Pankreatitis bei Patienten mit Hyperparathyreoidismus
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Aus der Medizinischen Klinik I des St. Josef Hospital Bochum -Universitätsklinikder Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. W.E. Schmidt Pankreatitis bei Patienten mit Hyperparathyreoidismus: Assoziation mit Mutationen im SPINK1 und CFTR Gen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Tilman Horn aus Essen 2008 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. W.E. Schmidt Koreferent: Prof. Dr. med. J. T. Epplen Tag der mündlichen Prüfung: 29.10.2009 Abstract / Kurzzusammenfassung Tilman Horn Pankreatitis bei Patienten mit Hyperparathyreoidismus: Assoziation mit Mutationen im SPINK1 und CFTR Gen Problem: Die Hyperkalzämie bei Patienten mit primärem Hyperparathyreoidismus (pHPT) gilt als Auslöser für die Entstehung einer Pankreatitis. Dieser Zusammenhang scheint nur milde ausgeprägt, denn die Prävalenz-Raten der Pankreatitis in großen Kollektiven liegen zwischen 1,5 und 3,5 %. Im Rahmen dieser Dissertation sollte überprüft werden, erstens: wie häufig eine Pankreatitis in einer der größten Kohorten Deutschlands von Patienten mit einem primären Hyperparathyreoidismus auftritt und zweitens: ob die Entstehung einer Pankreatitis möglicherweise durch andere bekannte genetische Risikofaktoren für eine Pankreatitis wie PRSS1, SPINK1 und CFTR Mutationen bedingt sein könnte. Methode: In einer Kohorte von 826 Patienten mit pHPT, die prospektiv in den Jahren 1987 bis 2002 charakterisiert worden waren, wurde bei 38 Patienten eine Pankreatitis diagnostiziert (4,6 %). Von 25 dieser Patienten (12 Frauen und 13 Männern) konnte DNA gewonnen und auf Mutationen im Serin Protease Inhibitor Kazal Typ I Gen (SPINK1, N34S), sowie dem kationischen Trypsinogen (PRSS1, N29I und R122H) mittels Schmelzpunktanalyse untersucht werden. Zur Analyse der CFTR Mutationen (36 Mutationen/Tn-Polymorphismus) wurde ein Hybridisierungskit benutzt. Als Kontrolle dienten 50 Patienten mit einem pHPT ohne Pankreatitis. Ergebnis: Das Pankreatitisrisiko ist bei Patienten mit einem pHPT um ein 10faches erhöht. Bei 4 von 25 Patienten mit pHPT und Pankreatitis konnte eine N34S Mutation im SPINK1-Gen identifiziert werden (16 %) (OR 8,0; Konfidenzintervall 1,0- 15,2; p < 0,001), wohingegen keine der 50 Kontrollen eine Mutation aufwies. Bei 4 Patienten wurden CFTR-Mutationen detektiert (OR 4,2; Konfidenzintervall 0,4- 7,9; p 0,002) und bei einem Patienten das 5T Allel. Ein Patient war transheterozygot für eine SPINK1 (N34S) und CFTR (R553X) Mutation. PRSS1 Mutationen fanden sich bei keinem der analysierten pHPT Patienten mit Pankreatitis. Diskussion: Die Auftretenshäufigkeit einer Pankreatitis in der Kohorte mit 4,6 % ist vergleichbar mit dem Auftreten in zuvor publizierten Studien und gegenüber der Normalbevölkerung erhöht. Dabei lassen die hier erhobenen Daten erneut vermuten, dass die pHPT vermittelte Hyperkalzämie nur eine untergeordnete Rolle bei der Entstehung einer Pankreatitis spielt. Erstmalig wurden zudem additive Risikofaktoren identifiziert und es konnte gezeigt werden, dass es bei Patienten mit pHPT und Pankreatitis eine starke Assoziation mit Mutationen im SPINK1- und CFTR-Gen gibt, als Anhalt für eine multifaktorielle Ursache der Pankreatitis bei Hyperparathyreoidismus. Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung .................................................................................................................... 7 1.1 Hyperparathyreoidismus ..................................................................................... 7 1.2 Pankreatitis.......................................................................................................... 8 1.2.1 Akute Pankreatitis........................................................................................ 9 1.2.2 Chronische Pankreatitis............................................................................. 11 1.3 Genetische Ursachen für eine Pankreatitis ....................................................... 13 1.3.1 1.4 2 3 Hereditäre Pankreatitis .............................................................................. 13 Pankreatitis assoziierte und modifizierende Gene ............................................ 14 1.4.1 Serinproteaseninhibitor Kazal-Typ I (SPINK1 : GenBank #AF286028 ).... 14 1.4.2 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) ............ 14 1.5 Pankreatitis und pHPT ...................................................................................... 15 1.6 Fragestellung..................................................................................................... 16 Patienten ................................................................................................................... 17 2.1 pHPT-Kohorte ................................................................................................... 17 2.2 Patienten mit pHPT und Pankreatitis ................................................................ 17 2.3 pHPT Kontroll-Gruppe ohne Pankreatitis .......................................................... 18 2.4 Ethikvotum......................................................................................................... 18 Material und Methoden: ............................................................................................ 19 3.1 DNA-Extraktion.................................................................................................. 19 3.2 Schmelzkurvenanalyse und Real-Time-PCR am LightCycler™ für SPINK1- (N34S) und PRSS1-(N29I und R122H) Mutationen...................................................... 20 4 3.3 Master Mix Ansätze für PRSS1 (N29I, R122H) und SPINK1 (N34S)................ 23 3.4 DNA-Sequenzierung ......................................................................................... 24 3.5 CFTR-Analyse................................................................................................... 25 3.6 Verbrauchsmaterialien ...................................................................................... 27 3.7 Geräte ............................................................................................................... 28 3.8 Statistik.............................................................................................................. 28 Ergebnisse ................................................................................................................ 29 4.1 Klinische Daten der Gesamtkohorte.................................................................. 29 4.2 Klinische Daten der Patienten mit pHPT und Pankreatitis ................................ 29 4.2.1 Mutationsanalyse....................................................................................... 30 4.2.2 PRSS 1-Gen-Mutationen........................................................................... 30 4.2.3 SPINK 1-Gen-Mutationen.......................................................................... 30 4.2.4 CFTR-Gen-Mutationen .............................................................................. 32 4.2.5 Transheterozygoter Patient (SPINK1: N34S/ CFTR: R553X) mit pHPT und Pankreatitis ............................................................................................................... 34 5 Diskussion................................................................................................................. 39 6 Literaturverzeichnis ................................................................................................... 50 Abkürzungsverzeichnis: ACP alkoholisch bedingte chronische Pankreatitis AP akute Pankreatitis CaSR Calcium Sensing Rezeptor CF zystische Fibrose CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator Cl¯ Chlorid-Ion CP chronische Pankreatitis DNA Desoxyribonukleinsäure FRET fluorescence resonance energy transfer H2O Wasser HP hereditäre Pankreatitis ICP Idiopathisch chronische Pankreatitis LC LightCycler MgCl2 Magnesiumchlorid NaCl Natriumchlorid OMIM Online Mendelian Inheritance in Man ((OMIM):http://www.ncbi.nlm.nih.gov) PCR Polymerasekettenreaktion pHPT primärer Hyperparathyreoidismus PRSS1 Serinprotease 1 (kationisches Trypsinogen) PTH Parathormon SPINK1 Serinproteinaseinhibitor Kazal Typ 1 TP tropische Pankreatitis Ferner wurden im Text der international gültige Einbuchstaben-Code der Aminosäuren und die Abkürzungen der Fachzeitschriften verwendet. 5 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Ursachen der akuten Pankreatitis modifiziert nach Greenberger und Toskes [33] ............................................................................................................................. 10 Tabelle 2:TIGAR-O-Klassifikation (Ursachen der chronischen Pankreatitis) modifiziert nach Etemad und Whitcomb [29]............................................................................... 12 Tabelle 3 : Mutationen auf dem INNO-LiPA CFTR 19-Teststreifen .................................. 26 Tabelle 4: Mutationen und Tn polymorphismen auf dem INNO-LiPA CFTR 17+TnTeststreifen ................................................................................................................ 27 Tabelle 5: Charakteristik der Gesamtkohorte und der Patienten mit pHPT und Pankreatitis ................................................................................................................................... 35 Tabelle 6: Ergebnis der (PRSS1, SPINK1 und CFTR) Mutationsanalysen bei Patienten mit pHPT und Pankreatitis ............................................................................................... 36 Tabelle 7: Häufigkeitswahrscheinlichkeit der N34S SPINK1 und CFTR Mutationen bei pHPT und Pankreatitis ............................................................................................... 37 Tabelle 8: Charakterisierung der Patienten mit pHPT und Pankreatitis............................ 38 Tabelle 9:Studien zur Korrelation pHPT/Pankreatitis........................................................ 39 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Beispiel einer Schmelzkurvenanalyse für eine SPINK1 N34S Mutation ...... 22 Abbildung 2: CFTR Testkarte............................................................................................ 26 Abbildung 3: SPINK1-(N34S)-Schmelzkurvenanalyse für pHPT/Pankreatitis Patienten .. 32 Abbildung 4: INNO LIPA CFTR 19 Testkarte für Patienten mit pHPT und Pankreatitis.... 34 6 1 Einleitung 1.1 Hyperparathyreoidismus Der Hyperparathyreoidismus ist eine Erkrankung der Nebenschilddrüse mit einer generalisierten Störung des Kalzium-, Phosphat- und Knochenstoffwechsels infolge einer vermehrten Parathormonproduktion. Die Erhöhung des zirkulierenden Parathormons (PTH) führt zu einer Hyperkalzämie und Hypophosphatämie. Der primäre Hyperparathyreoidismus (pHPT) gehört zu den häufigen endokrinologischen Erkrankungen mit einer Prävalenz von ca. 0,2 bis 0,4 %. Frauen sind zwei- bis dreimal häufiger betroffen als Männer [41]. Meistens wird die Diagnose nach dem 40. Lebensjahr gestellt. Bei mehr als 80 % der Patienten mit pHPT ist ein singuläres Adenom der Nebenschilddrüse die Ursache [83]. Weitere Ursachen für einen Hyperparathyreoidismus sind multiple Adenome der Nebenschilddrüse (5 %), Hyperplasie der Epithelkörperchen (15 %) und Karzinome der Epithelkörperchen (<1 %). Selten wird ein Hyperparathyreodismus im Rahmen einer multiplen endokrinen Neoplasien (MEN, autosomal dominante Vererbung) beobachtet. Die MEN-1 (Wermer-Syndrom) weist neben dem Hyperparathyreoidismus Tumoren der Hypophyse und des Pankreas auf und ist mit einer Magensäurehypersekretion und einem Ulkusleiden (Zollinger-EllisonSyndrom) assoziiert. Phäochromozytom, Die ein MEN-2A medulläres (Sipple-Syndrom) ist Schilddrüsenkarzinom durch und ein einen Hyperparathyreoidismus charakterisiert, bei der MEN-2B (Gorlin-Syndrom) treten zusätzlich Neurinome auf, meist jedoch kein Hyperparathyreoidismus [34]. Die Störung der Kalziumhomöostase resultiert aus der vermehrten PTH Sekretion und seiner Wirkung im physiologischen Regelkreis. Dieser ist durch die Steuerungselemente intestinalen der ossären Kalzium-Resorption Kalzium-Mobilisierung, und Steigerung der Steigerung tubulären der Kalzium- Reabsorption gekennzeichnet. Die klassische Symptomtrias "Stein-, Bein- und Magenpein" im Sinne einer Nephrolithiasis, der Osteitis fibrosa cystica sowie Dyspepsie oder Ulcera ventriculi findet man heute eher selten [2, 13]. Die Diagnose des pHPT ist daher oft eine Zufallsdiagnose bei erhöhtem Kalziumspiegel. Bei genauerer Befragung der 7 Patienten mit pHPT gibt die Mehrzahl der Patienten jedoch Beschwerden wie Abgeschlagenheit, Müdigkeit, Reizbarkeit und Mangel an sexuellem und emotinalem Interesse an [36, 37, 54]. Die initiale Verdachtsdiagnose kann laborchemisch bestätigt werden. Es imponiert ein erhöhtes Kalzium (Serumkalzium > 2,6 mmol/l (Normwert: 2,2-2,6 mmol/l) bei normaler Nierenfunktion und normalem Gesamteiweiß), ein erniedrigtes Phosphat und ein erhöhtes intaktes PTH im Serum. Im Urin lässt sich ein erhöhter Kalzium und Phosphatspiegel nachweisen. Im Rahmen der Lokalisationsdiagnostik spielt die Sonographie des Halses zur Diagnostizierung vergrößerter Nebenschilddrüsen, bei eingeschränkter Sensitivität, eine wichtige Rolle. Sensitiver scheinen Computertomographie oder Szintigraphie. Die Erfolgsquote der bilateralen explorativen Parathyreoidektomie durch einen erfahrenen, endokrinen Chirurgen liegt bei ca. 95 Prozent [46]. Die kurative Therapie der Wahl ist eine Entfernung der vergrößerten Epithelkörperchen, wobei die Indikation zur Operation dann vorliegt, wenn es sich um einen symptomatischen pHPT handelt. Durch rechtzeitige Entfernung der vergrößerten Epithelkörperchen ist die Erkrankung heilbar. 1.2 Pankreatitis Die Pankreatitis ist eine abakterielle entzündliche Erkrankung der Bauchspeicheldrüse. Bereits 1896 wurde von Chiari die Hypothese postuliert, dass das entscheidende Ereignis für die Entstehung einer Pankreatitis die Selbstverdauung durch die eigenen Verdauungsenzyme ist [17]. Bei der Pankreatitis kann man die akute, die akut rekurrierende und die chronische Form unterscheiden (siehe 1.2.1 und 1.2.2). Die alterspezifische Häufigkeit in den westlichen Industrieländern zeigt einen Gipfel in der Altersgruppe zwischen 35 und 44 Jahren. Die Inzidenz der akuten Pankreatitis beträgt ca. 10 Neuerkrankungen pro 100.000 Einwohnern und Jahr 8 [8, 79], die Inzidenz der chronischen Pankreatitis beträgt zwischen 3,5 bis 10 Neuerkrankungen pro 100.000 Einwohner und Jahr [4, 15, 48, 88]. 1.2.1 Akute Pankreatitis Die akute Pankreatitis zeigt einen weit differierenden klinischen Verlauf. Von der klinisch milde verlaufenden, interstitiell-ödematösen Form (70 - 80 %) [8] bis zur hämorrhagisch-nekrotisierenden Form (20 - 30 %) [14, 44] mit generalisierter Sepsis und Multiorganversagen sind alle Ausprägungen möglich und werden im klinischen Alltag gesehen [76]. Bei der milden Form beträgt die Letalität weniger als 2 % [9], wohingegen bei schwerem Verlauf die Letalität 15 - 25 % [32] beträgt. Symptome einer akuten Pankreatitis sind plötzlich einsetzende Oberbauchschmerzen, Übelkeit, Erbrechen und Fieber. Diagnosekriterien sind neben den klinischen Symptomen die Erhöhung der pankreatischen Enzyme: Amylase und Lipase (über das Dreifache des oberen Grenzwertes) und bildmorphologische Kriterien im transabdominellen Ultraschall oder Abdomen-CT wie z.B. ein peripankreatisches Ödem oder Nekrosen. Auch die Kalzium-, Magnesium-, Natrium-, Kalium-, Bikarbonat-, Glukose- oder Fettwerte im Blut können erhöht sein. Pathophysiologische Modelle zeigen, dass sich die akute Pankreatitis in drei Phasen entwickelt [35]. Die erste Phase ist charakterisiert durch die intrapankreatische Aktivierung von Verdauungsenzymen mit darauf folgender Schädigung der Azinuszellen. Trypsin spielt hierbei eine entscheidende Rolle, denn neben der Fähigkeit zur Aktivierung anderer Zymogene wie Proelastase, Chymotrypsinogen besteht die Fähigkeit zur Autoaktivierung. Die zweite Phase beinhaltet eine proinflammatorische Reaktion unterschiedlicher Ausprägung mit Aktivierung, Chemoattraktion und Sequestration von Neutrophilen im Pankreas, sowie der Ausschüttung unterschiedlicher Zytokine. Die dritte Phase umfasst die lokalen und systemischen Auswirkungen der aktivierten proteolytischen Enzyme und der freigesetzten proinflammatorischen Mediatoren. 9 Vielfältige Auslöser für eine akute Pankreatitis sind bekannt. Die beiden häufigsten Ursachen sind Gallensteine und Alkoholkonsum (ca. 90 %) [12, 86]. Weitere Ursachen zeigt Tabelle 1, wobei in diesem Zusammenhang auch die Hyperkalzämie als mögliche Ursache einer akuten Pankreatitis aufgeführt wird. Tabelle 1: Ursachen der akuten Pankreatitis modifiziert nach Greenberger und Toskes [33] häufige Ursachen - Gallensteine (einschließlich Mikrolithiasis) (30-60 %) - Alkohol (akuter und chronischer Alkoholismus (1530 %) - Hypertriglyceridämie - Endoskopisch retrograde Cholangiopankreatikographie (ERCP), besonders nach Papillen-Manometrie - Trauma (besonders stumpfes abdominelles Trauma) - postoperativ (abdominelle und nicht abdominelle Operationen) - Arzneimittel (z.B. Azathioprin, 6-Mercaptopurin, Sulfonamide, Östrogene,Tetrazykline, Valproat, antiretrovirale Substanzen) - Sphinkter-Oddi-Dysfunktion seltene Ursachen - vaskuläre Veränderungen und Vaskulitis - (Ischämie nach Herzoperationen) - Kollagenosen und thrombotisch thrombozytopenische Purpura (TTP) - Pankreaskarzinom - Hyperkalzämie - Periampulläre Divertikel - Pankreas divisum - hereditäre Pankreatitis - mit Pankreatitis assoziierte Mutationen (z.B. SPINK1, CFTR) - Zystische Fibrose - Niereninsuffizienz sehr seltene Ursachen - Infektionen ( Mumps, Coxsackie-Viren, Zytomegalievirus, Echovirus, Parasiten) - Autoimmunerkrankungen ( z.B. Sjögren-Syndrom) 10 Die Therapie der akuten Pankreatitis ist überwiegend auf supportive Maßnahmen beschränkt, wie intensivmedizinische Überwachung bei schwerem Verlauf, analgetische Therapie, ggf. Nahrungskarenz, ausreichende Flüssigkeitssubstitution, eventuell Antibiotika-Gabe und ggf. eine chirurgische Intervention bei Komplikationen [25]. Circa 90 % der AP-Fälle heilen ohne Residuen aus, wohingegen es in etwa 10 % zu einem allmählichen Übergang von der akuten in eine chronische Pankreatitis kommt. 1.2.2 Chronische Pankreatitis Bei der chronische Pankreatitis (CP) handelt es sich um eine rekurrierende oder kontinuierliche entzündliche Erkrankung des Pankreas. Sie ist durch irreversible morphologische Veränderungen charakterisiert und mündet bei einem Teil der Patienten in einem exokrinen und endokrinen Funktionsverlust [84]. Im Verlauf der Erkrankung kann es durch die exokrine und/oder endokrine Pankreasinsuffizienz zu Insulinmangeldiabetes Pankreaspseudozysten, Maldigestion, kommen. Milz- und Gewichtsverlust, Weitere Steatorrhoe Komplikationen Pfortaderthrombosen, Stenosen und sind des Pankreasgangsystems oder des distalen Ductus choledochus. Die Patienten leiden insbesondere an chronischen Oberbauchschmerzen, Gewichtsverlust und Steatorrhoe. Mit zunehmender Dauer der Erkrankung kann es zu einer malignen Entartung des Pankreas kommen, wobei das relative Risiko um fünf Prozent innerhalb von 20 Jahren zunimmt [49]. In bis zu 70 - 80 % der Fälle ist die Ursache für eine CP bei Erwachsenen äthyltoxisch [3, 28]. Weitere Ursachen können metabolische Störungen und anatomische Anomalien sein (Ursachen/Risiko-Klassifikationssystem der chronischen Pankreatitis siehe Tabelle 2), wobei auch in diesem Zusammenhang die Hyperkalzämie und der pHPT erwähnt werden. Genetische Ursachen werden als hereditäre Pankreatitis und „modifizierende Gene“ bezeichnet. 11 Tabelle 2:TIGAR-O-Klassifikation (Ursachen der chronischen Pankreatitis) Rezidivierende Obstruktive modifiziert nach Etemad und Whitcomb [29] Toxisch- Idiopathisch Genetisch Autoimmun metabolisch alkoholisch akute Pankreatitis early onset autosomal isolierte postnekrotische dominant autoimmune (schwere akute (Mutationen des chronische Pankreatitis) kationischen Pankreatitis Pankreatitis Pankreas divisum Trypsinogen im Codon 29 und 122) Rauchen late onset modifizierende syndrom- wiederkehrende Sphinkter Oddi Gene (z.B. CFTR; assozierte akute Pankreatitis Dysfunktion SPINK1- autoimmune Mutationen; chronische kationisches Pankreatitis (z.B. Trypsinogen, Sjögren- Codon 16, 22, 23) Syndrom; PBC) Gangobstruktion Hyperkalzämie, tropische (teils Gefäßerkrankungen z.B. bei pHPT auch genetisch oder Ischämien bedingt) Hyperlipidämie nach Ganzkörper- duodenale bestrahlung ampulläre Zyste Chronische posttraumatische Niereninsuffizienz Pankreasgangnarbe medikamentös Vergiftungen 12 1.3 Genetische Ursachen für eine Pankreatitis 1.3.1 Hereditäre Pankreatitis Die hereditäre Pankreatitis (HP) als Unterform der CP wurde zum ersten Mal 1952 von Comfort und Steinberg beschrieben [22]. Die genaue Charakterisierung der HP ist eng verbunden mit der Identifizierung einer amerikanischen Familie im mittleren Westen. Bereits 1972 publizierten McElroy und Christiansen in einer Arbeit im American Journal of Medical Genetics [57] den Stammbaum einer Familie, deren betroffene Familienmitglieder bereits im Kindesalter an einer Pankreatitis mit chronischem Verlauf erkrankten. Im Jahr 1996 gelang es unabhängig voneinander drei Arbeitsgruppen den Genort für die hereditäre Pankreatitis auf Chromosom 7 (7q35) [51, 67, 103] zu lokalisieren, auf dem auch wichtige pankreatische Verdauungsenzyme lokalisiert sind (z.B. Carboxypeptidase A1, Trypsinogen Familie). Whitcomb et al. identifizierten daraufhin, im selben Jahr, mit Hilfe der DNA der erkrankten Familie, eine Punktmutation im Exon 3 des kationischen Trypsinogen (PRSS1; OMIM 276000) als Erkrankungsursache für die hereditäre Pankreatitis [103]. Es handelte sich dabei um den Austausch eines Arginin durch Histidin an Position 122 der Proteins (R122H). In rascher Folge wurden weitere Mutationen im PRSS1 Gen beschrieben, z.B. N29I, A16V, D22G oder K23R, wobei die N29I und R122H Mutationen mehr als 90 % ausmachen. Bis zum heutigen Zeitpunkt sind mehr als 25 PRSS1 Gen Varianten beschrieben worden (für die komplette Übersicht: www.uni- leipzig.de/pancreasmutation/db.html). Die Definition der HP umfasst ein autosomal dominantes Krankheitsbild (Penetranz ca. 80 %) mit meist schon im Jugendalter (13,9 ± 12,2 Jahren) [52] rezidivierenden akuten Pankreatitiden und der Entwicklung einer chronischen Pankreatitis mit zwei Betroffenen einer Generation oder drei Betroffenen in mehr als einer Generation [56, 82, 85]. Als Spätkomplikation zeigt sich bei Patienten mit einer HP eine deutlich erhöhte Inzidenz für das Auftreten von Pankreaskarzinomen (bis zu 40 % im Alter von 70 Jahren) [52], so dass neben der funktionellen Bedeutung ein wichtiger klinischer Grund besteht die Patienten mit einer HP zu identifizieren. Die Entdeckung der PRSS1 Mutationen unterstützte zudem die Hypothese, dass Trypsin eine Schlüsselrolle in der Pankreatitisentstehung spielt. 13 1.4 Pankreatitis assoziierte und modifizierende Gene 1.4.1 Serinproteaseninhibitor Kazal-Typ I (SPINK1 : GenBank #AF286028 ) Der Serinprotease-Inhibitor Kazal Typ I (SPINK1; OMIM 167790) ist ein wichtiger intrapankreatischer Trypsin-Inhibitor, der Trypsin durch kovalente Bindung zwischen dem katalytischen Serin der Protease und einem Lysin im reaktiven Zentrum von SPINK1 inhibiert [7]. Lokalisiert ist das SPINK1-Gen auf dem Chromosom 5 [40]. Die SPINK1-vermittelte Inhibition des Trypsin ist allerdings temporär, da der Typsin-SPINK1-Komplex selbst als Substrat für Trypsin dient. Somit kommt es im Verlauf zu einer Reduktion der SPINK1 Aktivität und zur dadurch vermittelten Wiederherstellung der ursprünglichen Trypsinaktivität. Dies wird als Phänomen der „temporären Inhibition“ bezeichnet [50]. Chen et al. beschrieben im Jahre 2000 als erste bei Patienten mit einer idiopathischen chronischen Pankreatitis (ICP) N34S SPINK1 Mutationen [16], wobei eine Assoziation erstmals von Witt et al. bei 23 % der untersuchten Patienten mit einer ICP aufgezeigt werden konnte [104]. 1.4.2 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Bei der zystischen Fibrose handelt es sich um eine Erkrankung, die insbesondere durch eine chronische Lungenerkrankung charakterisiert ist, wobei im Verlauf auch Komplikationen des Pankreas auftreten können [61, 89]. Sie ist die häufigste autosomal rezessiv vererbte Erkrankung. Der Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR; OMIM 602421) ist 1989 als Krankheitsgen der zystischen Fibrose (CF) (OMIM 219700) identifiziert worden [42, 70] und befindet sich auf dem langen Arm von Chromosom 7 (7q31). In Deutschland sind 4 % der Bevölkerung asymptomatische heterozygote Genträger [5, 24]. Bei 1 - 2 % der Patienten mit CF tritt im Rahmen der Erkrankung eine rezidivierende Pankreatitis auf [81]. Das CFTR-Gen kodiert für einen cAMP-abhängigen Chloridkanal [71] und besitzt eine bedeutende Rolle in der Sekretion von Bikarbonat und Chlorid. Aktuell sind bereits mehr als 1500 Mutationen im CFTR-Gen beschrieben worden, wobei die kodierende Sequenz 27 Exons beinhaltet. In Deutschland sind ca. 72 % 14 der Patienten mit zystischer Fibrose homozygot oder compound heterozygot für acht Mutationen des CFTR-Gens (∆508F, G542X, R553X, W1282X, N1303K, 621+1G→T, 1717-1G→A und R117H) [93]. Die häufigste Mutation des CFTRGens mit einer Frequenz von 66 % stellt die ∆508F-Deletion dar [93]. Die Erstbeschreibung von CFTR Mutationen bei Patienten mit einer CP bzw. ICP erfolgte 1998 durch zwei unterschiedliche Arbeitsgruppen aus England und den USA [18; 80]. Sharer et al. konnten bei Patienten mit einer CP heterozygote CFTR Mutationen nachweisen [80], wohingegen Cohn et al. bei Patienten mit einer ICP CFTR Mutationen diagnostizierten [18]. 1.5 Pankreatitis und pHPT Im Rahmen des pHPT steht die Hyperkalzämie als mögliche Ursache der Pankreatitis und weitgehend akzeptierter Pathomechanismus im Vordergrund [29]. Die Trypsinaktivierung ist kalziumabhängig, wobei der Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration eine entscheidende Rolle spielt. Es ist beschrieben worden, dass ein erhöhter zytosolischer Kalziumspiegel, ein klassisches Symptom eines primären Hyperparathyreoidismus, eine akute Pankreatitis auslösen kann [87]. In den größten Studien zum pHPT ist allerdings nur eine Auftretenshäufigkeit von einer Pankreatitis zwischen 1,5 % [10, 99] und 6,8 % [1] beschrieben worden. 15 1.6 Fragestellung Durch die Kooperation mit der chirurgischen Klinik des Universitätsklinikums Gießen-Marburg gelang es eine der weltweit größten Kohorten von Patienten mit einem pHPT zu untersuchen. Dabei konzentriert sich diese Dissertation auf folgende wesentlichen bisher nicht beantworteten Fragestellungen: 1) Wie hoch ist die Prävalenz einer Pankreatitis bei Patienten mit einem primären Hyperparathyreoidismus in Deutschland? 2) Gibt es zusätzliche genetische Risikofaktoren bei Patienten mit einem primären Hyperparathyreoidismus und Pankreatitis? Neben der Auswertung der Datenbank zur Feststellung der Prävalenz wurde die identifizierte pHPT/Pankreatitis Kohorte auf Mutationen in den SPINK1, PRSS1 und CFTR Genen untersucht. Letztere sind bekannte genetische Risikofaktoren für eine Pankreatitis. Methodisch wurden dazu PCR, DNA-Sequenzierung und Hybridisierungskits benutzt. 16 2 Patienten 2.1 pHPT-Kohorte Über einen Zeitraum zwischen April 1987 und Dezember 2002 wurden 826 Patienten mit Hyperparathyreoidismus in der chirurgischen Klinik des Universitätsklinikums Gießen-Marburg untersucht und behandelt. Erfasst wurden Alter und Geschlecht der Patienten, Parathormonspiegel, Phosphat, Kalzium, Lipase, Amylase und klinische Symptome wie Nierensteine, peptische Ulcera und Knochenschmerzen. Lag eine Pankreatitis vor, wurde hier unterschieden zwischen einer akuten, akut hämorrhagischen, akut wiederkehrenden und chronisch kalzifizierenden Form der Pankreatitis. Die Behandlung des Hyperparathyreoidismus in der chirurgischen Klinik des Universitätsklinikums Gießen-Marburg bestand aus einer bilateralen Exploration und Identifikation von allen vier Epithelkörperchen (Glandulae parathyreoideae), sowie der Entfernung von vergrößerten Drüsen, sowohl bei sporadischen Fällen als auch im Falle einer multiplen endokrinen Neoplasie (MEN). 2.2 Patienten mit pHPT und Pankreatitis Die Diagnose der akuten Pankreatitis wurde anhand folgender Kriterien gestellt: 1) akute abdominelle Schmerzen; 2) laborchemisch erhöhte Pankreasenzyme (Lipase oder Amylase ≥ des 3-fachen des oberen Grenzwertes); 3) sonografische oder radiologische Kriterien für eine AP (Pankreasnekrose, ödematöse Pankreatitis, interstitielle Kalzifizierung im CT). Die Diagnose der chronischen Pankreatitis wurde in Anlehnung an die Marseille-Rom-Klassifikation gestellt [77]. In der pHPT-Gesamtkohorte wurden 38 Patienten (4,6 %) mit Pankreatitis identifiziert, wobei von 25 Patienten DNA gewonnen und auf die spezifischen Mutationen untersucht werden konnte. Auf die spezifische Zusammensetzung dieser Patientengruppe wird in Tabelle 5 sowie im Ergebnisteil dezidiert eingegangen. 17 2.3 pHPT Kontroll-Gruppe ohne Pankreatitis Die Kontroll-Gruppe bestand aus Patienten mit einem primären Hyperparathyreoidismus ohne Nachweis einer Pankreatitis und wurde aus der Gesamtkohorte rekrutiert. Es wurde DNA von 50 Patienten aus dieser Population untersucht. Dabei handelte es sich um 50 Patienten (25 Frauen, 25 Männer; das Durchschnittsalter bei Operation betrug 60 ± 13 Jahre) mit einem isolierten primären Hyperparathyreoidismus ohne Hinweise auf eine akute Pankreatitis oder abdominelle Beschwerden in der Vorgeschichte. Ein Patient aus der KontrollGruppe wies ein MEN-Syndrom auf. Eine detaillierte klinische, laborchemische und symptomatische Auflistung der Patienten zeigt Tabelle 5. 2.4 Ethikvotum Die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission der Ruhr-UniversitätBochum als unbedenklich eingestuft (Ethikvotum 2436). Alle Patienten wurden über die wissenschaftlichen Ziele und Durchführung molekulargenetischer Untersuchungen aufgeklärt. Die Entnahme von venösem Blut erfolgte nach Aufklärung und Zustimmung der Patienten. 18 3 Material und Methoden: 3.1 DNA-Extraktion Die genomische DNA wurde einerseits in der Abteilung für Allgemeinchirurgie des Universitäts-Klinikum Gießen-Marburg in Marburg aus Nebenschilddrüsengewebe, welches kryokonserviert war, und im Weiteren in der Medizinischen Klinik I der Universitätsklinik St. Josef-Hospital in Bochum aus EDTA-Vollblutproben gewonnen. Die DNA-Extraktion der Proben erfolgte mittels "QIAmp Mini Kit" nach Anweisungen des Herstellers (Qiagen, Hilden, Deutschland). Zu Beginn werden 20 µl Qiagen Protease (oder Proteinase K) in ein 1,5 ml großes Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Dann gibt man 200 µl EDTA-Blut von den Patientenproben und 200 µl Puffer AL (Lysepuffer) hinzu und das Ganze wird ca. 15 Sekunden auf dem Vortexer gut durchmischt. Nach 10 Minuten Inkubation im Wasserbad bei 56 °C werden 200 µl Ethanol (96-100 %) hinzugegeben und auf dem Vortexer für 15 Sekunden durchmischt. Das Gemisch wird nun vorsichtig in einen Säulenfilter (QIAamp Spin Column), der in einem 2 ml Auffangröhrchen steckt, gegeben und für 1 Minute bei 8000 rpm zentrifugiert. Die DNA ist jetzt an das Filtermaterial der Säule gebunden und diese wird auf ein neues Auffangröhrchen gesetzt, während das alte mit dem Filtrat verworfen wird. Auf die Säule gibt man 500 µl Puffer AW1 (Waschpuffer 1) und man zentrifugiert erneut für 1 Minute bei 8000 rpm. Die Säule wird erneut in ein neues Auffangröhrchen gesetzt, und dann mit 500 µl Puffer AW2 (Waschpuffer 2) erneut gewaschen und für 3 Minuten bei 13000 rpm zentrifugiert. Um noch kleine Reste des Puffers aus dem Filter zu lösen, zentrifugiert man diesen in einem neuen Röhrchen ohne Zugabe eines Puffers für eine weitere Minute bei 13000 rpm. Nach diesem Schritt gibt man dann nach dem Umsetzen der Säule auf ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen 200 µl des Elutionspuffers Puffer AE oder H2O dd hinzu und zentrifugiert nach 1 Minute Inkubation bei Raumtemperatur (15-25° C) für 1 Minute bei 8000 rpm. Die vorher am Filter gebundene DNA befindet sich nun im Eluat. 19 3.2 Schmelzkurvenanalyse und Real-Time-PCR am LightCycler™ für SPINK1-(N34S) und PRSS1-(N29I und R122H) Mutationen Zum Nachweis der von uns untersuchten Mutationen haben wir Polymerasekettenreaktionen (PCR) mit dem LightCycler™System der Firma Roche Molecular Biochemicals durchgeführt. Es handelt sich dabei um eine RealTime-PCR. Grundidee der PCR ist es DNA durch zwei flankierende Primer mit Hilfe der DNA-Polymerase durch wiederholte Verdoppelung in mehreren Zyklen zu vervielfältigen. Man verwendet die PCR dabei um kurze, genau definierte Teile eines DNA-Stranges zu vervielfältigen, wobei nur kurze DNA-Abschnitte bis zu ca. 10 kbp (10.000 Basenpaare) kopiert werden können. Ein PCR-Prozess besteht aus einer Serie von 20-30 Zyklen. Jeder Zyklus besteht aus drei Schritten. Zuerst Wasserstoffbrückenbindungen, werden die die durch Erhitzen DNA-Stränge auf 96° C die zusammenhalten aufgebrochen. Dies bezeichnet man als Melting = Schmelzen. Man senkt dann die Temperatur ab und die Primer können sich an die Einzelstrang-DNA anlegen, hierbei handelt es sich um das so genannte Annealing = Anlagern. Die benötigte Temperatur (Annealing-Temperatur) hängt vom jeweiligen Primer ab. Man wählt die Temperatur bei der Standard PCR so, dass sie ca. 3° C unter der errechneten Schmelztemperatur von Primer und Zielsequenz liegt. Im letzten Schritt füllt dann die DNA-Polymerase von dem Primer aus beginnend die fehlenden Stränge mit Nukleotiden auf. Diese bezeichnet man als Elongation = Verlängerung. Die hierbei benötigte Temperatur (68 -72 °C) hängt von der DNA-Polymerase ab. Die für die Vervollständigung benötigte Zeit heißt Extensionszeit, diese muss entsprechend der zur erwartenden Amplifikationsgrösse gewählt werden und errechnet sich wie folgt: Größe des Amplifikates in bp/25. Wählt man die Extensionszeit zu kurz, kann die Polymerase das Amplifikat nicht während eines Zyklus komplett synthetisieren. Die so in einem Zyklus entstandenen DNA-Stränge bilden dann die Vorlage für den nächsten Zyklus. Die Schmelzkurvenanalyse ist ein Verfahren, das auf dem Prinzip der herkömmlichen PCR beruht und zusätzlich die Möglichkeit der Identifizierung von Mutationen bietet. 20 Man erreicht die Identifizierung dadurch, dass sich zwei Hybridsonden (Anchorund Sensor-Sonde) an das Produkt binden. Man markiert die Sonden mit zwei Fluorochromen, die sich während der Zyklen an das PCR-Produkt binden. Einer der Fluorochrome, das Donator-Fluorochrom wird dann durch eine Lichtquelle angeregt und gibt einen Teil seiner Energie an das Akzeptor-Fluorochrom ab. Diese Messmethoden benötigen den Gebrauch von spezifischen SequenzSonden, wie bereits oben beschrieben. Eine dieser Methoden ist die so genannte Hybridisations-Sonden-Methode. Diese Methode wird benutzt zur DNA-Detektion und –Quantifizierung und hat eine maximale Spezifität zur Identifikation des gesuchten Produktes. Man ergänzt zu den Reaktionskomponenten, die auch bei der konventionellen PCR benötigt werden, zwei speziell entwickelte sequenzspezifische Oligonukleotide (zwei Sonden), welche mit zwei verschiedenen Fluoreszenz-Farben versehen werden. Die Anchor-Sonde erhält an der 5´-Position einen Farbstoff z.B. LC Red 640 (Acceptorfarbstoff/ z.B. LightCycler Red 640) und an der 3´-Position ein –p (phosphoryliertes Ende). Die Sensor-Sonde erhält am 3´-Ende eine Markierung mit z.B. Fluorescein einem Donorfarbstoff. Die Erkennung basiert auf der Emittierung von einem Fluoreszenz-Signal mit einer spezifischen Wellenlänge durch den so genannten Fluoreszein-Resonanz-Energie-Transfer (fluorescence resonance energy transfer = FRET) zwischen den beiden Sonden, nachdem sie sich an der Zielsequenz angebunden haben. Je größer die Übereinstimmung mit der Ziel-Sequenz, desto höher ist das Signal. Führt man im Anschluss daran eine Schmelzkurven-Analyse durch, lassen sich Mutationen anhand von Schmelztemperaturen identifizieren. Dabei bedient man sich des Mechanismus, dass jede ds-DNA ihre spezifische Schmelztemperatur hat. Diese ist definiert als die Temperatur, bei der 50 % der DNA als Einzelstrang vorliegen. Erreicht man die Schmelztemperatur, kommt es zu einem Knick in der Kurve (X-Achse: Temperatur; Y-Achse: Fluoreszenz). Trägt man nun die Temperatur (X-Achse) gegen die dF/dT (Y-Achse) auf, bekommt man in der Kurve einem Peak, hier liegt genau die Schmelztemperatur (siehe Abbildung 1). Handelt es sich bei dem bei der PCR entstandenen Produkt um den Wildtyp, hybridisiert die Sensor-Sonde, bei Wahl der entsprechenden Sonden, zu 100 % mit dem Template und schmilzt bei höheren Temperaturen ab. Handelt es sich aber um 21 eine Mutation hybridisiert die Sensor-Sonde zu einem geringeren Prozentsatz und hat einen niedrigeren Schmelzpunkt. Als Kontrolle laufen Wildtyp- und Mutationskontrollen im Ansatz mit. Abbildung 1: Beispiel einer Schmelzkurvenanalyse für eine SPINK1 N34S Mutation Zur Durchführung der Real-Time-PCR und Schmelzkurvenanalyse mit Hilfe des LightCycler® der Firma Roche Diagnostics, Mannheim wurde jeweils ein Master Mix Ansatz für die Mutationen N29I (PRSS1-Gen), R122H (PRSS1-Gen) und N34S (SPINK1-Gen) entworfen. 22 3.3 Master Mix Ansätze für PRSS1 (N29I, R122H) und SPINK1 (N34S) PRSS1 (N29I) Master Mix Zusätze 1x H2O steril (farblos) 6,2 µl MgCl2 (blau)(25 mM) 0,4 µl N29I-Fw (10 µM) 0,5 µl N29I-Rv (10 µM) 0,5 µl N29I-Sensor (4µM) 0,2 µl N29I-Anchor (4µM) 0,2 µl FAST DNA Master HYBR 1,0 µl Gesamtvolumen 9,0 µl Eingesetzte Primer für N29I: • N29I-Fw (5´-ACATGCTATTGACTTGCC) • N29I-Rv (5´-GGCCTGCTGATACCAC) Eingesetzte Hybridisierungssonden für N29I: • N29I-Sensor (5´-GGGCTACAACTGTGAGGAGAA-FL) • N29I-Anchor (5´-LC Red640-CTGTCCCCTACCAGGTGTCC-p) PRSS1 (R122H) Master Mix Zusätze 1x H2O steril (farblos) 6,4 µl MgCl2 (blau)(25 mM) 0,2 µl R122H-Fw (10 µM) 0,5 µl R122H-Rv (10 µM) 0,5 µl R122H-Sensor (10 µM) 0,2 µl R122H-Anchor (10 µM) 0,2 µl FAST DNA Master HYBR 1,0 µl Gesamtvolumen 9,0 µl Eingesetzte Primer für R122H: • R122H-Fw (5´-CCCCCAATACGACAGG) • R122H-Rv (5´-ACTAAGGGTCCCACTCA) Eingesetzte Hybridisierungssonden für R122H: • R122H-Sensor neu (5´-CAACGCCCACGTGTCCACCA-FL) • R122H-Anchor neu (5´- LC Red640-TCTCTGCCCACCGCCCCTCCAGCC-p) 23 SPINK1 (N34S) Master Mix Zusätze 1x H2O steril (farblos) 8,8 µl MgCl2 (blau) 1,2 µl PSTI / Fw (10 µM) 1,0 µl PSTI / Rv (10 µM) 1,0 µl PSTI-3FL (10 µM) 1,0 µl PSTI-3LC (10 µM) 1,0 µl Fast Start DNA Master HYBR 2,0 µl Gesamtvolumen 16,0 µl Eingesetzte Primer für N34S: • PSTI-F3 (5´-ccaatcacagttattccccagag) PSTI-R3 (5´-gtttgcttttctcggggtgag) Eingesetzte Hybridisierungssonden für N34S: • PSTI-3FL Sensor (5´- ccaaatgttacaatgaacttaatggatgc-FL) • PSTI-3LC Anchor (5´- LC Red640-ccaagatatatgaccctgtctgtgggac-p) Die verwendeten Primer und Hybridisierungssonden wurden von der Firma TIB MOLBIOL (Berlin, Deutschland) hergestellt. 3.4 DNA-Sequenzierung Die DNA-Sequenzanalyse wurde mit dem Capillary Electrophoretic Genetic Analysis System (CEQTM 8000) der Firma Beckman-Coulter im Zentrum für klinische Forschung der Ruhr-Universität durchgeführt. Eine DNA-Sequenzierung wurde nur bei Messproblemen mit dem LightCycler und sehr begrenzter DNA Konzentration und Menge durchgeführt. Dies war in einem Fall nötig, bei dem die Schmelzkurvenanalyse für N34S SPINK1 unsaubere Ergebnisse ergab. Es wurden dazu die bereits genannten Primer benutzt und in 2 Ansätzen forward und reverse Strang sequenziert. 24 3.5 CFTR-Analyse Aufgrund der begrenzten Menge an DNA und der großen Anzahl an bekannten Mutationen (> 1500 in 27 Exons) mussten wir uns auf eine Analyse mit der INNOLiPA-CFTR-Testmethode beschränken. Dies ist eine validierte Testmethode, (INNO-LiPA CFTR 19 und INNO-LiPA CFTR 17 + Tn polymorphism Innogenetics N.V., Gent, Belgien), mit welcher simultan 36 der häufigsten Mutationen und die Tn-Polymorphismen identifiziert werden können. Die Testmethode basiert auf dem Prinzip der reversen Hybridisierung mit Hilfe von allel-spezifischen Oligonukleotiden (ASO). ASO, die die verschiedenen MutationsAllele sowie den Wildtyp repräsentieren, sind hier als parallele Banden auf eine Nitrozellulosemembran aufgebracht und fixiert. Der interessante Bereich eines Gens wird mit Hilfe von genomischer DNA und biotinylierten Primern in einer PCRReaktion amplifiziert. Das biotinylierte Amplifikat hybridisiert nach chemischer Denaturierung unter definierten Temperaturbedingungen mit den membranfixierten Oligonukleotidsonden. Die spezifischen Hybride werden in einer Folgereaktion sichtbar gemacht. An Strepavidin gekoppelte alkalische Phosphatase bindet das Biotin der Hybride und katalysiert im Anschluss eine Farbreaktion, bei der ein unlösliches violett-braunes NBT/BCIP-Präzipitat entsteht. Dieses Präzipitat schlägt sich an der Stelle der Hybride Nitrozellulosestreifen nieder (siehe Abbildung 2: CFTR Testkarte). 25 auf dem Abbildung 2: CFTR Testkarte Mittels dieser Methode können folgende Mutationen detektiert werden: Tabelle 3 : Mutationen auf dem INNO-LiPA CFTR 19-Teststreifen M.F508del M.G542X M.N1303K M.W1282X M.G551D M.1717-1G→A M.R553X M.CFTRdele2,3(21kb) M.I507del M.711+1G→T M.3272-26A→G M.3905insT M.R560T M.1898+1G→A M.S1251N M.I148T M.3199del6 M.3120+1G→A M.Q552X 26 Tabelle 4: Mutationen und Tn polymorphismen auf dem INNO-LiPA CFTR 17+TnTeststreifen M.621+1G→T M.3849+10kbC→T M.2183AA→G M.394delTT M.2789+5G→A M.R1162X M.3659delC M.R117H M.R334W M.R347P M.G85E M.1078delT M.A455E M.2143delT M.E60X M.2184delA M.711+5G→A 5T 7T 3.6 9T Verbrauchsmaterialien QIAmp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden Oligonukleotide TIB Molbiol, Berlin Ampli Taq Gold DNA-Polymerase Perkin Elmer, Überlingen GeneAmp 10xPCR-Puffer, MgCl2, dNTPs Perkin Elmer, Überlingen LightCycler-Kapillaren Roche Diagnostics,Mannheim LightCycler Fast Start DNA Roche Diagnostics,Mannheim Master HYBR Polymerase Roche Diagnostics,Mannheim ELUCIGENE™ CF29 Orchid Diagnostics, UK Primer für Exon 1-5 des PRSS1 Gen TIB Molbiol, Berlin Primer für Exon 1-4 des SPINK1 Gen TIB Molbiol, Berlin Primer und FRET Sonden TIB Molbiol, Berlin Standardtips 2,5; 100; 1000 µl Eppendorf Sequenzing Kit CEQ Beckman-Coulter 27 3.7 Geräte Zentrifuge Labofuge 400 (DNA-Extraktion) Heraeus LightCycler (Schmelzkurvenanalyse) Roche Diagnostics LightCycler-Zentrifuge Roche Diagnostics Vortexer IKA Zentrifuge 5417R (Aufreinigung für Sequenzierung) Eppendorf CEQ™8000 (DNA-Sequenzierung) 3.8 Beckman-Coulter Statistik Die statistische Analyse wurde mit Hilfe des SPSS-Programm, Version 11.0 für Windows (Chicago, USA) durchgeführt. Für die statistische Auswertung der Daten der SPINK1 Mutationen (pHPT mit Pankreatitis versus pHPT ohne Pankreatitis), wurde der Fisher´s exact Test verwendet. P Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Zur Analyse der beobachteten versus den zu erwartenden Häufigkeiten der CFTR Mutationen und des SPINK1/CFTR transheterozygoten Zustandes wurde ein binominaler Test verwendet. Die erwartete Häufigkeit der SPINK1 Mutation wurde festgelegt unter der Annahme, dass die Häufigkeit einer heterozygoten N34S SPINK1 Mutation in der Kontrollgruppe identisch mit der Häufigkeit in der Normalbevölkerung ist, welche mit bis zu zwei Prozent angegeben wird [16, 26, 68, 90, 94, 96]. Die erwartete Häufigkeit einer CFTR Mutation von 1/25 gesunder heterozygoter Mutations-Träger in der Normalbevölkerung wurde unter der Annahme getroffen, dass die Häufigkeit des Auftretens einer zystischen Fibrose auslösenden schweren CFTR Mutation 4 % in der deutschen Bevölkerung beträgt [53]. 28 4 Ergebnisse 4.1 Klinische Daten der Gesamtkohorte In der Gesamtkohorte von 826 Patienten trat insgesamt 38-mal eine Pankreatitis auf. Davon hatten 16 Patienten eine akute, 2 Patienten eine akut hämorrhagische, 6 Patienten eine akut wiederkehrende und 14 Patienten eine chronische kalzifizierende Pankreatitis. Bei 24 der 826 Patienten wurde ein MEN-Syndrom diagnostiziert. Bei der Geschlechterverteilung gab es fast doppelt so viele Frauen wie Männer (581 Frauen / 245 Männern), dies entspricht der allgemeinen Geschlechterverteilung des Auftretens eines pHPT, wovon Frauen zwei bis dreimal häufiger betroffen sind als Männer [41]. Sowohl der PTH (212 ± 11 pg/ml) als auch der Kalziumspiegel (3 ± 0,1 mmol/l) waren deutlich erhöht. Die ebenfalls bestimmten Werte für Phosphat, Lipase, Amylase und alkalische Phosphatase lagen im Durchschnitt im Normbereich. Als klinische Hauptsymptome imponierten bei 45 % der Patienten Nierensteine und bei 35 % Knochenschmerzen, peptische Ulcera traten nur bei 9 % der Patienten auf. 4.2 Klinische Daten der Patienten mit pHPT und Pankreatitis Von 25 der 38 Patienten mit Pankreatitis konnte DNA gewonnen werden. Die Verteilung in der Gruppe zeigte sich wie folgt: 13 Frauen, 12 Männer; Durchschnittsalter bei Operation von 57 ± 2,5 Jahren, davon 10 Patienten mit akuter, 1 Patient mit akut hämorrhagischer, 5 Patienten mit akut wiederkehrender und 9 Patienten mit chronisch kalzifizierender Pankreatitis. Anamnestisch ergab sich kein Hinweis auf eine andere Genese der Pankreatitis: wie Alkoholmissbrauch, biliäre Pankreatitis, Trauma, Hyperlipidämien oder medikamentös toxische Ursachen. Lediglich bei einem Patienten waren Gallensteine beim Auftreten der Pankreatitis diagnostiziert worden. Eine biliäre Genese der Pankreatitis konnte aber ausgeschlossen werden. Bei zwei Patienten 29 trat die Pankreatitis Jahre nach einer Cholecystektomie auf. Bei zwei weiteren Patienten wurde ein begrenzter Alkoholkonsum angegeben. Mit Berücksichtigung des Durchschnittsalters bei der Operation (60 ± 13 versus 57 ± 2,5 Jahren) und der Geschlechterverteilung (25 versus 12 Männern und 25 versus 13 Frauen) unterschied sich die Gruppe der Patienten mit Pankreatitis nicht signifikant von der Kontrollgruppe ohne Pankreatitis. Der Kalzium- und PTH-Spiegel war sowohl in der Gruppe der Patienten mit einer Pankreatitis und einem pHPT, als auch in der pHPT-Kontrollgruppe deutlich erhöht, wobei sich auch hier im Vergleich der beiden Gruppen kein signifikanter Unterschied zeigte. Der Kalziumspiegel betrug 3,1 ± 0,1 mmol/l und der PTHSpiegel 226 ± 71 pg/ml bei den Patienten mit pHPT und Pankreatitis versus einem Kalziumspiegel von 3,0 ± 0,33 mmol/l und einem PTH-Spiegel von 210 ± 82 pg/ml in der pHPT-Kontrollgruppe (siehe Tabelle 5). 4.2.1 Mutationsanalyse 4.2.2 PRSS 1-Gen-Mutationen PRSS1-Gen-Mutationen (N29I und R122H) konnten weder in der pHPT und Pankreatitis Gruppe noch in der Kontrollgruppe nachgewiesen werden (siehe Tabelle 6). 4.2.3 SPINK 1-Gen-Mutationen Insgesamt vier der 25 Patienten (16 %) mit pHPT und Pankreatitis waren Träger einer heterozygoten N34S Mutation (siehe Abbildung 3). Dagegen wies kein Patient der pHPT-Kontrollgruppe eine N34S Mutation auf (P< 0,001) (siehe Tabelle 7). Hinsichtlich ihrer Laborparameter ergaben sich keine signifikanten Unterschiede. Alle 4 Patienten wiesen ähnliche Kalziumwerte im Vergleich zu den Wildtyp-Patienten auf, (3.2 versus 3.1 mmol/l; siehe Tabelle 8). Der Mittelwert des PTH-Spiegel war niedriger im Vergleich zu den Patienten mit dem Wildtyp (123 versus 243 pg/ml; siehe Tabelle 8), bei breiter Streuung jedoch ohne statistische Signifikanz. Keiner der Patienten mit N34S Mutation berichtete über eine Familienanamnese, welche eine hereditäre Ursache der Erkrankung nahe legte. 30 Lediglich ein Patient berichtete über einen maßvollen Alkoholkonsum. Das durchschnittliche Alter für das Auftreten der ersten Pankreatitis-Episode betrug 48 Jahre. Bei den 4 Patienten mit der N34S SPINK1 Mutation diagnostizierten wir 2-mal eine akute Pankreatitis (50 %) und 2-mal eine chronische Pankreatitis (50 %). In der SPINK1-Widtyp-Kohorte trat 8-mal eine akute Pankreatitis (38 %) auf, 1-mal eine akut hämorrhagische (5 %), 5-mal eine akut wiederkehrende (24 %) und 7-mal eine chronische Pankreatitis (33 %). Dokumentierte Nierensteine hatten 3 von 4 Patienten (75 %) mit der N34S Mutation, hingegen nur 12 von 21 (57 %) der Patienten mit dem SPINK1 Wildtyp. Ein peptisches Ulcus hatte einer der 4 (25 %) Patienten mit der N34S Mutation. Im Vergleich dazu hatten 4 von 21 Patienten (19 %) mit dem SPINK1 Wildtyp peptische Ulcera. Knochenschmerzen wurden von den Patienten mit der N34S Mutation nicht angegeben, wohingegen bei den Patienten mit dem SPINK1 Wildtyp 10 der 21 Patienten (48 %) über Knochenschmerzen klagten (siehe Tabelle 8). 31 Die bei einer Schmelztemperatur von 58,4 °C gezeigten Kurven zeigen zwei heterozygote N34S SPINK1 Mutationsträger (blaue und graue Kurve). Die grüne Kurve entspricht der heterozygoten Kontrolle. Abbildung 3: SPINK1-(N34S)-Schmelzkurvenanalyse für pHPT/Pankreatitis Patienten 4.2.4 CFTR-Gen-Mutationen Aufgrund der zuvor durchgeführten PRSS1 und SPINK1 Analysen waren für die CFTR Mutationsanalyse nur noch eingeschränkte DNA Mengen vorhanden und es konnten nicht alle Patienten untersucht werden. Es gelang von den 25 Patienten mit pHPT und Pankreatitis 24 Patienten mit dem INNO-LiPA CFTR 19-Teststreifen und 20 Patienten mit dem INNO-LiPA CFTR 17+Tn-Teststreifen zu untersuchen (siehe Tabelle 6). Vier von den untersuchten 24 Patienten (17 %) wiesen eine schwere heterozygote CFTR-Gen-Mutation auf (P=0,002; im Vergleich zu der normalen Bevölkerung; siehe Tabelle 7). Es konnte 2-mal die ∆508F- und 2-mal die R553X-Mutation 32 nachgewiesen werden (siehe Abbildung 4). Bei einem Patienten wurde das 5T Allel gefunden (siehe Tabelle 6). Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Laborwerte zwischen den Kohorten mit CFTR Mutation und CFTR Wildtyp (siehe Tabelle 8). Von den Mutationsträgern berichtete kein Patient über eine zystische Fibrose oder pulmonale Erkrankung in der Familie. In der Patientenkohorte mit einer CFTR Mutation wiesen 3 Patienten (60 %) eine akute Pankreatitis auf und 2 Patienten (40 %) eine chronische Pankreatitis. In der Kohorte mit dem CFTR Wildtyp trat 7-mal eine akute Pankreatitis (37 %), 1-mal eine akut hämorrhagische (5 %), 5-mal eine akut wiederkehrende (26 %) und 6-mal eine chronische Pankreatitis (32 %) auf. Nierensteine traten bei 3 von 5 (60 %) Patienten mit einer CFTR Mutation auf, hingegen bei 11 von 19 Patienten (58 %) mit dem CFTR Wildtyp. Peptische Ulcera traten bei keinem der Patienten mit einer CFTR Mutation auf, im Vergleich dazu bei 5 von 19 Patienten (26 %) mit dem CFTR Wildtyp. Knochenschmerzen wurden von einem der 5 Patienten (20 %) mit einer CFTR Mutation angegeben, bei den Patienten mit dem CFTR Wildtyp gaben 8 von 10 Patienten (42 %) Knochenschmerzen an (siehe Tabelle 8). 33 Die Hybridisierungskitkarte zeigt in Probe 1 den Wildtyp und in Probe 2 eine heterozygote R553X Mutation bei einem Patienten mit pHPT und Pankreatitis Abbildung 4: INNO LIPA CFTR 19 Testkarte für Patienten mit pHPT und Pankreatitis 4.2.5 Transheterozygoter Patient (SPINK1: N34S/ CFTR: R553X) mit pHPTund Pankreatitis Insgesamt wurde ein transheterozygoter Patient mit einer Kombination aus SPINK1 N34S Mutation und CFTR R553X Mutation identifiziert. Bei diesem Patienten trat die erste Episode einer Pankreatitis bereits mit 18 Jahren auf. Im Alter von 28 Jahren wurde bereits eine Pankreaskopfresektion durchgeführt. Die abdominellen Symptome persistierten jedoch weiterhin. Der pHPT wurde im Alter von 28 Jahren diagnostiziert und 4 Jahre später operiert. 34 Tabelle 5: Charakteristik der Gesamtkohorte und der Patienten mit pHPT und Pankreatitis pHPT- pHPT- pHPT- und Pankreatitis- Gesamtkohorte Kontrollgruppe Gruppe Patienten 826 50 25 MEN-Syndrom 24 1 1 Alter bei Operation 59±0.5 60±13 57±2.5 Geschlecht (m/w) 245/581 25/25 12/13 Parathormon 212±11 210±82 226±71 0.76±0.1 0.8±0.27 0.98±0.15 3±0.1 3.0±0.33 3.1±0.1 Nierensteine 371 10 15 Peptische Ulzera 77 3 5 Knochenschmerzen 289 8 10 Pankreatitis: 38 0 25 -akute 16 0 10 -akut hämorrhagische 2 0 1 -akut wiederkehrende 6 0 5 -chronisch 14 0 9 51±4 57±43 227±61 [<80 pg/ml] Phosphat [0.8-1.5 mmol/l] Kalzium * [2.2-2.6 mmol/l] kalzifizierende # Lipase [<190 U/l] [1593±759] [Lipase bei AP] Amylase 32±1 33±15 143±43 141±9 139±101 192±23 [8-65 U/l] Alkalische Phosphatase [40-190 U/l ] * Der Kalziumspiegel war bei 753 der 826 Patienten dokumentiert. # Die akute Pankreatitis wurde überwiegend in peripheren Krankenhäusern diagnostiziert; aufgeführt sind die Laborparameter des Aufnahmetags zur OP, sowie die peripher dokumentierten Werte (Lipase bei AP). 35 Tabelle 6: Ergebnis der (PRSS1, SPINK1 und CFTR) Mutationsanalysen bei Patienten mit pHPT und Pankreatitis Patient PRSS1 SPINK1 CFTR CFTR N29I / R122H N34S Mutation Poly T 1 -# - - 7T/7T 2 - - F508del 9T/7T 3 - - - 7T/7T 4 - - - 7T/7T 5 - N34S - 7T/7T 6 - N34S - 7T/7T 7 - - - 9T/7T 8 - - - 7T/7T 9 - - NDa NDa 10 - - - 7T/7T 11 - - - 7T/7T 12 - - - 7T/5T 13 - - - 7T/7T 14 - - - 9T/7T 15 - - - 7T/7T 16 - N34S - 7T/7T 17 - - F508del 9T/7T 18 - - R553X 7T/7T 19 - - - 7T/7T 20 - - - 7T/7T 21 - N34S R553X 7T/7T 22 - - - NDª 23 - - - NDª 24 - - - NDª 25 - - - NDª NDª: nicht durchgeführt bei zu wenig DNA-Material #: wies zwei Wildtyp-Allele auf 36 Tabelle 7: Häufigkeitswahrscheinlichkeit der N34S SPINK1 und CFTR Mutationen bei pHPT und Pankreatitis Häufigkeiten Genotypen a beobachtete O/E ratio 95% CI P-value SPINK1 (N34S) 2/100 4/25 8,0 1,0-15,2 <0,001 CFTR Mutation 1/25 4/24 4,2 0,4-7,9 0,002 5T Allel 5/100 1/20 1,0 0,02-2,0 1,0 CFTR heterozygot 1/16400 1/25 656 13,3-1295,6 <0,001 erwartete schwer CF +N34S heterozygot ª Das Vorkommen der N34S SPINK1 Mutation in der normalen deutschen Population ist geringer als 2 % (0.36 % [104] - 1.6 % [90]). Die erwartete Häufigkeit von schweren Mutationen welche eine CF verursachen wurde mit 1/25 angenommen [53]. Das erwartete Auftreten für das 5T Allel beträgt 5 % [23]. Die erwartete Allel Häufigkeit für die N34S SPINK1 Mutationen und für die Kombination von beiden, CFTR und SPINK1, ist zitiert nach Noone et al. [63] 37 Tabelle 8: Charakterisierung der Patienten mit pHPT und Pankreatitis Patienten pHPT und Pankreatitis (SPINK1 Wildtyp) 21 pHPT und pHPT und Pankreatitis Pankreatitis (SPINK1 N34S CFTR Wildtyp a heterozygot) 4 19 pHPT und Pankreatitis CFTR Mutation 5 1 0 1 0 58 ± 2 52 ± 8 59 ± 2 49 ± 8 9/12 2/2 8/11 3/2 243 ± 82 123 ± 43 245 ± 98 203 ± 53 1 ± 0.2 0.74 ± 0.2 1 ± 0.2 0.8 ± 0.1 3.1 ± 0.1 3.2 ± 0.3 3.1 ± 0.1 3.1 ± 0.2 12 3 11 3 Peptische Ulcera 4 b 1 5 0 Knochenschmerzen 10 0 8 1 Pankreatitis 21 4 19 5 - akute 8 2 7 3 - akut hämorrhagische 1 0 1 0 - akut wiederkehrende 5 0 5 0 - chronisch kalzifizierende 7 2 6 2 201 ± 65 209 ± 124 171 ± 39 325 ± 266 [528 ± 236] [2236 ± 1029] [689 ± 509] [1480 ± 725] 108 ± 27 321 ± 226 156 ± 54 103 ± 53 195 ± 25 178 ± 63 206 ± 29 144 ± 21 MEN Syndrom Alter bei Operation Geschlecht(m/w) Parathormon [<80 pg/ml] Phosphat [0.8-1.5 mmol/] Kalzium [2.2-2.6 mmol/l] Nierensteine § Lipase [<190 U/l] [AP] Amylase [8-65 U/l] Alkalische Phosphatase [40-190 U/l] a Es konnten nur 24 Proben mit dem INNO-LiPA 19 und 20 Proben mit dem INNO-LiPA 17+Tn Teststreifen untersucht werden. b Ein Patient hatte ein Ulcus duodeni. § Die akute Pankreatitis wurde überwiegend in peripheren Krankenhäusern diagnostiziert; aufgeführt sind die Laborparameter des Aufnahmetags [AP]. 38 5 Diskussion Die Auswertung der Daten von 826 Patienten mit einem Hyperparathyreoidismus (HPT) erlaubte erstmalig eine umfassende Analyse einer großen Kohorte auf die folgenden wissenschaftlich ungeklärten Fragestellungen: Wie hoch ist die Prävalenz einer Pankreatitis bei Patienten mit einem primären Hyperparathyreoidismus in Deutschland und gibt es zusätzliche Pankreatitis assoziierte genetische Risikofaktoren bei Patienten mit einem primären Hyperparathyreoidismus und Pankreatitis? Zur Beantwortung der ersten Fragestellung erfolgte die Auswertung der prospektiv über den Zeitraum von 1987 bis 2002 erhobenen Daten hinsichtlich einer diagnostizierten Pankreatitis, wobei diese bei 38 der Patienten (4,6 %) festgestellt wurde und dies einem Wert entspricht , der leicht oberhalb der zuvor publizierten Häufigkeiten liegt (siehe Tabelle 9). Tabelle 9:Studien zur Korrelation pHPT/Pankreatitis Studien Zeitraum Patienten Pankreatitis Häufigkeit Ergebnis n=1153 N=17 1.5 % Keine Korrelation n=686 N=10 1.5 % Korrelation nicht mit pHPT Bess, Edis et al. 1950-1975 1980 [10] van Lanschot and Bruining 1984 [99] Ronni-Sivula 1985 ausgeschlossen 1956-1979 n=240 N=8 3.3 % [73] Koppelberg, Korrelation nicht beschrieben 1987-1992 n=234 N=13 5.6 % Bartsch et al.1994 Korrelation vorhanden [45] Carnaille, Oudar et n=1224 N=40 3.2 % al. 1998 [15] Agarwal, George vorhanden 1991-2003 n=87 N=6 6.8 % et al. 2003 [1] Mittelung Korrelation Korrelation Vorhanden ∑ n=3624 ∑ n=94 39 Ø=2.6 % Dabei wird der Zusammenhang zwischen dem HPT und einer Pankreatitis nun schon seit Jahrzehnten kontrovers diskutiert. Bereits 1962 wurde durch Mixter et al. [58] ein Zusammenhang zwischen einem HPT und der Pankreatitis postuliert. Durch zwei in den 90er Jahren publizierten Studien mit großen Patientenkohorten (n = 1153 und n = 686 Patienten) [10, 99] wurde dies allerdings erstmalig angezweifelt, denn die Auftretenshäufigkeit einer Pankreatitis bei Patienten mit HPT betrug lediglich 1,5 %. In ihrer Studie werteten Bess et al. [10] dabei retrospektiv Daten von 1153 Patienten aus, welche im Zeitraum zwischen 1950 bis 1975 behandelt worden waren. Es wurde nur bei 17 Patienten eine Pankreatitis diagnostiziert (1,5 %), weshalb die zuvor angenommene Assoziation von HPT und Pankreatitis angezweifelt wurde. Die Diagnose der Pankreatitis wurde dabei anhand von abdominellen Beschwerden und erhöhten Laborparametern (Amylase und Lipase), sowie radiologisch nachgewiesenen Pankreasverkalkungen und klinischen Zeichen einer exokrinen Pankreasinsuffizienz gestellt. Eine Angabe über die Diagnosekriterien des HPT, sowie über den Kalziumspiegel wurde nicht gemacht. Zu bedenken ist, dass es sich zwar um eine sehr große Kohorte handelte, die verwendeten Daten jedoch retrospektiv erhoben wurden und die Diagnosekriterien ggf. eine geringere Sensitivität besaßen. Ronni-Sivula wertete 1985 Daten von 240 Patienten aus und gab die Auftretenswahrscheinlichkeit für eine Pankreatitis mit 3,3 % an [73], die in den letzten größeren Studien durch Carnaille et al. [15] (1998; n = 1224 Patienten) und durch Agarwal et al. [1] (2003; n = 87 Patienten) in ihrer Tendenz bestätigt wurden (3,2 % bzw. 6,8 %). Agarwal et al. [1], die die höchste Prävalenz beschrieben, wiesen bei 6 von 87 Patienten (6,8 %) eine Pankreatitis nach, wobei die Kohorte mit 87 Patienten sehr klein war und die Pankreatitis einmal erst nach der operativen Sanierung des HPT auftrat und somit nicht gesichert durch den HPT bedingt gewesen ist. Dieses Beispiel erläutert somit sehr anschaulich die Gefahr einer kleinen Studienkohorte und möglicher systemischer Fehler in den Einschlusskriterien, die bei der Rekrutierung, der im Rahmen dieser Dissertation untersuchten Patienten, hinsichtlich dieser beiden Punkte vermieden wurde. Die Diskrepanz der Auftretenshäufigkeiten einer Pankreatitis bei Patienten mit einem HPT lässt sich möglicherweise zudem durch sensitivere Screeningmethoden aber auch durch mögliche, nun zu diskutierende, genetische Unterschiede durch unterschiedliche Herkunftsländer erklären (siehe Tabelle 9). 40 Anhand der aktuell bestehenden Datenlagen liegen die von uns erhobenen prospektiven Werte zur Auftretenswahrscheinlichkeit einer Pankreatitis bei Patienten mit einem HPT mit 4,6 % in einem, mit den bereits publizierten Studien, vergleichbaren Bereich. Obwohl die Pankreatitishäufigkeit in den Industrienationen in den letzten 50 Jahren deutlich zugenommen hat, existieren nur wenige Daten zur Pankreatitishäufigkeit in der deutschen Bevölkerung. Prof. Lankisch aus Lüneburg hat im Zeitraum von 1988 – 1995 Zahlen zur Epidemiologie der Pankreatitis in Deutschland erhoben. Die Inzidenz einer akuten Pankreatitis lag in diesem Zeitraum in der Region Lüneburg bei 19,7/100000 Einwohner/Jahr, die der chronischen Pankreatitis bei 6,4/100000 Einwohnern/Jahr. Die altersspezifische Häufigkeit zeigte einen Gipfel für die akute Pankreatitis in der Altersgruppe zwischen 35 - 44 Jahren und für die chronische Pankreatitis bei 45 – 54 Jahren [48]. In der hier untersuchten Kohorte trat eine akute Pankreatitis bei umgerechnet 193/100000 Patienten/Jahr auf und eine chronische Pankreatitis bei 113/100000 Patienten/Jahr. Die aktuellen Daten dokumentieren damit, dass das Pankreatitisrisiko bei Patienten mit einem pHPT um ca. das 10 fache erhöht ist. Trotzdem tritt sie mit 4,6% insgesamt nur selten auf, insbesondere hinsichtlich der für Nierensteine (45 %), Knochenschmerzen (35 %) und peptischen Ulcera (9 %) dokumentierten deutlich erhöhten Auftretenswahrscheinlichkeiten. Somit muss auch die pathophysiologische Bedeutung der im Rahmen des pHPT auftretenden Hyperkalzämie und der Zusammenhang mit der Pankreatitis als monokausaler Auslöser in Frage gestellt werden, der sich in der Aufführung der Hyperkalzämie bzw. der HPT in den gängigen Risikofaktorentabellen für eine AP und CP widerspiegelt [32, 41] (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass möglicherweise zusätzliche krankheits-modifizierende Faktoren (z.B. genetische Faktoren und Umweltfaktoren) die Entwicklung einer Pankreatitis bei Patienten mit einem pHPT beeinflussen könnten. Hintergrund der Diskussion einer Korrelation von HPT und Pankreatitis ist der postulierte pathophysiologische Mechanismus einer Hyperkalzämie vermittelten intrapankreatischen Trypsinaktivierung [29]. Unter physiologischen Bedingungen werden die Zymogene, unter ihnen Trypsinogen, im kalziumreichen Milieu des 41 Duodenums durch die Enterokinase aktiviert. Trypsin ist zudem in der Lage, andere Zymogene wie Proelastase und Chymotrypsinogen zu aktivieren und besitzt darüber hinaus die Fähigkeit zur Autoaktivierung. Bei der Pankreatitis beginnt die Trypsinaktivierung bereits innerhalb des Pankreas und leitet so die Selbstverdauung des Organs und damit die Pankreatitis ein. Kalzium spielt dabei eine essentielle Rolle. Haverback et al. konnten bereits 1960 nachweisen, dass Kalzium die Trypsinaktivierung steigert [38] und vermuteten, dass die HPT assoziierte Hyperkalzämie eine vermehrte intrapankreatische Konversion von Trypsinogen in Trypsin bedingt. Ward et al. zeigten, dass ein Anstieg des freien zytosolischen Kalziums als Auslöser einer Pankreatitis in Frage kommt [100, 101]. Diese Hypothese wurde durch Studien an Mäusen durch Mooren et al. bestärkt [59], denen es durch die Gabe des Kalzium Chelators BAPTA-AM gelang, nicht nur die Trypsinogenaktivität, sondern auch die Entstehung einer Pankreatitis signifikant zu reduzieren [59]. Krüger et al. untersuchten die Trypsinogenaktivierung an isolierten Pankreas-Azinus-Zellen invivo und bestätigten, dass Kalzium zur intrazellulären Trypsinogenaktivierung notwendig ist [47]. Dabei ergaben sich Hinweise dafür, dass eine zusätzliche Umverteilung des Kalziums in andere Zellregionen, die Dauer des KalziumionenEinstroms und die Lokalisation der intrazellulären Kalziumionen-Freisetzung direkt an der Zymogenaktivierung beteiligt zu sein scheinen [47]. Zugleich bestätigten sie, dass eine Absenkung sowohl der extrazellulären als auch der intrazellulären Kalziumionen-Konzentration die intrazelluläre Proteasenaktivierung erniedrigt bzw. vollständig aufhebt [47]. Die Kalziumhomöostase der Azinuszelle ist daher der vermutete kausale Pathomechanismus bei der Entstehung der Pankreatitis bei Patienten mit einem HPT. Die hier erhobenen Daten weisen allerdings darauf hin, dass die Hyperkalzämie nicht der allein auslösende Faktor zu sein scheint. Darüber hinaus scheint zumindest eine Hyperkalzämie von einer überwiegenden Mehrheit der Patienten ohne Entwicklung einer Pankreatitis (95,4 %) toleriert zu werden. In den letzten Jahren wurde die Hypothese der krankheits-modifizierenden Faktoren bei der Entstehung einer Pankreatitis, im Rahmen einer Hyperkalzämie, durch weitere Studien unterstützt [30, 31]. Bei der Untersuchung einer Familie mit einer chronischen Pankreatitis sowie 42 einer familiären hypokalziurischen Hyperkalzämie, die eine asymptomatische Hyperkalzämie bedingt, konnte eine Kombination einer SPINK1 N34S Mutation mit einer Mutation des Calcium-sensing Receptors (CaSR) (L518P) als Auslöser der Pankreatitis nachgewiesen werden [30]. Mutationen im CaSR-Gen waren bis zu dieser Studie einzig als Auslöser für Erkrankungen des Kalziumstoffwechsels, wie der familiären hypokalziurischen Hyperkalzämie, der autosomal dominanten Hypokalzämie sowie des schweren neonatalen Hyperparathyreoidismus bekannt. Aus den erhobenen Daten lässt sich ebenfalls vermuten, dass zusätzliche „disease modifier“, hier Mutationen im CaSR, bei der Genese der Pankreatitis eine Rolle spielen [30], denn erst die Kombination aus CaSR-Mutation und SPINK1(N34S)-Mutation löste den Phänotyp einer chronischen Pankreatitis aus, Träger einer einzelnen Mutation (CaSR oder SPINK1) blieben beschwerdefrei [30]. Eine Studie an einer großen Kohorte mit ICP bestätigte dies, indem eine weitere Familie mit dieser Konstellation gefunden wurde [31]. Diese Überlegung wird zudem durch die im Jahr 2002 durch Racz et al. publizierte Charakterisierung des CaSR auf duktalen und azinären Pankreaszellen unterstützt [69], wobei postuliert wurde, dass der CaSR im Pankreas eine multifunktionale physiologische Rolle bei der Regulation der Kalziumkonzentration im Pankreassaft spielen könnte [69]. Interessanterweise wurde im Jahre 2007 eine weitere Studie von Murugaian et al. publiziert [60], die Mutationen im CaSR Gen bei Patienten mit einer tropischen Pankreatitis (TP) entdeckten, wobei insbesondere für diese Kohorten eine Assoziation mit N34S SPINK1 Mutationen bekannt ist. Auch hier ergeben sich somit Hinweise auf eine multifaktorielle Genese und eine Abhängigkeit von der Kalziumhomöostase. Aufgrund der bis zum heutigen Zeitpunkt bestehenden Daten, bezüglich der Hypothese von krankheits-modifizierenden Faktoren bei der Entstehung einer Pankreatitis, lag damit die Schlussfolgerung einer Untersuchung auf genetische, mit Pankreatitis-assoziierter Risikofaktoren nahe. Zu den im Rahmen dieser Dissertation untersuchen Mutationen gehörten die im PRSS1-Gen (N29I und R122H), die eine erhöhte Trypsinogenaktivität verursachen [74, 75] und als Auslöser einer hereditären Pankreatitis bekannt sind. N29I und R122H sind dabei für mehr als 95% der HP Fälle verantwortlich, wobei auch seltenere mit HP assoziierte Mutationen wie A121T, V123M oder R122C mittels 43 unserer Methode detektiert worden wären. Keiner dieser Mutationen konnte in unserer Kohorte nachgewiesen werden. Dies verwundert im Nachhinein nicht, da im Regelfall bei der durch Mutationen verursachten HP eine Pankreatitis bereits im Jugendalter (13,9 ± 12,2) auftritt [52] und die Penetranz der Erkrankung mit 80% sehr hoch ist. Neben einer leeren Familienanamnese betrug das durchschnittliche Erkrankungsalter in der untersuchten Kohorte bei der Diagnosestellung, 57 ± 2,5 Jahre, was eine HP oder HP-assozierte Mutation unwahrscheinlich macht. Bei 16 % unserer Patienten (4 von 25 Patienten) konnte dagegen eine SPINK1 Mutation (N34S) nachgewiesen werden. SPINK1 ist der wichtigste intrapankreatische Trypsin-Inhibitor, der Trypsin durch kovalente Bindung zwischen dem katalytischen Serin der Protease und einem Lysin im reaktiven Zentrum von SPINK1 inhibiert. Im Gegensatz zu den PRSS1-Mutationen wird somit vermutet, dass die N34S Mutation im SPINK1-Gen physiologische Abwehrmechanismen gegen eine inadäquate oder verfrühte Enzymaktivität beeinflusst [7, 62, 95]. Es gilt als bestätigt, dass die N34S Mutation als häufigste SPINK1-Gen-Mutation mit unterschiedlichen Formen der CP assoziiert ist [72, 105], allerdings scheinen N34S-SPINK1-Mutationen eine Pankreatitis dabei nicht selbständig auszulösen, sondern nur zusammen mit weiteren genetischen oder Umweltfaktoren [68, 72]. Weder in-vitro Experimente noch Experimente an knock out Mäusen konnten dabei bis heute die Rolle der N34S Mutation abschließend erklären. Obwohl es sich zeigte, dass sich bei einem Ungleichgewicht zwischen Trypsin-Aktivität und ihrer Hemmung durch SPINK1 eine Pankreatitis entwickelt, führt die N34S Mutation allein weder zu einem Funktionsverlust des Proteins [39, 55] noch zu einer eingeschränkten Sekretion [43]. Es ist daher abschließend nicht geklärt, wie SPINK1 Mutationen zu einem Funktionsverlust oder zu einer Funktionseinschränkung des Proteaseninhibitors führen und dadurch eine erhöhte intrapankreatische Trypsinaktivität bedingen. Nach der Erstbeschreibung von SPINK1-Mutationen bei Patienten mit einer idiopathischen chronischen Pankreatitis (ICP) durch Chen et al. [16] konnten Witt et al. als erste eine Assoziation aufzeigen [104]. In Ihrer Studie hatten 23 % der Patienten mit einer ICP eine SPINK1 Mutationen. Dabei handelt es sich im Wesentlichen (bei 18 von 22 Patienten (81 %)) um eine N34S Mutation. Im 44 Weiteren zeigten sich seltenere Mutationen am N-terminalen Ende des Moleküls (P55S). Es fanden sich sowohl heterozygote als auch homozygote N34SPatienten (6 von 22 Patienten waren homozygot), wobei ein phänotypischer Unterschied zwischen beiden Gruppen nicht festzustellen war. In weiteren Studien wurde dieser Zusammenhang belegt und diskutiert. Dabei scheint eine Kombination mit anderen Gendefekten oder Umweltfaktoren zur Induzierung der Erkrankung („disease modifier“) notwendig zu sein [6, 63, 68]. Seit ihrer Entdeckung wurden N34S Mutationen in weiteren Pankreatitiskohorten mit tropischer Pankreatitis (44 %) [11] und äthyltoxischen Pankreatitis (6,3 % [78] und 9,2 % [97]) identifiziert. Bei der TP werden als pathogenetisch additive Risikofaktoren eine Malnutrition, Antioxidantien-Defizienz oder eine toxische Schädigung des Pankreas durch Cassavawurzel-Konsum (enthält toxische zyanogene Glykoside) diskutiert, wobei 2007 mit den CaSR Mutationen ein weiterer genetischer Risikofaktor, der auf eine multifaktorielle genetische Ursache deutet, identifiziert wurde [60]. Bhatia et al. konnten bei 44 Prozent der von ihnen untersuchten Patienten mit einer TP eine N34S-Mutation nachweisen [11]. Diese Daten lassen vermuten, dass genetische Dispositionsfaktoren wie z.B. die SPINK1 Mutationen bei der Pathogenese der TP eine wichtige Rolle spielen. Weitere Studien konnten eine signifikante Korrelation zwischen N34S Mutationen und einer [27; 94; 105], alkoholinduzierten so dass sich chronischen vermuten Pankreatitis lässt, dass (ACP) nachweisen ein modifiziertes Proteaseninhibitorsystem auch bei einer ACP pathogenetisch bedeutsam ist. Allerdings scheint der Einfluss der N34S-Mutation nicht so ausgeprägt wie bei der ICP und TP zu sein, denn es werden lediglich Auftretenshäufigkeiten von 6,3 % [78] bzw. 9,2 % [97] der SPINK1 Mutationen bei Patienten mit einer AP angegeben. Die mögliche Funktion der N34S SPINK1 Mutation als „disease modifier“ wird auch dadurch deutlich, dass Mutationsträger häufig in der Normalbevölkerung vorkommen. Dabei wird eine Häufigkeit von 1,6 % in den USA [68, 78], 1,58 % in Frankreich [16], 1 % in der Schweiz [96], 2,6 % in Finnland [97] und 0,36 % [104] bzw. 1,6 % [90] in Deutschland beschrieben, Pakreatitishäufigkeit liegt. 45 die deutlich über der Die N34S SPINK1 Mutationshäufigkeit von 16 % in unserer pHPT/PankreatitisSubgruppe überschreitet die Auftretenswahrscheinlichkeit von ungefähr 1 % in der Normalbevölkerung signifikant, womit ein zusätzlicher genetischer Mechanismus der Pankreatitisinduktion bei Patienten mit pHPT bewiesen scheint. Es ist in diesem Zusammenhang interessant, dass der einzige Patient mit einem pHPT und einer Pankreatitis, der bis zum jetzigen Zeitpunkt auf die SPINK1 Mutation getestet wurde, positiv für die N34S Mutation war [27]. Er war ein Bestandteil einer Gruppe von Patienten, welche als "verschiedenartige" ("miscellaneous") chronische Pankreatitis bezeichnet wurden, und, obwohl es sich nur um einen Fall handelt, unterstützt dieses Ergebnis die Hypothese einer genetischen Komponente. Im Rahmen dieser Dissertation konnte somit erstmalig gezeigt werden, dass N34S SPINK1 Mutationen eine wichtige Rolle bei der Entstehung einer Pankreatitis bei Patienten mit einem pHPT spielen. Hinsichtlich der CFTR Mutationen ergaben sich ähnliche Hinweise auf einen genetischen Background. Die Identifizierung einer schweren CFTR Mutation bei 4 (2-mal ∆F508 und 2-mal R553X) von 24 Patienten (17 %) unserer Patientengruppe unterlegt die mögliche Relevanz additiver genetischer Faktoren bei Patienten mit pHPT und Pankreatitis. Aktuelle Studien zeigen, dass bei ca. 30 % der Patienten mit einer chronischen oder rezidivierenden Pankreatitis mindestens ein abnormales CFTR Allel nachweisbar ist, im Gegensatz zu der zu erwartenden Häufigkeit von 3-4 % der Normalbevölkerung [64, 65, 92]. Das Risiko der Entstehung einer so genannten idiopathischen chronischen Pankreatitis (ICP) nimmt bei einem Träger der zystischen Fibrose ungefähr um das 5-fache zu, wobei insbesondere der Terminus „idiopathisch“ bei einer dann detektierten Mutation umstritten ist. Da nicht alle Träger einer CFTR Mutation an einer Pankreatitis erkranken, scheinen auch hier weitere Faktoren an der Entstehung einer Pankreatitis beteiligt zu sein. Obwohl in verschiedenen Kohorten seit 1998 bis zu 25 % CFTR Mutationen bei Patienten mit einer ICP aufgezeigt werden konnten [18, 63, 64, 80, 102], ist es bis zum heutigen Zeitpunkt nicht vollständig verstanden, warum heterozygote CFTR Mutationsträger anfällig für eine Pankreatitis sind. Noone et al., die den CFTR gesteuerten Ionen-Transport im Nasenepithel von Patienten mit einer ICP 46 gemessen haben, berichten über einen CFTR vermittelten, beeinträchtigten Cl¯Transport bei Patienten mit unterschiedlichen CFTR Mutationen, der darauf hinweisen könnte, dass es pathophysiologische Auswirkungen im Pankreas geben könnte [63]. Die CFTR-Protein-Funktion als Anionen-Kanal reguliert direkt den Cl¯Ausstrom und indirekt die HCO3¯-Sekretion. Im Weiteren reguliert es den H2Ound Na+-Einstrom. Patienten mit einer zystischen Fibrose weisen ein abnormales CFTR-Protein in den Epithelzellen, z.B. im Pankreasgang auf, so dass möglicherweise eine veränderte Viskosität des Pankreassaftes und/oder eine pHÄnderung infolge eines gestörten Ionentransportes die Autoaktivierung von Trypsinogen und damit die Pankreatitisentstehung begünstigt. Zudem vermutet man, dass es durch die Sekretion eines viskösen Sekrets zu einer obstruktiven Pankreatitis und damit zum Organuntergang kommen kann [18]. Hinsichtlich der HPT-assozierten Pankreatitis ergeben sich daraus weitere mögliche pathophysiologische Mechanismen. Während der physiologische Pankreassaft alkalisch ist und einen hohen Anteil an Kalzium aufweist, könnte die Kombination aus Hyperkalzämie im Rahmen eines pHPT und verminderter Flusseigenschaft des Pankreassaft bei einer CFTR Mutation eine Gangobstruktion durch auskristalisierte „Pankreas-Steine“ auslösen [19]. Die beiden ersten Studien, die zur Assoziation von CFTR Mutationen und Pankreatitis veröffentlicht wurden, sind 1998 publiziert. Damals beschrieben zwei Arbeitsgruppen aus England und den USA unabhängig voneinander in zwei Kohorten mit chronischer bzw. idiopathischer Pankreatitis Mutationen des CFTR Gens [18, 80]. Cohn et al. fanden bei 26 % ihrer Patienten mit einer ICP eine CFTR Mutation und bei 19 % ein 5T Allel [18], wohingegen Sharer et al. bei 13 % der Patienten mit einer CP eine heterozygote CFTR Mutation nachwiesen [80]. Dabei ist bemerkenswert, dass die letztgenannte Studie, die Patienten mit einer CP auf CFTR-Mutationen untersuchte, zwei Patienten mit einem pHPT enthielt [80]. Einer dieser Patienten wies eine heterozygote ∆F508-Mutation auf. Obwohl diese Studie den Grundstein für alle weiteren Studien zu CFTR Mutationen und Pankreatitis legte, wurde dieser Zusammenhag zwischen CFTR Mutationen in Patienten mit pHPT und Pankreatitis bis zu dieser Dissertation nicht weiter untersucht. 47 Man kann CFTR Mutationen in mindestens 5 Kategorien unterteilen, welche sich durch die molekularen Konsequenzen bzw. die sich daraus ergebenden Funktionseinschränkungen definieren [91]. Vereinfacht unterscheidet man zwischen „schweren“ und „milden“ Mutationen. Patienten mit einer zystischen Fibrose und einer Pankreasinsuffizienz haben jeweils eine „schwere“ Mutation auf beiden Allelen, wohingegen Patienten mit einer zystischen Fibrose und ausreichender Pankreasfunktion zumindest eine Mutation haben, welche mit einer „milden“ Funktionseinschränkung des CFTR Proteins assoziiert ist. Bei der großen Anzahl an bekannten CFTR-Mutationen (aktuell > 1500) ist eine Testung aller Exons bei Patienten mit einer Pankreatitis sehr aufwendig und nur mit genügend vorhandener DNA möglich. Auch aus diesem Grund konnte in dieser Kohorte keine vollständige CFTR Mutationsanalyse durchgeführt werden. Die Problematik der „Gengrösse“ (27 Exons) erklärt auch die nur begrenzt vorhandenen Daten hinsichtlich einer CFTR-Mutationsverteilung in der Normalbevölkerung. Während die ∆508F-Mutation mit 66 % als häufigste Mutation beschrieben wird [93], ist die R553X-Mutation in Familien mit einer zystischen Fibrose (~1,8 %) selten [98]. Wir konnten bei 2 von 24 Patienten (8,3 %) eine R553X-Mutation nachweisen, wobei offen bleiben muss, ob dies spezifisch für Patienten mit pHPT und Pankreatitis ist. Da CFTR, PRSS1 und SPINK1 Mutationen verschiedene Proteine betreffen, ergibt sich eine mögliche synergistische Risikoerhöhung für das Auftreten einer Pankreatitis bei gleichzeitigem Vorliegen [21, 63]. Der bereits, im Gegensatz zu den restlichen Patienten, im jungen Alter erkrankte trans-heterozygote Patient mit pHPT und Pankreatitis (SPINK1: N34S/ CFTR: R553X) unterstützt diese Hypothese einer Kumulation von genetischen Risikofaktoren eindrücklich. Dabei ist die These des synergistischen genetischen Effektes weitgehend akzeptiert und verschiedene Studien konnten bereits Kombinationen von SPINK1 Mutationen und CFTR Mutationen bei Patienten mit einer ICP nachweisen [6, 20, 63, 66, 102]. Nach den Daten von Noone et al. [63] ist das Risiko eine Pankreatitis zu entwickeln 40-fach erhöht, wenn zwei CFTR Mutationen vorliegen und um das 900-fache erhöht, sollte eine Heterozygotie für CFTR und N34S vorliegen. Cohn et al. beschrieben 2005 ein 10-fach erhöhtes Risiko eine chronische Pankreatitis zu entwickeln, wenn eine SPINK1 Mutation vorliegt, ein 48 40-fach erhöhtes Risiko für compound heterozygote CFTR Mutations-Träger und ein 500-fach erhöhtes Risiko sollten beide Genotypen vorliegen [21]. CFTR Gen Mutationen scheinen also ebenso wie die N34S Mutation bei der Entstehung einer Pankreatitis bei Patienten mit einem pHPT eine wichtige Rolle zu spielen. Ob weitere CFTR Mutationen bei vollständiger Sequenzierung gefunden worden wären, kann nicht beantwortet werden, scheint jedoch wahrscheinlich. Somit wäre auch eine größere genetische Suszeptibilität hinsichtlich der CFTR Mutationen denkbar. Abschließend ist zu sagen, dass das Pankreatitisrisiko bei Patienten mit pHPT ca. 10 fach erhöht ist. Dabei scheint die starke Assoziation der N34S SPINK1 und CFTR Mutationen (inklusive des 5T Allel) bei 9 von 25 Patienten mit pHPTassozierter Hyperkalzämie und Pankreatitis, die These zu unterstützen, dass die Hyperkalzämie lediglich das Risiko für die Entstehung einer Pankreatitis erhöht, aber möglicherweise nicht als alleiniger kausaler Auslöser gelten kann. Inwieweit weitere genetische und Umweltfaktoren eine Rolle bei der Entstehung einer Pankreatitis spielen ist bis zu jetzigen Zeitpunkt ungeklärt. Es ist daher von Nöten, weitere Kollektive mit pHPT prospektiv auf die von uns gestellte Hypothese einer multifaktoriellen untersuchen, um diese Ergebnisse zu validieren. 49 Genese der Pankreatitis zu 6 Literaturverzeichnis [1] Agarwal, A., George, R. K.,Gupta, S. K.,Mishra, S. K.(2003). Pancreatitis in patients with primary hyperparathyroidism. Indian J. Gastroenterol. 22(6), 224-5 [2] Albright, F., Reifenstein, E. C. (1948). The parathyroid glands and metabolic bone disease. 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Peter Felderbauer, der mit viel wissenschaftlichem Scharfsinn, kritischen Fragen und seiner offenen Art einen großen Betrag zur Fertigstellung dieser Arbeit beigetragen hat, ebenso wie das gesamte Team vom Labor des St. Josef-Krankenhaus Bochum. Mein Dank gilt auch den Kooperationspartnern der vorliegenden Studie, Dr. med. E. Karakas und Dr. med. V. Fendrich, welche die Proben der Probanten rekrutiert und uns zugesandt haben. Ebenso möchte ich den beteiligten Patienten für die Teilnahme an der Studie danken. Lebenslauf: Persönliche Daten Name: Tilman Horn Geburtsdatum: 07.03.1972 Geburtsort: Essen Familienstand: ledig eine Tochter, 4 Jahre Persönlicher Werdegang Berufstätigkeit seit 08/2005 Assistenzarzt in der kardiologischen Abteilung der katholischen Kliniken Essen Nord 07/2000-07/2005 Assistenzarzt in der internistischen Abteilung des Philippusstift Essen-Borbeck Studium 1993-2000 Studium der Humanmedizin an der Universität GH Essen 08/1995 Physikum 08/1996 1. Staatsexamen 03/1999 2. Staatsexamen 04/1999-03/2000 Praktisches Jahr am St.Josef Hospital Oberhausen und an der Universität von Elche/Alicante 05/2000 3. Staatsexamen Schulausbildung 1978-1982 Grundschule Schmachtenberg in Essen-Kettwig 1982-1991 Theodor-Heuss-Gymnasium in Essen-Kettwig Abitur Mai 1991 Zivildienst 1991-1993 Zivildienst als Pflegehelfer in der Fachklinik Rhein/Ruhr Freiwilliges soziales Jahr 04/1993-09/1993 freiwilliges Soziales Jahr in St. Marienhospital GmbH Ratingen Weiterbildungen 08/2006 Facharzt für Innere Medizin 06/2008 Annerkennung des Schwerpunktes Kardiologie Publikation Felderbauer, P., Karakas, E., Fendrich, V., Bulut, K., Horn, T., Lebert, R., HollandLetz, T., Schmitz, F., Bartsch, D., Schmidt, W. E. (2007). Pancreatitis Risk in Primary Hyperparathyroidism: Relation to Mutations in the SPINK1 Trypsin Inhibitor (N34S) and the Cystic Fibrosis Gene. Am J Gastroenterol. 102, 1-7
