einer N-Acetyl-L-Glutamat Deacetyiase - ETH E

Diss. ETH 6562
Charakterisierung und Lokalisierung
einer N-Acetyl-L-Glutamat Deacetyiase
aus Pseudomonas aeruginosa
ABHANDLUNG
zur
Erlangung
des Titels eines Doktors der Naturwissenschaften
der
EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE
ZÜRICH
vorgelegt
HERBERT
dipl.
geboren am
von Regensdorf
von
FRÜH
Natw. ETH
19.
September
ZH und
1950
Mogeisberg SG
Angenommen auf Antrag von
Leisinger, Referent
Prof. Dr. Th.
Prof. Dr. L.
Ettlinger,
1980
Korreferent
86
-
-
ZUSAMMENFASSUNG
5.
aeruginosa PAQ1
Pseudomonas
Zwischenprodukt
ArgA-Mutanten,
als
Arginin-Biosynthese
der
dem ersten
C- und N-Quelle.
einziger
Arginin-Biosynthese
die im ersten Schritt der
Fähigkeit
haben diese
N-Acetyl-L-Clutamat,
wächst auf
blockiert sind,
In Rohextrakten dieser Stämme und des Wild¬
verloren.
typs konnte eine Aktivität gemessen werden, die N-Acetyl-L-Clutamat
Diese
deacetyliert.
reits bekannten
N-Acetyl-L-Glutamat Deacetylase
deacylierenden Enzymen
spezifische
über auf Vollmedium
de 15000-fach
gereinigt
Zellen
ist
L-spezifisch
testeten
der Rate für
ein
Peptidase-Aktivität.
Durch die
von
Die
90'000
+
Deacetylase
Unter 17 als Substrat ge¬
N-Acetyl-L-Glutamin, N-Acetyl-L-
konnten
mit 20 % alle
übrigen
mit
weniger
als 10 %
N-Acetyl-Derivate
Aminosäuren wurden nicht gespalten.
Die
Deacetylase
Aktivität Co
beträgt
Das K
konnte durch
Sphäroplastierung
konnte mit Hilfe
wur¬
Die
inhibiert.
zerplatzten.
Enzym
werden.
katalytische
Deacetylase
diese
keine
gegen¬
mittels Ausschluss¬
44'000 D.
von
N-Acetyl-L-Glutamat hydrolysiert
für ihre
ständig
zeigt
Analyse
Molekulargewicht
2 Untereinheiten
N-Acetyl-L-Glycin
hydrophoben
nötigt
Die
und
aus
N-Acetyl-L-Aminosäuren
Methionin und
von
besteht
Enzym
N-Acetyl-L-Glutamat
im Saccharose-Gradienten und SDS-
Polyacrylamid Gelelektrophorese ergab
Das
und der
einen Faktor 5 erhöht. Das
um
und charakterisiert. Eine
chromatographie, Ultrazentrifugation
400 D.
andern be¬
N-Acetyl-L-Glutamat Deacetylase
Aktivität der
gezüchteten
von
Acetylornithinase
Bei Wachstum auf
Formylaspartat Deformylase getrennt.
wurde die
wie der
wurde
mit
von
es
und wird deshalb
N-Acetyl-L-Glutamat
Veränderung
Lysozym
Dass
für
2+
sich
von
um
der
den Zellen
ein
dieses
2+
EDTA voll¬
1.43 mM.
-Konzentration und
abgelöst werden,
ohne dass
periplasmatisches Enzym handelt,
Fluoreszenz-markierten
Lokalisierung
Mg
von
Enzyms
im
Antikörpern unterstützt
der
Deacetylase
werden.
periplasmatischen Raum wird
Wachstumsverhalten der argA-Mutanten hinreichend erklärt werden.
physiologische Bedeutung
be-
bleibt unklar.
Die
das
87
-
-
SUMMARY
6.
Pseudomonas
aeruginosa
PAQ1 grows
intermediate of
arginine-biosynthesis,
ArgA mutants,
which
and thus
A
are
are
unable to
N-acetyl-L-glutamate,
on
as a
sole carbon and
blocked in the first step of
of the
been
wildtype
induced 5-fold
determined
during growth
phoresis
showed
was
no
Substrates
were
44000
strongly
partially
90100.
hydrolysed
has
17
by
weight
The
N-acetyl-L-amino
sucrose
deacetylase
inhibited
by
of
hydrophobic
needs Co
EDTA. The K
was
2+
for
by
deacetylase
is
localization in the
argA
mutants.
periplasmic
The
space has
physiological
means
of
explained
a
with
as
a
rate of less
serve as
and therefore is
respect
to
N-acetyl-L-
by manipulation
growth
deacetylase
of
It has been identi-
fluorescent
the
and
N-acetyl-L-gly-
and
catalytic activity
role of the
L-specific
N-acetyl-L-glutamate,
released from intact cells
probable periplasmic enzyme by
has been
gelelectro-
acids tested
-concentration and spheroplast formation with lysozyme.
as a
SDS
amino acids did not
1.43 mM with
was
is
density gradient
deacetylated
were
weight
determined
N-acetyl-L-amino
acids
activity
The enzyme has been
with 20 % of the rate observed for
glutamate. The deacetylase
2+
89600 and
as
two subunits.
N-acetyl-derivatives
the
wildtype
characterized. The molecular
The molecular
indicating
In the
N-acetyl-L-glutamine, N-acetyl-L-methionine
Substrates. The
the
ability.
has been found in crude extracts
N-acetyl-L-glutamate.
peptidase activity. Among
whereas the other
than 10 %.
on
by gel chromatography
ultracentrifugations
fied
have lost this
N-acetyl-L-glutamate deacetylase
formylaspartate deformylase.
15000-fold and
purified
Mg
source.
separated from other well known deacylating activities like acetyl-
ornithinase and
cine
This
and the mutants.
nitrogen
arginine-biosynthesis
synthesize N-acetyl-L-glutamate,
N-acetyl-L-glutamate deacetylating activity
the first
antibody.
behavior of
is unknown.
Its