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otw^ \m^<~ls~ Diss. ETH No. 8804 Evolutionary Guidance as a Tool in Organic Chemistry A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZÜRICH for the degree of Doctor of Natural Sciences presented by Rudolf Konrad Allemann Dipl. born Chem. ETH April 29,1960 Citizen of Welschenrohr accepted on the recommendation of Prof. Dr. Steven A. Prof. Dr. Albert (SO) Benner, examiner Eschenmoser, co-examiner ADAG Administration & Druck AG Zürich 1989 170 Summary 8: Drosophila melanogaster is known with stereochemistry opposite a from A mammals. 'stereochemical from Drosophila. Three isocitrate dehydrogenase, hydrogen from with results, together that the engineering decarboxylases synthesized 14 a on and with by helical strueture cosolvent. of the as that peptide. catalysis The and primary of peptide of is synthesized using its the pH is group step in the increased of kcat of 0.39 min"l and tertiary a Based way strueture. as a on to The phase methodology proposed tertiary the for other the of 5% the while as The a the of an unusually The the The of the formation catalytic trifluoroethanol. This conformation alpha-helical K\l of 8.8 these data maximize the strueture be is of by ART-OAD follows Michaelis- altered and was to side. explained by be can for natural alpha-helix, consequence which by proven the on mM pancreatic Polypeptides two known. of catalyst addition result capable of 2D-NMR-spectroscopy. side necessary the is of trifluoroethanol a Substrate the conformer of ART-OAD. of oxaloacetate of and catalyzed decarboxylation. by the indeed are as functional a Solution aqueous efficient helical the amino sequences solid neutral These peptide (ART-OAD) protrude addition an pro-R NAD(P)H. from beta-ketoacids of The one alanines) by the the of enzymes. CD- on lysine residues, in altered in such was with a of them one changing agreement is at of the decarboxylation The Menten kinetics, without first of ART-OAD is evidence strueture one of the form base efficiency the oxaloacetate positive charges of unprotonated Schiffs stabilized in strueture and (leucines synthetic Polypeptide pKa of 7.25 for proximity the be can This decarboxylation low residues hydrophobic of designed. was Only hydrophilic residues (lysines) protrude only transfer that evolution concluded combination a dehydrogenases potential of redox decarboxylation its and the is and yeast glycerol-3-phosphate behavior of the support amphiphilic alpha-helix It Polypeptide residue the from dehydrogenase, easily be explained by can the of details for (malate pro-S hydrogen the reduce. to details solid a of transfer dehydrogenase (glucose-6-phosphate enzymes dehydrogenase, evolved constructed was examined other alcohol an dehydrogenases alcohol enzyme) catalyze stereoselectivity known on profile' malic contain to the enzymes Three the subtle even Based an has enzyme of published data, correlates that and alcohol dehydrogenase) catalyze model of the NAD(P)H. dehydrogenase, that crystal number of mutations peptide (31 which determined. the primary sequence of the characterized. in were and a amino CD data collagen acids) were like was in helix, 171 where every forms third residue non-covalent a is Four angiogenin, stranded prepared 53 to by RNase in expressed had data E. RNase ribosomal short inserting A but not two replaced that had mutants of hydrolysis UpA The two of in Orders of be and vitro magnitude translation structurally strategy proteins. was for the compared increased Substrates separated from the of work for as leads RNA that processes 74 small characteristic The capability to to vitro 11%. UpA through with with is This catalytic demonstrates activity 49 led the to However, markedly as that different by nearly an the RNAses against 116 respect decreased of digestive were residues folding to while its activity characteristic increased both bovine proteins 112 and UpA, as into which due human vessels such translation. protein of RNase A, by in and RNase A hydrolysis to 24 mutant a The probably in of blood angiogenin that enzyme inhibitor catalytic can be ribosomal RNA angiogenin. presented have the inhibit to symetrical. Substrates mutant through properties comparable the The peptide determined UpA, and as growth techniques. to The as digestive a RNA reconstituted 15 helix. is dimer such human characterized. not specific activity activity against of Segments and could replacement of residues 63 properties. the the small using moleeular biological coli, purified, been that induees A RNA Problems. Replacement of the amino acids to that suggest alpha an physiological pH including dinucleotides RNA homologue of a effectively hydrolyzes pancreatic onto at hybrids between bovine pancreatic RNase A, hydrolyzes Single were packed Solution aqueous NMR by gel filtration. Preliminary is proline, a in dimer in this thesis engineered proteins development of shows for hypotheses that billions that studying of relate years the is strueture evolutionary a powerful and function of 172 Zusammenfassung Es eine der ist Stereochemie Ein Säugetiere. wurde dass bekannt, andere Wasserstoffes der Malic und Dehydrogenase Alkohol-Dehydrogenase Enzym) der die phosphat-Dehydrogenase Ein Wasserstofftransfers mit dem Transfer Substrat, des Modell, Enzyme Glycerin-3- und NAD(P)H von des Stereospezifität die natürlichen des Redoxpotential Isocitrat- pro-R die während Wasserstoffes pro-S welchem des Substrates Enzymes korreliert wird, kann sowohl diese Resultate als auch andere Daten der Literatur in feinste Details einfacher im Verhalten Ausgehend katalysierten langes Weise den von der Polypeptide entworfen NMR-spektroskopische und Details der einem an Untersuchungen Aminosäuren enthält. Trifluorethanol Aminogruppe eines Aminogruppen des damit, dass den die Peptides ist. Die Michaelis-Menten 0.38 min-1 helikale werden. ist Lysine einer Struktur ART-OAD nahe Spezies Schiffschen Effekt wirklich Die eine von in welcher durch eines ein welche der Base. für sogar Aminosäuren der Leucine) für die 7.25 der extrem Werte für geladenen unprotonierte Zugabe von Form 5% ist in Konformation un0" der Decarboxylierung vergrössert, kcat tiefe helikalen Katalyse der helikalen nur und Dieser der die in von von der Die die Seite eine positiv in sich (ART-OAD) Katalysator pH-Wert. und CD- Einklang des Oxalessigsäure durch ART-OAD folgt gemessenen aus Enzyme 14 (Alanine Zugabe effizienter ART-OAD Folge die -Wertes pKs befinden. Dass von ein Peptide hydrophobe neutralem beeinander Decarboxylierung Kinetik. bei in kann Folge erklärbar, katalytischen und 8.8 mM. nur dieses gegenseitige Beeinflussung reaktive Katalyse Seite natürliche wurde dass zeigten, Als Oxalessigsäure die Peptides die notwendigen Bildung Trifluoethanol andere Lysinreste der ist Aminogruppe Die der von durch ist Konformation die stabilisiert Decarboxylierung pKs-Wert und (Lysine) Evolution die Festkörper synthetisiert. wässriger Lösung eine amphiphile Helix bildet, hydrophile durch beta-Ketosäuren von dass hat. Enzyme optimiert bekannten Decarboxylierung zeigt sich, Es erklären. und Drosophila aus des Alkohol-Dehydrogenase in Hefe der (Malat-Dehydrogenase, den katalysieren Uebertragung funktionelles Dehydrogenasen Enzyme NAD(P)H auf ihr jeweiliges von Drosophila melanogaster aus Alkohol-Dehydrogenasen Profil' untersuchten Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase, katalysieren. die als 'stereochemisches Drei bestimmt. die aufweist ^M betragen einer 173 Ausgehend von und von Polypeptiden Aminosäuren sind mit und eine in aufweist, welcher jede stehen. Das die Peptide des Es wurden vier des welches effizienter ein kleinen jedoch von Stücke eines Angiogenin ersetzt. Der für RNase Die 15 Proteine 24 Hydrolyse ein von und UpA als RNase durch die Hybrid, A vergleichbar. entprechenden welches aufweist. für die Diese Hybrid welchem in Wurden strukturell welche der Die für Prozesse, welche verändert und sprechende Verbindung die dabei Strategie zwischen zur der um in ist, der zeigen, als 53 als und wurden, ersetzt Ersatz Katalysatoren RNase A der - 63-74 der in Aktivität der war RNase A resultierte ersetzt, ist Angiogenin - 1.6% der Aktivität bessere RNase von Inhibitor der in ein A vitro die für RNase A kleinen Aktivität dass Proteine und kurze aus RNS gegenüber Substraten ribosomaler RNS, trennen. Eigenschaften Struktur nicht wurden Der Translation Aminosäuren nur bis zum A Hybriden, welche ähnliche vitro gegenüber zu Formulierung 49 werden. Angiogenin 11% katalytischen Arbeit Struktur ihre zu Aktivität demzufolge möglich, erhöhten dieser UpA RNS, Dazu ein - und exprimiert, gereinigt Aminosäuren die aus Aktivität Angiogenin Resultate von Coli Translation jedoch jedoch ein katalytische von typisch der wie RNase zu entsprechenden Segmente führte Ihre Aminosäuren Translation als RNase A. Es ist charakteristische 116 ein - ribosomaler von rekonstituiert A. wie Rindes Blutgefässen induziert, E. die nicht vitro Hydrolye ist in Inhibitoren effizienterer Inhibitor der Angiogenin UpA ist, hergestellt. bis Kontakt engem der Pankreas des aus wie RNase alpha-Helix Kollagen NMR-Messungen von Hydrolyse wurden 112 wie Grund A von die CD-Daten sein. zu der durch wegen und Eigenschaften aufweisen von in Mutant, bis A eine wie in ist, Die bevorzugt einzelsträngige RNS, Wachstum Katalysator Faltungsproblemen Aminosäuren das welcher maximal 31 wässriger Lösung (pH=7) Auf menschlichem RNS-molekülen Genes charakterisiert. welches in Prolin in symetrisch und - charakterisiert. und ein Dimere konnte. Mutationen entworfene so Sekundärstruktur zwischen RNase Hybride Verdauungstraktes, homologes Protein, konnte werden Dimeren Beispiel UpA, hydrolysiert welches bildet ihre wurden der Das Einklang, eine Aminosäure dritte gezeigt Struktur die Helix, antiparallele Gel-Filtration scheint Struktur vorgeschlagenen dazu Anzahl die Tertiärstruktur. in pankreatischen beiden der synthetisiert wurde lange Peptide der zueinander Enzym der zwei von eines dass verändert, gleichzeitiger Erhaltung bei durch Kristallstruktur derart Aminosäuresequenzen war Primärstrukturen den der das während optimiert von der Studium Milliarden haben, Hypothesen Funktion der ist, von eine evolutionären von Jahren erfolgsver¬ welche Proteinen eine herstellen.
