Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
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Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung“ Teil IX Peter Schmieder AG NMR 2/104 Das Programm Beim letztes Mal Methoden zur Bestimmung von skalaren Kopplungskonstanten Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 3/104 Das Programm Heute Das „dynamic range“ Problem Proteine HSQC 3D- und 4D-NMR 15N-editierte Spektren Kopplungskonstanten mit dem HSQC Liganden-Screening mit dem HSQC Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 4/104 Das „dynamic range“ Problem Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 5/104 Das „dynamic range“ Problem Wir haben ja schon gesehen, dass das Signal für die Auswertung digitalisiert wird, also in binäre Zahlen verwandelt wird. digital raus analog rein Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 6/104 Das „dynamic range“ Problem 216 215 214 213 212 211 210 29 28 27 26 25 24 23 22 21 Der ADC (Analog-Digital-Converter) hat bei einem modernen Spektrometer 16 bis 18 Bit. Der Empfänger, der das Signal aufnimmt, das später digitalisiert wird, muss so eingestellt werden, dass das größte Signal durch diese bits angemessen dargestellt wird. 20 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 7/104 Das „dynamic range“ Problem 216 215 214 213 212 211 210 Das größte Signal wird das vom Lösungsmittel sein, das es ja in sehr hoher „Konzentration“ vorliegt. 29 28 27 2 6 25 24 23 22 H2O (18 g/mol), Dicht 1.0, 55 mol/ltr CHCl3 (119 g/mol), Dicht 1.5, 12 mol/ltr DMSO (78 g/mol), Dicht 1.1, 14 mol/ltr 21 20 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 8/104 Das „dynamic range“ Problem 216 215 214 213 212 211 210 29 28 27 26 25 24 23 22 21 Die Substanzen liegen aber u.U. nur mit eine Konzentration von 1 mM vor, d.h. in wässriger Lösung ist 55 000 mal soviel Lösungsmittel wie Substanz. 216 = 65536 Wird also das Signal des Lösungsmittels gut digitalisiert, dann findet man das Substanzsignal zusammen mit dem Rauschen im untersten Bit 20 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 9/104 Das „dynamic range“ Problem 216 215 214 213 212 In einem Spektrum eines Proteins in wässriger Lösung sieht man nur schwer das Protein 211 210 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 10/104 Das „dynamic range“ Problem 216 215 214 213 Man muss es sehr vergrößern, doch Proteinsignale sind nah am Rauschen 212 211 210 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 11/104 Das „dynamic range“ Problem 216 215 214 213 212 211 210 29 28 27 26 25 24 23 22 Das Lösungsmittelsignal muss also entfernt werden. Eine Vorgehensweise ist die Deuterierung des Lösungsmittels. Ist DMSO zu 99.97 % deuteriert entspricht das einer Protonenkonzentration 4 mM, das sind nur noch 22 21 20 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 12/104 Das „dynamic range“ Problem 216 215 214 213 212 211 210 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 Allerdings funktioniert das nicht wenn Lösungsmittel und Substanz austauschbare Protonen haben. CHCl3 kann problemlos durch CDCl3 ersetzt werden, H2O aber nicht durch D2O und CH3OH nur durch CD3OH, sonst verschwinden austauschbare Protonen. In diesen Fällen muss man das starke Lösungsmittelsignal experimentell unterdrücken Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 13/104 Lösungsmittelunterdrückung Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 14/104 Lösungsmittelunterdrückung Die einfachste und robusteste Lösungsmittelunterdrückung ist die „Vorsättigung“, bei der vor Beginn des eigentlichen Experiments mit einem langen, schwachen und daher sehr selektiven Puls auf das Lösungsmittel eingestrahlt wird. Das erfordert aber, dass die Spektrenmitte auf der Lösungsmittelfrequenz sitzt. θ 1H Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 15/104 Lösungsmittelunterdrückung Das Wasser verschwindet zwar nicht vollständig, aber das „dynamic range“ Problem wird überwunden Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 16/104 Lösungsmittelunterdrückung Vorteile Die Methode ist mit jedem NMR-Experiment kombinierbar Man braucht keinen 90°-Puls zu kennen Nachteile Das Restsignal kann bei ungünstigen Verhältnissen breit und groß sein Die Sättigung kann sich auf austauschbare Protonen übertragen Der Bereich der Einstrahlung ist vollständig gelöscht Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 17/104 Lösungsmittelunterdrückung Ein Experiment, das auf die Sättigung verzichten kann, ist die 1-1-Sequenz, die sehr simpel ist. 90x 1H Hz 90° Hx 90° H-x -Hy 90-x Δ 2πδHΔ -Hy cos 2πδHΔ + Hx sin 2πδHΔ Hz cos 2πδHΔ + Hx sin 2πδHΔ nicht detektierbar Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 18/104 Lösungsmittelunterdrückung Der Wert δH ist relativ zur Spektren-Mitte („on- resonanz“) zu sehen. Die wird bei wässrigen Lösungen immer auf der Wasserfrequenz positioniert (was schon beim Vorsättigen unumgänglich ist). Für das Wasser ist also der Wert δH(H2O) = 0 und damit ist auch der Sinus 0. Im Vektormodell ausgedrückt hat sich die Magnetisierung des Wassers zwischen den beiden Pulse nicht bewegt und wird einfach wieder in die zRichtung gedreht. Das ist unabhängig von Δ ! Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 19/104 Lösungsmittelunterdrückung Welche Signale erscheinen hängt von der Wahl von Δ ab und von den chemischen Verschiebungen Hx sin 2πδHΔ Bei einer Wartezeit Δ von 100 usec liegt das Maximum an einem 600 MHz-Spektrometer bei δHΔ = ¼, d.h. δH = 2500 Hz = 4.1 ppm Wobei das relativ zur Spektrenmitte zu sehen ist. Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 20/104 Lösungsmittelunterdrückung Das Anregungsprofil kann man mit einer einfachen Probe experimentell bestimmen δH = 0 δH = -1/4 Δ δH = 1/4 Δ Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 21/104 Lösungsmittelunterdrückung 1-1Wasserunterdrückung Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 22/104 Lösungsmittelunterdrückung Vorteile Die Methode vermeidet Sättigung der austauschbaren Protonen Sie lässt sich mit vielen Experimenten kombinieren und braucht keine besondere Spektrometeraustattung Nachteile Das Restsignal kann bei ungünstigen Verhältnissen breit und groß sein, der Sinus hat einen schmalen Nulldurchgang Man braucht den 90°-Puls Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 23/104 Lösungsmittelunterdrückung Um das Problem mit der schmalen Nullstelle des Sinus zu lösen, wurde die 1-1-echo Sequenz erdacht. 1H 90x 90-x Δ 90φ τ φ = x, y, -x, -y 2Δ 90-φ τ φrec φrec = +, -, +, - Durch die zweite Periode wird der Sinus in einen (Sinus)3 verwandelt mit einer flacheren Nullstelle Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 24/104 Lösungsmittelunterdrückung 1-1-echo Wasserunterdrückung Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 25/104 Lösungsmittelunterdrückung Das Experiment, das eine optimale Lösungsmittelunterdrückung bietet ist die WATERGATE-Sequenz 90 1H Δ 90H O 2 180 90H O 2 Δ Gz Auch hier erkennt man wieder eine Spin-Echo-Sequenz Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Lösungsmittelunterdrückung 90 1H Δ 90H O 2 180 90H O 2 26/104 Δ Gz Die beiden selektiven Pulse auf die Wasserfrequenz ergeben für das Wasser in der Summe einen 360°-Puls, für alle Signale die von diesen Pulsen nicht getroffen werden ergibt sich ein 180° Puls Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Lösungsmittelunterdrückung 90 1H Δ 90H O 2 180 90H O 2 27/104 Δ Gz Der 180° Puls wird die Gradienten refocussieren, d.h. ihr Effekt verschwindet, ein 360° Puls bleibt dagegen ohne Wirkung, das Wasser wird von den Gradienten gelöscht Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 28/104 Lösungsmittelunterdrückung Das Anregungsprofil hängt von der Wahl der selektiven Pulse ab δH = 0 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 29/104 Lösungsmittelunterdrückung Man wählt das Profil so, das die gewünschten Signale gute Intensität haben Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 30/104 Lösungsmittelunterdrückung Bei all diesen Techniken geht man allerdings davon aus, das nur ein großes Signal zu unterdrücken ist. Sollten mehrere Signale zu entfernen sein wir es deutlich komplizierter, bei manchen kombinierten Techniken (LC-NMR) kann das aber durchaus relevant sein. Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 31/104 Proteine Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Proteine 32/104 Die Primärstruktur Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Proteine 33/104 Aminosäure-Seitenketten Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Proteine 34/104 Ebenen struktureller Organisation Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 35/104 Proteine Der Ramachandran-Plot Die Struktur einer Polypeptidkette kann durch die Winkel phi (φ) und psi (ψ) beschrieben werden. Aus sterischen Gründen sind nur bestimmte Winkelkombinationen erlaubt, die im Ramachandran-Plot zu erkennen sind. Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Proteine 36/104 Sekundärstrukturelemente Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 37/104 Proteine Unterschiede in der chemischen Verschiebung treten durch Strukturierung auf Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 38/104 NMR-Spektroskopie an Proteinen 1H-1D-Spektrum von F3-008 (in d6-DMSO, 300 K) D-Pro Phe Phe Phe Trp Lys(Z) aromatische Protonen Indol-HN 11 Hα-Protonen HN-Protonen 10 9 8 7 6 5 4 aliphatische Protonen 3 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 2 1 ppm Peter Schmieder AG NMR 39/104 NMR-Spektroskopie an Proteinen 1H NMR-Spektrum eines Proteins Aliphaten Aliphaten Aromaten Aromaten H N HN α H Hα CH 3 3 CH Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 40/104 NMR-Spektroskopie an Proteinen Ist das Protein ungefaltet gibt es keine Anisotropieeffekte 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 0 ppm Peter Schmieder AG NMR 41/104 NMR-Spektroskopie an Proteinen 13C NMR-Spektrum eines Proteins 2 O D O H 2 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR NMR-Spektroskopie an Proteinen 15N 42/104 NMR-Spektrum eines Proteins 2 O D O H 2 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Sequenzspezifische Zuordnung 43/104 Bei Proteinen ist das Problem der Resonanzzuordnung in einem Polymer noch verschärft. Das einzige was vorher bekannt ist, ist die Primärsequenz, die MUSS aber bekannt sein. Basierend auf der Sequenz versucht man wieder Nachbarschaftsbeziehungen zwischen den Aminosäuren zu etablieren und auf diese Weise eine sequenz-spezifische Zuordnung durchzuführen Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 44/104 Sequenzspezifische Zuordnung Die ursprüngliche Strategie basiert auf einer 1. Identifizierung von Spinsystemen über die skalare Kopplung (J-Kopplung) im DQF-COSY oder TOCSY 2. Verknüpfung der Spinsysteme über den NOE-Effekt zwischen benachbarten Aminosäuren 3. Abgleich der verknüpften Spinsysteme mit der Primärsequenz und damit Zuordnung zu definierten Aminosäuren Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 45/104 Sequenzspezifische Zuordnung dNα(i,i) Der Abstand vom HN zum Hα, dNα(i,i) innerhalb einer Aminosäure ist immer kurz genug für einen NOE Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 46/104 Sequenzspezifische Zuordnung dαN Das gleiche gilt für den Abstand vom HN zum Hα der Aminosäure (i-1), dαN Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Sequenzspezifische Zuordnung 47/104 dβN und auch – mit Einschränkungen - für den Abstand vom HN zum Hβ der Aminosäure (i-1), dβN Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 48/104 Sequenzspezifische Zuordnung Identifizierung der Aminosäuretypen ppm TOCSY 1.0 D-Pro Phe Phe Phe Trp Lys(Z) 1.5 2.0 2.5 3.0 K 3.5 4.0 4.5 F/W F/W F/W F/W 5.0 9.0 Prolin hat kein HN, daher sind 5 Spinsysteme zu erkennen, Lysin ist eindeutig, die anderen sind „Aromaten“ 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 ppm Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 49/104 Sequenzspezifische Zuordnung Übertragung der Spinsysteme ins NOESY ppm ppm TOCSY 1.0 NOESY 1.0 1.5 1.5 Spinsysteme 2.0 2.0 2.5 2.5 3.0 3.0 K 3.5 K 3.5 4.0 4.5 F/W F/W 9.0 4.5 F/W F/W 5.0 8.8 8.6 4.0 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 5.0 ppm F/W F/W F/W F/W 9.0 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" ppm Peter Schmieder AG NMR 50/104 Sequenzspezifische Zuordnung „Sequential walk“ Erst in der Theorie.... 2 1 1 dαN 2 dNα(i,i) 2 dαN 4 3 3 dNα(i,i) 3 dαN Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 4 dNα(i,i) 4 Peter Schmieder AG NMR 51/104 Sequenzspezifische Zuordnung ...dann im Spektrum ppm 1.0 1.5 1 2.0 D-Pro Phe Phe Phe Trp Lys(Z) 2.5 3.0 K4 3.5 4.0 4.5 W5 F2 F3 5.0 9.0 8.8 8.6 8.4 8.2 F6 8.0 7.8 7.6 7.4 ppm Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 52/104 Sequenzspezifische Zuordnung ppm 2D-NOESY (100 msec) der SAM Domäne (83 Aminosäuren) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 53/104 Sequenzspezifische Zuordnung 2D-TOCSY (65 msec) der SAM Domäne (83 Aminosäuren) ppm 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 54/104 Sequenzspezifische Zuordnung 2D-TOCSY (24 msec) der SAM Domäne (83 Aminosäuren) ppm 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 55/104 Sequenzspezifische Zuordnung ppm ppm 0 0 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 11 11 10 9 8 7 ppm 10 9 8 7 ppm HN-Bereich von TOCSY und NOESY der SAM Domäne (83 Aminosäuren) Dieselbe Strategie zur Zuordnung kann verwendet werden, wird aber durch Überlagerung erschwert Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 56/104 Sequenzspezifische Zuordnung Die sequenzspezifische Zuordnung und auch die Extraktion von strukturrelevanter Information wird mit zunehmender Proteingröße immer schwieriger: 1. Es sind mehr Signale im selben spektralen Bereich, die Wahrscheinlichkeit für Überlagerung nimmt zu 2. Mit zunehmender Molekülgröße ändern sich die Relaxationseigenschaften, die Linien werden breiter, die Überlagerung wird noch wahrscheinlicher und TOCSY und COSY funktionieren immer schlechter heteronukleare Spektren Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 57/104 Proteine: Isotopenmarkierung Die Aufnahme von heteronuklearen Spektren ist bei Proteinen mit den Heterokernen in natürlicher Häufigkeit (13C=1.1% und 15N=0.4%) unrealistisch, es muß angereichert werden Chromatographie Plasmid SDS-Gel E.coli Zell-Lysat Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 58/104 Sequenzspezifische Zuordnung Mit markierten Proteinen gibt es dann zwei Möglichkeiten: Die bislang vorgestellte Strategie zur sequenzspezifischen Zuordnung wird dann mit 15N-editierten, dreidimensionalen Techniken erweitert und ist dann auch auf mittelgroße Proteine anwendbar Es wird eine neue Strategie basierend auf sogenannten Tripelresonanz-Techniken angewendet, die auch für „sehr große“ Proteine noch anwendbar ist Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 59/104 HSQC Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 60/104 HSQC Bei den heteronuklearen Spektren von Proteinen ist eine Optimierung hinsichtlich der Relaxationseigenschaften und der Linienbreiten erforderlich, man nimmt daher bei 15N ein HSQC statt eines HMQC auf 90x 1H 180 Δ/2 180x 90x 180 Δ/2 Δ/2 180 nX 90y 90x 90x t1/2 Δ/2 180 t1/2 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Entkopplung Peter Schmieder AG NMR 61/104 HSQC 90x 1H 180 Δ/2 180x 90x 180 Δ/2 Δ/2 180 nX 90y 90x 90x t1/2 Δ/2 180 t1/2 Entkopplung Heteronuclear Single Quantum Correlation Die Zeit in der transversale Protonenmagentisierung vorliegt ist von der Evolutionszeit unabhängig Es gibt in der Evolutionszeit keine Entwicklung von Protonen-Kopplung Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 62/104 HSQC HSQC180vs. HMQC x 90x 1H Δ Δ 90x nX 90x t1/2 Entkopplung t1/2 Bei sehr guter Auflösung sieht man die Aufspaltung im HMQC, die dadurch erzeugte Linienverbreiterung ist immer vorhanden ppm 104.5 105.0 105.5 106.0 106.5 107.0 8.4 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 8.3 8.2 ppm Peter Schmieder AG NMR 63/104 HSQC Sowohl HMQC als auch HSQC arbeiten mit Protonendetektion und damit höherer Empfindlichkeit Das HMQC hat weniger Pulse und ist daher weniger fehleranfällig, vor allem bei 13C kann das Vorteile haben Beim HSQC ist die Implementierung einer Lösungsmittelunterdrückung günstiger, sehr gut funktioniert das mit der WATERGATE-Sequenz Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 64/104 HSQC HSQC mit WATERGATE-Wasserunterdrückung 90x 1H 180 Δ/2 180x 90x 180 Δ/2 Δ/2 180 nX 90y 90x 90x t1/2 Δ/2 180 t1/2 Entkopplung Gz Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 65/104 HSQC 90x 1H 180 Δ/2 90y 180x nX 90x 90x t1/2 Kein δH, aber JHX JHH für kurze Δ vernachlässigbar 180 Δ/2 Δ/2 180 90x Δ/2 180 Entkopplung t1/2 wie vorne Kein δH, aber δX Δ wird wieder Keine JHH und auch 1/2JHX gesetzt keine JHX Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 66/104 HSQC 90x 1H 180 Δ/2 90y nX 90x 90x t1/2 90° Hx πJHXΔ 2Hx Xz 90° Hy 90° Xx 90° Hy 90° Xx 90x 180 Δ/2 Δ/2 180 Hz 180x Δ/2 180 Entkopplung t1/2 -Hy cos πJHXΔ + 2Hx Xz sin πJHXΔ = 2Hx Xz 2Hz Xy 2πδXt1 2Hx Xz cos 2πδXt1 2Hz Xy cos 2πδXt1 πJHXΔ Hy cos 2πδXt1 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 67/104 HSQC Hy cos 2πδXt1 H,X-HSQC δX2 δX3 δX1 δH1 δH2 δH3 Nach Detektion und 2DFouriertransformation entsteht ein 2D-Spektrum mit δX in der indirekten Dimension und δH der daran gebundenen Protonen in der direkten Dimension Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 68/104 HSQC 15N-HSQC der SAM Domäne (83 Aminosäuren) Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 69/104 HSQC 13C-HSQC der SAM Domäne (83 Aminosäuren) Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 70/104 HSQC 1H, H,15N-HSQC N-HSQC 1 10.0 1H,13 H, C-HSQC C-HSQC 15 9.0 8.0 7.0 1 13 100 20 110 45 120 70 130 95 140 120 7.0 5.0 3.0 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 1.0 Peter Schmieder AG NMR 71/104 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie mit mehr als zwei Dimensionen Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 72/104 nD-NMR Ein dreidimensionales Experiment entsteht formal durch Kombination von zwei zweidimensionalen Experimenten 1. 2D-Sequenz Preparation Evolution Mischung Detektion Preparation 2. 2D-Sequenz Evolution Mischung Detektion 3D-Sequenz Preparation Evolution (1) Mischung (1) Evolution (2) Mischung (2) Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Detektion Peter Schmieder AG NMR 73/104 nD-NMR 90 1H 90 90 NOESY τm t1 90 1H 180 Δ/2 90 90 1H t1 τm 180 Δ/2 NOESY-HSQC 90 180 180 Entkopplung 90 180 Δ/2 90 90 t2/2 Δ/2 t1/2 Δ/2 180 nX 90 t1/2 90 90 180 Δ/2 nX 90 90 Δ/2 180 HSQC 180 Δ/2 180 t2/2 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Entkopplung Peter Schmieder AG NMR 74/104 nD-NMR 90 1H 90 90 t1 τm 180 Δ/2 180 90 180 Δ/2 Δ/2 180 nX 90 90 90 t2/2 Δ/2 180 t2/2 Entkopplung Man hat nun zwei Evolutionszeiten (t1 und t2) die beide voneinander unabhängig systematisch variiert werden müssen. Auch bei verlängerter Messzeit ist dadurch die Zahl der möglichen Messpunkte und damit der Auflösung noch weiter begrenzt. Die dritte Dimension wiegt das aber auf. Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 75/104 nD-NMR Das Spektrum ist dann keine Fläche mit Signalen mehr sondern ein Würfel, mit drei Achsen mit chemischer Verschiebung. Intensität zeigt sich als „vierte Dimension“ Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 76/104 nD-NMR Da der Würfel nur schwer zu analysieren ist, schneidet man aus dem Würfel bei konstanter Frequenz in einer Dimension ein 2DSpektrum heraus, das man als herkömmliches 2D analysiert Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 77/104 nD-NMR 90 1H 90 90 t1 τm 180 Δ/2 180 90 180 Δ/2 Δ/2 180 nX 90 90 90 t2/2 Δ/2 180 t2/2 Entkopplung Ein Beispiel für ein 3D- Experiment ist das dreidimensionale nX-NOESY-HSQC Es wird dazu verwendet die Überlagerung in den NOESYSpektren, die sowohl bei der Zuordnung als auch bei der Abstandsbestimmung ein Problem ist aufzulösen Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 78/104 nD-NMR Als Beispiel dient der Bereich der Aminoprotonen, in dem bei Proteinen immer Überlagerung auftritt 1D-1H-Spektrum Bereich der Aminoprotonen eines Proteins, 4 Signale δH 9 8 7 von denen 2 überlagert sind 2 Signale Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 79/104 nD-NMR δH (ppm) 0 2 2D-NOESY-Spektrum: 4 Die Überlagerung im Bereich 6 der Seitenketten wird aufgelöst, nicht aber im 8 Bereich der Aminoprotonen 10 9 δH (ppm) 8 7 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 80/104 nD-NMR δN (ppm) 110 2D-15N-HSQC-Spektrum 120 Die Überlagerung im Bereich der Aminoprotonen 130 9 δH (ppm) 8 wird aufgelöst 7 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 81/104 nD-NMR Im 3D-Spektrum gibt es dann keine Überlagerung mehr Zwei der drei Seitenflächen entsprechen genau den zweidimensionalen Experimenten Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR nD-NMR 82/104 Aus dem Würfel wird eine Ebene („plane“) extrahiert, hier bei einer bestimmten 15N-Verschiebung „plane“ Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 83/104 nD-NMR Die Überlagerung ist verschwunden ! 2D 0 δH(ppm) „plane“ 2 4 6 8 10 δH(ppm) 9 8 7 9 8 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 7 Peter Schmieder AG NMR 84/104 nD-NMR δH (ppm) 0 „plane“ 2 Zur Analyse der Daten werden 4 6 8 „strips“ aus dem 3D extrahiert 10 9 δH (ppm) 8 7 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 85/104 nD-NMR 3D NOESY 3D-NOESY 9.0 1 8.0 H (ppm) 7.0 H (ppm) 9.0 15 10.0 1 6.0 H (ppm) 1 9.0 6.0 3.0 3.0 0.0 0.0 2D NOESY 2D-NOESY 10.0 9.0 N=120.68 ppm 8.0 7.0 1 H (ppm) Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 86/104 nD-NMR 180 90 1H t1 TOCSY Δ/2 180 90 180 Δ/2 Δ/2 180 nX 90 90 90 t2/2 Δ/2 180 Entkopplung t2/2 Genauso gibt es das dreidimensionale nX-TOCSY-HSQC Auch hier die Überlagerung in den Spektren aufgelöst und die bekannte Strategie der sequenzspezifischen Zuordnung greift wieder Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR nD-NMR 87/104 Das Schema der mehrdimensionalen NMR lässt sich problemlos auf eine vierte Dimension erweitern Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 88/104 Bestimmung von 3JHNHα mit dem HSQC Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 89/104 Bestimmung von 3JHNHα mit dem HSQC Wir hatten schon gesehen, daß die 3JHNHα Kopplungskonstante wichtige Strukturinformation enthält. Sie ist aber mit zunehmender Größe des Proteins und damit dem Versagen des DQF-COSY mit dem Experiment nur noch schwer zu bestimmen HN CO 3J HNHα Hα Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" R CO Peter Schmieder AG NMR Bestimmung von 3JHNHα mit dem HSQC 90x 1H Δ/2 180 δ/2 δ/2 90y Δ/2 180 15N 180x 90x 180 Δ/2 90x 90x t1/2 90/104 Δ/2 180 t1/2 Entkopplung Man nutzt daher das 15N-HSQC zur Bestimmung der Kopplungskonstanten. Bislang hatten wir sie immer wegen der kurzen Wartezeiten vernachlässigt, macht man die Wartezeiten länger werden sie relevant. Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Bestimmung von 3JHNHα mit dem HSQC 90x 1H Δ/2 180 δ/2 δ/2 90y Δ/2 180 15N 90x 91/104 Diesmal rechnen wir mit der 3JHH, chemische Verschiebung entwickelt sich auch hier nicht Heteronukleare Kopplung entwickelt sich nicht während der Wartezeit δ, sondern nur, wie gehabt während Δ/2, am Ende haben wir mit Δ = 1/2J wieder antiphaseMagnetisierung Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Bestimmung von 3JHNHα mit dem HSQC 90x 1H 180 Δ/2 δ/2 δ/2 90y Δ/2 180 15N HNz 90° Hx 90° Hy 90° Xx 90x 92/104 Am Ende rechnen wir also nur mit 3JHH, die sich ungestört während Δ + δ entwicklet πJHH(Δ + δ) 2HNx Nz cos πJHH (Δ+δ) - 4HNy Nz Hαz sin πJHH (Δ+δ) 2HNz Ny cos πJHH (Δ+δ) - 4HNy Ny Hαx sin πJHH (Δ+δ) führt am Ende zu Signal nicht detektierbar Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Bestimmung von 3JHNHα mit dem HSQC 93/104 Damit erscheint die Kopplung als Intensität im HSQC 3J HH=4 Δ+δ=50 msec 3J HH=10 Hz Hz Δ+δ=125 msec Man nimmt nun eine Serie von HSQCs auf mit unterschiedlichen Werten für δ und erhält je nach Kopplungskonstante an verschiednen Stellen einen Nulldurchgang Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Bestimmung von 3JHNHα mit dem HSQC 94/104 Man bestimmt dann die Intensität der Signale in jedem HSQC und trägt gegen die verwendete Wartezeit auf. Daraus kann man mit einem einfachen fit die Nullstelle und damit die Kopplungskonstante bestimmen. Die Auflösung im HSQC ist viel besser als im COSY und daher gibt es weniger Überlagerung, die Signale werden auf sehr empfindliche Art und Weise durch die 1JHN erzeugt, das Experiment funktioniert also auch bei größeren Proteinen Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 95/104 Liganden-„Screening“ mit dem HSQC Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 96/104 Screening Eine weitere, zunehmend wichtigere Anwendung der NMR-Spektroskopie ist das „Screenen“ von Substanzbibliotheken zur Identifizierung von Leitstrukturen für Pharmaka Dazu gibt es inzwischen zahlreiche Verfahren, eines davon ist das sogenannte „SAR-by-NMR“ Verfahren. Ausgangspunkt ist dabei ein vollständig zugeordnetes 15N-HSQC Spektrum Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 97/104 Screening HSQC-Spektren mit und ohne potentiellem Liganden werden verglichen Das ist auch als „high-throughput“ Verfahren möglich Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 98/104 Screening Damit wird ein erster Ligand identifiziert, der dann mit Synthese oder gezielter Suche noch optimiert werden kann Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 99/104 Screening Dann wird ein zweiter Ligand identifiziert, der wiederum optimiert werden kann und dann mit dem ersten verknüpft wird Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 100/104 Screening Anwendung auf einen Inhibitor von Stromelysin Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 101/104 Screening Anwendung auf einen Inhibitor von Stromelysin Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Screening 102/104 Neben dem „Screening“ kann das gleiche Experiment natürlich auch zum Studium von Protein-LigandWechselwirkungen genutzt werden. Dann wird nur ein, schon bekannter Ligand eingesetzt und die Bindungsstelle und gegebenenfalls auch die Bindungskonstante bestimmt. Neben dem Screening mit dem HSQC gibt es noch zahlreiche andere NMR-Screening-Techniken, die eine Veränderung an den Liganden nutzen um die Bindung zu detektieren Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 103/104 Zusammenfassung Was haben wir uns heute angeschaut: Lösungsmittelunterdrückung Proteine und die sequenzspezifische Zuordnung HSQC Dreidimensionale NMR: NOESY-HSQC Kopplungskonstanten mit dem HSQC Screening mit dem HSQC Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 104/104 That‘s it for today Nächstes Mal: Tripelresonanzexperimente TROSY Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR
