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Pharmakokinetik von „stealth Liposomen“ in Kombination
mit einer therapeutischen Plasmapherese an
tumortragenden Ratten.
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Fakultät für Biologie und der Fakultät für Medizin
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
vorgelegt von
Romeo Ngoune
geboren in Douala (Kamerun)
Freiburg im Breisgau
Juni/2015
Die vorliegende Arbeit wurde von 2011 bis 2015 am Institut für klinische Chemie und
Laboratoriumsmedizin des Klinikums der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
unter Betreuung von Dr. G. Pütz und Prof. K. Winkler angefertigt.
Dekan der Fakultät für Biologie: Prof. Dr. Wolfgang Driever
Dekanin der Medizinischen Fakultät: Prof. Dr. Kerstin Krieglstein
Promotionsvorsitzender: Prof. Dr. Stefan Rotter
Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. Karl Winkler
Fakultätsverantworlicher Betreuer: Prof. Dr. Thomas Brabletz
Referent: Prof. Dr. Thomas Brabletz
Koreferent: Prof. Dr. Michael Nassal
Drittprüfer: Prof. Dr. Georg Häcker
Datum der mündlichen Prüfung: 23.09.2015
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung
1.1
Die Apherese
1
1.2
1.2.1
1.2.2
Liposomen
PEGylierung der Liposomen
Liposomen in vivo
2
5
6
1.3
Das Passive Targeting und der enhanced permeability
and retention
8
1.4
Krebs (Karzinom)
10
1.5
Chemotherapie
12
1.6
1.6.1
1.6.2
PEGyliertes liposomales Doxorubicin
Häufige Nebenwirkungen von Doxorubicin und PLD
Nebenwirkungen Bekämpfung
13
14
15
1.7
Controlled Application and Removal Liposomal
Therapeutics (CARL)
15
1.8
BQ-123 ein Endothelin Rezeptor Antagonist
17
1.9
Angiotensin II (AT-II)
18
1.10
In vivo Bildgebung System (Fluoreszenz- und Biolumineszenzimaging) 20
1.11
Ziele der Arbeit
2
Materialien und Methoden
2.1
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.1.4
2.1.5
Materialien
Geräte
Verbrauchschemikalien
Substanzen für die Herstellung von Homogenisierungspuffer
Lipide
Farbstoffe
24
25
26
27
27
28
2.2
2.2.1
2.2.1.1
2.2.1.2
2.2.1.3
2.2.1.4
2.2.1.5
2.2.1.6
Methoden
Zellen
Charakteristika der Zelllinien
Zellkulturen
Passagieren und ernten der Zellen
Transfektion
Bestimmung der Transfektionseffizienz
Zellzählung mit Neubauer-Zählkammer und Trypanblau
28
28
29
29
29
30
30
2.2.2
Versuchstiere
31
22
I
Inhaltsverzeichnis
2.2.2.1
2.2.2.2
2.2.2.3
2.2.2.4
Kriterien zur vorzeitigen Tötung von tumortragenden Ratten
Anästhesie
Einimpfung der Ratten mit MAT B III-Zellen
Vermessen des Tumorvolumens
31
32
32
32
2.2.3
2.2.3.1
2.2.3.2
2.2.3.3
2.2.3.4
Die diskontinuierliche Plasmapherese
Vorbereitung des Tieroperationsraums
Blutentnahme und intravenöse Applikation
Durchführung der Plasmapherese
Rückspülung der Filter
32
32
33
34
35
2.2.4
2.2.4.1
2.2.4.2
2.2.4.3
2.2.4.4
Liposomenherstellung
Herstellung am Rotationsverdampfer
Liposomenextrusion
Bestimmung der Phospholipidkonzentration
Eichgerade zur Ermittlung des Umrechnungsfaktors
für die Bestimmung der Konzentration der Liposomen
Bestimmung der Liposomengröße mittels
Photonenkorrelationsspektroskopie
35
35
36
36
Messung der Proben
Lumineszenzspektrometrie
Messung der Dox- Konzentration nach Fällung
Methyl tertiary-butyl ether–Methode (MTBE): LipidextraktionsMethoden zur Messung der Fluoreszenz der Liposomen im Plasma
38
38
39
2.2.6
2.2.6.1
2.2.6.2
2.2.6.3
In vivo Imaging
Versuchsaufbau und Vorbereitungen
Durchführung der Aufnahmen
Bildbearbeitung und Quantifizierung
40
40
40
41
2.2.7
Gel-Permeations-Chromatographie (GPC)
42
2.2.8
2.2.8.1
Messung des Blutdruckes
Steigerung der Liposomen-Akkumulation in Tumor durch AT-II:
Non-Invasive Messung des Blutdruckes bei Ratten
43
2.2.9
Applikation von BQ-123
44
2.2.10
Schwimmen der Ratten
44
2.2.11
Statistik
45
3.
Ergebnisse
3.1
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.3.1
Liposomen
Wahl der Liposomenzusammensetzung und Herstellung
Bestimmung der Liposomengröße und Konzentration
Liposomen in vivo
Stabilität des Farbstoffes im Liposomenmembran mit der
Gel-Permeations-Chromatographie (GPC)
2.2.4.5
2.2.5
2.2.5.1
2.2.5.1.1
2.2.5.1.2
37
38
39
43
46
46
46
47
47
II
Inhaltsverzeichnis
3.2
Plasmahalbwertszeit (HWZ)
3.3
Bestimmung der Zeitpunktes der maximalen Akkumulation
der Liposomen inTumoren
Wahl des Liposomenfarbstoffs für die IVIS-Aufnahmen
Anreicherungskinetik der Liposomen
Zeitpunkt der maximalen Akkumulation
Verlauf der Fluoreszenz in Haut, Ohren, Pfoten und Tumor
Akkumulation der Liposomen in Haut, Ohren, Pfoten
und Tumor
3.3.1
3.3.2
3.3.3
3.3.4
3.3.5
51
53
53
55
57
61
62
3.4
3.4.1
3.4.2
3.4.3
Die Diskontinuierliche Plasmapherese
Rückhaltevermögen des Liposomenfilters
Effizienz der Plasmapherese mit leeren Liposomen
Effizienz der Plasmapherese mit PLD
64
64
66
67
3.5
3.5.1
3.5.2
3.5.3
Anreicherung und Plasmapherese
Einfluss einer Plasmapherese auf die Verteilung von Liposomen
Mittelwerte der Akkumulationskurven
Berechnung des Plasmapherese-Einflusses
68
69
73
79
3.6
Therapieversuche
83
3.6.1
Plasmahalbwertszeit von PLD
84
3.6.2
Therapie mit PLD
86
3.6.3
IVIS-Aufnahme der Luziferaseexpression bei den tumortragenden Ratten
nach einer PLD-Therapie in Kombination mit einer Plasmapherese
86
3.6.4
Therapie mit 4,5 mg PLD/kg Körpergewicht und Plasmapherese
nach 24 h
Rattengewicht
Tumorvolumen
Tumor-Luziferaseexpression
89
89
91
92
Therapie mit 9 mg PLD/kg KGW und Plasmapherese
nach 24, 36 und 48 h
Rattengewicht
Tumorvolumen
Tumor-Luziferaseexpression
93
93
95
97
3.6.4.1
3.6.4.2
3.6.4.3
3.6.5
3.6.5.1
3.6.5.2
3.6.5.3
3.6.6
3.6.6.1
3.6.6.2
3.6.6.3
3.7
Therapie mit 14 mg PLD/kg Körpergewicht und Plasmapherese
nach 36 h
Rattengewicht
Tumorvolumen
Tumor-Luziferaseexpression96
Nebenwirkungen der tumortragenden Ratten nach
PLD-Therapie in Kombination mit der Plasmapherese
98
98
100
102
III
Inhaltsverzeichnis
3.7.1
3.7.2
3.7.3
3.7.4
3.7.5
Hautrötungen
Verkrustungen in Pfoten, Mund und Augenbereich (nach circa 14 Tagen)
Nässe im Genitalbereich
Langfristige Nebenwirkungen
Einfluss von Plasmapheresebehandlung auf die auftretenden
Nebenwirkungen nach Behandlung mit PLD
102
105
108
109
3.8
3.8.1
3.8.2
3.8.3
Blutanalyse
Blutparameter vor Therapie
Blutparameter 6 Tage nach der Therapie
Blutparameter 15 Tage nach der Therapie
112
113
114
115
3.9
3.9.1
3.9.1.1
3.9.1.2
3.9.1.2.1
3.9.1.2.2
Verkürzung der Anreicherungszeit
Verkürzung der Anreicherungszeit durch AT-II
Blutdruckmessung nach AT-II Applikation
Einfluss von AT-II auf den EPR-Effekt
IVIS-Aufnahmen der tumortragenden Ratten nach AT-II Applikation
Tumoranreicherung nach Applikation von AT-II
A- AT-II-Gabe nach 4 h
B- AT-II-Gabe nach 8 h
C- AT-II-Gabe nach 24 h
117
117
117
119
119
121
121
123
125
3.9.2
3.9.2.1
Einfluss von BQ-123 auf die Anreicherung von Liposomenin Tumor
IVIS- Aufnahmen der tumortragenden Ratten vor und nach BQ-123
Applikation
Einfluss von BQ-123 auf die Anreicherung von Liposomen im Tumor
und in der Haut
127
3.9.3
3.9.3.1
3.9.3.2
Steigerung der Liposomenmenge im Tumor durch Schwimmen
Aufnahmen der tumortragenden Ratten vor und nach dem Schwimmen
Steigerung der Fluoreszenzintensität im Tumor durch Schwimmen
132
132
133
4
Diskussion
4.1
4.1.1
4.1.2
4.1.3
Liposomen
Wahl der Liposomen und Bestimmung der Liposomengröße
Liposomen in vivo
Plasmahalbwertszeit der Liposomen
136
136
137
139
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
Zeitpunkt der maximalen Anreicherung der Liposomen im Tumor
Wahl des Farbstoffes
Anreicherungskinetik der Liposomen
Zeitpunkt der maximalen Anreicherung der Liposomen in Tumor
140
140
141
142
4.3
Die diskontinuierliche Plasmapherese
144
4.4
Anreicherung und Plasmapherese
147
4.5
4.5.1
4.5.2
4.5.3
Therapieversuche
Plasmahalbwertszeit von PLD
Behandlung mit 4,5 mg/kg KGW PLD
Behandlung mit 9 mg/kg KGW PLD
149
150
150
151
3.9.2.2
109
128
129
IV
Inhaltsverzeichnis
4.5.4
4.6
Behandlung mit 14 mg/kg KGW PLD
Implikationen der Ergebnisse aus den Tierversuchen für die weitere
Entwicklung des CARL-Projektes
153
158
158
4.7.3
Verkürzung des Zeitpunkts der maximalen Anreicherung
Einfluss von AT-II auf EPR-Effekt
Steigerung der Liposomen Anreicherung nach Applikation
von BQ-123
Steigerung der Liposomen Anreicherung nach körperlichen Aktivität
4.8
Optical Imaging System: Vorteile und Nachteile
163
5
Zusammenfassung und Ausblick
165
6
Summary and Outlook
168
7
Literaturverzeichnis
171
8
Anhang
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
Abkürzungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Kongreßbeiträge mit Posterpräsentation
Danksagung
4.7
4.7.1
4.7.2
155
161
163
184
188
191
192
193
V
Einleitung
1. Einleitung
1.1 Die Apherese
Der Begriff Apherese leitet sich ursprünglich von dem griechischen Wort "aphairesis" ab und
bedeutet "entfernen, wegnehmen, absondern, trennen". Die Apherese in ihrer einfachsten
Form wurde schon in der Antike in der Form eines Aderlass praktiziert. Beim Aderlass wurde
dem Patienten eine teilweise erhebliche Menge Blut entnommen. Ab 3000 Jahre vor Christus
wurde Aderlass nur mit strenger Indikation ausgeübt. Der Durchbruch der Apherese gelang
im 19. Jahrhundert. Im Jahr 1909 führte Fleig der ersten erfolgreichen Plasmapherese bei
Sepsis Patienten durch (Tobias et al., 1992; Fleig et al., 1909). Das Blut wurde kontrolliert
entfernt und ersetzt. Später konnten Abel und seine Mitarbeiter erfolgreich die Plasmapherese
bei den Tieren durchführen (Abel et al., 1914). Im Jahr 1967 gelang De Gennes et al., die
erste Plasmapherese bei Hyperlipoproteinämie (De Gennes et al., 1967). Weitere klinische
Verbreitungen, fand die Plasmapherese dann mit dem Fortschritt der technischen
Entwicklung. Meilensteinen waren die geschlossene Zellzentrifuge (Judson et al., 1968), die
Kaskadenfiltration (Agishi et al., 1980), die Immunoadsorption (Stoffel et al., 1981) und die
Heparin-induzierte extrakorporale low density lipoprotein (LDL)-Präzipitation (HELP)
(Wieland und Seidel, 1983). Seitdem haben sich die verschiedenen Apheresemethoden
weiterentwickelt. Die von Agishi entwickelte Kaskadenfiltration wird in der CARL-Studie
beispielweise angewendet.
Als Apherese bezeichnet man heutzutage Behandlungsverfahren, deren Therapieeffekte auf
der extrakorporalen Elimination pathogener Proteine, proteingebundener pathogener
Substanzen oder pathogener Zellen des Blutes basiert. Mit Hilfe von Absorption, Filtration
und Präzipitation werden pathogene Proteine, Lipide oder pathogene Zellen des Blutes aus
dem Blutkreislauf entfernt. Plasmapherese ist der Vorläufer der heutigen Apherese. Bei der
ursprünglichen Plasmapherese wurde das abgetrennte Plasma verworfen und parallel dazu
durch eine gleiche Menge Plasmaersatzmittel oder Plasma, welches aus dem Blut von
gesunden Spendern gewonnen wurde, ersetzt. Mit den neuen Methoden wird das Blut oder
das Plasma von den pathogenen Stoffen entfernt und dem Patienten refundiert. Diese neue
Plasmapheresemethode hat sich mit der Zeit etabliert.
Je nach Substanz, die entfernt werden soll, unterscheidet man: LDL-Apherese,
Immunapherese; Toxinapherese. Während die Toxinapherese in der Regel nur im
Krankenhaus bei lebensbedrohenden und sehr komplexen Krankheitszuständen zum Einsatz
kommt, werden die anderen Verfahren auch in der ambulanten Praxis durchgeführt. Jährlich
1
Einleitung
werden weltweit ca. 250.000 bis 300.000 Behandlungen mit der therapeutischen Apherese
durchgeführt (www.braun.de).
Haupteinsatzgebiete der therapeutische Plasmapherese sind die Therapie von:
•
schweren Fettstoffwechselerkrankungen (LDL-Apherese) (Thompson et al., 1975)
Die LDL-Apherese wird bei schweren Formen der Hypercholesterinämie eingesetzt. Dabei
werden LDL-Cholesterin und andere Risikofaktoren der Arteriosklerose entfernt (Winters et
al., 2011).
•
Störungen der Blut- bzw. Mikrozirkulation
Beispielweise
bei
thrombotisch-thrombozytopenischer
Purpura
(TTP),
hämolytisch-
urämischem Syndrom (HUS), Hörsturz oder altersbedingter Augen-Erkrankung, ischämischer
diabetischer Fuß-Syndrom (Nand et al., 1990). Die Blutfließeigenschaften werden verbessern,
indem man Fibrinogen und andere rheologisch relevante Blutbestandteile aus dem Blut filtert
(Tan und Hart, 2005).
•
Autoimmunerkrankungen(Immunapherese)
Die Apherese kann möglicherweise auch bei folgenden Erkrankungen zur angewendet
werden:
Darmerkrankungen
Muskelschwäche
(Rheumatoide
(Colitis
(Myasthenia
Arthritis)
gravis),
und
bei
ulcerosa),
chronisch
Herzmuskelerkrankungen,
entzündliche
Unterbrechung
der
schwere
Systemerkrankungen
Gerinnungskaskade
(Hemmkörperhämophilie), Toxinelimination (Dialyse), akute Vergiftungen (biologische und
chemische Toxine), Leberversagen durch Stoffwechseltoxine, Sepsis (Exo- und Endotoxine).
Dabei werden Toxine aus dem Blut der Patienten gefiltert.
Die Nachteile der therapeutische Plasmapherese waren bis jetzt die Unselektivität, das Risiko
einer Infektion, und der hohe Verfahrens- und Gerätepreis. Durch schnelle und gute
Entwicklung wurden die Verfahren immer sicherer, selektiver, effektiver und klinisch
verträglicher (Tan et Hart, 2005).
1.2 Liposomen
Liposomen sind kugelförmige Hohlkörperchen. Sie bestehen aus einer Lipiddoppelschicht.
Sie können in ihrem Innenraum hydrophile Substanzen aufnehmen, in ihrer Doppelmembran
lipophile Stoffe (Gregoriadis und Ryman, 1971). Liposomen sind leistungsfähige
Trägersysteme für Wirkstoffe (Akbarzadeh et al., 2013). Die Struktur der Liposomen ähnelt
2
Einleitung
stark der einer Zelldoppelmembran. Liposomen wurden zum ersten Mal von Bangham
beschrieben als er an Zellmembranen forschte (Bangham et al., 1965). Liposomen bestehen
hauptsächlich aus Phospholipiden und Cholesterol. Phospholipide als Hauptkomponenten der
natürlich vorkommenden Doppelschichten sind amphiphile Moleküle, d.h. sie bestehen aus
einem zum Inneren der Doppelmembran gerichteten nichtpolaren, hydrophoben Teil, und aus
einem polaren, hydrophilen Teil, der zum äußeren der Doppelmembran gerichtet ist.
Die hydrophile Kopfgruppe enthält Phosphat. Dieses Phosphat kann als Phosphordiester mit
der primären Hydroxylgruppe des Glycerols sowie mit einem hydrophilen Molekül, wie z.B.
Cholin, Serin, Ethanolamin oder Glycerol verestert werden. Der lipophile Rest besteht aus
zwei Fettsäuren, die mit den restlichen Hydroxylgruppen des Glycerols verestert sind [Abb. 1]
Abbildung 1: Phospholipid in verschiedenen Darstellungen (Quelle: Pixgood.com)
Phospholipide bilden spontan Liposomen in Wasser, dafür müssen der hydrophile und der
hydrophobe Molekülteile fast die gleichen Querschnittsflächen besitzen [Abb. 2].
Natürliche Phospholipide werden hauptsachlich aus Eigelb oder Sojabohnen gewonnen. Die
Phospholipide enthalten hauptsächlich Phosphatidylcholine (PC), Phosphatidylethanolamine
(PE) und Phosphatidylserine (PS).
3
Einleitung
Abbildung 2: Liposome (Quelle: Enzyklopädie Britannica, Inc.)
Die physikalischen und chemischen Eigenschaften von Liposomen (Permeabilität,
Membranfluidität, Oberflächenladung, Größe, und Lamellarität) hängen stark von den
verwendeten Lipidbestandteilen der Membran und von der Herstellungsmethoden ab. Die
Dicke der Doppelschicht beträgt ungefähr 4 nm und kann sich auf 5 bis 10 nm vergrößern,
wenn sie außen beschichtet ist (Lasic, 1997. Buch)
Die Liposomen werden durch ihre strukturellen Eigenschaften (Größe und Lamellarität)
klassifiziert (Papahadjopoulos, et al., 1978). Man unterscheidet:
• Kleine unilamellare Vesikel (small unilamellar vesicles (SUV)) bestehen aus einer
Lipiddoppelschicht, deren Durchmesser < 50 nm liegt. Durch ihre geringe Größe weisen SUV
eine hohe Membranspannung auf.
• Große unilamellare Vesikel (large unilamellar vesicles (LUV)) besitzen ebenfalls eine
Lipiddoppelschicht. Sie haben einen Durchmesser > 50 nm. Sie sind im Vergleich zu den
SUV spannungsfrei, demzufolge lagerstabiler.
• Große multilamellare Vesikel (large multilamellar vesicles (LMV)) mit einem Durchmesser
von mehr als 0,5 µm. Sie bestehen aus mehreren Doppelschichten.
• Megagroße unilamellare Vesikel (giant unilamellar vesicles (GUV)) mit einem Durchmesser
von mehr als 1 µm, mit einer Doppelschicht.
4
Einleitung
1.2.1 PEGylierung der Liposomen
Durch die PEGylierung der Liposomen werden sie möglicherweise weniger effektiv vom
retikuloendothelialen System (RES) als konventionellen Liposomen erkannt (Allen und
Hansen, 1991; Allen et al., 1987).
Der genaue Mechanismus ist noch nicht eindeutig geklärt. Es wird aber vermutet, dass
Polyethylenglycol (PEG) sowohl die elektrostatische als auch hydrophobe Bindungsaffinität
mit Plasmaproteinen unterbindet (Lasic und Papahadjopoulos, 1995). Die Opsonisierung wird
erschwert (Woodle & Lasic, 1992; Lasic et al., 1991). Die Blutzirkulationszeit von
Liposomen im Plasma wird dadurch verbessert (Düzgünes und Nir, 1999). PEG wird als
polymerer sterischer Stabilisator verwendet. PEG wird über einen vernetzten Lipidanker auf
die Liposomenmembranoberfläche gebracht (Allen et al., 2002, 1991) [Abb. 3].
PEG als lineares Polyetherdiol besitzt folgenden Eigenschaften: Biokompatibilität,
Löslichkeit in wässrigen und organischen Medien (Powell, 1980, Papahadjopoulos, et al.,
1981), fehlende Toxizität, sehr geringe Immunogenität und Antigenität (Dreborg und
Akerblom, 1990), und eine gute Ausscheidungskinetik (Immordino et al., 2006; Yamaoka et
al., 1994). Durch diese zahlreiche Eigenschaften, werden PEG-Liposomen in einer Vielzahl
von Anwendungen in der Biomedizin verwendet. Darüber hinaus besitzen die Liposomen eine
Lipidmatrix mit geringer Permeabilität und ein wässriges Puffersystem im Innern, die
gemeinsam dafür sorgen, dass die eingekapselten Moleküle während der Zirkulationszeit in
den Liposomen eingeschlossen bleiben (Hong et al., 1999). Die Abbaurate des Wirkstoffs
wird dadurch verringert, so dass er länger im Blutkreislauf verbleibt (Gabizon et al., 2012,
2003, 2002).
5
Einleitung
Abbildung 3: Darstellung der Polymer Polyethylenglycol (PEG) auf der Liposomendoppelschicht
(Immordino et al., 2006).
1.2.2 Liposomen in vivo
Das Schicksal der Liposomen in vivo ist ein sehr kritischer Punkt der Liposomen und wird
seit langem intensiv stark debattiert. Folgende Faktoren beeinflussen das Verhalten der
Liposomen in vivo: die Größe, die Morphologie oder Art, die Ladung, die Rigidität der
Membran und die Art der Applikation (i.v., i.p., i.m., s.c.). Leber und Milz sind die zwei
Zielorte von Liposomen (Gregoriadis und Ryman, 1972). Liposomen folgen wie die meisten
Arzneistoffe dem LADME-Konzept (Liberation, Adsorption, Distribution (Verteilung),
Metabolismus und Elimination). Die Verteilung und die Absorption des eingekapselten
Wirkstoffs hängen stark von der Verteilung und Absorption von Liposomen ab (H. Schreier,
1982). Die Verweildauer der Liposomen im Plasma hängt von der Plasmazusammensetzung
ab. Serumproteine können an Liposomen adsorbiert werden, high density lipoproteine (HDL)
können unilamellare Liposomen umbauen und sie zur Leber transportieren (Immordino et al.,
2006; H. Schreier und M. Raeder-Schikorr, 1982). Der Einbau von Cholesterol schützt die
Liposomen vor der Interaktion mit HDL (Damen et al. 2005; Demel und De Kruyff, 1976).
Cholesterol ist ein wichtiger Bestandteil der Zellmembran und einer der Hauptbestandteile der
Liposomenmembran. Cholesterol führt durch seine Integration mit Phospholipiden zu einer
verminderten Membranpermeabilität und erhöht somit die Stabilität der Liposomen (Gabizon
6
Einleitung
et al., 1988; Demel und De Kruyff, 1976). Die eingekapselten Wirkstoffe bleiben länger in
den Liposomen eingeschlossen (Hosta-Rigau et al., 2012).
A
B
Abbildung 4: Die Verweildauer des Liposomen-Wirkstoffes im Plasma. (überarbeitet aus Gabizon et al.,
1993).
Die Auswahl der Phospholipide spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der
hohen Plasmakonzentrationen von Liposomen [Abb. 4 A]. Die in HSPC-Liposomen
eingekapselten Wirkstoffe bleiben länger eingekapselt im Plasma verglichen mit Wirkstoffe,
die in Ei-PC-Liposomen eingekapselt worden sind [Abb. 4 B] (Senior, 1987; Gregoriadis und
Senior, 1980). Dies ist vermutlich aufgrund der verringerten Affinität dieser Liposomen mit
7
Einleitung
den Serum Opsoninen. Weitere Gründe können Leakage oder Abbau der beladenen
Liposomen sein.
Auch wichtig für das Verhalten der Liposomen in vivo ist die Phasenübergangstemperatur
(Tm) der Phospholipide, diese muss in der Regel deutlich über 37° C sein. Die Tm der
Liposomen ist sowohl von der Kopfgruppe als auch von der Kettenlänge der Fettsäurereste
und deren Sättigungsgrad abhängig. Die Tm von HSPC zum Beispiel liegt bei 52° C
(Horowitz et al., 1992). Sie liegt somit ~ 15° C höher als 37°C. HSPC-Liposomen haben
somit eine erheblich steifere Membrandoppelschicht, die die Opsonisierung erschwert, als EiPC-Liposomen mit einer Tm von 37° C. HSPC-Liposomen sind in vivo entsprechend stabiler
als die Ei-PC-Liposomen (Vincent et al., 1991).
Die Verweildauer der Liposomen in vivo hängt auch von der Austrittsgeschwindigkeit der
eingekapselten Stoffe ab. Die Größe von Liposomen spielt auch eine enorme Rolle.
Liposomen, die zum Beispiel durch einen 400 nm-Filter extrudiert wurden, werden 7,5-mal so
schnell im Plasma entfernt als Liposomen, die durch einen 200-nm-Filter extrudiert wurden
(Gabizon et al., 1988). Diese ihrerseits werden 5-mal so schnell als kleinen unilamellaren
Vesikeln entfernt (Allen und Everest, 2003; Senior et al., 1985).
1.3 Das Passive Targeting und der enhanced permeability and retention
effect
Der enhanced permeability and retention (EPR) – Effekt, erstmals von Hiroshi Maeda et al.,
1986 beschrieben, bewirkt, dass sich Partikel < 500 nm in soliden Tumoren anreichern. Der
EPR- Effekt ist ein Grund, weshalb sich Liposomen für die Bekämpfung solider Tumoren
besonders eignen. Die Liposomen können hierbei als Träger für kleine Moleküle, z.B.
Arzneistoffe wie Doxorubicin, dienen. Schnell wachsende Tumore bilden beim Wachsen
einen Cluster und brauchen viel Sauerstoff. Sauerstoffmangel führt zu einer Stabilisierung des
Transkriptionsfaktors hypoxia inducing factor (HIF), welcher seinerseits den vascular
endothelial growth factor (VEGF) überaktiviert (Drummond et al., 1999). Um den
Sauerstoffgehalt in den Tumoren zu decken, wachsen die Blutgefäße schnell, so dass sie nicht
vollständig mit Epithelzellen ausgekleidet werden. Tumorblutgefäße sind meist unregelmäßig
in der Form, erweitert und undicht oder defekt. Die Endothelzellen sind schlecht ausgerichtet
oder unorganisiert mit großen Fenstern (Iyer et al., 2006). Durch das fenestrierte Endothel,
gelangen die Liposomen ins Gewebe [Abb. 5], (Haag and Kratz, 2006). Dieser Vorgang wird
Extravasation genannt. Die Liposomen werden dann im perivaskulären Raum aufgelöst und
8
Einleitung
setzen den eingeschlossenen Wirkstoff frei oder sie werden durch Endozytose aufgenommen
(Düzgünes und Nir, 1999).
Durch ein fehlendes adäquates Lymphsystem im Tumorgewebe werden die eingedrungenen
Liposomen nicht wieder heraustransportiert. Der passive EPR-Effekt führt zu einer 50 bis 70fache Anreicherung der Liposomen im Tumorgewebe im Vergleich zu normalen Geweben
(Maeda et al., 2000; 2001).
Tumorgröße und Wachstum spielen eine entscheidende Rolle bei der Verteilung von
Liposomen. Eine gute Anreicherung findet sich jedoch nicht in allen Tumoren. In kleinen
Tumoren im Bereich großer Blutgefäße akkumulieren nur wenige Liposomen, da die kleinen
Tumoren ungehindert von den großen stabilen Gefäßen versorgt werden. Bei großen schnell
wachsenden Tumoren ist die Liposomenanreicherung in der Kernregion gering, weil die
Kernregionen nur unzureichend von Blutgefäßen versorgt wird (Ekdawi et al., 2015). Das
Wachstum kann nicht mehr kontrolliert werden, die Liposomen reichern sich nur am Rand der
Tumoren an und erreichen nicht mehr das Zentrum der Tumore (Drummond et al., 1999).
Abbildung 5: EPR-Effekt.
Schematische Darstellung der anatomischen und physiologischen Charakteristika von Normal- und
Tumorgewebe in Bezug auf ihre vaskuläre Permeabilität und die Retention von kleinen und großen Molekülen
(Haag und Kratz, 2006).
9
Einleitung
1.4 Krebs (Karzinom)
Als Krebs bezeichnet man krankhafte Veränderungen, bei welchen gesunde Zellen in
Krebszellen umgewandelt werden. Fast alle Krebsarten bilden Tumore.
Man unterscheidet zwischen krebsartigen bzw. bösartigen (maligne) und gutartigen (benigne)
Tumoren. Die malignen Neubildungen bestehen aus entarteten Zellen, die anders aussehen als
"normale" Zellen. Diese Zellen teilen sich schneller und zerstören dabei das gesunde Gewebe.
Sie wandern von ihrem Ursprungsort aus über das Blut oder das Gefäßsystem (Lymphsystem)
in andere Organe und vermehren sich dort als Tochtergeschwülste (Metastasen) weiter.
Mammakarzinom ist sowohl in Deutschland als auch in Europa die häufigste
Krebsneuerkrankung bei Frauen (Curado, 2011; DeSantis et al., 2011). Ungefähr 31,3 Prozent
aller Krebserkrankungen bei Frauen entfallen auf Brustkrebs [Abb. 6]. Im Jahr 2010
erkrankten laut Robert-Koch- Institut ungefähr 70.000 Frauen in Deutschland an Brustkrebs.
Pro Jahr sterben circa 17.000 Frauen an den Folgen einer Brustkrebserkrankung laut RobertKoch-Institut. Das mittlere Erkrankungsalter an Brustkrebs liegt bei 64 Jahren. Das sind sechs
Jahre unter dem durchschnittlichen Erkrankungsalter bei Krebs insgesamt. Während die Zahl
an Neuerkrankungen an Mammakarzinom seit 1980 weiter ansteigt, nimmt die Sterblichkeit
seit Mitte der 90-er Jahre leicht ab (rki.de).
Die wesentlichen Gründe für die hohe Sterblichkeitsrate sind sowohl die zu spät gestellten
Diagnosen als auch die eingeschränkten Möglichkeiten maligne Tumore zu behandeln. Die
eigentlichen Ursachen für die Brustkrebsentstehung sind unbekannt und individuell
abgestimmt. Sowohl endogene als auch exogene Faktoren konnten identifiziert werden.
Risikofaktoren für die Entstehung eines Mammakarzinoms sind weibliches Geschlecht, das
Alter (> 50) und familiäre Disposition. Treten Fälle von Brustkrebs vermehrt bei Verwandten
ersten Grades auf, so erhöht sich das Risiko an Brustkrebs zu erkranken. In 5 – 10% der Fälle
findet
sich
eine
genetische
Veränderung
in
einem
der
prädisponierenden
Tumorsuppressorgenen BRCA1und BRCA2 genauso wie bei Ovarialkarzinom (McPherson et
al., 2000) statt. BRCA1 liegt auf dem langen Arm von Chromosom 17 (17q21) (Foster et al.,
2002; Hall et al., 1990). BRCA1 ist für die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen
zuständig. Das Fehlen von BRCA1 führt zu vermehrten chromosomalen Abnormitäten (M. Li
et al., 2013; Chang-Claude et al., 1997). BRCA2 liegt auf dem Chromosom 13 (13q12) und
beteiligt sich ebenfalls an der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (Chang-Claude,
2001). Weitere Risikofaktoren sind frühe Menarche (<12 Jahre), späte Menopause(>55
Jahre), Kinderlosigkeit, erste ausgetragene Schwangerschaft nach dem 30 Lebensjahr,
erhöhter Alkoholkonsum, Vitamin A- und E- Mangel, Mastopathie (bezeichnet eine Vielzahl
10
Einleitung
proliferativer und degenerativer Umbauprozesse des Brustdrüsen-Parenchyms, verursacht
durch
hormoneller
Dysbalancen
zwischen
Östrogenen
und
Progesteron),
Östrogenlangzeitsubstitution, anamnetisch bekanntes Uterus-, Ovarial- oder Kolonkarzinom,
fettreiche Ernährung und Mangel an Bewegung. Für die meisten diesen Risikofaktoren liegen
in Deutschland aber keine gesicherten Daten vor. Mammakarzinom entwickelt sich über
mehrere Stadien bis zu Entstehung von Metastasen, was die Therapie schwerer macht.
Das Ovarialkarzinom ist ein maligner Tumor des Ovars (Eierstock), an dem jährlich etwa
3,5% der Frauen in Deutschland erkranken [Abb. 6]. Meist sind die Frauen ab dem 45.
Lebensjahr betroffen. Die Erkrankungsspitze liegt im 60. - 70. Lebensjahr. Ovarialkarzinom
ist mit einer hohen Mortalität verbunden. Pro Jahr sterben ca. 5.500 Frauen. Ursache für die
hohe Sterberate ist meist die späte Diagnose (Engelberth et al., 2014; Jayson et al., 2014). Die
Entstehung des Ovarialkarzinoms ist nicht vollkommen geklärt. Fast 90% treten sporadisch
auf. Eine mögliche Ursache könnte die bei der Ovulation entstehende wiederholte Verletzung
des Oberflächenepithels zu sein, aus der sich Zysten und Wachstumsvorgänge bilden können.
Häufige ovulatorische Zyklen gehören zu den Risikofaktoren für die Entstehung eines
Ovarialkarzinoms, wohingegen Faktoren, die eine Ovulation längerfristig unterdrücken, vor
der Erkrankung schützen. Wie bei Brustkrebs spielt eine Mutation in BRCA1-Gen und
BRCA2-Gen eine wichtige Rolle. In der ca. 5% Fälle lässt sich eine genetische Ursache
feststellen. Zu den Risikofaktoren gehören auch: Alter, Unfruchtbarkeit, Geburtslosigkeit,
Medikamentöse Ovulationsauslösung (z.B. im Rahmen einer in-vitro-Fertilisation), und
Mammakarzinom.
Mehrere
Schwangerschaften
und
langjährige
Einnahme
von
Ovulationshemmern sind dagegen protektive Faktoren.
Zu den verschiedenen Therapiemöglichkeiten des Mamma- und Ovarialkarzinoms gehören
eine Operation, Chemotherapie, Hormontherapie, Strahlentherapie und monoklonale
Antikörper Therapie (targeted Therapie mit Trastuzumab, Tyrosinkinase-Hemmer und
Bevacizumab) (Jones et al., 2007). Daneben gibt es noch Methoden der RadioImmuntherapie, der palliativen bzw. lindernden Behandlungen. Damit wird die Lebensqualität
aufrechterhalten.
Fortschritte in der Chemotherapie werden vor allem in der Verbesserung der Verträglichkeit
und der Wirksamkeit der Zytostatika erwartet. Um die Wirksamkeit einer Zytostatika
Behandlung zu steigern, werden häufig Kombinationen von verschiedenen Zytostatika mit
unterschiedlichen Wirkmechanismen und Toxizitätsprofilen eingesetzt. Auf diese Weise kann
die Gesamtdosis an antitumoralen Wirkstoffen erhöht und die Nebenwirkungen insgesamt
11
Einleitung
verringert werden. Weitere Möglichkeiten Nebenwirkungen zu verringern wäre eine
Dosisreduktion (Al-Batran et al., 2006) sowie extrakorporale Blutwäsche (Pütz et al., 2009).
Abbildung 6: Prozentualer Anteil der häufigsten Tumorlokalisationen an allen Krebsneuerkrankungen in
Deutschland 2010 (ohne nicht-melanotischen Hautkrebs) . Angaben in Prozent.
Quelle: Schätzung der Dachdokumentation Krebs im Robert Koch-Institut
1.5 Chemotherapie
Allgemein wird die Chemotherapie als eine medikamentöse Behandlung, hauptsächlich von
Krebserkrankungen, eingesetzt. Ziel einer Chemotherapie ist es, alle im Körper vorhandenen
oder nach der Operation noch verbliebenen Krebszellen zu zerstören. Dabei werden
Wirkstoffe verabreicht, die die Vermehrung der Tumorzellen hemmen. Sie werden deshalb
Zytostatika genannt. In erster Linie handelt es sich um Substanzen, die eine normale
Zellteilung verhindern. Ihre Wirksamkeit an den Zellen ist umso höher, je schneller sich diese
vermehren. Brustkrebszellen sind gegenüber der Chemotherapie empfindlicher als gesunde
Zellen, weil Sie eine hohe Vermehrungsrate haben. Allerdings werden auch gesunde Zellen
durch die Zytostatika an der Zellteilung gehindert. Körpergewebe mit hoher Teilungsrate wie
die Schleimhaut des Magen-Darm-Traktes oder die Haarwurzelzellen werden daher oft
stärker betroffen als Gewebe mit langsamer Teilungsrate.
Chemotherapie wird nicht nur bei fortgeschrittenen metastasierenden Tumoren, sondern auch
bei Tumoren im Frühstadium eingesetzt. Tumoren können schon in Frühstadien
Mikrometastasen ausbilden. Eine Chemotherapie kann sowohl vor und als auch nach einer
Operation erfolgen. Die Chemotherapie nach der Operation wird als adjuvanten Therapie
12
Einleitung
bezeichnet, und die vor der Operation als neoadjuvante. Die adjuvante Chemotherapie senkt
das Rückfall- und Sterberisiko bei Patienten gegenüber einer Operation alleine.
Die adjuvante Therapie wird:
- bei großen und schnell wachsenden Tumoren eingesetzt, bei der sich eine Operation sich
zunächst als schwierig erwies. Beispiele: bei Hormonrezeptor-negativen, also gegenüber
weiblichen Geschlechtshormonen (Östrogene, Progesteron) unempfindlichen Tumoren.
-
bei
Hormonrezeptor-positiven,
also
gegenüber
weiblichen
Geschlechtshormonen
(Östrogene, Progesteron) empfindlichen Tumoren, die bei zusätzlichen anderen Eigenschaften
ein hohes Rückfallrisiko haben, gefolgt von Antihormontherapie.
- bei HER2-positiven Tumoren zusätzlich mit dem Antikörper Trastuzumab: Bei
Brusttumoren, die auf ihrer Oberfläche in verstärktem Maße Bindungsstellen für das HER2Protein aufweisen, kann die Chemotherapie mit einer zielgerichteten Therapie kombiniert
werden (Mohamed et al., 2013; Piccart-Gebhart, 2006).
- bei inflammatorischen (entzündlichen) Karzinomen wird bereits im Vorfeld der Operation
eine präoperative (neoadjuvante) Chemotherapie durchgeführt, da in diesem Fall der Tumor
im Brustgewebe durch eine alleinige Operation nicht ausreichend kontrolliert werden kann.
Die neoadjuvante Chemotherapie wird durchgeführt, um einen Tumor so zu verkleinern, dass
anschließend eine brusterhaltende Operation möglich ist. Zudem kann durch die neoadjuvante
Therapie rasch beurteilt werden, ob die ausgewählten Chemotherapeutika wirken (Jones et al.,
2007).
1.6 PEGyliertes liposomales Doxorubicin
PEGyliertes liposomales Doxorubicin (PLD) eignet sich für die Therapie von Brustkrebs
(Fiegl et al., 2011; J. Huober et al., 2010, O’Shaughnessy, 2003) und Ovarialkarzinom (Grenn
und Rose, 2006; Rose, 2005). Das in PEGylierten Liposomen eingekapselte, rotorange
fluoreszierende Anthrazyklin-Antibiotikum Doxorubicin (Dox), auch bekannt unter der
Namen Adriamycin, wurde 1969 erstmals aus dem Pilzstamm Streptomyces Peucetius isoliert
(Arcamone et al., 1969). Das Doxorubicin-Molekül besteht aus einem naphthacenchinon
Kern. Dox bindet an Nukleinsäuren, vermutlich durch spezifische Interkalation des planaren
Anthrazyklin-Kerns mit der DNA-Doppelhelix Der Anthrazyklin-Ring ist lipophil, aber das
gesättigte Ende des Ringsystems enthält reichliche Hydroxylgruppen neben dem
Aminozucker, wodurch ein hydrophiles Zentrum entsteht (Cummings et al., 1991). Das ganze
Molekül ist amphoter mit sauren Funktionen in den phenolischen Gruppen und basischen
Funktionen in den Aminogruppen. Doxorubicin bindet sowohl an Zellmembranen als auch an
13
Einleitung
Plasmaproteine. Nach der Interkalation mit der DNA, sind die beiden DNA-Stränge so
verbunden, das sie nicht mehr voneinander getrennt werden. So wird sowohl die Replikation
der Nukleotide als auch die Wirkung von DNA- und RNA-Polymerasen gehemmt. Ein
weiterer Ansatzpunkt von Dox ist das Enzym DNA-Topoisomerase II (TOP). TOPs kommen
in allen Organismen vor und spalten vorübergehend eine oder beide superhelikale Stränge der
DNA. Durch diese transiente Spaltung wird die räumliche Struktur der DNAs so verändert,
dass die Transkription möglich wird. Durch die Bindung von Dox an TOP IIA werden die
Doppelstrangbrüche der DNA akkumuliert (S.H Chen et al., 2013; Drlica und Franco, 1998),
die Transkription und die Translation werden gehemmt. Die Bindung von Dox an der
Zellmembran kann eine Vielzahl von zellulären Funktionen beeinflussen. Eine enzymatische
Elektronenreduktion von Dox durch eine Vielzahl von Oxydasen, Reduktasen und
Dehydrogenasen kann zur Entstehung von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen
species (ROS)) führen. Freien Radikale können Proteine und Lipide oxidieren, und somit zur
Zerstörung der Zellmembran führen.
Durch die charakteristischen morphologischen Veränderungen wird vermutet, dass Zellen die
mit Doxorubicin behandelt wurden, möglicherweise durch Apoptose oder programmierten
Zelltod untergehen (S.H. Chen et al., 2013). Neben seinen tumorhemmenden Eigenschaften
zeigt Dox mutagene, teratogene und karzinogene Wirkungen
1.6.1 Häufige Nebenwirkungen von Doxorubicin und PLD
Eine Chemotherapie sollte sich in erster Linie gegen Krebszellen richten. Durch die
Chemotherapie werden aber auch gesunde Körperzellen zerstört, insbesondere Zellen mit
hoher Teilungsrate wie die Schleimhautzellen des Magen-Darmtraktes, die blutbildenden
Zellen des Knochenmarks und auch die Haarwurzelzellen. Typische Nebenwirkungen von
PLD sind: Anhaltende Erschöpfung und Müdigkeit, palmar-plantares ErythrodysästhesieSyndrom (PPE) (Miller et al., 2014; Lotem et al., 2000), Übelkeit und Erbrechen, Durchfall,
Appetitlosigkeit, Stomatitis (Entzündungen der Mundschleimhaut) (Minisini et al.,2008),
Haarausfall (reversibel), Veränderungen der Finger- und Zehennägel, Störungen der
Blutbildung mit Blutarmut (Anämie), erhöhte Infektionsanfälligkeit (Immunschwäche;
Neutropenie), Thrombozytopenie, Gefühlsstörungen an Händen und Füßen (Neuropathie),
vorübergehende Störungen
geistiger Funktionen, z.B. Konzentrationsschwäche und
Beeinträchtigung der Merkfähigkeit, Herzrhythmusstörung und Kardiomyopathie (Kumar et
al., 1012; Fiegl et al., 2011). PPE tritt allerdings erst nach mehrmaliger Dosis von PLD ein
(Farr und Safwat, 2011; Lorusso et al., 2007), nicht aber beim konventionellen Dox. Diese
14
Einleitung
Nebenwirkungen treten unmittelbar nach Beginn der Chemotherapie ein oder ein paar Tagen,
Wochen oder sogar Monaten später in unterschiedliche Grad auf. Die meisten von ihnen sind
vorübergehend. Die Nebenwirkungen hängen von der Art und Dosis der eingesetzten
Medikamente, der Behandlungsdauer sowie der körperlichen Verfassung der Patientinnen ab.
Die Kardiomyopathie ist dosislimitierend. Die festgelegte Gesamtdosis an Anthrazyklinen
sollte nicht überschritten werden. Bei Kinder und ältere Menschen, das Risiko der
Kardiotoxizität ist besonders hoch. Nichtdestrotz hat PLD bezüglich der Nebenwirkungen
gegenüber dem konventionellen Doxorubicin Vorteile. Die Kardiotoxizität und die
hämatologischen Depressionen sind bei Therapie mit PLD weniger vorhanden als beim
konventionellen Doxorubicin (Pisano et al., 2013; O’Brien et al., 2004; Gabizon et al., 1997).
1.6.2 Nebenwirkungen bekämpfen
Die Nebenwirkungen einer Chemotherapie können heute durch begleitende therapeutische
Maßnahmen (Supportiv Therapie) gemildert werden. So werden Medikamente gegen Übelkeit
und Erbrechen (5-HT3-Antagonisten) oder zur Minderung von Gefühlsstörungen verabreicht.
Eine drohende Immunschwäche mit erhöhter Infektanfälligkeit kann durch regelmäßige
Blutkontrollen frühzeitig erkannt werden. In einem solchen Fall ist es möglich, entsprechende
Vorsichtsmaßnahmen gegen Infektionen zu treffen und Medikamente einzusetzen, die das
Immunsystem stimulieren (z.B. granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF).
Die Neubildung roter Blutkörperchen kann durch die Gabe von Erythropoietin angeregt
werden. Dadurch lässt sich Blutarmut (Anämie) beheben, die als eine der Ursachen für die bei
Chemotherapie oft auftretenden Erschöpfungszustände (Fatigue) gilt. Derzeit ist aber unklar,
ob dadurch das Tumorwachstum angeregt wird. Um Haarausfall zu kaschieren, erhalten die
Patientinnen ein Rezept für künstlichen Haarersatz. Dieser ist allerdings nur vorübergehend
nötig, da die Haare in der Regel etwa sechs Wochen nach der letzten Chemotherapie wieder
zu wachsen beginnen. Bei PPE wird eine Vielzahl von Feuchtigkeitscreme und Lotion
angewendet, um die Schmerzen zu mildern (Lorusso et al., 2007)
1.7 Controlled Application and Removal Liposomal Therapeutics
(CARL)
Im Rahmen des Projektes “Controlled Application and Removal of Liposomal Therapeutics”
(CARL) werden Methoden erforscht um bestimmte Wirkstoffträger (Caelyx: liposomal
verkapseltes Doxorubicin) aus dem Blutkreislauf zu entfernen (Pütz et al., 2010). Dieses
Verfahren hat zum Ziel, bei Krebspatienten, die sich einer Chemotherapie unterziehen, nach
15
Einleitung
maximaler Anreicherung des Wirkstoffes im Tumor das überschüssige liposomal verkapselte
Zytostatikum aus dem Kreislauf zu entfernen. So könnten die schwerwiegenden
Nebenwirkungen von Zytostatika ohne Wirkungsverlust verringert werden (Eckes et al.,
2011; Pütz et al., 2010; Pütz et al., 2008). Der palmar-plantare Erythrodysästhesie und
Stomatitis sind im Falle von Caelyx die hauptdosislimitierenden Nebenwirkungen (Eckes et
al., 2011). Sie können zum Therapieabbruch führen. Plasmapherese-Techniken sind so weit
entwickelt, dass sie problemlos für eine sichere und wirksame Beseitigung von
therapeutischen liposomales Doxorubicin in einem experimentellen Modell verwendet werden
können (Pütz et al., 2010). Im CARL- Projekt, wird eine Doppelmembranfiltration (DMF)
verwendet, um Zytostatika aus dem Kreislauf zu entfernen (Pütz et al., 2010). Die DMF
beruht auf Einsatz semipermeabler Membranen, welche aus dem Blut unerwünschte Moleküle
abtrennen können (Winters et al., 2011). In beiden Filtern (Plasmafilter und Lipidfilter) liegen
die Membranen als Hohlfasern vor. Hier werden in einem geschlossenen System sowohl ein
Plasmafilter, der Blutkörperchen von Plasma abtrennt als auch ein Kaskadenfilter
(Lipidfilter), der das Plasma von den Toxinen befreit, angewandt [Abb. 7].
Abbildung 7: Schematische Darstellung der Kaskadenfiltration (nach Langer Uwe, 2004. Diss.)
Der Plasmafilter unterscheidet sich vom Kaskadenfilter durch seine Porengröße. Der
Siebkoeffizient dieses Kaskadenfilters ist so gewählt, dass er für die zu eliminierende
Substanz
praktisch
null beträgt, für
alle
anderen Substanzen
mit
kleinerem
Molekulargewicht aber möglichst hoch ist (Bambauer et al., 2012). Dadurch werden
16
Einleitung
wichtige Plasmabestandteile nicht entfernt, und können
wenigstens teilweise refundiert
werden. Die Zuführung einer Plasmaersatzlösung kann minimiert werden oder gar wegfallen.
Das Risiko einer Infektion wird somit auch minimiert.
Trotz Fortschritt in der Plasmapherese Verfahren, stand die CARL-Studie vor vielen offenen
Fragen. Die detaillierte Anreicherungskinetik und der Abbau der Liposomen in Tumor
wurden noch nicht vor der Durchführung der Plasmapherese gründlich untersucht. Die Frage
der Retention und ob die angereicherte PLD während der Plasmapherese entfernt wurden
blieb bislang offen. Der EPR-Effekt in Kombination mit der Plasmapherese war nicht
untersucht, obwohl sehr viel schon über die vermehrten Anreicherung und Retention der
Partikeln im Tumor bekannt (Maeda et al., 2001). Die gewählte optimale Zeit für die
Durchführung der Plasmapherese von Eckes et al., basierte auf Literaturdaten (Eckes et al.,
2011). Die Möglichkeiten neue Therapieschemata zu evaluieren sind aus ethischen Gründen
bei Menschen begrenzt.
Um verbesserte Therapieoptionen auf der Basis einer Kombination von liposomalen
Wirkstoffträgern und deren extrakorporale Elimination zu entwickeln, werden Erkenntnisse
im Rahmen eines Tierversuches benötigt. Bislang sind wenig Plasmapherese an Kleinsäuger
durchgeführt worden. Die wenige Versuche in diesem Bereich an Kleinsäugern wurden von
D. B. Follette und Euler berichtet (Follette et al., 1993; Euler et al., 1985). Unter Verwendung
eines miniaturisierten Hohlfaser-Membransystem, konnten Follette et al., zeigen, dass eine
Plasmapherese an Ratten grundsätzlich machbar ist. Über diese wenige Arbeiten hinaus ist die
Apherese an Kleinsäugern jedoch nur unzureichend untersucht und entwickelt.
1.8 BQ-123 ein Endothelin Rezeptor Antagonist
Endothelin (ET) ist ein Peptidhormon der alpha-2 Makroglobuline Familie, die überwiegend
in den Blutgefäßen produziert wird. Man unterschieden zwischen ET-1; ET-2 und ET-3. ET-1
wurde im Jahr 1988 von Yanagisawa entdeckt und isoliert (Yanagisawa et al., 1988). Durch
die Messung des Plasmaspiegels, wurde eine erhöhte Endothelin-Produktion bei
Gefäßerkrankungen und insbesondere Atherosklerose, Myokardinfarkt und Herzversagen,
Lungenhochdruck und Nierenerkrankungen (Lüscher und Wenzel, 1994) gefunden. Eine
große Menge an Endothelin-1 in den Tumoren und eine hohe Dichte von ETA- Rezeptoren in
den Tumorgefäßen wurden nachgewiesen (Sonveaux et al., 2004). Endothelin -1 (ET-1) ist
ein starkes vasokonstriktorisches Peptid und Regulator des Blutflusses (Fukuroda et al.,
1994). Dabei steigt der Blutdruck. ET-1 bindet an zwei verschiedener Rezeptoren, ETA und
ETB (Motte et al., 2006; Iglarz, et al., 2003). ETA ist für die starke vasokonstriktorischer
17
Einleitung
Effekt und ETB für die Vasodilatation in den Gefäßen (Schiffrin, 2001;) verantwortlich. ETA
und ETB gehören zur Familien der sieben G-Proteinen gekoppelter Rezeptoren (GPCR). ETARezeptoren werden primär nur in der glatten Muskulatur der Gefäße und ETB-Rezeptoren
sowohl in der glatten Muskulatur als auch in den Endothelzellen.
Der selektive Rezeptor-Antagonist BQ-123 (Cyclo [D-Asp-L-Pro-D-Val-L-Leu-D-Trp] ist ein
potenter Antagonist von Endothelin-1 (ET-1) - induzierter Hypertonie über die Bindung an
ETA-Rezeptoren (D'Orleans-Juste et al., 1992). BQ-123 führt durch eine Vasodilatation zu
einer vermehrten Akkumulation kleine Partikeln im Tumor, aber nicht in gesunden Geweben
durch Steigerung der Blutfluss in Tumorbereich. Durch Vasodilatation der glatten Muskulatur
im Tumorgefäßbereich werden die Fenestrae vermutlich erweitert und die Partikeln können
leicht durch das schon löchrige Endothel diffundieren (Sonveaux et al., 2004).
1.9 Angiotensin II (AT-II)
AT-II ist ein Peptidhormon des Renin-Angiotensin-Aldosteron-System. AT-II ist wichtig für
die Regulation des Blutdruckes, für die Ausschüttung von Aldosteron und für die
Aufrechterhaltung des Wasserhaushaltes im Körper (Benigni et al., 2010). Dieses
Gewebshormon führt zu Gefäßverengung und dadurch zum Blutdruckanstieg. AT-II entsteht
durch enzymatische Spaltung des Angiotensin I (AT-I) durch das Angiotensin Converting
Enzym (ACE) im Plasma. AT-I selbst wird inaktiv durch die Leber produziert. AT-II wirkt
über zwei Rezeptoren: Angiotensin Typ-1- und Typ-2-Rezeptoren. Diese AngiotensinRezeptoren gehören zur Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren und besitzen sieben
transmembranäre Domänen (Porrello et al., 2009; Hunyady und Catt, 2006). AT-II entfaltet
seine ausgeprägte starke Blutdruck erhöhende (hypertensive) Wirkung und Vasokonstriktion
durch die Bindung an AT-1-Rezeptoren. Die Plasmahalbwertszeit von AT-II beträgt nur
wenige Minuten. Die Funktion des AT-2-Rezeptors ist noch weitgehend unbekannt. Es soll
aber für die Vasodilatation zuständig sein.
AT-II induzierter Bluthochdruck soll die therapeutische Wirksamkeit von liposomalem
Doxorubicin in tumortragenden Mäusen erhöhen (Hattori et al., 2011). Unter Hypertension
(mit AT-II induzierten Bluthochdruck) wurde zum Beispiel mehr PLD außerhalb
Tumorblutgefäßen in Tumoren als unter Normotension. Unter Normotension blieb das meiste
PLD zunächst aber nur in den Blutgefäßen. AT-II steigert den Tumorblutfluss (Hori et al.,
1992, 1985) und beeinflusst möglicherweise den EPR-Effekt durch die gesteigerte
Anreicherung von Partikeln in den soliden Tumoren [Abb. 8] (Maeda et al., 2013).
Tumorgewebe sind charakterisiert durch eine starke Angiogenese eine unvollständige
18
Einleitung
Gefäßarchitektur und Undichtigkeit der Gefäße (Folkman & Klagsbrun, 1987). Durch
fehlende glatte Muskulatur in schnell wachsenden Tumoren, führt die Erhöhung des
Blutdruckes zu vermehrten Anreicherung von Partikeln in Tumor [Abb.8] (Nagamitsu et al.,
2009; Maeda, 2001).
Abbildung 8: EPR-Effekt und Einfluss von AT-II auf den EPR-Effekt.
Schematische Darstellung des Blutgefäßsystems im normalen
Gewebe (oben) und Tumorgewebe unter
hypertensive Zustand (unten). Im unteren Bild, führt AT-II induzierte Hypertension zu einer Vasokonstriktion
und Extravasation von Makromolekülen (dunkle Punkte) an der rechten Seite angezeigt. (Maeda et al., 2013).
Die gesunden Gefäße werden dabei nicht betroffen [Abb. 8]. In normalen Geweben
beschleunigt AT-induzierten Bluthochdruck die Geschwindigkeit des Blutflusses, reduziert
jedoch die Gefäßdurchmesser, so dass das Blutströmungsvolumen unverändert bleibt (Li et
al., 1993).
1.10 In vivo Bildgebung System (Fluoreszenz- und BiolumineszenzImaging)
Ein in vivo Imaging ist ein bildgebendes Verfahren. Es kann zum Beispiel angewendet
werden, um die Akkumulation von fluoreszenzmarkierten Liposomen in den Tumoren zu
verfolgen oder auch um die Therapieeffizienz von Chemotherapeutika zu beurteilen. Es wird
zwischen die Fluoreszenz und die Biolumineszenz unterschieden.
19
Einleitung
Als Biolumineszenz bezeichnet man die Fähigkeit mancher Lebewesen, Licht zu erzeugen
(O'Farrell et al., 2013, Matern, 1984).
Das Licht wird in Anwesenheit von Sauerstoff und mit Hilfe von Luziferase erzeugt (Wilson
und Hastings, 1998; Baldwin et al., 1996; Wet et al., 1987)
Luziferin + O2 ------> Oxyluziferin + hν
Das in vivo Imaging beruht auf die Detektion von Lichtemissionen. Der Vorteil dieses
Verfahrens ist, dass man es auch in vivo anwenden kann (Zinn et al., 2008; Greer und Szalay,
2002), zum Beispiel für die Detektion von Tumoren (Keyaerts et al., 2008). In dieser Arbeit
wurde diese Methode angewandt, um die Wirkung der untersuchten Chemotherapeutika auf
die tumortragenden Ratten in vivo zu messen. Die Methode besitzt eine hohe Sensitivität
(Zinn et al., 2008). Die Luziferase-Expression und Biolumineszenz haben keinen Einfluss auf
das Tumorzellwachstum in vitro oder in vivo (Tiffen et al., 2010). Tumorzellen werden mit
einem Luziferase-Gen stabil transfiziert und dann den Tieren eingeimpft. Nach Wachstum des
Tumors kann Luziferin (150 mg/kg Gewicht der Ratte) gespritzt werden (Kheirolomoon et al.,
2010). Die Zellen, die das Luziferase-Gen exprimieren, produzieren dann ein Lichtsignal, das
durch eine CCD-Kamera (charge-coupled device) detektiert werden kann (Zinn et al., 2008).
Das entsprechende Signal ist abhängig von der Zahl der vitalen transfizierten Tumorzellen. Im
Falle einer therapeutischen Wirkung sollte das Lichtsignal sich nach Absterben der
transfizierten Tumorzellen abschwächen. Der Erfolg einer Therapie kann somit beurteilt
werden.
Fluoreszenz (eine Form der Lumineszenz) ist die spontane Emission des Lichtes nachdem die
Moleküle angeregt worden sind. Die Fluoreszenz wurde 1952 von G. G. Stokes beschrieben
(James et al., 1983). Bei der Lichteinstrahlung absorbieren bestimmte Elektronen der
fluoreszierenden Moleküle die Photonen und gelangen in ein höheres Energieniveau. Die
Elektronen können sich jedoch nicht auf diesem Niveau halten und fallen auf ihr
ursprüngliches Energieniveau zurück. Sie setzen die aufgenommene Energie wieder frei und
es kommt zur Emission des Fluoreszenzlichts. Bei der Fluoreszenz wird das kurzwellige Licht
absorbiert und das langerwellige Licht emittiert.
Die Fluoreszenz Imaging findet viele Anwendungen in der Medizin und Biochemie, zum
Beispiel in der Immunhistochemie, in der Gelelektrophorese und auch in der
Fluoreszenzdiagnostik.
20
Einleitung
In dieser Arbeit, werden die Liposomen bei der Herstellung mit einem Farbstoff gekoppelt
und an Kleintiere intravenös appliziert. Die Tiere werden in ein bildgebendes Gerät platziert.
Durch die Anregung der Partikeln, emittieren die Liposomen ein schwaches Licht. Die
Intensität dieses Lichtes kann ausgewertet werden, somit kann die Anreicherung der
Liposomen in den Tumoren in vivo verfolgt werden.
21
Einleitung
1.11 Ziele der Arbeit
Krebs bleibt in Deutschland trotz Fortschritt der Therapie und verbesserter Früherkennung die
zweithäufigste Todesursache. Die Erforschung und
Entwicklung von neuen Techniken,
Methoden und Medikamente sollen zu einer Verbesserung der Therapie beitragen.
Chemotherapie ist eine oft angewendete Behandlung bei Krebs. Die angewendet Substanzen
sind sowohl für die gesunden als auch für die Krebszellen hochtoxisch. Dadurch entstehen
schwerwiegenden Nebenwirkungen. Liposomen werden vermehrt als Wirkstoffträgern in der
Pharmaindustrie angewendet. Die Einkapselung von Wirkstoffen in diesen Fetthüllen führen
zu einer bessere Verträglichkeit und Verteilung der Wirkstoffe. Das pegyliertes liposomal
verkapselte Doxorubicin wird als Monotherapie bei Patientinnen mit metastasierendem
Mamma- und
Ovarialkarzinom mit erhöhtem kardialem Risiko angewendet. Durch die
Anwendung von PLD wurde die Kardiotoxizität deutlich verringert, dafür traten palmarplantares Erythrodysästhesie-Syndrom (PPE) und Stomatitis vermehrt auf.
Die Plasmapherese ist ein Behandlungsverfahren, bei dem toxische Moleküle aus dem
Blutkreislauf extrakorporal entfernt werden. In der laufenden CARL-studie wird dieses
Verfahren angewendet, um das überschüssige Caelyx bei Mamma- und Ovarialkarzinom
Patienten nach einer PLD-Chemotherapie zu entfernen. Die Plasmapherese wird meist
problemlos durchgeführt. Aber Aufgrund fehlender Daten basiert die optimale Zeit für die
Durchführung der Plasmapherese auf den Literaturdaten von Tierversuche. Die Anreicherung
der Partikeln vor, während und nach der Plasmapherese bei der PLD-Therapie kann nicht
kontrolliert werden. Die Plasmapherese sollte optimal durchgeführt werden nach der
maximalen Anreicherung von Liposomen in Kreislauf, um die Effizienz der Therapie nicht zu
schwächen.
Eine mögliche Elimination von Partikeln während der Plasmapherese konnte nicht
ausgeschlossen. Theoretisch sollte es nicht während der Plasmapherese zu einem Auswaschen
bereits angereicherten Liposomen im Tumor kommen. Ein experimenteller Nachweis steht
bisher aus.
Ziele der vorliegenden Arbeit sind:
- Die Entwicklung einer Plasmapherese an Kleinsäuger.
- Weitergehende Untersuchung des EPR-Effekts mit Hilfe der Plasmapherese.
- Der Zeitpunkt der maximalen Anreicherungszeit der Liposomen in einem RattentumorModell mit Hilfe eines bildgebenden Verfahrens zu erforschen.
22
Einleitung
- überprüfen ob, die bereits im Tumor angereicherten Liposomen bei der Plasmapherese
entfernt werden.
- zu untersuchen, ob die therapeutische Plasmapherese nach einer PLD-Therapie zu einer
Verringerung
der
Nebenwirkungen
an
tumortragenden
Ratten
ohne
Verlust
der
Therapieeffizienz führen kann.
- Beeinflussung des EPR-Effekts mit diversen Stimulantien.
23
Material und Methoden
2. Materialien und Methoden
2.1 Materialien
Artikel
Hersteller
Zellkultur
Iscove Basal Medium mit 10% FCS (Fetal Biochrom (Berlin, Deutschland)
Calf Serum)
Trypsin-EDTA
Biochrom (Berlin, Deutschland)
Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS)
Biochrom (Berlin, Deutschland)
Dulbecco
G 418 Sulfate
Calbiochem (USA)
Nanofectin Kit
PAA (Österreich)
Luciferase Assay System
Promega (Mannheim, Deutschland)
Microtest Zellkulturplatte, 96 Vertiefungen, Greiner Bio-One (Frickenhausen,
Flachboden mit Deckel steril
Deutschland)
50-ml-Gewebekulturflasche 75 cm2 mit
Greiner Bio-One (Frickenhausen,
abgeschrägtem Hals
Deutschland)
50 ml Reagenzgefäß, Polystyrol
Greiner Bio-One (Frickenhausen,
Deutschland)
5 - 50 ml sterile Einmalpipetten
Costar (USA)
Pasteurpipetten aus Glas, Typ PF 1155,
BRAND (Wertheim, Deutschland)
Cat.No. 747720
Sterican-Kanülen
B | Braun (Melsungen, Deutschland)
20 G Kanüle (Ø 0,90 x 40mm 20 G x 11/2 )
22 G Kanüle (Ø 0,70 x 30mm 22 G x 11/4“)
26 G Kanüle (Ø 0,45 x 25mm 26 G x 1)
Katheter mit Flügeln
BD Insyte-W 24 GA 0,75 IN 0,75 x 19 mm BD Becton Dickinson (USA)
25 ml/min
Introcan Safety-W 24 G x ¾“ (0,7 x 19 mm) B| Braun (Melsungen, Deutschland)
22 l/min
24
Material und Methoden
Spritzen
Injekt Luer 2 ml; 5 ml
B| Braun (Melsungen, Deutschland)
Injekt – F 1 ml
B| Braun (Melsungen, Deutschland)
Syringe Luer Lock Tip 1 ml
BD (Franklin Lakes, NJ, USA)
Venenpunktionsbesteck
Venofix 25 G (0,50 x 15 mm; L: 30 cm; Luer
B| Braun (Melsungen, Deutschland)
Lock)
Venofix 23 G (0,65 x 20 mm; L: 30 cm; Luer
B| Braun (Melsungen, Deutschland)
Lock)
Nucleopore Track-Etch Membrane 50, 100,
Whatman/GE Healthcare (Frankfurt,
200 nm
Deutschland)
2.1.1 Geräte
Gerät
Hersteller
Brutschrank
Heraeus (Hanau, Deutschland)
Sterilwerkbank
BDK (Sonnenbuhl-Genkingen, Deutschland)
Spektrometer DU 640 Beckmann
Beckmann Instruments (Fullerton, USA)
Lumineszenzspektrometer LS 50
Perkin Elmer (UK)
Mikroskop Axiovert 25
Carl Zeiss (Jena, Deutschland)
Mikroskop IM 35
Carl Zeiss (Jena, Deutschland)
Biolumineszenz-Imaging-Gerät IVIS Caliper Perkin Elmer (USA)
Spektrum
Luminometer WALLAC Victor2 1420
Perkin Elmer (Finnland)
Multilabel Counter
Extrusionsapparatur
Avestin Europe (Mannheim, Deutschland)
25
Material und Methoden
Präzisionsküvetten aus Quarzglas SUPRASIL Hellma (Müllheim, Deutschland)
Typ Nr.: 105. 254-QS
Photonenkorrelationsspektroskopiegerät
Nicomp Inst. Corp. (Santa Barbara, CA,
Nicomp. Submicrom Particle Analyser Model USA)
380
Zentrifuge Biofuge PrimoR Heraeus
Kendro Laboratory Product (Osterode,
Deutschland)
Zentrifuge Centrifuge 5424
Eppendorf (Hamburg, Deutschland)
FPLC-Gerät BioLogic Duo Flow
Bio-Rad (München, Deutschland)
FPLC-Fraktionssammler BioFrac Fraction
Bio-Rad (München, Deutschland)
collector
2.1.2 Verbrauchschemikalien
Substanz
Hersteller
Doxorubicinhydrochlorid (580 g/mol)
Apotheke der Universitätsklinik Freiburg
C27H29NO11HCl
Verschiedene Hersteller
(Exzitationswellenlänge 470 nm;
Emissionswellenlänge 555 nm)
PLD: (DOXOVES) liposomales Doxorubicin FormuMax Scientific (Kanada)
HCl (4,0 ± 0,1 mg/ml). Lipidkonzentration:
40 ± 0,1 mg/ml (nach Stewart) . Mittlere
Durchmesser der Liposomen: 89,3 ± 0,7 nm.
PDI: 0,03 ± 0,01
Caelyx (Liposomales
Apotheke der Universitätsklinik Freiburg
Doxorubicinhydrochlorid 2 mg/ml)
Hersteller: Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development, L.L.C
(New Jersey, USA)
Trypanblau-Lösung 0,4%
Sigma (UK)
D-Luciferin-Natriumsalz
Promega (Mannheim, Deutschland)
26
Material und Methoden
2.1.3 Substanzen für die Herstellung von Homogenisierungspuffer
Substanz
Molmasse
Summenformel/Abkürzung Hersteller
[g/mol]
Saccharose 0,25 M
342,3
C12H22O11
Roth
(Karlsruhe,
Deutschland)
HEPES
238,31
C8H18N2O4S
(Pufferan®)
Roth
(Karlsruhe,
Deutschland)
2.1.4 Lipide
Substanz
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-
Molmasse
Summenformel/
[g/mol]
Abkürzung
734,06
DPPC
Phosphocholin
Hersteller
Genzyme
Pharmaceuticals
(Schweiz)
Hydrogenated soy
783,774
phosphatidylcholine
1,2-distearoyl-phosphatidyl
2000
HSPC
Aventi Polar Lipids,
C44H88NO8P
Inc. (USA)
MPEG 2000- DSPE
Genzyme
ethanolamine-methyl-
Pharmaceuticals
polyethyleneglycol
(Schweiz)
Cholesterol
386,67
C27H46O
Sigma life Sciences
(Steinheim,
Deutschland)
27
Material und Methoden
2.1.5 Farbstoffe
Farbstoffe
Abkürzung
Hersteller
'DiI'; DiIC18(3))
Invitrogen
1, 1’-dioctadecyl-3, 3, 3’, 3’-
(Molecular Probes®)
tetramethylindocarbocyanine perchlorate
(USA)
Excitation/Emission: 549/565 nm
'DiO'; DiOC18(3)
3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine
Invitrogen
(Molecular Probes®)
perchlorate ('DiO'; DiOC18(3))
(USA)
Excitation/Emission: 490/515 nm
Rhodamin DHPE
Lissamine™ rhodamine B 1,2-dihexa-
Invitrogen
(Molecular Probes®)
decanoyl-sn-glycero-3-phospho-
(USA)
ethanolamine, Triethylammonium salt
Excitation/Emission: 530/580 nm
'DiR'; DiIC18 (7)
1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3’, 3’Tetramethylindotricarbocyanine Iodide
Invitrogen
(Molecular Probes®)
(USA)
Excitation/Emission: 750/ 780 ‡ nm
‡ Fluoreszenzemission dieser Farbstoff ist
unsichtbar für das menschliche Auge.
2.2 Methoden
2.2.1 Zellen
2.2.1.1 Charakteristika der Zelllinien
Für die Versuche wurde die gut charakterisierte MAT B III-Tumorzelllinie (13762 MAT B
III; ATCC Katalog-Nr. CRL-1666) gewählt. Diese Zellen wurden aus einem Tumor (13762
solid mammary adenocarcinoma) einer transplantierten Ratte extrahiert und vom EG&G
Mason Research Institute etabliert.
Diese Tumorzellen sind für gesunde erwachsene Menschen nicht gesundheitsgefährdend. Sie
wurden allerdings bisher nicht auf Humanes Immundefizienz-Virus (HIV) und Hepatitis-BVirus (HBV) hin untersucht. (Quelle: ATCC-Produktinformation).
28
Material und Methoden
2.2.1.2 Zellkultur
Alle Zellkulturversuche wurden an sterilen Werkbänken durchgeführt, um mögliche
Kontaminationen der Zellkultur mit Bakterien, Viren, Hefen oder Pilzen zu vermeiden.
In Inkubatoren wurden die Zellen bei 37 °C in humider 5%iger CO2-Atmosphäre angezogen.
Für die langfristige Lagerung der Zellen in flüssigem Stickstoff wurde Iscove Medium mit
5% Dimethylsulfoxid (DMSO) verwendet. Um tiefgefrorene Zellen wieder in Kultur zu
bringen, wurde die tiefgefrorene Zellsuspension zügig im Wasserbad bei 37 °C aufgetaut und
anschließend in Iscove Basal Medium mit 10% Fetal Calf Serum (FCS) kultiviert. Nachdem
sich die Zellen abgesetzt hatten, wurde das Medium ausgetauscht, um das restliche DMSO
und abgestorbenes Zellmaterial zu entfernen.
2.2.1.3 Passagieren und ernten der Zellen
Bei Erreichen von 70 - 80% Konfluenz der Zellen wurde das Medium entfernt, und die Zellen
wurden zweimal mit jeweils 5 ml PBS gewaschen. Der Zellrasen wurde anschließend
gleichmäßig mit 2,5 ml Trypsin/EDTA-Lösung (Verdünnung einer 10-fach konzentrierten
Stammlösung auf eine Endkonzentration von 0,05% Trypsin (w/v)/0,02% EDTA(w/v))
bedeckt und im Brutschrank für 5 - 10 min bei 37 °C bebrütet. Trypsin ist ein proteolytisches
Enzym und löst die Zellen aus ihrem Verband und von der Kulturgefäßoberfläche ab. EDTA
ist ein Komplexbildner, der die calciumvermittelte Zelladhäsion löst, indem er
Chelatkomplexe mit Calciumionen eingeht.
Zur Inaktivierung des Trypsins wurde FCS enthaltendes Medium hinzugegeben. Die
gewonnene Zellsuspension wurde 5 min bei 100 x g zentrifugiert, und der Überstand wurde
verworfen. Um alle Mediumsrückstände zu entfernen, wurden die Zellen noch einmal in PBS
aufgenommen und zentrifugiert. Anschließend wurde ein Teil der Zellen für die weitere
Kultur in neuem Medium aufgenommen. Entsprechend ihrem Wachstumsverhalten wurden
die Zellen ein- bis zweimal pro Woche passagiert.
2.2.1.4 Transfektion
Die Transfektion erfolgte mit dem Transfektionsreagenz Nanofectin Kit der Firma PAA nach
Protokoll. Nanofectin besteht aus einem Polymer mit positiv geladenen Regionen zur
Bindung von DNA, das in poröse Nanopartikel eingebettet ist. Der Komplex schützt die an
die Nanopartikel gebundene DNA vor dem Abbau durch DNAsen. Der DNA-NanopartikelKomplex kann von den Zellen aufgenommen werden. Innerhalb der Zellen werden die
freigesetzten DNA-Nanopartikel-Komplexe vor dem DNA-Abbau geschützt.
29
Material und Methoden
MAT B III-Zellen wurden in einer 25 cm2 Flasche
ausgesät und kultiviert, bis der
Gefäßboden halb bedeckt war (halbe Konfluenz). Jeweils 2,5 ml einer Lösung des LuziferaseReportervektors (pGL3-Kontrolle) und des PcDNA3-Plasmids mit einer Konzentration von
jeweils 1 µg/µl wurden mit 245 ml einer 150 mM NaCl-Lösung gemischt. Danach wurden 16
µl Nanofectin und 234 µl 150 mM NaCl gemischt und zu der ersten Mischung pipettiert. Die
Probe wurde sofort vermischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation
wurde die Mischung zu den Zellen in der Flasche gegeben und mit ihnen langsam vermischt.
Die Transfektion dauerte zwischen 24 und 48 h. Für die Selektion wurde das alte Medium
entfernt und durch Medium ersetzt, das das Antibiotikum Geneticin G-418 (0,5 mg/ml)
enthielt. Die Zellen wurden danach entsprechend ihrem Wachstumsverhalten ein- bis zweimal
pro Woche passagiert.
2.2.1.5 Bestimmung der Transfektionseffizienz
Die Effizienz der Transfektion wurde mit Hilfe eines Luziferase-Assays (System Promega)
untersucht.
Vor der Bestimmung wurden der 1x Lysepuffer und das Luziferase-Assay-Reagens nach
Herstellerangaben vorbereitet. Das Medium wurde aus der Flasche mit den Luziferasetransfizierten Zellen vorsichtig abgesaugt. Die adhärenten Zellen wurden mit PBS 2-mal
gewaschen. Zu den Zellen wurde 1 ml 1x Lysepuffer gegeben und 2 bis 3 Minuten gewartet.
Die Flasche mit den Zellen wurde mehrfach geschwenkt, um eine vollständige Abdeckung der
Zellen mit dem Lysepuffer zu gewährleisten. Durch Klopfen wurden anhaftende Zellen vom
Boden
der Flasche
abgelöst. Die
Zellen
und alle Flüssigkeit wurden
in ein
Mikrozentrifugenröhrchen überführt, und das Röhrchen wurde auf Eis gestellt. Das Röhrchen
wurde 10-15 Sekunden stark geschüttelt und bei Raumtemperatur zentrifugiert (15 s bei
12000 x g). In 6 Vertiefungen einer schwarzen 96-well-Platte wurden jeweils 20 µl des
Überstandes vorgelegt, dazu wurden kurz vor der Messung 100 µl des Luciferase-AssayReagens pipettiert, und die Intensitäten der Lumineszenz in relativen Einheiten (Relative
Light Units) wurden als Indikator für die Transfektionseffizienz gemessen (WALLAC
Victor2; Messdauer 1000 ms/well).
2.2.1.6 Zellzählung mit Neubauer-Zählkammer und Trypanblau
Die Trypanblaufärbung wurde verwendet, um den Anteil vitaler Zellen vor der Einimpfung an
den Ratten zu ermitteln. Dabei werden die abgestorbenen Zellen durch Trypanblau gefärbt,
weil ihre Zellmembranen durchlässig für den Farbstoff werden. Die vitalen Zellen werden
30
Material und Methoden
nicht gefärbt. Ein Volumen von 20 µl der Zellsuspension von frisch geernteten Zellen
(zwischen 2 x 105 – 4 x 107 Zellen/ml) wurde mit 80 µl einer 0,4%igen Trypanblaulösung
gemischt. Ein Volumen von 20 µl der Mischung wurde in eine Zählkammer gefüllt, der
vorher ein Deckglas aufgelegt wurde.
Die Zählung erfolgte nach Absetzen der Zellen (nach 1 - 2 min) unter einem Mikroskop mit
10 - 40-fach vergrößerndem Objektiv. Nur die nicht gefärbten Zellen wurden gezählt. Die
Berechnung erfolgte anhand der folgenden Formel:
Zellzahl/ml = durchschnittliche Zellzahl pro Großquadrat x Verdünnungsstufe x Kammerkonstante (104)
2.2.2 Versuchstiere
Die für die Versuche verwendeten weiblichen Fischerratten (150 – 200 g, 5 – 7 Wochen alt)
wurden von Charles River (Sulzfeld, Deutschland) bezogen. Die Tiere wurden in geräumigen
Käfigen in einem ventilierten Raum gehalten. Autoklaviertes Wasser und Futter standen den
Tieren ad libitum zur Verfügung. Die Raumtemperatur betrug 21 °C, bei einer
Luftfeuchtigkeit von 55 - 60%. Der Tag/Nacht-Rhythmus war auf 12 h eingestellt. Als
Einstreu dienten Sägespäne. Die Käfige wurden vor der Benutzung mit ihrer vollständigen
Ausstattung autoklaviert. Die Tiere wurden mindestens zwei Wochen vor Versuchsbeginn
geliefert, damit sie sich an ihre neue Umgebung gewöhnen konnten, und so gefüttert, dass sie
das gewünschte Gewicht erreichten. Den Tieren wurden während der Versuche keine Angst,
Leiden und Schmerzen zugefügt. Die durchgeführten Versuche waren gemäß § 8 des
Deutschen Tierschutzgesetzes vom Regierungspräsidium Freiburg genehmigt worden. Nach
Beendigung der Versuche wurden die Tiere mit einer hohen Dosis an Thiopenthan sofort
eingeschläfert.
2.2.2.1 Kriterien zur vorzeitigen Tötung von tumortragenden Ratten
Ratten wurden euthanasiert:
-
wenn der Durchmesser von Tumoren größer als 3,0 cm war
-
bei ulzerierenden Tumoren, unabhängig von der Tumorgröße
-
bei einem Gewichtsverlust von über 20% des Anfangsgewichtes
-
bei Merkmalen wie: Apathie, Isolierung der Tiere, Palpieren der Tumoren als Zeichen
für starke Schmerzen, Behinderung bei der Futter- und Wasseraufnahme durch
Tumoren, motorische Auffälligkeit, Blässe, Parese, auffällige Atembeschwerden,
31
Material und Methoden
abnormale Körperhaltung, Blut an Körperöffnungen, auffallende Abwehrreaktionen/
Aggressivität, Verletzungen, Hautveränderungen, lokale Infektion(en), Automutilation
2.2.2.2 Anästhesie
Die Tiere wurden zuerst in einer Vier-Liter-Box mit einem Durchflussgemisch aus 4 L/min
Sauerstoff
und
4%
Isofluran
((±)-Difluormethoxy-1-chlor-2,2,2-trifluorethan)
(Abbott,Wiesbaden, Deutschland) schnell betäubt. Nachdem die Tiere tief betäubt waren,
wurden sie zur Aufrechterhaltung der Anästhesie über eine Maske mit einem
Durchflussgemisch
aus
2
L/min
Sauerstoff
und
2%
Isofluran
versorgt.
Diese
Inhalationsnarkotika wurden sowohl bei der Tumorimplantation und der Blutabnahme als
auch bei der Plasmapherese verwendet. Die Augen der Ratten wurden zum Schutz vor
Austrocknung vor und nach dem Versuch mit einer Bepanthen® Augen- und Nasensalbe
(Bayer Vital, Leverkusen, Deutschland) eingecremt.
2.2.2.3 Einimpfung der Ratten mit MAT B III-Zellen
Die MAT B III-Zellen wurden wie oben beschrieben vorbereitet und gezählt. Nach der
Zählung wurde je Ratte, 2*105 vitale Zellen in 100 µl PBS mit einer 26-G-Kanüle (Ø 0,45 x
25 mm 26 G x 1) subkutan eingeimpft. Die Dauer bis zum Erreichen der gewünschten
Tumorgröße variierte zwischen 6 und 10 Tagen. Die Ratten wurden nach der Einimpfung alle
12 h beobachtet, dabei wurde ihr allgemeiner Zustand kontrolliert.
2.2.2.4 Vermessen des Tumorvolumens
Die Tumorgröße wurde mit einem digitalen Messschieber (Mitutoyo, USA) gemessen, dabei
wurden das Körpergewicht und der allgemeine Zustand kontrolliert. Es wurden Länge (a),
Breite (b) und Höhe (c) bestimmt. Da die Tumoren keine einheitlichen Formen hatten, wurde
das Produkt a*b*c als Tumorvolumen errechnet.
2.2.3 Die diskontinuierliche Plasmapherese
2.2.3.1 Vorbereitung des Tieroperationsraums
Vor jeder Plasmapherese wurden die Tiere gewogen und auf ihren allgemeinen Zustand hin
untersucht. Die Filter wurden vor der Benutzung mit einer 0,9%igen Kochsalzlösung mit
Heparin (100 I.U) gespült. Nach der Benutzung wurden sie mit einer 20%igen Ethanollösung
gespült.
32
Material und Methoden
2.2.3.2 Blutentnahme und intravenöse Applikation
Die intravenöse Applikation erfolgte über eine Introcan® W oder BD Insyte-W StandardVenenverweilkanüle mit Fixierflügel [Abb. 9 A]. Das Platzieren der Kanüle erfolgte in
Vollnarkose und verlangte eine gewisse Handfertigkeit. Die Verweilkanüle wurde unter
Anstauen der Schwanzvenen gelegt, nachdem der Schwanz vorher kurz unter eine
Rotlichtlampe gehalten worden war, um die Vene zu erweitern. Nach dem Platzieren wurde
die Kanüle mit einer NaCl-Heparin-Mischung (100 I.U) gespült, um eine Verstopfung der
Kanüle durch Gerinnsel zu verhindern und um zu kontrollieren, ob die Kanüle sich wirklich in
der Vene befand. Anschließend wurde die Kanüle mit Klebestreifen fixiert. Die Therapeutika
wurden über die Kanüle appliziert. Für die Blutentnahme wurden 20 µl Heparin-Natrium
25000 IE/5 ml (100 I.U./kg Körpergewicht) (Ratiopharm, Ulm, Deutschland) in einem 1,5
ml-Röhrchen vorgelegt. Die Gewinnung des Blutes erfolgte über die Schwanzvene mit Hilfe
eines 25 G Sicherheits-Venenpunktionsbestecks [Abb. 9 B].
A
33
Material und Methoden
B
Abbildung 9: A) Applikation von PLD. B) Blutentnahme bei der Plasmapherese über ein
Venenpunktionsbesteck.
Die Ratten wurde in einer Box betäubt. Danach wurden sie mit Hilfe einer Narkosemaske (von Prof. Haberstroh,
Universitätsklinikum Freiburg) betäubt gehalten. Über einen in der Schwanzvene fixierten Zugang wurde PLD
appliziert.
2.2.3.3 Durchführung der Plasmapherese
Zur Durchführung einer Plasmapherese, wurden Ratten mit hergestellten Liposomen oder
PLD i.v. injiziert. Nach einer definierten Zeit (abhängig von der Liposomen oder PLD) wurde
das Tier betäubt, und eine Venenverweilkanüle wurde platziert. Die Plasmapherese wurde
manuell durchgeführt. Durch diese Venenverweilkanüle wurden 300 – 500 µl HeparinNatrium 25000 IE/5 ml (100 I.U./kg Körpergewicht) injiziert. Es wurde 5 min gewartet, damit
das Heparin seine Wirkung entfalten konnte. Circa 1 ml einer 5%igen Glukoselösung (B
Braun, Melsungen, Deutschland) wurde subkutan gespritzt, um einen möglichen
Flüssigkeitsverlust zu kompensieren. Mit Hilfe einer Punktionskanüle wurden 1,5 bis 2 ml
Blut abgenommen. Das Blut wurde bei 4500 x g 1 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das
Plasma wurde abgenommen und mit so wenig Druck wie möglich durch einen Lipidfilter
gegeben. Für die Überprüfung der Effektivität der Plasmapherese und der Filtration wurden
40 µl Plasma vor und nach der Filtration abgenommen. Das Filtrat wurde mit den vorher
zentrifugierten Blutbestandteilen vermischt und den Ratten durch den zuvor gelegten Zugang
langsam injiziert. Es wurde 5 Minuten gewartet, damit das injizierte Blut sich im Kreislauf
verteilen und die Erythrozyten sich wieder mit Sauerstoff anreichern konnten. Der gesamte
Vorgang wurde fünf- bis sechsmal wiederholt. Das entnommene Volumen sollte immer gleich
dem injizierten sein. Ein Plasmaverlust durch Filtration wurde mit einer Ringer-Lösung (B
34
Material und Methoden
Braun, Melsungen Deutschland) ersetzt. Ungefähr 6 bis 8 ml Blut konnten dabei gewaschen
werden. Falls der Filter verstopfte, wurde er mit einer 0,9%igen Kochsalzlösung durchgespült.
Tabelle 1. Technische Daten des gelieferten Filtermodells (www.membrana.com)
Hersteller
Membrana
Modultyp
Micro-Modul
Modulnummer
081099 – 081104
Polymer
Polyethersulfone
Membran
FraktioPES 40/200
Siebkoeffizient für Human Serum Albumine (HSA)
≥ 0,75
Siebkoeffizient für Immunglobuline M (IGM)
≤ 0,17
Faseranzahl
230
Effektive Innenfläche (trocken)
0,0058 m2
Effektive Außenfläche (trocken)
0,0081 m2
Wanddicke
40 μm
Innendurchmesser
200 μm
Transmembranfluss (Wasser, 25 °C)
5 ml/[min x cm² x bar]
2.2.3.4 Rückspülung der Filter
Die Rückspülung der Filter erfolgte zuerst mit 30 ml Liposomenpuffer. Um die Lipide
komplett aus den Membranfasern zu spülen, wurden die Filter noch zusätzlich mit 50 ml einer
20%igen Ethanollösung gespült. Bei weiterer Verwendung der Filter wurden dieser mehrmals
in beiden Richtungen mit Puffer durchgespült. Der Filter wurde bis zur weiteren Verwendung
in derselben 20%igen Ethanollösung aufbewahrt.
2.2.4 Liposomenherstellung
2.2.4.1 Herstellung am Rotationsverdampfer
Die gewünschten Mengen an PC wurden jeweils abgewogen und mit Chloroform gemischt,
so dass die Endkonzentrationen der Stammlösungen 10 mg/ml betrugen. Diese PCStammlösungen wurden in folgenden Anteilen in einen 100 ml Rundkolben pipettiert:
50 mol% HSPC; 39 mol% Cholesterol; 10 mol% DSPE-PEG 2000 und 1 mol% von einem
Farbstoff (DiO, DiI, DiR).
35
Material und Methoden
Das Chloroform aus der resultierenden Lipidmischung wurde am Rotationverdampfer bei
50 °C (Wasserbad) und ständiger Druckreduktion entfernt. Die Druckabnahme erfolgte
stufenweise von 450 mbar auf final 20 mbar. Zum Schutz des Farbstoffs erfolgte die
Präparation in der Dunkelheit. Um sämtliche Lösungsmittelrückstände zu entfernen, wurde
der entstandene Lipidfilm ungefähr 60 Minuten bei 1 mbar getrocknet. Anschließend wurde
der Lipidfilm in Liposomenpuffer aufgenommen und mit Hilfe von Glasperlen in Lösung
gebracht.
2.2.4.2 Liposomenextrusion
Die Herstellung der Liposomen erfolgte nach der Extrusionsmethode von Macdonald
(Macdonald et al., 1991). Mit Hilfe einer Extrusionsapparatur [Abb. 10] wurden aus der
Lipiddispersion Liposomen hergestellt. Diese wurden durch eine Reihe von Membranen
verschiedener Größe gedrückt. Dabei wurde die Dispersion erst ungefähr 19-mal durch eine
200-nm-Membran, danach circa 21-mal durch eine 100-nm-Membran gedrückt.
Abbildung 10: Extrusionsapparatur von Lipofast
2.2.4.3 Bestimmung der Phospholipidkonzentration
Die Konzentrationsbestimmung an cholinhaltigen Phospholipiden in der LiposomenSuspension erfolgte mit Hilfe eines Spektralphotometers (DU® 640). Die von Stewart
entwickelte Methode beruht auf der Bestimmung eines Phospholipid-Farbstoffkomplexes
(Stewart, 1980). Hierzu wurde eine Ammoniumferrothiocyanatlösung hergestellt, bestehend
aus 27,03 g FeCl3*6H2O und 30,4 g NH4SCN, die in 1 l ddH2O gelöst wurden. Die Lösung
konnte bei Raumtemperatur gelagert und mehrere Monate verwendet werden. Zur
36
Material und Methoden
Bestimmung der Phospholipidkonzentration wurde die hergestellte Liposomensuspension im
Verhältnis 1:20 (v/v) verdünnt. In einem 2-ml-Reaktionsgefäß wurden 750 µl der oben
beschriebenen Ammoniumferrothiocyanatlösung mit 1 ml Chloroform vorgelegt, und 25 µl
der Liposomenverdünnung oder des Liposomenpuffer wurden als Kontrolle dazugegeben.
Beide Phasen wurden gründlich gemischt und bei 1500 x g 5 min lang zentrifugiert. Nach der
Zentrifugation wurde die obere dunkle wässrige Phase vorsichtig mit der Pasteurpipette
abgenommen. Die Entfernung der restlichen Tröpfchen erfolgte mit Wattestäbchen. Die
Chloroformphase wurde in eine Glasküvette überführt. Die Extinktion der Lösung wurde bei
485 nm bestimmt. Als Blindwert diente eine analog behandelte Probe aus Liposomenpuffer.
Zum Nullabgleich des Photometers wurde eine Messung von Chloroform durchgeführt. Von
jeder Liposomensuspension wurden 5 Proben gemessen und von der Kontrolle 3 Proben. Aus
diesen Proben wurde der Mittelwert berechnet.
Tabelle 2. Zusammensetzung des Liposomenpuffers für 1 L Lösung bei pH=7,4
Komponente
Konzentration [g/l]
Konzentration
[mM]
NaCl
68,96
118
KCl
3,54
4,74
KH2PO4
0,806
0,59
Na2HPO4
0,929
0,59
MgCl2
2,42
10
NaHCO3
12,6
15
HEPES
23,8
1,18
2.2.4.4 Eichgerade zur Ermittlung des Umrechnungsfaktors für die Bestimmung der
Konzentration der Liposomen
Von verschiedenen PCs wurden Lösungen mit den Konzentrationen 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35,
40, 45 und 50 µM hergestellt. Die Lösungen hatten ein Endvolumen von 1 ml, dazu wurden
750 µl einer Ammoniumferrothiocyanatlösung pipettiert. Die Proben wurden vermischt, und
die überstehende Ammoniumferrothiocyanatlösung wurde entfernt. Die Extinktion der
Chloroformphase wurde bei 485 nm gemessen. Dreifache Werte wurden bestimmt. Die
Mittelwerte der Extinktion wurden in einer Graphik gegen die Konzentrationen aufgetragen.
Aus den Mittelwerten der entstandenen Geraden wurde der Umrechnungsfaktor errechnet.
37
Material und Methoden
Die Konzentration ergibt sich aus der Formel:
C = Extinktionsdifferenz(Mittelwert der Proben – Mittelwert der Kontrolle)* Fe(CN)3-Faktor
C: PC-Konzentration
Fe(CN)3- Faktor: Ermittelter Faktor aus den Eichgeraden
2.2.4.5 Bestimmung der Liposomengröße mittels Photonenkorrelationsspektroskopie
Die Verteilung der Größe der Liposomen wurde durch Photonenkorrelationsspektroskopie
(PCS) bestimmt. Bei gegebener Temperatur und Viskosität des Lösungsmittels bewegen sich
Partikel verschiedener Größe mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Dabei bewegen sich
kleinere Partikel mit höherer Geschwindigkeit als größere Partikel. Partikel oder
Makromoleküle in einem flüssigen Medium unterliegen einer Brown´schen Bewegung. Bei
der PCS trifft Laserlicht auf die Teilchen der zu prüfende Substanz, dabei wird das Licht
gebeugt. Die Diffusion von Teilchen verursacht eine schnelle Schwankung der Streuintensität
des Lasers. An einem bestimmten Punkt wird die Intensität des durch die Probe gestreuten
Lichts gemessen. Die Intensität des Streulichts schwankt dabei umso schneller, je kleiner die
Partikel sind. Die berechnete Korrelationsfunktion ergibt einen Diffusionskoeffizient für eine
gegebene Temperatur und Viskosität, aus der die Partikelgröße mit der Stokes-EinsteinFormel ermittelt werden kann. Für die Messung wurden die Liposomen mit destilliertem
Wasser in einer Einmalküvette verdünnt, bis die Lichtstreuung zwischen 180 und 250 kHz
lag. Ermittelt wurden die Größe der Partikel, ihre Standardabweichung, die Varianz und der
Polydispersionsindex (PDI). Die Messungen dauerten 10 Minuten. Angegeben wurden,
Temperatur = 23 ° C; Viskosität = 0.933 cp; Kanalbreite = 19.0 µs und Wellenlänge = 632.8
nm.
2.2.5 Messung der Proben
Die Fluoreszenz der entnommenen Proben wurde mit Hilfe eines Lumineszenzspektrometers
(LS) bestimmt. Es wurden jeweils drei Werte gemessen.
2.2.5.1 Lumineszenzspektrometrie
Die Lumineszenzspektroskopie ist ein Verfahren zur Messung der Konzentration von
verschiedenen fluoreszierenden Stoffen.
Bestimmte Moleküle, Ionen und Atome haben, nachdem sie durch Energiezufuhr
(Primärstrahlung) angeregt wurden, die Eigenschaft, Licht zu emittieren (Sekundärstrahlung),
dessen Intensität kann mit einem LS bestimmt werden.
38
Material und Methoden
Die Lichtintensität hängt von der Anzahl der in der Lösung vorhandenen Fluorophormoleküle
ab. Die Intensität des Anregungsstrahls nimmt mit zunehmender Eindringtiefe ab, was dazu
führt, dass nur noch ein kleiner Teil der Moleküle überhaupt durch den Anregungsstrahl
aktiviert wird. Eine reversible Veränderung des Fluorophors kann eine Löschung der
Fluoreszenzintensität bewirken, dies wird als Quenching bezeichnet.
Mit
dem
vorhandenen
Spektrometer
konnte
allerdings
nur
Stoffe
mit
einer
Emissionswellenlänge von max. 700 nm gemessen werden. Für Farbstoffe mit höheren
Wellenlängen, wie z.B. DiR, wurde das IVIS-Caliper Imaging Systems angewendet.
2.2.5.1.1
Messung der Dox- Konzentration nach Fällung
Ein Volumen von 10 µl des abgenommenen Plasmas wurde mit 90 µl ddH2O verdünnt, mit 10
µl einer 3 M Trichloressigsäure (TCA)-Lösung versetzt und gemischt. Die Proben wurden 5
min bei 18.000 x g zentrifugiert. Von dem Überstand wurden 70 µl in eine Präzisionsküvette
aus Quarzglas überführt, und die Dox-Konzentration wurde anhand seiner rot leuchtenden
Fluoreszenz bei 470 nm Exzitation/555 nm Emission mit Hilfe eines LS gemessen.
2.2.5.1.2
Methyl tertiary-butyl ether –Methode (MTBE): Lipidextraktionsmethoden
zur Messung der Fluoreszenz der Liposomen im Plasma (Matyash et al., 2008)
Ein Volumen von 10 µl Plasma wurden mit 90 µl ddH2O verdünnt. Die Probe wurde mit 300
µl Methanol gemischt, anschließend wurde 1 ml MTBE hinzugefügt. Die Proben wurden gut
gemischt und 1 Stunde im Thermomixer bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurden
250 µl ddH2O hinzugefügt, und die Proben wurden 10 min im Thermomixer gerührt.
Anschließend wurden die Proben 10 min bei 1500 x g zentrifugiert. Die Überstände wurden
abgenommen, in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt und in einem Heizblock zum Verdampfen
gebracht. Nach dem Trocknen wurden 100 µl einer 2:1-Mischung aus Methanol/Chloroform
in das Gefäß pipettiert und resuspendiert. Anschließend wurde die Fluoreszenz mittels eines
Lumineszenz-Spektrometers gemessen.
39
Material und Methoden
2.2.6 In vivo Imaging
2.2.6.1 Versuchsaufbau und Vorbereitungen
Das für die Versuche benötigte D-Luziferin-Natriumsalz (Promega, Deutschland) wurde in
PBS gelöst, filtersterilisiert, portioniert (30 mg in 0,5 ml PBS), eingefroren und bei -70 °C
gelagert. Die benötigte Menge wurde kurz vor dem Versuch aufgetaut und auf
Körpertemperatur
erwärmt.
Die
D-Luziferin-Lösung
wurde
bis
zur
Verwendung
lichtgeschützt gelagert.
Das IVIS-Spektrum Imaging Systems von Caliper besteht aus einer Dunkelkammer,
Narkosemasken für die Messung von bis zu 6 Mäusen und 3 Ratten parallel und einer
hochauflösenden CCD (charge-coupled device)-Kamera, die mit einem Computer verbunden
ist. Vor der Benutzung wurde die Kamera auf -90 °C gekühlt und die Dunkelkammer auf
Raumtemperatur eingestellt. Die genutzten Exzitations- und Emissionswellenlängen lagen
zwischen etwa 350 nm und 800 nm. Die Lichtquelle und die Belichtungszeit wurden
eingestellt und gespeichert.
Die Bilder wurden mit Hilfe einer Software bearbeitet und ausgewertet (Living Image 4.0).
Das Gerät wurde jedes Mal vor Beginn und nach Ende der Versuche mit Desinfektionsmittel
abgewischt.
2.2.6.2 Durchführung der Aufnahmen
Nach Erreichen der gewünschten Tumorgröße wurden die Ratten im Bereich der Tumoren
rasiert, um die Qualität der Messungen zu verbessern. Anschließend wurden sie in einer Box
mit 4% Isofluran und 4 Litern Sauerstoffzufuhr betäubt. Nachdem die Tiere eingeschlafen
waren, wurde ihnen Luziferin intraperitoneal gespritzt, und sie wurden in die Dunkelkammer
gebracht, dabei wurde die Mischung des Betäubungsmittels in den Anschlüssen der Kammer
auf 2% Isofluran und 2 Liter Sauerstoff umgestellt. Die Tiere wurden auf ihre rechten Seiten
gelegt, da die Tumoren sich auf den linken Seiten befanden.
1- Biolumineszenz: Die Messungen wurden 5 Minuten nach der Gabe von Luziferin
begonnen. Die Bilder wurden sofort ausgewertet. Es wurden so viele Aufnahmen
gemessen bis eine Abschwächung des Lichtsignals erkennbar wurde. Die Aufnahmen
mit dem jeweils höchsten Signal wurden ausgewertet. Eine ganze Messung dauerte
ungefähr 30 min.
40
Material und Methoden
2- Fluoreszenz: Die erste Messung erfolgte vor der Gabe der Liposomen,
(Nullwertmessung). Danach wurden DiR- Liposomen zu einer Endkonzentration von
4 mM PC zu den Ratten i.v appliziert. Sie wurden wieder betäubt und in das Gerät
gelegt. Neben die Tieren oben rechts wurde ein Marker platziert. Durch den Marker,
wurden die Messungen kalibriert. Der Marker enthielt 4 mM PC der injizierten
Liposomen. Die Exzitation- und Emissionswellenlänge wurde eingestellt. Die
einzelnen Messungen dauerten jeweils 1 Sekunde.
Am Ende der Aufnahmen wurden die Tiere aus der Dunkelkammer genommen, in den Käfig
gelegt und in den Stall zurückgebracht. Nach 1 Minute ohne Betäubung waren die Tiere meist
wieder wach. Das Gerät wurde gereinigt.
2.2.6.3 Bildbearbeitung und Quantifizierung
Zur Bearbeitung der Bilder wurde eine auf dem Computer installierte Living Image 4.0
Software angewendet. So konnte die Skalierung für alle Messungen auf das gleiche Intervall
eingestellt werden. Das Farbspektrum der Skala ging von Blau bis Rot. Dabei wurden
Bereiche mit geringer Lichtintensität blau und Bereiche mit hoher Intensität rot dargestellt.
Regions Of interest (ROI) mit definierter Größe wurden definiert und die Lichtintensität
abgelesen. Die ROIs wurden bei demselben Versuch immer wieder auf die definierte Stelle
gelegt.
1- Biolumineszenz: Eine gleich große ROI wurde in einen Bereich der Tiere ohne
Tumor gelegt, um die Lichtintensität des Bildhintergrundes zu messen. Zur
Berechnung
der
endgültigen
Lichtintensität
wurde
die
Lichtintensität
des
Hintergrundbildes von der Lichtintensität des Tumorbereichs subtrahiert.
2- Fluoreszenz: Für die ROIs von Tumor und Haut wurde ein Durchmesser von 1,5 cm
gewählt. Für Ohr und Pfote wurde ein Durchmesser von 0,5 cm gewählt. Dadurch,
dass das Gerät einige Abweichungen nach jeder Messung zeigte, wurde der Mittelwert
der gemessenen Marker aller durchgeführten Messungen in einem Versuch berechnet.
Die gemessenen Marker Werte einzelner Messungen wurden durch diese Mittelwerte
geteilt. So wurden die gemessenen Messwerte liposomaler Marker normalisiert, um
den Verlust und den Gewinn der Fluoreszenzintensität bei jeder Messung
auszugleichen. Dadurch, dass die Tumore subkutan lagen, musste der Anteil an
41
Material und Methoden
Fluoreszenz der Haut von der gesamten gemessenen Fluoreszenz im Bereich der
Tumoren abgezogen werden. Die Berechnung von akkumulierten Liposomen im
Tumor erfolgte wie folgt:
Ermittelte Fluoreszenzintensität(FI) (Tumor)= gemessene FI (Tumorregion) - gemessene FI (Haut)
2.2.7 Gel-Permeations-Chromatographie (GPC)
Ein Fast Protein Liquid Chromatography-System (FPLC) (BioLogic DuoFlow, BIO-RAD
Deutschland) wurde verwendet, um Liposomen von Lipoproteinen zu trennen. Somit wurde
geprüft, ob die Bindung des Farbstoffs an die Liposomen in vivo stabil ist, und, ob eine
mögliche Fusion der Liposomen mit HDL in vivo stattfindet. Die GPC trennt Substanzen
aufgrund ihrer unterschiedlichen Größe über eine Säule auf. Die Ausrüstung bestand aus
einem Computer mit USB-Kommunikationseinrichtung, einer System-Peripherie (zwei
Pumpen vom Typ F10, Gegendruckregler, passenden Spannern und zwei Mischern), einem
Detektionssystem
(UV-Detektor,
Quadtec-Detektor),
einem
AVR7-3-Ventil,
einem
Fraktionssammler (BIOFRAC) und einer Dreispitz-Säule, geladen mit Superose 6 prep Grad
(GE Healthcare, Schweden).
Der Laufpuffer bestand aus PBS (9,55 g/l, Biochrom, Deutschland), Natriumazid (200 mg/l
bidest. H2O, Merck, Deutschland) und EDTA (372,3 mg/l; AppliChem, Deutschland). Der
Puffer wurde steril filtriert und im Ultraschallbad entgast. Vor der Applikation wurden 40 µl
der Proben mit 260 µl des Puffers verdünnt und bei 10.000 x g für 5 min zentrifugiert, um die
groben Partikel zu entfernen. Ein Volumen von 300 µl des Gemisches wurde mit einer
Hamilton-Spritze in die Probeschleife der Apparatur geladen. Bei einer Fließgeschwindigkeit
von 0,2 ml/min mit 2 ml Laufpuffer wurden die Trennungen gestartet, dazu kam noch 80 ml
Laufpuffer. Circa 60 Fraktionen wurden gesammelt. Die Menge an Eluat betrug 1 ml pro
Fraktion. Im UV-Detektor wurde die optische Dichte des Eluats bei 280 nm gemessen. Nach
jedem Lauf des BioLogic DuoFlow wurde die Säule mit dem Laufpuffer gewaschen und
regeneriert. Blank-Läufe wurden regelmäßig durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit und die
Hintergrundabsorption zu überprüfen. Das Chromatogramm wurde analysiert, und die
Fluoreszenz der einzelnen Fraktionen wurde mit Hilfe des IVIS Caliper gemessen.
42
Material und Methoden
2.2.8 Messung des Blutdruckes
2.2.8.1 Steigerung der Liposomen-Akkumulation in Tumor durch AT-II: Non-Invasive
Messung des Blutdruckes bei Ratten
Um den Effekt von AT-II auf die Anreicherung der Liposomen in den Tumor zu untersuchen,
wurden die Ratten wie oben beschrieben mit MAT B III-Zellen eingeimpft. Der Blutdruck
wurde nichtinvasiv mit Hilfe einer an einen Computer angeschlossenen Apparatur gemessen.
Der Rattenschwanz wurde in die ringförmige Blutdruckmanschette der Coda-Apparatur
eingeführt [Abb. 11]. Der Messmechanismus ähnelt dem von Blutdruckmessgeräten für den
Einsatz am Menschen. Das Gerät pumpt Luft in die Manschette, danach wird die Luft
langsam abgelassen. Aus der Veränderung des Luftdrucks wird von der Software der
Blutdruck ermittelt und angezeigt. SBP (systolischer Blutdruck), DBP (diastolischer
Blutdruck) und MBP (mittlerer Blutdruck) wurden minutenweise vor und während der AT-IIInjektion mit Hilfe einer entsprechenden Software gemessen.
Nach Erreichen der gewünschten Tumorgröße wurden Liposomen injiziert. AT-II mit einer
Konzentration von 20 µg AT-II in 1 ml NaCl wurde den Ratten i.v. manuell sehr langsam
nach einer definierten Zeit gespritzt, und die Messung wurde durchgeführt. AT-II wird schnell
im Blut abgebaut. Der Versuch dauerte 30 bis 40 Minuten. Mit einer Thermometersonde
wurde die Temperatur der Ratte während der gesamten Messung gemessen. Eine konstante
Raumtemperatur war wünschenswert. Die Heizplatte wurde auf 20 °C erwärmt. Lärm wurde
während den Versuchen vermieden. Zwischen Manschettenring und Messgerät wurde ein
Abstand von ca. 2 cm gelassen. Ein zu dicker Rattenschwanz könnte zu Fehlmessungen
führen.
43
Material und Methoden
Abbildung 11: Blutdruckmanschette einer Coda-Apparatur um einen Rattenschwanz
2.2.9 Applikation von BQ-123
Nach Entstehung der gewünschten Tumorgröße wurden die tumortragenden Ratten mit
Isofluran in einer Box betäubt, und die gewünschte BQ-123 Dosis (1 mg/kg KGW oder
2 mg/kg KGW) wurde appliziert. Bei der i.v.-Applikation wurde ein Zugang in der
Schwanzvene eingeführt, und BQ-123 wurde langsam injiziert. Bei der i.p.-Applikation
wurde BQ-123 in dem Bauchraum injiziert. Nach der Injektion wurden die Ratten in den
Käfig gelegt, beobachtet und zur Messung gebracht
2.2.10 Schwimmen der Ratten
Um den Effekt der Steigerung der Herzleistung auf die Anreicherung der Liposomen in
Tumor zu untersuchen, wurden Schwimmversuche durchgeführt. Durch das Schwimmen
wurde von den Ratten gefordert, ständig in Bewegung zu bleiben, dies führte zu einer
Steigerung der Herzleistung.
Den Ratten wurden Tumorzellen eingeimpft. DiR-Liposomen wurden hergestellt. Nach
Entstehung der Tumoren wurden IVIS-Aufnahmen der Ratten gemacht (vor Injektion).
Danach wurden Liposomen i.v. injiziert und direkt im Anschluss weitere IVIS-Aufnahmen
gemacht um die Akkumulation der Liposomen im Bereich der Tumoren zu messen. Nach 24 h
wurden die Ratten in ein Schwimmbecken gesetzt.
Als bestgeeignetes Schwimmbecken wurde ein speziell für Kleintiere entwickeltes
Schwimmbecken für neurologische Untersuchungen angewendet [Abb. 12]. Das Becken hatte
einen Durchmesser von 3 Metern und eine Tiefe von 0,75 Metern. Die Ratten konnten
schwimmen, aber nicht aus dem Becken springen. Sie waren ständig in Bewegung, durch die
44
Material und Methoden
glatte Innenseite des Beckens konnten sie sich nicht für längere Zeit stützen. Das Becken
wurde vorher mit lauwarmem Wasser gefüllt. Es wurde jeweils nur eine Ratte in das Becken
gelegt. Die gesamte Schwimmdauer betrug 1 Stunde mit Pausen. Die Ratten waren circa 2
Minuten im Becken. Danach wurden sie aus dem Wasser genommen, mit einem warmen
Tuch abgetrocknet und in einem warmen Käfig gesetzt, um dort weiter zu trocknen und 2
Minuten zu ruhen. Danach wurden sie wieder zum Schwimmen in das Becken gelegt.
Abbildung 12: Ratten spezielles Schwimmbecken
2.2.11 Statistik
Die Mittelwerte, Standardabweichungen und die statistischen t-Tests wurden mit Hilfe des
Computerprogramms SlideWrite Plus Version 7.01 (Advanced Graphics Software Inc.,
Encinitas, Kalifornien, USA) bestimmt. MS Office 2010 wurde für die Textverarbeitung und
Tabellenkalkulation angewendet. Fotos wurden mittels Irfanview bearbeitet. IVIS-Aufnahmen
wurden mittels einer Living Image 4.1 Software ausgewertet.
45
Ergebnisse
3 ERGEBNISSE
3.1 Liposomen
3.1.1 Wahl der Liposomenzusammensetzung und Herstellung
Caelyx wird mit guter therapeutischer Wirkung für die Therapie von Karzinomen
angewendet. Die Zusammensetzung der Liposomen in dieser Arbeit basiert deshalb auf der
Zusammensetzung von Caelyx, mit Ausnahme einer Erhöhung des PEG-Anteils von 5 auf 10
mol%. In den Vorversuchen erreichte man mit 5 mol% PEG nur eine Halbwertszeit im
Plasma von ca. 12 h (Ngoune, 2010. Diplomarbeit). Durch die Erhöhung des PEG-Anteils auf
10 mol% wurde versucht die Halbwertszeit zu verlängern.
Liposomen wurden wie im Kapitel 2.2.4 beschrieben hergestellt und nach der MacDonaldMethode extrudiert (MacDonald et al., 1991). Für die Extrusion der Liposomen wurde nur
eine einzige Membran mit 100 nm Porendurchmessern angewendet, nicht zwei wie es
ursprünglich beschrieben wurde. Bei Lipiden mit hohen Phasenübergangstemperaturen
werden hohe Drücke bei der Extrusion benötigt.
3.1.2 Bestimmung der Liposomengröße und Konzentration
Liposomen wurden hergestellt. Danach wurde die Menge an Phosphatidylcholin in der
extrudierten Liposomensuspension durch eine kolorimetrische Messung nach Stewart
bestimmt (siehe Kapitel 2.2.4.3). Die Extinktion wurde bei 485 nm gemessen. Um die PCKonzentration berechnen zu können, erfolgte bei jeder neu angesetzten Ferrothiocyanatlösung
eine Eichung mit verschiedenen nicht liposomalen PCs mit Konzentrationen von 5-50 µM
(Kapitel
2.2.4.4).
Die
Charakterisierung
der
Liposomen
erfolgte
mittels
eines
Photonenkorrelationsspektrographen (PCS) und wurde in der Klinik für Tumorbiologie
Freiburg durchgeführt. Die Größe der Partikel, ihre Standardabweichung, die Varianz und der
Polydispersionsindex (PDI) wurden ermittelt. Somit konnte die Qualität der hergestellten
Liposomen sichergestellt werden.
Die mittleren Durchmesser der Liposomen der drei untersuchten Liposomenchargen lagen
zwischen 168 und 181 nm. Die Standardabweichungen betrugen zwischen 34,4 und 44,0 nm
[Tab. 3]. Dies entspricht 19,8 - 26,2% des mittleren Durchmessers.
Der PDI ist ein Maß für die Breite der Größenverteilung der Partikeln. Bei guter Präparation
sollte der PDI unter dem allgemein akzeptierten Wert von 0,2 liegen. Die PDI der
hergestellten Liposomen betrugen zwischen 0,039 und 0,069, und liegen dabei deutlich unter
der
genannten
PDI-Grenze
von
0,2.
Die
ist
schmal.
Aufgrund
der
schmalen
46
Ergebnisse
Molekulargewichtsverteilung gekennzeichnet durch den guten PDI, wurden die Liposomen
für die weiteren Versuche angewendet.
Tabelle 3. Größenverteilung der Liposomen.
Die Liposomen wurden hergestellt und nach der MacDonald-Methode extrudiert. Mittels eines PCS wurden die
folgende Parameter ermittelt: Mittlerer Durchmesser, Standardabweichung und der PDI. Die Messung dauerte 10
min. (n=3)
Liposomenchargen-
Mittlerer
Standardabweichung
Nr.
Durchmesser in nm
in nm (%)
1
173,4
34,4 (19,8)
0,039
2
167,9
44,0 (26,2)
0,069
3
180,5
39,5 (21,9)
0,045
3.1.3
Polydispersionsindex
Liposomen in vivo
3.1.3.1 Stabilität des Farbstoffes im Liposomenmembran mit der Gel-PermeationsChromatographie (GPC)
Hydrophobe Moleküle können im Plasma an Lipoproteine oder an Albumin gebunden
vorliegen. Die Fusion von Liposomen mit HDL ist seit langem bekannt (Immordino et al.,
2006). Ein Austausch des an Liposomen während der Herstellung hinzugefügten Farbstoffs
oder eine Bindung an Lipoproteine würden die mittels Fluoreszenzmessung ermittelte
Biodistribution der Liposomen verfälschen. Um die Stabilität der Liposomen zu überprüfen,
wurden DiR-Liposomen hergestellt und den Ratten in einer Endkonzentration von 4 mM PC
im Plasma i.v. gespritzt. Die Tiere haben die leeren Liposomen in der verwendeten
Konzentration gut vertragen und zeigten keine nach außen erkennbaren toxischen Reaktionen.
Das Blut wurde nach verschiedenen Zeitpunkten abgenommen und zentrifugiert. Die
Lipidpartikelfraktionen wurden mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) getrennt
[Abb. 13].
Liposomen in Puffer zeigten bei Auftrennung mittels GPC nur einen einzigen Peak zwischen
Fraktionen 17 und 21 [Abb. 13 A]. Die Auftrennungen von allen Plasmaproben ergaben drei
verschiedenen Peaks [Abb. 13 B – G]. Die Peaks entsprechen VLDL, LDL und HDL wie
beschrieben (März et al., 1993).
VLDL, LDL und HDL kommen entsprechend in den Fraktionen 17 - 21, 26 - 30 und 31 - 40
vor [Abb. 13 B – G]. Die Liposomen fielen somit in die Fraktionen 17 - 21 wie die VLDL.
47
Ergebnisse
A
B
C
48
Ergebnisse
D
E
F
49
Ergebnisse
G
Abbildung 13: Untersuchung der Stabilität von Farbstoff in den Liposomen durch GPC in vivo.
DiR-Liposomen wurden wie oben beschrieben hergestellt. Die Ratten wurden intravenös injiziert mit Liposomen
in einer Endkonzentration von 4 mM PC im Plasma. Blutproben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten
gesammelt. Das Plasma und Liposomen im Puffer wurden mittels GPC analysiert wie im Kapitel 2.2.7
beschrieben. Die Fließgeschwindigkeit betrug 0,2 ml/min, das Auftragsvolum betrug 300 µl, Das GPC –Material
bestand aus Superose 6 prep grad. Eluat betrug 1 ml und die optische Dichte 280 nm. Chromatogramme von nur
Liposomenproben (A) und Plasmaproben, die Liposomen enthielten (B – G) sind dargestellt. Typisches Beispiel
bei n=3.
Die Abb. 13 zeigt, dass keine signifikante Änderung im Plasmaprofil der Liposomen
stattgefunden hat, somit kann eine Interaktion zwischen Liposomen und Lipoproteinen
weitgehend ausgeschlossen werden.
Um die Stabilität des Farbstoffes nachzuweisen oder einen möglichen Austausch
auszuschließen wurde die Fluoreszenzintensität der Liposomen in den verschiedenen
Fraktionen nach den GPC-Auftrennungen gemessen. Ein Fluoreszenzsignal wurde nur in den
Fraktionen 17 - 22 der Proben, die Liposomen enthielten, gemessen [Abb. 14]. Die
Fluoreszenzsignale überlappen sich zwischen Fraktion 17 und 22. Die Fluoreszenzintensität
nimmt mit fortlaufender Zirkulationszeit ab. Aus diesem Grund wurde bei den Proben nach
72 h keine Fluoreszenz mehr gemessen. Im Plasma ohne Liposomen war erwartungsgemäß
keine Fluoreszenz sichtbar.
Ein fehlendes Fluoreszenzsignal in den Fraktionen 25 - 40 deutet darauf hin, dass kein oder
ein vernachlässigbarer Austausch vom liposomalen Farbstoffs mit HDL und LDL und
Proteinen in vivo in den ersten 72 h nach Injektion der Liposomen in die Ratten stattfindet.
Eine Wechselwirkung der Liposomen mit VLDL kann nicht ausgeschlossen werden, da
Liposomen und VLDL in denselben Fraktionen zu finden sind. Eine alleinige Interaktion mit
50
Ergebnisse
VLDL ist jedoch wegen fehlender Änderung im Lipoproteinprofil sehr unwahrscheinlich
(Cwiklinska et al., 2013).
Abbildung 14: Fluoreszenz der GPC-Fraktionen.
Die Fluoreszenzintensitäten der verschiedenen gesammelten GPC-Fraktionen (vgl. Abb. 13) wurden mit Hilfe
eines IVIS-Caliper gemessen. Die Fluoreszenzintensitäten für die verschiedenen Fraktionen sind aufgetragen.
Mittelwerte und Standardabweichungen sind angegeben. (n=3).
3.2
Plasmahalbwertszeit (HWZ)
Die Plasmahalbwertszeit ist definiert als die Zeit, nach der die Konzentration eines Stoffes im
Blutkreislauf von der Anfangskonzentration auf die Hälfte
der Anfangskonzentration
abgefallen ist. Die Akkumulation der Liposomen im Tumor ist abhängig von der
Zirkulationszeit der Liposomen in Blutkreislauf. Für die Anreicherung und in-vivo-IVISVersuche wurden Liposomen mit langen Plasmahalbwertszeiten benötigt. Liposomen wurden
den Ratten intravenös über die Schwanzvene appliziert. Blutproben wurden nach
verschiedenen Zeiten abgenommen, und die Fluoreszenz im Plasma wurde gemessen. In Abb.
15 dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus verschiedenen Messungen.
Anhand
dieser
Punkte
wurde
eine
passende
exponentielle
Standard
Funktion
(y=100*exp(–x/a2) mit Hilfe der SlideWrite plus 7.01 Software berechnet. Das Programm
SlideWrite Plus verwendet bei der nichtlinearen Kurvenanpassung,
den Levenberg-
Marquardt-Algorithmus. Die Koeffizienten der nicht-linearen Anpassungsfunktion werden
51
Ergebnisse
durch ein iteratives Verfahren der Minimierung der Gütefunktion Chi-Quadrat (Kriterium der
kleinsten Quadrate) bestimmt. Die Gauß-Jordan-Methode wurde für die Matrixinversion bei
jeder Iteration eingesetzt (SlideWrite Dokumentation. Copyright 1983-2010). Die Zeit vor
Beginn der ersten Probenannahme wurde als 100% gesetzt. Aus den jeweils oberen und
unteren Werten der Standardabweichungen der Mittelwerte wurden zwei neuen Kurven
gefittet. Diese Kurven entsprachen der Fehlerbereich der initiale Kurve. Der Anteil der
Liposomen im Plasma in Prozent ist gegen die Zeit aufgetragen [Abb. 15]. Die Auswertungen
der Proben und die Berechnungen mittels der Formel aus der Funktion ergaben eine
Plasmahalbwertszeit der Liposomen von ungefähr 29 h (24 – 31 h) [Abb. 15].
Die Konzentration von Liposomen im Plasma nimmt mit der zunehmenden Zeit proportional
ab. Der Abbau erfolgt nach einer Reaktion erster Ordnung. Der Korrelationskoeffizient betrug
r=0,98.
Abbildung 15: Plasmahalbwertszeit von Liposomen.
Den Ratten wurden Liposomen in einer Endkonzentration von 4 mM PC im Plasma intravenös injiziert.
Blutproben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt, und die Fluoreszenz der Liposomen im Plasma
wurde mit einem Fluorometer gemessen. Eine exponentielle Konzentrationskurve wurde auf der Grundlage der
Messwerte bestimmt. Der relative Anteil der Liposomen im Plasma ist gegen die Zeit aufgetragen. Dargestellt
sind Mittelwerte, Standardabweichungen und die Korrelationsfunktion. Aus den jeweils oberen und unteren
Werten der Standardabweichungen wurde zur Ermittlung der Fehlerbereiche zwei neuen Kurven gefittet und der
Fehlerbereich bei 50% abgelesen. (n=6)
52
Ergebnisse
3.3
Bestimmung
der
Zeitpunktes
maximalen
Akkumulation
der
Liposomen in Tumoren
3.3.1 Wahl des Liposomenfarbstoffs für die IVIS-Aufnahmen
Als Tracer für die Liposomen wurden Farbstoffe untersucht. Die Wahl der Farbstoffe spielte
für die weiteren Versuche eine wichtige Rolle. Nur ein gut sichtbarer und quantifizierbarer
Farbstoff kann zu einer eindeutigen und sicheren Verfolgung der Liposomen in vivo analysiert
werden.
Um einen geeigneten Farbstoff für die IVIS-Aufnahmen auszuwählen, wurden Liposomen mit
unterschiedlichen Farbstoffen (DiO, DiI, DiR) hergestellt und den tumortragenden Ratten i.v.
injiziert. Bei den Farbstoffen handelt es sich um lipophile Farbstoffe, die sich gut in die
Liposomenmembranen integrieren lassen. Der Frequenzbereich der Wellenlängen der
Farbstoffe variiert von Grün bis nahes Infrarot. Alle Fluoreszenzaufnahmen wurden sofort
nach Liposomen- und PLD-Applikation mit dem Gerät IVIS-Caliper durchgeführt.
Bei den IVIS-Aufnahmen mit DiO-Farbstoff wurde eine starke Fluoreszenz der Ratten
registriert [Abb. 16 A], sogar bei der Ratte, die keine fluoreszierende Liposomen bekam. Das
Fell der Tiere zeigte eine hohe Eigenfluoreszenzintensität. Die Pfoten und Ohren zeigten
ebenso ein starkes fluoreszierendes Signal. Durch die starke Eigenfluoreszenz der Ratte war
es nicht möglich, die Fluoreszenz der Farbstoffe in den verschiedenen Regionen der Ratten
und der Tumorbereich zu differenzieren.
Der rote Farbstoff DiI ermöglichte bessere Aufnahmen als der Grün-Gelbe DiO-Farbstoff.
Hier wurde ein kleiner Unterschied zwischen der Ratte, die fluoreszierende Liposomen bekam
und der Kontrollratte ohne Liposomen gesehen [Abb. 16 B]. In den fellfreien Regionen wie
Pfoten und Ohren zeigte die Ratte, die DiI-fluoreszierende Liposomen bekam, ein
Fluoreszenz Signal im Vergleich zu der Ratte ohne DiI-Liposomen. Die Kontrollratte zeigte
nur ein rotes fluoreszierendes Signal im Fellbereich. DiI-Farbstoff würde sich möglicherweise
gut bei felllosen Tieren wie Nacktratten eignen. Die verwendeten Ratten von Typ Fischer
müssten großflächig rasiert werden.
Bei der Verwendung des DiR-Farbstoffes zeigte nur die Ratte, die DiR-Liposomen bekam,
ein Fluoreszenzsignal in der Haut-, Tumor-, Pfoten- und Ohrregion. Die Tumorregionen
konnten von den Hautregionen gut differenziert und analysiert werden [Abb. 16 C]. Daher
wurde für die weiteren Versuche der DiR-Farbstoff ausgewählt.
Die Anregungs- und Emissionswellenlängen von DiR liegen nahe dem Infrarotbereich. Durch
die bei diesen Wellenlängen fehlende Eigenfluoreszenz der Ratten auch im Fell konnten die
53
Ergebnisse
Messungen problemlos ausgewertet werden. Die gemessene Fluoreszenz stammte mit
Sicherheit von den fluoreszierenden Liposomen, nicht von Fell oder vom Tier.
Die Farbstoffe mit Exzitations- und Emissionswellenlängen unter 500 nm eignen sich
definitiv nicht für die geplanten Versuche erforderlichen Aufnahmen, vor allem bei
unrasierten Tieren [Abb. 16 A und B].
Das fluoreszierende Signal von Dox wurde in vivo an Ratten getestet. Das in Liposomen
einkapselten Dox hat eine Orange fluoreszierende Farbe. Tumortragenden Ratten wurde PLD
(Konzentration 9 mg/kg KGW Dox) i.v. injiziert. Sowohl die Kontrollratte als auch die mit
PLD behandelten Ratten zeigte eine starke Eigenfluoreszenz der Ratten [Abb. 16 D], vor
allem im Fellbereich. Eine fehlerfreie Auswertung der Anreicherung war hier leider nicht
möglich, da die Fluoreszenz von Doxorubicin von der Eigenfluoreszenz der Ratte überstrahlt
wurde.
Die Aufnahmen mit dem DiR-Farbstoff zeigte im Vergleich zu DiI deutlich bessere
Ergebnisse, denn sowohl bei der Ratte mit DiR-Liposomen als auch bei der Ratte ohne DiRLiposomen wurde keine Eigenfluoreszenz der Ratten im Fellbereich registriert. DiR-Farbstoff
wurde für die Versuche als Standardfarbstoff angewendet. Das orange fluoreszierende
Doxorubicin war als Detektionsfarbstoff in vivo nicht zu nutzen.
A
- DiO
B
+ DiO
- DiI
+ DiI
54
Ergebnisse
C
+ DiR
D
- DiR
- PLD
+ PLD
Abbildung 16: Auswahl von Farbstoffen.
Liposomen mit verschiedenen Farbstoffen wurden hergestellt. Die Liposomen (A – C) und PLD (D) wurden den
Tumor tragenden Ratten intravenös injiziert so dass die Endkonzentration im Plasma von 4 mM PC oder 9
mg/kg KGW PLD betrug. Die IVIS-Aufnahmen wurden nach Liposomeninjektion durchgeführt. Für die
Farbskala wurde der Bereich zwischen 1,00e9 und 4,00e9 [p/s/cm2/sr] / [µW/cm2] gewählt. (Typische Beispiele)
3.3.2 Anreicherungskinetik der Liposomen
Nachdem DiR als Standardfarbstoff für die weiteren Versuche gewählt wurde, wurde die
Anreicherungskinetik von Liposomen in tumortragenden Ratten mit Hilfe des IVIS Caliper
Imaging-System untersucht. Indirekt wurde auch untersucht, ob die mit Farbstoffmarkierten
Liposomen schnell entfernt werden. Die Kontrollgruppe bekam Liposomen mit Farbstoff zu
einer Endkonzentration von 4 mM PC. Die andere Gruppe erhielt gleichzeitig eine halbe
55
Ergebnisse
Konzentration DiR- gefärbten Liposomen und eine Halbe Konzentration Liposomen ohne
Farbstoff d.h. jeweils 2 mM. Aufnahmen wurden durchgeführt und ausgewertet. Die
Abbildung 17 stellt die Akkumulationsmuster der Liposomen in den Tumorregionen dar.
Die Fluoreszenzintensität von der Kontrollgruppe mit 4 mM DiR-Liposomen war insgesamt
doppelt so groß wie die Intensität von der Gruppe mit 2 mM DiR-Liposomen und 2 mM
farblosen Liposomen. Ein Anreicherungsmuster konnte nicht erkannt werden. Liposomen
reichern sich im Tumor eher nach dem Zufallsprinzip an. Der Farbstoff spielt keine Rolle.
Abbildung 17: Anreicherungskinetik der Liposomen im Tumor.
Liposomen wurden hergestellt. Tumortragenden Ratten wurden mit Liposomen intravenös injiziert. Die
Kontrollgruppe bekam nur DiR-Liposomen (4 mM PC Endkonzentration im Plasma). Die andere Gruppe erhielt
2 mM Konzentration DiR- gefärbten Liposomen und 2 mM Liposomen ohne Farbstoff. Die IVIS-Aufnahmen
wurden nach verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt. (n=3)
56
Ergebnisse
3.3.3 Zeitpunkt der maximalen Akkumulation
Nach Ermittlung der Plasmahalbwertszeit und der Wahl des Farbstoffes wurde der Zeitpunkt
der maximalen Akkumulation der Liposomen im Tumor untersucht. Ein wichtiger Punkt für
eine erfolgreiche Verminderung der Nebenwirkungen mit der Plasmapherese bei Brustkrebs
ohne Verlust der Therapieeffizienz ist der optimale Anreicherungszeitpunkt der Liposomen in
den Tumoren. Dafür wurden Ratten mit MAT B III-Zellen inokuliert (siehe Kapitel 2.2.2.3).
Nach Wachstum des Tumors bis zu der gewünschter Größe wurden die Ratten mit
fluoreszenzmarkierten Liposomen über die Schwanzvene i.v. gespritzt. Mittels einer CCDKamera wurde die Fluoreszenzintensität der akkumulierten Liposomen in den Tumorregionen
und in der Haut nach verschiedenen Zeitpunkten gemessen.
Die Aufnahmen in Abb. 18 stellen ein typisches Beispiel der Liposomenanreicherung in den
Tumorregionen dar. Nach der Injektion der DiR-Liposomen wurde zunächst ein starkes
Fluoreszenzsignal auf der gesamten Körperoberfläche der tumortragenden Ratten beobachtet
[Abb. 18]. Dieses Fluoreszenzsignal nahm in dem beobachteten Hautbereich mit der Zeit ab,
während das Signal im Tumor anstieg. Die Ratte zeigte bis nach ungefähr 36 h eine stetig
steigende starke Fluoreszenz in Tumorbereich (ROI 2). Währenddessen nahm die Fluoreszenz
in der Haut (ROI 1) schneller als im Tumorbereich ab.
Das steigende Fluoreszenzsignal in ROI 2 bis ca. 36 h deutet auf eine Steigerung der
Liposomen-Akkumulation im Tumorbereich hin. Von diesem Zeitpunkt an
begann die
Fluoreszenz langsam abzunehmen. Die Abnahme der Fluoreszenz im Hautbereich ist
proportional zu der Fluoreszenzabnahme in Blutkreislauf.
57
Ergebnisse
Direkt nach Liposomen
12 h
2h
24 h
6h
36 h
58
Ergebnisse
48 h
72 h
96 h
Abbildung 18: Anreicherung der Liposomen im Tumor.
Einer tumortragenden Ratte wurden DiR-Liposomen in einer Endkonzentration von 4 mM PC im Plasma
intravenös injiziert, und die IVIS-Aufnahmen wurden nach verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt. Die ROIs
der gewählten Regionen (Ohren, Pfoten, Haut und Tumorregion) wurden ausgewertet. Als Kontrolle wurde eine
Verdünnungsreihe der DiR-Liposomen benutzt. Typisches Beispiel, (bei n=11).
59
Ergebnisse
Die Fluoreszenzintensitäten in den ROIs wurden wie im Kapitel 2.2.6.3 beschrieben,
berechnet. Die Fluoreszenzintensitäten im Bereich der normalen Haut wurden von den
Fluoreszenzintensitäten im Tumorbereich subtrahiert. Die Abbildung 19 A zeigt die
Anreicherungsverläufe von 11 Tieren. In der Abbildung 19 B sind die aus diesen Tieren
berechneten Mittelwerte der gemessenen Fluoreszenzintensitäten gegen die Zeit aufgetragen.
Die Anreicherungskinetik der Liposomen in den Tumoren verlief von Tier zu Tier
unterschiedlich. Die Anreicherungsmaxima lagen zwischen 24 und 55 h. Der maximale
Anreicherungszeitpunkt wurde über den Mittelwert der Maxima einzelner Kurve berechnet.
Der mittlere maximalen Anreicherungspunkt liegt bei ~41 h (± 17 h). Der Anstieg erfolgte
nicht linear, ein schneller Anstieg erfolgte meist in den ersten 12 Stunden nach
Liposomeninjektion.
Die Ratten zeigen deutliche individuelle Unterschiede (vgl. [19A], die sich in den großen
Fehlerbalken der Standardabweichung wiederfinden. Verschiedene Liegepositionen und
unterschiedliche Größen der Tumore tragen zu den beobachteten Varianzen bei [Abb. 19 B].
A
60
Ergebnisse
B
Abbildung 19: Zeitliche Entwicklung der Fluoreszenzintensität im Tumor nach Gabe von Liposomen.
Farbstoffmarkierte Liposomen wurden durch Extrusion hergestellt und den tumortragenden Ratten in einer
Endkonzentration von 4 mM PC im Plasma i.v. injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion
wurden
IVIS-Aufnahmen
der
Fluoreszenz
von
Liposomen
durchgeführt.
In
A
sind
einzelne
Anreicherungsverläufe dargestellt. In B sind die Absoluten Mittelwerte und Standardabweichungen gezeigt
(n=11)
3.3.4 Verlauf der Fluoreszenz in Haut, Ohren, Pfoten und Tumor
Die Abbildung 20 stellt die Fluoreszenzintensität der Liposomen in der Haut, Tumor, Ohren
und Pfoten dar. Die gemessene Fluoreszenzintensität wurde auf die Fläche normiert.
Aufgrund unterschiedlicher Größe der Organe, wurde bei den Auswertungen ROIs
unterschiedlicher Größe gewählt. Bei den ROIs von der Haut und dem Tumor wurde ein
Diameter von 1,5 cm ausgewählt und bei Ohren und Pfoten 0,5 cm. Die ROIs wurden als
Kreis mit der Fläche von A= πr² gewählt.
In den Tumoren wurde eine hohe Fluoreszenzintensität registriert. Die Struktur des
Tumorgewebes begünstigt die Liposomenakkumulation im gewählten Tumormodell. Die
Haut und die Pfoten zeigen einen ähnlichen Verlauf der Fluoreszenzintensität. Liposomen
akkumulieren in der Haut und in den Extremitäten gleich. Die Gewebe der Haut und der
Pfoten bieten die Liposomen gleiche Voraussetzung für ihre Akkumulation. In den Ohren
wurde auch hier eine geringere Fluoreszenzintensität im Vergleich zu anderen Organen
61
Ergebnisse
beobachtet. Die Struktur der Ohren begünstigt nicht die Liposomenakkumulation,
wahrscheinlich wegen des Knorpels findet eine geringe Durchblutung statt.
Liposomen reichern sich besser im Tumorgewebe an als in der Haut, Pfoten und in den
Ohren.
Abbildung 20: Unterschied der Fluoreszenzintensität abhängig von der Gewebe (Tumor, Haut, Ohren
und Pfoten)
Farbstoffmarkierte Liposomen wurden durch Extrusion hergestellt und den tumortragenden Ratten in einer
Endkonzentration von 4 mM PC im Plasma i.v. injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion
wurden IVIS-Aufnahmen der Fluoreszenz von Liposomen durchgeführt. ROIs (Tumor und Haut betrugen 1,5
cm Diameter und von Ohr und Pfote 0,5 cm) wurden gewählt. Die Fläche der ROIs wurde mit der Formel A= πr²
berechnet. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen der Fluoreszenzintensität der ROIs dividiert
durch die entsprechende ROI-Fläche. (n=11)
3.3.5 Akkumulation der Liposomen in Haut, Ohren, Pfoten und Tumor
Bislang wurde nur die Fluoreszenzintensität der Liposomen in den Organen dargestellt. In den
Regionen wie der Haut beispielweise nimmt die Fluoreszenzintensität mit der Zeit trotz
Anreicherung der Liposomen ab. Die gemessene Fluoreszenzintensität in den Geweben
entstammt der Fluoreszenz, der in den Geweben angereicherten Liposomen und der
Liposomen in den Blutgefäßen, die die Gewebe versorgen. Um die Anreicherung der
62
Ergebnisse
Liposomen in den Organen zu bestimmen, muss die Menge der Liposomen in den
Blutgefäßen von der gemessenen Fluoreszenzintensität abgezogen werden. Mit der Gleichung
[y=100*exp(-x/41,48)] wurde eine Plasmahalbwertszeit für die Liposomen von 29 h
berechnet (Siehe Abs. 3.2). Entsprechend wurde mit der Formel [A=A0*exp(-t/41,48)] die
Fluoreszenzintensität von Blut im Kreislauf in der Zeit t berechnet. A0 entspricht der
Fluoreszenzintensität direkt nach Applikation der Liposomen, zu diesem Zeitpunkt hat noch
keine Akkumulation stattgefunden. A wird von in den im Abschnitt 3.3.4 der gerechneten
Fluoreszenzintensität abhängig von der Fläche abgezogen. Abb. 21 stellt die so berechneten
Mittelwerte der Akkumulation der Liposomen in den Tumoren, Haut, Pfote und Ohr dar. Im
Tumor wurde eine starke Akkumulation der Liposomen beobachtet. Die Akkumulation in die
Pfoten lief zunächst schwankend, zeigte später ein ähnliches Akkumulationsprofil wie in der
Haut. Die Schwankungen hängen stark von der Liegeposition der Ratten, denn es war
schwierig bei den Pfoten jedes Mal auf die gleiche Position zu treffen. In den Ohren wurde
keine Akkumulation der Liposomen beobachtet. Die gemessene Fluoreszenzintensität in den
Ohren stammte von den Liposomen im Kreislauf.
Auf der X-Skala wurde eine gestrichene Linie auf 29 h (Plasmahalbwertszeit der Liposomen)
gesetzt. Die Treffpunkte diese gestrichene Linie mit der Akkumulationskurve im Tumor und
in der Haut sind jeweils mit * und + markiert. Nach 29 h sind im Tumor schon 84% der
maximal in den Tumor anreicherten Liposomen vorhanden. In der Haut sind es nur die 50%
der maximal in den Haut anreicherten Liposomen vorhanden. Das Tumorgewebe begünstigt
somit eine schnelle Anreicherung der Liposomen im Vergleich zu dem Hautgewebe.
63
Ergebnisse
Abbildung 21: Akkumulation der Liposomen in Ohren, Pfoten, Haut und Tumor.
Farbstoffmarkierte Liposomen wurden durch Extrusion hergestellt und den tumortragenden Ratten in einer
Endkonzentration von 4 mM PC im Plasma i.v. injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion
wurden IVIS-Aufnahmen der Fluoreszenz von Liposomen durchgeführt. ROIs (Tumor und Haut betrugen 1,5
cm Diameter und von Ohr und Pfote 0,5 cm) wurden gewählt. Die Fläche der ROIs wurde mit der Formel A= πr²
berechnet. Mit der Formel A= A0*exp(-t/41,48) wird die Fluoreszenzintensität im Blut in der Zeit t berechnet. A0
entspricht der Fluoreszenzintensität direkt nach Applikation der Liposomen. A wurde von der gerechneten
Fluoreszenzintensität abhängig von der Fläche abgezogen. * und + markiert die Treffpunkten von jeweils Tumor
und Haut an der Plasmahalbwertszeit. Dargestellt sind Mittelwerte der Fluoreszenzintensität dividiert durch die
entsprechende ROI-Fläche minus A. (n= 11).
3.4 Die Diskontinuierliche Plasmapherese
3.4.1
Rückhaltevermögen des Liposomenfilters
Für die Durchführung der Plasmapherese wurde ein Filter benötigt, um die Liposomen aus
dem Plasma zu entfernen. Die Durchlässigkeit des Liposomenfilters für die Liposomen wurde
überprüft. Weil das angewendete Fluorometer den DiR-Farbstoff nicht erfassen konnte,
wurden die Liposomen stattdessen mit DiO-Farbstoff präpariert und den Ratten in einer
Endkonzentration von 4 mM PC i.v. injiziert. Nach der Blutentnahme wurde das Blut
zentrifugiert, um die zellulären Bestandteile vom Plasma zu trennen.
Die Plasmaproben wurden mit der MTBE-Methode verarbeitet (siehe Kapitel 2.2.5.1.2) und
ihre Fluoreszenz wurde am Lumineszenzphotometer gemessen.
64
Ergebnisse
Abbildung 22: Rückhaltevermögen des Lipidfilters.
DiO- Liposomen wurden den Ratten i.v. injiziert. Nach 5 min wurden Proben für die Filtration entnommen. Die
Fluoreszenzintensität des Plasmas wurde vor und nach der Filtration gemessen. Aufgetragen sind die Mittelwerte
und Standardabweichungen der Fluoreszenzintensitäten. (n=3)
Die Fluoreszenzintensität von Plasma mit Liposomen vor Filtration ist deutlich höher als die
Fluoreszenzintensität bei den Proben ohne Liposomen und nach der Filtration [Abb. 22]. Die
Fluoreszenzintensität des Filtrates ist etwas schwächer als die des Plasmas ohne Liposomen.
Die Liposomen konnten mit dem Filter erfolgreich und vollständig aus dem Plasma entfernt
werden, daher eignet sich der verwendete Lipidfilter gut für die Plasmapherese.
Dadurch, dass das Filtrat eine geringere Intensität aufweist als das Plasma ohne Liposomen,
kann man vermuten, dass der Filter nicht nur Liposomen aufhält, sondern auch
Plasmabestandteile mit hohen Molekulargewichten. Es werden keine Liposomen bei der
Filtration durchgelassen, somit ist der Siebkoeffizient (ein Maß für die Durchlässigkeit des
Liposomenfilters für die Liposomen) für unsere Liposomen praktisch null.
65
Ergebnisse
3.4.2
Effizienz der Plasmapherese mit leeren Liposomen
Die Plasmapherese, ist ein Verfahren, das angewendet wird, um bestimmte Stoffe aus dem
Blutkreislauf zu entfernen. Sie wurde diskontinuierlich und manuell durchgeführt, denn die
im Plasma vorhandenen Partikeln wurden zuerst durch eine Zentrifugation und danach durch
eine Filtration entfernt. Dieses bereits zuvor etablierte Verfahren wurde hier angewendet, um
überschüssige Liposomen aus dem Kreislauf zu entfernen. Dafür wurden DiO-gefärbte
Liposomen hergestellt und den Ratten i.v. gespritzt. Nach Applikation der Liposomen wurde
5 min gewartet bis sich die Liposomen komplett in Kreislauf verteilt haben. Danach wurde
mit der Plasmapherese begonnen. Die Plasmapherese dauerte maximal 1,5 h. Für die
Durchführung der Plasmapherese wurden zwei Personen gebraucht. Die Hemmung der
Koagulation des Blutes durch Injektion von 100 I.U. Heparin vereinfachte die Blutabnahme,
somit dauerte jede Abnahme 1- 2 Minuten.
Auf der Abbildung 23 ist der Anteil der Liposomen im Blut gegen die Anzahl der
Waschschritte aufgetragen.
Eine Abnahme der Konzentration der Liposomen im Plasma nach den einzelnen Waschritten
wurde registriert. Ungefähr 59% (+/- 10%) der vorhandenen Liposomen in Kreislauf wurden
entfernt [Abb. 23]. Die Effizienz der ersten Waschschritte war größer als die der späteren
Waschschritte, da die Konzentration an Liposomen im Blut mit jedem Waschschritt abnahm
(rote Kurve). Um diese Ergebnisse zu erzielen, wurden 7 Waschschritte mit jeweils 1,5 – 2 ml
benötigt. Circa 10 ml Blut konnten gewaschen werden. Dies entspricht 80 - 90% vom
Blutvolumen einer 180 bis 200 g schweren Ratte.
Die blaue Linie entspricht dem idealen Verlauf der Plasmapherese (angenommen, die Ratte
hätte 10 ml Blut, nach Entnahme von 1,5 ml Blut, blieben noch 8,5 ml im Kreislauf). Nach
der Filtration und Reinfusion der 1,5 ml, verdünnt sich das reinfundierte Volumen mit dem
Blut im Kreislauf. Die Konzentration von Liposomen im Plasma sinkt, und würde dann
[0,85(x-1) *100%] in % der injizierten Dosis betragen. X ist die Zahl der Waschgänge. Das
gewaschene Blut vermischte sich im Kreislauf wieder mit dem ungewaschenen. Nach dem
siebten Waschgang lag die Konzentration der Liposomen im Plasma bei ungefähr 41%. Dies
entspricht nur ~3% mehr als dem idealen Wert.
Die diskontinuierliche Plasmapherese ist somit gleich effizient wie technisch aufwendigen
Aphereseverfahren. Sie eignet sich gut für die Verwendung an Kleinsäuger.
66
Ergebnisse
Mit der Plasmapherese konnte ~59% (+/- 10%) der vorhandenen Liposomen in Kreislauf
entfernt werden.
Abbildung 23: Reduktion des Anteils im Plasma zirkulierender Liposomen durch manuelle
Plasmapherese.
Farbstoffmarkierte Liposomen wurden durch Extrusion hergestellt und den Ratten i.v. injiziert in einer
Endkonzentration von 4 mM PC im Plasma. Die Plasmapherese wurde 5 min nach der Liposomeninjektion
durchgeführt. Plasmaproben wurden vor der Filtration gesammelt, und die Fluoreszenzintensität wurde
gemessen. Die Fluoreszenz vor dem ersten Waschschritt wurde als 100% zu Beginn der Plasmapherese
festgelegt.
Die
blaue
Linie
entspricht
einem
idealisierten
Aphereseverlauf.
Mittelwerte
und
Standardabweichungen sind angegeben. (n=7)
3.4.3
Effizienz der Plasmapherese mit PLD
Plasmapherese wurde an tumortragenden Tieren durchgeführt, nach dem PLD in einer
Konzentration von 9 mg Dox/Kg KGW den Ratten i.v. appliziert wurde. Die Plasmapherese
wurde nach 36 h durchgeführt. In den später erfolgenden die meisten Versuchen zur Therapie
wurde die Plasmapherese erst nach 36 h angesichts der relativer hohen Plasmahalbwertszeit
von PLD und der maximalen Anreicherungszeit der Liposomen in Tumor durchgeführt.
Durch die Plasmapherese wurden ungefähr 45% (+/-9%) der noch im Kreislauf zirkulierenden
PLD entfernt [Abb. 24]. Nach dem vierten Waschgang lag die Menge von PLD im Plasma bei
ungefähr 55%. Es entsprach ca. 6% weniger als dem idealen Wert der bei ~61% lag nach dem
67
Ergebnisse
vierten Waschgang. Die blaue Linie entspricht einem idealisierten Aphereseverlauf. Wegen
der Belastung der Plasmapherese an den tumortragenden Ratten wurde nur 4 Waschschritten
durchgeführt.
Mit der Plasmapherese konnte 45% (+/- 9%) der vorhandenen PLD im Kreislauf mit nur vier
Waschgängen entfernt werden.
Abbildung 24: Reduktion des Anteils im Plasma zirkulierender PLD durch Plasmapherese.
PLD wurde den Ratten in einer Konzentration von 9 mg/Kg KGW Dox i.v appliziert. Nach 36 h wurde die
Plasmapherese durchgeführt. Plasmaproben wurden vor der Filtration gesammelt, und die Fluoreszenz wurde
gemessen. Die Fluoreszenz des ersten Waschschrittes wurde als 100% zu Beginn der Plasmapherese festgelegt
vor dem ersten Waschschritt. Die blaue Linie entspricht einem idealisierten Aphereseverlauf. Mittelwerte und
Standardabweichungen sind angegeben. (n=5)
3.5 Anreicherung und Plasmapherese
Nachdem die Plasmapherese für das Rattenmodell entwickelt und sicher etabliert war, wurden
tumortragende Ratten 22 h nach Injektion von fluoreszenzmarkierten Liposomen einer
Plasmapherese wie beschrieben unterzogen, um zu überprüfen, ob die bereits im Tumor
angereicherten Liposomen nach der Plasmapherese entfernt werden. Fluoreszenzaufnahmen
der Tiere wurden vor und nach der Plasmapherese sowie an verschiedenen Zeitpunkten
während der gesamten Versuchslaufzeit durchgeführt. Die tumortragenden Ratten wurden für
die Messungen im Bereich der Tumoren rasiert. Die ROIs wurden im Ohr-, Pfoten- und
68
Ergebnisse
Tumorbereich wie im Abschnitt 2.2.6.3 beschrieben wurde, gewählt. Zur Qualitätskontrolle
wurde eine Verdünnungsreihe von DiR-Liposomen als Marker benutzt.
3.5.1 Einfluss einer Plasmapherese auf die Verteilung von Liposomen
Die Abbildungen 25 A - K stellen ein typisches Beispiel der IVIS-Aufnahmen einer
tumortragenden Ratte zu verschiedenen Zeitpunkten nach Liposomeninjektion dar. Direkt
nach Gabe der Liposomen wurde zunächst wie in Abb. 18 schon gezeigt worden ist, ein
starkes Fluoreszenzsignal in der Haut, Ohren, Pfoten und Tumor gemessen. Die
Fluoreszenzintensität der Liposomen im Tumor stieg kontinuierlich bis zur Durchführung der
Plasmapherese [Abb. 25 A - E: links liegenden Ratte]. Die Plasmapherese wurde 22 h nach
Gabe der Liposomen aufgrund der Plasmahalbwertszeit von Liposomen von ca. 29 h. Direkt
nach der Plasmapherese betrugen die Fluoreszenzintensitäten in der Haut, Ohren, Pfoten und
Tumor bei der Ratte, die mit Plasmapherese behandelt wurde, jeweils ~73%, ~62%, ~76%
und ~91% ihrer entsprechenden Fluoreszenzintensitäten vor der Plasmapherese [Abb. 25 E –
F]. Der Verlust der Fluoreszenzintensitäten in der Haut, Ohren und Pfoten betrug jeweils
~27%, ~38% und ~24%. In Betrachtung der subkutanen Lage des Tumors (die
Fluoreszenzintensität der Tumor wurde von der Fluoreszenzintensität der Haut subtrahiert)
betrug der Verlust der Fluoreszenzintensität nur ~9%. Der Verlust in der Haut bei der
Plasmapherese Ratte war mehr als 3-fach höher als der Verlust im Tumor.
Bei der Kontrollratte, betrugen die Fluoreszenzintensitäten in demselben Zeitraum in der
Haut, Ohren, Pfoten und Tumor jeweils ~86%, ~109%, ~113% und ~100% ihrer
entsprechenden Fluoreszenzintensitäten vor Apherese. Ein Verlust der Fluoreszenzintensität
wurde nur in Haut registriert. In den Ohren, Pfoten und Tumor blieben die
Fluoreszenzintensitäten relativ stabil in dem genannten Zeitraum. Regionen mit starken
Plasmaphereseeinflüssen wurden mit * (Haut), ** (Ohren und Pfoten) bei der Ratte, die mit
Plasmapherese behandelt wurde, und + (Haut), ++ (Ohr und Pfoten) bei der Kontrollratte
markiert [Abb. 25 E - G].
Circa 2 Stunden nach der Plasmapherese nahmen die Fluoreszenzsignale deutlich in der Haut
und Pfoten bei der Versuchsratte ab. In den Ohren und Tumor blieben die
Fluoreszenzintensitäten relativ konstant. Die Fluoreszenzintensitäten in der Haut, Ohren,
Pfoten
und
Tumor
betrugen
jeweils
~77%,
~110%,
~80%
und
~107%
der
Fluoreszenzintensitäten nach der Plasmapherese [Abb. 25 F – G]. Bei der Kontrollratte
betrugen die Fluoreszenzintensitäten in der Haut, Ohren, Pfoten und Tumor jeweils 107%,
92%, 101% und 100% ihren jeweiligen Intensitäten nach der Plasmapherese [Abb. 25 F – G].
69
Ergebnisse
Nach der Plasmapheresebehandlung, stiegen die Fluoreszenzintensitäten durch die Entfernung
der noch im Kreislauf zirkulierenden Liposomen nicht mehr an,
im Gegensatz zu der
Kontrollratte [Abb. 25 E – H]. An den Pfoten wurde bei der Kontrollratte noch ein
Fluoreszenzsignal 72 h nach Liposomeninjektion an den gewählter Fluoreszenzskala optisch
gesehen. In der Haut und den Pfoten, betrugen die Fluoreszenzintensitäten bei der
Kontrollratte 1/3 mehr als bei der mit Plasmapherese behandelten Ratte.
Die Fluoreszenzintensität im Tumor nahm allmählich sowohl in der Kontrollratte als auch in
der Ratte, die mit Plasmapherese behandelt worden ist, mit der Zeit ab. Auch in der Haut und
Ohren nahmen die Fluoreszenzintensitäten der Liposomen mit der Zeit ab. Diese Abnahme
korreliert wahrscheinlich mit der Abnahme der Liposomen im Blutkreislauf.
Allgemein wurden große Fluoreszenzschwankungen bei den Messungen beobachtet. Die hohe
Fluoreszenzintensität der Messungen am Anfang deutet auf die große Menge an Liposomen
im Plasma hin. Die Haut, Ohren und die Pfoten sind stark durchblutet und haben eine dünne
Hautschicht. Die Schwankungen des Fluoreszenzsignals nahmen nach der Plasmapherese
wahrscheinlich wegen der Elimination des im Kreislauf vorhandenen Liposomen ab.
Die Fluoreszenzintensität bei der Kontrollratte folgte allgemein einem klassischen
Anreicherungsmuster wie im Kapitel 3.3.3 beschrieben ist [siehe Abb. 18].
Die Plasmapherese führt zu einer verstärkten Elimination der im Kreislauf vorhandenen
Liposomen. Durch den starken Rückgang der Fluoreszenzintensität nach der Plasmapherese,
konnte ein Unterschied vor und nach Plasmapherese gut beobachtet werden.
Durch die Plasmapherese wurden die Fluoreszenzintensitäten der Liposomen in der Haut, den
Pfoten und den Ohren deutlich reduziert, während die Abnahme in den Tumoren wesentlich
geringer war.
70
Ergebnisse
Direkt nach Liposomeninjektion
A
2 h nach Liposomeninjektion
B
6 h nach Liposomeninjektion
C
12 h nach Liposomeninjektion
D
71
Ergebnisse
22 h nach Liposomeninjektion
24 h nach Liposomeninjektion und direkt nach
vor Plasmapherese
Plasmapherese
F
E
+ Plasmapherese
26 h nach Liposomeninjektion und 2 h
nach Plasmapherese
28 h nach Liposomeninjektion und 4 h nach
Plasmapherese
G
+ Plasmapherese
Kontrolle
H
Kontrolle
+ Plasmapherese
Kontrolle
72
Ergebnisse
48 h nach Liposomeninjektion und 24 h
nach Plasmapherese
72 h nach Liposomeninjektion und 48 h nach
Plasmapherese
J
I
+ Plasmapherese
Kontrolle
+ Plasmapherese
Kontrolle
73
Ergebnisse
96 h nach Liposomeninjektion und 72 h
nach Plasmapherese
K
+ Plasmapherese
Kontrolle
Abbildung 25: Anreicherung der Liposomen und Plasmapherese.
DiR-Liposomen wurden hergestellt. Die Ratten wurden mit Liposomen in einer Endkonzentration von 4 mM PC
im Plasma intravenös injiziert, und die IVIS-Aufnahmen wurden nach verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt.
Die links liegende Ratte wurde ca. 22 h nach Injektion der Liposomen mit Plasmapherese behandelt. Für die
Farbskala wurde der Bereich zwischen 1,00e9 und 4,00e9 [p/s/cm2/sr]/[µW/cm2] gewählt. Als Qualitätskontrolle
wurde eine Verdünnungsreihe eines Markers benutzt. Typisches Beispiel, (n= 11 bei der Kontrollgruppe und n=
9 bei der Plasmapheresegruppe).
3.5.2 Mittelwerte der Akkumulationskurven
In den Abbildungen 26 sind der Mittelwerte der Akkumulationskurven mit Plasmapherese
dargestellt. Obwohl die maximale Akkumulation der Liposomen im Tumor erst nach ~41 h
ihr Maximum erreicht, erfolgte die Plasmapherese aufgrund der Halbwertszeit der Liposomen
im Blut von ~29 h schon 22 h nach Liposomen-Injektion. Ungefähr 22 h nach Injektion der
Liposomen befinden sich noch etwa 59 % Liposomen im Kreislauf, und so können die
74
Ergebnisse
Plasmapherese-Effekte gut untersucht werden. In der Kontrollgruppe wurden 11
tumortragende Ratten eingerechnet und in der Plasmapheresegruppe wurden 9 Ratten
untersucht. Die Auswertung erfolgte wie im Kapitel 2.2.6.3 beschrieben ist. Mittelwerte und
Standardabweichungen der Fluoreszenzintensitäten der angereicherten Liposomen in Tumor,
Haut, Ohren und Pfoten wurden dargestellt. Der Plasmapherese-Zeitraum betrug 1 bis 1,5
Stunden.
Im Tumor wurde zunächst in den ersten Stunden nach der Liposomen-Applikation ein
schneller Anstieg der Fluoreszenzintensität beobachtet [Abb. 26, Tumor]. Während die
Fluoreszenzintensität bei der Kontrollgruppe im Plasmapherese-Zeitraum unverändert blieb,
wurde bei der Plasmapheresegruppe direkt nach der Plasmapherese eine leichte Abnahme der
Fluoreszenzintensität registriert. Diese mittlere Abnahme der Fluoreszenzintensität bei der
Plasmapheresegruppe betrug ~3% der Fluoreszenzintensität im Vergleich zu der
Fluoreszenzintensität vor der Plasmapherese [Abb. 26, Tumor]. Diese Abnahme sehr gering
und liegt unterhalb der Messfehlergrenzen. Nach der leichten Abnahme folgte ein Plateau, das
über 30 Stunden dauerte. Bei der Kontrollgruppe stieg die Fluoreszenz weiter bis zu ihrem
Maximum bei circa 41 h. Danach folgte ein Abbau der Fluoreszenzintensitäten bei der
Plasmapherese- und der Kontrollgruppe mit der Zeit. Entsprechend wurde die Akkumulation
der Liposomen im Tumor durch die Plasmapherese kaum beeinflusst. In Haut-, Ohr- und
Pfoten wurden ähnliche Verläufe registriert. Zunächst wurde eine starke Fluoreszenzintensität
direkt nach der DiR-Liposomen-Injektion sowohl bei der Plasmapheresegruppe als auch bei
der Kontrollgruppe gemessen. Die starke Fluoreszenz direkt nach der Liposomengabe ist
bedingt
durch
die
starke
Durchblutung
der
Haut,
Ohren
und
Pfoten.
Die
Fluoreszenzintensitäten nahmen mit der Zeit ab. Die Liposomen haben eine begrenzte Zeit im
Kreislauf. Im Plasmapherese-Zeitraum werden ~ 6% der Liposomen bei einer Halbwertszeit
der Liposomen im Plasma von 29 h abgebaut.
Bei der Kontrollgruppe fiel die Fluoreszenz in der Haut wie erwartet ab. Die Abnahme der
Fluoreszenzintensität im Plasmapherese-Zeitraum betrug ~9% [Abb. 26, Haut]. Die
errechnete Akkumulation der Liposomen in der Haut wurde in der Abb. 21 dargestellt. Die
Liposomen reichern sich in der Haut trotz Abnahme der Fluoreszenzintensität weiter an. Bei
der Plasmapheresegruppe wurde eine stärkere Abnahme nach der Plasmapherese im
Vergleich zu der Kontrollgruppe beobachtet. Eine Fluoreszenzabnahme von ~25% wurde
registriert. Bei der Plasmapherese wurden ~59% der im Kreislauf vorhandenen Liposomen
entfernt. Da die Haut gefäßreich ist, wurde die Fluoreszenzintensität der Liposomen im
Blutkreislauf mit der Formel A=A0*exp(-t/41,48) (siehe Kapitel 3.3.5) von der gemessenen
75
Ergebnisse
Fluoreszenzintensität abgezogen, um die Akkumulation der Liposomen in der Haut
darzustellen. Die Akkumulation der Liposomen nach dem Plasmapherese-Zeitraum betrug
sowohl bei der Plasmapheresegruppe als auch bei der Kontrollgruppe ~90% im Vergleich zu
der Akkumulation vor der Plasmapherese. Der Verlust der Fluoreszenz von ~10% bei der
Plasmapherese- und Kontrollgruppe ist angesichts der Messfehler im Toleranzbereich. Nur
die sich im Kreislauf befindenden Liposomen wurden bei der Plasmapherese entfernt. Die
angereicherten Liposomen wurden nicht bei der Plasmapherese entfernt.
Die Anreicherung in den Pfoten verlief wie schon im Kapitel 3.3.5 gezeigt wurde, wie in der
Haut. In den Pfoten stieg das Fluoreszenzsignal bei der Kontrollgruppe sogar um ~5%
zwischen 22 und 24 h. Die Plasmapheresegruppe verlor über 24% ihrer ursprünglichen
Fluoreszenzintensität durch die Plasmapherese im Vergleich zum Wert zu Beginn [Abb. 26,
Pfote]. Die Akkumulation der Liposomen blieb in der Kontrollgruppe in der Plasmapherese
identisch. Bei der Plasmapheresegruppe wurde eine Abnahme der Akkumulation von ~13%
berechnet. Angesichts der hohen Varianz lag die Abnahme im Bereich der Fehlertoleranz.
Im Ohrbereich blieb das Fluoreszenzsignal bei der Kontrollgruppe zwischen 22 und 24 h
gleich. Bei der Plasmapheresegruppe nahm das Signal nach der Plasmapherese um ~47 % im
Vergleich zu dem Signal vor der Plasmapherese ab [Abb. 26, Ohr]. Der Verlust der
Fluoreszenzintensität nach der Plasmapherese korreliert mit der Entfernung der Liposomen im
Kreislauf. Wie im Kapitel 3.3.5 beschrieben wurde, akkumulieren Liposomen nicht im Ohr.
Die gemessene Fluoreszenzintensität stammte von der Fluoreszenz der Liposomen im
Blutkreislauf.
Nach 24 h in der Haut, Pfoten und Ohren folgte ein kontinuierlicher und normaler Abfall des
Fluoreszenzsignals bei der Plasmapherese- und Kontrollgruppe mit der Zeit.
Der Verlust der Fluoreszenzintensität nach der Plasmapheresebehandlung lag bei 25% in der
Haut, 47% in Ohren und 24% in den Pfoten, aber nur 3% in Tumor. Die reale Akkumulation
der Liposomen in den Organen wurde nicht beeinflusst. Die bereits akkumulierten Liposomen
wurden nicht entfernt.
Durch die interindividuellen Unterschiede entstehen große Schwankungen der absoluten
Werte bei den Messungen.
76
Ergebnisse
77
Ergebnisse
78
Ergebnisse
Abbildung 26: Zeitliche Entwicklung der Fluoreszenzintensität im Tumor, Haut, Ohren und Pfoten nach
Gabe von Liposomen.
Farbstoffmarkierte Liposomen wurden durch Extrusion hergestellt und den tumortragenden Ratten in einer
Endkonzentration von 4 mM PC im Plasma i.v. injiziert. Eine Gruppe wurde zusätzlich mit der Plasmapherese
22 h nach Gabe von DiR-Liposomen behandelt (n=9). Bei den Kontrolltieren wurden n=11 Ratten untersucht. Zu
verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion wurden IVIS-Aufnahmen der Fluoreszenz von Liposomen
durchgeführt. Die ROIs von Tumor und Haut betrugen 1,5 cm Diameter und von Ohr und Pfote 0,5 cm.
Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen.
3.5.3
Berechnung des Plasmapherese-Einflusses
Für eine bessere Erfassung der Effekte der Plasmapherese, wurde die Fluoreszenzintensität
der Liposomen zu Beginn der Plasmapherese als 100% festgelegt. Der PlasmaphereseZeitraum betrug 1 bis 1,5 Stunden. Die Normierung der Daten von Abb. 26 ergab die
Abbildungen 27 [Tumor, Haut, Ohr und Pfoten]. Mit Hilfe eines Student- t-tests wurde die
Signifikanz der Ergebnisse der Plasmapherese bestimmt.
Ein deutlicher Verlust der Fluoreszenzintensitäten bei den Plasmapheresegruppen von 25% in
der Haut, 47% in Ohren, 24% in Pfoten und nur 3% in Tumor wurde in Abb. 27 dargestellt.
Im Tumor stieg bei der Kontrollgruppe die Fluoreszenzintensität nicht-signifikant wie
erwartet im Plasmapherese-Zeitraum leicht an (*, p(0,22)). Bis 36 h nach Gabe der
Liposomen, stieg bei der Kontrollgruppe die Fluoreszenzintensität weiter an. Die
79
Ergebnisse
Fluoreszenzintensität fiel danach bis 48 h noch leicht ab. Bei der Plasmapheresegruppe wurde
die plasmapherese 22 h nach Gabe der Liposomen durchgeführt. Direkt nach der
Plasmapherese wurde bei der Plasmapheresegruppe eine nicht-signifikante Abnahme der
Initialfluoreszenz (Fluoreszenz vor der Plasmapherese) von ~3% berechnet (Abb.27, Tumor
**, p(0,32)). Nach Abschluß der Plasmapherese betrug die Fluoreszenzintensität, der
Plasmapheresegruppe ~7% weniger als die Fluoreszenzintensität bei der Kontrollgruppe.
Diese Differenz von 7% war nicht signifikant (***, p(0,13)). In der Plasmapheresegruppe
blieb die Fluoreszenzintensität 12 und 24 h nach der Plasmapherese konstant.
In der Haut, wurde eine nicht-signifikante Abnahme der Fluoreszenzintensität bei der
Kontrollgruppe im Plasmapherese-Zeitraum von ~5% berechnet (*, p(0,09)). In der
Plasmapheresegruppe wurde eine signifikante Abnahme von ~25% berechnet (**, p<0,001).
Nach der Plasmapherese betrug die Fluoreszenzintensität bei der Plasmapheresegruppe ~20%
weniger als bei der Kontrollgruppe. Dieser Unterschied ist signifikant (***, p<0,001).
Wie schon oben erwähnt wurde, ähnelt sich die Anreicherung der Liposomen in der Haut und
Pfoten. In den Pfoten, wurde eine nicht-signifikante Abnahme der Fluoreszenzintensität bei
der Kontrollgruppe in der Plasmapherese-Zeitraum von ~4% berechnet (*, p(0,17)). In der
Plasmapheresegruppe wurde eine signifikante Abnahme von ~24% berechnet (**, p<0,001).
Direkt nach der Plasmapherese, betrug die Fluoreszenzintensität bei der Plasmapherese ~20%
weniger als bei der Kontrollgruppe. Dieser Unterschied ist signifikant (***, p<0,001).
Wie im Kapitel 3.3.4 erwähnt wurde, reichern sich Liposomen nicht in den Ohren wegen des
Knorpels an. Die gemessenen Fluoreszenzintensitäten stammten von der Fluoreszenz der
Liposomen in den Gefäßen. In den Ohren, blieben die Fluoreszenzintensitäten bei der
Kontrollgruppe
über
den
Plasmapherese-Zeitraum
identisch
(*,
p(0,91)).
In
der
Plasmapheresegruppe wurde eine signifikante Abnahme von ~47% berechnet (**, p<0,001).
Nach der Plasmapherese betrug die Fluoreszenzintensität bei der Plasmapheresegruppe ~48%
weniger als bei der Kontrollgruppe. Dieser Unterschied ist sehr signifikant (***, p<0,001). In
der Haut, Pfoten und Ohren nahmen die Fluoreszenzintensitäten sowohl bei der
Kontrollgruppe als auch bei der Plasmapheresegruppe mit der Zeit ab.
Der Effekt der Plasmapherese bei den tumortragenden Ratten erwies sich direkt nach der
Plasmapherese als signifikant in Bereich Haut, Ohren und Pfoten, nicht aber im
Tumorbereich. Somit lässt sich zeigen, dass die Plasmapherese einen starken Effekt auf Haut,
Ohren und Pfoten hat, aber nicht im Tumor. Allerdings reichern sich die Liposomen im
Tumor bei den Kontrolltieren noch geringfügig weiter an, da die maximale Anreicherung erst
80
Ergebnisse
später erreicht wird. Eine frühe Durchführung der Plasmapherese wäre negativ für die
Akkumulierung der Liposomen im Tumor.
81
Ergebnisse
82
Ergebnisse
Abbildung 27: Plasmapherese verringert die Fluoreszenzintensität der Liposomen in Haut, Ohr und
Pfote, aber nicht im Tumor.
Farbstoffmarkierte Liposomen wurden durch Extrusion hergestellt und den tumortragenden Ratten i.v. in einer
Endkonzentration von 4 mM PC im Plasma injiziert. Die Plasmapherese wurde 22 Stunden nach der
Liposomeninjektion durchgeführt. Die Fluoreszenz der Liposomen vor, unmittelbar nach, 12 h und 24 h nach der
Plasmapherese wurde analysiert. Die Fluoreszenzintensität vor Plasmapherese wurde auf 100% festgelegt. PWerte wurden mit einem zweiseitigen Student-t-test berechnet. Mittelwerte, Standardabweichungen und p-Werte
sind angegeben. (n=11 bei Kontrolle und n=9 bei Plasmapherese)
3.6 Therapieversuche
In diesen Abschnitt wurde untersucht, ob die Plasmapherese in Kombination mit einer PLDTherapie bei Krebs zu weniger Nebenwirkungen bei gleichbleibender Therapieeffizienz führt.
Die Plasmapherese wurde zuvor für die Kleinsäuger entwickelt und erfolgreich angewendet
(siehe Kap. 3.4). Im Kapitel 3.5 wurde gezeigt, dass im Tumor angereicherten Liposomen bei
der Plasmapherese nicht entfernt werden.
In
diesem
Abschnitt
wird
pegyliertes
liposomalen
Doxorubicin
(PLD)
anstatt
farbstoffmarkierte Liposomen angewendet. PLD mit seinem Wirkstoff DoxorubicinHydrochlorid wird als Standard-Chemotherapeutikum in der Behandlung von Karzinomen
angewendet. Um die Therapieeffizienz während der Therapie zu ermitteln, wurden die Ratten
mit Luziferase- Reportervektor transfizierten MAT B III-Zellen geimpft. Nach Erreichen
83
Ergebnisse
einer gewünschten Tumorgröße wurden die Ratten mit verschiedenen Konzentrationen von
PLD
mit
der
entwickelten
diskontinuierlichen
Plasmapherese
behandelt.
Die
Plasmahalbwertszeiten von verschiedenen PLD-Konzentrationen wurden zuerst untersucht.
Auf Grund der bereits erhaltenen Daten zur Anreicherungsgeschwindigkeit der Liposomen im
Tumor, konnte der Zeitpunkt für die Plasmapherese in verschiedenen Versuchsgruppen
festgelegt
werden.
Unter
Berücksichtigung
der
Plasmahalbwertszeiten
und
der
Anreicherungskinetik wurden verschiedene Therapieschemata untersucht.
3.6.1 Plasmahalbwertszeit von PLD
Die Plasmahalbwertszeiten von verschiedenen PLD Konzentrationen im Blutplasma der
Ratten wurden untersucht. PLD mit einer Konzentration von jeweils 4,5, 9 und 14 mg PLD/kg
KGW wurde den tumortragenden Ratten intravenös über die Schwanzvene appliziert. Die
Ratten haben diese Konzentrationen von PLD direkt nach ihrer Gabe im allgemein gut
vertragen.
Blutproben wurden nach verschiedenen Zeiten abgenommen, und die Fluoreszenzintensität
von Dox im Plasma wurde gemessen. Die Konzentration von PLD zum Zeitpunkt 5 min nach
Injektion wurde als 100% definiert.
In der Abbildung 28 ist die Menge von Dox in Plasma angegeben in Prozent der maximalen
Konzentration
gegen
die
Zeit
aufgetragen.
Dargestellt
sind
Mittelwerte
und
Standardabweichungen. Nach dem Levenberg-Marquardt-Algorithmus wurden die StandardFunktionen berechnet. Mit Hilfe der gefitteten Funktionen wurden die Halbwertszeiten der
verschiedenen PLD Konzentrationen berechnet.
84
Ergebnisse
Abbildung 28: Plasmahalbwertszeit von PLD.
Den tumortragenden Ratten wurden intravenös jeweils 4,5, 9 oder 14 mg PLD/kg KGW injiziert. Blutproben
wurden zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt, und die Fluoreszenz von Dox im Plasma wurde mit einem
Fluorometer gemessen. Eine exponentielle Konzentrationskurve wurde auf der Grundlage der Messwerte
bestimmt. Der Anteil der Liposomen im Plasma ist gegen die Zeit aufgetragen. Die Konzentration von PLD zum
Zeitpunkt 5 min nach Injektion wurde als 100% definiert. Dargestellt sind Mittelwerte, Standardabweichungen,
Korrelationskoeffizient und die Gleichung der Kurve. (n=6)
Die Plasmahalbwertszeit von 4,5 mg/kg KGW PLD betrug ~36 h [95% Konfidenzintervall
(KI) lag zwischen 34 und 39 h], die von 9 mg/kg KGW PLD ~52 h [95% KI (47 - 57 h)] und
die 14 mg/kg KGW PLD betrug ~78 h [95% KI (62 – 95 h]. Bei allen drei Konzentrationen
nahmen die Mengen von PLD im Plasma exponentiell mit der Zeit ab. Mit steigender
Konzentration stieg die Halbwertszeit von PLD im Plasma. Der zeitliche exponentielle Abbau
von PLD verlief wie bei den leeren Liposomen nach einer Reaktion 1. Ordnung. Im Vergleich
zu den leeren Liposomen mit einer in-vivo-Halbwertszeit von 29 h besitzt PLD jedoch eine
deutliche längere Plasmahalbwertszeit.
Eine Verdoppelung der PLD-Konzentration führte nicht zu einer Verdoppelung seiner
Halbwertszeit, dennoch ist die Halbwertszeit konzentrationsabhängig.
85
Ergebnisse
3.6.2 Therapie mit PLD
Verschiedene PLD-Konzentrationen wurden den tumortragenden Ratten nach Erreichen der
gewünschten Tumorgröße i.v. injiziert. Für die Versuche wurde ein syngenes Modell
ausgewählt. Die MAT B III-Zellen stammten von einer tumortragenden Ratte von demselben
Stamm. Durch diese Kompatibilität wuchsen die Tumoren ungehindert schnell heran. Die
diskontinuierliche Plasmapherese wurde jeweils 24, 36 und 48 h nach PLD-Injektion
durchgeführt. Die Tiere wurden meist solange beobachtet, bis eines der Abbruchkriterien
erreicht wurde. Beim Auftreten eines der Abbruchkriterien wie massivem Gewichtsverlust
von über 20% des Ausgangswertes, oder einer Zunahme des Tumorvolumens über 3 cm in
Länge, Breite oder Höhe, wurden die Tiere aus dem Versuch genommen und euthanasiert.
Die Tiere wurden auch getötet als keine positiven Veränderungen bezüglich der Therapie
mehr auftraten. Das Gewicht der Tiere, ihre Tumorgröße und ihr allgemeiner Zustand wurden
ständig kontrolliert. Die Messung der Tumorgröße erfolgte mit einem digitalen Messschieber.
Die Länge a, Breite b und Tiefe c wurden gemessen. Aus den gemessenen Werten von a, b
und c wurde die Größe der Tumoren mit der Formel a*b*c*errechnet. Mittels eines IVISCaliper wurde die Luziferaseexpression oder Aktivität in Tumorzellen der Ratten gemessen.
3.6.3 IVIS-Aufnahme der Luziferaseexpression bei den tumortragenden
Ratten nach einer PLD-Therapie in Kombination mit einer
Plasmapherese
Die Bilder stellen die Luziferaseaktivität in den Tumoren bei den tumortragenden Ratten nach
Luziferin-Injektion dar. Die MAT-BIII-Zellen wurden mit einem Luziferase-ReportervektorPlasmid transfiziert. Durch eine i.p. Injektion von Luziferin in Anwesenheit von Sauerstoff
emittieren die Zellen ein Signal. Dieses Biolumineszenzsignal wurde mit einem IVIS-CaliperGerät mit Hilfe einer Living Image Software 4.1 aufgenommen und ausgewertet (Saha et al.,
2011). Die Aufnahmen wurden direkt vor Therapiebeginn und zu verschiedenen Zeitpunkten
nach der Therapie durchgeführt. Bei der Auswertung wurden auf der Ratte zwei
Bildausschnitte (ROI) gewählt. Ein ROI wurde in den Tumorbereich gelegt, der andere in
einen Bereich der Tiere ohne Tumor, um die Lichtintensität des Bildhintergrundes zu messen.
Ein typischer Therapieverlauf zweier tumortragender Ratten wurde in Abb. 29 dargestellt. Die
beiden tumortragenden Ratten wurden mit 9 mg PLD/kg KGW behandelt. Bei einer Ratte
wurde zusätzlich eine Plasmapherese 36 h nach PLD-Therapie durchgeführt.
Vor der Therapie zeigten die Tumorzellen beider Ratten eine starke Luziferaseaktivität [Abb.
29]. Drei Tage nach der PLD-Behandlung, reduzierten sich die Signale der beiden Ratten um
86
Ergebnisse
fast die Hälfte. Am Tag 5 nach PLD-Therapie reduzierte sich das Signal bei der Kontrollratte
wieder um die Hälfte und blieb am Tag 8 stabil. Das Signal der Ratte, die mit Plasmapherese
behandelt wurde, blieb am 5 und 8 Tag nach PLD-Gabe dagegen fast gleich. Zum Ende des
Versuchs am 16. Tag nach Therapie war bei der Kontrollratte fast keine Luziferaseaktivität
mehr zu messen (nur noch ~2% des Anfangssignals). Bei der Ratte, die zusätzlich mit
Plasmapherese behandelt wurde, wurde nur noch ein schwaches Signal gemessen (~12% des
Anfangssignals).
In den markierten ROIs außerhalb des Tumorbereichs wurden nur leichte, vernachlässigbare
Schwankungen beobachtet.
87
Ergebnisse
Vor Therapie
Kontrolle
3 Tage nach Therapie
+ Plasmapherese
5 Tage nach Therapie
Kontrolle
+ Plasmapherese
Kontrolle
+ Plasmapherese
8 Tage nach Therapie
Kontrolle
+ Plasmapherese
88
Ergebnisse
12 Tage nach Therapie
Kontrolle
16 Tage nach Therapie
+ Plasmapherese
Kontrolle
+ Plasmapherese
Abbildung 29: Luziferaseexpression der Tumorzellen bei tumortragenden Ratten.
Tumortragenden Ratten wurden mit 9 mg PLD/kg KGW behandelt. Eine Ratte wurde zusätzlich mit der
Plasmapherese 36 h nach PLD-Gabe behandelt. Die IVIS-Aufnahmen wurden nach verschiedenen Zeitpunkten während der
Therapie durchgeführt nachdem unmittelbar vor Aufnahme Luziferin i.p. (150 mg/kg KGW) appliziert wurde. Die ROIs der
gewählten Regionen (Haut und Tumorregion) wurden ausgewertet. Für die Farbskala wurde der Bereich zwischen 1,00e4
und 1,00e5 [p/s/cm2/sr] gewählt. Typisches Beispiel.
3.6.4 Therapie mit 4,5 mg Dox/ kg Körpergewicht und Plasmapherese
nach 24 h
PLD wurde den tumortragenden Ratten einmalig in einer Konzentration von 4,5 mg Dox/ kg
KGW injiziert. Es wurden 2 Gruppen mit PLD (4,5 mg/kg KGW) behandelt. Eine Gruppe
wurde zusätzlich mit der Plasmapherese behandelt. Die Zeitspanne der üblichen
Behandlungsdauer
war
von
Therapieversuch
zu
Therapieversuch
unterschiedlich.
Therapieeffizienz und die Nebenwirkungen wurden ständig kontrolliert.
3.6.4.1 Rattengewicht
Die Abbildung 30 stellt die Variation des Rattengewichtes bei Behandlung mit oder ohne
Plasmapherese dar. Das Rattengewicht direkt vor Therapiebeginn wurde als 100% definiert.
89
Ergebnisse
In den ersten 5 Tagen zeigte sich kein Unterschied zwischen den beiden Kurven, der
Gewichtsverlust der Ratten beider Gruppen war identisch [Abb. 30]. Das Gewicht in der
Plasmapheresegruppe lag nur minimal unter dem Gewicht der Kontrollgruppe. Die
tumortragenden Ratten nahmen während dieser Zeit ~5% ihrer Anfangsgewichtes ab. Danach
nahm das Gewicht bei der Kontrollgruppe kontinuierlich ab [Abb. 30, rote Kurve]. Diese
Abnahme stabilisierte sich zwar 12 Tage nach der Therapie, aber keine Zunahme wurde
registriert. Bei der Gruppe, die mit Plasmapherese behandelt wurde, nahmen die Ratten schon
nach 8 Tagen kontinuierlich zu. Am Ende des Versuchs, 16 Tage nach Therapiebeginn, hatte
die Kontrollgruppe ~7,5% ihres Anfangsgewichtes verloren, die mit Plasmapherese
behandelten Ratten aber nur ~2%.
PLD bewirkte schon bei 4,5 mg Dox/kg KGW einen Gewichtsverlust bei den tumortragenden
Ratten. Die Plasmapherese führt zu weniger Gewichtsverlust bei Behandlung mit PLD.
Abbildung 30: Entwicklung des Rattengewichtes während der Therapie mit 4,5 mg PLD und
Plasmapheresis nach 24 h.
Jede Kurve repräsentiert den Gewichtsverlauf tumortragenden Ratten nach Behandlung mit PLD (4,5 mg
PLD/kg KGW). Eine Gruppe wurde zusätzlich mit Plasmapherese 24 h nach PLD-Injektion behandelt (blaue
Kurve) (n=4). Kontrollgruppe (n=3). Das Rattengewicht direkt vor Therapiebeginn wurde als 100% definiert.
Angegeben sind die Mittelwerte und Standardabweichungen.
90
Ergebnisse
3.6.4.2 Tumorvolumen
Während der Therapie wurde das Tumorvolumen mit Hilfe eines Digitalschiebers gemessen.
Durch ihre subkutane Lage konnten die Tumoren problemlos gemessen werden. Die Tumoren
wachsen unterschiedlich schnell. Das relative Tumorvolumen wurde in Prozent des
Anfangsvolumens
vor
Therapiebeginn
dargestellt.
Das
Tumorvolumen
direkt
vor
Therapiebeginn wurde als 100% definiert. Die gemessenen Daten der Tumorvolumina für die
jeweilige Gruppe sind in Abb. 31 dargestellt.
Bei der Kontrollgruppe, dargestellt durch die rote Linie in Abbildung 31, wurde eine
Stabilisierung des Tumorvolumens 5 Tage nach der Therapie festgestellt. Dies deutet auf eine
Wirkung von PLD hin. Dieses Gleichgewicht blieb 3 Tage erhalten, aber nach 8 Tagen
wuchsen die Tumoren wieder weiter. In der Gruppe, die zusätzlich mit Plasmapherese 24 h
nach PLD-Therapie behandelt wurde, wurde keine auffällige Wachstumsverzögerung
gemessen. Alle Gruppen haben die Therapien gut vertragen. Es wurde keine sichtbaren
Nebenwirkungen beobachtet.
Die Größe der Standardabweichungen wurde bedingt durch die unterschiedliche Tumorgröße,
das Tumorwachstum und die geringe Rattenzahl pro Gruppe beeinflusst. Zusätzlich sind
interindividuelle Unterschiede der Tiere zu berücksichtigen. Tumore wuchsen unterschiedlich
von Tier zu Tier auf.
Die zusätzliche Behandlung mit Plasmapherese nach 24 h bei 4,5 mg/kg KGW PLD führt zu
einer Verschlechterung der Therapiewirkung bezüglich des Tumorwachstums. Durch das
teilweise schnelle Wachstum der Tumoren und die Verkapselung vom Doxorubicin in den
Liposomen trat die therapeutische Wirkung von Doxorubicin erst ab dem 6. Tag nach
Behandlung ein.
91
Ergebnisse
Abbildung 31: Tumorwachstum nach Therapie mit 4,5 mg PLD/kg KGW und Plasmapherese nach 24 h.
Die Tumorgröße ist gegen die Tage nach der Behandlung aufgetragen. Die Kontrollgruppe wurde nur mit PLD
behandelt (n=3). Die zweite Gruppe erhielt zusätzlich eine Plasmapheresebehandlung 24 h nach PLD-Gabe
(n=4). Jede Kurve beschreibt den Verlauf der gemittelten Tumorgröße. Das Tumorvolumen direkt vor
Therapiebeginn
wurde
als
100%
definiert.
Angegeben
sind
die
arithmetische
Mittelwerte
und
Standardabweichungen.
3.6.4.3 Tumor-Luziferaseexpression
Mit Hilfe eines IVIS-Caliper-Geräts wurde die Luziferaseexpression der Tumorzellen nach
einer i.p. Luziferininjektion gemessen. Die Luziferaseexpression der Tumorzellen direkt vor
Therapiebeginn wurde als 100% definiert.
In der Abbildung 32 wurde die Luziferaseexpression der tumortragenden Ratten nach
Therapie dargestellt. Bei der Plasmapheresegruppe fiel die Luziferaseaktivität zunächst auf
unter ~80% in Vergleich zum Initialsignal 5 Tage nach der Therapie mit PLD ab, danach
blieb sie konstant auf ~75% an und fiel nach 13 Tagen wieder auf das Niveau der
Luziferaseexpression der Kontrollgruppe ab.
Bei der Kontrollgruppe [Abb. 32, rote Kurve] stieg die Luziferaseexpression zunächst 5 Tage
nach Therapie stark auf über ~150% in Vergleich zu Beginn an, bevor sie nach 9 Tage auf
~50% stark abnahm. Eine weitere Abnahme der Luziferaseaktivität der Tumorzellen auf unter
~35% des Initialsignals erfolgte 13 Tage nach der PLD-Gabe.
92
Ergebnisse
Die beiden Gruppen hatten am Tag 13 nach der Behandlung eine fast ähnliche
Luziferaseaktivität.
Abbildung 32: Tumor-Luziferaseexpression nach i.v.-Behandlung mit 4,5 mg PLD/kg KGW.
Die Kontrollgruppe erhielt nur 4,5 mg/kg KGW PLD (rote Kurve, n=3). Eine Gruppe wurde zusätzlich mit
Plasmapherese behandelt (blaue Kurve, n=4). Die Luziferaseexpression der Tumorzellen direkt vor
Therapiebeginn wurde als 100% definiert. Angegeben sind die Mittelwerte und Standardabweichungen.
3.6.5 Therapie mit 9 mg PLD/kg KGW und Plasmapherese nach 24, 36 und
48 h
Da bei niedrigerer Dosis keine gute Wirkung von PLD und keine vergleichbaren sichtbaren
Nebenwirkungen zu beobachten waren, wurde die PLD-Dosis von 4,5 mg auf 9 mg/kg KGW
erhöht. Aufgrund der langen Plasma-HWZ wurde die Plasmapherese nach 24, 36 und 48 h
durchgeführt.
3.6.5.1 Rattengewicht
Die Abbildung 33 stellt den Gewichtsverlauf von tumortragenden Ratten nach PLD-Therapie
mit oder ohne Plasmapherese dar. Vier verschiedene Gruppen wurden untersucht. Bis zum
Tag 8 nach PLD hatten die vier Gruppen einen ähnlichen Gewichtsverlauf. Die Kurven der
Plasmapheresegruppen verliefen leicht unter der Kurve der Kontrollgruppe.
93
Ergebnisse
In der Kontrollgruppe, die nur PLD bekam (rote Kurve, n=12), verloren die Ratten die ersten
14 Tage nach Therapie kontinuierlich an Gewicht. Erst 20 Tage nach der Behandlung
begannen die Ratten wieder an Gewicht zuzunehmen. Am Ende der Versuchen lag das
mittlere Gewicht bei ~90% ihrer Initialgewichtes.
In der zweiten Gruppe, wurde 24 h nach der i.v. Gabe von PLD eine Plasmapherese
durchgeführt (blauen Kurve (n=7)). Nach dem Gewichtsabfall in den ersten 8 Tagen fingen
die Ratten wieder an zuzunehmen. Am Ende der Therapie hatten die Ratten im Durchschnitt
sogar ~2% mehr Gewicht als zu Beginn der Therapie.
Bei der dritten Gruppe (orange Kurve, n=8), wurde die Plasmapherese 36 h nach PLD-Gabe
durchgeführt. Hier ähnelte der Gewichtsverlauf den von der Gruppe 2 mit Plasmapherese
nach 24 h. Am Ende des Versuchs nach 25 Tagen hatten die tumortragenden Ratten dieser
Gruppe 4% mehr Gewicht als zu Beginn.
Bei der Gruppe vier, mit Plasmapherese nach 48 h (magenta Kurve, n=3), nahmen die Ratten
deutlich schnell an Gewicht ab. Am Tag 9 nach Therapie hatten die Ratten ~20% ihres
Anfangsgewichtes verloren. Durch die lange Anreicherungszeit und die zusätzliche
Plasmapheresebelastung verloren die tumortragenden Ratten schnell an Gewicht und konnten
sich nicht schnell erholen. Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Abbruchskriterien
nur 9 Tage nach Therapiebeginn wegen starken Gewichtsverlustes euthanasiert.
Am Ende des Versuches zeigten die Plasmapheresegruppe 2 und 3 allgemein einen
signifikanten Gewichtsunterschied im Vergleich zu der Kontrollgruppe. Der p-Wert zwischen
der Gruppe, die mit Plasmapherese nach 24 h behandelt wurde und der Kontrollgruppe zeigt
einen signifikanten Unterschied des Gewichtes (p(0,021)<0,05). Zwischen der Gruppe, die
mit der Plasmapherese nach 36 h behandelt wurde und der Kontrollgruppe ist der Unterschied
stark signifikant (p(0,006)<0,01).
Obwohl die Belastung der Ratten durch die PLD-Gabe mittels Plasmapherese verringert
wurde, zeigten die Ratten der Plasmapheresegruppe erst nach etwa 8 Tage einer Stabilisierung
ihrer Gewichte. Ein Effekt der Plasmapherese auf die Gewichtsentwicklung stellvertretend für
die Gesamtbelastung des Organismus wurde somit festgestellt. Nach einer einmaligen PLDBehandlung (9 mg/kg KGW) nahmen tumortragenden Ratten zunächst leicht an Gewicht ab.
Die mit Plasmapherese behandelten Ratten 24 und 36 h nach PLD-Gabe erholte sich schneller
als unbehandelten Kontrollratten.
94
Ergebnisse
Abbildung 33: Entwicklung des Rattengewichtes während der PLD-Therapie mit 9 mg/kg KGW PLD und
Plasmapherese nach 24, 36 und 48 h.
Jede Kurve repräsentiert den Gewichtsverlauf von tumortragenden Ratten nach Behandlung mit PLD (9 mg/kg
KGW PLD). Vier Gruppen wurden untersucht. Die Kontrollgruppe erhielt nur PLD (rote Kurve, n=12). Gruppe
2 (n=7), Gruppe 3 (n=8) und Gruppe 4 (n=3) wurden zusätzlich mit Plasmapherese 24, 36 und 48 h jeweils nach
PLD-Injektion behandelt (blaue, orange und Magenta Kurven). Das Rattengewicht direkt vor Therapiebeginn
wurde als 100% definiert. * weist darauf hin, dass die Ratten aus den Versuchen herausgenommen und
euthanasiert wurden. Angegeben sind die Mittelwerte und Standardabweichungen.
3.6.5.2 Tumorvolumen
Die Abbildung 34 stellt den Verlauf der Tumorgröße bei den drei verschiedenen
Therapiegruppen dar. Das Volumen des Tumors vor der Therapie wurde als 100% definiert.
Die Therapie mit 9 mg PLD zeigte bezogen auf das Tumorvolumen allgemein einen deutlich
besseren Effekt als die Therapie mit 4,5 mg/kg KGW PLD.
In der Kontrollgruppe, die nur PLD erhielt (rote Kurve), stieg das Tumorvolumen 5 Tage
nach PLD-Gabe leicht an. Danach nahmen die Tumorvolumen bis zum Tag 15 nach der
Therapie ab und blieben danach stabil. In der zweiten Gruppe, bei der die tumortragenden
Ratten zusätzlich mit Plasmapherese 24 h nach Therapiebeginn behandelt wurden, zeigte sich
auch zunächst eine Steigerung des Tumorvolumens auf ~200% bis zu 8 Tage nach PLDBehandlung. Danach folgte eine Abnahme bis zum Tag 12. Danach begannen die Tumoren
wieder stark zu wachsen und erreichten am Ende über 200% ihres Initialvolumens. Bei der
dritten Gruppe wurde die Plasmapherese 36 h nach PLD-Injektion durchgeführt. Diese
95
Ergebnisse
Gruppe zeigte eine Verdoppelung des Tumorvolumens in den ersten Tagen nach Therapie,
gefolgt von einer schnellen Tumorreduktion auf ~150% bis zum Tag 8. Das Tumorvolumen
nahm dann progressiv ab wie bei der Kontrollgruppe bis zum Ende der Versuche. Bei der
Gruppe mit Plasmapherese nach 48 h nahm das Tumorvolumen sofort ab. Nach Tag 6 betrug
der Volumenverlust ~10% im Vergleich zum Beginn der Therapie. Am Tag 9 nach PLD
betrug das Tumorvolumen nur ~80 % des Initialvolumens. Die Ratten wurden wegen starken
Gewichtsverlusts euthanasiert.
Bei der mit Plasmapherese nach 36 h behandelten Gruppe verlief das Tumorwachstum fast
wie bei der Kontrollgruppe mit Ausnahme der ersten Tage der Therapie. Eine frühe
Durchführung der Plasmapherese (nach 24 h) führte zu einem schlechteren Therapieeffekt der
Plasmapherese bezüglich der Tumorgröße. Eine Plasmapherese nach 48 h führte zu einem
verstärkten Therapieeffekt, möglicherweise jedoch wegen der allgemeinen Schwächung der
Tiere durch die zusätzliche Belastung.
Abbildung 34: Tumorwachstum nach Therapie mit 9 mg/kg KGW PLD und Plasmapherese nach 24, 48
und 36 h.
Die Tumorgröße ist gegen die Tage nach der Behandlung aufgetragen. Vier Gruppen sind untersucht. Gruppe 1
erhielt nur PLD (rote Kurve, n=12). Gruppe 2 (n=7), Gruppe 3 (n=8) und Gruppe 4 (n=3) wurden zusätzlich mit
Plasmapherese 24, 36 und 48 h jeweils nach PLD-Injektion behandelt (blaue, orange und Magenta Kurven). Jede
Kurve beschreibt den Verlauf der Tumorgröße. Das Tumorvolumen direkt vor Therapiebeginn wurde als 100%
definiert. * weist darauf hin, dass die Ratten aus den Versuchen herausgenommen und euthanasiert wurden.
Angegeben sind die Mittelwerte und Standardabweichungen.
96
Ergebnisse
3.6.5.3 Tumor-Luziferaseexpression
An den vier oben genannten Gruppen wurde parallel die Luziferaseaktivität nach der PLDTherapie in Kombination mit Plasmapherese nach 24, 36 und 48 h gemessen.
Die Gruppen mit Plasmapherese nach 24 und 36 h zeigten zunächst einen leichten Anstieg der
Luziferaseexpression. Am Tag 8 nach der PLD-Therapie folgte bei den zwei genannten
Gruppen eine Reduktion der Luziferaseexpression auf ~50% der zu Beginn des Versuches
gemessenen Aktivität [Abb. 35]. Die stärkste Reduktion war bei der Gruppe zu beobachten,
die zusätzlich mit Plasmapherese nach 36 h behandelt wurde, danach folgte die Gruppe, bei
der die Plasmapherese 24 h nach PLD-Therapie durchgeführt wurde. Die Kontrollgruppe und
die Gruppe mit Plasmapherese nach 48 h zeigten zunächst einen ähnlichen Verlauf. Am Tag 5
betrug die Luziferaseexpression ~75% des Initialsignales bei der Kontrollgruppe und ~80%
bei der Gruppe mit Plasmapherese nach 48 h. Am Tag 9 fiel das Signal bei der Gruppe mit
Plasmapherese nach 48 h auf unter 20%. Die Ratten wurden dann jedoch wegen starken
Nebenwirkungen aus den Versuchen genommen. Ab Tag 9 zeigten die Kontrollgruppe und
die Gruppen mit Plasmapherese nach 24 und 36 h einen ähnlichen Verlauf. Die Unterschiede
der Luziferaseexpression der drei Gruppen lagen insgesamt im Bereich der Fehlertoleranz.
Auch hier zeigte die Durchführung der Plasmapherese nach 36 h eine etwas bessere
Wirksamkeit im Vergleich zu Plasmapherese nach 24 h und zu der Kontrollgruppe. Die
Gruppe mit Plasmapherese nach 48 h konnte leider aufgrund starken Gewichtsverlustes nicht
länger beobachtet werden.
97
Ergebnisse
Abbildung 35: Tumor-Luziferaseexpression nach Behandlung mit 9 mg/kg KGW PLD und
Plasmapherese.
Der Verlauf der Luziferaseaktivität der MAT B III-Luc-Zellen nach PLD Therapie ist dargestellt. Gruppe 1
erhielt nur PLD (rote Kurve, n=12). Gruppe 2 (n=7), Gruppe 3 (n=8) und Gruppe 4 (n=3) wurden zusätzlich mit
Plasmapherese 24, 36 und 48 h jeweils nach PLD-Injektion behandelt (blaue, orange und magenta Kurven). Die
Luziferaseexpression der Tumorzellen direkt vor Therapiebeginn wurde als 100% definiert. * weist darauf hin,
dass die Ratten aus den Versuchen herausgenommen und euthanasiert wurden. Angegeben sind die Mittelwerte
und Standardabweichungen.
3.6.6 Therapie mit 14 mg PLD/ kg Körpergewicht und Plasmapherese nach
36 h
Nachdem gezeigt wurde, dass die Durchführung der Plasmapherese 36 h nach Gabe von PLD
der idealer Zeitpunkt als nach 24 h oder nach 48 h war, wurde geprüft, ob eine Erhöhung der
PLD-Konzentration im Plasma auf 14 mg in Kombination mit der Plasmapherese nach 36 h
einen Vorteil bringen kann. Die Plasma-HWZ von 14 mg/kg KGW PLD in vivo beträgt 78 h.
Zwei Gruppen wurden gebildet. Die Kontrollgruppe erhielt nur 14 mg/kg KGW PLD, an der
zweiten Gruppe wurde zusätzlich nach 36 h eine Plasmapherese durchgeführt.
98
Ergebnisse
3.6.6.1 Rattengewicht
Das Gewicht der Ratten bei der Kontrollgruppe (rote Kurve) sank schnell und stark ab. Am
Tag 11 nach der Therapie hatten die Ratten der Kontrollgruppe ~20% ihres Initialgewichtes
verloren, so dass sie in Anbetracht der Abbruchskriterien aus den Versuchen genommen
wurden (siehe Stern) [Abb. 36]. Die Gruppe, die zusätzlich mit einer Plasmapherese behandelt
wurde, verlor zunächst geringfügig mehr Gewicht (Tag 5). Dies deutet auf eine zusätzliche
mögliche Belastung durch die Plasmapherese hin, wie bereits im vorhergehenden Kapitel
besprochen wurde. Ab Tag 11 wurde jedoch eine leichte Zunahme der tumortragenden Ratten
an Gewicht registriert. Am Ende der Versuche am Tag 29 hatten die tumortragenden Ratten
der Plasmapheresegruppe wieder 90% ihres Anfangsgewichtes.
Trotz einer kurzfristigen Mehrbelastung, konnte langfristig ein deutlicher positiver Effekt der
Plasmapherese beobachtet werden.
Abbildung 36: Entwicklung des Rattengewichtes während der Therapie mit 14 mg/kg KGW PLD mit
Plasmapherese nach 36 h.
Tumortragenden Ratten wurden mit PLD (14 mg PLD/kg KGW) behandelt. Kontroll- und Plasmapheresegruppe
sind dargestellt. Die Kontrollgruppe erhielt nur PLD (rote Kurve, n=5). Die Plasmapheresegruppe (n=7) wurde
zusätzlich mit Plasmapherese 36 h nach PLD-Injektion behandelt (blaue Kurve). * weist darauf hin, dass die
Ratten aus den Versuchen herausgenommen und euthanasiert wurden. Das Rattengewicht direkt vor
Therapiebeginn wurde als 100% definiert. Angegeben sind die Mittelwerte und Standardabweichungen.
99
Ergebnisse
3.6.6.2 Tumorvolumen
Die Abbildung 37 stellt die Entwicklung der Tumorgröße während der Therapie mit 14 mg
PLD/kg KGW in Kombination mit oder ohne Plasmapherese dar. Während der ersten 5 Tage
nach der Therapie zeigten die Kontroll- und Plasmapheresegruppen ein ähnliches
Tumorwachstum. Die Volumen der Tumore stiegen auf über 250%. Danach begannen die
Tumoren der Kontrollgruppe sich langsam zu verkleinern bis zu Tag 11 nach PLD-Gabe.
Aufgrund des starken Gewichtsverlusts wurden die Ratten aus dem Versuch genommen.
Auch bei der Gruppe, die zusätzlich mit Plasmapherese behandelt wurde, fing die
Tumorgröße nach dem Tag 5 an, sich schnell zu verkleinern. Ab Tag 8 nach PLD-Gabe folgte
eine Abnahme des Volumens bis zu Tag 22. Ab Tag 22 folgte dann ein erneutes Wachstum
der Tumoren. Trotz Abnahme der Tumorvolumina während der Therapie blieben die
Tumoren immer größer als zu Beginn der Therapie.
Abbildung 37: Tumorwachstum nach Therapie mit 14 mg/kg KGW PLD ohne und mit Plasmapherese
nach 36 h. Die Tumorgröße ist gegen die Tage nach der Behandlung aufgetragen. Zwei Gruppen wurden
untersucht. Gruppe 1 erhielt nur PLD (rote Kurve, n=5). Gruppe 2 (n=7) wurde zusätzlich mit Plasmapherese 36
h nach PLD-Injektion behandelt (blaue Kurve). * weist darauf hin, dass die Ratten aus den Versuchen
herausgenommen und euthanasiert wurden. Das Tumorvolumen direkt vor Therapiebeginn wurde als 100%
definiert. Angegeben sind die Mittelwerte und Standardabweichungen.
100
Ergebnisse
3.6.6.3 Tumor-Luziferaseexpression
Mit Hilfe eines IVIS-Caliper-Geräts wurde die Luziferaseexpression der Tumorzellen bei der
Therapie mit 14 mg/kg KGW PLD gemessen.
Sowohl die Kontrollgruppe, die nur PLD erhielt, als auch die Gruppe, die zusätzlich zur PLDGabe mit der Plasmapherese behandelt wurde, zeigten einen ähnlichen Verlauf. Bis zum Tag
11 nach PLD-Gabe wurde ein starker Rückgang der Luziferaseexpression der Tumorzellen in
den beiden Gruppen festgestellt [Abb. 38]. Bei der Plasmapheresegruppe nahm das Signal
weiterhin ab, bis zu einem fast totalen Verlust nach Tag 16. Am Tag 11 wurde die
Kontrollgruppe wegen starken Gewichtsverlustes aus dem Versuch genommen. Die hohen
Standardabweichungen deuten auf die interindividuellen Unterschiede.
Abbildung 38: Tumor-Luziferaseexpression nach Behandlung mit 14 mg PLD/kg KGW mit
Plasmapherese nach 36 h.
Zwei Gruppen sind dargestellt. Die Kontrollgruppe erhielt nur PLD (rote Kurve, n=5). Die Plasmapheresegruppe
(n=7) wurde zusätzlich mit Plasmapherese 36 h nach PLD-Injektion behandelt (blaue Kurve). Der Stern deutet
dass, die Gruppe aus dem Versuch genommen wurde. Die Luziferaseexpression der Tumorzellen direkt vor
Therapiebeginn wurde als 100% definiert. Angegeben sind die Mittelwerte und Standardabweichungen.
101
Ergebnisse
3.7 Nebenwirkungen der tumortragenden Ratten nach PLD-Therapie in
Kombination mit der Plasmapherese
Eine Therapie mit hoher PLD-Dosis ist meist begleitet von starken Nebenwirkungen. Um das
Ausmaß der sichtbaren Nebenwirkungen und die Auswirkungen der Plasmapherese zu zeigen,
wurden die tumortragenden Ratten der Kontroll- und Plasmapheresegruppe während der
Therapie mit PLD mit Hilfe einer Digitalkamera zu verschiedenen Zeitpunkten fotografiert.
Die Kontrollratten erhielten nur eine PLD-Therapie. Die andere Gruppe wurde wie bereits
beschrieben, zusätzlich zur PLD-Therapie mit der Plasmapherese behandelt. Um einen
besseren Vergleich der Nebenwirkungen zu ermöglichen, gehörten die abgebildeten Ratten
immer zu
derselben
Versuchsreihe.
Eine
Kontrollratte wurde
immer mit
einer
Plasmaphereseratte gepaart. Sie erhielten in derselben Zeit die PLD-Therapie.
Auf den unteren Abbildungen sind die häufigen sichtbaren Nebenwirkungen dargestellt. Die
am meisten betroffenen Regionen sind Haut, Augen, Pfoten und Genitalregionen. Diese
sichtbaren und messbaren Nebenwirkungen halfen die Wirkung der Plasmapherese besser zu
beurteilen. Die Nebenwirkungen sind abhängig von der PLD-Konzentration und treten
unterschiedlich stark und an unterschiedlichen Tagen auf.
Die meisten dieser Nebenwirkungen sind reversibel. Die tumortragenden Ratten mit starken
Nebenwirkungen wurden sofort euthanasiert.
3.7.1 Hautrötungen
Die in den ersten Tagen nach der PLD-Therapie zuerst zu beobachtende Nebenwirkung war
die Hauttoxizität. Die Bilder zeigen Kontrollratten und tumortragende Ratten, die mit
Plasmapherese behandelt wurden [Abb. 39]. Die tumortragenden Ratten wurden vor
Therapiebeginn auf ihrer linken Körperseite rasiert. Dadurch wurden die Tumoren mit Hilfe
eines digitalen Messschiebers besser messbar, und die Hautrötungen wurden besser
dargestellt. Die Kontrollratten zeigten extreme Hautrötungen [Abb. 39 A, B und C, siehe
Pfeil]. Diese Rötungen waren bei den mit Plasmapherese behandelten Ratten nicht zu sehen.
Die starken Hautrötungen deuten auf eine starke Akkumulation von PLD in der Haut hin. Die
Hautrötungen traten schon 5 Tage nach der Behandlung mit PLD auf und blieben circa 14
Tage erhalten. Hautrötungen werden auch beim Menschen beobachtet.
Das Haarwachstum war schneller bei den Ratten, die mit Plasmapherese behandelt wurden,
als den Kontrollratten [Abb. 39 D]. Die Haare fingen erst wieder zu wachsen an als die
Rötung von PLD auf der Haut verschwunden war. Bei den Kontrollratten verzögerte sich das
Wachstum um eine bis zwei Woche.
102
Ergebnisse
A
Kontrolle
+ Plasmapherese
B
Kontrolle
+ Plasmapherese
103
Ergebnisse
C
Kontrolle
+ Plasmapherese
D
+ Plasmapherese
Kontrolle
Abbildung 39: Anreicherung von PLD in der Haut der tumortragenden Ratten und Haarwachstum nach
PLD-Therapie.
A, B und C) Pfeilen zeigen Regionen, die von Nebenwirkungen stark betroffen sind, auf der Kontrollratte nach
einer einmaligen PLD-Therapie (9 mg/kg KGW). Das untere Bild (B) zeigt das Haarwachstum der Ratten.
Typisches Beispiel.
104
Ergebnisse
3.7.2 Verkrustungen in Pfoten, Mund und Augenbereich (nach circa 14
Tagen)
Die Verkrustungen im Mund-, Pfoten- und Augenbereich traten ungefähr 8 Tage nach
Therapie nur bei der Kontrollratte auf [Abb. 40 A, B, C und D]. Die Bereiche sind auf den
Bildern mit Pfeilen markiert. Die Ratte, die mit der Plasmapherese behandelt wurde, hatte
wenig oder gar keine Verkrustungen. Auch diese Nebenwirkungen waren dosisabhängig. Den
bedrohlichen Verkrustungen im Pfotenbereich entsprachen beim Menschen die Palmarplantare Erythrodysästhesie (PPE) [Abb. 40 A und B]. Die PPE trat an stark beanspruchten
Regionen auf. Die Verkrustungen im Mundbereich führten wahrscheinlich zu einer Reduktion
der Nahrungsaufnahme und zu einer Gewichtsreduktion [Abb. 40 C].
Im Augenbereich war von der trockenen Verkrustung meist das Augenlid betroffen [Abb. 40
D].
Die Verkrustungen waren reversibel, sie verschwanden bereits circa 10 Tage nach ihrer
Entstehung.
A
Kontrolle
+ Plasmapherese
105
Ergebnisse
B
Kontrolle
C
+ Plasmapherese
Kontrolle
106
Ergebnisse
D
+ Plasmapherese
Kontrolle
E
+ Plasmapherese
Kontrolle
Abbildung 40: Verkrustungen in Pfoten (A und B), Mund (C) und Augenbereich (D und E) nach PLDTherapie.
Pfeile zeigen Regionen, die von Nebenwirkungen stark betroffen sind, auf der Kontrollratte nach einer
einmaligen PLD-Therapie (9 mg/kg KGW). Typisches Beispiel.
107
Ergebnisse
3.7.3 Nässe im Genitalbereich
Nebenwirkungen traten auch im Bereich des Urogenitaltraktes der Ratten 14 Tage nach PLDGabe auf [Abb. 41 A und B]. Hier war Nässe um den Urogenitaltrakt zu beobachten, wie bei
der linken Kontrollratte zu sehen ist. Bei der mit Plasmapherese behandelten Ratte war diese
Nässe nur schwach ausgeprägt.
A
Kontrolle
+ Plasmapherese
B
+ Plasmapherese
Kontrolle
Abbildung 41: A und B. Nässe im Genitalbereich nach PLD-Therapie.
Pfeile zeigen Regionen, die von Nebenwirkungen stark betroffen sind, auf der Kontrollratte nach einer
einmaligen PLD-Therapie (9 mg/kg KGW). Typisches Beispiel.
108
Ergebnisse
3.7.4 Langfristige Nebenwirkungen
Circa 30 Tage nach PLD-Therapie waren noch optische Unterschiede zwischen der
Kontrollratte und der Ratte, die zusätzlich mit der Plasmapherese behandelt worden ist,
festzustellen. Die Zonen sind mit Pfeilen markiert. Auf der Abb. 42 ist eine Veränderung im
Bereich der Schnauze zu sehen. In diesem Bereich wuchs kein Fell mehr.
Kontrolle
+ Plasmapherese
Abbildung 42. Bleibende Nebenwirkungen nach PLD-Therapie.
Pfeile zeigen Regionen, die von Nebenwirkungen stark betroffen sind, auf der Kontrollratte nach einer
einmaligen PLD-Therapie (9 mg/kg KGW). Typisches Beispiel.
Anhand der Abbildungen lässt sich festhalten, dass bei der tumortragenden Ratte, die
zusätzlich mit der Plasmapherese behandelt worden ist, deutlich schwächer ausgeprägte
Nebenwirkungen auftraten als bei der Kontrollratte nach einer einmaligen PLD-Therapie.
3.7.5 Einfluss von Plasmapheresebehandlung auf die auftretenden
Nebenwirkungen nach Behandlung mit PLD
In Tabelle 4 wurden die Zahl der betroffenen tumortragenden Ratten mit entsprechenden
Nebenwirkungen nach Therapie mit PLD und Plasmapherese dargestellt. Nebenwirkungen
wurden nach den definierten Einteilungskriterien bewertet.
Wie in Kapitel 3.6.4 erwähnt wurde, wurde nach Gabe von 4,5 mg PLD/kg KGW sowohl bei
Kontrollratten (n=3) als auch bei den Ratten die zusätzlich mit Plasmapherese (n=4) behandelt
wurde, fast keine Nebenwirkungen beobachtet [Tab. 4].
In der Gruppe mit 9 mg PLD/kg KGW wurden bei allen Tieren der Kontrollgruppe (n=12),
die aufgelisteten
Nebenwirkungen
beobachtet.
Bei
der Plasmapheresegruppe,
mit
109
Ergebnisse
Plasmapherese nach 24 h (n=7) waren nur PPE zu beobachten und, die waren milder als bei
der Gruppe mit Plasmapherese nach 36 und 48 h. Bei der Plasmapheresegruppe nach 36 h
(n=8) waren alle Nebenwirkungen schwach ausgeprägt bis nicht vorhanden. Bei der Gruppe
mit Plasmapherese nach 48 (n=3), wurden alle Nebenwirkungen wie bei der Kontrollgruppe
beobachtet. Bei der geringeren Rattenzahl ist es allerdings schwer eine deutliche Aussage zu
machen.
In der Gruppe mit der Konzentration von 14 mg/kg KGW PLD waren die Nebenwirkungen in
der Kontrollgruppe (n=5) sehr stark. Nach der zusätzlichen Behandlung mit der
Plasmapherese nach 36 h (n=7) waren die zwar Nebenwirkungen noch vorhanden, sie waren
allerdings nur mäßig ausgeprägt.
110
Ergebnisse
Tabelle 4: Einfluss von Plasmapherese auf den auftretenden Nebenwirkungen von PLD
Die
Auftretenswahrscheinlichkeit
Verschiedenen
Nebenwirkungen
nach
PLD
ist
eingetragen.
Einteilungskriterien (außer bei Haarwachstumsverzögerung): + leicht ausgeprägt (bei genauer Untersuchung
detektierbar), ++ Mittel ausgeprägt (deutlich sichtbar), +++ schwerwiegende ausgeprägt (Verschlechterung führt
zu Abbruch), ++++ Abbruch. K= Kontrolle; PL= Plasmapherese
Neben-
PPE
wirkungen
Augen
Nässe
Hautrötungen
Verkrustungen
Genitalbereich
Haarwachstums
-verzögerung
Nach Rasur
K
PL
K
PL
K
PL
K
PL
K
PL
4,5 mg/kg KGW
+0
+0
+0
+0
+0
+0
+0
+0
0
0
PLD +
++ 0
++ 0
++ 0
++ 0
++ 0
++ 0
++ 0
++ 0
Plasmapherese
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
9 mg/kg KGW
+0
+2
+0
+0
+ 12
+0
+0
+0
12
3
PLD +
++ 12
++ 0
++ 12
++ 0
++ 0
++ 0
++ 12
++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
9 mg/kg KGW
+0
+3
+0
+2
+ 12
+2
+0
+3
12
2
PLD +
++ 12
++ 0
++ 12
++ 0
++ 0
++ 0
++ 12
++ 1
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
9 mg/kg KGW
+0
+1
+0
+0
+ 12
+3
+0
+0
12
2
PLD +
++ 12
++ 1
++ 12
++ 1
++ 0
++ 0
++ 12
++ 3
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
+++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
14 mg/kg KGW
+0
+0
+0
+0
+0
+0
+0
+0
5
7
PLD +
++ 0
++ 7
++ 0
++ 7
++ 0
++ 7
++ 0
++ 5
+++ 5
+++ 0
+++ 5
+++ 0
+++ 5
+++ 0
+++ 5
+++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
++++ 0
Therapie
nach 24 h
Kontrolle n=3
Plasmapherese n=4
Plasmapherese
nach 24 h
Kontrolle n=12
Plasmapherese n=7
Plasmapherese
nach 36 h
Kontrolle n=12
Plasmapherese n=8
Plasmapherese
nach 48 h
Kontrolle n=12
Plasmapherese n=3
Plasmapherese
nach 36 h
Kontrolle n=5
Plasmapherese n=7
111
Ergebnisse
3.8 Blutanalyse
Um Blutparameter zu analysieren, wurde den tumortragenden Ratten zu verschiedenen
Zeitpunkten vor und nach der Therapie Blut entnommen. Mit Hilfe eines vollautomatischen
Analysengeräts von Typ Sysmex XE 2100 wurde ein Blutprofil hergestellt. Für die Messung
wurden 200 µl Blut benötigt.
Die Tabelle 5 stellt die Blutparameter einer Kontrollgruppe, die mit 9 mg PLD/kg KGW
behandelt worden ist, und einer Plasmapheresegruppe, die zusätzlich zu 9 mg PLD/kg KGW
noch mit Plasmapherese 36 h nach PLD-Gabe behandelt worden ist, dar. Folgende Parameter
wurden gemessen: WBC (weiße Blutkörperchen (Leukozyten)), RBC (rote Blutkörperchen
(Erythrozyten)),
HGB
Erythrozytenvolumen),
(Hämoglobin),
MCH
(Mittleres
HCT
(Hämatokrit),
corpuskuläres
MCV
Hämoglobin),
(Mittleres
MCHC
(Hämoglobingehalt pro Erythrozyt), PLT (Blutplättchen oder Thrombozyten).
112
Ergebnisse
3.8.1 Blutparameter vor Therapie
Vor der Therapie waren die gemessenen Parameter der Kontrollgruppe sowie der
Plasmapheresegruppe fast identisch und befanden sich im normalen Bereich [Tab. 5].
Tabelle 5: Blutparameter vor Therapie mit PLD (9 mg PLD/kg KGW). Mittelwerte und
Standardabweichungen sind eingetragen. (Standardabweichungen sind in den Klammern). Grün-markiert sind
die Normalwerte. (n=3)
Blutparameter
Kontrollgruppe
+ Plasmapherese
Normalwerte Ratte
WBC (weiße
12,27 x 103 (4,9 x 103)
13,4 x 103 (4,52 x 103)
6 - 18 x 103 /µl
8,15 x 106 (0,45 x 106)
7,62 x 106 (1,89 x 106)
5 - 10 x 106
HGB (Hämoglobin) g/dl
15,1 (0,89)
14 (3,52)
11 - 19,2 g/dl
HCT (Hämatokrit) %
42,9 (1,23)
40,1 (9,16)
36 - 57%
MCV (Mittleres
52,7 (1,68)
52,8 (1,64)
46 - 65 fl
18,5 (0,265)
18,4 (0,17)
18 - 23 pg
35,2 (1,42)
34,9 (1,4)
31 - 40 g/dl
640 x 103 (67 x 103)
729 x 103 (228 x 103)
200 - 1500 x 103 /µl
Blutkörperchen
Leukozyten) /µl
RBC (rote
Blutkörperchen
Erythrozyten)/µl
Erythrozyten-volumen) fl
MCH (Mittleres
korpuskuläres
Hämoglobin) pg
MCHC
(Hämoglobingehalt pro
Erythrozyt) g/dl
PLT (Blutplättchen oder
Thrombozyten) / µl
3.8.2 Blutparameter 6 Tage nach der Therapie
Am Tag 6 nach PLD-Gabe oder 4,5 Tage nach der Plasmapherese betrug die Zahl der weißen
Blutkörperchen (Leukozyten) bei der Kontrollgruppe und Plasmapheresegruppe jeweils nur
113
Ergebnisse
noch ~66 und ~39% ihren jeweiligen Initialwerten vor Therapie. Die Zahl der
Thrombozytenzahl bei der Plasmapheresegruppe blieb identisch und bei der Kontrollgruppe
wurde ein Abfall von ~20% gemessen. Bei der Kontrollgruppe hielten sich die anderen
Parameter stabil. Bei der Plasmapheresegruppe fielen zusätzlich noch RBC, HGB und HCT
auf etwa die Hälfte [Tab. 6]. Einen Grund für den niedrigen RBC-Wert könnte ein leichter
Blutverlust bei der Plasmapherese sein. Die Zahl der RBC hängt mit HGB und HCT
zusammen. Der Abfall der RBC-Zahl führte bei gleichbleibenden MCHC zu einer Abnahme
von HGB-gehalt und HCT.
Tabelle 6: Blutparameter vor Therapie mit PLD (9 mg PLD/kg KGW). Mittelwerte und
Standardabweichungen sind eingetragen. (Standardabweichungen sind in den Klammern). Grün-markiert sind
die Normalwerte; Rot-markiert sind die Außer dem Normalbereich. (n=3).
Blutparameter
Kontrollgruppe
+ Plasmapherese
Normalwerte Ratte
WBC (weiße
8,09 x 103 (3,76 x 103)
5,12 x 103 (4,6 x 102)
6 - 18 x 103 /µl
8,12 x 106 (1,14 x 106)
4,21 x 106 (7,58 x 105)
5 - 10 x 106
HGB (Hämoglobin) g/dl
14,6 (2,05)
7,67 (1,75)
11 - 19,2 g/dl
HCT (Hämatokrit) %
42,6 (5,67)
23,3 (6,44)
36 - 57%
MCV (Mittleres
52,5 (0,436)
54,9 (5,22)
46 - 65 fl
17,9 (015)
18,1 (0,945)
18 - 23 pg
34,2 (0,55)
33,1 (1,6)
31 - 40 g/dl
507 x 103 (224 x 103)
704 x 103 (407 x 103)
200 - 1500 x 103 /µl
Blutkörperchen
Leukozyten) /µl
RBC (rote
Blutkörperchen
Erythrozyten)/µl
Erythrozyten-volumen) fl
MCH (Mittleres
korpuskuläres
Hämoglobin) pg
MCHC
(Hämoglobingehalt pro
Erythrozyt) g/dl
PLT (Blutplättchen oder
Thrombozyten) / µl
114
Ergebnisse
3.8.3 Blutparameter 15 Tage nach der Therapie
Bis zum Tag 15 nach Therapie stieg die Zahl der WBC bei beiden Gruppen im Vergleich zu
den Werten vor der Therapie und am Tag 6 nach Therapie stark an. Die Zahl der WBC bei
den beiden Gruppen war fast gleich. Die Zahl der RBC bei der Kontrollgruppe war
geringfügig höher als bei der mit Plasmapherese behandelten Gruppe. Bei der Kontrollgruppe
war die RBC-Zahl im Vergleich zu den Blutparametern 6 Tage nach der Therapie leicht
zurückgegangen. Bei der Plasmapheresegruppe ist die RBC-Zahl gestiegen [Tab. 7].
Das Hämoglobingehalt war bei der Plasmapheresegruppe wieder angestiegen auf einen
normalen Wert. Ein Anstieg von ~40% wurde registriert im Vergleich mit dem HGB-gehalt
am Tag 6 nach Therapie. Diese Werte lagen im Normalbereich. Der HGB-Gehalt bei der
Kontrollgruppe lag am Tag 15 nach der Therapie ~9% niedriger als am Tag 6. Diese HGBGehalt-Abnahme bei der Kontrollgruppe führte wahrscheinlich zu einer Abnahme des
Hämatokrits um ~12%. Die Hämatokritwerte sowohl von der Kontrollgruppe als auch von
der Plasmapheresegruppe lagen wieder im Normalbereich.
Eine starke Zunahme der Thrombozytenzahl wurde bei beiden Ratten gemessen. Die Zahl der
Thrombozyten verdoppelte sich bei der Kontrollgruppe und Plasmapheresegruppe.
115
Ergebnisse
Tabelle 7: Blutparameter 15 Tage nach Therapie mit PLD (9 mg PLD/kg KGW). Mittelwerte und
Standardabweichungen sind eingetragen. (Standardabweichungen sind in den Klammern). Grün-markiert sind
die Normalwerte; Rot-markiert sind die Außer dem Normalbereich. (n=3).
Blutparameter
Kontrollgruppe
+ Plasmapherese
Normalwerte Ratte
WBC (weiße
21,8 x 103 (8,67 x 103)
20,3 x 103 (1,1 x 103)
6 - 18 x 103 /µl
6,91 x 106 (0,78 x 106)
5,5 x 106 (1,33 x 106)
5 - 10 x 106
HGB (Hämoglobin) g/dl
12,4 (0,7)
11,6 (3,18)
11 - 19,2 g/dl
HCT (Hämatokrit) %
36,3 (1,7)
36,5 (6,79)
36 - 57%
MCV (Mittleres
52,8 (0,354)
66,8 (3,82)
46 - 65 fl
18 (0,99)
20,9 (0,7)
18 - 23 pg
34,2 (0,354)
31,4 (2,9)
31 - 40 g/dl
983 x 103 (274 x 103)
1170 x 103 (465 x 103)
200 - 1500 x 103 /µl
Blutkörperchen
Leukozyten) /µl
RBC (rote
Blutkörperchen
Erythrozyten)/µl
Erythrozyten-volumen) fl
MCH (Mittleres
korpuskuläres
Hämoglobin) pg
MCHC
(Hämoglobingehalt pro
Erythrozyt) g/dl
PLT (Blutplättchen oder
Thrombozyten) / µl
Die Analyse der Blutparameter tumortragenden Ratten nach PLD-Therapie in Kombination
mit und ohne Plasmapherese zeigte keinen Nachteil der Plasmapherese am Ende der
Versuche. Am Tag 6 nach der PLD-Therapie wurde bei den Ratten, die zusätzlich mit der
Plasmapherese behandelt worden waren, eine Abnahme des HGB-Gehalts und des HCT
registriert. Am Tag 15 waren die beiden Werte sowie alle anderen Parameter wieder im
normalen Bereich.
116
Ergebnisse
3.9 Verkürzung der Anreicherungszeit
Wie schon gezeigt wurde, werden die bereits im Tumor angereicherten Partikeln bei der
Plasmapherese nicht entfernt (Abs. 3.5). Die maximale Anreicherungszeit der Liposomen in
Tumor wurde bei 41 h ermittelt.
Liposomen reichern sich schneller im Tumor an als in anderen Geweben in deren
Nebenwirkungen auftreten. Eine weitere Verkürzung der Anreicherungszeit der Liposomen
im Tumor und die Irreversibilität der Liposomen Anreicherung in Tumor könnten eine frühe
Blutwäsche ermöglichen. Eine frühe Plasmapherese könnte zu einer schnellen Entfernung der
überschüssigen Liposomen in Kreislauf und wahrscheinlich zu deutlich weniger
Nebenwirkungen führen, ohne dass die Akkumulation in Tumor oder die Therapie betroffen
ist. Verschiedene Möglichkeiten zu einer spezifischen Steigerung der Akkumulation der
Liposomen im Tumor wurden bereits beschrieben (Li et al., 198; Hori et al., 1985). In dieser
Arbeit wurden der Effekt von Angiotensin II (AT-II) und das Peptid Cyclo(D-alpha-aspartylL-prolyl-D-valyl-L-leucyl-D-tryptophyl
auch
BQ-123
(ein
Endothelin
Rezeptor
A
Antagonist) genannt, sowie die Steigerung der körperlichen Aktivität untersucht.
3.9.1 Verkürzung der Anreicherungszeit durch AT-II
AT-II
führt
durch
seine
blutdrucksteigende
Wirkung
zu
einer
Steigerung
des
Tumorblutflusses (K. Hori et al., 1985, 1992). Durch die Steigerung des Stromflusses können
mehr Partikeln durch das löchrige Endothel ins Tumorgewebe diffundieren (Maeda, 2001;
Nagamitsu et al., 2009). AT-II führt durch fehlende glatte Muskulatur in schnell wachsenden
Tumoren zu einer passiven Dilatation in den Blutgefäßen in den Tumoren.
3.9.1.1 Blutdruckmessung nach AT-II Applikation
Mittels eines Blutdruckmessgerätes speziell für kleine Tiere wurde der Blutdruck vor und
während der AT-II Gabe gemessen. AT-II mit einer Konzentration von 20 µg AT-II in 1 ml
NaCl wurde den Ratten manuell i.v. gespritzt. Die komplette AT-II Applikation dauerte ~1 h.
Jede Injektion ist durch eine Erhöhung des Blutdruckes gekennzeichnet. SBP (Systolischer
Blutdruck), DBP (Diastolischer Blutdruck) und MBP (Mittlerer Blutdruck) wurden vor und
während AT-II-Gabe gemessen. Die Messungen erfolgten im Abstand von jeweils einer
Minute. AT-II wurde an den mit Isofluran betäubenden Ratten über die Schwanzvene
appliziert.
Vor AT-II Gabe lagen die systolischen Blutdruckwerte zwischen ~60 und ~90 mmgHg und
die diastolischen Werte zwischen ~48 und ~65 mmHg. Ein deutlicher Anstieg des
117
Ergebnisse
Blutdruckes war nach jeder AT-II-Injektion zu beobachten. Die systolischen Blutdruckwerte
lagen während der Gabe zwischen ~140 und ~180 mmHg, und die diastolischen
Blutdruckwerte zwischen ~90 und ~140 mmHg. Durch die manuelle Gabe schwankte das
injizierte AT-II Volumen. Diese Schwankung führte wieder zu einer Schwankung
der
maximalen Werte. Durch die geringere Halbwertszeit von AT-II im Blutkreislauf fiel der
Blutdruck nach Gabe von AT-II entsprechend schnell wieder ab. [Abb. 43].
Abbildung 43: Blutdruckmessung während AT-II-Injektion.
DBP, MBP und SBP wurden mittels eines Blutdruckmessgerätes speziell für kleine Tiere vor und während der
intravenösen AT-II-Gabe gemessen und dargestellt. Die Messungen erfolgten im Abstand von jeweils eine
Minute. Typisches Beispiel bei n=3.
Die Abb. 44 stellt die Mittelwerte von SBP, DBP und von MBP dar. Bei der Kontrollratte
betrugen DBP, MBP und der SBP jeweils ~60 (±8), ~67 (±8) und ~83 (±9) mmHg. Durch die
Gabe von AT-II stiegen DBP, MBP und SBP jeweils auf ~90 (±12), ~105 (±13) und ~135
(±15) mmHg deutlich an. Eine Steigerung von jeweils ~33, ~36 und ~38% wurde während
der AT-II Gabe für DBP, MBP und SBP beobachtet.
118
Ergebnisse
Abbildung 44: Änderung des Blutdruckes während der AT-II-Gabe.
AT- II mit einer Konzentration von 20 µg AT-II in 1 ml NaCl wurde den Ratten manuell i.v. gespritzt. Die
komplette AT-II Applikation dauerte ~1 h. SBP (Systolischer Blutdruck), DBP (Diastolischer Blutdruck) und
MBP (Mittlerer Blutdruck) wurden vor und während AT- II-Gabe gemessen. Mittelwerte sind aus den einzelnen
gemessenen DBP, MBP und SBP gerechnet. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen (n=3).
3.9.1.2 Einfluss von AT-II auf den EPR-Effekt
Die Akkumulation der Liposomen im Tumor wurde mittels eines IVIS-Caliper-Geräts
gemessen. Liposomen wurden zuvor an tumortragenden Ratten in einer Endkonzentration von
4 mM PC im Plasma intravenös gespritzt. Die Gabe von AT-II erfolgte intravenös an
tumortragenden Ratten entweder 4, 8 oder 24 h nach Liposomengabe. Die Aufnahme mit dem
IVIS erfolgte vor der Liposomeninjektion und zu verschiedenen Zeitpunkten nach
Liposomengabe, vor allem vor und nach AT-II-Applikation.
3.9.1.2.1
IVIS-Aufnahmen der tumortragenden Ratten nach AT-II Applikation
Die Abbildung 45 stellt Bilder von tumortragenden Ratten vor und nach der AT-II
Applikation dar. Die Fluoreszenzintensität der Liposomen im Tumor bei der Ratte, die mit
AT-II 24 h nach Liposomengabe behandelt worden ist, stieg deutlich nach AT-II-Gabe im
Vergleich zu der Fluoreszenzintensität vor der AT-II Applikation. Die Fluoreszenzintensität
119
Ergebnisse
in diesem Beispiel lag um ~28% über der Intensität vor der AT-II-Applikation. Bei der
Kontrollratte ohne AT-II-Behandlung wurde über dem gleichen beobachteten Zeitraum
ebenfalls ein Anstieg im Tumorbereich beobachtet. Dieser leichte Anstieg betrug ~9% der
Initialfluoreszenz.
Die Gabe von AT-II 24 h nach
Liposomeninjektion führte somit zu einer vermehrten
Akkumulation der Liposomen im Tumor.
Vor AT-II
- AT-II
Nach AT-II
+ AT-II
- AT-II
+ AT-II
Abbildung 45: Anreicherung der Liposomen im Tumor vor und nach AT-II-Gabe (24 h nach
Liposomeninjektion).
Den tumortragenden Ratten wurden intravenös DiR-Liposomen injiziert. Nach 24 h erhielt die rechts liegende
tumortragende Ratte eine i.v.-Gabe von 20 µg AT-II und die IVIS-Aufnahmen wurden zu verschiedenen
Zeitpunkten durchgeführt. Die Dauer der AT-II Applikation betrug ca. 1 h. Die ROIs der gewählten Regionen
(Haut und Tumorregion) wurden ausgewertet. Für die Farbskala wurde der Bereich zwischen 1,00e9 und 4,00e9
[p/s/cm2/sr] / [µW/cm2]
gewählt. Typisches Beispiel bei i.v.-Gabe von 20 µg AT-II 24 h nach der
Liposomeninjektion.
120
Ergebnisse
3.9.1.2.2
Tumoranreicherung nach Applikation von AT-II
In Abb. 46 stellt die Akkumulation der Liposomen im Tumor [A, B, C, D, E und F] mit ATII dar. AT-II wurde den tumortragenden Ratten 4,8 oder 24 h nach Gabe der Liposomen
appliziert. Der Anreicherungsverlauf im Tumor und der Haut wurde verfolgt (oberes Bild). In
den unteren Bildern wurde die Anreicherung in Prozent dargestellt. Die Fluoreszenzintensität
vor der AT-II Applikation wurde als 100% - Wert definiert.
A- AT-II-Gabe nach 4 h
Die Anreicherung der Liposomen im Tumor vor AT-II-Gabe verlief wie im Abs. 3.3.3
beschrieben ist (siehe Abb. 29) [Abb. 46 A]. Die Kurvenverläufe der Haut von der Kontrollund der Gruppe mit AT-II verliefen identisch. Direkt nach langsamer AT-II-Injektion 4 h
nach
Applikation
der
Liposomen
wurde
kurzfristig
keine
Veränderung
der
Fluoreszenzintensität im Tumorbereich sowohl bei der Kontrollgruppe als auch bei der
Gruppe, die AT-II erhielt, beobachtet [Abb. 46 A]. Danach wurde ein kurzer Anstieg bei der
Gruppe mit AT-II beobachtet. Der Zeitpunkt der maximale Anreicherungszeit betrug bei der
Kontrollgruppe 45 h und bei der Gruppe mit AT-II 32 h nach Liposomengabe. Dieser
Unterschied der Zeitpunkte der maximalen Anreicherungszeiten ist kein primärer Effekt auf
der AT-II-Wirkung da der Effekt nicht sofort nach AT-II-Gabe antrat, und lag im Bereich der
Fehlertoleranz. Im Bereich der Haut wurde auch kein Effekt von AT-II beobachtet [Abb. 46
A]. Die mittleren Gesamtmengen an akkumulierten Liposomen im Tumor betrugen im
Vergleich zu der Gesamtmenge vor AT-II-Gabe der Liposomen in dieser Zeit jeweils ~32%
und ~29% bei der Kontrollgruppe und bei der mit AT-II behandelten Gruppe. Der
Unterschied in den Gesamtmengen an Liposomen im Tumor ist nicht-signifikant. Ein Effekt
von AT-II auf die Geschwindigkeit der Liposomenanreicherung im Tumor konnte 4 h nach
Liposomeninjektion nicht beobachtet werden. Der Effekt von AT-II ist von kurzer Dauer,
Liposomen reicherten sich danach normal wieder an.
121
Ergebnisse
A
122
Ergebnisse
B
Abbildung 46: Einfluss von AT-II auf die Anreicherungsfluoreszenz der Liposomen im Tumor und Haut.
Farbstoffmarkierte Liposomen wurden durch Extrusion hergestellt und den tumortragenden Ratten in einer
Endkonzentration von 4 mM PC im Plasma i.v. injiziert. AT-II wurde i.v. nach Liposomen-Injektion appliziert
4 h. Vor und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion von Liposomen wurden IVIS-Aufnahmen der
Fluoreszenz von Liposomen durchgeführt. (n=3).
A) Anreicherungsverlauf im Tumor und Haut.
B) Zeitlicher Verlauf der Fluoreszenzintensitäten bis 24 h nach AT-II-Gabe. Die Fluoreszenzintensität vor der
AT-II Applikation wurde als 100 % - Wert und als 0-Punkt definiert.
B- AT-II-Gabe nach 8 h
In der Abb. 46 C wurde der gesamten Anreicherungsverläufe dargestellt. AT-II wurde 8 h
nach Liposomen-Injektion appliziert. Der Verlauf der Fluoreszenzintensität im Tumor in der
Kontrollgruppe verlief flacher als bei der Gruppe mit AT-II. In der Haut ähnelten sich die
Verläufe der Kontrollgruppe und denen der Gruppe mit AT-II 8 h nach Liposomen-Injektion
[Abb. 46 C]. Bei der Kontrollgruppe ohne AT-II stieg die Fluoreszenzintensität der
Liposomen im Tumor im beobachteten Zeitraum um ~3% (±1%). Bei der Gruppe, die AT-II 8
h nach der Liposomen-Injektion bekam, wurde zwei Stunden nach der Gabe von AT-II eine
Steigerung der Fluoreszenzintensität von ~12% (±4%) gemessen [Abb. 46 D]. Der
Unterschied zwischen der Gruppe mit AT-II und der Kontrollgruppe nach der Applikation
von AT-II betrug ~9% zugunsten der Gruppe mit AT-II. Es folgte danach bei den beiden
Gruppen eine normale Anreicherung der Liposomen im Tumor. Der Zeitpunkt der maximale
123
Ergebnisse
Anreicherung der Liposomen im Tumor lag sowohl bei der Kontrollgruppe als auch bei der
Gruppe mit AT-II bei ~52 h. Eine Steigerung der mittleren Gesamtmengen an akkumulierten
Liposomen betrug im Vergleich zu der Gesamtmenge vor AT-II-Gabe der Liposomen in der
jeweiligen Zeitpunkte der maximalen Anreicherung jeweils ~32% und ~50% bei der
Kontrollgruppe und bei der mit AT-II behandelten Gruppe. Ein leichter Effekt trat direkt nach
AT-II-Gabe auf. AT-II hat möglicherweise einen Einfluss auf die akkumulierte Gesamtmenge
an Liposomen im Tumor. Eine Aussage über einen Effekt von AT-II auf die Gesamtmenge
der Liposomen in den Tumoren konnte aufgrund der hohen Varianz nicht gemacht werden.
C
124
Ergebnisse
D
Abbildung 46 C und D: Einfluss von AT-II auf die Anreicherungsfluoreszenz der Liposomen im Tumor
und Haut. Farbstoffmarkierte Liposomen wurden durch Extrusion hergestellt und den tumortragenden Ratten in
einer Endkonzentration von 4 mM PC im Plasma i.v. injiziert. AT-II wurde i.v. nach Liposomen-Injektion
appliziert 8 h. Vor und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion von Liposomen wurden IVISAufnahmen der Fluoreszenz von Liposomen durchgeführt. (n=3).
C) Anreicherungsverlauf im Tumor und Haut.
D) Zeitlicher Verlauf der Fluoreszenzintensitäten bis 24 h nach AT-II-Gabe. Die Fluoreszenzintensität vor der
AT-II Applikation wurde als 100 % - Wert und als 0-Punkt definiert.
C- AT-II-Gabe nach 24 h
In der Abb. 46 E wurde der gesamten Anreicherungsverläufe dargestellt. Der
Anreicherungsverlauf der Kontrollgruppe sah wie einen klassischen Anreicherungsverlauf der
Liposomen (siehe Abb. 19) sowohl im Tumor als auch in der Haut. Im Bereich der Haut,
wurde bei den Kontrollgruppen eine normale Abnahme der Fluoreszenzintensität wie im
Abschnitt 3.5.1 beschrieben ist, beobachtet. Bei der Gruppe mit AT-II wurde sofort eine
Steigerung der Fluoreszenzintensität im Tumorbereich nach AT-II-Gabe gemessen [Abb. 46
E]. Der Anstieg der Fluoreszenzintensität im Tumorbereich betrug ~29 % (±17%) im
Vergleich zu der Fluoreszenzintensität vor AT-II-Gabe [Abb. 46 F]. Danach stieg die
Fluoreszenzintensität nicht mehr an. Ein Einfluss von AT-II auf die Anreicherung der
Liposomen in der Haut konnte nicht beobachtet werden. Der Zeitpunkt der maximalen
Anreicherungszeit der Liposomen im Tumor in der Gruppe mit AT-II betrug ~26 h. Bei der
125
Ergebnisse
Kontrollgruppe blieb die Fluoreszenzintensität im Tumor nach der AT-II Gabe zunächst
stabil, danach stieg die Fluoreszenz normal weiter bis 24 h nach NaCl- Gabe an. Der
Zeitpunkt der maximalen Anreicherungszeit im Tumor der Kontrollgruppe lag bei ~48 h. Die
mittleren Gesamtmengen an akkumulierten Liposomen im Tumor betrugen im Vergleich zu
der Gesamtmenge vor AT-II-Gabe der Liposomen der jeweiligen Zeitpunkte der maximalen
Anreicherung jeweils ~9% und ~29% bei der Kontrollgruppe und bei der mit AT-II
behandelten Gruppe. Die Differenz der Gesamtmengen betrug ~20% zugunsten der Gruppe
mit AT-II. Dieser Unterschied erwies sich nach Berechnung mit Hilfe einem Student t test als
signifikant [Abb. 46 F].
Die Gabe von AT-II 24 h nach Liposomeninjektion führte sofort zu einer schnelleren
Anreicherung und zu einer signifikanten deutlichen Akkumulation der Liposomen in Tumor.
Der Zeitpunkt der maximalen Anreicherungszeit der Liposomen in Tumor wurde um ~22 h
verkürzt. Die Gabe von AT-II führt nicht zu einer verstärkten Anreicherung der Liposomen in
der Haut.
E
126
Ergebnisse
F
Abbildung 46 (E und F): Einfluss von AT-II auf die Anreicherungsfluoreszenz der Liposomen im Tumor
und Haut. Farbstoffmarkierte Liposomen wurden durch Extrusion hergestellt und den tumortragenden Ratten in
einer Endkonzentration von 4 mM PC im Plasma i.v. injiziert. AT-II wurde i.v. nach Liposomen-Injektion
appliziert 24 h. Vor und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion von Liposomen wurden IVISAufnahmen der Fluoreszenz von Liposomen durchgeführt. (n=6).
E) Anreicherungsverlauf im Tumor und Haut.
F) Zeitlicher Verlauf der Fluoreszenzintensitäten bis 24 h nach AT-II-Gabe. Die Fluoreszenzintensität vor der
AT-II Applikation wurde als 100 % - Wert und als 0-Punkt definiert. * zeigt die Signifikanz der Unterschied in
der Gesamtmengen (p<0,05). P wurden mit einem zweiseitigen Student-t-Test berechnet. Dargestellt sind
Mittelwerte und Standardabweichungen.
3.9.2 Einfluss von BQ-123 auf die Anreicherung von Liposomen in Tumor
Als weiteres potentielles Mittel um die Anreicherung von Liposomen im Tumor zu steigern,
wurde BQ-123, ein selektiver ETA-Endothelin Rezeptor Antagonist angewendet. ETARezeptoren sind vor allem auf glatten Gefäßmuskelzellen und auf Myozyten des Herzens zu
finden. Endothelin-1 bindet mit hoher Affinität an ETA-Rezeptoren. Die intrazelluläre
Calciumkonzentration steigt und führt zu einer starken Vasokonstriktion. EndothelinRezeptorantagonisten wie BQ- 123 senken den Blutdruck. Durch die vasodilatatorische
Wirkung vom BQ-123 und das Fehlen der glatten Muskulatur im Gefäßendothel der Tumoren
können sich die Liposomen möglicherweise leichter im Tumorgewebe anreichern.
127
Ergebnisse
3.9.2.1 IVIS-Aufnahmen
der
tumortragenden
Ratten
vor
und
nach
BQ-123
Applikation
Die Abb. 47 zeigt exemplarische Bilder der tumortragenden Ratten vor und nach i.p.
Applikation von 2 mg/kg KGW BQ-123. Die Fluoreszenzintensität im Tumor der Ratte mit
BQ-123 stieg um ~13% durch die BQ-123-Gabe als der Initialintensität vor der BQ-123
Applikation. Bei der links liegenden Kontrollratte blieb die Fluoreszenzintensität im über der
Beobachtungszeitraum Tumor konstant.
Vor BQ-123
- BQ-123
+ BQ-123
Nach BQ-123
- BQ-123
+ BQ-123
Abbildung 47: Anreicherung der Liposomen im Tumor vor und nach BQ-123-Gabe.
Den tumorragenden Ratten wurden intravenös injiziert DiR-Liposomen in einer Endkonzentration von 4 mM PC
im Plasma injiziert. Nach 24 h bekam eine tumorragende Ratte eine i.p.-Gabe von 2 mg/kg KGW BQ-123 und
die andere NaCl. IVIS-Aufnahmen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt. Die ROIs der gewählten
Regionen (Haut und Tumorregion) wurden ausgewertet. Für die Farbskala wurde der Bereich zwischen 1,00e9
und 4,00e9 [p/s/cm2/sr]/[µW/cm2] gewählt. Typisches Beispiel bei i.p.-Gabe von 2 mg/kg KGW BQ-123 24 h
nach Liposomengabe.
128
Ergebnisse
3.9.2.2 Einfluss von BQ-123 auf die Anreicherung von Liposomen im Tumor und in der
Haut
Die Abb. 48 stellt der Effekt von BQ-123 auf die Anreicherung von Liposomen im Tumor
[Abb. 48 A] und in der Haut [Abb. 48 B] dar. Eine Gruppe von tumortragenden Ratten wurde
mit verschiedenen BQ-123 Mengen i.p. oder i.v. auf einem Volumen von 0,5 ml injiziert. Die
Kontrollgruppe erhielt dasselbe Volumen an NaCl injiziert. Im Abschnitt 3.9.1.2.2 wurde nur
bei AT-II-Gabe 24 h nach Liposomen eine Verkürzung des Zeitpunkts der maximalen
Akkumulationszeit der Liposomen im Tumor erreicht. Somit wurde BQ-123 24 h nach
Liposomen-Injektion appliziert.
Die Fluoreszenzintensität bei der Kontrollgruppe stieg zu einem Maximum von ca. 48 h nach
Injektion der Liposomen. Bei der Gruppe, die 1 mg/kg KGW BQ-123 i.p. erhielt, wurde keine
Veränderung der Fluoreszenzintensität im Tumor nach der BQ-123-Gabe festgestellt. Die
Fluoreszenzintensität nach der BQ-123- Gabe blieb fast identisch bis 12 h nach BQ-123Gabe. Danach folgt ein rascher Abfall der Fluoreszenzintensität [Abb. 48 A]. In der Haut
wurde ein normaler Abbau der Fluoreszenzintensität beobachtet. Der Abbau der Fluoreszenz
verlief wie bei der Kontrollgruppe [Abb. 48 B]. Die Gabe von 1 mg/kg KGW BQ-123 i.p.
führte nicht zu einer schnellen Anreicherung der Liposomen in Tumor, eher zu einer
verringerten Anreicherung im Vergleich zu den Kontrollratten. Dieser Unterschied lag jedoch
im Bereich der Messfehler.
Durch die Steigerung der Menge von BQ-123 von 1 mg auf 2 mg/kg KGW bei einer i.p. Gabe
erhöhte sich die Fluoreszenzintensität im Tumor 2 h nach BQ-123-Gabe um ~15% im
Vergleich zur Kontrollgruppe. Danach folgte ein schneller Abfall der Fluoreszenzintensität 12
h nach BQ-123-Gabe während in der Kontrollgruppe die Fluoreszenzintensität noch weiter
anstieg. Der Zeitpunkt der maximalen Akkumulationszeit in der Gruppe mit 2 mg/kg KGW
BQ-123 lag bei ~26 h. Der Zeitpunkt der maximalen Akkumulationszeit in der
Kontrollgruppe lag bei ~48 h. Die Verdoppelung der Dosis von BQ-123 von 1 mg auf 2
mg/kg KGW bei i.p. Gabe führte zu einer Verkürzung des Zeitpunkts der maximalen
Akkumulationszeit um ~22 h. In der Haut wurde ein ähnliches Abfallmuster wie bei der
Kontrollgruppe bei 2, 6 und 12 h nach BQ-123-Gabe. Bei 24 und 48 h nach BQ-123 wurde
ein starker Abfall der Fluoreszenzintensität beobachtet [Abb. 48 B]. Nachdem ein Effekt bei 2
mg/kg KGW BQ-123 registriert wurde, wurde die Applikationsart von i.p. auf i.v. gewechselt,
um den positiver Effekt von BQ-123 zu verstärken. Den tumortragenden Ratten wurden 2 mg
BQ-123/kg KGW in 0,5 ml PBS i.v. langsam gespritzt nachdem ein Zugang vorher gelegt
wurde. Die Applikationsdauer betrug 30 min. Als erste Reaktion von BQ-123-Gabe wurde
129
Ergebnisse
eine Verminderung der Fluoreszenzintensität im Tumor gemessen. Eine Abnahme der
Siganlintensität im Tumor gemessen. Danach folgte eine leichte Steigerung der
Fluoreszenzintensität bei einem Maximum von 12 h nach BQ-123 Injektion. Trotz der
leichten Steigerung der Fluoreszenz lag die maximale Fluoreszenzintensität deutlich unter der
maximalen Fluoreszenzintensität der Kontrollratten. Die maximale Fluoreszenzinzensität
betrug nur ~3% mehr als die Fluoreszenzintensität direkt vor Gabe von BQ-123. Die i.v.Gabe von 2 mg/kg KGW BQ-123 an die tumortragenden Ratte führte nicht zu mehr
Anreicherung der Liposomen im Tumor. Eine Verkürzung des Zeitpunkts der maximalen
Anreicherung konnte nicht erreicht werden. Bq-123 führte in der Haut 2 h nach der i.v. Gabe
zu einem starken Abfall der Fluoreszenzintensität [Abb. 48 B]. Die Fluoreszenzintensität in
der Haut stieg danach leicht an (6 und 12 h) und fiel danach sehr stark im Vergleich zu
Kontrollgruppe ab (24 und 48 h).
Die Steigerung der Liposomen Akkumulation in Tumor durch BQ- 123 oder die Verkürzung
der Zeitpunkt der maximalen Anreicherung ist abhängig von der Konzentration von BQ-123
und von der Art der Applikation von BQ-123. Der Wechsel von der Injektionsart von i.p zu
i.v führte zu einer Verschlechtung der Akkumulation von Liposomen in Tumor.
Nur die i.p. Gabe von 2 mg/kg KGW BQ-123 führte zu einer Verkürzung des Zeitpunkts der
maximalen Anreicherung der Liposomen im Tumor um ~22 h im Vergleich zu der
Kontrollgruppe. Bei der Kontrollgruppe lag der Zeitpunkt der maximalen Anreicherung bei
~48 h. Die maximale Fluoreszenzintensität oder Gesamtmenge der Liposomen im Tumor lag
nach Gabe von BQ-123 bei ~114%. Es sind ~14% mehr als der 100%-Wert. In der
Kontrollgruppe lag die maximale Fluoreszenzintensität oder Gesamtmenge der Liposomen
nach 48 h bei ~116%. Es sind ~16% mehr als der initialer 100%-Wert. Die Differenz der
Akkumulationsgesamtmenge der Liposomen bei der Kontrollgruppe und bei i.p Gabe von 2
mg/kg KGW BQ-123 betrug ~2% und lag im Bereich der Fehlertoleranz. Allgemein
auffallend ist der beschleunigten Abbau der Liposomen, so dass die Fluoreszenzintensität im
Tumor und in der Haut deutlich verringert wird [Abb. 48 A, 24 und 48 h nach BQ-123].
130
Ergebnisse
A
B
Abbildung 48: Zeitliche Entwicklung der Fluoreszenzintensität im Tumor (A) und in der Haut (B) nach
BQ-123-Gabe. Farbstoffmarkierte Liposomen wurden durch Extrusion hergestellt und den tumortragenden
Ratten in einer Endkonzentration von 4 mM PC im Plasma i.v. injiziert. Verschiedene Konzentrationen BQ-123
wurden 24 h nach Liposomen-Injektion i.v. oder i.p. appliziert. Die Fluoreszenzintensität vor der BQ-123
Applikation wurde als 100%-Wert angenommen. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen.
A) Fluoreszenzintensität im Tumor.
B) Fluoreszenzintensität in der Haut.
131
Ergebnisse
3.9.3 Steigerung der Liposomenmenge im Tumor durch Schwimmen
Eine körperliche Aktivität während einer Chemotherapie Behandlung wird häufig empfohlen.
Die Körperliche Aktivität führt zu einer Steigerung der Herzschlagfrequenz und des
Herzzeitvolumens. Die Erhöhung diesen zwei Parametern könnte möglicherweise einen
Einfluss auf die Anreicherung der Liposomen im Tumor haben. Um diese Hypothese zu
überprüfen, wurden tumortragende Ratten 24 h nach Liposomen-Injektion in einem
Schwimmbecken speziell für Kleintiere zum Schwimmen gebracht. Der Schwimmzyklus
wurde
wie
im
Kapitel
2.2.10
beschrieben
ist,
durchgeführt.
Zwischen
den
Schwimmintervallen gab es für die Tiere eine Minute Pause. Der gesamte Versuch dauerte
insgesamt 1 h.
3.9.3.1 Aufnahmen der tumortragenden Ratten vor und nach dem Schwimmen
Die Abb. 49 zeigt exemplarische Bilder von tumortragenden Ratten vor und nach dem
Schwimmen. Bei der Kontrollratte blieb die Fluoreszenzintensität im Zeitraum von eine
Stunde fast identisch. Bei den Ratten, die an dem Schwimmversuch teilgenommen haben,
stiegen die Fluoreszenzintensitäten im Tumor nach dem Schwimmen um durchschnittlich
~10% im Vergleich zu ihren jeweiligen Intensitäten vor dem Schwimmen.
132
Ergebnisse
Vor dem Schwimmen
Kontrolle
+ Schwimmen
Nach dem Schwimmen
+ Schwimmen
Kontrolle
+ Schwimmen
+ Schwimmen
Abbildung 49: Anreicherung der Liposomen im Tumor vor und nach dem Schwimmen.
Den tumortragenden Ratten wurden intravenös DiR-Liposomen in einer Endkonzentration von 4 mM PC im
Plasma i.v. injiziert. Nach 24 h wurden die mittlere und die rechts liegenden tumortragenden Ratten für eine
Stunde zum Schwimmen gebracht, wie im Kapitel 2.2.10 beschrieben ist und die IVIS-Aufnahmen wurden
anschließend durchgeführt. Die ROIs der gewählten Regionen (Haut und Tumorregion) wurden ausgewertet.
Für die Farbskala wurde der Bereich zwischen 1,00e9 und 4,00e9 [p/s/cm2/sr]/[µW/cm2] gewählt. Typisches
Beispiel bei n=3.
3.9.3.2 Steigerung der Liposomenmenge im Tumor durch Schwimmen
Abb. 50 stellt die Anreicherung der Liposomen vor und nach dem Schwimmen dar. Die
Fluoreszenzintensität vor dem Schwimmen wurde als 100%-Wert definiert.
Bei der Kontrollgruppe ohne Schwimmen blieb die Fluoreszenzintensität im Tumor während
des beobachteten Zeitraums konstant. Nach 6 h stieg die Fluoreszenzintensität bei der
Kontrollgruppe von 99% nach dem Schwimmen auf ~102% an. In der Haut stieg die
Fluoreszenzintensität zunächst an und fiel 6 h später ab. Bei der Schwimmgruppe stieg die
Fluoreszenzintensität der Liposomen im Tumor nach dem Schwimmen durchschnittlich um
~7% (±8) im Vergleich zur Initialfluoreszenz vor dem Schwimmen an. Ungefähr 6 h nach
dem Schwimmen, fiel die Fluoreszenzintensität der Schwimmgruppe von ~107% nach dem
133
Ergebnisse
Schwimmen auf ~104% leicht ab. In der Haut wurde bei der Schwimmgruppe nach dem
Schwimmen einen Anstieg der Fluoreszenzintensität wie bei der Kontrollgruppe. Eine starke
Abnahme der Fluoreszenzintensität von ~107% auf ~83% wurde 6 h nach der Schwimmen
beobachtet. Diese Abnahme war angesichts der hohen Fehlerbalken nicht signifikant.
Eine körperliche Aktivität führte kurzfristig zu einer leichten vermehrten Akkumulation der
Liposomen im Tumor. Dieser Anstieg ist aber über die Zeit gering und liegt in Bereich der
Fehlertoleranz. Der Zeitpunkt der maximalen Anreicherungszeit wurde nicht verkürzt. Die
Anreicherung der Liposomen in der Haut wurde vom Schwimmen nicht beeinflusst.
Tumor
134
Ergebnisse
Haut
Abbildung 50: Einfluss von Schwimmen auf die Fluoreszenzintensität im Tumor und in der Haut
Farbstoffmarkierte Liposomen wurden durch Extrusion hergestellt und den tumortragenden Ratten in einer
Endkonzentration von 4 mM PC im Plasma i.v. injiziert. Ratten wurden für eine Stunde zum Schwimmen 24 h
nach Liposomen-Injektion gebracht, wie im Kapitel 2.2.10 beschrieben ist. Die Fluoreszenzintensität vor dem
Schwimmen wurde als 100%-Wert angenommen. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen.
(n=3).
135
Diskussion
4 DISKUSSION
4.1 Liposomen
4.1.1 Wahl der Liposomen und Bestimmung der Liposomengröße
Die Zusammensetzung der für diese Arbeit angewendeten Liposomen basierte auf der
Zusammensetzung der Caelyx-Liposomen. Caelyx besteht aus 55 mol% HSPC; 40 mol%
Cholesterol und 5 mol% PEG. Um die Halbwertszeit der Liposomen in vivo zu verbessern
wurde der PEG-Anteil verdoppelt. Die leichte Modifikationen wurden wie im Kapitel 2.2.4.1
beschrieben wurde, durchgeführt. Die hergestellten Liposomen bestanden aus 50 mol%
HSPC; 39 mol% Cholesterol, 10 mol% PEG und ~1 mol% von einem Farbstoff.
Kleine Liposomen wurden für die in vivo Versuche durch Extrusion hergestellt. Die
Durchmesser der Liposomen lagen mit 168 bis 181 nm etwas höher als der Durchmesser der
verwendeten Membran mit 100 nm Größe. Bei der Extrusion wurde nur eine 100 nmMembran verwendet. Bei der beschriebenen Methode sollten zwei Membranen benutzt
werden. Durch die hohe Phasenüberganstemperaturen der Lipide, war eine Extrusion mit
doppelten 100 nm-Membranen nicht möglich. Die manuelle Extrusion durch nur eine
Membran erwies sich schon als sehr schwierig und erforderte hohe Drücke und erhebliches
Fingerspitzengefühl.
Die
Anwendung
von
gesättigten
Lipiden
und
eines
hohen
Cholesterolanteils führt zu rigiden Membranen was die Extrusion zusätzlich erschwert. Diese
wurden jedoch benötigt um eine möglichst lange Zirkulationszeit der Liposomen zu
gewähren.
Im Allgemeinen sind die durch Extrusion hergestellten Liposomen meist 20-50 % größer als
die gegebene Filterporengröße (Drummond et al., 1999). Trotz dieses Unterschieds in der
Größe, war der PDI (Ein Maß für die Breite der Größenverteilung) der verschiedenen
Liposomen-Chargen sehr gut [Tab. 3]. Der PDI war aber verglichen mit dem PDI von Caelyx
hoch. Der PDI von Caelyx beträgt 0,001 und liegt damit ausgesprochen niedrig. (Ngoune,
2010, Diplomarbeit).
Die Plasmazirkulationszeit der Liposomen in vivo und die Anreicherung mittels der EPREffekt hängen von der Größe der Liposomen ab. Die Liposomengröße von 161 bis 181 nm
liegt deutlich unter der Liposomengröße von 400 nm, die von Maeda in dem EPR-Effekt
beschrieben worden ist (Maeda et al., 2000). Deshalb sollte sich die verwendeten Liposomen
gemäß dem EPR-Effekt im Tumor anreichen können. Inwiefern ein Unterschied zwischen den
verwendeten Modellliposomen und dem kommerziellen PLD besteht, ist nicht bekannt. Da
136
Diskussion
die Porengröße der Tumorendothelien stark schwankt ist allenfalls eine verbesserte
Anreicherung von kleinen Liposomen zu erwarten, so dass die hier erreichten Ergebnisse auch
auf PLD übertragbar sein sollten.
Frühere Studien zeigten, dass die Eliminierungsrate im Plasma bei PEG Einschluss in den
Liposomen bei Größen zwischen 80 – 200 nm unbeeinflusst blieb (Liu et al, 1992; Woodle et
al 1992; Allen et al, 1989;). Liposomen über 200 nm werden vermehrt in der Leber
aufgenommen, in Gegensatz zu Liposomen unter 200 nm (Liu et al., 1992). Die
Blutzirkulationszeit
unserer
Modellliposomen
sollte
bei
unseren
Liposomengröße
unbeeinflusst bleiben.
Die präparierten Liposomen konnten somit als Modellliposomen für die weiterführenden
Versuche verwendet werden.
4.1.2 Liposomen in vivo
Die Stabilität der Liposomen in vivo und deren Interaktion mit Lipoproteinen wurden mittels
GPC untersucht. Die hergestellten Liposomen wurden in vivo über die Schwanzvene i.v.
appliziert.
Die GPC-Chromatogramme der Plasmaproben zeigten drei verschiedenen Peaks ohne
Änderungen in deren Profilen. Die drei Peaks entsprechen VLDL, LDL und HDL (Fernandez
et al., 2008; Raabe at al., 1998; März et al., 1993). Die Proben, die nur Liposomen im Puffer
enthielten, zeigten erwartungsgemäß nur einen Peak in den Fraktionen 17 – 21.
Liposomen können möglicherweise in vivo mit HDL interagieren (Immordino et al., 2006;
Allen et al., 1989; Damen et al., 1981). Die Liposomen würden dabei ihre Struktur verlieren
und werden dadurch zerstört. Sowohl Liposomen als auch ihr Inhalt erreichen dabei ihre Ziele
nicht. In den genannten Arbeiten wurde nur mit konventionellen Liposomen ohne Zusatz von
PEG gearbeitet. In dieser Arbeit wurde vorwiegend mit sogenannte „Stealth Liposomen“
gearbeitet. Die Zugabe von PEG vermindert die Interaktion von Liposomen mit
Plasmaproteinen (Immordino et al., 2006). Zusätzlich zu PEG wurde ein hoher Anteil an
Cholesterol (39 mol%) angewendet. Cholesterol ist ein wichtiger Bestandteil für die Stabilität
der Liposomen in vivo. Cholesterol erhöht die Membranrigidität der Liposomen und
unterbindet dabei auch die Interaktionen zwischen Liposomen und Plasmaproteinen
(Drummond et al., 1999).
Die Fluoreszenzintensität in den verschiedenen GPC-Fraktionen wurde gemessen. Keine
Fluoreszenzintensität der Liposomen wurde in den LDL-, HDL- und Protein-Fraktionen nach
verschiedenen Zeiten gemessen. Somit können wir mit Sicherheit ausschließen, dass in vivo
137
Diskussion
eine Interaktionen zwischen Liposomen, LDL, HDL und Proteine in den ersten 72 h
stattfindet. Eine Interaktion von PEGylierten Liposomen mit HDL, wie in frühere Studie
konnte wie für nicht-PEGylierten Liposomen nicht bestätigt werden (Damen et al., 1981).
Die Liposomen in den Plasmaproben eluierten in den VLDL-Fraktionen (17 - 21). Eine
Interaktallenion von Liposomen mit VLDL wurde berichtet. Dabei interagieren Liposomen
mit VLDL und es entsteht γ-LpE Partikeln in der Größe von HDL (Cwiklinska et al., 2013).
Die genannten γ-LpE wurden zusammen mit HDL in den Fraktionen (31 - 40) eluiert werden.
Allerdings wurde keine Fluoreszenzintensität in den HDL-Fraktionen gemessen. Somit
können wir ausschließen, dass eine Interaktion von Liposomen mit VLDL wie beschrieben
stattfindet.
Eine Dissoziation von Farbstoff zu den Liposomen wurde oft thematisiert (Hagvet et al.,
2012). Hagtvet et al., berichtet eine Ablösung von den an Liposomen gekoppelter Farbstoff
während der Zirkulation der Liposomen in Kreislauf ohne Zerstörung der Liposomen
(Hagtvet et al., 2012). Diese Dissoziation von Farbstoff und Liposomen konnte hier nicht
bestätigt werden. Der Unterschied könnte an der Präparation liegen. Hagtvet et al., haben PLD
mit DiD-Farbstoff nach der Präparation markiert. Das Problem könnte an der Integration vom
Farbstoff in den Liposomenmembranen liegen. In dieser Arbeit wurde der Farbstoff schon bei
der Liposomen-Präparation integriert, damit der Farbstoff stabil in der Membran bleibt. Eine
Ablösung des Farbstoffes von den Liposomen würde zu einer Verfälschung der
Biodistribution führen. Eine mögliche Zerstörung der Liposomen ist nicht auszuschließen.
Nicht stabile Liposomen oder zerstörte Liposomen würden wahrscheinlich schnell aus dem
Kreislauf entfernt. Da die Fluoreszenzintensität nur in den Fraktionen, die Liposomen
enthielten, gemessen wurde, können wir ausschließen, dass ein relevanter Verlust des
Farbstoffes von den Liposomen stattfindet. Die Stabilität des Farbstoffes an unseren
Liposomen in vivo wurde anders wie von Verkade et al, beschrieben worden ist, bestätigt
(Verkade et al., 1992). Verkade et al, benutzten in ihre Arbeit keine PEGylierten Liposomen.
Eine Interaktion von Liposomen mit HDL- und VLDL-Lipoproteinen konnte nicht
nachgewiesen werden. Ein Austausch von Liposomenfarbstoff mit anderen Proteinen wurde
ausgeschlossen.
138
Diskussion
4.1.3 Plasmahalbwertszeit der Liposomen
Eine längere Plasmahalbwertszeit der Liposomen ist essentiell für die weiterführenden
Versuche. Zur Bestimmung der Halbwertszeit der Liposomen in vivo, wurden Blutproben
nach verschiedenen Zeitpunkten abgenommen, nachdem Liposomen intravenös injiziert
wurden. Die Plasmahalbwertszeit der Liposomen betrug ungefähr 29 h. Dieses Ergebnis lag
leicht über der beschriebenen Plasmahalbwertszeit von Liposomen in der Literatur (Allen et
Hansen, 1991). Allen und Hansen setzten für die beschriebene Halbwertszeit von 24,8 h einer
Liposomen-Konzentration von 5 mM PC ein (Allen et Hansen, 1991). In dieser Arbeit, wurde
eine Endkonzentration von 4 mM PC an Liposomen im Blutkreislauf verwendet. Trotz 1 mM
weniger eingesetztes PC, war die untersuchte Plasmahalbwertszeit leicht höher als die von
Allen und Hansen. Der Unterschied hier liegt vielleicht bei der Lipid-Zusammensetzung der
Liposomen (Gabizon et al., 2012; Vincent et al., 1991). Allen und Hansen wählten für die
Präparation ihren Liposomen Sphingomyelin, Ei PC, Cholesterol und PEG-DSPE in
Massenverhältnis 1:1:1: 0,2, dies entsprach 10 mol% PEG-DSPE. Für diese Arbeit wurde als
Hauptlipid HSPC gewählt. HSPC durch seine hohe Phasenübergangstemperatur Tm eignet
sich gut für die in vivo Versuche und hat eine bessere Stabilität in vivo als Ei-PC (Gabizon et
al., 2011). Allgemein zeigen Lipide mit einer hohen Phasenübergangstemperatur eine bessere
Stabilität in vivo als die Lipide mit niedrigeren (J. Chen et al., 2012; Bally et al., 1990). Dies
ist auch einen der Gründe wieso HSPC statt Ei-PC für die Herstellung von Caelyx
angewendet wurde. Der Phasenübergangstemperatur Tm von HSPC liegt bei 53°C und von
Ei-PC bei 37°C (Goldberg et al., 2011).
Eine Erhöhung der Endkonzentration von PC zwischen 0,5 – 5 mM im Plasma führt zu einer
leichte Verlängerung der Verweildauer der Liposomen in vivo. Liposomen können umgekehrt
proportional zu ihrer Abbaurate an Serumproteine binden (Chonn et al., 1992). Eine Erhöhung
der Lipiddosis führt zu einer Erhöhung der Blutzirkulationshalbwertszeiten der Liposomen,
weil die Opsonine im Plasma alle gebunden und erschöpft sind (Harashima et al., 1993). Die
Menge an Liposomen im Plasma baut sich exponentiell mit der Zeit ab. Eine Reaktion erster
Ordnung findet beim Abbau statt (Allen und Hansen, 1991).
Durch die PEGylierung werden die Liposomen schlechter vom RES erkannt als
konventionelle Liposomen ohne PEG (Immordino et al., 2006; Allen und Hansen, 1991). PEG
unterbindet
sowohl
elektrostatische
als
auch
hydrophobe
Bindungsaffinitäten
mit
Plasmaproteinen (Lasic et al., 1995) und die Opsonisierung wird erschwert (Lasic, 1997.
Buch). Somit zirkulieren die Liposomen länger im Blutkreislauf. Der Einbau von Cholesterol
wie oben schon erwähnt erhöht zusätzlich die Stabilität der Liposomen in vivo. Für die Arbeit
139
Diskussion
wurden 10 mol% PEG statt 5 mol% eingesetzt. Die Erhöhung des PEG-Anteils führte zu einer
Verlängerung der Plasmahalbwertszeit (Allen et al., 2013). In den Vorversuchen lagen die
Halbwertszeiten der Liposomen ohne PEG und 5 mol% PEG bei einer Konzentration von 4
mM PC jeweils bei ~11 h und bei ~17 h (Ngoune, 2010. Diplomarbeit). Durch die Erhöhung
des PEG-Anteils auf 10 mol% wurde eine Plasmahalbwertszeit von ~29 h erreicht.
Wie schon im Kapitel 4.1.1 diskutiert wurde hängt die in vivo Halbwertszeit der Liposomen
stark von ihrer Größe ab. Kleine Liposomen zirkulieren länger im Kreislauf als große
Liposomen (Woodle et al., 1992).
4.2 Zeitpunkt der maximalen Anreicherung der Liposomen im Tumor
Die passive gesteigerte Akkumulation der Liposomen in Tumor ist durch den EPR-Effekt
(Maeda et al., 2000) beschrieben worden. Mit Hilfe eines Optical Imaging-System wurde die
Anreicherung der Liposomen in Tumor verfolgt und der EPR-Effekt untersucht. Die
Bestimmung der maximalen Anreicherungszeit stellt einen wichtigen Meilenstein dieser
Arbeit dar. Eine Plasmapherese sollte erst nachdem die Liposomen sich ausreichend in Tumor
akkumuliert haben durchgeführt werden. Wenn man dem Prinzip der Retention gemäß EPREffekt folgt, würden die angereicherten Liposomen bei der Plasmapherese nicht wieder
entfernt.
4.2.1 Wahl des Farbstoffes
Für die IVIS-Aufnahmen wurde ein Farbstoff gebraucht, der in vivo stabil in die Liposomen
integriert ist und die Aufnahmen gut darstellen kann. DiO-, DiI-, DiR-Farbstoffe wurden
getestet. Durch ihre lipophile Eigenschaften eignen sich die drei Farbstoffe gut als Marker für
die Liposomen (Csisza´r et al., 2010; Daubeuf et al., 2009). DiO-, DiI-, DiR-Farbstoffen
haben eine kurze Exzitationszeit (lifetechnologies.com). Die kurze Exzitationszeit führt zur
kürzeren Messzeiten. Die Präparation der Liposomen mit den Farbstoffen wie im Kapitel
2.2.4.1 beschrieben ist, lief problemlos. Durch ihre lipophile Eigenschaft lassen sie sich gut in
den Membranen integrieren. Hydrophile Farbstoffe können nicht in die Membrane integriert
werden. Sie können aber in den Liposomen eingekapselt werden. Die Aufnahmen mit dem
DiR-Farbstoff zeigten gute Ergebnisse. Die Aufnahmen konnten gut ausgewertet werden und
die Ratten zeigten bei der Exzitations- und Emissionswellenlänge keine Eigenfluoreszenz. Die
Ratten zeigten bei dem DiI-Farbstoff zwar eine Eigenfluoreszenz, ein Unterschied zwischen
die Kontrollratte ohne DiI-Liposomen und die Ratte, die DiI-Liposomen bekam erkennbar.
140
Diskussion
Die Ratten zeigten bei dem DiO-Farbstoff eine starke Eigenfluoreszenz. Bei DiO-Farbstoff
zeigte sogar die Ratte, die keine fluoreszierende Liposomen bekam eine starke gelbe
Eigenfluoreszenz nicht nur im Fell sondern auch in den Ohren und Pfoten. Dadurch war auch
hier eine fehlerfreie Auswertung der Liposomen Anreicherung nicht möglich.
In mancher Arbeit von farbstoff-markierten Liposomen, wurde überwiegend mit nackten
Mäusen gearbeitet (Hagtvet et al., 2012). Trotz des fehlenden Fells was auch teilweise die
Autofluoreszenz verursacht hat, waren die Abweichungen der Fluoreszenz in den
verschiedenen Regionen sehr hoch. Die Eigenfluoreszenz der Ratten hat möglicherweise viele
Gründe. Ein Zusammenhang mit dem eingenommenen Futter wird thematisiert. In den
kleinen Exzitations-und Emissionswellenlänge zeigen Organen wie Gallenblase, Dünndarm
und Blase starke Eigenfluoreszenz (Frangioni et al., 2003).
Für diese Arbeit wurde ein etabliertes syngenes Modell ausgesucht (Marzola et al., 2005;
Guo et al., 2002). Die Fischer-Ratten trugen ein normales Fell. Ein gute Vergleich von
Farbstoff mit kleinen Exzitations-und Emissionswellenlänge in Vergleich zu Farbstoffen mit
Exzitations-und Emissionswellenlängen in Infrarotbereich wurde in der Arbeit von Frangioni
beschrieben (Frangioni et al., 2003). Um die Ergebnisse der Aufnahmen zu verbessern
wurden die Tumorratten auf den untersuchten Bereichen rasiert. Tumor- und Hautregionen
wurden so gut dargestellt, dass man sie auch fehlerfrei auswerten konnte. In Exzitation- und
Emissionswellenlänge von DiR nahe Infrarotbereich war die Hintergrundfluoreszenz
vernachlässigbar. Somit konnte mit Sicherheit gesagt werden, dass das gemessene Signal
auch von der injizierten Liposomen kommt. Ein möglicher Abbau der Farbstoffe oder ihre
Interaktion mit HDL wurde im Kapitel 4.1.2 schon diskutiert.
Für die Verfolgung der Liposomen am IVIS zeigten sowohl DiR als auch DiI gute
Ergebnisse. Durch die komplette fehlende Eigenfluoreszenz der Ratte beim DiR-Farbstoff,
wurde der DiR-Farbstoff als Standardfarbstoff für die Markierung von Liposomen.
4.2.2 Anreicherungskinetik der Liposomen
Die Anreicherungskinetik der Liposomen
wurde in tumortragenden Ratten untersucht.
Möglicherweise werden die farbstoff-markierten Liposomen schneller im Kreislauf entfernt
als die nicht markierten Liposomen. Liposomen werden generell in vivo von Makrophagen
phagozytiert (Drummond et al., 1999). Der Farbstoffzusatz an Liposomen könnte die
Makrophagen möglicherweise stärker stimulieren.
Die gleichzeitige Injektion von 2 mM
fluoreszenzmarkierten Liposomen und 2 mM
unmarkierter Liposomen zeigte ~50% weniger Fluoreszenzintensität im Vergleich zur
141
Diskussion
Kontrolle mit einer vollen Konzentration von 4 mM PC an fluoreszierenden Liposomen.
Wenn die farbstoff-markierten Liposomen schneller aus dem Kreislauf entfernt werden oder
sich weniger in Tumor anreichern, würde der Fluoreszenzunterschied im Tumorbereich
zwischen die Ratten mit einer halber Konzentration fluoreszenzmarkierte Liposomen und
einer halber Konzentration von Liposomen ohne Farbstoff im Vergleich zur Kontrolle mit
einer vollen Konzentration weit über ~50% sein. Ein Nachteil von fluoreszierenden
Liposomen wurde nicht beobachtet. Daher reichern Liposomen sich im Tumor durch ein
Zufallsprinzip an. Der Farbstoff hat keine Auswirkungen auf die Anreicherung der
Liposomen im Tumor.
4.2.3 Zeitpunkt der maximalen Anreicherung der Liposomen in Tumor
In Abschnitt 3.3.3 wurde der Zeitpunkt der maximalen Anreicherung der Liposomen in
tumortragenden Ratten untersucht. Die Anreicherung der Liposomen im Tumor wird durch
den EPR-Effekt (Maeda et al., 2000) beschrieben und ist durch passives Targeting getriggert.
Die von uns verwendeten Liposomen reichern sich mit steigender Zeit bis ~41 h im Tumor
an. Ab da entsteht ein Plateau das bis zu 72 h anhält. Die Liposomen reichern sich je nach
Tier mit unterschiedlicher Kinetik an. Bei einigen Tiere reichern sich sehr schnell an, einige
langsamer [Abb. 17 A], Grund ist vermutlich unterschiedliche Tumoranatomie. In Abb. 17 B
sind die Mittelwerte aufgetragen. Die verschiedenen Anreicherungskinetiken bedingen die
hohen
Standardabweichungen,
wie
sie
in
Abb.
19
dargestellt
sind.
Der
Anreicherungszeitpunkt korreliert mit den schon publizierten Daten (Hagtvet et al., 2012;
Gabizon et al, 1997; Gabizon et al, 1990). Hagtvet et al., berichtete bei seiner
Anreicherungskinetik mit DiD-farbstoffmarkiertem PLD ein Maximum von 48 h. Gabizon et
al. kamen früher zu demselben Ergebnisse mit einem PLD-Modell (Charrois et al., 2003;
Gabizon et al., 1997). Harrington et al., kamen mit ihrem Liposomen- und Mausmodell nur zu
einem Anreicherungsmaximun von 24 h (Harrington et al., 2000). Die Halbwertszeit der
Liposomen betrug allerdings nur 10 h.
Die Ausprägung des
EPR-Effektes wird durch verschiedene Einflussfaktoren bestimmt:
regionale Durchblutung des Tumors, Durchlässigkeit der Gefäßversorgung des Tumors,
strukturelle Barrieren durch perivaskuläre Tumorzellen und der extrazellulären Matrix und
intratumorale Druckunterschiede (Kobayashi et al., 2013). Die Anreicherung der Liposomen
in Tumoren ist auch abhängig von der Zirkulationszeit der Liposomen im Kreislauf. Der
Zirkulationszeit der Liposomen ist wiederum abhängig von Größe, Zusammensetzung
142
Diskussion
(Maruyama et al., 1990), Ladung, PEGylierung, Dosis der Liposomen (Harashima et al.,
1993).
Die Anreicherung durch den EPR-Effekt konnte gut beobachtet werden. Eine schnelle initiale
Akkumulation in den Tumoren wurde registriert. Die Permeabilität der Gefäße wurde durch
die gute Akkumulation der Liposomen in den Tumoren bestätigt. Die Fenestration in den
endothelialen Zellen der soliden Tumoren haben eine Breite zwischen 300 und 4700 nm
(Nehoff et al., 2014; Maeda, 2013; Greish et al., 2007). Zum Vergleich Die Fenestration
zwischen die Endothelzellen der Gefäßen gesunden Geweben beträgt ca. 10-nm (Maeda,
2013). Die hergestellten Liposomen mit einem maximalen Durchmesser von 181 nm konnten
ungehindert durch die Gefäße in das Tumorgewebe durchdringen (Tredan et al., 2007; Maeda
et al., 2001). Die Anreicherung der Liposomen in mittleren Tumoren erfolgt schneller als in
kleinen Tumoren. Tumore mit der Größe unter 1-2 mm sind meist avaskulären (Jain et al.,
1989; Folkman, 1997). Um die Permeabilitätsparameter des EPR-Effekts darzustellen, wurde
in dieser Arbeit, mit Tumoren mit einer mittleren Größe von 1 – 2 cm Länge, Breite oder
Höhe gearbeitet. Die angereichten Liposomen verteilen sich nicht in dem gesamten Tumor
sondern bleiben meist in der Peripherie oder im Bereich der Gefäße wegen der hohen
interstitiellen Druck im Tumor und ein großer Zwischenraum der Tumoren im Vergleich zu
Normalgewebe (Ekdawi et al., 2015; Maeda, 2013; Ngoune, 2010, Diplomarbeit; Greish et al,
2007; Jain et al., 1989). Die intratumorale Verteilung konnte mit der hier verwendeten
Messmethode nicht aufgelöst werden. Die IVIS-Aufnahmen zeigen meist eine asymmetrische
Verteilung der farbstoffmarkierten Liposomen. Ein weiterer wichtiger Parameter des EPREffektes ist die Retention. Mehrere Argumente werden derzeit diskutiert. Ein wichtiger Punkt
ist das Fehlen der lymphatischen Bahnen in den Tumoren (Matsumura und Maeda, 1986).
Nur lymphatischen Bahnen können die Makromoleküle entfernen (Greish et al, 2007; Maeda
et al., 2001). Die angereichten Partikeln werden dadurch nicht entfernt. So konnten sich die
Liposomen ungehindert und stetig in den Tumoren bis ~41 h akkumulieren. Die
Fluoreszenzintensität der Liposomen in den Tumoren stieg somit kontinuierlich bis ein
Plateau entstand.
Die Akkumulation der Liposomen im Tumor erfolgt sehr schnell in den ersten Stunden. Nach
29 h stunden sind bereits 84% der maximal in den Tumor anreicherten Liposomen vorhanden.
Von den restlichen 50% der sich im Kreislauf noch befindet, reichern sich später nur noch
16% der maximal angereicherten Liposomen an. Was im Tumor passiert und warum die
Liposomen trotz ihrer ausreichernden Menge im Plasma sich später nicht mehr anreichern, ist
noch nicht bekannt. Möglicherweise hindern die bereits akkumukierten Liposomen im Tumor
143
Diskussion
mit steigernder Zeit die Anreicherung weitere Liposomen. In der Haut dagegen wurde nach
einer Plasma-HWZ eine 50%ige Akkumulation berechnet.
Interessanterweise handelt es sich bei der beobachteten maximalen Anreicherung nicht um ein
Sättigungsphänomen. Gabizon et al., zeigten in einem Eskalationsversuch bei 8-facher PLDDosis eine 12-fache Akkumulation der Liposomen im Tumor (Gabizon et al., 2002). Charrois
und Allen zeigten 2003 eine direkte Korrelation der Liposomenmenge im Tumor mit der
gegebenen Dosis bei gleichbleibender Anreicherungskinetik (Charrois et al., 2003). Bei den
bisherigen untersuchten Plasmakonzentrationen wurde noch keine echte Tumorsättigung
beschrieben, Tumoren können vermutlich mehr Liposomen aufnehmen als bisher gedacht.
Ein weiterer Punkt der die Retention beim EPR-Effekt erklärt ist der intratumoraler Druck.
Der hohe Protein Gehalt in den Tumoren kann zu einer Erhöhung des kolloidalen Drucks
führen und verhindert dadurch die Bewegung der angereicherten Partikeln (Nehoff et al.,
2014; Kobayashi et al., 2013). Eine genaue Untersuchung dieses Phänomens konnte mit der
hier verwendeten Methode nicht durchgeführt werden. Der Akkumulationsvergleich unter
verschiedenen Organen wird später im Kapitel 4.4 diskutiert.
In vielen Anreicherungsversuchen wurde PLD angewendet. PLD hat eine deutlich höhere
Plasmahalbwertszeit als das in der Arbeit angewendeten Liposomenmodell. Mit der hier
angewendeten leeren Liposomen wurde ein Anreicherungsmaximum der Liposomen in
Tumoren nach ~41 h ermittelt. Dies entspricht 1,3 Halbwertszeiten. Möglicherweise liegt das
max. der Anreicherung bei PLD noch etwas höher, da die Liposomen in höherer
Konzentration im Blut verbleiben. Allerdings findet der Großteil der Anreicherung in den
ersten Stunden nach Liposomengabe statt (siehe Abb. 21) und somit ist der Effekt durch die
längere Halbwertszeit von PLD auf die gesamte akkumulierte Menge gering.
Der EPR-Effekt konnte mit unseren Tumor- und Liposomenmodell bestätigt werden, die
beobachteten Anreicherungszeiten liegen im Einklang mit den bereits beschriebenen
Untersuchungen.
4.3 Die diskontinuierliche Plasmapherese
Die Plasmapherese ist definiert als Blutwäsche. Die Plasmapherese wird angewendet um
Liposomen und PLD in den Therapieversuchen später aus dem Blutkreislauf zu entfernen.
Heute findet man diverse Plasmapherese Arten wie Doppelmembranfiltration (DMF), die
Immunoadsorption, Dextran Sulfate (Liposorber LA-15 System) und viele mehr (Winters,
2011). Die Unterschiede liegen in der Technik wie die toxischen Stoffe entfernt werden. Im
Tierbereich wird die Plasmapherese bei großen und kleinen Tieren angewendet (Folette et al.,
144
Diskussion
1993; Cohen et al., 1987; Euler et al., 1985; Markofsky und Orentreich, 1976). Mit den
großen Tieren wie Schweine und Hunden ist es leichter zu arbeiten als mit kleinen Tiere wie
Ratten, da hier auf die üblichen Apheresetechniken des Menschen zurückgegriffen werden
kann. In dieser Arbeit, wurde mit einem etablierten syngenen Rattentumormodell gearbeitet
(Marzola et al., 2005; Guo et al., 2002). Denn für die weiteren Versuche wurden
Therapiestudien geplant. Die Vorteile der Ratten im Vergleich zu großen Tiere sind zu einem
die Kosten, zu anderem die schnell wachsenden Tumoren. Ein Tumormodell an Schweinen
oder Hunden wäre weder praktikabel noch ethisch vertretbar. Allerdings gibt es außer den
Berichten von Follette et al., 1993 und Euler et al., 1985, die schon vor geraumer Zeit
erschienen, derzeit kein typisches etabliertes Rattenmodell zur Apherese.
In den Vorarbeiten wurde mit einer Apparatur mit zwei geschalteten Pumpen, die das Blut
und Plasma getrieben haben, gearbeitet (Marina Sucharew, 2008, Diplomarbeit). Den Ratten
wurde bei einer OP zwei Verweilkatheter (ein Zugang und ein Abgang für Blut) eingepflanzt.
Die zwei Gänge waren häufig verstopft trotz Heparinspülung. Bis Zum Tumorwachstum
wurde eine Durchführung der Plasmapherese praktisch unmöglich. Das Legen von einem
Dauerkatheter in die Schwanzvene und die ständige Blutabnahme erwiesen sich auch als sehr
schwierig und benötigen präzise Arbeiten. Das Verfahren der Plasmapherese wurde stark
verbessert und kann jetzt problemlos angewendet werden. Zu Ende der Etablierung der
Plasmapherese haben alle Ratten die Plasmapherese überlebt mit sehr guten Ergebnissen. Die
Plasmapherese wurde 5 min nach Applikation der DiO-gefärbten Liposomen durchgeführt.
Die Plasmapherese dauerte 1 – 1,5 h. Durch die Plasmapherese wurden ~59% der im
Blutkreislauf vorhandenen Liposomen entfernt. Dieses Ergebnis korreliert gut mit den
Ergebnisse von Eckes et al., und von Giannini et al. Pütz und al., und Giannini et al., konnten
mit ihren Plasmapheresemodell entsprechend 62 % und 64% der im Kreislauf noch
vorhandenen Partikeln entfernen (Eckes et al., 2011; Giannini et al. 2005).
Der schnelle Abfall wurde in den ersten 4 Waschschritten beobachtet. Fast 48% der Partikeln
wurden in diesen 4 ersten Waschritten schon entfernt. Pütz et al., berichtete von einer starke
Abnahme der Partikeln in den ersten Phasen der Plasmapherese. Sie haben nach der Wäsche
von den 1 und 2 Liter Blut jeweils ~40 und ~23% von den Liposomen in den Kreislauf
entfernen können (Pütz et al., 2010). Bei den 6. Und 7. Waschschritte wurden fast kein
Unterschied mehr beobachtet, so dass wir sagen konnten, dass mehr als 7 Waschschritten
nicht unbedingt zu einem besseren Ergebnis führt.
Pütz et al., benutzen eine DMF für die Plasmapherese. Dadurch dass, es schwierig war diese
DMF bei Ratten durchzuführen, haben wir die erste Filtration, das heißt die Trennung von
145
Diskussion
Blutbestandteilen und Plasma, durch die Zentrifugation ersetzt. Die Zentrifugation erwies sich
schneller und besser praktikabel als die Filtration. Somit wurden die Zeit zur Durchführung
der Plasmapherese deutlich verkürzt und die Ratte musste nicht mehr lange betäubt werden.
Die zweite Filtration erfolgte wie bei der DMF mit einem Lipid- oder Liposomenfilter. Der
Filter hat nur einen kleinen Totraum. Bei großer Liposomen-Konzentration waren sie
verstopft und müssten nach jeder zweiten Filtration durchgespült werden. Der Filter erfüllte
ganz seine Funktion bei Betrachtung des Rückhaltevermögens des Filters. Der Filter hat
kleine Poren (Siehe Abb. 2.2.3.3). Dies erschwerte den Durchgang der Moleküle mit hohem
Molekulargewicht. So wurden Antikörper und Albumin teilweise mitentfernt. Die Filtration
wurde manuell durchgeführt. Wie schon Pütz et al., erwähnt hatte führt ein zu starke Druck zu
einer Zerstörung der Partikeln, so können eingekapselte Wirkstoffe wie Doxorubicin nicht
filtriert werden und gelangen im Kreislauf obwohl sie zu entfernen war. Bei der Filtration
wurden geringe Drücke eingesetzt, eine Zerstörung der Liposomen wurde nicht beobachtet.
Einer Alternative zur
zweiten Filtration wäre ein Plasmaaustausch oder eine
Plasmasubstitution da die Tiere von derselben Inzucht stammten. Das Plasma sollte vorher
von anderen Ratten abgenommen und aufbewahrt werden. Die Entscheidung blieb bei
derFiltrationsmethode um die Rattenanzahl möglichst zu begrenzen.
Die Benutzung von Isofluran als Betäubungsmittel brachte viele Vorteile. Im Vergleich zu der
Mischung Ketamin/Rompun, war sie gut steuerbar. Die Aufwachzeit der Tiere, die die
Mischung Ketamin/Rompun bekamen, konnte nicht definiert werden. Diese Art der
Betäubung war nicht genau steuerbar. Die Blutentnahme erwies sich als sehr schwierig. Der
Blutdruck fiel nach der Betäubung so stark, dass manchmal nicht mehr möglich war, Blut
abzunehmen. Das Blut hatte eine dunkle rote Farbe, fast schwarz. Diese deutete auf einen
Sauerstoffmangel. Durch die Abnahme wurden die Erythrozyten für eine kurze Zeit aus dem
Sauerstoffkreislauf entzogen. Durch die Anwendung von Isofluran wurde ein starker Abfall
des Blutdruckes verhindert. Die Blutentnahme war dadurch leichter. Durch die gute
Steuerbarkeit von Isofluran, wurden die Ratten bereits 1 min nach dem Abschalten von
Isofluran wieder wach.
Die Plasmapherese erforderte präzise Arbeiten. Das mehrmalige Stechen der Schwanzvene
könnte diese beschädigen so dass der Versuch nicht mehr durchgeführt werden kann. Die
Applikation von Heparin erleichterte das Abfließen vom Blut somit wurde die Dauer der
Plasmapherese auch verkürzt. Für eine schnelle und saubere Plasmapherese werden zwei
Personen benötigt.
146
Diskussion
Die diskontinuierliche Plasmapherese wurde erfolgreich bei kleinen Tieren entwickelt und
kann weitgehend problemlos angewendet werden.
4.4 Anreicherung und Plasmapherese
Durch die Plasmapherese wurden in unserem Modell im Durchschnitt ~59% der im
Blutkreislauf zirkulierenden Liposomen entfernt. Bisher ist nicht bekannt, ob eine schnelle
Reduktion der zirkulierenden Menge an Liposomen im Blut zu einem Verlust von bereits im
Tumor oder anderen Organen angereicherten Liposomen führt. Ob die bereits im Tumor und
der Haut angereicherten Liposomen durch die Plasmapherese entfernt werden, wurde hier
untersucht. Die Plasmapherese wurde aufgrund der Plasmahalbwertszeit der Liposomen 22 h
nach Injektion der Liposomen durchgeführt. Dieser Zeitpunkt wurde gewählt, damit noch eine
relevante Menge an Liposomen im Plasma zirkuliert, bei diesen Bedingungen etwa 60-70%
der ursprünglichen Liposmengabe. Nach der Plasmapherese wurde ein Verlust von nur ~3%
der Fluoreszenzintensität der Liposomen in Tumor registriert. Im Tumorbereich erwies sich
der geringere Verlust der Fluoreszenz nach der Plasmapherese als nicht signifikant. Damit
kann die Akkumulation von Liposomen im Tumor, vermittelt durch den EPR-Effekt, als
weitestgehend irreversibel angesehen werden.
Die starke Reduktion der Liposomen im Kreislauf durch die Plasmapherese wirkt sich
vorteilhaft auf die Nebenwirkungen einer PLD-Therapie aus. Im Rahmen der CARL-Studie
konnte gezeigt werden, dass die dosislimitierenden Nebenwirkungen wie Palmar-PlantarErythrodysesthesie (PPE) auch
„hand-foot-syndrome“ werden durch eine Plasmapherese
stark reduziert werden können (Eckes et al., 2011). Die Effizienz der Therapie korreliert mit
der Menge an Wirkstoff im Tumor. Durch die irreversible Anreicherung der Liposomen im
Tumor auch bei Anwendung einer
Plasmapherese sollte therapeutisch kein Nachteil
entstehen‚ Auf Grund der geringen Patientenzahl konnte über einen möglichen Einfluss der
Plasmapherese auf die Effizienz der Tumortherapie in der CARL-Studie keine Aussage
getroffen werden. Da die Tumore der bekannten Tiermodelle und die Tumore des Menschen
prinzipiell denselben Aufbau besitzen ist ein signifikanter Verlust von Liposomen im Tumor
beim Menschen sehr unwahrscheinlich. Dementsprechend führt eine CARL-Therapie
wahrscheinlich nicht zu einem Verlust der Therapieeffizienz.
Das Endothelgewebe in den Tumor ist nicht dicht verschlossen. Aus diesem Grund können
die Liposomen einfacher in den Tumoren akkumulieren als in Geweben mit geschlossenen
Endothelien. Die akkumulierten Liposomen bleiben aber meist nur in der Peripherie (Ekdawi
et al., 2015; Maeda, 2013) des Tumors. Trotzdem wurden die akkumulierten Liposomen im
147
Diskussion
Tumor bei der Plasmapherese nicht entfernt. Warum die angereicherten Liposomen bei der
Plasmapherese nicht entfernt werden ist nicht bekannt. Die Gründe für die Retention der
Partikeln im Tumor wurden im Abschnitt (Akkumulation) diskutiert. Dieses Ergebnis
bestätigt zunächst, dass kein zirkulierender Kreislauf im Tumor für die Liposomen mit Größe
über 100 nm besteht (Maeda et al. 2002). Das Tumorgewebe erlaubt eine schnelle
Anreicherung der Liposomen und eine gute Retention. Sogar ein kurzfristig eingestellter
deutlicher liposomaler Konzentrationsunterschied zwischen Blutkreislauf und Tumor
verursacht durch die Plasmapherese führt nicht zu einer Rückkehr der Liposomen in
Blutkreislauf. Im Tumor findet in dem Plasmapherese-Zeitraum in der Kontrollgruppe eine
Steigerung der Fluoreszenzintensität statt, da der Zeitpunkt der maximalen Anreicherung noch
nicht erreicht ist. Bei diesen Tieren sind noch genug Liposomen in Kreislauf für eine weitere
Anreicherung vorhanden. In den Plasmapheresegruppe wurden die im Kreislauf
zirkulierenden
Liposomen
größtenteils
entfernt,
es
folgte
keine
Zunahme
der
Fluoreszenzintensität mehr.
Der Zeitpunkt der Durchführung der Plasmapherese stellt einen weiteren wichtigen Punkt dar.
Wegen der Plasmahalbwertszeit der Liposomen, die bei ~29 h liegt, wurde die Plasmapherese
für den Nachweis einer irreversiblen Anreicherung 22 h nach Injektion der Liposomen
durchgeführt. Die Plasmapherese sollte idealerweise erst durchgeführt werden wenn die
Liposomen sich maximal im Tumor angereichert haben. Der Zeitpunkt der maximalen
Anreicherung der Liposomen im Tumor liegt in unserem Modell bei ~41 h. Nach 41 h sind
bei einer Halbwertszeit von 29 h jedoch nur noch ~37% der injizierten Liposomen im
Kreislauf vorhanden. Eine Plasmapherese entfernt ca. 59% der zirkulierenden Liposomen, so
dass eine Plasmapherese nach 41 h entsprechend noch etwa 19% der ursprünglichen
Liposomengabe entfernen würde. Dementsprechend wäre ein Effekt der Plasmapherese auf
die Anreicherung der Liposomen sehr klein. Bei einer höheren Plasmahalbwertszeit der
Partikeln wie bei PLD, wäre eine späte Durchführung der Plasmapherese nach dem
Anreicherungsmaximum empfehlenswert.
In der Haut, den Ohren und den Pfoten betrug die Abnahme der Fluoreszenzintensität nach
der Plasmapherese jeweils ~25, ~47 und ~24%. Diese Regionen sind von der Plasmapherese
stark betroffen. Die Abnahme der Fluoreszenzintensität war in der Haut, Ohren und Pfoten
deutlich stärker als im Tumor und erwies sich mittels eines Student t-tests als signifikant.
Diese
Regionen
sind
jedoch
stark
durchblutet.
Werden
die
gemessenen
Fluoreszenzintensitäten um die geschätzt aus dem Blut stammenden Fluoreszenzen korrigiert,
so zeigt sich, dass in der Haut und den Pfoten auch eine geringe Akkumulation stattfindet, die
148
Diskussion
ähnlich wie im Tumor irreversibel ist. Die Eliminierten Liposomen stammen sehr
wahrscheinlich
aus
dem
Blutkreislauf
(siehe
Abb.
21).
Die
Verläufe
der
Fluoreszenzintensitätsabnahmen nach der Plasmapherese in der Haut, Ohren und Pfoten
sowohl in der Kontrollgruppe als auch in der Plasmapheresegruppe sind fast identisch.
Liposomen reichern sich nicht nur im Tumor sondern auch in Leber, Milz, Haut und den
Extremitäten an (Charrois et Allen, 2003). Die Anreicherung verläuft in verschiedenen
Organen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Die Anreicherung im Tumor verläuft
schneller als in der Haut. Die Therapie von Karzinomen mit liposomalen Doxorubicin (PLD)
ist von starken Nebenwirkungen begleitet. Die Anreicherung von PLD in den Extremitäten
zum Beispiel führt zu einer Palmar-Plantar-Erythrodysesthesie (PPE) auch
„hand-foot-
syndrome“ genannt. Eine Plasmapherese könnte die Nebenwirkungen reduzieren falls die
Akkumulation irreversibel ist (CARL-Projekt (Pütz et al., 2009)). Diese Ergebnisse bestätigen
die CARL-Theorie von Pütz et al. (Pütz et al., 2010).
4.5 Therapieversuche
PLD wird für die Therapie von Karzinomen angewendet, mit guten Therapieergebnissen. Die
guten Therapieergebnisse sind begleitet von vielen Nebenwirkungen. Um weitere
Erkenntnisse zur Unterstützung des CARL-Projektes zu gewinnen, wurden Therapieversuche
zur Kombination von PLD und Apherese an tumortragenden Ratten durchgeführt. Für die
Therapieversuche wurden den tumortragenden Ratten 4,5; 9 oder 14 mg/kg KGW PLD
intravenös appliziert. Eine Gruppe wurde zusätzlich mit der Plasmapherese behandelt.
Tumorgröße und Tumorzellaktivität wurden während der gesamten Versuchszeit gemessen.
Diese Parameter dienten als Maßstab für die Bewertung der Therapieeffizienz. Rattengewicht
und Nebenwirkungen wurden aufgezeichnet, wobei das Rattengewicht ein Parameter für die
allgemeine Belastung der Ratte durch PLD, Tumor und eventuelle Plasmapherese diente. Für
die Arbeit wurde mit einem einem syngenen Tumormodell gearbeitet. Bei diesem Modell
sind die Ratten nicht immunsupprimiert. Eine Immunsuppression wäre bei der PLD-Therapie
in Kombination mit der Plasmapheresebelastung von Nachteil, da die Plasmapherese nicht
steril abläuft und durch die Therapie das Immunsystem belastet wird (Siehe Tabelle 7).
Infektionen wurden während der Versuche nicht beobachtet. Ein syngenes Tiermodell hat den
Nachteil, dass nicht mit humanen Tumorzellen gearbeitet wird. PLD hat jedoch bereits in
vielen verschiedenen humanen Zelllinien seine Wirksamkeit gezeigt (Vaage et al., 1993;
Williams et al., 1993). Für die Anreicherung und die Effekte der Plasmapherese, ist der EPREffekt und damit die Architektur der den Tumor versorgenden Blutgefässe ausschlaggebend.
149
Diskussion
Die Durchblutung des Tumors unterscheidet sich zwar je nach Wachstumsgeschwindigkeit
des Tumors, Speziesunterschiede bezüglich der Herkunft der Tumorzellen wurden bisher
jedoch nicht beschrieben. Die Tumoren wuchsen in dem hier verwendeten Tiermodell ohne
Therapie sehr schnell, innerhalb von etwa 10 - 16 Tagen waren die Abbruchkriterien erreicht.
Dementsprechend kann auf einen gut durchbluteten Tumor geschlossen werden.
4.5.1 Plasmahalbwertszeit von PLD
Zur Untersuchung der Plasmahalbwertszeiten von verschiedenen PLD-Konzentrationen
wurden den tumortragenden Ratten 4,5, 9 und 14 mg/kg KGW PLD appliziert. Blut wurde
nach verschiedenen Zeiten abgenommen und analysiert. Die Plasmahalbwertszeiten betrugen
jeweils 36, 52 und 78 h. Die ermittelten Plasmahalbwertszeiten korrelieren mit in den
Ergebnissen von Allen et al., 1979. Die Halbwertszeiten sind abhängig von der PLDKonzentration. Je höher die Konzentration desto länger die Halbwertszeit der Partikeln im
Kreislauf (Charrois et Allen 2003). Wenn in Liposomen Wirkstoffe eingeschlossen sind,
hängt ihre Plasmahalbwertszeit von der Geschwindigkeit, wie schnell der Wirkstoff aus dem
Träger leckt, ab. Eine Schnelle vorzeitige Freisetzung der Wirkstoffe führt zu einer schnellen
Elimination der Liposomen im Kreislauf (Drummond et al., 1999; Gabizon et al., 1995). Die
Verkapselung von Doxorubicin in den PEGylierten Liposomen verlängert die Zirkulationszeit
von Doxorubicin in Blut. Doxorubicin hat eine Halbwertszeit im Plasma nur von ca. 5 min
(Yong-Jiang Zhao et al., 2009; Rahman et al., 1986). Der Spiegel von Doxorubicin im Plasma
ist normalerweise dreiphasisch mit Halbwertszeiten von 12 Minuten, 3 und 30 Stunden. Die
relativ lange terminale Eliminationshalbwertszeit von 3 und 30 h hängt meist mit der
intensiven Gewebsbindung zusammen (Rahman et al., 1986). Im Vergleich zu dem
angewendeten Liposomenmodell in dieser Arbeit hat PLD eine deutlich längere
Plasmahalbwertszeit.
4.5.2 Behandlung mit 4,5 mg/kg KGW PLD
Das Rattengewicht der beiden Gruppen verlief bis 5 Tage nach Therapie gleich. Danach
verlor die Kontrollgruppe weiter an Gewicht. Die andere Gruppe, die Plasmapherese als
Zusatzbehandlung bekam nahm schon an Gewicht zu. Wegen der Halbwertszeit von 36,5 h
wurde die Plasmapherese schon 24 h nach Applikation von PLD durchgeführt. Die
Betrachtung der Therapieeffizienz mittels Luziferaseexpression (Siehe Abb. 31) zeigt, dass
beide Gruppen auf PLD ansprechen. Trotz unterschiedlichem Tumorwachstum waren die
Effekte nach 13 Tagen bei den beiden Gruppen identisch. Die Luziferaseexpression der
150
Diskussion
Tumorzellen und Tumorwachstum korrelieren nicht miteinander. Diese Unterschiede könnten
auf eine nicht stabile Klonierung der Tumorzellen hindeuten. Möglicherweise führt auch die
fehlende Selektion in vivo zu einem beschleunigten Wachstum von Tumorzellen ohne
Reporterplasmid.
Die Unterschiede in dem Tumorwachstum der beiden Gruppen am Ende des Versuches waren
groß. Die Tumoren in der Kontrollgruppe wuchsen mit einer Verzögerung zwischen Tag 5
und Tag 8. Die Verzögerung des Tumorwachstums in der Kontrollgruppe zeigt auf einer Seite
die Sensitivität der Zellen gegen PLD, auf der anderen Seite reicht die einmalige Gabe von
4,5 mg PLD nicht für eine effektive Therapie. In der Plasmapheresegruppe wuchsen die
Tumoren weiter ohne Verzögerung auf. Die Akkumulation von PLD im Tumor war noch
nicht abgeschlossen als die Plasmapherese durchgeführt wurde. Die Durchführung der
Plasmapherese nach 24 h erwies sich möglicherweise als zu früh. Bei der Konzentration von
PLD waren keine äußeren Nebenwirkungen sichtbar sowohl in der Kontrollgruppe als auch
bei der Plasmapheresegruppe.
Insgesamt bei Betrachtung der Tumorgrößenentwicklung und Therapieeffizienz führt die
Durchführung der Plasmapherese 24 h nach 4,5 mg/kg KGW PLD-Applikation zu einer
Verschlechterung der Therapie. Beim Rattengewicht nahm die Plasmapheresegruppe
schneller wieder an Gewicht zu als die Kontrollgruppe. Hier bringt die Plasmapherese einen
Vorteil.
Die Plasmapherese bringt einen besseren Effekt bezüglich des Gewichts. Wenn man aber
Tumorgröße und Therapieeffizienz dazu betrachtet führt die Plasmapherese bei der PLDDosis von 4,5 mg/kg KGW nicht zu einem positiven Effekt.
Die Plasmapherese sollte deshalb bei einer geringen Dosis allenfalls nach Erreichen des
Akkumulationsmaximums durchgeführt werden, sie bringt bei einer Dosis ohne relevante
Nebenwirkungen jedoch keinen sichtbaren Vorteil.
4.5.3 Behandlung mit 9 mg/kg KGW PLD
Die Therapie mit 9 mg/kg KGW PLD in Kombination mit der Plasmapherese wurde
untersucht. Die Kontrollgruppe bekam nur PLD, die zweite, dritte und vierte Gruppe bekamen
jeweils zusätzlich eine Plasmapherese Behandlung 24,36 und 48 h nach PLD-Applikation.
Die Gruppen die mit einer Plasmapherese behandelt wurden, verloren die ersten Tage etwas
mehr Gewicht als die Kontrollgruppe ohne Plasmapherese. Die Plasmapherese stellt somit
generell eine zusätzliche Belastung dar. Durch die Betäubung und den unvermeidlichen
Blutverlust während der Blutabnahme sind die tumortragenden Ratten vermutlich etwas
151
Diskussion
geschwächt und benötigen wahrscheinlich ein paar Tage um sich zu erholen. Am Tag 8 nach
Therapie fingen die Ratten der Plasmapheresegruppe nach 24 und 36 h schon an, Gewicht zu
gewinnen, während die Kontrollgruppe weiter an Gewicht verlor. Die Gruppe mit
Plasmapherese nach 48 h konnte nicht lange verfolgt werden, weil sie nach wenigen Tagen
über 20% ihres Initialgewichtes verloren hatten und somit in Übereinstimmung mit den
Abbruchkriterien getötet wurden. Bei einer Plasmapherese nach 36 h überwiegt die geringere
Belastung des Tieres durch die entfernten Chemotherapeutika, während bei einer
Plasmapherese nach 48 h dieser Effekt geringer ausfällt, und die zusätzliche Belastung des
Organismus durch die Plasmapherese überwiegt. Bei der Betrachtung des Tumorvolumens
stieg die Kurve der Plasmapheresegruppe nach 24 h zunächst an, dann folgte eine Abnahme.
Ab Tag 12 nach PLD-Gabe stieg das Volumen wieder schnell an. Die Durchführung der
Plasmapherese nach 24 h ist sowohl bei einer PLD Konzentration von 4,5 mg/kg KGW als
auch vom 9 mg/kg KGW noch viel zu früh. Die Tumoren sind noch nicht maximal mit den
PLD angereichert sind. Eine Erfolgreiche Therapie kann somit nicht erreicht werden. Bei der
Gruppe mit Plasmapherese nach 48 h, wurden die Ratten aufgrund starker Nebenwirkungen
eingeschläfert. Die Kombination einer langen Zirkulationsphase von PLD und einer
Plasmapherese waren für die Tiere sehr belasten. Diese Gruppe zeigten ähnliche
Nebenwirkungen wie die Kontrollgruppe ohne Plasmapherese. PLD hatte reichlich Zeit sich
in den gesunden Geweben anzureichern. Die Gruppe mit Plasmapherese nach 36 h mit 9 mg
PLD zeigte deutlich bessere Ergebnis im Vergleich zu anderen Gruppen. Das Tumorvolumen
ging nach einem kurzen Anstieg ständig nach unten, ähnlich wie bei der Kontrollgruppe. Die
Nebenwirkungen bei der Gruppe mit Plasmapherese nach 36 h waren deutlich weniger als bei
der Kontrollgruppe.
Aufgrund interindividueller Unterschiede wuchsen die Tumoren unterschiedlich. Erst 5 Tage
nach PLD-Gabe wurde der Effekt auf die Luziferaseexpression beobachtet. Das
Luziferasesignal alle Gruppen fiel stark nach 5 Tagen. Die MAT B III-Luc-Zellen sind
empfindlich
gegen
PLD.
Eine
Korrelation
zwischen
Tumorvolumen
und
die
Luziferaseexpression der Zellen war jedoch nicht möglich. Es wurde manchmal kein Signal
gemessen obwohl der Tumor noch vorhanden war und manchmal weiter wuchs. Die
Vermutung liegt nahe, dass die Zellen nicht stabil kloniert wurden oder die Zellen in vivo
aufgrund fehlender Selektion das Luziferase-Plasmid schneller während ihrer Teilung
verlieren. In Nekrosebereich kann die Luziferaseexpression nicht gemessen werden. Häufig
weisen
größere Tumore in ihrem
Zentrum nekrotische Bereiche auf.
Bei der
Tumorgrößenbestimmung mit einem Messschieber wird dieser Nekrosebereich durch die
152
Diskussion
Einkapselung in der Tumorhülle mit erfasst, so dass der aktive Anteil der Tumore geringer ist
als die Gesamtgröße vermuten lässt.
Die Nebenwirkungen wie Verkrustungen in Augenbereich, Nässe im Genitalbereich nur bei
der Kontrollgruppe, Rötung und Ödeme an Pfoten und Haut wurden bei 9 mg/kg KGW PLD
gut sichtbar. Bei der Plasmapheresegruppe sowohl bei 24 h als bei 36 h waren fast keine
Nebenwirkungen oder nur schwach ausgeprägte Nebenwirkungen zu beobachten.
Eine gewisse primäre Belastung der Tiere durch die Plasmapherese kann auch anhand der
Blutparameter beobachtet werden. Bei den Plasmaphereseratten waren 6 Tage nach Therapie
die Parameter HGB, RBC und WBC schlechter als die entsprechenden Werte der
Kontrollratten.
Aber
15
Tage
nach
Therapie
waren
die
Blutparameter
der
Plasmapheresegruppe besser als die der Kontrollgruppe, so dass langfristig, wie schon beim
Gewicht
der
Tiere
beobachtet,
die
geringere
Belastung
der
Tiere
durch
das
Chemotherapeutikum überwog.
Bei 9 mg/kg KGW PLD zeigte die Plasmapherese sowohl hinsichtlich Nebenwirkungen als
auch hinsichtlich Therapiewirkung einen deutlichen Vorteil trotz der zusätzlichen primären
Belastung durch die Blutwääsche.
Die Behandlung mit 9 mg/kg KGW PLD und Plasmapherese 48 h nach PLD führte zu einer
Verschlechterung des allgemeinen Zustands der Ratten und zu mehr Nebenwirkungen. Wird
die Plasmapherese zu spät durchgeführt, haben sich die Nebenwirkungen bereits manifestiert
und die Entlastung des Organismus durch die Elimination eines kleinen Teils an
Chemotherapeutika fällt zu gering aus, um einen positiven Gesamteffekt zu erzielen.
4.5.4 Behandlung mit 14 mg/kg KGW PLD
Der Effekt der Plasmapherese wurde auch bei einer sehr hohen Dosis von 14 mg/kg KGW
untersucht. Zwei Gruppen bekamen jeweils 14 mg PLD. Eine Gruppe wurde zusätzlich mit
der Plasmapherese 36 h nach PLD-Gabe behandelt. Die tumortragenden Ratten zeigten
erheblichen Nebenwirkungen. Die Tiere der Kontrollgruppe mussten bereits nach
durchschnittlich 11 Tagen nach PLD-Gabe aus den Versuchen genommen und eingeschläfert
werden, weil sie 20% ihres Initialgewichtes verloren hatten. Die Plasmapheresegruppe verlor
zwar in den ersten 8 Tagen nach PLD-Gabe (entsprechend 6,5 Tage nach der Plasmapherese)
mehr Gewicht als die Kontrollgruppe, trotz dieses schnellen Gewichtsverlusts in den ersten
Tagen nahmen die tumortragenden Ratten der Plasmapheresegruppe danach wieder an
Gewicht zu. Die Abbruchkriterien wurden in dieser Gruppe nicht erreicht. Die Tumorvolumen
der beiden Gruppen verliefen bis zur Euthanasie der Kontrollgruppe gleich. Wegen der hohen
153
Diskussion
PLD-Konzentration waren die Nebenwirkungen dementsprechend stark ausgeprägt, deutlich
stärker als bei der Therapie mit 9 mg/kg KGW PLD. Nur durch die Plasmapherese konnte die
Ratten bei einer Konzentration von 14 mg/kg KGW PLD überleben. Die Nebenwirkungen
waren im Beobachtungszeitraum nur mittelmäßig ausgeprägt, deutlich geringer als in der
Kontrollgruppe. Sie waren jedoch entsprechend stärker als in der gruppe mit 9 mg/kg KGW
PLD.
Die Luziferaseexpression bei der Plasmapherese- und Kontrollgruppe verlief ähnlich,
charakterisiert durch einen steilen Abfall nahezu vollständigen Abfall der Luziferaseintensität.
Bei dieser hohen Konzentration konnten keine Unterschiede in der Therapie mit oder ohne
Plasmapherese beobachtet werden. Beim Tumorvolumen ist ein Vergleich wegen
interindividueller Unterschiede schwierig. Beide Gruppen zeigen eine deutliche Regression
des Tumorvolumens. Bei der Kontrollegruppe stieg das Volum nach Tag 8 wieder leicht an,
Dieser Anstieg ist jedoch in Anbetracht der großen interindividuellen Varianz schwer zu
beurteilen. Der Abfall Luziferazeexpression ist erwartungsgemäß bei 14 mg/kg KGW PLD
viel stärker als bei 9 mg/kg KGW PLD.
Eine Erhöhung der Dosis von 9 mg/kg KGW PLD auf 14 mg mit Plasmapherese nach 36 h
brachte interessanterweise keine therapeutischen Vorteile mehr. Mit 14 mg/kg KGW brauchte
die Plasmapheresegruppe länger, um wieder an Gewicht zuzunehmen, als bei 9 mg/kg KGW.
Am Ende der Versuche hatte die Gruppe mit 9 mg/kg KGW PLD schon 4% mehr Gewichte,
und die Gruppe mit 14 mg/kg KGW noch 10% weniger als ihre jeweiligen Initialgewichte vor
Therapie. Möglicherweise führt ein schlechter Allgemeinzustand der Tiere zu einem
vermehrten Tumorwachstum, da die Mechanismen des organismus, das Tumorwachstum zu
bremsen, auch verringert werden.
Fazit: Eine erfolgreiche Tumortherapie mit PLD stützt sich auf eine gute Wirksamkeit von
PLD. Die Nebenwirkungen haben einen Einfluss auf die Effizienz der Therapie. Die
Plasmapherese kann
die nebenwirkungen in ihrer Häufigkeit und ihrem Schweregrad
verringern. Eine gute Balance zwischen Therapiedosis und die Zeit der Durchführung der
Plasmapherese ist wichtig. Plasmapherese sollte nicht bei zu kleiner PLD-Dosis (4,5 mg/kg
KGW) durchgeführt werden. Eine
Dosis von 14 mg/kg KGW ist in dem verwendeten
Rattentumormodell mit starkem Gewichtsverlust verbunden. Hier wird die Plasmapherese
dringend notwendig für das Überleben der Tiere. Eine späte Durchführung der Plasmapherese
(nach 48 h) führt nicht zu weniger Nebenwirkungen. Die Dosis von 9 mg/kg KGW in
154
Diskussion
Kombination mit einer Plasmapherese nach 36 h eignete sich in dem hier beschriebenen
Tiermodell gut für eine erfolgreiche Tumortherapie.
4.6
Implikationen der Ergebnisse aus den Tierversuchen für die weitere
Entwicklung des CARL-Projektes
Diese Arbeit wurde im Rahmen des CARL-Projektes durchgeführt um weitere Erkenntnisse
zu den zu Grunde liegenden Mechanismen zu gewinnen. PLD eignet sich gut für die Therapie
von Krebs bei Menschen. PLD zeigt bislang gute Therapieerfolge, ist aber von vielen
dosislimitierenden Nebenwirkungen begleitet (Lyass et al., 2000). Das erste Ziel der CARLTherapie ist eine Reduktion der Nebenwirkungen bei einer PLD-Therapie ohne Verlust der
Therapieeffizienz
(Pütz
et
Knochenmarkdepression, PPE
al.,
2009).
Manche
Nebenwirkungen
wie
die
und Mucositis konnten durch die Plasmapherese deutlich
reduziert werden, und somit konnte die Lebensqualität der Patienten gesteigert werden.
(Eckes et al., 2011). Die Milderung der Nebenwirkungen bei Einsatz einer Plasmapherese
könnte beim Menschen neue Therapieansätze öffnen. So könnte die Kombination einer
erhöhten Dosis PLD mit einer Plasmapherese eine Steigerung der Therapieeffizienz bei
gleichbleibenden oder gar Verringerten Nebenwirkungen erlauben.
Die Anreicherung von PLD kann beim menschen nicht verfolgt werden. Obwohl theoretische
Überlegungen einen Rückstrom von bereits angereicherten Liposomen aus dem Tumor in die
Zirkulation unwahrscheinlich machen, war diese Annahme bisher nicht experimentell
überprüft. Der EPR-Effekt in Kombination mit der Plasmapherese konnte bisher
nicht
untersucht werden, obwohl sehr viel schon über die vermehrten Anreicherung und Retention
der Partikeln im Tumor bekannt ist (Maeda et al., 2001).
Die Plasmapherese von Liposomen wurde bei Kleintieren etabliert und mit ähnlichen
Eliminationsraten angewendet, wie sie für human-therapeutische Systeme bekannt sind. Das
Anreicherungsmaximum lag in unserem Tiermodell bei ~41 h. Aufgrund der kurzen
Plasmahalbwertszeit der Liposomen wurde die Plasmapherese bei Farbstoff markierten
Liposomen nach ~22 h durchgeführt. Die angereicherten Liposomen wurden während der
Plasmapherese nicht entfernt. Die Theorie der Retention (Nehoff et al., 2014; Kobayashi et
al., 2013; Greish, 2007; Maeda et al., 2001) wurde dadurch erstmals experimentell bestätigt.
Die Plasmapherese kann bei Wahl des richtigen Zeitpunktes sinnvoll angewendet werden.
Ein Verlust der Therapieeffizienz ist nicht zu befürchten wenn die Plasmapherese nach dem
Erreichen des Anreicherungsmaximums durchgeführt wird. Allerdings kann aus den Daten
aus dem Tiermodell nicht unbedingt auf die Anreicherungsgeschwindigkeit von humanen
155
Diskussion
Tumoren geschlossen werden. Das Anreicherungsmaximum zeigt deutliche interindividuelle
Unterschiede. Es liegt unter den gewählten Bedingungen zwischen 24 und 56 h
(Extremwerte). Eine persönliche Abstimmung und Anpassung für jede Patientin ist wegen
fehlenden Monitorverfahren derzeit nicht möglich.
Die Plasmapherese stellt bei Kleintieren eine zusätzliche Belastung dar. Diese Belastung ist
beim Menschen deutlich geringer, sie zeigt sich eventuell in einer leicht gestiegenen Rate an
Fatigue (Eckes et al., 2011). Patienten vertragen die Plasmapherese meist gut,
Nebenwirkungen durch die Plasmapherese selber treten praktisch nicht auf (Eckes et al.,
2011). Die Apparaturen, die bei der therapeutischen Apherese eingesetzt werden sind weit
entwickelt und das System ist geschlossen (Pütz et al., 2010). Bei den Kleintieren ist das
System diskontinuierlich und einfacherer aufgebaut. Ein geringes Blutvolumen geht bei der
Methode verloren. Im Gegensatz zur therapeutischen Apherese geht bei den im Tierversuch
verwendeten Filtern ein höherer Anteil an Plasmaproteinen verloren. Zusätzlich werden die
Tiere zur Plasmapherese narkotisiert. Trotz dieser Belastungen konnten sich die Ratten mit
Plasmapherese schneller erholen als die Kontrollgruppen ohne Plasmapherese. Die
Durchführung der Plasmapherese nach 36 h zeigte bessere Ergebnisse als nach 24 und 48 h.
Trotz des großen Intervalls der maximalen Anreicherungszeiten zeigte die Durchführung der
Plasmapherese nach 36 h allgemein gute Ergebnisse, obwohl sie etwas vor dem Erreichen des
Anreicherungsmaximums liegt. Da die Anreicherung jedoch nicht linear verläuft spielt der
Unterschied wahrscheinlich nur eine untergeordnete Rolle für die Therapieeffizienz. Auf der
anderen Seite ist die rechtzeitige Entfernung der zirkulierenden Liposomen für eine sinnvolle
Entlastung des organismus von nöten. Je länger die PLD im Kreislauf zirkuliert reichern sich
auch in gesunden Geweben an und verursachen mehr Nebenwirkungen.
In den Therapiestudien dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Kombination von Dosis und
Plasmapherese wichtig ist. Die Therapie mit 9 und 14 mg/kg KGW PLD mit Plasmapherese
nach 36 h zeigte gute Ergebnisse. Die Nebenwirkungen mit 9 mg/kg KGW waren mittelmäßig
und konnten mit der Plasmapherese fast komplett gemildert werden. Bei 14 mg/kg KGW PLD
waren die Nebenwirkungen ohne Plasmapherese erheblich. Mit Hilfe der Plasmapherese
wurden auch in unserem Tiermodell die Nebenwirkungen deutlich reduziert. Die Milderung
der Nebenwirkungen bestätigt im Tiermodell die Ergebnisse der CARL-Studie (Eckes et al.,
2011) und unterstützen die Anwendung einer Plasmapherese in Kombination mit einer PLDTherapie.
Mehrere
Studien
mit
verschiedenen
Therapieschemata
wurden
bereits
durchgeführt, um zu untersuchen, wie die Nebenwirkungen vermindert werden können. In
seiner Arbeit konnte Al-Batran S.-E. et al., durch Reduktion der Dosis 50 mg/m² auf 40
156
Diskussion
mg/m² die Nebenwirkungen wie Palmar-Plantar-Erythrodysästhesie (PPE) und Stomatitis
deutlich mildern (Al-Batran et al., 2006). Die Patienten zeigten bei 40 mg/m2 weniger PPE et
Stomatitis als Patienten die mit Therapie mit 50 mg/m² behandelt wurden. Ob dieses
Therapieschema einen gleichbleibenden Therapieerfolg aufweist ist allerdings fraglich. Eine
Kombination der Plasmapherese eignet sich vermutlich besser, da die Verringerung der Dosis
um 20% entsprechend zu einer direkten Verringerung der PLD-Menge im Tumor um 20%
führt, die Plasmapherese bei Beibehaltung der ursprünglichen Dosis jedoch allenfalls zu einer
geringfügig verringerten Dosis im Tumor führen sollte, selbst wenn der maximale Zeitpunkt
der Anreicherung noch nicht erreicht ist. Bislang wird bei Menschen aufgrund
Nebenwirkungen meist 40 mg/m² PLD alle 4 Wochen angewendet (Eckes et al., 2011;
Lorusso et al., 2007; Lyass et al., 2000), obwohl die empfohlene Dosis 50 mg/m2 beträgt. In
Kombination mit der Plasmapherese wäre auch eine Behandlung mit PLD alle 3 Wochen
vertretbar. Durch die deutliche Reduktion der dosislimitierenden Nebenwirkungen ohne
Therapieverlust nach Durchführung der Plasmapherese, wäre eine Verkürzung der
Applikationsintervalle von PLD auf alle 3 Wochen in Kombination mit der Plasmapherese gut
vertretbar. Studien wurden durchgeführt um die beste Applikationsschema von PLD zu
erforschen (Charrois und Allen, 2003; Allen und Hansen, 1991). Eine Therapie mit einer
einmaligen hohe Dosis PLD (18 mg/kg KGW) führte im Mausmodell zu besseren
Therapieerfolge als eine Therapie mit zwei Dosen 9 mg/kg KGW pro Woche (Charrois et al.,
2003). Der AUC in Tumor bei einer einmaligen Gabe von 18 mg/kg KGW PLD ist höher als
die wöchentliche doppelte Dosis von 9 mg/kg KGW PLD. Die Versuche dauerten
durchschnittlich 14 Tage. Die Nebenwirkungen wie PPE waren bei wiederholten Dosen
stärker. Bei jeweils einer einmaligen PLD-Gabe in Kombination mit der Plasmapherese,
führte die Therapie mit 14 mg PLD/kg KGW nicht zu besseren Ergebnissen als mit 9 mg. In
unseren Arbeit konnte somit gezeigt werden, dass eine zu hohe Konzentrationserhöhung nicht
unbedingt zu einem besseren Therapieerfolg führt, da eine hohe Gesamtbelastung des
Organismus sich auch ungünstig auf die Kontrolle des Tumorwachstums durch das
Immunsystem auszuwirken scheint. Möglicherweise ist dieser Effekt bei den meist
verwendeten immunsupprimierten Tieren geringer, hierzu sind jedoch noch weitere
Experimente notwendig. Für einen besseren Therapieerfolg eignet sich möglicherweise eine
wiederholte Gabe von 9 mg PLD/kg KGW gefolgt von einer Plasmapherese 36 h nach PLDApplikation. In unserem Rattenmodell konnte eine zweimalige Gabe von PLD in
Kombination mit der Plasmapherese (Wiederholung von PLD und Plasmapherese nach 7
157
Diskussion
Tage nach der erster PLD-Gabe und Plasmapherese) wegen schwieriger erneuter
Blutentnahme experimentell nicht durchgeführt werden.
4.7 Verkürzung des Zeitpunkts der maximalen Anreicherung
Die Anreicherung von Liposomen im Tumor kann durch eine Steigerung des Blutdruckes
verbessert
werden.
Bisher
wurde
jedoch
nur
eine
kurzfristige
Steigerung
der
Akkumulationseffizienz beschrieben (Maeda et al., 2000). In diesem Abschnitt sollte auch der
langfristige Einfluss auf die Gesamtmenge an Liposomen im Tumor sowie der Einfluss auf
die Zeit bis zum Erreichen des Maximums untersucht werden. Durch die lange Zirkulation der
Liposomen im Blutkreislauf reichern sich die Liposomen sowohl im Tumor als auch in den
gesunden Organen an. Eine verstärkte und schnellere Anreicherung der Liposomen im Tumor
könnten mit AT-II, BQ-123 und eine körperliche Aktivität beeinflusst werden. Durch eine
schnellere Akkumulation der Liposomen nur im Tumor könnte die Plasmapherese früher
durchgeführt werden. Die dosislimitierenden Nebenwirkungen würden wahrscheinlich noch
schwächer ausgeprägt sein, ohne Verlust der Therapieeffizienz. Die Wirkungen von AT-II
und BQ-123 sind bereits in der Literatur beschrieben (Nagamitsu et al., 2009; Sonveaux et al.,
2004; Li et al., 1993).
4.7.1 Einfluss von AT-II auf EPR-Effekt
Angiotensin II wurde den tumortragenden Ratten 4, 8 und 24 h nach Liposomengabe i.v
appliziert. Die Fluoreszenzintensität im Tumorbereich wurde vor und nach AT-II Gabe
gemessen.
Während der Gabe von AT-II wurde eine Erhöhung des Blutdruckes gemessen. Die Tiere
zeigten sofort einer schnellen Reaktion nach jede Volumeninjektion von AT-II. Das CobasBlutdruckmessgerät
eignete
sich
gut
für
die
Blutdruckmessung.
Außer
kleinen
Kontaktprobleme der Blutdruckmanschette mit dem Schwanz der Ratte, die selten auftraten,
konnten der Blutdruck gut gemessen werden. Die gemessenen Werte schwanken stark. Mit
der zur Verfügung stehender Injektionsapparatur konnte leider kein adäquates Volumen
injiziert werden, die für die gewählte Rattengröße passen würde. Große Volumina würden für
die Tiere eine zusätzliche Belastung stellen. AT-II wurde mit Hilfe einer Spritze manuell
appliziert. Die manuelle Gabe von AT-II erwies sich als schwierig. Es war nicht möglich
immer wieder dasselbe AT-II-Volumen in der Spritze zu injizieren. Die manuelle Applikation
von AT-II ist verantwortlich für die Schwankung der Spitzenwerte. Ein Dauerplateau wie in
der Literatur wurde nicht erreicht (Hattori et al., 2011). Das Muster der Messung erinnerte
158
Diskussion
mehr an ein Sägeblattmuster bei denen die Blutdruckwerten ein hoch und herunter
schwankten. Die Gabe von AT-II mit einer adäquaten Pumpe wäre hier sicherlich hilfreich
aber nicht notwendig, da der gewünschter Effekt von AT-II auftrat. Der diastolische, der
mittlere und der systolische Blutdruckwerte stiegen um ~50% nach intravenöser AT-IIInjektion. Wie in der Abb. 43 ersichtlich ist, ist die Anreicherung von Liposomen im Tumor
von der Applikationszeit von AT-II abhängig.
Die Applikation von AT-II 4 h nach Liposomengabe führte nicht kurzfristig zu einem
schnellen Anstieg der Fluoreszenzintensität in den Tumoren. Eine Steigerung der
Fluoreszenzintensität wurde 8 h nach AT-II gemessen, aber der Zeitpunkt der maximalen
Anreicherung konnte dadurch über die Zeit nicht verkürzt werden.
Direkt nach Applikation von AT-II, 8 h nach i.v Applikation von DiR-Lipososmen wurde
einen Anstieg der Fluoreszenzintensität der Liposomen im Tumorbereich, wie auch bei
direkter Gabe vonAT-II schon mehrfach berichtet wurde, registriert (Li et al., 1993). Mit
steigender Zeit stiegen die Fluoreszenzintensitäten sowohl bei der Kontrollgruppe als auch bei
der Gruppe mit AT-II. Nach 8 h sind noch ~82% der Liposomen im Blut. Während AT-IIGabe wird nur ein Teil der ~82% im Tumor verstärkt angereichert. Da die Wirkung von AT-II
sehr kurz ist, konnten sich die restlichen Liposomen im Kreislauf weiter anreichern. Der
Effekt auf die Verkürzung des Zeitpunkts der maximalen Anreicherung ist hier nicht
vorhanden. Somit kann ausgeschlossen werden, dass die Gabe von AT-II 8 h nach
Liposomengabe primär zu einer Verkürzung des Zeitpunkts der maximalen Anreicherung
führt.
Bei der AT-II-Applikation nach 24 h wurde sofort das Anreicherungsmaximum um ~22 h
verkürzt verglichen mit dem Kontrollgruppe und eine Steigerung der Fluoreszenzintensität
von ~29% wurde erzielt. Vor der AT-II-Gabe sind noch ~56% der injizierten Liposomen in
Blut vorhanden. Nach AT-II-Gabe betrug die gemessene Fluoreszenz im Tumor über 29% der
Initialfluoreszenz vor AT-II-Gabe. Von den restlichen ~56% wurde durch den Steigenden
Blutdruck noch eine große Mengen Liposomen in den Tumoren angereicht. Danach folgte
keine weitere Anreicherung mehr. Durch AT-II-Gabe wurde die Liposomenmenge in den
Tumoren und fenestrierte Organe gesteigert (Greish, 2007; Hori et al., 1990), und die
Liposomenmenge im Plasma reduziert so dass, keine Anreicherung von Liposomen mehr in
den Tumoren stattfand. Bei der AT-II-Applikation 24 h nach Liposomeninjektion, wurde die
Zeit des Anreicherungsmaximums um ~12 h verkürzt.
Der Effekt von AT-II auf den EPR-Effekt bezüglich Verkürzung des Zeitpunkts der
maximalen Anreicherung hängt von dem Zeitpunkt der AT-II-Gabe nach der Liposomen159
Diskussion
Injektion ab. In vielen Arbeiten, wurden die Liposomen unter Hypertension appliziert und ein
deutlicher Anstieg der Liposomen Anreicherung in den Tumoren wurde registriert (Hattori et
al., 2011; Maeda et al., 2000; Li et al., 1993). Die Gabe von AT-II direkt unter Hypertension
hängt sicherlich mit der Halbwertszeit der angewendeten Partikeln zusammen. Das
Makromolekül poly(styrene-co-maleic-acid)-neocarzinostatin conjugate (SMANCs), die in
den meisten Arbeiten oft angewendet werden, haben eine Halbwertszeit von weniger als eine
Stunde (Li et al., 1993). Aus diesem Grund muss die Gabe von AT-II schnell erfolgen. In
dieser Arbeit wurde AT-II jeweils nach 4,8 und 24 h appliziert. Die Plasmahalbwertszeit der
Liposomen beträgt ~29 h. Bei dieser Halbwertszeit war es möglich AT-II im verschiedenen
Zeitpunkte zu applizieren. Sowohl eine deutliche kurzfristige Anreicherung der Partikeln in
Tumor als auch eine Verkürzung des Anreicherungsmaximums konnten erzielt werden.
Eine signifikante Zunahme der Gesamtmengen der Liposomen im Tumor durch AT-II wurde
nur bei der Gruppe die AT-II 24 h nach Liposomen erhielt beobachtet. Allerdings erfolgt im
Anschluss an die verstärkte Anreicherung ein beschleunigter Abbau der angereicherten
Liposomen (vgl. Abb 46). Entspricht würde ein therapeutischer Effekt vermutlich eher gering
ausfallen. Die späte Gabe von AT-II führte durch Erhöhung des Blutdruckes zu einer
vermehrten Anreicherung der sich noch im Kreislauf befindenden Liposomen im Tumor und
es folgte keine Weitere Anreicherung mehr der Liposomen. Bei der Kontrollgruppe mit einem
normalen Blutdruck wurde gewöhnliche Anreicherung beobachtet. Wie mehrfach beschrieben
wurde, kann eine Steigerung des Blutdruckes zu mehr Anreicherung der Liposomen im
Tumor führen und nicht in den gesunden Gefäßen (Nagamitsu et al., 2009; Li et al., 1993).
Bei der Gabe von AT-II 4 und 8 h nach Liposomen wurde zwar ein leichter Anstieg der
Liposomen-Gesamtmenge im Tumor gemessen. Der Anstieg lag aber im Bereich der
Fehlertoleranz. Ein signifikanter Unterschied wegen der geringeren Anzahl an Ratten konnte
nicht bestimmt werden. Weitere Untersuchungen werden benötigt um hier eine klare Aussage
zu treffen. In seiner Arbeit konnte Maeda die Akkumulation von SMANCs bei normalen und
bei erhöhtem Blutdruck in Tumor und verschiedenen gesunden Gewebe gut darstellen. In
dieser Arbeit wurde die Anreicherung der Liposomen in der Haut unter Bluthochdruck (bei
Gabe von AT-II) untersucht. AT-II führt zu keiner Erhöhung der Anreicherung der
Liposomen in der Haut. Eine Abnahme der Fluoreszenzintensität bewirkt durch AT-II wurde
sogar im Bereich der Haut beobachtet (Li et al., 1993). Diese Abnahme der Fluoreszenz ist
allerdings angesichts der geringeren Anzahl an angewendeten Tieren nicht signifikant.
Der positive Effekt von AT-II auf den EPR-Effekt konnte nachgewiesen werden (Hattori et
al., 2011; Nagamitsu et al., 2009; Li et al., 1993). Wie Hattori zeigte, führt eine steigende
160
Diskussion
Anreicherung von liposomalen Doxorubicin in den Tumoren zu einer besseren Therapie
(Hattori et al, 2011). Die steigende Akkumulation durch AT-II beschränkt sich meist nur auf
Tumore und nicht auf gesunde Gewebe wie in dieser Arbeit am Beispiel der Haut gezeigt
werden konnte (Greish, 2007; Li et al., 1993; Hori et al., 1992). Bei einer Therapie mit PLD,
wäre eine gewisse Anreicherung von PLD nach AT-II in den Tumoren nicht aber in der Haut
und anderen Organe, zu erwarten (Maeda et al., 2000; Li et al., 1993). Dies würde zu einer
besseren Therapie bei gleichen Nebenwirkungen führen. Eine Kombination mit der
Plasmapherese ist hier denkbar und sollte weiter untersucht werden. Eine Verkürzung des
Anreicherungsmaximums der Liposomen in Tumor um ~12 h bedeutet, dass die
Plasmapherese 12 h vorher durchgeführt werden kann. Wie schon berichtet wurde, führt die
Steigerung der Anreicherung der Partikeln zu einer Verbesserung der Therapie (Nagamitsu et
al., 2009; Li et al., 1993). Bei einer frühen Plasmapherese-Durchführung wären die
Nebenwirkungen wahrscheinlich geringer.
Die Applikation von AT-II 24 h nach Liposomengabe führt zu einer Verkürzung des
Anreicherungsmaximums der Liposomen in Tumor mit einer kurzfristigen Steigerung der
Liposomen-Gesamtmenge im Tumor.
4.7.2 Steigerung der Liposomen Anreicherung nach Applikation von
BQ-123
BQ-123 wurde den tumortragenden Ratten 24 h nach Liposomengabe appliziert. BQ-123
wurde sowohl i.p. als auch i.v. appliziert bei Konzentrationen zwischen 1 bis 2 mg/Kg KGW.
Nur bei der Konzentration von 2 mg/Kg KGW BQ-123 i.p. wurde eine Verkürzung des
Anreicherungsmaximums der Liposomen in Tumor von ~22 h erreicht. Eine Steigerung der
Anreicherung von Liposomen über ~15 % im Vergleich zur Kontrollgruppe wurde als direkte
Reaktion auf die BQ-123-Gabe gemessen. Eine Steigerung der maximalen Menge der
Liposomen am Anreicherungsmaximum konnte hier nicht festgestellt werden. Bei der
Gruppe, die 2 mg/Kg KGW BQ-123 i.p. erhielt, wurde der Zeitpunkt der maximalen
Anreicherung 26 h nach Liposomengabe erreicht und die Fluoreszenzintensität betrug ~114%.
Bei der Kontrollgruppe lag das Anreicherungsmaximum bei ~48 h und die maximale
Fluoreszenzintensität betrug ~116%. Anders als AT-II wo der Blutdruck erhöht wird und
mehr Liposomen in den Tumoren drückt, nutzt BQ-123 die passive Dilatation der Gefäße
durch Abfall des Blutdruckes um die Anreicherung der Partikeln im Tumor zu steigen
(Thébaud et al., 2000; Warner et al., 1994; Warner et al., 1993). Die passive Dilatation führt
zwar zu einer Verkürzung des Zeitpunkts der maximalen Anreicherung, aber nicht zu einer
161
Diskussion
Steigerung der akkumulierten Gesamtmenge an Liposomen in den Tumoren aus. In
Anbetracht der Verkürzung des Zeitpunkts der maximalen Anreicherung wäre eine frühere
Durchführung der Plasmapherese ohne Verlust der Therapieeffizienz im Falle von Therapie
somit denkbar. Allerdings ist auch hier der beobachtete Effekt gering.
Die Gabe von 1 mg/kg KGW i.p. und von 2 mg/Kg KGW i.v. brachte keine Vorteile, eher
Nachteile durch geringe Anreicherung im Vergleich zu der Kontrollgruppe. Möglicherweise
ist die Konzentration von 1 mg/kg KGW nicht genug für eine gute Wirkung bei den Ratten.
Bei der i.v. Gabe von BQ-123 tritt die Wirkung von BQ-123 sehr schnell auf. Der Blutdruck
fällt sehr schnell ab und die Blutzirkulation wird auch weniger und die Liposomen treten auch
weniger in den Tumoren. Die fehlende Wirkung konnte auf einen schnellen Abbau von BQ123 in der Blutbahn liegen. Einer vermehrte Akkumulation von Partikeln in den Tumoren
nach BQ-123, durch Steigerung der Blutfluss in den Tumoren wie von Sonveaux schon
beschrieben, konnte bei der Gabe von 2 mg BQ-123/kg KGW i.p. beobachtet werden
(Sonveaux et al., 2004). Diese Wirkung ist bei größeren Blutgefäßen stark und trifft weniger
gesunde kleine Gefäße (Bonvallet et al., 1993).
In Anbetracht der Verkürzung des Zeitpunkts der maximalen Anreicherung um ~22 h und
eine Steigerung der Liposomen Anreicherung bei einer i.p-Gabe von 2 mg BQ-123/kg KGW,
wäre eine Therapiekopplung mit der Plasmapherese hier auch sicher vorteilhaft. Die Wirkung
von BQ-123 auf den EPR-Effekt muss dennoch untersucht werden, um eine sichere Aussage
zu machen.
4.7.3 Steigerung der Liposomen Anreicherung nach körperlichen Aktivität
Eine Steigerung des Blutdruckes und der Durchblutung kann auch durch körperliche Aktivität
erreicht werden. Um diese kontrolliert zu induzieren wurden die Ratten einem alternierenden
Schwimmzyklus unterworfen. Die Anreicherung der Liposomen in Tumor nach dem
Schwimmen wurde untersucht. Unmittelbar nach dem Schwimmen wurde eine Steigerung der
Fluoreszenzintensität im Tumor von ~7 % in der Schwimmgruppe im Vergleich zur Intensität
vor dem Schwimmen beobachtet. Die körperliche Aktivität führte zu einer geringen
Steigerung der Partikeln-Anreicherung in Tumor. Die steigende Herzleistung und das erhöhte
Herzminutenvolumen führten zu einer Steigerung des Blutflusses in den Tumoren und zu
mehr Anreicherung der Liposomen. Dieser Anstieg der Fluoreszenzintensität kompensierte
sich aber mit der Zeit. Die Ratten, die geschwommen haben, waren nach dem Schwimmen
müde sodass sie sich wahrscheinlich nach den Versuchen erholen wollten und sich wenig
bewegt haben. Die Kontrollratte waren ständig in Bewegung und konnte so den anfänglichen
162
Diskussion
Rückstand nach 6 h einholen. Die körperliche Aktivität führt kurzfristig zu einer geringeren
Steigerung der Liposomenmenge im Tumor. In der Haut, wurde kein Unterschied beobachtet.
Schwimmen führte nicht zu mehr Anreicherung der Liposomen in der Haut.
Der Zeitpunkt der maximalen Anreicherung wird aber nicht verkürzt. Um die
Fluoreszenzintensität deutlicher zu steigern und den Zeitpunkt der maximalen Anreicherung
zu verkürzen, wäre eine kontinuierliche sportliche Aktivität mit vielen Pausen dazwischen
wahrscheinlich effektiver als die hier untersuchte eine Stunde Aktivität.
Fazit: AT-II, BQ-123 und Schwimmen sind mögliche Stimulantien der Anreicherung von
Partikeln in Tumor. Bei AT-II wurde eine Steigerung der Gesamtmenge der Liposomen im
Tumor von ~29% und eine Verkürzung des Zeitpunkts der maximalen Anreicherung. Bei BQ123 wurde zwar eine Verkürzung des Zeitpunkts der maximalen Anreicherung beobachtet
aber ohne Steigerung der Gesamtmenge. Beim Schwimmen wurde zwar eine leichte nichtsignifikante kurzfristige Steigerung gemessen. Der Zeitpunkt der maximalen Anreicherung
wurde beim Schwimmen aber nicht verkürzt. Eine Kombination von Therapie, Stimulantien
und Plasmapherese ist möglicherweise vorteilhaft und soll weiter untersucht werden. Der
Zeitpunkt der maximalen Anreicherung im Tumor, die als optimaler Zeitpunkt um die
Plasmapherese durchzuführen wurde ermittelt. Bei einer Verkürzung dieses Zeitpunkts der
maximalen Anreicherung durch Stimulation der Liposomen-Anreicherung im Tumor aber
nicht in die anderen gesunden Organe, könnte die Plasmapherese somit früher durchgeführt
werden.
4.8 Optical Imaging System: Vorteile und Nachteile
Mit Hilfe vom IVIS Imaging System wurde die Anreicherungskinetik der Liposomen in
einem subkutanen Tumormodell analysiert. Das Nutzen eines IVIS Gerät hat viele Vorteile.
Durch die nichtinvasive Methode konnte die Akkumulation der Liposomen durch die
Messung der Fluoreszenz verfolgt werden. Für die verschiedenen Zeitpunkte müssen die
Tiere nicht umgebracht werden und die Tumore anschließend entnommen und analysiert
werden. Die Tiere können dadurch auch sehr lange verfolgt werden. Die Zahl der für die
Versuche benötigten Tiere ist niedrig. Die interindividuellen Unterschiede werden gemindert.
Die Methode bietet außerdem eine große Sensitivität der Signaldetektion. Die Messdauer ist
deutlich kürzer verglichen mit anderen bildgebenden Verfahren wie zum Beispiel MRI. Die
Aufnahmen haben eine hohe Auflösung. Durch die geschickte Wahl des Farbstoffes konnten
Störungen durch die Hintergrundfluoreszenz und die Eigenfluoreszenz der Tiere
163
Diskussion
minimiertwerden. Mehrere Aufnahmen konnten nacheinander durchgeführt werden und
waren gut reproduzierbar. Mit Hilfe der Software Living Image 4.1 konnten die gewünschten
Regionen gut quantifizierbar gemessen werden. Die Sensitivität der Tumorzellen konnte so
ermittelt werden. Bei nicht-therapierten Ratten zeigten die Zellen starke Luziferase-Aktivität.
Bei den therapierten Tiere, korrelierte die gemessene Luziferase-Aktivität der Tumorzellen
allerdings nicht mit der Messung der Tumorgröße mit einer digitalen Schiebelehre,
wahrscheinlich wegen des Nekrotisierens der Tumoren (Lim et al., 2009).
Die Nachteile der Methode sind diverse. Bei den Ratten war schwierig wegen der Größe der
Tiere mit 3-dimensionaler Räumung zu arbeiten, so dass eine 2-dimensionale Räumung
gewählt wurde. Die Quantifizierung der Signalintensität wurde dennoch möglich. Die
Position der Tiere im Gerät stellte bei wiederholten Messungen einer Zeitreihe ein weiteres
Problem dar. Es wurde grundsätzlich versucht, die Tiere immer in gleicher Position zu
vermessen.
164
Zusammenfassung und Ausblick
5 ZUSAMMENFASSUNG und AUSBLICK
Krebs bleibt in Deutschland nach den Herz-Kreislauferkrankungen die zweithäufigste
Todesursache. Zur Bekämpfung von Krebs werden Chemotherapeutika angewendet. Die
Chemotherapie tötet jedoch nicht nur Krebszellen, sondern auch gesunde Zellen. Doxorubicin
wird seit vielen Jahren auch als liposomale Formulierung in der Krebstherapie eingesetzt.
Nach der Applikation zirkuliert pegyliertes liposomales Doxorubicin (PLD) lange im
Blutkreislauf und reichert sich in den verschiedenen Organen im Kreislauf in
unterschiedlichen Mengen und Geschwindigkeiten an. Die vorliegende Arbeit dient zur
Unterstützung des „Controlled Application and Removal of Liposomal Therapeutics“
(CARL)-Projektes. Das Ziel der CARL-Therapie ist eine Reduktion der Nebenwirkungen bei
einer PLD-Therapie ohne Verlust der Therapieeffizienz (Pütz et al., 2009). Um die
Nebenwirkungen einer PLD-Therapie zu reduzieren wird der Überschuss an PLD nach einer
maximalen Akkumulation im Tumor mit einer Plasmapherese entfernt. In der CARL-Studie
wurden
mehr
als
50
Plasmapheresenbehandlungen
bei
Patienten
durchgeführt.
Nebenwirkungen wie palmar-plantares Erythrodysästhesie (PPE) und Stomatitis konnten
deutlich verringert werden (Eckes et al., 2011; Pütz el al., 2010).
Die Hauptziele dieser Arbeit waren die Plasmapherese an Kleintiere zu etablieren, die
Anreicherungskinetik der Liposomen im Tumor mittels eines Imaging Systems zu
untersuchen und mehr Erkenntnisse über den „enhanced permeability and retention“ (EPR)Effekt zu gewinnen. Der EPR-Effekt besagt, dass im Tumor angereicherte Partikel > 400 nm
nicht mehr entfernt werden (Maeda et al., 2001). Der Effekt der Plasmapherese sollte bei einer
PLD Therapie an Kleintieren weitgehend untersucht werden. Um die Vorteile der
Plasmapherese besser zu beurteilen, sollten die Nebenwirkungen in Verbindung mit der
Plasmapherese genau analysiert werden.
Für die Anwendung am Kleintiermodell wurde ein Plasmaphereseverfahren entwickelt,
untersucht und im Rahmen der weiteren Versuchsführungen problemlos angewendet. Eine
diskontinuierliche Plasmapherese wurde manuell durchgeführt. Dieses Verfahren erreichte
ähnliche Eliminationsraten wie die üblichen klinischen Aphereseverfahren, erforderte jedoch
ein gewisses manuelles Geschick.
Liposomen wurden mit 10 mol% Polyethylenglycol (PEG) hergestellt um lange
Plasmahalbwertszeiten zu erreichen. Die Halbwertszeit der Liposomen im Plasma betrug ca.
29 h. Um ihre Anreicherungskinetik mit Hilfe eines Imaginggerätes zu verfolgen, wurden die
Liposomen bei ihrer Herstellung mit einem DiR-Farbstoff markiert. Die Exzitations- und
Emissionswellenlängen von DiR liegen im nahen Infrarot-Bereich. Die Fluoreszenzmessung
165
Zusammenfassung und Ausblick
von DiR konnte erfolgreich ohne relevante Störungen durch eine Eigenfluoreszenz der Tiere
durchgeführt werden. Das Biolumineszenz-Gerät eignet sich gut sowohl für die
Fluoreszenzmessung
als
auch
für
die
Biolumineszenzmessung.
Die
in
vivo
Anreicherungskinetik der Liposomen im Tumor wurde mittels Fluoreszenzmessung ermittelt.
Der mittlere Zeitpunkt der maximalen Anreicherungszeit der Liposomen im Tumor lag bei
~41 h. Dieser Anreicherungszeitpunkt beschreibt den richtigen Zeitpunkt, um eine
Plasmapherese durchzuführen. Wegen der Halbwertszeit der Liposomen von ~29 h, wurde die
Plasmapherese 22 h nach Applikation der Liposomen durchgeführt. Während der
Plasmapherese wurden ca. 59% der im Kreislauf noch zirkulierenden Liposomen entfernt.
Experimentell konnte gezeigt werden, dass die im Tumor bereits angereicherten Partikel nach
der Plasmapherese nicht entfernt wurden. Während die durchschnittliche Elimination im
Tumor nur 3% betrug, wurden in der Haut, in den Ohren und den Pfoten jeweils ~25, ~48 und
~24% weniger Fluoreszenzintensität nach der Plasmapherese gemessen. Diese Änderungen
der Fluoreszenzintensitäten resultierten allerdings von den sich im Blutkreislauf noch
befindenden Liposomen. Die Anreicherung der Liposomen im Tumor ist irreversibel, genauso
wie in der Haut, und den Pfoten. Weitere Versuche wie beispielweise, Eskalationsversuche
mit höheren Liposomen-Konzentrationen, sollten noch durchgeführt werden, um weitere
Erkenntnisse über die Anreicherungskinetik zu gewinnen. Die Retentionshypothese, die von
Maeda beschrieben wurde, konnte hier experimentell bestätigt werden, wobei sich Maeda
primär auf die mangelnde Lymphdrainage bezieht. Warum die angereicherten Liposomen
trotz Plasmapherese nicht mehr aus dem Tumor herausgewaschen werden, sollte zum
besseren Verständnis des EPR-Effektes in weiterführenden Arbeiten näher untersucht werden.
Für die Therapie wurde PLD angewendet. PLD hat eine deutlich höhere Halbwertszeit als die
hergestellten DiR-Liposomen. Bei der Therapie wurden 4,5; 9 und 14 mg/kg KGW PLD
angewendet. Bei 4,5 mg/kg KGW PLD wurde die Plasmapherese 24 h nach Applikation der
Liposomen
durchgeführt.
Sowohl
bei
der
Kontrollgruppe,
als
auch
bei
der
Plasmapheresegruppe wurden keine Nebenwirkungen sichtbar. Nach einer kurzen Phase der
Stabilisierung wuchsen die Tumoren wieder schneller. Bei 9 mg/kg KGW PLD wurden die
tumortragenden Ratten mit der Plasmapherese jeweils nach 24, 36 und 48 h behandelt. Die
Gruppe mit der Plasmapherese zeigte nach 36 h sowohl bei den Therapieerfolgen, als auch bei
den Nebenwirkungen bessere Ergebnisse als die Kontrollgruppe und die Gruppen mit
Plasmapherese nach 24 und 48 h. Bei 14 mg/kg KGW PLD, wurde die Plasmapherese nach
36 h durchgeführt. Dabei zeigte die Plasmapheresegruppe mittelstarke Nebenwirkungen im
Vergleich zu der Kontrollgruppe, die stark ausgeprägte Nebenwirkungen aufwies. Die
166
Zusammenfassung und Ausblick
Therapieerfolge waren bei den Gruppen mit 14 mg/kg KGW PLD nicht besser als bei den
Gruppen mit 9 mg/kg KGW PLD. Eine Steigerung der PLD-Konzentration von 9 mg/kg
KGW auf 14 mg/kg KGW brachte keinen größeren Erfolg bei der Therapie. Die Kombination
von 9 mg/kg KGW PLD mit Plasmapherese nach 36 h erwies sich für unser Modell als bestes
Therapieschema.
Die Anreicherungskinetik der Liposomen wurde unter Einfluss von einer körperlichen
Aktivität, BQ-123 und Angiotensin II (AT-II) untersucht. Die Gabe AT-II 24 h nach der
Applikation von Liposomen führte zu einer leicht gesteigerten Anreicherung der Liposomen
nur im Tumor, nicht aber in anderen Organen wie die Haut. Der Zeitpunkt der maximalen
Anreicherungszeit wurde sowohl bei AT-II-Gabe als auch bei BQ-123-Gabe verkürzt.
Dadurch könnte die Plasmapherese früher durchgeführt werden. Die Anreicherung der
Liposomen im Tumor erfolgt schneller als in anderen Organen. Die Stimulation der
Anreicherung der Partikel im Tumor sollte jedoch besser untersucht werden. Eine
Kombination
mit
der
PLD-Therapie
wäre
möglicherweise
sinnvoll.
Die
PLD-
Nebenwirkungen werden damit vorraussichtlich noch milderer.
167
Summary and outlook
6 SUMMARY and OUTLOOK
In Germany cancer follows cardiovascular diseases as the second leading cause of death.
Chemotherapeutics are applied for most cancer therapies. However the chemotherapeutics
kills both cancer and healthy cells. Doxorubicin has been used for many years as a liposomal
formulation in the treatment of cancer. Following its application, pegylated liposomal
doxorubicin (PLD) has a longer circulation time in the bloodstream and accumulates in
different quantities and speed in various organs of body. The present study was consisted to
assisting the “Controlled Application and Removal of Liposomal Therapeutics” (CARL)project. The first goal of CARL-therapy is a reduction of side effects after a PLD-therapy
without loss of treatment effectiveness (Pütz et al., 2009). To reduce side effects during PLDtherapy, plasmapheresis was used after PLD-injection to remove the excess of PLD in
bloodstream after a maximal accumulation of PLD in tumor. In the CARL-study until now
more than 50 clinical plasmapheresis treatments were performed. Side effects such as palmarplantar erythrodysesthesia (PPE) and stomatitis were significantly reduced (Eckes et al, 2011;
Pütz el al, 2010).
The main objectives of the presented work were to establish the plasmapheresis in small
animals, to examine the accumulation kinetics of the liposomes in the tumor using an imaging
system and to gain more knowledge about the enhanced permeability and retention (EPR)effect. EPR-effect says, particles bigger than 400 nm are not removed after accumulations in
tumor (Maeda et al., 2001).
The effect of plasmapheresis should be widely studied in combination with a PLD-therapy in
small animals. In order to assess the benefits of plasmapheresis, the side effects should be
analyzed exactly.
The discontinuous plasmapheresis in rats was successfully developed and was successfully
applied for further experiments. This process reached similar elimination rates as the usually
clinical apheresis, but required, however, a lot of manual skill.
In order to increase their plasma half-life, liposomes were prepared with 10 mol%
polyethylenglycol (PEG). The half-life of liposomes in plasma was approximately 29 h. By
the preparation, liposomes were labeled with a DiR-dye to track their accumulation kinetics
using an imaging device. The excitation and emission wavelengths of the dye were near the
infrared range. The fluorescence measurement of the DiR-dye was performed successfully
without any significant interference from the animal’s autofluorescence.
The Bioluminescence imaging used was well suitable for fluorescence and bioluminescence.
The kinetics of the accumulated liposomes in the tumor in vivo was determined using
168
Summary and outlook
fluorescence imaging. The time point of a maximal accumulation time of the liposomes in the
tumor was determined at ~ 41 h. This accumulation time describes the right time to perform
plasmapheresis in a clinical setting. If the plasmapheresis is performed earlier before the
maximal time point reach, less liposomes would accumulate in tumor und the therapy could
be hampered.
Because of the half-life of the model-liposomes used for accumulation studies (~ 29 h), the
plasmapheresis was performed 22 h after administration of the liposomes. So a substantial
amount of circulating liposomes was eliminated. During plasmapheresis, about 59% of the
currently circulating liposomes were removed. In tumor no loss of the fluorescence intensity
was registered after plasmapheresis. The particles already accumulated in the tumor were not
removed. While the mean elimination of fluorescence in tumor was only 3%, the reduction of
the fluorescence intensity in skin, ears and paws was ~25, ~48 and ~24% respectively after
plasmapheresis. However, these changes in the fluorescence intensity resulted from the
liposomes present in the bloodstream. The accumulation of the liposomes in the tumor as well
as skin and paws seems irreversible. Because of its cartilage structure, no accumulation of
liposomes occurs in the ears. Further tests, such as escalating test with higher liposome
concentration, were need to gain further insights into the accumulation kinetics. The retention
hypothesis, described by Maeda, was experimental confirmed in this study. As reason, Maeda
suspected primarily the lack of lymphatic drainage. Why the accumulated liposomes are not
washed out the tumor despite plasmapheresis to better understand the EPR-effect should be
investigated more closely in further works.
For the cancer therapy, PLD (pegylated liposomal doxorubicin) has been applied. Industrial
manufactured PLD has a significantly longer half-life than the hand-made DiR-liposomes
used as model-liposomes. Different concentrations of PLD (4.5, 9 and 14 mg/kg BW) were
PLD applied. By a concentration of 4.5 mg/kg BW PLD with plasmapheresis 24 h after
application of PLD, no side effects were observed in both the control group and in the
plasmapheresis group. The tumors grew up quickly after a short period of stabilization. By a
concentration of 9 mg/kg BW PLD, the tumor-bearing rats were treated with plasmapheresis
24, 36 and 48 h after application of PLD. The group with plasmapheresis at 36 h shows better
results than the control group regarding therapeutic efficacy, as well as well as lower side
effects. The group with plasmapheresis after 24 and 48 h did not perform better. When using a
concentration of 14 mg/kg BW PLD, plasmapheresis was performed after 36 h. The
plasmapheresis group showed moderate side effects compared to the control group. The
control group shows pronounced adverse reactions. The therapeutic success was not better by
169
Summary and outlook
the group with 14 mg/kg BW than the group with 9 mg/kg BW. An increase of PLD
concentration from 9 mg/kg BW to 14 mg/kg BW did not have a better success in therapy. In
our model, the combination of 9 mg/kg BW PLD-therapy with plasmapheresis at 36 h proved
to be the best therapeutic model.
The accumulation kinetics of the liposomes was investigated under the influence of a physical
activity, BQ-123 and angiotensin II (AT-II). The administration of AT-II 24 h after
application of liposomes led to a slight increase of the accumulation of liposomes only in the
tumor, but not in other organs such as the skin. The time point of maximum accumulation
time was shortened after both AT-II- and BQ-123-administration, so that, the plasmapheresis
could be performed earlier. A combination therapy might be useful. Possibly the PLD-side
effects could be further reduced when plasmapheresis is performed earlier. The accumulation
of the liposomes in the tumor is faster than in other organs. The stimulation of the
accumulation of the particles in the tumor should be investigated in more detail, since EPR is
fundamental to all cancer therapies using nanoparticles.
170
Literaturverzeichnis
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183
Anhang
8 Anhang
8.1 Abkürzungsverzeichnis
In dieser Arbeit wurden folgende Abkürzungen verwendet:
(Allgemein übliche Abkürzungen, sowie gebräuchliche SI-Einheiten und abgeleitete
Einheiten werden nicht mit aufgeführt)
Abb.
Abbildung
ACE
Angiotensin Converting Enzym
ALB
Albumin
AT-I
Angiotensin I
AT-II
Angiotensin II
BP
Blutdruck
BQ-123
Cyclo (D-trp-D-asp-L-pro-D-val-L-leu)
CHOL
Cholesterol
CARL
Controlled Application and Removal of Liposomal Therapeutics
CCD
Charge-coupled device
CT
Computertomographie
DBP
Diastolischer Blutdruck
DiI
1, 1’-dioctadecyl-3, 3, 3’, 3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate
DiO
3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate ('DiO'; DiOC18(3))
DiR; DiIC18 (7)
1, 1'-Dioctadecyl-3, 3, 3’, 3’-Tetramethylindotricarbocyanine Iodide
DMF
Doppelmembranfiltration
DMSO
Dimethylsulfoxid
DPPC
1,2-O-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin
DSPE
Distearoylphosphatidylethanolamine
DSPG
1, 2-O-distearoyl-Sn-glycero-3-phosphorac-(1-glycerol)
Dox
Doxorubicin
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
184
Anhang
ET
Endothelin
EPC
Ei- Phosphatidylcholin
EPR
Enhanced permeability and retention
FI
Fluoreszenzintensität
FCS
Fetal Calf Serum
FPLC
Fast Protein Liquid Chromatography
G-CSF
Granulozyten-Kolonie-Stimulierender Faktor
GPC
Gel-Permeations-Chromatographie
GPCR
G- Proteinen gekoppelter Rezeptoren
GUV
Giant Unilamellar Vesicles
HBV
Hepatitis-B-Virus
HDL
High Density Lipoprotein
HELP
Heparin-induzierte extrakorporale LDL-Präzipitation
HIF
Hypoxia Inducing Factor
HIV
Humanes Immundefizienz-Virus
HSA
Human Serum Albumine
HSPC
Hydrogenated soy phosphatidylcholine
HUS
Hämolytisch-urämischem Syndrom
HWZ
Halbwertszeit
ID
Injizierte Dosis
IGM
Immunglobuline M
i.p.
Intraperitoneal
Isofluran
(±)-Difluormethoxy-1-chlor- 2,2,2-trifluorethan
i.v.
Intravenös
KGW
Körpergewicht
185
Anhang
LADME
Liberation, Adsorption, Distribution (Verteilung), Metabolismus und
Elimination
LDL
Low Density Lipoprotein
LMV
Large multilamellar vesicles
LS
Lumineszenz Spectrometer
LUV
Large unilamellar vesicles
M
Molare Masse [g/mol]
MBP
mittlerer Blutdruck
MDF
Membran-Differential-Filtration
MPEG 2000- DSPE 1,2-Distearoyl-phosphatidyl ethanolamine-methyl-polyethyleneglycol
MTBE
Methyl tertiary-butyl ether
PAF
Platelet Activating Factor
PBS
Phosphatgepufferte Salzlösung
PC
Phosphatidylcholin
PCS
Photon Correlation Spectograph
PDI
Polydispersionsindex
PE
Phosphatidylethanolamine
PEG
Polyethylenglycol
PFCE
Perfluoro-15-kron-5-Ether
PLD
Pegylated liposomales Doxorubicin
PS
Phosphatidylserine
POPC
1-O-palmitoyl-2-O-oleoyl-sn-glycero-1-phosphocholin
PPE
Palmar-Plantares Erythrodysästhesie-Syndrom
RES
Retikuloendotheliales System
Rhodamin DHPE
Lissamine™ rhodamine B 1,2-dihexa-decanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, Triethylammonium salt
ROI
Regions Of interest
186
Anhang
ROS
Reactive oxygen species
SBP
Systolischer Blutdruck
SUV
Small unilamellar vesicles
SPC
Soya- Phosphatidylcholin
Tm
Phasenübergangstemperatur
TCA
Trichloressigsäure
TOP
Topoisomerase II
TTP
Thrombotisch-thrombozytopenischer Purpura
VEGF
Vascular endothelial growth factor
VLDL
Very Low Density Lipoprotein
187
Anhang
8.2 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Phospholipid in verschiedenen Darstellungen
3
Abbildung 2: Liposome
4
Abbildung 3: Darstellung der Polymer Polyethylenglycol (PEG) der
Liposomendoppelschicht
6
Abbildung 4: Die Verweildauer des Liposomen-Wirkstoffes im Plasma
7
Abbildung 5: EPR-Effekt
9
Abbildung 6: Prozentualer Anteil der häufigsten Tumorlokalisationen
an allen Krebsneuerkrankungen in Deutschland 2010
12
Abbildung 7: Schematische Darstellung der Kaskadenfiltration
16
Abbildung 8: EPR-Effekt und Einfluss von AT-II auf den EPR-Effekt
19
Abbildung 9: A) Applikation von PLD
33
B) Blutentnahme bei der Plasmapherese über ein Venenpunktionsbesteck 34
Abbildung 10: Extrusionsapparatur von Lipofast
36
Abbildung 11: Blutdruckmanschette einer Coda-Apparatur um
einen Rattenschwanz
Abbildung 12: Ratten spezielles Schwimmbecken
44
45
Abbildung 13: Untersuchung der Stabilität von Farbstoff in den
Liposomen durch GPC in vivo
48
Abbildung 14: Fluoreszenz der GPC-Fraktionen
51
Abbildung 15: Plasmahalbwertszeit von Liposomen
53
Abbildung 16: Auswahl von Farbstoffen
54
Abbildung 17: Anreicherungskinetik der Liposomen im Tumor.
57
Abbildung 18: Anreicherung der Liposomen im Tumor.
58
Abbildung 19: Zeitliche Entwicklung der Fluoreszenzintensität im Tumor
nach Gabe von Liposomen.
60
Abbildung 20: Unterschied der Fluoreszenzintensität abhängig
von den Geweben (Tumor, Haut, Ohren und Pfoten)
62
Abbildung 21: Reale Akkumulation der Liposomen in Tumor,
Haut, Ohren und Pfoten
Abbildung 22: Rückhaltevermögen des Lipidfilters.
64
65
Abbildung 23: Reduktion des Anteils im Plasma zirkulierender
Liposomen durch manuelle Plasmapherese.
67
188
Anhang
Abbildung 24: Reduktion des Anteils im Plasma zirkulierender
PLD durch Plasmapherese
Abbildung 25: Anreicherung der Liposomen und Plasmapherese.
68
71
Abbildung 26: Zeitliche Entwicklung der Fluoreszenzintensität im Tumor,
Haut, Ohren und Pfoten nach Gabe von Liposomen
77
Abbildung 27: Plasmapherese verringert die Konzentration der akkumulierten
Liposomen in Haut, Ohr und Pfote, aber nicht im Tumor
81
Abbildung 28: Plasmahalbwertszeit von PLD.
85
Abbildung 29: Luziferaseexpression der Tumorzellen bei tumortragenden Ratten
88
Abbildung 30: Entwicklung des Rattengewichtes während der Therapie
mit 4,5 mg/kg KGW PLD und Plasmapheresis nach 24 h
90
Abbildung 31: Tumorwachstum nach Therapie mit 4,5 mg/kg KGW PLD und
Plasmapherese nach 24 h
92
Abbildung 32: Tumor-Luziferaseexpression nach i.v.-Behandlung
mit 4,5 mg PLD/kg KGW
93
Abbildung 33: Entwicklung des Rattengewichtes während der PLD-Therapie
mit 9 mg PLD und Plasmapherese nach 24, 36 und 48 h.
95
Abbildung 34: Tumorwachstum nach Therapie mit 9 mg/kg KGW PLD und
Plasmapherese nach 24 und 36 h
96
Abbildung 35: Tumor-Luziferaseexpression nach Behandlung mit 9 mg PLD
mit Plasmapherese nach 24 und 36 h.
98
Abbildung 36: Entwicklung des Rattengewichtes während der Therapie
mit 14 mg/kg KGW PLD mit Plasmapherese nach 36 h.
99
Abbildung 37: Tumorwachstum nach Therapie mit 14 mg PLD ohne und
mit Plasmapherese nach 36 h.
100
Abbildung 38: Tumor-Luziferaseexpression nach Behandlung mit
14 mg PLD/kg KGW mit Plasmapherese nach 36 h
101
Abbildung 39: Anreicherung von PLD in der Haut der tumortragenden Ratten und
Haarwachstum nach PLD-Therapie.
103
Abbildung 40: Verkrustungen in Pfoten (A und B), Mund (C) und Augenbereich
(D und E) nach PLD-Therapie
105
Abbildung 41: A und B. Nässe im Genitalbereich nach PLD-Therapie
108
Abbildung 42: Bleibende Nebenwirkungen nach PLD-Therapie
109
Abbildung 43: Blutdruckmessung während AT-II-Injektion
118
189
Anhang
Abbildung 44: Änderung des Blutdruckes während der AT-II-Gabe.
119
Abbildung 45: Anreicherung der Liposomen im Tumor vor und nach
AT-II-Gabe (24 h nach Liposomeninjektion).
120
Abbildung 46: Zeitliche Entwicklung der Fluoreszenzintensität im Tumor
(A, B und C) und Haut (D, E und F) nach AT-II Injektion
122 - 127
Abbildung 47: Anreicherung der Liposomen im Tumor vor und nach
BQ-123-Gabe
128
Abbildung 48: Zeitliche Entwicklung der Fluoreszenzintensität im Tumor (A)
und in der Haut (B) nach BQ-123-Gabe
131
Abbildung 49: Anreicherung der Liposomen im Tumor vor und nach
Dem Schwimmen
133
Abbildung 50: Zeitliche Entwicklung der Fluoreszenzintensität im Tumor
nach dem Schwimmen
134
190
Anhang
8.3 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Technische Daten des gelieferten Filtermodells.
35
Tabelle 2: Zusammensetzung des Liposomenpuffers für 1 L Lösung bei pH=7,4.
37
Tabelle 3: Größenverteilung der Liposomen.
47
Tabelle 4: Einfluss von Plasmapherese auf den auftretenden
Nebenwirkungen von PLD.
111
Tabelle 5: Blutparameter vor Therapie mit PLD (9 mg PLD/kg KGW).
113
Tabelle 6: Blutparameter vor Therapie mit PLD (9 mg PLD/kg KGW).
114
Tabelle 7: Blutparameter 15 Tage nach Therapie mit
PLD (9 mg PLD/kg KGW).
116
191
Anhang
8.4 Kongressbeiträge mit Posterpräsentation
The 5th International Liposome Society Conference – Liposome Advances: Progress in Drug
and Vaccine Delivery. Dec. 2011. London.
R. Ngoune; V. Maks; M. Meißner; D. von Elverfeldt; K. Winkler and G. Pütz.
Accumulation and biodistribution of liposomes in a rat tumor model treated with
CARL- plasmapheresis.
The 39th Annual Meeting & Exposition of the Controlled Release Society. Juli, 2012. Québec
City, Kanada.
R. Ngoune; V. Maks; M. Meißner; D. von Elverfeldt; K. Winkler and G. Pütz.
Accumulation and biodistribution of liposomes in a rat tumor model treated with
CARL- plasmapheresis.
The 13th European Symposium on Controlled Drug Delivery. 16 – 18 April 2014. Egmond
Aan Zee ‐ The Netherlands.
R. Ngoune, V. Maks, K. Winkler and G. Pütz. Accumulation and biodistribution of
liposomes in a rat tumor model treated with CARL- plasmapheresis.
The 7th Imaging in Drug Discovery Conference. Oct. 7-8, 2014 in Dublin, Ireland.
R. Ngoune, V. Maks, K. Winkler and G. Pütz. Accumulation and biodistribution of
Stealth Liposomes and plasmapheresis using Optical imaging.
192
Anhang
8.5 Danksagung
Zunächst möchte ich Herrn Prof. Dr. Winkler für die Möglichkeit, in seiner Abteilung meine
Arbeit durchführen zu können, danken. Außerdem bedanke ich mich für die sehr gute
Betreuung.
Herrn Prof. Dr. Brabletz danke ich ganz herzlich für seine Bereitschaft zur Betreuung und
Korrektur dieser Arbeit.
Großer Dank gebührt Herrn Dr. Pütz für die hervorragende Betreuung, sowie für die
zahlreichen Diskussionen, Anregungen und wertvollen Ratschläge und Kritiken bei der
Erstellung dieser Arbeit. Außerdem möchte ich mich für seine Geduld und sein Vertrauen,
welches er mir entgegengebracht hat, herzlich bedanken. Bedanken möchte ich mich auch für
das Korrekturlesen und besonders für die Freiheit, die er mir während des gesamten
Forschungsprojektes gewährte, was maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit beitrug.
Herrn Maks möchte ich für die hervorragende Einarbeitung in den Bereich der Tierversuche,
sowie seine unermüdliche, ausgezeichnete und akribische Hilfe bei der Durchführung der
Plasmapherese und für die zum Teil nächtlichen Biolumineszenz-Messungen bedanken. Seine
kreativen Ideen haben wesentlich zur Entwicklung der Plasmapherese in unserem Tiermodell
beigetragen.
Annette Peters und Johannes Kohlschütter und PD. Dr. Michael Hoffmann danke ich für die
wissenschaftlichen Diskussionen, Anregungen und für das Korrekturlesen dieser Arbeit. Ihr
kompetenter Rat und ihre Hilfe kamen mir bei der Fertigstellung der Arbeit sehr zugute.
Allen Mitarbeiter der Forschung, Sibylle Rall, Olesja Schmelzer, Jan Wöhrl, Christine
Contini, Andrea Friedmann und Stephanie Meier danke ich für viele Hinweise, Hilfen und
viele anregende Diskussionen während meiner Arbeit im Labor, die so manche thematische
Wende in meine Dissertation brachten. Zusätzlich danke ich ihnen für die nette
Arbeitsatmosphäre.
Allen Mitarbeitern der Abteilung Klinische Chemie danke ich für die Hilfe bei den
Blutuntersuchungen.
Der Arbeitsgruppe Massing (insbesondere Vittorio Ziroli und Jessica Kluth) in der
Tumorbiologie Freiburg danke ich für die Möglichkeit, das PCS-Gerät des Labors
mitbenutzen zu dürfen, sowie für ihre tatkräftige Unterstützung bei der Charakterisierung der
Liposomen.
Dr. Mate Döbrössy (Klinik für Neurochirurgie Sektion Stereotaxie der Universitätsklinik
Freiburg) danke ich für die Bereitstellung des Schwimmbeckens für die Kleintiere und für
seine hilfreiche Hinweise.
Ein ganz besonderer Dank geht an meine Eltern, die mir das Studium der molekularen
Medizin ermöglichten und mir auch während der Anfertigung dieser Doktorarbeit immerzu
unterstützend und liebevoll zur Seite standen.
Allen meinen lieben Freunden, meiner Familie (Huguette Tchamko, Fomeza Patrick) bedanke
ich mich für ihre liebe Unterstützung, ihre Aufmunterungen sowie für die entgegengebrachte
Nachsicht.
193
Anhang
Meiner Geschwistern Narcisse und Olga danke ich für die Motivation, Geduld und Betreuung
meiner Kinder während dieser Arbeit.
Allergrößter Dank gilt meiner Frau Annie-Joelle, für ihre ständige, unermüdliche
Unterstützung und Motivation während der Erstellung dieser Arbeit. Bei meinen Kindern
Ashley und Gwenaël möchte ich mich für den Spaß und ihr Lächeln während dieser Zeit
bedanken.
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