Skript Teil VI - Peter Schmieder
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Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung“ Teil VI Peter Schmieder AG NMR 2/105 Das Programm Beim letztes Mal Heteronukleare NMR Ein Beispiel Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 3/105 Das Programm Heute Peptide DQF-COSY, TOCSY, Spinsysteme NOE und NOESY, ROESY sequenzspezifische Zuordnung von Peptiden Strukturbestimmung von Peptiden Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 4/105 Peptide Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 5/105 Peptide Peptide bestehen aus Aminosäuren, dabei sind die αAminosäuren wegen ihrer biologischen Bedeutung am wichtigsten Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 6/105 Peptide Am α-Kohlenstoff besteht ein Stereozentrum, man unterscheidet daher D- und L-Aminosäuren Natürliche Aminosäuren haben LKonfiguration, sie kommen in Proteinen vor Mit Ausnahme von Cystein hat die L-Form eine S-Konfiguration Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 7/105 Peptide 20 natürliche Aminosäuren Alanin Ala A Leucin Leu L Arginin Arg R Lysin Lys K Asparagin Asn N Metionin Met M Aspartat Asp D Phenylalanin Phe F Cystein Cys C Prolin Pro P Glutamin Gln Q Serin Ser S Glutamat Glu E Threonin Thr T Glycin Gly G Tryptophan Trp W Histidin His H Tyrosin Tyr Y Isoleucin Ile I Valin Val V Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 8/105 Peptide 20 natürliche Aminosäuren Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 9/105 Peptide Die Aminosäuren werden über die Peptid-Bindung zu Peptiden und Proteinen verkettet Peptid-Rückrat oder „backbone“ Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 10/105 Peptide Die Abfolge der Seitenketten ist die einzige Variable in der „Sequenz“, d.h. der Abfolge der Aminosäuren LSFAAAMNGLA INEGFDLLRSG KEDAKGKSEEE Die Raumstruktur ist aus der Sequenz (noch) nicht ableitbar Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 11/105 Peptide Die Peptidbindung ist aufgrund ihres pseudoDoppelbindungs-Charakters planar Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 12/105 Peptide Damit sind nur zwei von drei Bindungen entlang des „backbones“ frei drehbar ψ (psi) φ (phi) Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 13/105 Peptide Nicht jede Kombination von φ (phi) und ψ (psi) ist sterisch erlaubt Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 14/105 Peptide Die erlaubten Kombinationen von phi und psi kann man dem Ramachandran-Plot entnehmen α = α-helix β = β-Faltblatt L = linksgängige helix Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 15/105 Peptide Sekundärstrukturelemente α-helix Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 16/105 Peptide Sekundärstrukturelemente β-Faltblatt Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 17/105 Peptide Sekundärstrukturelemente β-turns typ II typ I Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 18/105 Peptide Ebenen struktureller Organisation Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 19/105 Peptide Lineare Peptide bis ca. 30 Aminosäuren sind in wässriger Lösung im allgemeinen flexibel und unstrukturiert („random coil“ Peptid) Viele kleine, in der Natur vorkommenden Peptide liegen aber in cyclischer Form vor. Dadurch ist der konformationelle Freiraum stark eingeschränkt und es liegt eine geordnete Struktur vor. Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide 20/105 cyclische Peptide können unterschiedliche Ringgrößen haben, 6 AS werden sehr oft verwendet D-Pro Phe Phe Phe Trp Lys(Z) F3-008: cyc-(dP-F-F-K(Z)-W-F) Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 21/105 Peptide 1H-1D-Spektrum (in d6-DMSO, 300 K) aromatische Protonen Indol-HN 11 Hα-Protonen HN-Protonen 10 9 8 7 6 5 4 aliphatische Protonen 3 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 2 1 ppm Peter Schmieder AG NMR 22/105 Peptide 13C-1D-Spektrum (in d6-DMSO, 300 K) aliphatische Kohlenstoffe aromatische Kohlenstoffe Carbonyl-Kohlenstoffe 190 180 170 160 150 140 Cα-Kohlenstoffe 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 30 20 10 ppm Peter Schmieder AG NMR Peptide 23/105 Man kann sogenannte „random coil“ Verschiebungen angeben Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 24/105 Peptide Unterschiede in der chemischen Verschiebung treten durch Strukturierung auf Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 25/105 Peptide Dadurch dass Peptide quasi Polymere sind, ergeben sich zwei Folgerungen. Eindimensionale Spektren sind von nur sehr begrenztem Wert, man wird immer zweidimensionale Spektren aufnehmen müssen. Die Linien sollten so scharf wie möglich sein, beim keinem der Spektren sollte ein MagnitudeRechnung notwendig sein Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 26/105 DQF-COSY Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 27/105 Peptide: DQF-COSY φ3 1H t1 φrec φ3 = x, y, -x, -y φrec = x, -y, -x, y Ein Experiment, das wir nun schon gut kennen, ist das COSY mit Doppelquantenfilter, das DQF-COSY. Es erzeugt Kreuzsignale via skalare Kopplung und arbeitet mit einem Phasencyclus. Kreuz- und Diagonalsignale haben gleiche Phase. Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 28/105 Peptide: DQF-COSY Auf der Diagonale befinden sich die Signale mit der gleichen Frequenz in t1 und t2, die Kreuzsignale befinden sich am Schnittpunkt unterschiedlicher Frequenzen in t1 und t2 Sie zeigen eine Kopplung zwischen den H1 und H2 an Transfer H1 H2 Kreuzsignal δ2 δ1 Diagonalsignal δ1 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" δ2 Peter Schmieder AG NMR 29/105 Peptide: DQF-COSY ppm DQF-COSY von F3-008, Korrelationen via 3 Bindungen 1 HN-Hα 2 (Fingerabdruck) 3 4 5 Seitenketten 6 7 8 9 10 symetrische Peaks 11 12 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 30/105 Peptide: DQF-COSY ppm HN-Hα 3.4 (Fingerabdruck) 3.6 3.8 D-Pro Phe Phe Phe Trp Lys(Z) 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 9.0 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 ppm 5 HN-Hα peaks sind zu erwarten, da Prolin kein HN hat. Eine Zuordnung ist erstmal nicht möglich Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 31/105 Peptide: DQF-COSY ppm 1.0 Seitenketten D-Pro Phe Phe Phe Trp Lys(Z) 1.5 2.0 2.5 3.0 Hier liegen alle Korrelationen der Seitenkettenprotonen 3.5 4.0 4.5 5.0 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 32/105 Peptide: DQF-COSY Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 33/105 Peptide: DQF-COSY ? Da im DQF-COSY nur Korrelationen über 3 Bindungen zu sehen sind, gibt es bei der Überlagerung von einem Signalpaar Mehrdeutigkeiten Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 34/105 Peptide: DQF-COSY Seitenketten ppm 1 Bei Peptiden gibt es wegen des engen Bereichs der HαVerschiebungen dieses Problem, man braucht ein Experiment, dass Korrelationen über mehrere Bindungen herstellt 2 3 Hα 4 5 6 HN 7 8 9 10 11 12 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 35/105 TOCSY Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 36/105 Peptide: TOCSY TOCSY TOtal Correlation SpectroscopY Beim TOCSY besteht die Mischzeit aus einer speziellen Pulssequenz, die Magnetisierung via skalarer Kopplung transferiert, in Abhängigkeit von der Mischzeit auch über mehrere Schritte Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 37/105 Peptide: TOCSY TOCSY τm 90x 1H t1 I1x,1y I1z Multipuls sequenz τm via skalare Kopplung t2 I2x,2y I2z Die Zahl der Transfers hängt von der Mischzeit τm ab, für einen Transferschritt mischt man ca. 20 msec, für viele Schritte bis zu 100 msec Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 38/105 Peptide: TOCSY τm 90x t1 1H H1z 90° Hx -H1y 2πδHt1 Multipuls sequenz t2 -H1y cos 2πδH1t1 + H1x sin 2πδH1t1 Das selektieren wir über den Phasencyclus τm - H1y cos 2πδH1t1 - H2y cos 2πδH1t1 2πδHt2 -H1y cos 2πδH1t1 cos 2πδH1t2 -H2y cos 2πδH1t1 cos 2πδH2t2 Die Signale haben die gleiche Phase ! Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 39/105 Peptide: TOCSY ? Im TOCSY ist die Mehrdeutigkeit aufzulösen, da eben mehrere Korrelationen zu sehen sind Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 40/105 Peptide: TOCSY ppm D-Pro Phe Phe Phe Trp Lys(Z) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm In einem TOCSY mit langer Mischzeit sind ist bei jedem Signal das ganze Spinsystem zu sehen Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 41/105 Peptide: TOCSY ppm 1.0 D-Pro Phe Phe Phe Trp Lys(Z) 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Im Seitenkettenbereich ..... 4.0 4.5 5.0 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 42/105 Peptide: TOCSY .....wie im HN-Bereich ppm 1.0 ppm Phe D-Pro 1.0 1.5 1.5 2.0 Phe Phe 2.0 2.5 2.5 3.0 Trp Lys(Z) 3.0 3.5 3.5 4.0 4.0 4.5 4.5 5.0 5.0 9.0 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 ppm 9.0 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 7.8 7.6 7.4 ppm Peter Schmieder AG NMR 43/105 Peptide: TOCSY JHH JHH JHH δH1 JHH δH1 δH1 δH2 Diagonalsignale Kreuzsignale Auch im TOCSY taucht natürlich die Kopplung in beiden Dimensionen auf und gibt den Signalen eine Feinstruktur. Allerdings haben alle Elemente der Signale gleiches Vorzeichen und die Feinstruktur ist oft nicht gut zu erkennen Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 44/105 Spinsysteme Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 45/105 Peptide: Spinsysteme Jede Aminosäure bildet ein separates Spinsystem, da über den Carbonyl-Kohlenstoff keine signifikante skalare Kopplung reicht HN-Hα gibt es in jeder Aminosäure (außer Prolin), die Seitenketten sind unterschiedlich Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Spinsysteme Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 46/105 Peter Schmieder AG NMR Peptide: Spinsysteme Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 47/105 Peter Schmieder AG NMR Peptide: Spinsysteme Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 48/105 Peter Schmieder AG NMR Peptide: Spinsysteme Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 49/105 Peter Schmieder AG NMR Peptide: Spinsysteme Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 50/105 Peter Schmieder AG NMR 51/105 Peptide: Spinsysteme Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Spinsysteme Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 52/105 Peter Schmieder AG NMR 53/105 Peptide: Spinsysteme Damit können wir Spinsysteme von Aminosäuren erkennen, ihre Position in der Sequenz ergibt sich damit aber nicht. Die Abtrennung der Spinsysteme untereinander durch die Carbonylgruppe verhindert die Etablierung eine Nachbarschaft von Aminosäuren durch skalare Kopplung und damit eine Zuordnung innerhalb der Sequenz Man braucht ein weiteres Experiment für eine Sequenz-spezifische Zuordnung Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 54/105 NOE, NOESY und ROESY Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 55/105 Peptide: NOESY und ROESY Bislang basieren alle 2D-Experimente auf skalarer Kopplung, also einer Wechselwirkung durch die Bindung. Es gibt aber auch eine Wechselwirkung durch den Raum, die dipolare Kopplung Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: NOESY und ROESY 56/105 Auf ihr basiert der NOE-Effekt: Nuclear Overhauser Enhancement Effekt I (NOE) ∼ 1/r6 Wegen des schnelle Abfalls mit r6 können nur Abstände bis 400 pm, manchmal 500 pm bestimmt werden r Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: NOESY und ROESY 57/105 Der NOE kann im NOE-Differenz Experiment gemessen werden Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 58/105 Peptide: NOESY und ROESY Im Falle von Biomolekülen sind aber wieder mehrdimensionale Experimente notwendig Das zweidimensionale Experiment um den NOE zu messen ist die Nuclear Overhauser Effekt SpectrocopY NOESY Da man mit dem NOESY Abstände bestimmen kann, ist es das zentrale Experiment für die Strukturbestimmung von Biomolekülen Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 59/105 Peptide: NOESY und ROESY NOESY 90x 1H 90x t1 Das NOESY arbeitet mit folgendem Phasencyclus φ3 = x φrec = x φ3 = y φrec = y φ3 = -x φrec = -x φrec = -y φ3 = -y 90φ3 τm t2 (φrec) Ein guter Wert τm hängt von der Molekülgröße ab, bei kleinen Molekülen 500 msec bis 1 sec, bei Peptiden 100 bis 400 msec, bei Proteinen 50200 msec Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 60/105 Peptide: NOESY und ROESY 90x Diesmal bleibt etwas anderes übrig H1z 90° Hx 90° Hx -H1y 1H 2πδHt1 90x t1 90φ3 τm t2 (φrec) -H1y cos 2πδH1t1 + H1x sin 2πδH1t1 -H1z cos 2πδH1t1 + H1x sin 2πδH1t1 während der Mischzeit wird Magnetisierung transferiert τm -H1z cos 2πδH1t1 - H2z cos 2πδH1t1 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 61/105 Peptide: NOESY und ROESY der letzte 90° Puls verwandelt es wieder in detektierbare Magnetisierung und selektiert die NOE-Signale 90° Hφ1 -H1y cos 2πδH1t1 - H2y cos 2πδH1t1 dann wird detektiert 2πδHt2 -H1y cos 2πδH1t1 cos 2πδH1t2 -H2y cos 2πδH1t1 cos 2πδH2t2 Diagonalsignal Kreuzsignal Auch hier haben wir die Feinstruktur vernachlässigt Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 62/105 Peptide: NOESY und ROESY Auch hier gilt wieder, das die Kreuzsignale und die Diagonalsignale die gleiche Phase haben Die NOESY Spektren sehen also aus wie die TOCSYSpektren, der Transfer beruht aber eben nicht auf skalarer Kopplung sondern auf dem NOE-Effekt 90x 1H 90x t1 I1z 90φ3 τm τm via NOE-Effekt t2 (φrec) I2z Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 63/105 Peptide: NOESY und ROESY D-Pro Phe Phe Phe Trp Lys(Z) Jedes Kreuzsignal weist auf einen Abstand von weniger als 500 pm hin Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: NOESY und ROESY 64/105 NOESY vs. DQF-COSY 90x 90x t1 1H 90φ3 τm t2 (φrec) φ3 = x, y, -x, -y φrec = x, y, -x, -y τm = 100 msec Δ = 3 usec 90x 1H 90x t1 90φ3 Δ anderer Phasencyclus t2 (φrec) φ3 = x, y, -x, -y φrec = x, -y, -x, y Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: NOESY und ROESY 65/105 NOESY vs. DQF-COSY Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 66/105 Peptide: NOESY und ROESY Es gibt aber beim NOESY ein Problem, das mit der Intensität der NOE-Signale Beweglichkeit der Moleküle zusammenhängt Die Intensität der NOE-Signale ist bei einer bestimmten Beweglichkeit und Feldstärke null !! log(ωτc) Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 67/105 Peptide: NOESY und ROESY Intensität der NOE-Signale Einen Ausweg bietet das ROESY Experiment Hier gibt es keinen Nulldurchgang log(ωτc) Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 68/105 Peptide: NOESY und ROESY ROESY 90x 90x 1H 90x t1 I1x τm via ROE-Effekt t2 (φrec) I2x Das ROESY und der ROE-Effekt sind dem NOESY sehr ähnlich, es wird aber nicht longitudinale sondern transversale Magnetisierung ausgetauscht Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: NOESY und ROESY NOESY mit ωτc > 1 69/105 ROESY, NOESY mit ωτc < 1 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 70/105 Peptide: NOESY und ROESY NOESY ROESY Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 71/105 Sequenzspezifische Zuordnung Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Sequenzspezifische Zuordnung 72/105 Ein Peptid ist ein Polymer Die Kenntnis der Sequenz ist unbedingt erforderlich Man führt eine sequenzspezifische Zuordnung durch Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Sequenzspezifische Zuordnung 73/105 Sequenz-spezifische Zuordnung 1. Welcher Aminosäuretyp liegt vor (welche Farbe) 2. Welche Aminosäure liegt neben welcher (Nachbarschaft) 3. Abgleich mit der Proteinsequenz 4. Die Reihenfolge von (1) und (2) ist egal Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Sequenzspezifische Zuordnung 74/105 Der Aminosäuretyp wird über COSY und TOCSY bestimmt Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Sequenzspezifische Zuordnung 75/105 Für die Methode der sequenzspezifischen Zuordnung sind Abstände entlang des Peptid-“backbone“ von Bedeutung Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Sequenzspezifische Zuordnung dNα(i,i) 76/105 Der Abstand vom HN zum Hα, dNα(i,i) innerhalb einer Aminosäure ist immer kurz genug für einen NOE Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Sequenzspezifische Zuordnung 77/105 dαN Das gleiche gilt für den Abstand vom HN zum Hα der Aminosäure (i-1), dαN Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Sequenzspezifische Zuordnung 78/105 dβN und auch – mit Einschränkungen - für den Abstand vom HN zum Hβ der Aminosäure (i-1), dβN Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Sequenzspezifische Zuordnung Es sollten also für jedes HN mindestens zwei Signale im Bereich des „Fingerabdrucks“ vorliegen: Eines zum Hα der gleichen Aminosäure, eines zum Hα der in der Sequenz vorangehenden ppm 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 9.0 79/105 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 ppm Daneben gibt es aber noch andere Signale von HN zu Seitenketten und Aromaten zu Seitenketten Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 80/105 Peptide: Sequenzspezifische Zuordnung 1. Identifizierung der Aminosäuretypen ppm ppm COSY 1.0 1.5 1.5 2.0 2.0 2.5 2.5 3.0 3.0 K 3.5 3.5 4.0 4.5 4.0 F/W F/W 9.0 4.5 F/W 5.0 8.8 8.6 TOCSY 1.0 8.4 8.2 F/W 8.0 7.8 7.6 7.4 5.0 ppm 9.0 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 7.8 7.6 7.4 ppm Peter Schmieder AG NMR Peptide: Sequenzspezifische Zuordnung 2. Übertragung der COSY-Peaks ins NOESY COSY NOESY ppm ppm 3.4 K 3.6 3.8 3.8 4.0 4.0 4.2 4.2 4.4 F/W F/W 4.4 4.6 4.6 4.8 4.8 F/W 5.0 F/W F/W F/W F/W 5.0 F/W 5.2 5.2 9.0 K 3.6 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 ppm 9.0 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 7.6 7.4 7.2 ppm Peter Schmieder AG NMR 81/105 82/105 Peptide: Sequenzspezifische Zuordnung 3. Dann kommt der „sequential walk“ Erst in der Theorie.... 2 1 1 dαN 2 dNα(i,i) 2 dαN 4 3 3 dNα(i,i) 3 dαN Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 4 dNα(i,i) 4 Peter Schmieder AG NMR Peptide: Sequenzspezifische Zuordnung 83/105 4. Dann im Spektrum ppm 1 K4 3.6 3.8 4.0 F2 4.2 W5 4.4 4.6 4.8 F3 5.0 D-Pro Phe Phe Phe Trp Lys(Z) F6 5.2 9.0 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 ppm Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Sequenzspezifische Zuordnung 84/105 nimmt man die Hβ mit dazu wird es noch etwas sicherer ppm 1.0 1.5 2.0 1 2.5 D-Pro Phe Phe Phe Trp Lys(Z) 3.0 K4 3.5 4.0 4.5 F2 9.0 W5 F6 F3 5.0 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 ppm Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 85/105 Peptide: Sequenzspezifische Zuordnung Die Zuordnung der Seitenketten kann man mit dem COSY oder dem TOCSY aus den sequenzspezifischen Zuordnung der Hauptkette ableiten ppm ppm 1.0 1.0 1.5 1.5 2.0 2.0 2.5 2.5 3.0 3.0 3.5 3.5 4.0 4.0 4.5 4.5 5.0 5.0 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 2.5 2.0 1.5 ppm Peter Schmieder AG NMR 86/105 Bestimmung der 3D-Struktur Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Bestimmung der 3D-Struktur 87/105 Ist die Zuordnung der Resonanzen abgeschlossen, ist damit aber die Raumstruktur des Peptides noch nicht bekannt. Hierzu ist die Extraktion von strukturgebender Information aus den NMRSpektren notwendig. Die ist aus drei Parametern erhältlich: 1. NOE-Effekten 2. skalaren Kopplungen 3. chemischen Verschiebungen Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Bestimmung der 3D-Struktur 88/105 Den NOE-Effekt haben wir schon kennen gelernt Nuclear Overhauser Enhancement Effekt I (NOE) ∼ 1/r6 Wegen des schnelle Abfalls mit r6 können nur Abstände bis 400 pm, manchmal 500 pm bestimmt werden r Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Bestimmung der 3D-Struktur 89/105 Abstände innerhalb des Moleküls sind zur Intensität der Kreuzsignale proportional. Allerdings lassen sich die Abstände nicht absolut bestimmen, sondern nur durch interne Kalibierung. Dazu braucht man NOE-Effekte von bekannten Abständen Dann kann man die unbekannten Abstände durch Vergleich der Intensitäten ermitteln Ieich Idist = rdist reich rdist = reich Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Ieich Idist Peter Schmieder AG NMR 90/105 Peptide: Bestimmung der 3D-Struktur Als Eichabstände eignene sich der Indol-Ring von Tryptophan oder zwei geminale Protonen NH2 R OH R O H N H H H 282 pm Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" 178 pm Peter Schmieder AG NMR Peptide: Bestimmung der 3D-Struktur 91/105 Die Intensität der Signale wird dabei durch Volumenintegration bestimmt, ganz analog den eindimensionalen Spektren, bei denen die Fläche unter der Kurve der Intensität entspricht Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Bestimmung der 3D-Struktur 92/105 Abstände in Sekundärstrukturelementen Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Bestimmung der 3D-Struktur 93/105 Abstände zwischen Sekundärstrukturelementen Mit wenigen Abständen kann eine Struktur stark eingeschränkt werden Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Bestimmung der 3D-Struktur 94/105 Skalare oder J- Kopplung haben wir schon vielfältig benutzt als Transfermechanismus zur Erzeugung von 2Ds. Das ermöglich analog dem NOE auch ihre Bestimmung und die Größe von 3J-Kopplungen erlaubt Rückschlüsse auf Dihedralwinkel 3J HNHα HN CO Hα R CO Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Bestimmung der 3D-Struktur 95/105 Dazu verwendet man die Karpluskurven. Methoden zur Bestimmung von J-Kopplungen sind sehr zahlreich. Karplus-Kurven HNHα=6.4 cos2φ – 1.4 cos φ + 1.9 J-Kopplung 3J Φ-Winkel Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Bestimmung der 3D-Struktur 96/105 Aber auch chemische Verschiebungen enthalten Strukturinformation. Der Zusammenhang ist zuerst für die Werte von Cα und Cβ aufgefallen Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Bestimmung der 3D-Struktur 97/105 Der exakte Zusammenhang ist allerdings sehr komplex, weswegen man einen Datenbankvergleiche durchführt. Dazu verwendet man bei Peptiden am besten 15 unterschiedliche Werte für die chemische Verschiebung: Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Bestimmung der 3D-Struktur 98/105 Die 15 Werte werden mit einer Datenbank für chemische Verschiebung von Proteinen, deren Struktur sehr gut bekannt ist, verglichen. Findet man einen vergleichbaren Satz an chemischen Verschiebungen kann man die phi und psi-Winkel übertragen Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Bestimmung der 3D-Struktur 99/105 Die gewünschte Struktur erhält man nun, indem man die Peptidkette so anordnet, dass alle durch die Experimente erhaltenen Vorgaben gleichzeitig erfüllt sind. In Anbetracht der vielen Freiheitsgrade ist das nur mit der Hilfe eines Computers möglich. Dabei wird im allgemeinen so vorgegangen, dass eine MolekulardynamikSimulation durchgeführt wird und die experimentellen Parameter als Randbedingungen zum Kraftfeld hinzugefügt werden Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Bestimmung der 3D-Struktur 100/105 Elemente eine Kraftfeldes Abstände Tetraederwinkel Dihedralwinkel Coulombwechselwirkung Lennard-Jones Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Bestimmung der 3D-Struktur 101/105 Zu den „chemischen“Elemente eines Kraftfeldes kommen noch die experimentellen hinzu, mit entsprechender Gewichtung Vchem = VB + VW + VD + VE + VC + VLJ Vparam = VNOE + VJ + Vshift V = Vchem + wparam*Vparam Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Bestimmung der 3D-Struktur 102/105 Energie (arb.) Das experimentelle Potential für Abstände aus NOES wird so eingeführt Abstand mit Fehlergrenze Abstand (100 pm) Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR Peptide: Bestimmung der 3D-Struktur 103/105 Am Ende steht dann die dreidimensionale Struktur des Peptides Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 104/105 Zusammenfassung Was haben wir uns heute angeschaut: Was sind Peptide DQF-COSY und TOCSY, Spinsysteme NOE, NOESY, ROESY Sequenzspezifische Zuordnung Bestimmung der 3D-Struktur Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR 105/105 That‘s it for today Nächstes Mal: Heteronukleare NMR an Peptiden Vorlesung „Mehrdimensionale NMR-SpektroskopieGrundlagen und Anwendungen in der Strukturaufklärung" Peter Schmieder AG NMR
