 konnten zeigen, dass das Ansprechverhalten auf Standard- Zytostatikakombinationen signifikant unterschiedlich war, und dass individuell erstellte Kombinationen teilweise bessere Ergebnisse lieferten. So zeigte sich ein signifikant unterschiedliches Ansprechverhaltern von duktalen bzw. lobulären Mammakarzinomen auf die gleichen Zytostatikakombinationen, außerdem bessere Ergebnisse bei der Wirkung neuerer Zytostatika und Zytostatikakombinationen bei Ovarialkarzinomen. Ein weiterer Vorteil des ATP-TCA ist die hohe Reproduzierbarkeit der mit dieser Methode erzielten Ergebnisse, die sowohl innerhalb eines Testansatzes als auch zwischen verschiedenen Testansätzen um weniger als 15% variieren. Die Auswertung der Testansätze mit dem Luminometer ist eine äußerst sensitive Methode und liefert präzise direkt auswertbare Ergebnisse. Wichtig für die Interpretation der Ergebnisse ist das nachgewiesene selektive Wachstum maligner Zellen in einem speziellen Kulturmedium, welches durch das mitgelieferte CAM (Complete Assay Medium) gewährleistet ist (Cree & Kurbacher, 1999). Auch in der vorliegenden Studie hat sich der ATP-TCA als effektives Verfahren zur Untersuchung der Chemosensitivität von Weichteilsarkomen erwiesen, das in 94% der Fälle auswertbare Ergebnisse lieferte (50 der 53 Testansätze). Die erhobenen Daten zeigen, dass der ATP-TCA eine wenig störanfällige Methode zur Einschätzung der ex vivo Chemosensitivität von bösartigen Weichteiltumoren ist. Die Ergebnisse belegen, dass Weichteilsarkome ein ausgeprägt heterogenes Antwortmuster auf die Behandlung mit Monosubstanzen und Kombinationspräparaten zeigen. Die Unterschiede im Ansprechverhalten auf die verschiedenen getesteten Zytostatika waren großteils signifikant. Die Ergebnisse stehen im Einklang mit den Resultaten vorangegangener klinischer Studien an anderen Tumoren (Coley, 1997; Le Cesne, 1995; Mattern & Volm, 1992; Morioka et al., 2001; Murata et al., 2000) und verdeutlichen, dass bei der Heterogenität der Weichteilsarkome eine Individualisierung der Chemotherapie vorteilhaft sein könnte. 50 5.8. Chemotherapie und Überlebensrate Trotz verschiedener Fortschritte in der Chemotherapie von Weichteilsarkomen konnten Zytostatikaprotokolle für neoadjuvante und adjuvante Chemotherapie mit Monosubstanzen oder Kombinationspräparaten die Überlebenszeit der Patienten bisher nicht signifikant verlängern (DeLaney et al., 2003; Mori et al., 2003; Rouesse & Tubiana-Hulin, 1988). Einzig die rezidivfreie Zeit nach radikaler Tumorresektion konnte durch adjuvante Therapieformen verlängert werden. Aufgrund durchschnittlicher Ansprechraten von nur etwa 15% - 25% (Chao et al., 2002; Morioka et al., 2001) hat sich die Chemotherapie bisher nicht standardisiert in der Therapie von Weichteilsarkomen etablieren können und bleibt sowohl neoadjuvant als auch adjuvant auf klinische Studien begrenzt (Reichardt, 2002). Bisher wird sie nur in fortgeschrittenen Stadien, bei Vorhandensein von Fernmetastasen oder lokal nicht kurativ resektablen Tumoren, also vor allem im palliativen Bereich, eingesetzt (Fahn et al., 2004). 5.9. Monosubstanzen und Kombiantionspräparate Die niedrige Inzidenz und große Heterogenität der Weichgewebssarkome lässt eine Testung und Entwicklung neuer Chemotherapie-Regimes mit besserer Hemmwirkung auf das Tumorzellwachstum als bisher bekannter Therapieprotokolle schwierig erscheinen (Skubitz et al., 2004; Steinau et al., 2001). Eines der am häufigsten in der Therapie von Weichteilsarkomen angewandten Monotherapie-Regimes ist die Behandlung mit Doxorubicin (Adriamycin). Klinische Studien belegen Ansprechraten von 17% -26%, vor allem in der Erstbehandlung (first line therapy) (Bramwell et al., 2003). In unseren Untersuchungen war Doxorubicin mit einer hohen Sensitivität von 70% das zweitwirksamste Medikament unter den mittels ATP-TCA getesteten Monosubstanzen. Die höchste Chemosensitivität konnten wir für Actinomycin D belegen (74% hohe Sensitivität, keine Resistenz). Bisherige 51 klinische Studien berichteten über Ansprechraten auf die Therapie mit Actinomycin D von durchschnittlich 17%, weshalb es als Monosubstanz in der Chemotherapie von Weichteilsarkomen kaum Verwendung findet (Koscielniak et al., 1999; Ruymann & Grovas, 2000). Die Ansprechraten für Ifosfamid werden mit 24% - 50% angegeben (Cartei et al., 2003; Frustaci et al., 2003; Phan & Patel, 2003; Schlemmer et al., 2003; Wall & Starkhammar, 2003, van Oosterom & Verweij, 1995). Vor allem hochdosiertes Ifosfamid (high dose ifosfamide) stellt eine Alternative in der Therapie bereits zytostatisch vorbehandelter Weichteilsarkome dar (second line therapy). Es werden Ansprechraten von bis zu 50% angegeben, allerdings wird Ifosfamid dann auch als „High dose“ in wesentlich höheren Konzentrationen verabreicht (Tursz, 1996). In unseren Untersuchungen zeigte sich unter Aktivität (64% Verwendung der Standarddosierung eine geringere hohe Sensitivität, 32% Resistenz) als bei den Monosubstanzen Doxorubicin und Actinomycin D. Interessant erscheinen die Dosisantwortkurven für die unterschiedlichen histologischen Subtypen der untersuchten Weichteilsarkomproben. Im Gegensatz zur klinischen Praxis, in der kaum Unterschiede zwischen verschiedenen Subentitäten von Weichteilsarkomen ablesen lassen, fanden wir bei unseren Antwortmuster Chondrosarkomen. Untersuchungen von signifikante Rhabdomyosarkomen Während die meisten Abweichungen im und extraskelettalen histologischen Subtypen annähernd gleich auf Actinomycin D reagierten, zeigten Rhabdomyosarkome eine deutlich stärkere Chemoresistenz (Abbildung 6). Weiterhin zeigten extraskelettale Chondrosarkome eine deutlich stärkere Chemoresistenz gegenüber Doxorubicin (Abbildung 7). Die Gründe für diese Ergebnisse sind unklar. Vor allem Actinomycin D gehört als Monosubstanz oder in Kombination zur Standardtherapie von Rhabdomyosarkomen im Kindesalter und wird für die Hyperthermie bzw. Isolierte Extremitätenperfusion eingesetzt (Koscielniak et al., 2002; Lethi et al., 1986; Ruymann, 2003; Ruymann & Grovas 2000). Weitere Studien müssen der Frage nachgehen, ob zukünftige Chemotherapieprotokolle die Unterschiede der histologischen Subtypen stärker einbeziehen sollten. In Hinsicht auf unsere Studienergebnisse könnte 52 eine individualisierte Chemotherapie für Patienten mit Weichteilsarkomen zu höheren Ansprechraten führen. Hierzu bedarf es allerdings der Korrelation mit klinischen Daten, da nur so der Vorteil der ATP-TCA gestützten individuellen Chemotherapie belegt werden kann. Aufgrund des geringen Zeitfensters erfolgte eine solche Korrelation hier nicht. Der ATP-TCA bestätigte die starke Chemoresistenz von Weichteilsarkomen gegenüber Vincristin, Cisplatin und Dacarbazin als Monosubstanzen, die schon aus früheren klinischen Studien bekannt ist (Mori et al., 2003; Phan & Patel, 2003; Reichardt, 2002). Nach Einführung der Kombiantionschemotherapie mit Adriamycin und Dacarbazin durch Gottlieb 1972 (Gottlieb et al., 1972) wurde das CYVADICSchema (Cyclophosphamid, Vincristin, Doxorubicin, Dacarbazin) entwickelt und zur Standardtherapie in der Behandlung bösartiger Weichgewebstumoren über mehr als ein Jahrzehnt (Frustaci et al., 1989). Wir testeten vier verschiedene Zytostatikakombinationen, darunter die VACKombination (Vincristin, Actinomycin D, Cyclophosphamid) und die Zweifachkombinationen aus Actinomycin D mit Ifosfamid und Doxorubicin mit Ifosfamid. Das CYVADIC-Schema zeigte hierbei die größte Chemoresistenz im Vergleich mit des anderen Testgruppen (Abbildung 5), während die Kombination aus Actinomycin D und Ifosfamid die höchste Chemosensitivität aufwies (76% hohe Sensitivität, 2% Resistenz). In der klinischen Onkologie wird heute die Zweifachkombination aus Doxorubicin und Ifosfamid bevorzugt (Issels et al., 2002). 5.10. Einfluss von Staging und Grading Der ATP-TCA lieferte weiterhin interessante Ergebnisse hinsichtlich der unterschiedlichen Differenzierungsgrade der untersuchten Tumoren (G2: n=17, G3: n=33). Während die mäßig differenzierten Tumoren (G2) im Durchschnitt eine relativ hohe Chemoresistenz aufwiesen, zeigten die schlecht differenzierten Tumoren (G3) eine signifikant höhere Chemosensibilität (Abbildung 8). Die Gründe für diese Ergebnisse könnten in 53 der höheren mitotischen Aktivität der G3-Tumoren liegen. Dies bestätigt die Hypothese, dass der Differenzierungsgrad eines Tumors Einfluss auf sein Ansprechverhalten auf eine Chemotherapie hat (van Glabbecke et al., 1999). Der histologische Differenzierungsgrad sollte als ein Untersuchungsaspekt in zukünftige Studien einfließen (Mori et al., 2003; van Haelst-Pisani et al., 1991). B e i d e n d u r c h g e f ü h r t e n Untersuchungen fanden sich signifikante Unterschiede im Antwortverhalten von Primärtumoren und Tumorrezidiven. Die Rezidivtumoren waren bei unseren Untersuchungen empfindlicher für die getesteten Zytostatika als die Primärtumoren, dargestellt für die Monosubstanzen Actinomycin D, Doxorubicin und Ifosfamid in Abbildung 9. Die Gründe hierfür bleiben ebenfalls unklar. Obwohl ein Auftreten von lokalen Rezidivtumoren die Prognose der Erkrankung deutlich verschlechtert, fanden wir eine höhere Chemosensitivität bei den Tumorrezidiven als bei den Primärtumoren (Hoos et al., 2000; Issels et al., 2001; Issels & Schlemmer, 2002; Wang et al., 1997; Wendtner et al., 2001). Auch hier könnte eine höhere mitotische Aktivität der Grund sein, da Rezidive nicht selten schneller und aggressiver wachsen als die Primärtumore (Bonvalot et al., 2004). 5.11. Einfluss des ATP-TCA auf zukünftige Studien Neue antiproliferativ wirksame Medikamente wie Exatecan, TZT 1027 und Trofosfamid sind mittlerweile nach Abschluss klinischer Phase II-Studien erhältlich und bieten teilweise gute antineoplastische Aktivität durch unterschiedliche Wirkmechanismen bei einem insgesamt günstigen Nebenwirkungsprofil (Bui et al., 2002; Chao et al., 2002; Singer et al., 2000; van Oosterom & Verweij, 1995; Wall & Starkhammar, 2003). Um die Entwicklung solcher Medikamente weiter voranzutreiben, kann der ATP-TCA als einfaches und zuverlässiges In-vitro-Testsystem verwendet werden. In unseren Studien konnten wir zeigen, dass der ATP-TCA zur Testung der individuellen prätherapeutischen Chemosensitivität von Weichteilsarkomen 54 geeignet ist. Dies unterstreicht, dass die Chemosensitivitätstestung durchführbar ist und dazu genutzt werden kann, das Verständnis für das Ansprechverhalten und die Resistenz von Weichteilsarkomen gegenüber Zytostatika zu verbessern und mögliche neue Therapiestrategien zu entwickeln. 55 6. Zusammenfassung Einleitung und Zielsetzung Weichteilsarkome sind eine seltene (1% aller soliden Malignome) u n d heterogene Gruppe von Erkrankungen (mehr als 50 Subtypen). Gegenwärtige Standardtherapie ist die onkologiegerechte Resektion weit im Gesunden in Kombination mit Strahlentherapie. Die Chemotherapie ist bisher nicht erfolgreich in die Therapie aufgenommen und auf Studien beschränkt. Nur wenige Zytostatika, unter ihnen Doxorubicin (Adriamycin), Epirubicin und Ifosfamid, zeigen Ansprechraten über 20%. Aktuelle ChemotherapieProtokolle unterscheiden kaum hinsichtlich verschiedener histologischer Subtypen bei Erwachsenen. Ziel der Untersuchungen war die Etablierung einer prätherapeutischen Chemosensitivitätstestung an Weichteilsarkomen. Material und Methoden Zur Bewertung eines in vitro Test-Systems, welches Informationen über das Chemosensitivitätsprofil individueller Weichteilsarkome liefern soll, haben wir an Tumorproben von 50 Weichgewebssarkompatienten, die im Zeitraum von August 2 0 0 2 b i s Juni 2004 an der Klinik für Plastische Chirurgie des Universitätsklinikums Bergmannsheil Bochum operiert wurden, sieben Zytostatika einzeln oder in verschiedenen Kombinationen und ein Schleimhautdesinfektionsmittel (Octenisept®) mittels eines ATP-basierenden Chemosensitivitätsassays (ATP-TCA) getestet. Das Prinzip des ATP-TCA beruht auf der Messung des intrazellulären ATP, welches ein Parameter für die Anzahl lebender Zellen darstellt. Das Tumorgewebe wird dazu in eine Einzelzellsuspension überführt, für 6-7 T a ge mit den Chemotherapeutika inkubiert und anschließend der ATP-Gehalt der Probe gemessen. Die Chemosensitivität lässt sich direkt aus dem ATP-Gehalt ablesen und wurde mittels eines Luziferin-Luziferase-basierenden Lumineszenzassays bewertet, welches individuelle Chemosensitivitätsindizes für die einzelnen Zytostatika liefert. Die Unterschiede in der Sarkomproben waren signifikant. 56 Chemosensitivität der getesteten Ergebnisse 1.) Der ATP-TCA liefert bei Weichgewebssarkomen valide Ergebnisse. Unsere Untersuchungen zeigen, dass die in vitro Testergebnisse auswertbar und reproduzierbar sind. 2.) Sowohl für die Zytostatikakombinationen Einzelmedikamente fanden wir als insgesamt auch für die unterschiedliche Ansprechraten. Die höchste Sensitivität zeigte sich für Actinomycin D als Einzelmedikament mit hoher Sensitivität bei 74% der Tumorproben (20% geringe Sensitivität, keine Resistenz) und in Kombination mit Ifosfamid (76% hohe Sensitivität, 2% Resistenz), gefolgt von Doxorubicin (Adriamycin) (70% hohe Sensitivität, 6% Resistenz) einzeln oder in Kombination mit Ifosfamid (72% hohe Sensitivität, 6% Resistenz). Dabei zeigten sich für diese Zweifachkombination bessere Ansprechraten als für die etablierten Standardtherapien wie die CYVADIC- (66% hohe Sensitivität, 4% Resistenz) oder die VAC-Kombination (70% hohe Sensitivität, 6% Resistenz). 3.) Es ließen sich signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen untersuchten histologischen Subtypen ermitteln. Die getesteten Rhabdomyosarkome des Erwachsenenalters wiesen eine signifikant höhere Chemoresistenz gegen Actinomycin D auf als die anderen getesteten Subentitäten. Gegen Doxorubicin zeigten die getesteten extraskelettalen Chondrosarkome eine höhere Resistenz als die anderen getesteten Weichgewebssarkome. 4.) Es fanden sich signifikante Unterschiede in der Chemosensitivität von Tumoren verschiedener Differenzierung (GII vs. GIII). Im Vergleich der Ansprechraten gegenüber Actinomycin D, Doxorubicin und Ifosfamid wiesen die niedrig differenzierten Tumoren insgesamt höhere Ansprechraten als die mäßig differenzierten Tumoren auf. 5.) Im Vergleich von Primärtumoren mit Tumorrezidiven zeigte sich ein höheres Ansprechverhalten der Rezidivtumoren Primärtumoren. 57 gegenüber den Schlussfolgerung Die Chemosensitivitätstestung ist bei Weichteilsarkomen durchführbar. Sie kann verwendet werden, um unser Verständnis für das Ansprechen oder die Resistenz einer Chemotherapie zu verbessern, oder neue Zytostatikakombinationen zu entwickeln. Die vorliegenden Daten lassen weiterhin erkennen, dass der ATP-TCA zur Identifizierung solcher Patienten verwendet werden kann, die möglicherweise von einer individuell angepassten zytostatischen Therapie profitieren. Ziel der klinischen Onkologie sollte es nun sein, die Voraussetzungen für die Weiterentwicklung des Konzeptes der prätherapeutischen Chemosensitivitätstestung im klinischen Alltag zu schaffen. 58 7. Literaturverzeichnis AJCC Cancer Staging Manual (1997). 5th Edition, Lippincott-Raven, Philadelphia, New York Andreotti, P.E., Cree, I.A., Kurbacher, C.M., Hartmann, D.M., Linder, D., Harel, G., Gleiberman, I., Caruso, P.A., Ricks, S.H., Untch, M. & et al. (1995). Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Res, 55, 5276-82. Andreotti, P.E., Thornthwaite, J.T., Morse, I.S. (1991). ATP Tumor Chemosensitivity Assay. In: Stanley, P.E., L.J. 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Lebenslauf Persönliches Name: Vorname: Geburtsdatum: Adresse: Familienstand: Staatsangehörigk.: Brett Daniel Stephan James 30.10.78 Schnatstr. 18 b D-44795 Bochum ledig Deutsch Schulische Ausbildung 1984 – 1988 1988 – 1997 26.05.1997 Dietrich Bonhoeffer-Grundschule, Bochum Märkisches Gymnasium, Bochum-Wattenscheid Zeugnis der Allgemeinen Hochschulreife 01.07.1997 – 31.07.1998 Zivildienst in der Zentralen Notfallaufnahme der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil, Bochum Akademische Ausbildung seit 01.10.1998 11.09.2000 28.08.2001 22.09.2003 Studium der Humanmedizin an der Ruhruniversität Bochum Zeugnis über die Ärztliche Vorprüfung Zeugnis über der Ersten Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Zeugnis über den Zweiten Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 20.10.2003 - 19.09.2004 Praktisches Jahr 1. Tertial Innere Medizin Medizinische Klinik, Pneumologie, Berufsgenossenschaftliche Kliniken Bergmannsheil, Bochum (Prof. Dr. med. G. Schulze-Werninghaus) 2. Tertial Chirurgie Chirurgische Universitäts- und Poliklinik, Berufsgenossenschaftliche Kliniken Bergmannsheil, Bochum (Prof. Dr. med. G. Muhr) 3. Tertial Plastische Chirurgie Klinik für Plastische Chirurgie, Berufsgenossenschaftliche Kliniken Bergmannsheil, Bochum (Prof. Dr. med. H.-U. Steinau) 30.11.2004 Approbation als Arzt 72 seit 15.12.2004 Wissenschaftlicher Mitarbeiter in der Chirurgischen Klinik und Poliklinik der BG-Kliniken Bergmannsheil Bochum, Universitätsklinik 73