Forstner_Maria_HERV-K - OPUS Würzburg

Aus der Frauenklinik und Poliklinik
der Universität Würzburg
Direktor: Professor Dr. med. J. Dietl
Einfluss des transmembranen Hüllproteins des
humanen endogenen Retrovirus K (HERV-K) auf die
Zytokinproduktion humaner in-vitro kultivierter
unreifer und reifer dendritischer Zellen
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde der
Medizinischen Fakultät
der
Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
Maria Elisabeth Forstner
aus Landshut
Würzburg, Juli 2013
Referentin:
Prof. Dr. rer. biol. hum. Ulrike Kämmerer
Koreferent:
Prof. Dr. med. Matthias Eyrich
Dekan:
Prof. Dr. med. Matthias Frosch
Tag der mündlichen Prüfung: 03.07.2014
Die Promovendin ist Ärztin.
Diese Arbeit ist
in Liebe und Dankbarkeit
meinen Eltern
Hans-Wilhelm und Roswitha Forstner
gewidmet.
1
Einleitung
1
1.1
Schwangerschaft als immunologisches Paradox
1
1.2
Hämochoriale Plazentation
3
1.3
Bisherige Erkenntnisse zur fetomaternalen Toleranz
4
1.4
Immunzellen in der Plazenta
6
1.5
Dendritische Zellen (DC)
7
1.6
Dendritische Zellen im uterinen Kontext
11
1.7
Humane endogene Retroviren (HERV)
15
1.8
Zytokine
21
1.8.1
Proinflammatorische Zytokine
22
1.8.1.1
Tumornekrosefaktor α
22
1.8.1.2
Interleukin 1β
23
1.8.1.3
Interleukin 2
23
1.8.1.4
Interleukin 8
24
1.8.1.5
Interleukin 6
24
1.8.2
Antiinflammatorische Zytokine
25
1.8.2.1
Interleukin 4
25
1.8.2.2
Interleukin 10
25
1.8.3
TH1/TH2-Balance
26
1.9
Ziel der Arbeit
28
2
Material und Methoden
29
2.1
Material
29
2.1.1
Geräte
29
2.1.2
Chemikalien und Verbrauchsmaterial
30
2.1.3
Zellen
32
2.1.4
HERV-Peptide/Proteine
32
2.1.5
FlowCytomix Human Th1/Th2 11plex Kit BMS810FF
32
2.2
Methoden
33
2.2.1
Isolierung von Monozyten für DC aus peripherem Blut
33
2.2.2
Gewinnung der Elutra-Zellen
33
2.2.3
Kultur der Elutra-Zellen
35
2.2.4
Zellzahlbestimmung
36
2.2.5
Herstellung des Zellmediums und Verteilung der Zellen in einer
2.2.6
96-Mikrotiterplatte (reife und unreife DC)
36
Beschreibung der HERV-Peptide
38
2.2.7
Verdünnungsreihen von HERV-K
38
2.2.8
Ernte und Aufbewahrung der Zellen
40
2.2.9
Cytometric Bead Assay
40
2.2.9.1
Standardreihen
42
2.2.9.2
Ansatz der Bead-Mischung
43
2.2.9.3
Ansatz der Biotin-Konjugat-Mischung
43
2.2.9.4
Ansatz der Platte
43
2.2.10
Durchflusszytometrie
44
2.2.11
Auswertung
45
3
Ergebnisse
46
3.1
Tumornekrosefaktor α
46
3.2
Interleukin 1β
49
3.3
Interleukin 2
51
3.4
Interleukin 8
51
3.5
Interleukin 6
53
3.6
Interleukin 4
55
3.7
Interleukin 10
56
4
Diskussion
59
4.1
Modelleinschränkungen
59
4.2
HERV und Immunsuppression
61
4.3
Feststellung zu den einzelnen Zytokinen
64
4.3.1
Tumornekrosefaktor α
65
4.3.2
Interleukin 1β
67
4.3.3
Interleukin 8
67
4.3.4
Interleukin 6
68
4.3.5
Interleukin 4
69
4.3.6
Interleukin 10
70
4.4
Bewertung des Einflusses von HERV-K
72
5
Ausblick
74
6
Zusammenfassung
75
7
Abkürzungsverzeichnis
77
8
Abbildungsverzeichnis
79
9
Tabellenverzeichnis
80
10
Literaturverzeichnis
80
1
1.1
Einleitung
Schwangerschaft als immunologisches Paradox
Viele Paare wünschen sich nichts sehnlicher als ein gemeinsames Kind. Wird dieser
Wunsch aufgrund wiederholter Aborte nicht erfüllt, stellt dies eine große Belastung
für die betroffenen Paare dar. Selbst im Idealfall entwickeln sich nur ca. 40-50% der
befruchteten Eizellen zu geburtsfähigen Säuglingen. 1 Kommt es zu wiederholten
ungeklärten Fehlgeburten bedeutet dies eine immense psychische Belastung für die
betroffenen
Frauen2
bzw.
Paare3.
Habituelle
Aborte
(definiert
als
drei
aufeinanderfolgende Aborte im 1.Trimester der Schwangerschaft mit demselben
Partner), die 1-3% aller Paare betreffen, stellen einen wichtigen Grund für ungewollte
Kinderlosigkeit dar.4 Nur in der Hälfte der Fälle können kausale Ursachen wie
chromosomale
Anomalien,
endokrinologische
Abweichungen,
anatomische
Abnormalitäten oder Infektionen zugeordnet werden.5 Als eine der Hauptursachen
bei unbekannter Ätiologie vermutet man, dass es zu gestörten Immunreaktionen in
der Gebärmutter kommt.6
7
Für eine immunologische Komponente der habituellen
Aborte spricht u.a., dass Frauen mit lange unerfülltem Kinderwunsch bei
Partnerwechsel teilweise schnell erfolgreich schwanger werden und ein gesundes
Kind gebären können.8 9
An der Grenze zwischen Mutter und Kind (Plazenta) kommt es zu einer direkten
Interaktion zwischen der maternalen Immunabwehr und dem fetalen Gewebe.
Während einer erfolgreichen Schwangerschaft wird der Fetus vom mütterlichen
Immunsystem akzeptiert. Obwohl der Fetus zur Hälfte väterliche Antigene (AG) trägt
(semiallogen), wird er vom Körper der Mutter nicht abgestoßen, wie es bei einem
Allotransplantat geschehen würde. Eine Schwangerschaft kann selbst bei einer
Eizellenspende oder Leihmutterschaft (und somit einem komplett allogenen Fetus)
erfolgreich sein.10 Jedoch ist die Immunantwort von graviden Frauen nicht generell
reduziert. Dies beweist der Immunstatus der Schwangeren und die adäquate
Immunantwort auf verschiedene inflammatorische Stimuli, d.h. das Immunsystem der
Mutter ist nicht ignorant.11 Das Immunsystem erkennt durchaus die fremden Antigene
des fetalen „Transplantats“ und reagiert darauf.12
13 14
So wurde im Maus-Modell
gezeigt, dass ein mit väterlichen Antigenen bestückter Tumor in der trächtigen
1
weiblichen Maus nicht abgestoßen wird, ein Tumor mit anderen Antigenen jedoch
schon. Nach Ablauf der Schwangerschaft wird auch der väterliche Tumor
abgestoßen.
Dies
bedeutet,
dass
die
Toleranz
sehr
spezifisch
und
nur
vorübergehend besteht.12 Die Mutter erweitert ihr „Selbst-Verständnis“ für die Dauer
der Gravidität auf die fremden Antigene des Fetus.8
Die Aufklärung des scheinbaren immunologischen Paradox der Schwangerschaft
und der komplexen Mechanismen der fetomaternalen Toleranz ist nicht nur von
Bedeutung für eine mögliche Therapie von habituellen Aborten, sondern auch
entscheidend für das Verständnis und die Behandlung von immunologischen
Erkrankungen, wie z.B. Autoimmunerkrankungen und Allergien, und für neue
Ansätze in der Transplantation von Zellen und Organen. 15 Zur Lösung des
Geheimnisses der Fortpflanzung soll die vorliegende Arbeit einen kleinen Beitrag
liefern.
Abb. 1: Plazenta: Schnittstelle zwischen Mutter und Kind
Humaner Keim nach Vollendung der Implantation, 12 Tage nach der Befruchtung. Der
Synzytiotrophoblast umgibt die Lakunen.
(aus Junqueira, L.C., Carneiro, J., Schiebler, T.H., Histologie. Zytologie, Histologie und
mikroskopische Anatomie des Menschen unter Berücksichtigung der Histophysiologie, 4.Auflage,
1996, Springer-Verlag)
2
1.2
Hämochoriale Plazentation
Die Schwangerschaft des Menschen zeichnet sich morphologisch durch ein
besonders intensives Eindringen plazentarer Zellen in den Uterus aus. Man spricht
von der sog. hämochorialen Plazentation. Die einzigartige „Aggressivität“ des
menschlichen
Trophoblasten
zeigt
sich
u.a.
darin,
dass
es
ektope
Schwangerschaften (also fetales Wachstum außerhalb des Uterus) nur beim
Menschen
gibt.16
Bei
der
Plazentation
kommen
die
fetalen
extravillösen
Trophoblastenzellen in sehr engen Kontakt mit maternalen Immunzellen17, da sie in
die Dezidua (=Endometrium des schwangeren Uterus) bis hin zum ersten Drittel des
Myometriums und sogar in die Spiralarterien einwandern. Diese fetale Invasion
ermöglicht die Verankerung der Plazenta in der Uteruswand und den Zugang zum
mütterlichen Gefäßsystem, der das Sauerstoff- und Nährstoffangebot für den Fetus
sichert.18
19
Zum Schutz der mütterlichen Integrität muss jedoch die Uteruswand vor
einer übermäßigen Invasion des extravillösen Trophoblasten (EVT) geschützt
werden. Es muss zu einem Gleichgewicht zwischen der Limitierung der fetalen
Invasivität und einer spezifischen Toleranz des EVT durch das mütterliche
Immunsystem kommen.8
Die Invasivität des Fetus ist während des 1.Trimenons am stärksten ausgeprägt, in
dieser Zeit ist der Kontakt der mütterlichen Immunzellen und der fetalen Zellen durch
die Dezidua begrenzt. Ab dem 2.Trimenon gelangt das mütterliche Blut in die
intervillösen Räume, wodurch die Trophoblastenzellen in direkten Kontakt mit dem
mütterlichen Blut gelangen.1 20 21 Das mütterliche Immunsystem stößt dabei auf keine
typischen somatischen Zellen, sondern auf extraembryonale, vom Trophektoderm
abstammende
Zellen,
die
einige
Besonderheiten
wie
unmethylierte
DNA,
Riesenzellen, Gen-Imprinting, bestimmte HLA-Antigene, endogene retrovirale
Produkte und onkofetale Proteine aufweisen.22
23
Zudem treten im Verlauf der
Schwangerschaft fetale Zellen ins Blut der Mutter und vice versa über, wo sie
mehrere Jahre persistieren können (Mikrochimerismus).24-26 Somit wird der
anfängliche lokale Kontakt zwischen fetalen und mütterlichen Zellen auf den ganzen
Körper ausgeweitet und das maternale Immunsystem muss sich mit fetalen
Immunogenen auseinandersetzen.
3
Abb. 2: Trophoblastenzellen in der menschlichen Plazenta.
Bei der hämochorialen Plazentation baden die vom Fetus abstammenden Zotten im mütterlichen Blut
des
intervillösen
Raums.
Die
innere
Schicht
der
trophoblastären
Zellen
stellen
die
Zytotrophoblastenzellen (CTB) dar. Von dieser Zellschicht stammt die äußere, multinukleäre
synzytiale Schicht des Synzytiotrophoblasten (SZT) ab. Die Haftzotten überbrücken den intervillösen
Raum und heften sich an die mütterliche Dezidua. Die zytotrophoblastären Zellen der Haftzotten
differenzieren zu extravillösen trophoblastären Zellen, die in die maternale Dezidua eindringen. Ein
Teil der extravillösen trophoblastären Zellen ersetzt die Wände der mütterlichen dezidualen Gefäße
und wird dann als endovaskulärer CTB bezeichnet.
(Abbildung modifiziert nach Sugimoto, J., Schust DJ. Review: human endogenous retroviruses and
the placenta. Reprod Sci 2009, 16(11):1023-33)
1.3
Bisherige Erkenntnisse zur fetomaternalen Toleranz
Warum kommt es nun aber trotz der Allogenität i.d.R. zu keiner Abstoßung des
Fetus? Bis heute ist es Gegenstand intensiver Forschung, inwiefern sich der Fetus
der maternalen Immunabwehr entziehen kann und wie die immunologische Toleranz
der Mutter gegenüber dem fetalen „Allotransplantat“ induziert wird. Es werden
4
verschiedene Ursachen für diese einzigartige immunologische Situation diskutiert:
Zum einen werden klassische HLA-Antigene gar nicht (wie HLA-A und B) bzw. nur
gering (wie HLA-C) auf der Oberfläche des Trophoblasten exprimiert19
27
,
wohingegen die nichtklassischen Oberflächenmoleküle wie HLA-E28, HLA-G29 30 und
HLA-F31 verstärkt vorkommen. HLA-C und E stellen Liganden für Natürliche
Killerzellen (NK) dar, wobei die NK die fetalen Zellen womöglich durch das
monomorphe HLA-E als „Selbst“ ansehen und nicht attackieren.28 Das Fehlen von
HLA-A und B verhindert evtl. eine zytotoxische T-Zell-Erkennung. Je nach
Kombination des fetalen HLA-C und des maternalen KIR (Killercell Immunglobulinelike Receptor) auf den NK kann die Schwangerschaft erfolgreich oder nicht
verlaufen.32 HLA-G kann über Antigen präsentierende Zellen (APC)33 und Apoptose
von
zytotoxischen
CD8+
T-Zellen34
eine
Unterdrückung
der
Immunantwort
bewirken.35
Zudem herrscht in erfolgreichen Graviditäten ein TH2-Profil der Zytokine (IL-4, IL-5,
IL-6, IL-9, IL-10, IL-13) vor, wohingegen inflammatorische T H1-Antworten (IL-2,
IFN-γ) oft mit Aborten assoziiert sind.
36 37-40 41 42
Während einer Schwangerschaft
werden bisweilen Besserungen der Symptomatik bei Krankheiten, die mit einem TH1Profil einhergehen (z.B. Multiple Sklerose, Rheumatoide Arthritis), beschrieben.43 Im
Gegensatz dazu ändert sich beim systemischen Lupus erythematodes, der mit einer
Neigung zu TH2-Antworten assoziiert ist, die Krankheitsaktivät nicht oder verstärkt
sich sogar.44 Die Bedeutung der TH1/ TH2-Balance wird jedoch in den letzten Jahren
kontrovers diskutiert (s.u.).45 46 47
Des Weiteren produzieren die Dezidua und die Zytotrophoblastzellen selbst
immunsuppressiv wirkende Zytokine wie z.B. TGF-β oder Interleukin 10 (IL-10) und
Mediatoren wie Indoleamine-2,3-Dioxygenase (IDO).48
49 50
Das Enzym IDO baut
Tryptophan ab und führt damit zu einer Reduktion dieser Aminosäure, was eine
Unterdrückung der T-Zell-Funktion (v.a. TH1) zur Folge hat.50
Außerdem kommt es vermutlich zu einer kontrollierten, spezifischen Apoptose (über
die Bindung von Fas-Ligand auf dem Trophoblasten und Fas auf aktivierten
Lymphozyten) von alloreaktiven T-Zellen, die paternale AG in der Plazenta
erkennen.12 51
Eine wichtige Rolle scheinen auch regulatorische T-Zellen (Treg) zu spielen, die eine
entscheidende Funktion in der Vermittlung der Selbsttoleranz einnehmen.52
5
53
Die
Konzentration der Treg ist im peripheren Blut gravider Frauen gegenüber NichtSchwangeren erhöht52 und auch aus der humanen Dezidua konnten Treg isoliert
werden.54 Im Maus-Modell führen jene CD4+CD25+ Treg-Zellen zur Toleranz
gegenüber dem Fetus.55 Bisher sind die Mechanismen ihrer Generierung, ihrer
Expansion, ihrer Spezifität und Migration im dezidualen Kontext jedoch weitgehend
unbekannt.15
Eine Begrenzung der Invasion des EVT durch geregelte Apoptose der fetalen Zellen
könnte die Entstehung eines inflammatorischen Mikromilieus verhindern, da ein
kontrollierter Zelltod im Gegensatz zur Nekrose keine entzündliche Immunantwort
induziert. Die Phagozytose apoptotischer Zellen durch Gewebsmakrophagen bewirkt
die Produktion von anti-inflammatorischen Zytokinen.56 Dieser Mechanismus könnte
das immunsuppressive Milieu im Uterus unterstützen, was wichtig für eine mögliche
tolerogene Ausrichtung von APC, die Epitope dieser apoptotischen Zellen
präsentieren, ist.8 57
Alle protektiven Mechanismen finden idealer Weise lokal statt, da die Schwangere in
der Lage sein muss gegen exogene Infektionen Widerstand zu leisten.
1.4
Immunzellen in der Plazenta
Besonders wichtig im immunologischen Kontext sind die in der Plazenta
vorherrschenden Immunzellen, deren Funktion entscheidend für die Reaktion des
mütterlichen Immunsystems auf den sich entwickelnden Fetus ist. Innerhalb des
stromalen Kompartiments des Endometriums herrscht in der lutealen Phase der
Schwangerschaft eine hohe Konzentration an unterschiedlichen Leukozyten vor, die
sich in der Dezidua des ersten Trimenons noch vermehren.58 59 Den größten Anteil
unter den CD45+ immunkompetenten Zellen in der fetomaternalen Grenzzone bilden
die CD16-CD56++ uterinen Natürlichen Killerzellen (uNK)60. Unter den T-Zellen
werden v.a. CD3+ T-Zellen gefunden.61
62 63
B-Zellen sind kaum zu finden.64 Im
Fokus dieser Arbeit stehen die endometrialen und dezidualen CD14+ DC-SIGN-bzw.+
CD83+bzw.- DEC-205+ CD40+ mononukleären Zellen, die 20% der dezidualen
Leukozyten darstellen.65-67
68
Durch Elektronenmikroskopie69 und Immunhisto-
chemie64 wurde ein enger Kontakt zwischen den Zellen des extravillösen
Trophoblasten und den dezidualen Leukozyten nachgewiesen. Dies legt parakrine
6
und direkte Interaktionen zwischen den mütterlichen Immunzellen und fetalen Zellen
nahe. Diese wechselseitigen Einflüsse sind möglicherweise bei der Regulation der
Toleranz gegenüber dem Fetus und der Trophoblasteninvasion beteiligt.
1.5
Dendritische Zellen (DC)
Die Immunabwehr des Menschen beruht auf einer abgestimmten Zusammenarbeit
des
unspezifischen
angeborenen
und
des
AG-spezifischen
erworbenen
Immunsystems (IS).70 Dendritische Zellen (DC) nehmen als professionelle Antigen
präsentierende
Zellen
(APC)
eine
wichtige
Position
in
der
menschlichen
Immunabwehr ein – zum einen wirken sie an der Schnittstelle zwischen
angeborenem und erworbenem IS71, zum anderen sind sie in der Lage Immunität
oder aber auch Toleranz zu vermitteln.72 DC können die Wirkung und Funktion von
B-, NK-, und T-Zellen (TH1/ TH2, Treg) beeinflussen.73 Erst 1972 wurden die DC als
sternförmige Zellen, die in der Lage sind Fortsätze auszubilden und sich zu
verformen, in der Milz von Mäusen von Steinman et al. nachgewiesen.74 Ihr Name
(griechisch dendron: Baum) leitet sich aus ihrer Morphologie ab, da ihre langen
beweglichen Zytoplasmaausläufer an Verästelungen erinnern. 75 Durch Erforschung
der schon 1868 entdeckten Langerhans-Zellen der Epidermis als Prototypen der DC
konnten wichtige Aspekte in der Entstehung von Immunität geklärt werden.75 76
Zu den APC gehören neben den dendritischen Zellen auch Gewebsmakrophagen
und B-Zellen, wobei den DC die höchste Potenz, eine AG-spezifische TZellimmunität auszulösen, zugeschrieben wird.77 78
Von ihrem Reifezustand und ihrem Wirkungsort hängt es ab, welche Funktion die DC
ausüben.79 Sie unterliegen im Verlauf der Immunantwort einem Zyklus verschiedener
Zustandsformen, die sich durch qualitativ und quantitativ unterschiedliche Produktion
von
Zytokinen,
durch
Expression
unterschiedlicher
Zelloberflächenmarker
(Rezeptoren für die Antigenaufnahme, für mikrobiologische Liganden, für Zytokine
und Chemokine) und unterschiedliche Aufgaben in der Immunantwort auszeichnen.73
Die aus dem Knochenmark hervorgehenden unreifen DC (immature DC, iDC)
patrouillieren durch nahezu alle Gewebe80 - v.a. durch Gewebe, die in direktem
Kontakt mit der Umwelt stehen (Haut und periphere Schleimhäute)81, aber auch im
Interstitium der parenchymatösen Organe, im Blut und im Lymphgewebe - als
7
sogenannte „Wächterzellen des Immunsystems“ auf der Suche nach potentiellen
Antigenen. Kommt es zu Antigenkontakt, z.B. in Form von pathogenen Erregern oder
toten Zellen, können die iDC diese durch Makropinozytose, Rezeptor vermittelte
Endozytose
und
Phagozytose
aufnehmen.82
84
83
Die
für
die
AG-Aufnahme
85
erforderlichen Rezeptoren (u.a. DC-SIGN , DEC205 ) werden auf unreifen DC im
besonderen Maße86, MHC-II-Komplexe hingegen in geringer Menge87 und
kostimulatorischen Moleküle88 nahezu gar nicht exprimiert79. Die aufgenommenen
Proteine werden intrazellulär zu Peptiden prozessiert und mit MHC-Komplexen
verbunden.72
89
Peptide, die aus dem Zytosol der Zelle stammen, werden zur
Präsentation für CD8+ zytotoxische Killerzellen mit MHC-I90, Peptide, die von außen
aufgenommen wurden, zur Präsentation für CD4+ T-Zellen mit MHC-II komplexiert.91
72
Z.B. durch proinflammatorische Zytokine wie IL-1 und TNF-α92
93
, durch
Signalmoleküle wie CD4094 oder durch Stimulation der Toll-like Rezeptoren kommt
es dann zur Aktivierung der DC. Die Zellen begeben sich auf eine Wanderung vom
Ort des Entzündungsgeschehens über die Lymphgefäße in die T-Zell-Region lokaler
Lymphknoten.72
95
Die Migration der DC wird durch die Ausbildung entsprechender
Chemokinrezeptoren (CCR), wie v.a. von CCR7, auf ihrer Oberfläche gesteuert.96
Auf ihrem Weg kommt es durch verschiedene zellbiologische Vorgänge zur Reifung
der DC. Die reifen DC (mature DC, mDC) sind nun in der Lage die auf ihrer
Zelloberfläche an MHC-Komplexe gebundenen Antigenfragmente (Epitope) den
naiven T-Lymphozyten (CD4+ bzw. CD8+) zu präsentieren. Aus dem Pool der
zirkulierenden T-Zellen wird die spezifisch zum präsentierten AG passende T-Zelle
aktiviert und deren klonale Expansion und Differenzierung in Effektorzellen
ausgelöst.97
98
Im
Oberflächenmoleküle99
reifen
100
Zustand
exprimieren
die
DC
kostimulatorische
wie B7 oder CD83 und produzieren verstärkt T-Zell
stimulierende Zytokine wie IL-12, TNF-α, IL-1β und IL-6.101
79
Die DC-Reifung
kontrolliert somit die Induktion von CD4+ und CD8+ T-Zell-Immunität. 102 103 Die für die
Migration der DC in den Lymphknoten (Chemokinrezeptoren), für die Interaktion mit
der T-Zelle (Adhäsionsmoleküle) und für die Kostimulation (B7-Moleküle und TNFRLiganden) erforderlichen Moleküle werden im reifen Zustand auf der Oberfläche der
DC im hohen Maße exprimiert.104 Ob sich aus der Aktivierung der T-Zellen eine
Immunitäts- oder eine Toleranzentwicklung ergibt, hängt v.a. von der Expression
8
eben jener kostimulatorischen Moleküle (wie CD80, CD86, CD40) auf den DC, aber
auch vom vorherrschenden Zytokinprofil und von Mediatoren wie IDO ab.
Neben ihrer Fähigkeit eine spezifische T-Zell-Antwort auszulösen, haben die DC
auch wichtige regulatorische Aufgaben im Immunsystem hinsichtlich der Induktion
einer peripheren Toleranz.94
105
106
So können unreife107 und mukosale DC
regulatorische T-Zellen induzieren, so dass eine Immunreaktion auf harmlose
Antigene verhindert wird.108-110 Auch können die DC T-Zellen in Richtung TH2 - Helfer
Antwort polarisieren111, wenn sie mit antiinflammatorischen Zytokinen wie IL-10112 113
114
oder Glukokortikoiden wie Dexamethason115 versetzt werden. Reife DC
stimulieren also inflammatorische TH1-Zellen, unreife DC induzieren IL-10produzierende regulatorische T-Zellen. Durch Stimulation mit unreifen DC wird die
Proliferation alloreaktiver T-Zellen irreversibel inhibiert und die T-Zellen verlieren ihre
Fähigkeit, IFN-γ, IL-2 oder IL-4 zu produzieren.116
Lutz und Schuler sprechen neben den reifen und unreifen DC von einem möglichen
semimaturen Zustand der DC, der eine permanente Toleranz gegenüber Selbst-AG
(aus peripheren Geweben) durch Induktion von CD4 + Treg - Zellen vermittelt. SemiMaturitiät werde durch Zytokine wie TNF-α induziert, wobei die DC dann trotz hoher
Expression
von
MHC-II-
und
kostimulatorischen
Molekülen
keine
proinflammatorischen Zytokine produzieren.79
Neben der Unterscheidung durch ihre Reife können die DC auch nach ihrer
Entstehung in zwei Hauptgruppen eingeteilt werden: Myeloide DC (DC1), die
bevorzugt TH1-Antworten induzieren und plasmazytoide DC (DC2), die TH2Antworten begünstigen. Dies trifft aber v.a. in Nagetieren zu.117
9
Lebenszyklus der DC
Abb. 3: Lebenszyklus der DC
Die unreifen DC (iDC) agieren im peripheren Gewebe als Wächterzellen. Sie nehmen fremde
Antigene (AG) auf und werden so aktiviert. Während der Verarbeitung der AG migrieren sie über die
Lymphgefäße in die Lymphknoten und reifen. Im Lymphknoten nehmen die reifen DC (mDC) Kontakt
mit den passenden T-Zellen auf und aktivieren diese. Die T-Zellen wandern dann zur spezifischen
Immunantwort ins entzündete Gewebe.
(Abbildung modifiziert nach Huck, B. Einfluss Schwangerschafts-assoziierter Hormone auf Phänotyp
und Funktion humaner dendritischer Zellen, Dissertation, Würzburg, 2004)
10
Unreife DC
Gewebeständig
Halbreife DC
SteadyState
migratorisch
Darmflora
intranasal
apoptotische Zellen
TNF-α
Reife DC
Infektiöser Status
migratorisch
LPS & CD40L
LPS & CD40L
MHC II: niedrig
B7: negativ/niedrig
IL-12-, IL-10-, IL-6-, TNF-α-,
IL-1β+
MHC II: hoch
B7: hoch
IL-12-, IL-10-/+, IL-6-, TNF-α+,
IL-1β+
MHC II: hoch
B7 hoch
IL-12+, IL-6+, TNF-α+, IL-1β+
Anergie
CD4+ IL-10+ Treg
Immunität
Toleranz
Toleranz
Immunität
Abb. 4: Unreife, halbreife, reife DC im Kontext der T-Zell-Toleranz und Immunität.
+
In vivo sind halbreife DC aktiv an der Toleranzentwicklung beteiligt, indem sie IL-10
+
CD4
regulatorische T-Zellen (Treg) Antigen-spezifisch aktivieren. Unreife DC induzieren T-Zell-Inaktivität
durch niedrige Expression von MHC II und kostimulatorischer Moleküle wie B7 und geringe Sekretion
proinflammatorischer Zytokine. Reife DC sind essentiell für die Stimulation der T-Zell-Immunität. Die
Reifung wird durch Stimulation von TLR z.B. durch LPS verursacht.
(Abbildung modifziert nach Lutz, M. B. and G. Schuler (2002). "Immature, semi-mature and fully
mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity?" Trends Immunol 23(9): 445-449.)
1.6
Dendritische Zellen im uterinen Kontext
Neben
anderen
immunkompetenten
Zellen
im
Bereich
der
fetomaternalen
Grenzzone könnten gerade die dendritischen Zellen für den Erhalt oder Misserfolg
einer Schwangerschaft verantwortlich sein. Die DC scheinen für die schwierige
Aufgabe, zum einen die Mutter (und somit auch den Fetus) vor Infektionen zu
11
schützen, zum anderen aber durch mögliche Präsentation fetaler AG, Toleranz
gegenüber dem Fetus zu schaffen, geeignet zu sein. Entscheidend ist das
Zusammenspiel der verschiedenen Zellen. Die DC-Funktion in utero in der frühen
Schwangerschaft muss immer in Relation zu den maternalen uNK und T-Zellen
gesehen werden.65 So findet sich z.B. eine kleine Anzahl unreifer DC in der Dezidua
in Gebieten mit dichter uNK-Infiltration. Diese dezidualen iDC könnten über
Aktivierung der NK die angeborene Immunabwehr stimulieren oder sie selbst
könnten durch Signale der NK, die die Liganden des Trophoblasten erkennen,
beeinflusst werden.
19 118
Der Einfluss der DC auf die NK und vice versa hängt von
dem Konzentrationsverhältnis DC zu NK und der Reife der DC ab.119 T-Zellen
erkennen den Trophoblasten nicht direkt, da er nur wenig HLA-C und kein HLA-A
und B exprimiert (s.o.). Somit ist die indirekte Erkennung über Präsentation durch
APC wahrscheinlicher und die Funktion der DC tolerogen oder immunogen zu wirken
entscheidend.
Die meisten der CD14+ mononukleären Zellen, die 20% der endometrialen
Leukozyten darstellen, exprimieren HLA-DR und DC-SIGN (CD209), welche Marker
für unreife dendritische Zellen darstellen.66
68
Im Gegensatz dazu sind reife CD83+
DC nur in geringer Menge in der Dezidua vorhanden.66
120
Askelund et al. fanden
eine signifikant höhere Anzahl an reifen DC in humanem Deziduagewebe von
Aborten in der 8.Schwangerschaftswoche als in normalen Schwangerschaften, was
die Vermutung nahelegt, dass reife DC eine Rolle in der Pathophysiologe von
habituellen Aborten spielen.121 Eine einzelne reife DC kann 100-3000 T-Zellen
stimulieren.122 So könnte auch eine nur kleine Anzahl an reifen DC in der humanen
Dezidua wichtiger Mediator für immunologische Interaktion in der fetomaternalen
Grenzzone sein.66 Die Art und der Reifungszustand der dezidualen DC ist also evtl.
das kritische Moment in der T-Zell-Alloerkennung des Trophoblasten.
Die im Uterus vorkommenden DC ähneln, wie von Kämmerer et al. beschrieben,
phänotypisch den im Stroma von Tumoren vorliegenden sog. Tumor assoziierten
Makrophagen (TAM).68
123
Es ist zu vermuten, dass TAM bzw. uterine DC (uDC)
wesentlich zum Wachstum und zur Invasität, aber auch zur Immunevasion der
Tumorzellen124 bzw. des Trophoblasten beitragen. Tumorassoziierte DC (z.B. DC
aus Metastasen bei malignem Melanom, DC aus dem peripheren Blut bei
Mammakarzinom) haben gewöhnlich eine niedrige allostimulatorische Fähigkeit und
12
liegen v.a. im unreifen Zustand vor. Zudem kann IL-10 in Tumorgeweben die
Toleranzentwicklung unterstützen.125-127 Unterbleibt bei AG-Kontakt die vermehrte
Produktion von CCR 7 (s.o.) auf der Oberfläche der iDC, bleiben die DC an Ort und
Stelle, was bei der Plazentation ein Grund für die Ansammlung unreifer Zellen ohne
oder mit nur wenigen auswandernden klassischen DC zu sein scheint. Das
Ausbleiben der Reifung der uDC wird wesentlich durch das Mikromilieu, in welchem
der Antigenkontakt stattfindet, bestimmt, so dass hier der Schlüssel zur Entwicklung
von Toleranz oder Abwehr vermutet wird. Im Plazentabett herrscht ein Milieu vor, in
dem ein eher tolerogener Phänotyp von uterinen DC vorliegt.123 Dies beinhaltet die
Anwesenheit von Prostaglandin E2128, Vitamin D3129, TGFβ und IL-10.130 65
13
uNK
Abb.5: DC im intrauterinen Kontext in der frühen Schwangerschaft
Aus der Haftzotte, die die Plazenta an der Dezidua verankert, wandern die CTB in die Dezidua und bis
ins Myometrium, wo sie in Kontakt mit den maternalen Immunzellen gelangen. Es finden sich darunter
neben den unreifen und reifen DC besonders viele uterine NK-Zellen (uNK), die oft in engem Kontakt
mit iDC beobachtet werden, T-Zellen, die mit mDC assoziiert vorliegen können, und Makrophagen
(MP). In der dezidualen Basalis liegen die iDC und uNK auch assoziiert mit invasivem CTB vor. Der
invasive CTB wandert von den Haftzotten aus durch die stromale Dezidua bis ins Myometrium, wo die
Zellen zu Riesenzellen fusionieren. Auf dem Weg ins Myometrium werden einige CTB apoptotisch und
dann von den iDC aufgenommen. Ein komplexes Mikromilieu an Zytokinen und anderen löslichen
Faktoren ermöglicht die wechselseitige Kommunikation zwischen den Zellen.
(Abbildung modifiziert nach Kammerer, U., von Wolff, M. et al. (2004). "Immunology of human
endometrium." Immunobiology 209(7): 569-574.)
14
Wie kommt es aber dazu, dass gerade die unreifen DC in der fetomaternalen
Grenzzone vorherrschen und die Reifung unterbleibt? Wie kommt es zur Schaffung
des tolerogenen Mikromilieus und dem Status einer friedvollen Koexistenz zwischen
zwei allogenen Geweben?
Bemerkenswert
ist,
dass
insbesondere
die
Plazenta
Trophoblast131-133 aber auch viele maligne Zellen134
135
und
der
extravillöse
durch eine einzigartige
Expression von Proteinen humaner endogener Retroviren (HERV) auffallen.
1.7
Humane endogene Retroviren (HERV)
Im humanen Genomprojekt (International Human Genome Sequencing Consortium
IHGS) wurde gezeigt, das ca. 8% des menschlichen Genoms aus endogenem
Virenmaterial besteht136, das vermutlich von infektiösen Retroviren stammt, die sich
im Laufe der letzten 40 Millionen Jahren durch Infektion der Keimzellen ins Genom
integriert haben und nach den mendelschen Regeln von Generation zu Generation
vererbt worden sind und werden.136
137 138 139
Die Nomenklatur der HERV erfolgt
heterogen, meist aber sind sie anhand der Bindungsstelle für den Primer, der die
reverse Transkription initiiert, benannt. Der Einbuchstabencode der Aminosäure des
jeweiligen t-RNA-Primers gibt dem HERV seinen Namen. So ergibt sich z.B. für Lysin
das Suffix K.140 141
Retrovirale Genome weisen eine typische Organisation auf, die sich durch gespleißte
Leserahmen mit den Gengruppen gag, pro, pol und env, die von nicht kodierenden
„long
term
repeats“
(LTR)
eingerahmt
werden,
auszeichnen
(s.u.).
Gag
(Gruppenspezifisches Antigen) kodiert für virale Strukturproteine (Matrix-, Capsidund Nukleokapsidproteine), Pol (Polymerase) und Pro (Protease) für virale Enzyme
(Reverse Transkriptase, Integrase, RNase, Protease, Polymerase) und Env
(Envelope) für Hüllproteine. Die LTR enthalten nichtkodierende und regulatorische
Sequenzen, u.a. Promotor- und Enhancer-Elemente.142 Exogene Retroviren sind von
einer Hüllmembran (Envelope) umgeben, in die transmembrane Hüllproteine (TM)
eingelagert sind, die der Rezeptorerkennung und Membranfusion dienen. An den
extraviralen Bereich des TM-Proteins ist ein externes Glykoprotein gebunden. Im
Inneren befinden sich das Virus-Kapsid, Nukleokapsidproteine und die viralen
Enzyme.143
15
Abb. 6: Schematischer Aufbau eines exogenen Retrovirus am Beispiel von HIV-1:
Die Hüllproteine aus transmembraner Untereinheit (TM) und Oberflächenglykoprotein (SU) sind in die
Membran eingelagert. (RT=Reverse Transkriptase)
(Abbildung modifiziert nach US National Institute of Health,
http://www.niaid.nih.gov/topics/HIVAIDS/Understanding/Biology/Pages/structure.aspx, Nov. 2011)
16
Retroviraler Lebenszyklus
Abb.7: Lebenszyklus von exogenen und endogenen Retroviren
Ein extrazelluläres Retrovirus besteht aus einer äußeren Hülle aus Glykoproteinen (Produkte des envGens) und der Zellmembran der Wirtszelle und den innerhalb dieser Hülle befindlichen Proteinen
(Produkte des gag-Gens) und zwei viralen RNA-Strängen, die sich aus den nichtkodierenden
Abschnitten
und
zusammensetzen.
mehreren
Das
retroviralen
Virus
interagiert
Enzymen
mit
(u.a.
der
die
Reverse
Wirtszellmembran
Transkriptase,
und
gelangt
RT)
durch
rezeptorvermittelte Endozytose in die Zielzelle. Nun wird die virale RNA durch die RT revers
transkribiert, die doppelsträngige DNA gelangt in den Zellkern und wird in das Genom des Wirts durch
die virale Integrase integriert. Nach Transkription der proviralen (integrierten) DNA wird die
entstandene virale RNA entweder für die Bildung neuer Viruspartikel oder für die Synthese viraler
Proteine verwendet. Die Schritte 1, 2 und 3 sind charakteristisch für extrazelluläre RV, alle anderen
Schritte für extrazelluläre und endogene RV. Eine Rekombination zweier LTRs eines ERV, die zu
einem einzelnen LTR führt ist möglich.
(Abbildung modifiziert nach Sverdlov, E. D. (2000). "Retroviruses and primate evolution." Bioessays
22(2): 161-171.)
Nach Integration der Retroviren ins Genom kam es im Verlauf der Evolution durch
Rekombinationen, Insertionen, Mutationen und Deletionen zur Inaktivierung eines
großen Teils der integrierten Retroelemente und somit oft auch zum Verlust ihrer
Infektiösität. Von vielen HERV sind im Genom nur noch die LTR erhalten, die als
Promotoren und Enhancer die Transkription zellulärer Gene aktivieren können.
Andererseits können Gene ihre Funktion auch verlieren, wenn es zur Integration des
HERV innerhalb dieser Gene kommt.136 142 137 131
17
Einige HERV weisen jedoch intakte offene Leserahmen (open reading frames,
ORFs) auf und so können bestimmte Sequenzen transkribiert und translatiert
werden.137
Die
Transkription
und
Expression
der
meisten
HERV
ist
gewebespezifisch. So werden retrovirale Elemente v.a. in Keimbahnzellen, in fetalem
Gewebe, in der Plazenta und auch in Tumorgewebe nachgewiesen.141 144
Gewebe
Treffer
HERV
EST
Anteil
HERV
Gewebe
Treffer
HERV
EST
Anteil
HERV
Zervix
Amnion normal
Leiomyos
Kolon (pooled)
Pankreas/Milz
(p.)
Knorpel
Fetales Gehirn
Leukozyten
Gehirn (pooled)
Hypothalamus
Milz
Muskuloskelettal
Prostatatumor
Prostata (normal)
ZNS
Hoden (normal)
Kopf (normal)
Brust (normal)
Lunge (normal)
Dünndarm
Kolon (normal)
Skelettmuskel
RPE u. Choroid
B-Zellen
Leber (nichtkanzerös)
HCC
Blase
fetale Augen
Nebenschilddrüse
Vorhaut
Nebenniere
Knochen
Kolon_ins.
Uterustumor
27
7
25
12
20
10080
10083
10108
10131
10197
0,27%
0,07%
0,25%
0,12%
0,20%
Pooled
Magen
Lungentumor
Blut
Nerventumor
59
373
105
84
147
26256
151066
31258
33243
38993
0.22%
0.25%
0.34%
0.25%
0.38%
39
7
12
15
78
24
10
25
27
28
28
52
96
61
39
53
143
68
27
30
10240
10327
10500
10710
12251
12459
12952
13461
13771
13988
14513
14539
42490
15177
15342
15737
17470
17894
18415
19506
0,38%
0,07%
0,11%
0,14%
0,64%
0,19%
0,08%
0,1%
0,20%
0,20%
0,19%
0,36%
0.23%
0.40%
0.25%
0.34%
0.82%
0.38%
0.15%
0.15%
123
39
94
88
162
219
110
531
248
116
195
158
268
261
539
351
328
372
346
92
40612
14842
43481
45610
51840
53681
53835
54135
65133
66823
74790
83387
104003
115824
118000
127496
129796
135730
146515
27652
0.30%
0,26%
0.22%
0.19%
0.31%
0.41%
0.20%
0.98%
0.38%
0.17%
0.26%
0.19%
0.26%
0.23%
0.46%
0.28%
0.25%
0.27%
0.24%
0.33%
29
57
84
72
34
86
50
89
68
19629
20339
22312
22510
23088
23654
24471
25147
25283
0.15%
0.28%
0.38%
0.32%
0.15%
0.36%
0.20%
0.35%
0.27%
Mark
Ohr
Embryo
Leber
Tonsillen
Nerv normal
Muskel
Plazenta
Keimzellen
Herz
Auge
Lymphe
Ovar
Haut
Hoden
Brust
Pankreas
Kopf-Nacken
Prostata
Knochenmar
k
Niere
Plazenta
Uterus
Kolon
Lunge
Pool
Hirn
Sonstiges
399
339
483
586
547
684
713
1036
153028
158876
171685
184598
216632
240799
347423
347670
0.26%
0.21%
0.28%
0.32%
0.25%
0.28%
0.21%
0.30%
Tab. 1: Expression von HERV in menschlichem Gewebe
Expressed Sequence Tag (EST) = exprimierte DNA-Sequenzen
Höchste Expressionsrate von HERV in der normalen Plazenta
(Tabelle modifiziert nach Kim, T. H., Y. J. Jeon, et al. (2004). "The distribution and expression of
HERV families in the human genome." Mol Cells 18(1): 87-93.)
18
Die Konservierung im Genom über Millionen von Jahren lässt vermuten, dass die
HERV als „symbiontische Parasiten“ einen wichtigen Beitrag zu physiologischen
Funktionen im menschlichen Körper leisten bzw. sogar mitverantwortlich für die
menschliche Evolution sind. Jedoch werden ihnen auch pathologische Auswirkungen
zugeschrieben, z.B. bei Erkrankungen wie Multiple Sklerose145, Schizophrenie146
147
und Neoplasien.148
HERV
ORFs in pol, gag, env
 HERV-K
ORFs in pro, pol, env
 HERV-H
ORF in pol
 HERV-L
ORF in gag
 ERV-1
 HERV-F (XA 34)
 HRES-1
ORF in env
 ERV-3 (HERV-R)
 HERV-FRD
 HERV-W
 HERV-E (clone 4-1)
 HERV-R(b)
 HERV-T
 ERV-9
ORF
Pol (mehrere Stellen)
Gag, env (6 verschiedene
Stellen)
Env (2q24.3), pro, pol
Lokalisierung
Plazenta (VT, EVT)
Pol
Plazenta, env in Amnion und
Chorion
Plazenta
Gag (18q22-23)
Gag (7q31.1-q31.3)
Gag (1q42)
SZT
Plazenta
Plazenta
Env (7q11.21)
Env (6p24.1)
Env (7q21.2)
Env
Env (3p24.3)
Env (19p13.11)
Env (11q13)
SZT
Plazenta
SZT, CTB
SZT
Plazenta
Plazenta
Plazenta
Tab. 2: Expression endogener Retroviren in der menschlichen Plazenta
Die Angabe von „Plazenta“ bedeutet, dass die Lokalisation nicht näher spezifiert werden kann.
Zytotrophoblast
(CTB),
villöser
Zytotrophoblast
(VT),
extravillöser
Zytotrophoblast
(EVT),
Synzytiotrophoblast (SZT).
(modifiziert nach Rote, N. S., S. Chakrabarti, et al. (2004). "The role of human endogenous
retroviruses in trophoblast differentiation and placental development." Placenta 25(8-9): 673-683.)
Die überproportionale Expression von HERV-Hüllproteinen in der Plazenta (z.B.
HERV-W 149, ERV-3150, HERV-FRD151) legt die Annahme nahe, dass diesen dort eine
besondere Rolle zukommt. Besonders gut untersucht sind hier z.B. Syncytin 1 als
Hüllprotein von HERV-W und Syncytin 2 als Hüllprotein von HERV-FRD, die auf der
Oberfläche des Trophoblasten exprimiert werden und wesentlich für die Fusion der
Zytotrophoblastzellen zum Synzytiotrophoblasten verantwortlich sind.149 151 152 22
Im hiesigen Labor konnte erstmals die Expression des transmembranen Hüllproteins
von HERV-K in normaler Plazenta zu verschiedenen Zeiten der Schwangerschaft
19
mittels Immunhistochemie und Western-Blot nachgewiesen werden. Das TM-Protein
wurde
in
villösen
Zytotrophoblastenzellen
Zytotrophoblastenzellen
(EVT)
(VT)
gefunden,
nicht
und
in
aber
extravillösem
in
den
Synzytiotrophoblastenzellen (SZT).153
CTB
CTB-Säule
Braun = Hüllprotein von HERV-K
Abb. 8: Expression von HERV-K-Hüllprotein in der Plazenta
Einige HERV-K-Proviren sind als aktivste und jüngste HERV die einzigen bekannten
endogenen Retroviren mit intaktem offenem Leserahmen für alle viralen Gene154 und
dadurch prinzipiell in der Lage sämtliche für die Replikation notwendigen Proteine zu
synthetisieren.141 Es existieren mehr als 60 provirale Kopien und über 2500 einzelne
LTR-Sequenzen im menschlichen Genom. In der Regel werden keine infektiösen
Partikel gebildet, dennoch wurde nachgewiesen, dass in humanen Plazenten HERV-K
verwandte Sequenzen in retrovirale Partikel verpackt werden können.155 156
Abb. 9: Strukturelles Schema von HERV-K
LTR mit möglichen Hormon responsiven Elementen, Enhancer-, Promotor-Elementen und
Polyadenylierungssignal und kodierende Genabschnitte.
(Abbildung modifiziert nach Sverdlov, E. D. (2000). "Retroviruses and primate evolution." Bioessays
22(2): 161-171.)
20
Frühere Studien haben neben fusiogenen auch immunmodulierende Eigenschaften
von
retroviralen
Hüllproteinen
festgestellt.
Zum
einen
kann
es
durch
Rezeptorinterferenz zum Schutz vor Infektion mit nahe verwandten exogenen
Retroviren kommen127
147
, zum anderen können die viralen Transmembranproteine
einen Effekt auf die Zellen des Immunsystems ausüben. U.a. Syncytin 2157 und die
transmembranen Hüllproteine von HERV-H158
159
wurden in früheren Studien bereits
als immunsuppressiv beschrieben. Durch eine immunsuppressive Domäne der TM160
161 158
ist eine lokale Unterdrückung der Immunantwort im Bereich der fetomaternalen
Grenzzone denkbar. Jedoch könnte es durch die HERV-Peptide auch zu einer
proinflammatorischen Reaktion durch die APC kommen, wie es für den Multiple
Sklerose MS)-assoziierten HERV (MSRV) bereits gezeigt wurde.162
1.8
Zytokine
Zytokine163 164 sind eine Familie von löslichen Polypeptiden mit kurzer Halbwertszeit
von einigen Minuten und niedrigem Molekulargewicht (<80kD), die viele Antworten
des angeborenen und erworbenen Immunsystems regulieren und gewöhnlich in
Konzentrationen im pikomolaren Bereich zur Spezialisierung des Immunsystems
beitragen. Dieselben Zytokine können von vielen verschiedenen Zellen gebildet
werden und einzelne Zytokine wirken auf verschiedene Zellen hämatopoetischer,
endokriner, nervöser und immuner Mechanismen. Zur Familie der Zytokine gehören
die Interleukine (IL), Kolonie-stimulierende-Faktoren (z.B. G-CSF, GM-CSF),
Interferone (z.B. IFN-γ), Zytotoxine (z.B. Tumornekrosefaktor α (TNF-α)), Chemokine
(z.B. IL-8, MCP-1) und Wachstumsfaktoren (z.B. TGF-α). Trotz ihrer strukturellen
Unterschiede teilen sie mehrere Eigenschaften. Es kommt zu einer transienten,
selbstlimitierenden Sekretion. In ihrer Wirkung sind sie meist pleiotrop und
redundant. Pleiotropismus bedeutet, dass ein Zytokin verschiedene Zelltypen
beeinflussen kann und somit verschiedene biologische Effekte verursacht.
Redundanz hingegen bedeutet, dass mehrere Zytokine dieselben Funktionen
übernehmen können. Des Weiteren beeinflussen sich die Moleküle in ihrer Synthese
und Wirkung oft gegenseitig, sie können sich in ihrer Reaktion auf (patho-)
physiologische Zellfunktionen antagonisieren bzw. additive oder synergistische
Effekte aufweisen. Sie können lokal (auto- bzw. parakrin), aber auch systemisch
21
(endokrin) agieren. Die Information der Zytokine wird über die Bindung an
spezifische hochaffine Rezeptoren auf den Zielzellen vermittelt. Externe Signale
regulieren die Expression der Rezeptoren und so die Antwort der Zellen. Die
zelluläre Antwort beinhaltet Veränderungen in der Genexpression der Zielzelle. Dies
kann zu neuen Funktionen oder zur Proliferation von Zellen führen, aber auch die
Aktivierung von Apoptose induzierenden Enzymen bedingen (TNF). Viele der
Veränderungen in der Genexpression führen zur Differenzierung und Proliferation
der B- und T-Lymphozyten und Aktivierung der Effektorzellen (u.a. Makrophagen).
Beispielsweise kommt es zur Differenzierung der T-Helfer-Zellen in TH1- und TH2Zellen. Die Antworten der Zielzellen auf die Zytokine sind i.d.R. streng reguliert und
Feedbackmechanismen verhindern ein Überschießen der Antworten.
1.8.1 Proinflammatorische Zytokine
1.8.1.1 Tumornekrosefaktor α
TNF-α163
164
ist maßgeblich an einer akuten inflammatorischen Reaktion beteiligt.
Ursprünglich wurde TNF-α als Serumbestandteil, der Nekrose von Tumoren
verursachte, identifiziert.165 Gebildet wird TNF-α hauptsächlich von aktivierten
mononukleären Phagozyten, aber auch von AG-stimulierten T-Zellen, NK-Zellen und
Mastzellen.166 Der potenteste Stimulator für TNF-α-Produktion durch Makrophagen
ist die Bindung von Lipopolysacchariden (LPS) an Toll like - Rezeptoren (TLR). Auch
IFN-γ (aus TH1- und NK-Zellen) fördert die TNF-α-Synthese. Seine überwiegende
physiologische Funktion ist die Rekrutierung von Neutrophilen und Monozyten zu
den Orten der Infektion und die Aktivierung dieser Zellen, Mikroorganismen zu
eradizieren.
TNF-α
veranlasst
die
Endothelzellen,
Adhäsionsmoleküle
für
Neutrophile, Monozyten und Lymphozyten zu exprimieren. Außerdem stimuliert
TNF-α die Zytokinsekretion von Endothelzellen und Makrophagen, was wiederum die
Chemotaxis von Leukozyten bewirkt. Zudem bewirkt TNF-α eine vermehrte Sekretion
von IL-1, das ähnliche Wirkungen wie TNF-α aufweist. In vitro induziert TNF-α die
Apoptose von Zellen.
Bei Vorliegen großer Mengen an TNF-α kommt es zu systemischen Auswirkungen
wie Induktion von Fieber im Hypothalamus (wie auch durch IL-1), Erhöhung der
Akute-Phase-Proteine (wie auch durch IL-6 und IL-1), Kachexie, Erniedrigung des
22
Blutdrucks, intravaskuläre Thrombosen und Hypoglykämie. Überproduziert kann
dieses Zytokin für viele systemische Komplikationen bis hin zum Tod im Rahmen
einer Sepsis verantwortlich sein. Im Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen ist
TNF-α Gegenstand intensiver Forschung.
Auch DC bilden nach Stimulation durch bakterielle AG wie LPS, also v.a. in ihrem
reifen Zustand, TNF-α.167 Zugleich steigert TNF-α die Migration der DC und bewirkt
zusammen mit PGE2 die Ausreifung der DC.168 169
1.8.1.2 Interleukin 1β
Die Funktion von IL-1163
164
besteht im Rahmen des angeborenen Immunsystems in
der Unterstützung von inflammatorischen Immunreaktionen bei Infektion und
anderen Stimuli. Es wird hautsächlich von aktivierten mononukleären Phagozyten,
von Neutrophilen, Epithel- und Endothelzellen gebildet. Seine Produktion wird durch
bakterielle Produkte (wie z.B. LPS) und andere Zytokine wie TNF-α stimuliert. Es
existieren IL-1α und β. Die biologischen Effekte von IL-1 sind ähnlich denen von
TNF-α und abhängig von der vorliegenden Menge des Zytokins. Bei niedrigen
Konzentrationen wirkt IL-1 als Vermittler einer lokalen Entzündungsreaktion, es
erhöht
die
Expression
von
Adhäsionsmolekülen
auf
der
Oberfläche
von
Endothelzellen, es stimuliert die Reifung der DC. Bei höheren Konzentrationen
kommt es zu systemischen Auswirkungen (Fieber, Stimulation der IL-6-, AkutePhase-Proteine-Bildung und der Neutrophilen- und Thrombozytenproduktion im
Knochenmark). Im Gegensatz zu TNF-α bewirkt IL-1 aber keine Apoptose von Zellen
und auch in sehr hohen Dosen keinen septischen Schock.
1.8.1.3 Interleukin 2
IL-2163
164
, ein Glykoprotein aus 133 Aminosäuren (15,4kDa), spielt als Wachstums-,
Überlebens- und Differenzierungssignal für B- und T-Lymphozyten eine große Rolle
in der Regulation der Immunantwort. Es wird nach Aktivierung mit AG und anderen
Kostimulatoren v.a. von T-Zellen sezerniert. Es fördert die Proliferation stimulierter TZellen und erhöht die Produktion von IFN-γ und IL-4 durch eben diese Zellen.
Außerdem fördert es die Proliferation und Differenzierung der NK und induziert deren
zytolytische Funktion. Jedoch ist IL-2 auch notwendig für das Überleben und evtl. die
23
Funktion von regulatorischen T-Zellen, die eine Immunantwort auf Selbst- und
andere AG unterdrücken können. IL-2 kann die Lyse von unreifen DC durch NK
verursachen, wohingegen die mDCs davor geschützt sind.170 Die Produktion von IL-2
durch die DC stimuliert die T-Zellen und bewirkt evtl. einen Switch von Toleranz zur
Immunitätsentwicklung.171
1.8.1.4 Interleukin 8
IL-8163
164
gehört zur Familie der CXC-Chemokine. Diese stellen eine Gruppe von
strukturell verwandten Zytokinen dar, die die Bewegung von Leukozyten stimulieren
und die Migration von Leukozyten vom Blut an den Ort des Entzündungsgeschehens
regulieren und einen Beitrag zur Angiogenese und Wundheilung leisten. Es
existieren ca. 50 bekannte humane Chemokine, die alle 8-12 kD-Polypeptide
darstellen. Proinflammatorische CXC Chemokine ziehen v.a. Neutrophile an und
aktivieren diese.172
173
IL-8 bewirkt auch eine Chemotaxis von T-Zellen und die
Unterdrückung der IL-4 Produktion.174 Es wird nach exogener und endogener
Stimulation durch eine Vielzahl verschiedener Zellen produziert. Auch DC
sezernieren IL-8 in niedriger Konzentration.175 Die Sekretion durch die DC wird durch
Zytokine wie IL-1 und TNF-α, durch bakterielle und virale Antigene und unter
oxidativem Stress gesteigert.176 177
1.8.1.5 Interleukin 6
IL-6163
164
ist ein Zytokin des angeborenen und erworbenen Immunsystems. Es wird
von mononukleären Phagozyten, vaskulären Endothelzellen, Fibroblasten, B-/TZellen und anderen Zellen als Reaktion auf Erreger und andere Zytokine (v.a. IL-1
und TNF-α) gebildet. Im Rahmen der angeborenen Immunantwort stimuliert IL-6 die
Synthese von Akute-Phase-Proteinen durch Hepatozyten und die Proliferation von
Neutrophilen aus Knochenmarkvorläufern. Aber auch auf andere hämatopoetische
Zellen wirkt IL-6 als Wachstumsfaktor. Im Hinblick auf das erworbene Immunsystem
fördert IL-6 das Wachstum der B-Lymphozyten und deren Differenzierung zu
Plasmazellen und wirkt möglicher Weise auch unterstützend auf zellvermittelte
Immunreaktionen, indem es die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen
verstärkt und die Generierung und Aktivität von regulatorischen T-Zellen eindämmt.
24
Zu beachten ist jedoch auch die mögliche antiinflammatorische Potenz des IL-6, die
sich in der Fähigkeit die Konzentration der proinflammatorischen Zytokine TNF-α und
IL-1 zu senken zeigt.178
1.8.2 Antiinflammatorische Zytokine
1.8.2.1 Interleukin 4
IL-4163
164
stellt den Hauptstimulus für die Produktion von IgE-Antikörpern und für die
Entwicklung von TH2-Zellen aus naiven CD4+ Helfer-T-Zellen dar und ist somit
vornehmlich für die Abwehr von Helminthen und Parasiten zuständig, aber auch
entscheidend in der Entstehung von Allergien. IL-4 wird als das Signalmolekül für die
TH2-Untergruppe bezeichnet und wirkt als Induktor und Effektor-Zytokin dieser
Zellen. Im Gegenzug unterdrückt es die TH1-Antwort und wirkt antagonistisch zu
IFN-γ, dem TH1-Signalmolekül. Insgesamt wird also ein eher immunsuppressives
Milieu unterstützt. Hauptsächliche Quellen von IL-4 sind die TH2-Zellen und aktivierte
Mastzellen.
Durch die Sekretion von IL-4 unterstützen DC die Differenzierung der T-Zellen und
deren IL-4 und IL-5-Produktion. Dies führt zur Aktivierung der Eosinophilen und IgESynthese in B-Zellen.97 IL-4 stimulierte T-Zellen können auch zur Synthese des
immunsuppressiven IL-10 stimuliert werden.179
1.8.2.2 Interleukin 10
IL-10163
164
, ein TH2-Zytokin, wirkt inhibitorisch auf aktivierte Makrophagen und
dendritische Zellen und ist somit an der Kontrolle des angeborenen Immunsystems
und der zellvermittelten Immunantwort beteiligt. Es wird vor allem von aktivierten
Makrophagen, DC und TH2-Zellen gebildet. Interleukin 10 ist in der Lage, die
Zytokinproduktion von T-Zellen und NK zu hemmen.180
Fähigkeit der Makrophagen, T-Zellen zu stimulieren
184
181 182 183
Es unterdrückt die
und reduziert die Bildung von
IL-12 und somit auch IFN-γ, welche stark proinflammatorisch wirken (TH1-Antwort).
Weiterhin hemmt IL-10 auch die Expression von kostimulatorischen Molekülen
(CD80 und 86) und Klasse-II-MHC-Molekülen auf der Oberfläche von MP und DC,
25
wodurch die T-Zell-Aktivierung unterdrückt wird und zellvermittelte Immunreaktionen
unterbunden werden.114 185 112
IL-10-Knockout-Mäuse entwickeln entzündliche Darmerkrankungen, wahrscheinlich
als ein Ergebnis unkontrollierter MP-Aktivierung.186 Auch das Ebstein-Barr-Virus hat
ein Gen, das homolog zum menschlichen IL-10-Gen ist. Das virale IL-10 weist die
gleichen Aktivitäten wie das humane Zytokin auf. Folglich kann das Virus gleichsam
das Immunsystem seines Wirts unterdrücken.180
181 187
188
Auch menschliche
Zytotrophoblastenzellen sind in der Lage Interleukin 10 zu produzieren.189
Bezüglich der dendritischen Zellen spielt IL-10 eine wichtige regulatorische Rolle. Es
kann autokrin die DC im immaturen Zustand halten97
190
und die Sekretion von TH1-
Zytokinen (IL-12, IFN-γ) durch reife DC reduzieren191 und so eine TH1-Antwort
effizient
unterdrücken.
Wirkung.114
116 192 193
Unter
IL-10-Einfluss
vermitteln
iDC eine
tolerogene
Weiterhin können DC durch IL-10-Sekretion naive T-Zellen zur
Synthese von IL-4 stimulieren und somit die Differenzierung zu TH2-Zellen
unterstützen.113 Zudem ist IL-10 vermutlich entscheidend für die Generierung von
Treg.110 194 195 116
Aufgrund seiner immunsuppressiven Eigenschaften (T-Zellsuppression182, Induktion
von Treg116
195 110 194
, tolerogener Phänotyp der DC192 193
79
) könnte IL-10 aus den
iDC evtl. der Schlüssel zur maternalen Toleranzinduktion gegenüber dem Fetus
sein.130
1.8.3 TH1/TH2-Balance
Zytokine163
164
sind
neben
direkten
Zell-Zell-Kontakten
und
Stoffen
wie
Prostaglandinen und Hormonen wichtige Koordinatoren in der Kommunikation
zwischen Mutter und Fetus und spielen eine Rolle bei der Implantation, der
Entwicklung der Plazenta und dem Überleben des Fetus.196
Die Bezeichnung „TH-Zytokine“ leitet sich von den T-Helfer-Zellen, Effektorzellen des
adaptiven Immunsystems, ab. Die T-Zellen spielen neben der Immunabwehr eine
wichtige Rolle in der Abstoßung von Transplantaten, Anti-Tumor-Immunität und
Autoimmunität. Nach Kontakt mit einem Antigen werden die naiven CD4+ TVorläuferzellen zur Proliferation und Differenzierung in T H1- oder TH2-Zellen
veranlasst. Diese Zellen bilden dann je nach Typ verschiedene Zytokine. TH1-Zellen
26
setzen als wichtigstes Zytokin IFN-γ frei, welches dann zur Produktion von IgG1-3
führt. Eine TH1-Antwort u.a. zur Abwehr von viralen und bakteriellen Infekten hat eine
starke
proinflammatorische,
zelluläre
Immunantwort
und
die
Bildung
von
Immunglobulinen mit zytotoxischer Potenz zur Folge.
TH2-Zellen hingegen produzieren verstärkt IL-4 und IL-5. Während IL-4 die BLymphozyten zur Bildung von IgE und IgG4 veranlasst, führt IL-5 zu einer Aktivierung
der eosinophilen Granulozyten sowie zu einer vermehrten IgA-Bildung durch BLymphozyten. Eine TH2-Reaktionslage tritt bei allergischen Erkrankungen und
parasitären Infektionen und im Rahmen von Toleranzmechanismen auf.
IFN-γ und IL-4 hemmen wechselseitig die Stimulation des jeweils anderen TH-Typs.
Die Einteilung der Zytokine in die beiden Gruppen erfolgt danach, von welcher TZelle sie gebildet werden, aber auch welchen Weg der Differenzierung sie fördern.
IL-12 und IFN-γ fördern die Differenzierung von TH1-Zellen, IL-4 von TH2-Zellen.197
Zu den TH1-Zytokinen zählen TNF-α, IL-2, IL-12 und IFN-γ. Unter die TH2-Zytokine
fallen IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 und IL-13.198
199
Beim Menschen lassen sich die
Interleukine 2, 6, 10 und 13 nicht restriktiv einer der beiden Gruppen zuordnen.47 Die
Interleukine 6 und 8, die auch von Bedeutung für diese Arbeit sind, weisen eher
proinflammatorische Eigenschaften auf.
Mehrere Studien zeigen, dass sich das Zytokingleichgewicht in einer erfolgreichen
Schwangerschaft von TH1- hin zu TH2-Zytokinen verschiebt. Ein Ungleichgewicht
zugunsten der TH1-Zytokine ist häufig mit Aborten assoziiert, ein Überwiegen der
TH2-Zytokine fördert das Überleben des Fetus.
36 37 38 39 40 41 42 200
Das TH2-Profil soll
den Fetus vor Angriffen des mütterlichen Immunsystems schützen, da die TH1Zytokine die Plazenta direkt bzw. indirekt mittels Aktivierung der zellvermittelten
Immunantwort
schädigen
können
und
die
TH2-Zellen
eine
eher
nicht-
inflammatorische Immunantwort induzieren.39 Dieses Paradigma wird in den letzten
Jahren jedoch zunehmend kontrovers diskutiert.45-47
Hier kommen auch die DC ins Spiel. Je nachdem, welche Zytokine sie bilden,
können sie den Weg für inflammatorische oder eben tolerogene Mechanismen
ebnen.
27
1.9
Ziel der Arbeit
Auf Grund der bekannten Expression der Hüllproteine von HERV-K in der Plazenta
soll in dieser Arbeit der Effekt dieser Peptide auf die Zytokinproduktion von
dendritischen Zellen als entscheidender Schrittmacher einer tolerogenen vs.
inflammatorischen Immunreaktion untersucht werden. Es gilt die Hypothese zu
beweisen, dass gerade die Peptide von den HERV in der Lage sind, exakt an der
Grenzzone zwischen Mutter und Fetus eine lokale Immunsuppression bzw. ein TH2Zytokinprofil zu bewirken und somit das Überleben des Fetus zu begünstigen. Ein
wichtiger Aspekt in diesem Prozess ist die Herstellung eines adäquaten Mikromilieus,
das den Schutz gegenüber Infektion bieten kann und gleichzeitig Zellwachstum
fördern und schädliche inflammatorische Immunreaktionen verhindern kann. HERV-K
könnte durch Hemmung der NK-vermittelten Lyse und/oder Modulierung der
Zytokinsekretion dezidualer Zellen wichtig für die Entwicklung des Fetus sein.60 Die
Zytokine können Einfluss auf die maternalen Immunzellen, aber auch auf das
Wachstum
und
die
Differenzierung
der
Trophoblastenzellen
und
den
Implantationsvorgang nehmen. Die Integration der HERV in das Genom der
Primaten könnte somit einen Beitrag zur menschlichen Evolution geliefert haben.
28
2
2.1
Material und Methoden
Material
Alle Prozentangaben zu Lösungen verstehen sich für Feststoffe als Gewichtsprozent
(w/v), für Flüssigkeiten als Volumenprozent (v/v).
2.1.1 Geräte
Zellkulturausstattung
Sterilwerkbank SterilGARD® Class II TypA/B3, The Baker Company
Brutschrank - Inkubator NAPCO 5420-1R, Labotect
Lichtmikroskop Leica DM IRB
Zentrifugen
EBA 12, Hettich
Universal 16R, Hettich
Waagen
Kern 510-33
Scaltec SAC 51
Ohaus LS 5000
Sonstige Geräte
ELUTRA®-Zellseparationssystem, Gambro BCT
FACScan, Becton Dickinson
Heizblock Techne Dri-Block® DB2A
Magnetrührer Variomag®
Vortex MS1 Minishaker IKA®
Rotationsschüttler
Vakuumpumpe, Bender MedSystems®
Software
FlowCytomix Pro 2.2 Software, Bender MedSystems®
Microsoft Office 2010 (Exel, PowerPoint, Word)
29
Staroffice 8
WinMDI, Joseph Trotter, The Scripps Research Institute
GraphPadPrism, Version 4.03, GraphPad Software, Inc.
BioDraw Ultra 12.0, Cambridge Software
2.1.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterial
geordnet nach Herstellern
Verbrauchsmaterial
Elutra®
Beutel
für
Medium
für
Elutra®-
Zellseparationssystem
Elutra®
3 Durchstichdeckel für Mediumflaschen
American National Can™
Parafilm “M”
Brand
Reaktionsgefäße , Zentrifugenröhrchen (Blue Caps)
1,5 ml, 15ml und 50ml
Braun
Original Perfusorspritze OPS 50ml
Eppendorf
Combitips, Pipettenspitzen, Plastikküvetten
Greiner
Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße,
Zentrifugenröhrchen Kryoröhrchen, Petrischalen
Cellstar®
Hartmann
Pehazell® Zellstoff
TPP
Petrischalen für Zellkultur 100*20mm
96-well Zellkulturplatten
Bender MedSystems®
FlowCytomix
Human
Th1/Th2
11plex
Kit
BMS810FF
96-well-Platten
Chemikalien
Biochrom
PBS Dulbecco, Alsever Solution, Zellkulturmedium
RPMI1640, Gentamycinsulfat,
Penicillin/Streptomycin
Boehringer Mannheim
Neuraminidase
30
CAI Biochem
Prostaglandin E2
Centeon
Beriglobulin
Endogen
Streptavidin-konjungierte Meerrettichperoxidase
(HRP)
PAN
fetales Kälberserum (FBS bzw. FCS)
Sandoz
GM-CSF (Leukomax400®)
Sigma
EDTA, Trypanblau-Lösung 0,4%, Rinderalbumin,
DMSO
Strathmann
Zellkulturzusätze IL-4, IL-6, IL-1β, TNF-α
Puffer und Lösungen
Soweit nicht anders angegeben, wurde destilliertes Wasser als Lösungsmittel
verwendet.
Medien
Grundmedium R10
RPMI-1640
mit
10%
FCS
und
Gentamycin
(50µg/ml)
Differenzierungsmedium
R10 mit GM-CSF (10 µl/ml) und IL-4 (1,6 µl/ml)
Reifungsmedium
R10 mit GM-CSF (10 µl/ml) und IL-4 (1,6 µl/ml) und
Reifungscocktail aus IL-1β, IL-6, TNF-α und
PGE2
Medienzusätze (Stammlösungen)
Pen/Strep
10000 E/ml Penicillin + 10000ml/ml Streptomycin
Gentamycin
10 mg/ml Gentamycinsulfat
GM-CSF
100 U/μl in R10 mit 0,1% BSA
IL-4
500 U/μl in PBS mit 0,1% BSA
IL-1β
1000 U/μl in R10
IL-6
1000 U/μl in R10
TNF-α
1000 U/μl in R10
PGE2
10-8 mol/ml in R10
Reifungscocktail
IL-1β (10000 U/ml), IL-6 (10000 U/ml), TNF-α
(10000 U/ml), PGE2 (10-8 mol/ml) in R10
31
Lösungen zur Zellisolierung
PBS
phosphatgepufferte Salzlösung (engl.
„phosphate buffered saline) in H2O
PBS mit Pen/Strep
PBS mit Pen/Strep (1:200)
PBS / Citrat
1 Volumenteil 0,106 M NaCitrat-Lösung mit 9 Teilen
PBS
PBS / EDTA
PBS mit 2 mM EDTA
PBS mit Neuraminidase
0,01 U/ml
RPMI farblos (PAA)
Hydrogencarbonat, Glukose, Salzen, Aminosäuren,
Vitaminen
2.1.3 Zellen
PBMC bzw. Elutra-Zellen: Monozyten isoliert aus Buffycoats von Blutspendern des
Blutspendedienstes
des
BRK,
Institut
Wiesentheid
und
der
Abteilung
für
Transfusionsmedizin des Universitätsklinikums Würzburg. Die Buffycoats wurden ca.
24 Stunden nach der Spende verabeitet.
2.1.4 HERV-Peptide/Proteine
Die HERV-Peptide TM05.04, TM13.12, K120 und K117 wurden freundlicher Weise
von Prof. Joachim Denner, Zentrum für HIV und Retrovirologie, Robert Koch-Institut
Berlin, bereitgestellt.
2.1.5 FlowCytomix Human Th1/Th2 11plex Kit BMS810FF
Kit zur Zytokinbestimmung von Bender MedSystems®
Inhalt pro Kit:
1 Röhrchen Setup Beads
11 Röhrchen fluoreszendierende Beads (mit Antikörpern)
22 Röhrchen Standard-Bead-Mischungen
11 Röhrchen Biotin-Konjugat-Mischung mit (Antikörpern)
1 Flasche Pufferlösung (PBS mit 10% BSA)
1 Flasche Reagent Dilution Buffer (RDB)
32
1 Röhrchen Streptavidin Phycoerythrin
196-well Filterplatte
6 Adhäsivfolien
2.2
Methoden
2.2.1 Isolierung von Monozyten für DC aus peripherem Blut
Aus dem peripheren Blut gesunder, freiwilliger Spender wurden mononukleäre Zellen
(PBMCs: Peripheral blood mononuclear cells) isoliert. Nach dem sterilen Öffnen der
von der Transfusionsmedizin erhaltenen Buffycoats wurde das Blut mit PBS/Citrat
verdünnt und je 30ml auf 15ml Lymphozytenseparationsmedium in zwei 50ml
Röhrchen vorsichtig aufgetragen. Anschließend wurde das Gemisch bei 400xg 30
Minuten ohne Bremse bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Durch die Zentrifugation ergaben sich drei Phasen. Der Überstand wurde bis kurz vor
der weißen Bande abgenommen und verworfen. Danach wurde die PBMC-Bande
akkurat abgenommen und die beiden Proben je Spender zusammen mit PBS/Citrat
gewaschen und bei 250xg mit Bremse zentrifugiert.
Schließlich wurden die Zellen in der Zählkammer gezählt und je 100 Millionen Zellen
in 10ml Medium (AIM-V) in einer Zellkulturschale (20cm) angesetzt und eine Stunde
im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 zur Adhärenz belassen. Nun wurden die nicht
adhärenten Zellen abgenommen und verworfen, die adhärenten Zellen (Monozyten)
wurden mit PBS/EDTA zweimal gründlich gewaschen, um restliche nicht adhärente
Zellen zu entfernen, und anschließend im Zytokinmedium kultiviert (s.2.2.3). Die
Gewinnung dendritischer Zellen aus peripherem Blut erfolgte weitgehend nach dem
Protokoll von Romani et al..201 202
Die DC, die durch Dichtegradientenzentrifugation gewonnen wurden, wurden für
Vorversuche zur Bestimmung der Notwendigkeit von Verdünnungen und der HERVKonzentrationen
genutzt,
die
Standardprozedur
der
Zellisolierung
für
die
Datenerfassung stellte die Elutra-Zellseperationsmethode dar.
2.2.2 Gewinnung der Elutra-Zellen
Aus dem peripheren Blut freiwilliger, gesunder Spender wurden mononukleäre Zellen
33
(PBMCs) mit Hilfe einer Leukapharese (Institut für Transfusionsmedizin) isoliert. Die
Anreicherung der Monozyten aus dem Leukapherisat erfolgte durch differenzielle
Zentrifugation mit Hilfe des ELUTRA®-Gerätes. Dabei werden die Zellen im
Gegenstrom aufgrund ihrer Größe separiert. In einer trichterförmigen Trennkammer,
die sich vom Zentrum der Zentrifugation aus verschmälert, kommt es infolge der
Zentrifugalkraft und der Veränderung der Fließgeschwindigkeit des Mediums, das
der Zentrifugalkraft entgegengesetzt fließt, zu einer Trennung der suspendierten
Zellen in der Trennkammer des Rotors, wobei sich größere Teilchen und solche mit
höherer Dichte näher an der Zentrifuge sammeln. Es wurden fünf verschiedene
Zellfraktionen hergestellt. Für die hier beschriebenen Versuche wurde die ELUTRAFraktion 5, welche die Monozytenfraktion enthält, eingesetzt. Die gewonnenen Zellen
wurden bis zur weiteren Verwendung in Portionen à 100 Mio. Zellen kryokonserviert.
Abb. 10: Elutra-Methode
(Abbildung
modifiziert
nach
der
Beschreibung
des
Testprinzips,
http://www.caridianbct.com/location/emea/products-and-services/Pages/elutra-cell-separationsystem.aspx, Nov. 2011)
34
Abb. 11: Die gewonnenen Fraktionen. In Röhrchen 5 befinden sich die gewünschten Zellen.
+
Abb.12: Nachweis der Reinheit der gewonnen Zellen: Fraktion 5: CD14 /HLA-DR
+
2.2.3 Kultur der Elutra-Zellen
Nach dem Auftauen der kryokonservierten im Elutra-Verfahren gewonnenen
Monozyten (100 Millionen) wurden die Proben der einzelnen Patienten in 50ml PBS
überführt und in der Zentrifuge bei 280xg für 10 Minuten gewaschen. In der
Zwischenzeit wurde das Medium für die Zellkultur vorbereitet. 60ml R10 wurden mit
18μl GM-CSF (Konzentration 0,3μl/ml) und 150μl IL-4 (Konzentration 2,5μl/ml)
vermischt. Im Anschluss daran wurden die Zellen nach Abgießen des Überstandes
pro Patient mit je 30ml des Mediums versetzt und jeweils auf drei Zellkulturplatten
35
(Durchmesser: 10cm) gleichmäßig verteilt. Die Platten wurden für 72 Stunden bei
37°C und 5% CO2 im Brutschrank belassen.
Elutra 6.8. nach 72h Inkubation, Vergrößerung 40x0.55
Elutra 8.11. nach 72h Inkubation, Vergrößerung 100x0,55
Abb. 13: Mikroskopische Kontrolle der Zellen: 2 exemplarische Beispiele
2.2.4 Zellzahlbestimmung
Die genaue Bestimmung der Zellzahl in einer Suspension war für den Ansatz von
definierten Zellkonzentrationen nötig. Dazu wurde eine bestimmte Menge einer
Zellsuspension
Lichtmikroskops
in
eine
wurden
Neubauer-Zählkammer
die
Zellen
je
gegeben.
Großquadrat
Mit
Hilfe
eines
ausgezählt.
Unter
Berücksichtigung des Kammerfaktors wurde die absolute Zellzahl pro ml Suspension
wie folgt berechnet:
2.2.5 Herstellung des Zellmediums und Verteilung der Zellen in einer
96-Mikrotiterplatte (reife und unreife DC)
Nach 72 Stunden wurden die Zellen aus dem Überstand abgeerntet und bei 280
Umdrehungen für zehn Minuten zentrifugiert. Nach dem Zählen der Zellen wurden
36
die Zellen mit R10 so verdünnt, dass sich 100.000 Zellen in 80μl Lösung befanden.
Von dieser Lösung wurden pro Probe (bezogen auf einen Reifezustand der DC eines
Patienten und ein Peptid) im Anschluss je 80μl in fünf Vertiefungen einer 96Mikrotiterplatte pipettiert, wovon drei Vertiefungen jeweils für die verschiedenen
Konzentrationen des Virusmaterials und zwei Vertiefungen für die Negativprobe ohne
Virusagens bestimmt waren. Daraufhin wurde das Medium für die Zellen angesetzt
(100μl pro Vertiefung). Dazu wurden zu R10 IL-4 und GM-CSF in einer Menge
dazugegeben, so dass sich am Ende eine Konzentration von 2,5μl/ml für IL-4 und
0,3μl/ml für GM-CSF je Probe ergab. Zur Hälfte des angesetzten Mediums wurde ein
Cocktail (in der Konzentration 1:20), der aus IL-1β, IL-6, TNF-α und PGE2 bestand
und zur Stimulierung der Reifung der dendritischen Zellen diente, gegeben. Dieses
Vorgehen liefert Zellen in großer Reinheit und ähnlichem Reifestatus. 203 Von der
hergestellten Lösung wurden je 100μl in die mit den Zellen versetzten und
beschrifteten Vertiefungen (reif/unreif) gegeben.
Rot: Iso
Schwarz: HLA-DR
Grün: CD1a
Lila: CD25
Dunkelblau: CD14
Gelb: CD 83
Hellblau: CD40
Braun: CD86
Unreife DC
Reife DC
Abb. 14: Darstellung der Oberflächenmarker der unreifen und reifen DC
37
2.2.6 Beschreibung der HERV-Peptide
Die HERV-Peptide TM05.04, TM13.12, K120 und K117, die auf der Oberfläche von
humanen villösen Zytotrophoblastenzellen und extravillösen Zytotrophoblastenzellen
exprimiert werden, wurden freundlicher Weise von Prof. Joachim Denner, Zentrum
für HIV und Retrovirologie, Robert Koch-Institut Berlin, in aufgereinigter From
bereitgestellt. Die Sequenzen der rekombinanten transmembranen Peptide TM05.04
und TM13.12 entsprechen einem großen Teil der Ektodomäne des HERV-KHüllprotein (PubMed Accnr. Q69384; AS 488-586). NH2-terminal befindet sich ein
Maltose-bindendes
Protein.204
(IDQKLANQINDLRQTVIWMGRL)
Die
und
K177
Sequenzen
von
K120
(IDQKLANQINDLRQTVIWMGRL)
entsprechen einem Teil des Hüllproteins (AS 518-537).
HERV-K env
FIFTLIAVIMGLIAVTATAAVAGVALHSSVQSVNFVNDWQKNSTRLWNSQSSIDQKLA
NQINDLRQTVIWMGDRLMSLEHRFQLQCDWNTSDFCITPQIYNESEHHWDMVRRH
LQGREDNLTLDISKLKEQIFEASKAHLNLVPGTEAIAGVADGLANLNPVTWVKTIGST
TIINLILILVCLFCLLLVCRCTQQLRRDSDHRERAMMTMAVLSKRKGGNVGKSKRDQI
VTVSV
Abb. 15: Sequenz der Ektodomäne des Hüllproteins von HERV-K (AS465-699)
Sequenz der rekombinanten TM-Proteine TM05.04 und TM13.12 in schwarzen Buchstaben,
Sequenzanteil der Peptide K120 und K177 in schwarzen fett-kursiven Buchstaben.
(Abbildung modifiziert nach PubMed Accno. Q69384)
2.2.7 Verdünnungsreihen von HERV-K
Es lagen vier Peptide des HERV-K vor. Die dendritischen Zellen (reif und unreif) der
Patienten wurden jeweils mit drei verschiedenen Konzentrationen der viralen Peptide
versetzt, um den Effekt auf die Zytokinproduktion zu testen. Die Verdünnungsreihen
wurden unter Zugabe von PBS angefertigt, von der Ausgangskonzentration wurde
jeweils im Verhältnis 1:10 und 1:100 gemischt. In die entsprechenden Vertiefungen
der Mikrotiterplatte wurden jeweils 20μl gegeben, so dass sich pro zu untersuchende
Probe ein Endvolumen von 200μl ergab. Pro Patient wurden als Negativprobe zwei
Vertiefungen nur mit PBS aufgefüllt ohne Zugabe von Virusmaterial.
38
Für TM05.04 bestand für die höchste Konzentration eine Endkonzentration bei einem
Endvolumen von 200μl in den Proben von 5μg/ml, für die mittlere von 0,5μg/ml und
für die niedrigste 0,05μg/ml. Für TM13.12 wurde eine Verdünnungsreihe mit 1μg/ml,
0,1μg/ml und 0,01μg/ml, für K120 und K177 entsprechend jeweils 25μg/ml, 2,5μg/ml
und 0,25μg/ml angefertigt.
Die Platten wurden für 48 Stunden bei 37°C und 5%CO2 im Brutschrank belassen.
Elutra 8.11. mDC/PBS
Elutra 8.11. mDC/K120-C3
Elutra 8.11. mDC/K120-C2
Elutra 8.11. mDC/K120-C1
Elutra 8.11. mDC/K177-C3
Elutra 8.11. mDC/K177-C2
Elutra 8.11. mDC/K177-C1
Elutra 8.11. iDC/PBS
39
Elutra 8.11. iDC/K120-C3
Elutra 8.11. iDC/K120-C2
Elutra 8.11. iDC/K120-C1
Elutra 8.11. iDC/K177-C3
Elutra 8.11. iDC/K177-C2
Elutra 8.11. iDC/K177-C1
Abb. 16: Mikroskopische Kontrolle der Zellen: Exemplarische Beispiele
2.2.8 Ernte und Aufbewahrung der Zellen
Nach 48 Stunden wurden die einzelnen Proben aus der Mikrotiterplatte jeweils in ein
Eppendorf-Gefäß überführt und bei 400xg für acht Minuten zentrifugiert. Daraufhin
wurde der Überstand sorgfältig und komplett abgenommen und in ein weiteres
Eppendorf-Gefäß gegeben. Davon wurden wiederum 50μl in ein drittes EppendorfGefäß portioniert. Das Eppendorf-Gefäß mit den Zellen wurde noch einmal kurz
anzentrifugiert, dann der Rest des Überstands abgenommen und verworfen. Alle
Eppendorf-Gefäße (pro Probe: ein Eppendorf-Gefäß mit Zellen und zwei EppendorfGefäße mit Überständen) wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur
weiteren Verarbeitung bei -80° C gelagert.
2.2.9 Cytometric Bead Assay
Zur Bestimmung der Zytokinmenge, die von den reifen bzw. unreifen dendritischen
Zellen produziert wurden, wurde der Test „FlowCytomix Human Th1/Th2 11plex Kit
BMS810FF“ von Bender MedSystems® verwendet und streng nach dem in der
Anleitung beschriebenen Protokoll vorgegangen. Auf Grund der Genauigkeit und
Nachweisgrenze des Testes und der Konzentration der produzierten Zytokine
40
wurden in der vorliegenden Arbeit folgende Zytokine ausgewertet: Interleukine 1β, 2,
4, 6, 8, 10, TNF-α. Im Folgenden gelten die Mengenangaben immer für eine 96Mikrotiterplatte,
also
96
Patientenproben
unter
Verwendung
aller
sieben
untersuchten Zytokine. Bei der Messung von weniger Proben, bzw. bei einer
geringeren Anzahl untersuchter Zytokine wurden die erforderlichen Mengen jeweils
umgerechnet. Z.B. mussten die Messungen der Interleukine 8, 6 und 4 bei den
unreifen dendritischen Zellen aufgrund der hohen Produktion in einer verdünnten
Zellsuspension (1:75) stattfinden.
Der Test beruht auf einer „Bead“-basierten quantitativen Analyse der besagten
Zytokine im Durchflusszytometer. Die „Beads“ sind mit Antikörpern komplexiert, die
spezifisch mit den zu messenden Zytokinen im Ansatz reagieren. Sie unterscheiden
sich untereinander in der Größe und im Spektralumfang. Als Referenzgröße wird
eine Standardreihe jedes einzelnen Zytokins in bekannter Konzentration erstellt. Die
Zytokine binden an die Antikörper, die mit den „Beads“ verbunden sind. Im nächsten
Schritt bindet ein mit Biotin-komplexierter zweiter spezifischer Antikörper an das
Zytokin-„Bead“-Molekül. Zum Schluss wird Streptavidin-Phycoerythrin zugegeben,
das an das Biotin-Konjugat bindet und fluoreszierende Signale emittiert. Nach der
Einstellung des Zytometers können die Proben analysiert werden und die
Konzentrationen der gemessenen Zytokine anhand der Standardkurven mit der
FlowCytomix Pro 2.2 - Software berechnet werden.
Eine Bestimmung der Zytokinkonzentration ist nur möglich, wenn die fluoreszierende
Intensität der Suspension signifikant höher als die des Lösungsmittels ist (+ 2
Standardabweichungen).
Zytokin Sensitivität (pg/ml)
TNF-α
3,2
IL-1β
4,2
IL-2
16,4
IL-8
0,5
IL-6
1,2
IL-4
20,8
IL-10
1,9
Tab. 3: Sensitivität
(modifiziert nach dem Protokoll des Testes)
41
Abb. 17: Prinzip des Cytometric Bead Assays
(modifiziert nach dem Protokoll des Testes)
2.2.9.1 Standardreihen
Zunächst wurde ein Testpuffer, der als Lösungsmittel verwendet wurde, angesetzt.
Dazu wurden 50ml des gut gemischten „Assay-Buffers“ mit 450ml destilliertem
Wasser versetzt und ohne Blasenbildung gut vermischt. Für die Standardreihe, die
zur Eichung des Tests nötig war, wurden zunächst neun Eppendorf-Gefäße
vorbeschriftet („S1-S7“, „Setup“, „Blank“). In die Eppendorf-Gefäße S2-S7 wurden je
100μl Testpuffer pipettiert. Dann wurden die für den jeweiligen Testtag benötigten im
Kit vorhandenen Standardsubstanzen anzentrifugiert und je nach Anleitung mit
destilliertem Wasser (die jeweilige Menge ist auf dem Röhrchen, in dem sich das
Zytokin befindet vermerkt) versetzt. Die nun erhaltenen Stocklösungen wurden auf
dem Vortexer geschüttelt und für zehn Minuten stehen gelassen und danach noch
einmal kurz zentrifugiert. Nun wurden je 10μl der gewünschten StandardStocklösungen in das mit S1 beschriftete Eppendorf-Gefäß gegeben und dann mit
destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 200μl gebracht, d.h. bei sieben zu
messenden Zytokinen wurden 130μl Aqua dest. verwendet. Nach kurzer Zeit auf
dem Vortexer wurden 50μl aus S1 in S2, wo sich schon 100μl Puffer befanden,
übertragen. Nach erneutem Vortexen wurden 50μl aus S2 in S3 pipettiert. Dieser
Vorgang wurde bis zum 7. Eppendorf-Gefäß wiederholt.
42
2.2.9.2 Ansatz der Bead-Mischung
Da pro Probe 25μl von der „Bead“-Mischung benötigt wurden, wurden für eine 96Mikrotiter-Platte vereinfachend 2500μl veranschlagt. Zur Vorbereitung wurden alle
benötigten „Bead“-Stocklösungen der zu messenden Zytokine mindestens fünf
Sekunden lang gevortext. Es wurden jeweils 1/20 des benötigten Endvolumens von
den jeweiligen Stocklösungen gebraucht und die entsprechende Menge in ein
beschriftetes Eppendorf-Gefäß pipettiert. Am Ende wurde der „Reagent Dilution
Buffer“ auf das erforderliche Endvolumen von z.B. 2500μl bei 96 Proben aufpipettiert.
Nach der Zentrifugation (fünf Minuten bei 3000xg) wurde der Überstand sorgfältig
abgezogen, wobei 50μl belassen werden sollten, um eine Resuspension zu
vermeiden. Im Anschluss wurde die gleiche Menge an „Reagent Dilution Buffer“
wieder dazugegeben und die Suspension für fünf Sekunden auf dem Vortexer
gemischt.
2.2.9.3 Ansatz der Biotin-Konjugat-Mischung
Für eine Patientenprobe waren 50μl der Biotin-Konjugat-Mischung nötig, so dass für
96 Proben von einem Volumen von 4900μl ausgegangen wurde. Zur Herstellung
wurden zunächst die Biotin-Stocklösungen der benötigten Zytokine aus dem Kit gut
gevortext und dann je Konjugat wiederum 1/20 des berechneten Endvolumen (bei
4900μl 245μl) entnommen und in einem Eppendorf-Gefäß zusammen mit 3185μl
„Reagent Dilution Buffer“ vermischt.
2.2.9.4 Ansatz der Platte
Für die weiteren Vorgänge wurde eine spezielle 96-well Filterplatte aus dem Kit, die
einen absaugbaren Membran-Boden hatte, und eine Pumpvorrichtung verwendet,
um die Platte unter Vakuumfiltration von unten absaugen zu können. Zur
Vorbereitung wurden zunächst 50μl der Pufferlösung in die einzelnen Vertiefungen
gegeben und diese einmal abgesaugt. Daraufhin wurden die aufgetauten
Patientenproben aus den oben beschriebenen „Überstand-Eppendorf-Gefäßen“
hochtourig zentrifugiert und dann jeweils 25μl aus den Überständen in die
vorgesehenen Vertiefungen gegeben. Die Standardreihe wurde zur besseren
43
Sicherheit doppelt angelegt (je 25μl der Standard-Mischung S1-S7) und als
Negativprobe wurde eine Vertiefung nur mit 25μl Pufferlösung versetzt. Zusätzlich
wurde eine Vertiefung wiederum mit 25μl aus S1 befüllt, um später Material für die
Einstellung am FACS-Gerät zu haben. Anschließend wurde in alle Vertiefungen 25μl
der gut gemischten Beads-Suspension und 50μl der Konjugat-Mischung pipettiert.
Jede Probe wurde durch Auf- und Abpipettierung jeweils gut durchmischt. Im
Anschluss wurde die ganze Platte mit einer transparenten Klebefolie bedeckt, mit
Alufolie blickdicht verpackt und für zwei Stunden auf dem Mikroplatten-Schüttler
(500rpm) zur Inkubation belassen.
In der Zwischenzeit wurde im abgedunkelten Umfeld 169μl der Streptavidin-PELösung mit 5111μl Pufferlösung versetzt.
Nach zwei Stunden wurde die Platte zweimal mit je 100μl Pufferlösung pro
Vertiefung durch Vakuumfiltration gewaschen. Danach wurden je 100μl Pufferlösung
und 50μl Strepatividin-PE-Lösung zu den Proben gegeben und die Platte wiederum
mit Klebefolie und Alufolie (zum Abdunkeln) versehen für eine Stunde bei
Raumtemperatur auf dem Schüttler belassen. Danach wurden die Proben erneut
zweimalig gewaschen und am Ende mit je 200μl Pufferlösung versehen. Gut
gemischt wurden die Proben in FACS-Röhrchen überführt. Im Anschluss wurden die
Proben
auf
Eis
im
Dunkeln
gelagert
und
innerhalb
von
24
Stunden
durchflußzytometrisch analysiert.
2.2.10 Durchflusszytometrie
Zur richtigen Einstellung des FACS-Gerätes wurde die Mischung mit den höchsten
Zytokinwerten verwendet (S1), um dann mit Hilfe der S1-S7 die Standardreihe zu
erstellen. Nach der Einlesung aller Proben wurde mit Hilfe des Computerprogramms
des Kits (FlowCytomix Pro 2.2 Software, Bender MedSystems®) anhand der
Standardreihe die Zytokinwerte der einzelnen Patientenproben ermittelt und
ausgewertet.
44
Abb. 18: Einstellung am FACS-Gerät, Erscheinungsbild der einzelnen Zytokine
(Abbildung entnommen aus dem Protokoll des Testes)
2.2.11 Auswertung
Die Daten der sechs Patienten wurden mit Hilfe von StarOffice 8 Calc bzw. Microsoft
Exel 2010 gelistet, sortiert und berechnet. Die statistische Auswertung der Daten und
die grafische Darstellung der Ergebnisse erfolgte mit Hilfe von GraphPadPrism und
Microsoft PowerPoint 2010. Die Auswertung erfolgte mit den zur Negativprobe
(Ansatz mit PBS) des jeweiligen Patienten ins prozentuale Verhältnis gesetzten
Werten. Es wurde der für unabhängige Stichproben geeignete nonparametrische
One-way-Anova-Kruskal Wallis-Test und der nonparametrische Mann-Whitney-UTest verwendet. Werte mit p<0,05 wurden als statistisch signifikant, Werte mit p<0,01
als hochsignifikant betrachtet.
45
3
Ergebnisse
Die jeweiligen Zytokinkonzentrationen in den Überständen der Zellkulturen
(Stichprobengröße n=6) von unreifen und reifen DC, die nach Zugabe der vier
unterschiedlichen
HERV-Peptide
gebildet
wurden,
wurden
mit
Hilfe
des
„FlowCytomix Human Th1/Th2 11plex Kit BMS810FF“ von Bender MedSystems®
bestimmt. Es wurden folgende Zytokine analysiert: TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-8, IL-6, IL-4,
IL-10.
Tumornekrosefaktor α
3.1
In Vorversuchen ergaben sich für TNF-α bei den reifen DC Werte, die über den
Sensitivitätsbereich des Testes hinausgingen. Daher wurden die Proben für die
Messung im Verhältnis 1:100 verdünnt.
Bei den reifen DC ergab sich durch Zugabe des HERV-Peptids K120 in drei
verschiedenen Konzentrationen eine hochsignifikante Änderung der Produktion von
TNF-α (p=0,003). Im Gegensatz zu den Proben, die nur mit PBS versetzt wurden,
produzierten die DC bei allen untersuchten Patienten unter dem Einfluss von K120 in
der höchsten Konzentration (C1) durchschnittlich nur ca. 40% der Menge an TNF-α
(p=0,002). In der mittleren Konzentration wurde die TNF-α-Produktion bei über 80%
der Patienten auf durchschnittlich 84% gedrosselt. Auch der Unterschied zwischen
der produzierten Zytokinmenge in den Ansätzen mit der höchsten Konzentration (C1)
an K120 und der mittleren Konzentration (C2) bzw. niedrigsten Konzentration (C3)
war signifikant bzw. hochsignifikant (p=0,015 bzw. p=0,002) Dies beweist eine von
der Konzentration des K120 abhängige Reduktion der TNFα-Produktion durch die
reifen DC.
mDC K120 TNFa
200
% TNFa zur Kontrolle
180
160
140
120
C1
C2
C3
100
80
60
40
20
0
1
2
3
4
5
6
Patient
Abb. 19: Auswirkung von K120 auf die TNF-α-Sekretion reifer DC
46
Auch für K177 ergaben sich ähnliche Beobachtungen. Es fand sich über das ganze
Experiment gesehen eine signifikante Änderung (p=0,031). Zudem ergab sich eine
von der Konzentration abhängige hoch- bzw. signifikante Reduktion der produzierten
TNF-α-Menge (PBS vs. C1: p=0,002; C1 vs. C2: p=0,041; C1 vs. C3: p=0,041). In
der höchsten Konzentration des Peptids ergab sich wie bei K120 eine
durchschnittliche Reduktion der TNF-α-Menge auf 40%. Hingegen wurden unter der
Zugabe von TM5.4 und TM13 keine signifikanten Änderungen der TNF-α-Produktion
durch die reifen DC gemessen. Lediglich in der mittleren Konzentration von TM13
zeigte sich eine Tendenz zur Verringerung der TNF-α-Produktion.
Bei den unreifen DC zeigt sich unter dem Einfluss der vier untersuchten HERVPeptide jeweils in der höchsten Konzentration eine Tendenz zu einer vermehrten
Sekretion von TNF-α. K120 bewirkte in höchster Konzentration bei vier der sechs
Patienten eine Steigerung der TNF-α-Produktion auf mehr als 200%. In mittlerer
Konzentration kam es jedoch in 67% der Fälle zu einer Reduktion. Auch in vier
Überständen der mit K177 versetzen Proben (C1) wurde eine Steigerung auf über
400% gemessen. Bei TM13 in höchster Konzentration wurde in fünf der sechs
Proben eine Steigerung der TNF-α-Produktion gemessen (auf über 200%).
47
Abb. 20: Auswirkung von HERV-K auf TNF-α
48
3.2
Interleukin 1β
In Vorversuchen ergaben sich für IL-1β bei den reifen DC Werte, die über den
Sensitivitätsbereich des Testes hinausgingen. Daher wurden die Proben für die
Messung verdünnt (1:100).
Bei den reifen DC konnten keine signifikanten Veränderungen durch die HERV-KPeptide gemessen werden. Jedoch kam es durch K120 bzw. TM13 jeweils in der
höchsten Konzentration bei fünf der sechs Patienten zu einer Steigerung der
Zytokinproduktion (Durchschnittswert bei K120: 128%, bei TM13: 120%). Unter dem
Einfluss von K177 bzw. TM5.4 jeweils in höchster Konzentration wurde bei vier der
sechs Patienten eine erhöhte Menge des IL-1β gemessen (Durchschnittswert bei
K177: 144%, bei TM5.4: 116%).
Bei den unreifen DC kam es zu pleiotropen Veränderungen der Zytokinproduktion.
Lediglich in der geringsten Konzentration der vier Peptide konnte man tendenziell
eine Suppression der IL-1β-Menge feststellen, die für TM13 sogar hochsignifikant
war (PBS vs. C3: p=0,002).
49
Abb. 21: Auswirkung von HERV-K auf IL-1β
50
3.3
Interleukin 2
Die Messergebnisse lagen mehrheitlich außerhalb des Sensitivitätsbereichs des
Testes, so dass hier leider keine aussagekräftige Auswertung erfolgen konnte.
3.4
Interleukin 8
In Vorversuchen ergaben sich für IL-8 Werte, die über den Sensitivitätsbereich des
Testes hinausgingen. Daher wurden die Proben für die Messung verdünnt (reife DC:
1:100; unreife DC 1:75).
Bei den reifen DC kam es unter Einfluss von K120 bzw. K177 in der höchsten
Konzentration zu einer Reduktion der IL-8-Produktion (durchschnittlich auf 82% bzw.
87%) in über 80% der Fälle. TM5.4 bewirkte in höchster Konzentration in allen Fällen
eine geringere Menge an IL-8 auf durchschnittlich 91% (p=0,004). Bei TM13 kam es
in der höchsten Konzentration jedoch in 50% der Proben zu einer Stimulation, in 50%
zu einer Suppression der Zytokinproduktion.
Im Gegensatz dazu produzierten die unreifen DC unter Einfluss der HERV-Peptide
vermehrt IL-8. K120 bewirkte in höchster Konzentration eine Stimulation der IL-8Produktion auf mindestens 140% (p=0,002). Auch in mittlerer Konzentration kam es
bei fünf der sechs Patienten zu einer gesteigerten IL-8-Konzentration. Insgesamt
wurde ein konzentrationsabhängiger Einfluss auf die Zytokinproduktion beobachtet.
In den Ansätzen mit K177 in höchster Konzentration wurde bei allen Proben ein
Anstieg der IL-8-Konzentration gemessen. Bei fünf der sechs Proben kam es zu
einem der Anstieg auf mehr als 350%, bei einer Probe wurde ein nur geringer
Anstieg auf 102% beobachtet (PBS vs. C1: p=0,002). Hier zeichnete sich ebenfalls
ein konzentrationsabhängiger Effekt ab (C1 vs. C2: p=0,041; C1 vs. C3: p=0,004).
Das gleiche gilt für TM13. Dieses Peptid vermittelte in höchster Konzentration eine
hochsignifikante Steigerung der IL-8-Sekretion durch die unreifen DC in allen
Ansätzen auf mindestens 123% (p=0,002), der stimulatorische Effekt ließ mit
Absinken der Peptipkonzentration nach.
Eine Tendenz zur Steigerung der IL-8-Konzentration fand sich auch unter Zugabe
von TM5.4, wobei der Effekt hier nicht signifikant war.
51
Abb. 22: Auswirkung von HERV-K auf IL-8
52
3.5
Interleukin 6
In Vorversuchen ergaben sich für IL-6 Werte, die über den Sensitivitätsbereich des
Testes hinausgingen. Daher wurden die Proben für die Messung verdünnt (reife DC:
1:100; unreife DC: 1:75).
Bei keinem der vier HERV-Peptide konnte ein eindeutiger Effekt auf die IL-6Sekretion der reifen DC festgestellt werden.
Bei den unreifen DC wurde durch K120 in höchster Konzentration nur in der Hälfte
der Fälle eine Steigerung der IL-6-Produktion festgestellt. Jedoch bewirkte das
Peptid in der mittleren Konzentration bei fünf der sechs Patienten eine Steigerung
auf z.T. über 700%, dieser Effekt war in der niedrigsten Konzentration wieder
abgeschwächt (Steigerung bei vier der sechs Patienten, maximal auf 160%). K177
bewirkte bei allen Patienten in der höchsten Konzentration eine Steigerung der IL-6Konzentration (durchschnittlich auf 235%; p=0,002), in der mittleren und niedrigsten
Konzentration
kam
Interleukinsekretion
es
(C1
jedoch
vs.
C2:
tendenziell
p=0,015;
zu
C1
einer
vs.
C3:
Suppression
p=0,002).
der
Einen
hochsignifikanten Unterschied (p=0,002) bewirkte in höchster Konzentration auch
TM5.4 (Steigerung der IL-6-Konzentration im C1-Ansatz bezogen auf den PBSAnsatz auf durchschnittlich 357%). In den Ansätzen mit TM5.4 in mittlerer und
niedrigster Konzentration konnte keine eindeutige Tendenz beobachtet werden.
Analoge Beobachtungen trafen auch für das HERV-Peptid TM13 zu, das in der
höchsten Konzentration eine hochsignifikante Steigerung der Zytokinproduktion
bewirkte.
53
Abb. 23: Auswirkung von HERV-K auf IL-6
54
3.6
Interleukin 4
Abb. 24: Auswirkung von HERV-K auf IL-4
55
In Vorversuchen ergaben sich für IL-4 Werte, die über den Sensitivitätsbereich des
Testes hinausgingen. Daher wurden die Proben für die Messung verdünnt (reife DC:
1:100;
unreife
DC
1:75).
Alle
vier
HERV-Peptide
wiesen
keinen
konzentrationsabhängigen, signifikanten Effekt auf die IL-4-Produktion der reifen und
unreifen DC auf.
3.7
Interleukin 10
Bei den reifen DC bewirkte K120 in höchster Konzentration in allen Fällen eine
Steigerung der IL-10-Sekretion (p=0,002). Auffällig war hierbei jedoch, dass es in
50% der Proben zu einer extremen (durchschnittlich auf 867%), in 50% zu einer nur
geringen Steigerung der Sekretion (105%) kam. Der Betrag der Steigerung
verringerte sich bei den Proben mit der besseren Stimulierbarkeit proportional zur
Konzentration
des
HERV-Peptids.
Bei
den
Patienten
mit
der
geringeren
Stimulierbarkeit kam es teilweise sogar zu einer Suppression der IL-10-Konzentration
(bezogen auf die Negativprobe). Ähnliches wurde auch bei der Zugabe von K177,
TM5.4 und TM13 beobachtet. Auch hier reagierten die reifen DC derselben drei
Patienten wie bei K120 in der höchsten Konzentration des Peptids mit einer
vermehrten Steigerung der Zytokinproduktion (auf durchschnittlich 342% (K177) bzw.
397% (TM5.4; p=0,002) bzw. 441% (TM13). Insgesamt konnte auch hier jeweils ein
konzentrationsabhängiger Effekt beobachtet werden.
Noch größere Unterschiede ergaben sich bei den unreifen DC. Wiederum bei den
gleichen drei Patienten kam es durch K120 und TM13 in jeweils höchster
Konzentration zu einer Steigerung der IL-10-Sekretion auf vierstellige Prozentwerte,
bei den anderen drei Patienten auf durchschnittlich 132% bzw.166%. (PBS vs. C1:
p=0,002). Mit der Reduktion der Peptidkonzentration sank auch die Sekretion des IL-10.
Die gleiche Tendenz zeichnete sich unter TM5.4 ab, wobei hier kein signifikanter
Unterschied berechnet wurde.
K177 bewirkte in höchster Konzentration ebenfalls eine Steigerung der IL-10Konzentration in allen Fällen (p=0,002), mit absinkender Stimulation in niedrigerer
Peptidkonzentration.
56
Abb. 25: Auswirkung von HERV-K auf IL-10
57
iDC K177 IL-10
900
400
800
% IL-10 zur Kontrolle
% IL-10 zur Kontrolle
mDC TM5.4 IL-10
450
350
300
250
C1
C2
C3
200
150
100
700
600
500
C1
C2
C3
400
300
200
100
50
0
0
1
2
3
4
5
1
6
2
3
4
5
6
Patient
Patient
Abb.: 26: Auswirkung von TM 5.4. auf die IL-10-Sekretion reifer DC bzw. von K177 auf die
IL-10-Sekretion unreifer DC
58
4
Diskussion
Ein wichtiger Schritt hin zur Aufklärung einer erfolgreichen Fortpflanzung der
Menschen ist die Identifizierung der Zellinteraktionen zwischen den verschiedenen
Zellpopulationen von Uterus und Plazenta, die durch die Produktion regulatorischer
Zytokine ein Toleranz auslösendes Gleichgewicht während der Schwangerschaft
aufrechterhalten können. Als Vermittler an vorderster Front bezüglich der fetalen
Antigene erscheinen deziduale APC, allen voran dendritische Zellen (DC), wichtige
Spieler in der fetomaternalen Anpassung während der Schwangerschaft zu sein. In
der vorliegenden
Zytotrophoblasten
nachgewiesenen
Arbeit wurde
und
in
daher der Einfluss des
invasiven
transmembranen
extravillösen
Hüllproteins
von
im
menschlichen
Trophoblastenzellen
HERV-K
auf
die
Zytokinproduktion in-vitro kultivierter humaner dendritischer Zellen untersucht.
Immunmodulierende Eigenschaften von HERV wurden bereits beschrieben, jedoch
nicht die direkte Wirkung der Transmembrandomäne von HERV-K, wie sie in der
Plazenta gefunden wurde, auf Zellen des Immunsystems. Da der Reifungszustand
der DC wichtig für ihre Reaktion und Funktion - zum einen als Vermittler einer
Abwehrreaktion, zum anderen als Wegbereiter einer tolerogenen Reaktion – ist und
DC in beiden Zustandsformen in der Plazenta nachgewiesen wurden, wurden die
Versuche mit reifen und unreifen DC durchgeführt.
Es wurde gezeigt, dass die Produktion verschiedener Zytokine durch DC durch
HERV-Peptide z.T. moduliert werden konnte. Es ergaben sich für die einzelnen
Zytokine sehr unterschiedliche Beobachtungen bzw. wurden je nach Zustand der DC
entgegengesetzte Reaktionen festgestellt.
4.1
Modelleinschränkungen
Die in der Arbeit verwendeten Zellen wurden aus Blutspendeüberresten von
gesunden Probanden isoliert. Angesichts des experimentellen Aufwands und der
hohen biologischen Variabilität wären Experimente mit einer größeren Stichprobe
wünschenswert, um konkretere Aussagen über die gefundenen Tendenzen treffen zu
können. Die Versuche mit aus dem Blut (und nicht aus der Dezidua) isolierten DC
können nur Modellcharakter haben. Durch das vorliegende Protokoll der DC-Kulturen
ergeben sich jedoch morphologisch, phänotypisch und funktionell den definierten
59
unreifen und reifen DC entsprechende Zellen, wie sie auch in der Dezidua
nachgewiesen wurden. Da Kämmerer et al. zeigten, dass deziduale APC nach
Zugabe eines Reifungscocktails, T-Zellen im gleichen Maße wie in vitro gereifte DC,
die von Monozyten abstammen, stimulieren66, können hier sicherlich vergleichende
Schlüsse gezogen werden. Somit handelt es sich um ein passendes Modell, um die
Funktionen der DC zu untersuchen. Jedoch fanden die Untersuchungen mit den
Immunzellen und den HERV-Peptiden ohne das sie normaler Weise umgebende
Milieu statt. So könnten die dezidualen DC durch andere plazentare Faktoren im
Zusammenspiel mit den HERV-Peptiden so beeinflusst werden, dass es zu einer
abweichenden Reaktion kommt. Gerade das Zusammenspiel von DC und uNK an
der fetomaternalen Grenzzone scheint wichtig für die Regulierung der lokalen
Immunität zu sein.65
205
Die Übertragung der in-vitro-Ergebnisse auf in-vivo-
Verhältnisse ist nicht leicht zu vollziehen, besonders da Zytokine oft in Kaskaden
wirken. Zur genaueren Beurteilung der Interaktion an der fetomaternalen Grenzzone
sind für weitere Untersuchungen direkt aus der Plazenta isolierte Zellen nötig, z.B.
uterine NK oder DC und deren Auswirkungen auf T-Zellen (T-Zell-Stimulationstests).
Weitere mögliche Einflussfaktoren, die hier in der vorliegenden Arbeit auf Grund der
anonymisierten Blutproben nicht beachtet werden konnten, sind Besonderheiten der
Patienten wie hormonelle Situation, Alter, Geschlecht und Aktivierungsstatus des
Immunsystems. In Vorversuchen wurde eine Konzentration und Inkubationszeit der
Peptide gewählt, bei der sich Veränderungen zeigten, jedoch wäre es denkbar, dass
evtl. noch größere Konzentrationen und eine längere Inkubationszeit einen Einfluss
auf die Produktion der Zytokine nehmen könnten. I.d.R. wiesen die verwendeten
Peptide dieselbe Wirkung auf die Zytokinproduktion auf, was aufgrund ihrer
Sequenzüberlappung zu erwarten war. Jedoch zeigten sich eher bei K120 und K177
als bei den rekombinanten Proteinen signifikante Effekte (vgl. TNF-α), was den
Beobachtungen bei Denner et al., die einen immunsuppressiven Effekt der ISUPeptide verschiedener Retroviren nur beobachteten, wenn die Peptide an ein
Trägerprotein gebunden waren, zu widersprechen scheint.206 Jedoch wurde dieser
Beobachtung schon bei der Konzeption der Versuche Rechnung getragen und die
rekombinanten Proteine in einer stärkeren Verdünnung (TM13.12 noch stärker
verdünnt als TM5.4) verwendet. Es scheint, dass die Verdünnung z.T. zu stark war,
60
so dass kein eindeutiger Effekt mehr auf die Zytokinproduktion nachgewiesen
werden konnte.
4.2
HERV und Immunsuppression
Zu beachten ist, dass die Tatsache der Expression von HERV-K-Proteinen in der
Plazenta alleine eine physiologische Funktion der Proteine nicht beweist. Hierzu
müsste
untersucht
werden,
ob
beispielsweise
in
nicht
erfolgreichen
Schwangerschaften keine Expression erfolgt bzw. könnten genetische Analysen
Aufschluss über etwaige Polymorphismen bei veränderter Expression geben.207 Die
Expression der Hüllproteine von HERV-K in der Plazenta könnte auch nur Folge
einer immunprivilegierten Situation an der fetomaternalen Grenzzone sein und nicht
die Ursache.208 133
In den letzten drei Jahrzehnten gab es einige Studien zur Funktion von
transmembranen
Hüllproteinen
von
endogenen
Retroviren.
Ausgehend
von
Vergleichen mit Eigenschaften von Hüllproteinen infektiöser Retroviren wurden die
Vermittlung von zellulärer Fusion, Rezeptorinterferenz mit exogenen Retroviren 209 210
und
Unterdrückung
vorgeschlagen.132
211
der
maternalen
Immunantwort
gegen
die
Plazenta
Das wohl bekannteste Retrovirus, HIV, bewirkt im Menschen
eine extreme Immunschwäche, die von der viralen Belastung abhängig ist.206 Evtl.
durch Rezeptorinterferenz der HERV kommt es zum Infektionsschutz des
ungeborenen Kindes HIV-infizierter Mütter, wofür die relativ geringe transplazentare
Transmission von HIV spricht.133
Bezüglich der Immunsuppression wurde initial im TM-Protein (p15E) des LeukämieVirus von Mäusen und Katzen eine Region definiert, der die immunsuppressive
Wirkung zugschrieben wird.212 Diese Region ist in vielen anderen tierischen
Retroviren, aber auch im HTLV (Humanes T-Zell-Leukämie-Virus), im HIV213 und in
HERV133
erhalten.214
immunsuppressiven
In
Versuchen
Domäne
mit
einem
homologen
aus
zu
dieser
17
vermeintlich
Aminosäuren
(LQNRRGLDLLFLKEGGL215) hergestellten synthetischen Peptid (CKS-17) wurde
beobachtet, dass es die Aktivität von NK inhibiert212 und die Immunantwort von
Lymphozyten und Monozyten unterdrückt. Zwar wurde die Produktion von IL-1 durch
mit LPS stimulierte Monozyten nicht gehemmt, jedoch wurde die zytozidale Wirkung
61
von IL-1 blockiert.216 Auch in den Versuchen dieser Arbeit (enthaltende Region der
Peptide:
IDQKLANQINDLRQTVIWMGRL)
wurde
übereinstimmend
keine
Unterdrückung der IL-1β-Sekretion durch die DC gemessen.
Weiterhin kam es laut Haraguchi et al. durch CKS-17 zu einer Hemmung der
Produktion von inflammatorischen TH1-Zytokinen (IFN-γ, IL-2, IL-12, TNF-α) bzw.
einer Stimulation der IL-10-Sekretion durch z.B. mit LPS-stimulierte PBMC. Keine
Veränderung in der Produktion wurde hier festgestellt für IL-4, IL-5, IL-6 und IL-13.217
218 219
Dies deckt sich mit den vorliegenden Ergebnissen, da bei den reifen DC (also
stimulierten DC) durch den Einfluss der HERV-Peptide ebenfalls eine vermehrte
IL-10- und eine verringerte TNF-α-Sekretion gemessen wurde. Es ergab sich analog
kein Effekt auf die IL-4 und IL-6-Konzentration in den Ansätzen mit den reifen DC.
Auch Mehrotra et. al. synthetisierten verschiedene kürzere Peptide mit homologen
Sequenzen zu CKS-17 und konnten ebenfalls für zwei Kandidaten eine Suppression
der IL-2 und TNF-α-Produktion durch humane PBMC nachweisen (Peptid
Konzentration hier: 30μmolar).214 Des Weiteren stellten Denner et al. fest, dass das
immunsuppressive Peptid von HIV in humanen Lymphozyten die Produktion von IL-2
und TNF-α senkte und von IL-10, IL-4, IFN-α und IFN-γ steigerte und keinen Einfluss
auf IL-12 und IL-1β hatte.206 Die dieser Arbeit zu Grunde liegenden Daten stimmen
hierin bzgl. TNF-α, IL-10 und IL1-β überein, jedoch zeigte sich kein Effekt auf die
IL-4-Produktion der DC.
Auch in-vivo wurden Studien über die immunsuppressiven Eigenschaften der TMProteine von Retroviren durchgeführt. So konnte für die Hüllproteine des Moloney
murine leukemia virus (MoMLV) bzw. des Mason-Pfizer monkey virus gezeigt
werden, dass sie - exprimiert in Tumorzellen von Mäusen - eine Proliferation von
Tumorzellen, die sonst vom murinen Immunsystem abgestoßen wurden, in
immunkompetenten Mäusen ermöglichten.160
220
Analog wurde dies 2001 erstmals
für ein HERV nachgewiesen. Die Expression des HERV-H-env-Gens ermöglichte es
Tumorzellen, der Immunabwehr der Maus zu entgehen, so dass eine Rolle der
immunsuppressiven HERV-Hüllproteine beim „Immune-Escape“ von Tumoren
vermutet werden kann.158 Für die Produkte des env-Gen des HERV-W (Syncytin 1)22
149
152
bzw. von HERV-FRD (Syncytin 2)151 (beide beinahe exklusiv in der
menschlichen
Plazenta
exprimiert)
wurden
bereits
essentielle
Funktionen
nachgewiesen. Sie vermitteln die Fusion der zytotrophoblastären Zellen zum SZT.
62
Syncytin 2 weist in vivo zudem immunsuppressive Eigenschaften auf, Syncytin 1
hingegen verlor diese Eigenschaften durch Substitution einer Aminosäure innerhalb
der vermeintlich immunsuppressiven Domäne.157 Auch hier bedienten sich
Mangeney et al. der Methode der Transduktion der Syncytine in murine Tumorzellen
und anschließender Beurteilung des Tumorwachtums in einer immunisierten Maus
(s.o.). Analoges gilt für die Syncytine A und B bei Mäusen. Ruebner et al. zeigten,
dass
eine
(Syncytin1,
verminderte
2,
Expression
HERV-P,
von
HERV-R,
verschiedenen
V1,
V2)
mit
HERV-Hüllproteinen
intrauteriner
fetaler
Wachstumsrestriktion im Menschen assoziiert war, was für einen essentiellen
Einfluss der HERV-Peptide auf die menschliche Fortpflanzung spricht, evtl. über eine
abnormale Zytokinproduktion mütterlicher Immunzellen.221
Im Menschen wurde in Melanomzellen die Expression von TM-Hüllprotein
nachgewiesen135 und es wurde gezeigt, dass die Tumorzellen in den MelanomMetastasen im Sentinel-LK einen Anstieg von IL-10 bewirken222, womöglich als ein
Effekt der exprimierten HERV-Proteine. Dies entspricht den Beobachtungen der
vorliegenden Experimente, in denen ein signifikanter Anstieg der IL-10-Produktion in
den reifen und unreifen DC unter TM-Einfluss gemessen wurde. Auch in Patienten
mit Lymphomen und Brustkrebs konnte man hohe Titer an HERV-K-RNA messen,
die
nach
erfolgreicher
Therapie
sanken.223
Die
Beobachtungen
in
der
Tumorimmunologie können auch für den menschlichen Trophoblasten von
Bedeutung sein. Plazentare Morphogenese weist ähnliche Mechanismen wie
Tumorgenese und Entstehung von Metastasen auf. Trophoblastzellen haben wie
Krebszellen eine hohe Proliferationsrate, können migrieren, sich invasiv verhalten
und dem Immunsystem entgehen.224
225
Erkenntnisse, über die Vorgänge in der
Plazenta, insbesondere über die Rolle, die die HERV-K-Peptide spielen, können
somit auch wichtige Hinweise über die Entstehung von Krebs und dessen Therapie
liefern.
Auf der anderen Seite muss man jedoch die Studien betrachten, die eine
inflammatorische Immunantwort auf in Tumorzellen exprimierte HERV-Hüllproteine
untersuchten. So zeigten Wang-Johanning et al., dass es in 88% der untersuchten
Brustkrebsgewebe im Gegensatz zu normalen Brustgeweben zu einer Expression
von HERV-Hüllproteinen kam. In einem großen Anteil der Patienten wurden AntiHERV-K-env-Antikörper nachgewiesen. Durch Stimulation von PBMC aus den
63
Patienten mit HERV-K-Antigen (SU (surface)-Anteil des Hüllproteins) kam es u.a. zu
einer vermehrten Sekretion von IFN-γ, IL-2, IL-6 und IL-8.226 Auch Rolland et al.
zeigten,
dass
retroviralem
die
SU-Einheit
Elements
(surface)
MRSV-ENV-SU
des
Multiple
aus
der
Sklerose-assoziierten
HERV-W-Familie
eine
proinflammatorische Aktivität aufweist. Es steigert die Sekretion von IL-6, TNF-α und
IL1-β in PBMC, triggert die Reifung von DC und unterstützt TH1-Antworten. Somit ist
dieses Hüllprotein möglicherweise in der Pathogenese chronisch inflammatorischer
oder neurodegenerativer Erkrankungen involviert.162
Dass die Ergebnisse in den Studien, die die Funktion von ERV-Hüllproteinen in vitro
prüfen, evtl. auch auf in vivo-Zustände übertragen werden können und somit ein
Einfluss auf die Fortpflanzung von Säugetieren und Menschen mit mehr Sicherheit
anzunehmen ist, zeigten Dunlap et al.. Das Hüllprotein des „endogenous Jaagsiekte
sheep retrovirus“, das in seiner Expression den Syncytinen des Menschen und der
Maus sehr ähnelt, reguliert demnach sowohl in vitro als auch in vivo das Wachstum
des Trophoektoderms und die Implantation des Embryos.227
4.3
Feststellung zu den einzelnen Zytokinen
Es bestehen wenig Zweifel, dass Zytokine und Chemokine wichtig für die Kontrolle
von endometrialen, dezidualen und fetalen Veränderungen und auch für die
Modulation des Immun- und endokrinen Systems während der Gravidität sind.
229 230 231
228 16
So können irreguläre Veränderungen in der Expression der Zytokine und
ihrer Rezeptoren zu einem Implantationsversagen der Frucht bzw. Aborten und
Unfruchtbarkeit
führen.
Die
vorhandenen
Studien
sind
hierzu
jedoch
oft
widersprüchlich. Daher sind in Zukunft dringend weitere Untersuchungen bzgl. der
Zytokine und ihrer Wirkung an der fetomaternalen Grenzzone in erfolgreichen und
erfolglosen Schwangerschaften nötig. Lokale Veränderungen des Gleichgewichts
zwischen TH1- und TH2-Zytokinen und eine komplexe „Kommunikation“ u.a. über
Zytokine und Chemokine zwischen Mutter und Fetus vermitteln die Implantation des
Fetus und die Entwicklung der Plazenta und sichern so das Überleben des
Nachwuchses. Die Beurteilung der Zytokine wird jedoch durch ihre pleiotrope
Funktionsweise und das konzertante Zusammenwirken erschwert. So kann das
64
Abweichen eines einzelnen Zytokins eine Veränderung mehrerer anderer Zytokine
bewirken. 47 228
Daher soll im Rahmen dieser Dissertation auf Erkenntnisse bezüglich des Einflusses
der untersuchten Zytokine auf Erhalt bzw. Gefährdung der Schwangerschaft
eingegangen werden und dies in Bezug auf die vorliegenden Ergebnisse diskutiert
werden.
Für
eine
erfolgreiche
Schwangerschaft
wurde
in
der
Vergangenheit
ein
antiinflammatorisches TH2-Umfeld als Voraussetzung postuliert. Jedoch häufen sich
neuere Daten, dass z.B. für einen erfolgreichen Implantationsvorgang und die
Invasion des Trophoblasten ein proinflammatorisches Mikromilieu wichtig ist.232
Laut Wira et al. ist die Implantation mit einer gesteigerten Sekretion von
proinflammatorischen
Zytokinen
und
Chemokinen
assoziiert233
und
eine
Unterdrückung dieser inflammatorischen Antwort kann zu einem Implantationsdefekt
führen.234
Zytokine
können
die
Freisetzung
und
Aktivität
von
Matrixmetalloproteinasen beeinflussen, was wichtig für die Invasivität des Fetus
ist.235
200
Chemokine führen vermutlich zur Einwanderung von Immunzellen in die
Plazenta, die eine Inflammation bedingen, wodurch die vaskuläre Permeabilität steigt
und die Implantation erleichtert wird.200 Auch in Tumoren beeinflussen Chemokine
das Ausmaß der Leukozyteneinwanderung, die Angiogenese, das Überleben und
Wachstum des Tumors, MMP tragen zu dessen Invasivität bei. In den Tumorzellen
kommt es oft zu einem Überwiegen der T H2-Zellen, was zu einer lokalen
Immunsuppression beitragen könnte.
4.3.1 Tumornekrosefaktor α
In vitro inhibiert TNF-α das Wachstum von humanen Trophoblastenzellen236 bzw.
stimuliert deren Apoptose237 und hemmt die Zellmotilität der selbigen.238 Ein früher
Abort ist bei Mäusen mit einer erhöhten Konzentration an TNF-α verbunden.239 240 241
242
PBMC von Frauen mit habituellen Aborten wiesen in mehreren Untersuchungen
eine erhöhte Sekretion von TNF-α auf.39
auch,
dass
243 244
Verschiedene Autoren beschreiben
Schwangerschaftskomplikationen
wie
Präeklampsie
und
Wachstumsrestriktion des Fetus mit einer erhöhten TNF-α-Sekretion assoziiert
sind.245
246 247
In trächtigen Mäusen persistierte eine Leishmania-maior-Infektion
65
länger als in nicht trächtigen Mäusen, da es zu einer vermehrten IL-10- und
verminderten IFN-γ- und TNF-α-Sekretion der Immunzellen vor Ort kam. Eine
Schwangerschaft verhinderte also eine adäquate TH1-Antwort gegen intrazelluläre
Erreger zum Schutz des Fetus bzw. führte eine ausgeprägte Leishmana-Infektion zu
Implantationsversagen und Abort.248 Murphy et al. zeigten, dass hohe Dosen an LPS
durch vermehrte Sekretion von IL-1, IL-6 und TNF-α durch MP in Mäusen Abort
auslösen können, im Gegensatz dazu aber eine geringe Dosis an LPS wenig
negativen Einfluss auf die murine Schwangerschaft aufweist, außer wenn es sich um
IL-10-Knockout-Tiere handelt. Durch neutralisierende AK gegen TNF-α oder IL-10Gabe konnte in diesen Tieren die Schwangerschaft gerettet werden. Auch Roberston
et al. beobachteten einen schwangerschaftsprotektiven Effekt von Etanercept (TNFAntikörper) in mit LPS behandelten IL-10-KO-Mäusen (siehe auch 4.3.6).249
250
Jedoch stimuliert TNF-α MMP-9 und ist somit auch positiv am Implantationsvorgang
beteiligt.235 251
Auffallend war in der vorliegenden Arbeit, dass es durch die HERV-Peptide K120 und
K177 zu einer hochsignifikanten Reduktion der TNF-α-Sekretion der reifen DC kam
(auf 40% der ursprünglichen Menge). Die beiden rekombinanten Hüllproteine hatten
keinen gegenteiligen Effekt. Bei den unreifen DC kam es zwar tendenziell zu einer
Erhöhung der TNF-α-Sekretion, jedoch war kein signifikanter Unterschied messbar.
Dies könnte bedeuten, dass die reifen DC durch den Einfluss des HERV-K im
Bereich
der
fetomaternalen
Grenzzone
dieses
proinflammatorische
Zytokin
vermindert sezernieren und somit eine Aktivierung der Immunabwehr und die
Reifung und Migration weiterer DC unterbunden bzw. abgeschwächt werden.168 169.
Fest et al. zeigten 2007, dass - potentiell HERV-Peptide exprimierende trophoblastäre Zellen die Migration von CD14+-Makrophagen förderten und u.a.
deren Sekretion von IL-6, IL- 8 und TNF-α nach 24 Stunden stimulierten. Jedoch
zeigte sich, dass die Sekretion von TNF-α nach 48 Stunden (der gleiche Zeitraum
wie in der vorliegenden Arbeit) wieder signifikant sank. Außerdem wurde die
Sekretion von IL-6 und TNF-α durch mit einer geringen Konzentration an LPS
stimulierte Makrophagen in Anwesenheit von trophoblastären Zellen im Vergleich zu
Ansätzen ohne trophoblastäre Zellen signifikant gesenkt. D.h. die Fähigkeit, TNF-α
zu produzieren, wurde durch die trophoblastären Zellen gerade in den aktivierten
Makrophagen reduziert.232 Auch in der vorliegenden Arbeit wurde die TNF-α-
66
Produktion der reifen, immunogenen DC durch die HERV-Peptide eingeschränkt, die
der unreifen DC eher gesteigert. Jedoch wurde bei Fest et al. dieser Effekt der
trophoblastären Zellen bei hohen Dosen an LPS wieder aufgehoben249, was hier
nicht untersucht wurde.
Insgesamt könnte das vorliegende Ergebnis darauf hinweisen, dass durch HERV-K
die immunogene Wirkung von ortsständigen reifen DC supprimiert wird und somit der
Fetus toleriert wird. Eine vollständige Suppression der TNF-α-Sekretion könnte
jedoch die Schwangerschaft durch das erhöhte Infektionsrisiko gefährden und daher
macht die beobachtete Restexpression durchaus biologisch Sinn.
4.3.2 Interleukin 1β
Bei den reifen DC kam es in den durchgeführten Versuchen tendenziell zu einer
Erhöhung der IL-1β-Sekretion, was den Auswirkungen auf TNF-α, wenn man die sich
überschneidenden Wirkungen der beiden Zytokine betrachtet, entgegengesetzt zu
sein scheint. Zudem beschreiben Lockwood et al., dass IL-1β mit der Rekrutierung
von MP zur Dezidua assoziert ist und die MP die endovaskuläre TB-invasion
einschränken, was in die Entwicklung einer Präeklampsie münden kann.246
252
Jedoch wurde in anderen Studien beschrieben, dass das Zytokin essentiell für die
fetale Implantation ist.253
200
Durch Steigerung der Produktion bzw. Stimulation von
Matrixmetalloproteinasen könnte IL-1β neben IL-6 und IL-8 einen Beitrag zur
Invasion des CTB leisten.235
254 263
Durch Gabe von IL-1-Rezeptor-Antagonisten
wurde die Implantationsrate in Mäusen erniedrigt bzw. führte das Fehlen von IL-1 zu
einer abnormalen Implantation.254 Die vorliegenden Ergebnisse weisen keinen
signifikanten Effekt des HERV-K auf die IL-1β-Produktion auf, was sich mit den
Ergebnissen bei Kleinermann et al. deckt.216 Es ist jedoch denkbar, dass auch hier
die zytozidale Wirkung von IL-1 blockiert und somit eine Gefährdung der Frucht
entgegengewirkt wird. Die Auswirkung des Zytokins auf den Implantationsvorgang
könnte jedoch erhalten bleiben.
4.3.3 Interleukin 8
IL-8 liegt in der frühen Schwangerschaft vermehrt in der Plazenta vor. Man vermutet,
dass dieses Chemokin u.a. über die Stimulation von MMP einen Beitrag im Rahmen
67
der Invasion des Fetus liefert und wichtig für die Dezidualisierung ist. Verschiedene
Studien zeigen einen wichtigen Einfluss von IL-8 auf die Veränderung des
endometrialen Stromas und auf Neoangiogenese.255
256 257 200 258
Durch Elongation
der bestehenden Gefäße und durch Neoangiogenese durch die pluripotenten
plazentaren mesenchymalen Vorläuferzellen kommt es zur Vaskularisierung der
Dezidua.255
Wie bei TNF-α kam es durch die HERV-Peptide bei den reifen DC tendenziell eher
zu einer Reduktion der IL-8-Sekretion, die absolut gesehen um ein Vielfaches höher
als die bei den unreifen DC war. Bei den unreifen DC wurde überwiegend eine
signifikante Erhöhung festgestellt. Auch bei Fest et al. kam es in CD14+Makrophagen durch trophoblastäre Zellen zu einer Stimulation der IL-8-Sekretion.
Jedoch erhöhten dort die trophoblastären Zellen ebenfalls die IL-8-Sekretion von MP,
die mit geringen und hohen Dosen an LPS versetzt wurden. 232 Die tendenzielle
Reduktion der IL-8-Bildung in den reifen DC der vorliegenden Arbeit lässt vermuten,
dass die HERV-Peptide reife immunogene DC in ihrer Wirkung supprimieren und
somit eine überschießende proinflammatorische Immunreaktion abgeschwächt
werden könnte. Hingegen werden die unreifen, vornehmlich in der fetomaternalen
Grenzzone vorherrschenden DC stimuliert, das für die Implantation wichtige IL-8 zu
sezernieren.
4.3.4 Interleukin 6
Während bei den reifen DC kein eindeutiger Einfluss auf die IL-6-Produktion
beobachtet werden konnte, kam es bei den unreifen zu einer signifikanten
Stimulation der IL-6-Sekretion. Auch bei Fest et al. wurde die IL-6-Sekretion aus MP
durch trophoblastäre Zellen stimuliert. Analog wie bei TNF-α kam es in den Ansätzen
mit einer niedrigen Dosis an LPS zu einer Supprimierung der IL-6-Produktion, mit
einer hohen Dosis LPS wurde dieser Effekt wieder aufgehoben.232
Einige Studien beschreiben, dass sowohl im Mausmodell als auch beim Menschen
eine niedrige IL-6-Serumkonzentration mit einer erfolgreichen Schwangerschaft, eine
hohe IL-6-Serumkonzentration mit einer erhöhten Abortrate assoziiert ist.259 260 261
Dies
würde
bedeuten,
schwangerschaftshinderliche
dass
hier
Situation
die
HERV-Peptide
unterstützen.
68
Im
eine
eher
Gegensatz
dazu
beobachteten Jasper et al. in Biopsaten aus dem Endometrium von Frauen mit
habituellem Abort eine reduzierte Expression der mRNA für IL-6.229 Zudem wurde in
IL-6-defizienten Mäusen eine erniedrigte Fruchtbarkeitsrate beobachtet und somit
IL-6
eine
essentielle
Bedeutung
für
eine
erfolgreiche
Schwangerschaft
zugesprochen. Raghupathy et al. beobachteten eine erhöhte IL-6-Sekretion durch
PBMC von Frauen mit erfolgreicher Schwangerschaft gegenüber Frauen mit
habituellem Abort.244 Zu beachten ist auch die mögliche antiinflammatorische Potenz
des IL-6, das als regulatorischer Faktor die TH2-Differenzierung vorantreiben und die
TH1-Antwort inhibieren kann, was sich u.a. in der Fähigkeit, die IL-4-Synthese zu
stimulieren, zeigt.
262
263
264
Dubinsky et al. beschreiben einen möglichen
schwangerschaftsprotektiven Effekt von IL-6. Das Zytokin könne die humorale
Immunantwort durch einen Anstieg blockierender asymmetrischer Antikörper so
beeinflussen, dass die Abortrate in Mäusen sinke.265 Zudem ist IL-6 laut
verschiedener Studien auch an der Regulation der Trophoblasteninvasion und
Dezidualisierung beteiligt.235 266 267 268
Betrachtet man das Überwiegen der Hinweise für einen positiven Effekt von IL-6,
sprechen die vorliegenden Ergebnisse dafür, dass die HERV-Peptide über die
Steigerung der IL-6-Sekretion aus den iDC zu einer erfolgreichen Schwangerschaft
beitragen könnten.
4.3.5 Interleukin 4
Unter Zugabe der HERV-Peptide wurde weder bei den reifen noch bei den unreifen
DC ein entscheidender Unterschied in der IL-4-Produktion beobachtet. Es kam also
auch zu keiner Suppression der Produktion dieses T H2- und immunsuppressiven
Zytokins, das von beiden DC in hohem Maße produziert wurde. IL-4 stimulierte
T-Zellen können auch zur Synthese des immunsuppressiven IL-10 stimuliert
werden179, d.h. die Tatsache, dass die HERV-Peptide die Sekretion von IL-4 in den
DC nicht verändern, könnte letztendlich zu einem toleranten Milieu und zum Schutz
des Fetus vor einer mütterlichen Immunattacke beitragen.
Verschiedene Studien schreiben IL-4 schwangerschaftsprotektive Eigenschaften zu.
Chaouat et al. und Krishnan et al. beobachteten eine erniedrigte Produktion von IL-4
69
in Abort-Mäusen
269 248
Bei Frauen mit habituellem Abort zeigten Raghupathy et al.
eine reduzierte Produktion von IL-4 in PBMC244, Piccini et al. in dezidualen
T-Zellen.36 Jedoch beschrieben Svensson et al. erfolgreiche Schwangerschaften in
IL-10- und IL-4-KO-Mäusen270, Fallon et al. sogar in Mäusen, die für vier TH2Zytokine (IL-4, IL-5, IL-9, IL-13) defizient waren.271 Diese Beobachtungen zeigen,
dass die Beurteilung der Funktion der Zytokine in der Schwangerschaft im Einzelnen
sehr schwierig ist. So kann die Funktion eines fehlenden Zytokins evtl. von einem
anderen Zytokin übernommen werden (Redundanz), ohne dass die Schwangerschaft
gefährdet wird, bzw. kann ein Zytokin die Funktion anderer fehlregulierter Zytokine
übernehmen, so dass dies kein pathologisches Resultat nach sich zieht. Die
Beurteilung der genau abgestimmten Vorgänge gestaltet sich daher sehr schwierig.
4.3.6 Interleukin 10
Unter den Zytokinen ist gerade IL-10 auf Grund seiner regulatorischen Beziehungen
zu anderen intrauterinen Modulatoren und seiner immunsuppressiven Eigenschaften
besonders interessant in Bezug auf seine Rolle in der Kommunikation zwischen
Mutter und Fetus.188 Gerade auf das Zytokin, das im Zusammenhang der
fetomaternalen Immunologie im Fokus vieler Studien stand, hatten die HERVPeptide sowohl bei den reifen als auch bei den unreifen DC einen gleichgerichteten
Einfluss.
In allen Ansätzen kam es in der höchsten Konzentration der Peptide zu einer
Steigerung der IL-10-Zytokinproduktion.
Bemerkenswert ist jedoch, dass es bei der Hälfte der Patienten zu einer extrem
starken Bildung von IL-10 kam. Dies könnte bedeuten, dass individuelle
Unterschiede im Sinne von „low- und high-responder“ in der Reaktion auf HERVPeptide bestehen. Somit wäre es vorstellbar, dass beispielsweise unterschiedliche
genetische Merkmale wie bestimmte HLA-Typen einen Einfluss auf die fetomaternale
Immunologie bzgl. der HERV-Peptide nehmen und Erfolg und Misserfolg einer
Schwangerschaft beeinflussen können. Vermindertes IL-10 in der Plazenta ist
häufiger mit Präeklampsie und Abort assoziiert245 215
248
bzw. können im Tiermodell
durch Gabe von IL-10 die Abortrate verringert oder Wachstumseinschränkungen
70
aufgehoben werden.272
269
Zudem produzieren die PBMC von Frauen mit
erfolgreichem Schwangerschaftsverlauf v.a. vermehrt IL 1039 42 244 und deziduale
T-Zellen aus Frauen mit habituellen Aborten weniger IL-10.36 Da IL-10 die
Expression von MMP-9 reduzieren kann, wird es zudem als autokriner Regulator der
Invasivität des Trophoblasten gesehen.273 Die Versuche von Svensson et al. (s.o.)
zeigen zwar, dass IL-10 nicht essentiell für eine erfolgreiche fetale Implantation sein
muss270, White et al. konstatierten aber einen essentiellen Einfluss von IL-10 auf das
fetale Wachstum.274 Sowohl Murphy et al. als auch Robertson et al. beschrieben,
dass in IL-10-KO-Mäusen schon eine geringe Dosis an LPS zu einem Verlust der
Schwangerschaft und fetaler Wachstumsrestriktion führte, was jedoch durch IL-10Gabe verhindert werden konnte. Es kam in den IL-10-KO-Mäusen durch LPS zu
einem Anstieg von IL-6, TNF-α, IL-1 und IL-12 im Serum und Uterus. IL-10 beinflusst
also die Resistenz auf inflammatorische Stimuli, indem es die Konzentration
proinflammatorischer Zytokine an der Implantationstelle zu senken vermag.
Außerdem zeigten Murphy et al., dass Mäuse, die IL-10 produzierten, die
Schwangerschaft auch noch unter zehnfacher LPS-Dosis austragen konnten.
Insgesamt heißt das, dass während einer normalen Gestation milde Entzündungen
auf Grund des antiinflammatorischen Effekts des IL-10 keinen Abort verursachen.249
250
Unter IL-10-Einfluss vermitteln iDC eine tolerogene Wirkung.114
116 209 210
Weiterhin
können DC durch IL-10-Sekretion naive T-Zellen zur Synthese von IL-4 stimulieren
und somit die Differenzierung zu TH2-Zellen unterstützen.113 Zudem ist IL-10
vermutlich
entscheidend
(CD4+CD25+-Treg).212
für
213
schwangerschaftserhaltenden
die
195
Effekt
Generierung
von
Zenclussen
et
der
Treg
regulatorischen
al.
nach275,
T-Zellen
wiesen
wobei
jedoch
einen
die
Neutralisierung von IL-10 deren protektiven Einfluss verhinderte.276 Analoge
Beobachtungen wurden von Kingsley et al. auch bei Allograft-Transplantionen
beschrieben.277 Auf Grund seiner immunsuppressiven Eigenschaften (T-Zellsuppression182, Induktion von Treg195
der DC192
116
, Unterstützung des tolerogenen Phänotyp
193 79 278
) scheint IL-10 aus den DC evtl. der Schlüssel zur maternalen
Toleranzinduktion gegenüber dem Fetus zu sein.130 Durch die Expression der
Hüllproteine des HERV-K, die die Sekretion von IL-10 aus den DC stimulieren,
könnte der semiallogene Fetus seinen eigenen Beitrag zu seiner Verteidigung gegen
71
das mütterliche Immunsystem leisten. Die Tatsache, dass die Stimulation so
unterschiedlich ausfiel, kann dafür sprechen, dass es hier zu individuellen
Unterschieden kommt, die die Reaktion auf HERV-K beeinflussen und es so zu einer
erfolgreichen Schwangerschaft kommt oder nicht.
4.4
Bewertung des Einflusses von HERV-K
Die Erkenntnis, dass die HERV-Peptide die Zytokinproduktion der DC z.T. signifikant
modulieren und diese Veränderung in den unterschiedlichen Reifestadien der DC
variieren, legt die Vermutung nahe, dass die in der humanen Plazenta exprimierten
Proteine in der Tat einen Einfluss auf den Verlauf einer Schwangerschaft nehmen.
Insgesamt kann man sagen, dass der Einfluss der HERV-Peptide auf die
Zytokinproduktion bzgl. des TH1/TH2-Gleichgewichts nicht eindeutig ist. Betrachtet
man
die
vielen
Studien,
die
auch
proinflammatorischen
Zytokinen
schwangerschaftsförderliche Eigenschaften zuweisen und die Veränderung der
Expression der Zytokine im Verlauf der Schwangerschaft beschreiben, wird man in
Zukunft wohl von dem starren Schema des TH1/TH2-Paradigmas absehen müssen.
Bei einer Schwangerschaft sind extrem fein abgestimmte, komplexe Vorgänge, bei
denen viele verschiedene Faktoren eine Rolle spielen, für einen Erfolg vonnöten.
Eine Übertragung der in-vitro-Ergebnisse auf in-vivo-Zustände ist nicht leicht zu
vollziehen. Die vorliegenden Ergebnisse sprechen jedoch für einen Einfluss des
HERV-K auf die Kommunikation zwischen Fetus und Mutter. Inwiefern genau und
wie wichtig bzw. essentiell die Expression der HERV-K-Peptide für einen
physiologischen Verlauf der Schwangerschaft ist, ob sie einen Einfluss auf
Pathologien während der Gestation hat und ob dem HERV-K eine Bedeutung in der
humanen Evolution zukommt, kann mit dieser Arbeit nicht geklärt werden. Jedoch
gibt diese Arbeit Anlass dafür, den Einfluss des HERV-K auf die menschliche
Fortpflanzung weitergehend zu untersuchen. Die Konservierung der retroviralen DNA
im menschlichen Genom spricht für einen positiven physiologischen Einfluss.
Anhand der vielen vorhandenen und z.T. widersprüchlichen Studien sieht man, dass
bzgl. der Beziehung zwischen Mutter und Kind im Mutterleib noch viele
Untersuchungen nötig sind, um die Geschehnisse während Entstehung und Erhalt
der Schwangerschaft und Geburt vollständig zu verstehen. Dieselben Zytokine
72
können
zu
bestimmten
Zeitpunkten der Schwangerschaft
entgegengesetzte
Wirkungen aufweisen. Es konnte hier gezeigt werden, dass in der Plazenta
exprimierten Hüllproteine des HERV-K die Funktion von humanen Immunzellen
verändern. Jedoch sind weitere Untersuchungen nötig, um diese Effekte in einen
Gesamtkontext einordnen zu können. Fest et al. stellten die Hypothese auf, dass die
Implantation durch ein proinflammatorisches Umfeld gewährleistet wird, welches
aber durch eine adäquate „Erziehung“ des angeborenen Immunsystems durch den
Trophoblasten kontrolliert werden muss.232 Vielleicht ist gerade das HERV-K an
dieser Erziehung beteiligt. Es wäre auch spannend zu untersuchen, ob eine
Dysregulation der Expression der HERV-Peptide zu einem Ansteigen z.B. der
Abortrate und Schwangerschaftskomplikationen wie Frühgeburt, Präeklampsie und
Choriocarcinom führt. Ein wichtige Aufgabe zum Verständnis der Fortpflanzung stellt
die Identifizierung der Zellinteraktionen zwischen den verschiedenen Zytokin
produzierenden Zellpopulationen von Uterus und Plazenta dar, die durch die
Produktion regulatorischer Zytokine ein Toleranz auslösendes Gleichgewicht
während
der
Untersuchung
Schwangerschaft
aufrechterhalten.
des
der
Einflusses
So
HERV-Peptide
bietet
beispielsweise
Zytokinproduktion von uterinen NK aus der humanen Plazenta an.
73
sich
auch
die
auf
die
5
Ausblick
Der Nobelpreisträger von 1960, Sir Peter Medawar, bezeichnete den Fetus als
„glückliches
Semiallotransplantat“
und
sprach
von
einer
aktiv
erworbenen
Immuntoleranz.279 Der Trophoblast ist trotz seiner Semiallogenität in der Lage, einen
Teil des mütterlichen uterinen Gewebes zu invadieren. Es kommt i.d.R. zur Toleranz
der fetopaternalen Antigene durch das mütterliche Immunsystem. Die Hypothese,
onkogene und immunsuppressive Retroviren, die sich in das Genom der
menschlichen Vorfahren integriert haben, als Grundlage der Evolution von Eier
legenden Tieren zu plazentaren Säugetieren vor 100 Mio. Jahren zu sehen, ist sehr
verlockend.280
211
Dass aber nicht in allen Säugetieren die gleichen endogenen
Retroviren konserviert sind, spricht vielleicht dafür, dass die Proviren eine Nische
gefunden und nur kleine evolutionäre Vorteile für verschiedene Spezies zu
verschiedenen Zeiten gebracht haben. Zukünftige genauere Erkenntnisse über die
immunologischen Vorgänge in der fetomaternalen Grenzzone können wichtige
Ansatzpunkte zum einem für Diagnostik, Prävention und Therapie bei habituellen
Aborten und anderen schwangerschaftsassoziierten Krankheiten, zum anderen aber
auch für Tumor- und Autoimmunerkrankungen und Organtransplantationen liefern.
Das Geheimnis der Fortpflanzung bleibt weiterhin bestehen und wird auch in Zukunft
die Forschung beschäftigen.
74
6
Zusammenfassung
Bei der Implantation des Fetus in den Uterus und während der Schwangerschaft
kommt es zu einer Interaktion fetaler Trophoblastzellen mit dem mütterlichen
Immunsystem. Trotz vieler verschiedener Studien ist bis heute nicht grundlegend
geklärt, welche Mechanismen zur immunologischen Akzeptanz des (semi-)allogenen
Fetus durch die Mutter beitragen. Zur wechselseitigen Kommunikation zwischen Kind
und Mutter tragen Zytokine bei, die von allen immunkompetenten Zellen sezerniert
werden können und regulatorisch auf die Immunantwort wirken. Eine Störung im
Gleichgewicht der Zytokine kann zu Aborten, Präeklampsie oder anderen
Pathologien führen. Eine wichtige Quelle von Zytokinen stellen u.a. die reifen und
unreifen dendritischen Zellen (DC), die in der humanen Dezidua nachgewiesen
wurden, dar. DC übernehmen als effiziente Antigen präsentierende Zellen eine
entscheidende
Funktion
im
Immunsystem
und
können
inflammatorische
Immunantworten induzieren. Jedoch spielen sie auch eine wichtige Rolle bei der
Vermittlung immunologischer Toleranz.
Die menschliche Plazenta weist eine auffällig starke Expression verschiedener
humaner endogener Retroviren (HERV) auf. Immunmodulierende Eigenschaften von
HERV wurden bereits beschrieben, jedoch nicht die direkte Wirkung von HERVProteinen der Plazenta auf Zellen des Immunsystems. Im Rahmen der Arbeit sollte
daher die Wirkung des Hüllproteins des HERV-K, das in den Zytotrophoblastenzellen
und in den Zellen des extravillösen Trophoblasten nachgewiesen wurde, auf die
Zytokinproduktion unreifer (iDC) und reifer DC (mDC) untersucht werden.
Als Modellsystem wurden in-vitro aus Monozyten des peripheren Blutes differenzierte
DC gewählt. Die DC wurden in unreifem und reifem Zustand mit unterschiedlichen
Konzentrationen von HERV-K-Peptiden (rekombinante Proteine (TM05.04 und
TM12.12) bzw. Peptide aus 22 Aminosäuren (K120 und K177)) behandelt.
Untersucht
wurden
die
Veränderungen
der
Zytokinspiegel
in
den
Zellkulturüberständen mittels Cytometric Bead Assay und Durchflusszytometrie. Die
Messungen zeigten z.T. signifikante Veränderungen der Zytokinproduktion. So wurde
die TNF-α-Sekretion der mDC durch K120 und K177 signifikant vermindert.
Dieselben Peptide supprimierten ebenfalls signifikant die IL-8-Sekretion der mDC.
Jedoch kam es durch alle vier HERV-Peptide (bei drei Peptiden signifikant) zu einer
Steigerung der IL-8-Produktion in den iDC. Auch IL-6 wurde von den iDC durch
75
HERV-K mehrheitlich signifikant vermehrt ausgeschüttet. Bzgl. IL-6 ergaben sich
jedoch keine signifikanten Veränderungen in den mDC. In allen Ansätzen kam es zu
einer konzentrationsabhängigen Stimulation der Sekretion des immunsuppressiven
IL-10
(bei
je
drei
Peptiden
signifikante
Ergebnisse).
Keine
signifikanten
Veränderungen ergaben sich für IL1-β und IL-4.
Die Erkenntnis, dass die HERV-Peptide die Zytokinproduktion der DC z.T. signifikant
modulieren und diese Veränderung in den unterschiedlichen Reifestadien der DC
variieren, lässt vermuten, dass die in der humanen Plazenta exprimierten Proteine
einen Einfluss auf den Verlauf einer Schwangerschaft nehmen. Bei einer
Schwangerschaft sind extrem fein abgestimmte, komplexe Vorgänge, bei denen viele
verschiedene Faktoren eine Rolle spielen, für einen Erfolg vonnöten. Eine
Übertragung der in-vitro-Ergebnisse auf in-vivo-Zustände ist nicht leicht zu
vollziehen. Die vorliegenden Ergebnisse sprechen jedoch für einen Einfluss des
HERV-K auf die Kommunikation zwischen Fetus und Mutter. Inwiefern genau und
wie wichtig bzw. essentiell die Expression der HERV-K-Peptide für einen
physiologischen Verlauf der Schwangerschaft ist, ob sie einen Einfluss auf
Pathologien während der Gestation hat und ob dem HERV-K eine Bedeutung in der
humanen Evolution zukommt, kann mit dieser Arbeit nicht geklärt werden. Jedoch
gibt diese Arbeit Anlass dafür, den Einfluss des HERV-K auf die menschliche
Fortpflanzung weitergehend zu untersuchen.
76
7
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
Accno.
Accessionnumber
AG
Antigen
AK
Antikörper
APC
Antigen-presenting cell (Antigen präsentierende Zelle)
Bp
Basenpaar
Bzgl.
Bezüglich
Bzw.
Beziehungsweise
Ca.
Carcinom
CTB
Zytotrophoblast
DC
Dendritic cell (Dendritische Zelle)
D.h.
Das heißt
DNA
Deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
Env
Envelope
ERV
Endogener Retrovirus
EST
Expressed Sequence Tag
Et al.
Et altera
EVT
Extravillöser Zytotrophoblast
Evtl.
Eventuell
H
Stunde
HERV
Humaner endogener Retrovirus
HLA
Human Leukocyte Antigen
iDC
Immature dendritic cell (unreife dendritische Zelle)
IDO
Indoleamine-2,3-Dioxygenase
i.d.R.
In der Regel
IFN
Interferon
IL
Interleukin
IS
Immunsystem
ISU-Peptide
Immunsuppressive Peptide
KIR
Killercell Immunglobuline-like Receptor
KO
Knockout
LGL
Large granular lymphocytes
77
LPS
Lipopolysaccharid
LTR
Long terminal repeats
mDC
Mature dendritic cells (reife dendritische Zellen)
MMP
Matrixmetalloproteinase
MP
Makrophage
MS
Multiple Sklerose
NK
Natürliche Killerzelle
PBMC
Peripheral blood mononuclear cells
RNA
Ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
RT
Reverse Transkriptase
RV
Retroviren
Sog.
Sogenannt
SU
Surface
S.o.
Siehe oben
S.u.
Siehe unten
SZT
Synzytiotrophoblast
TB
Trophoblast
TGF
Transforming Growth Factor
TLR
Toll-like Receptor
TM
Transmembran
TNF
Tumornekrosefaktor
Treg
Regulatorische T-Zelle
U.a.
Unter anderem
uDC
Uterine dendritic cell (uterine dendritische Zelle)
uNK
Uterine natürliche Killerzelle
Vgl.
Vergleiche
V.a.
Vor allem
VT
Villöser Zytotrophoblast
Z.B.
Zum Beispiel
ZTB
Zytotrophoblast
78
8
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1:
Plazenta: Schnittstelle zwischen Mutter und Kind
(aus Schiebler, T.H. (1996) Zytologie, Histologie und mikroskopische Anatomie des
Menscher unter Berücksichtigung der Histophysioloe. 4.Auflage, 2004 © SpringerVerlag)
Abb. 2:
Trophoblastenzellen in der menschlichen Plazenta
(Abbildung modifiziert nach Sugimoto, J., Schust DJ. Review: human endogenous
retroviruses and the placenta. Reprod Sci 2009, 16(11):1023-33)
Abb. 3:
Lebenszyklus der DC
(Abbildung modifiziert nach Huck, B. Einfluss Schwangerschafts-assoziierter Hormone
auf Phänotyp und Funktion humaner dendritischer Zellen, Dissertation, Würzburg)
Abb. 4:
Unreife, halbreife, reife DC im Kontext der T-Zell-Toleranz und Immunität
(Abbildung modifziert nach Lutz, M. B. and G. Schuler (2002). "Immature, semi-mature
and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity?" Trends
Immunol 23(9): 445-449.)
Abb. 5:
DC im intrauterinen Kontext in der frühen Schwangerschaft (Abbildung modifiziert
nach Kammerer, U., von Wolff, M. et al. (2004). "Immunology of human endometrium."
Immunobiology 209(7): 569-574.)
Abb. 6:
Schematischer Aufbau eines exogenen Retrovirus am Beispiel von HIV-1
(Abbildung
modifiziert
nach
US
National
Institute
of
Health,
http://www.niaid.nih.gov/topics/HIVAIDS/Understanding/Biology/Pages/structure.aspx,
Nov. 2011)
Abb. 7:
Lebenszyklus von exogenen und endogenen Retroviren
(Abbildung modifiziert nach Sverdlov, E. D. (2000). "Retroviruses and primate
evolution." Bioessays 22(2): 161-171.)
Abb. 8:
Expression von HERV-K-Hüllprotein in der Plazenta; eigene Bilder
Abb. 9:
Strukturelles Schema von HERV-K
(Abbildung modifiziert nach Sverdlov, E. D. (2000). "Retroviruses and primate
evolution." Bioessays 22(2): 161-171.)
Abb. 10:
Elutra-Methode
(Abbildung
modifiziert
nach
der
Beschreibung
des
Testprinzips,
http://www.caridianbct.com/location/emea/products-and-services/Pages/elutra-cellseparation-system.aspx, Nov. 2011)
Abb. 11:
Die gewonnenen Fraktionen, eigene Bilder
Abb. 12:
Nachweis der Reinheit der gewonnen Zellen, eigene Bilder
Abb. 13:
Mikroskopische Kontrolle der Zellen, eigene Bilder
Abb. 14:
Darstellung der Oberflächenmarker der unreifen und reifen DC, eigene Bilder
Abb. 15:
Sequenz der Ektodomäne des Hüllproteins von HERV-K
(Abbildung modifiziert nach PubMed Accno. Q69384)
79
Abb. 16:
Mikroskopische Kontrolle der Zellen, eigene Bilder
Abb. 17:
Prinzip des Cytometric Bead Assays
(modifiziert nach dem Protokoll des Testes)
Abb. 18:
Einstellung am FACS-Gerät
(Abbildung entnommen aus dem Protokoll des Testes)
Abb. 19:
Auswirkung von K120 auf die TNF-α-Sekretion reifer DC, eigene Bilder
Abb. 20:
Auswirkung von HERV-K auf TNF-α, eigene Bilder
Abb. 21:
Auswirkung von HERV-K auf IL-1β, eigene Bilder
Abb. 22:
Auswirkung von HERV-K auf IL-8, eigene Bilder
Abb. 23:
Auswirkung von HERV-K auf IL-6, eigene Bilder
Abb. 24:
Auswirkung von HERV-K auf IL-4, eigene Bilder
Abb. 25:
Auswirkung von HERV-K auf IL-10, eigene Bilder
Abb. 26:
Auswirkung von TM 5.4. auf die IL-10-Sekretion reifer DC bzw. von K177 auf die IL10-Sekretion unreifer DC, eigene Bilder
9
Tabellenverzeichnis
Tab. 1:
Expression von HERV in menschlichem Gewebe
(modifiziert nach Kim, T. H., Y. J. Jeon, et al. (2004). "The distribution and expression
of HERV families in the human genome." Mol Cells 18(1): 87-93.)
Tab. 2:
Expression endogener Retroviren in der menschlichen Plazenta
(modifiziert nach Rote, N. S., S. Chakrabarti, et al. (2004). "The role of human
endogenous retroviruses in trophoblast differentiation and placental development."
Placenta 25(8-9): 673-683.)
Tab. 3:
Sensitivität
(modifiziert nach dem Protokoll des Testes)
10 Literaturverzeichnis
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Sadler T. Medizinische Embryologie. 11 ed: Thieme, 2008.
Klock SC, Chang G, Hiley A, Hill J. Psychological distress among women with
recurrent spontaneous abortion. Psychosomatics 1997;38(5):503-7.
Serrano F, Lima ML. Recurrent miscarriage: psychological and relational
consequences for couples. Psychol Psychother 2006;79(Pt 4):585-94.
Stirrat GM. Recurrent miscarriage. Lancet 1990;336(8716):673-5.
Hill JA. Immunological contributions to recurrent pregnancy loss. Baillieres
Clin Obstet Gynaecol 1992;6(3):489-505.
Kiechle M. Gynäkologie und Geburtshilfe. 1 ed: Elsevier Urban & Fischer,
2007.
Vince GS, Johnson PM. Materno-fetal immunobiology in normal pregnancy
and its possible failure in recurrent spontaneous abortion? Hum Reprod
1995;10 Suppl 2:107-13.
80
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
von Rango U. Fetal tolerance in human pregnancy--a crucial balance between
acceptance and limitation of trophoblast invasion. Immunol Lett
2008;115(1):21-32.
Pearson H. Reproductive immunology: Immunity's pregnant pause. Nature
2002;420(6913):265-6.
Remohi J, Gartner B, Gallardo E, Yalil S, Simon C, Pellicer A. Pregnancy and
birth rates after oocyte donation. Fertil Steril 1997;67(4):717-23.
Thellin O, Coumans B, Zorzi W, Igout A, Heinen E. Tolerance to the foetoplacental 'graft': ten ways to support a child for nine months. Curr Opin
Immunol 2000;12(6):731-7.
Tafuri A, Alferink J, Moller P, Hammerling GJ, Arnold B. T cell awareness of
paternal alloantigens during pregnancy. Science 1995;270(5236):630-3.
Malan Borel I, Gentile T, Angelucci J, Pividori J, Guala MC, Binaghi RA, et al.
IgG asymmetric molecules with antipaternal activity isolated from sera and
placenta of pregnant human. J Reprod Immunol 1991;20(2):129-40.
Innes A, Cunningham C, Power DA, Catto GR. Fetus as an allograft:
noncytotoxic maternal antibodies to HLA-linked paternal antigens. Am J
Reprod Immunol 1989;19(4):146-50.
Guleria I, Sayegh MH. Maternal acceptance of the fetus: true human
tolerance. J Immunol 2007;178(6):3345-51.
Salamonsen LA, Hannan NJ, Dimitriadis E. Cytokines and chemokines during
human embryo implantation: roles in implantation and early placentation.
Semin Reprod Med 2007;25(6):437-44.
Rieger L, Segerer S, Bernar T, Kapp M, Majic M, Morr AK, et al. Specific
subsets of immune cells in human decidua differ between normal pregnancy
and preeclampsia--a prospective observational study. Reprod Biol Endocrinol
2009;7:132.
Norwitz ER, Schust DJ, Fisher SJ. Implantation and the survival of early
pregnancy. N Engl J Med 2001;345(19):1400-8.
Moffett-King A. Natural killer cells and pregnancy. Nat Rev Immunol
2002;2(9):656-63.
Frank HG KP. Nonvillous parts and trophoblast invasion. In: Benirschke K KP,
Baergen RN, editor. Pathology of the human placenta, 2006.
Keith Moore L, Persaud, T. . Embryologie. 5 ed: Elsevier, Urban & Fischer,
2007.
Mi S, Lee X, Li X, Veldman GM, Finnerty H, Racie L, et al. Syncytin is a
captive retroviral envelope protein involved in human placental
morphogenesis. Nature 2000;403(6771):785-9.
Moffett A, Loke YW. The immunological paradox of pregnancy: a reappraisal.
Placenta 2004;25(1):1-8.
Bianchi DW, Zickwolf GK, Weil GJ, Sylvester S, DeMaria MA. Male fetal
progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum.
Proc Natl Acad Sci U S A 1996;93(2):705-8.
Adams Waldorf KM, Nelson JL. Autoimmune disease during pregnancy and
the microchimerism legacy of pregnancy. Immunol Invest 2008;37(5):631-44.
Maloney S, Smith A, Furst DE, Myerson D, Rupert K, Evans PC, et al.
Microchimerism of maternal origin persists into adult life. J Clin Invest
1999;104(1):41-7.
81
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
King A, Burrows TD, Hiby SE, Bowen JM, Joseph S, Verma S, et al. Surface
expression of HLA-C antigen by human extravillous trophoblast. Placenta
2000;21(4):376-87.
King A, Allan DS, Bowen M, Powis SJ, Joseph S, Verma S, et al. HLA-E is
expressed on trophoblast and interacts with CD94/NKG2 receptors on
decidual NK cells. Eur J Immunol 2000;30(6):1623-31.
Hiby SE, King A, Sharkey A, Loke YW. Molecular studies of trophoblast HLAG: polymorphism, isoforms, imprinting and expression in preimplantation
embryo. Tissue Antigens 1999;53(1):1-13.
Kovats S, Main EK, Librach C, Stubblebine M, Fisher SJ, DeMars R. A class I
antigen,
HLA-G,
expressed
in
human
trophoblasts.
Science
1990;248(4952):220-3.
Ishitani A, Sageshima N, Lee N, Dorofeeva N, Hatake K, Marquardt H, et al.
Protein expression and peptide binding suggest unique and interacting
functional roles for HLA-E, F, and G in maternal-placental immune recognition.
J Immunol 2003;171(3):1376-84.
Hiby SE, Walker JJ, O'Shaughnessy K M, Redman CW, Carrington M,
Trowsdale J, et al. Combinations of maternal KIR and fetal HLA-C genes
influence the risk of preeclampsia and reproductive success. J Exp Med
2004;200(8):957-65.
LeMaoult J, Krawice-Radanne I, Dausset J, Carosella ED. HLA-G1-expressing
antigen-presenting cells induce immunosuppressive CD4+ T cells. Proc Natl
Acad Sci U S A 2004;101(18):7064-9.
Fournel S, Aguerre-Girr M, Huc X, Lenfant F, Alam A, Toubert A, et al. Cutting
edge: soluble HLA-G1 triggers CD95/CD95 ligand-mediated apoptosis in
activated CD8+ cells by interacting with CD8. J Immunol 2000;164(12):6100-4.
Le Bouteiller P, Blaschitz A. The functionality of HLA-G is emerging. Immunol
Rev 1999;167:233-44.
Piccinni MP, Beloni L, Livi C, Maggi E, Scarselli G, Romagnani S. Defective
production of both leukemia inhibitory factor and type 2 T-helper cytokines by
decidual T cells in unexplained recurrent abortions. Nat Med 1998;4(9):1020-4.
Wegmann TG, Lin H, Guilbert L, Mosmann TR. Bidirectional cytokine
interactions in the maternal-fetal relationship: is successful pregnancy a TH2
phenomenon? Immunol Today 1993;14(7):353-6.
Wegmann TG. The cytokine basis for cross-talk between the maternal
immune and reproductive systems. Curr Opin Immunol 1989;2(5):765-9.
Hill JA, Polgar K, Anderson DJ. T-helper 1-type immunity to trophoblast in
women with recurrent spontaneous abortion. JAMA 1995;273(24):1933-6.
Raghupathy R. Th1-type immunity is incompatible with successful pregnancy.
Immunol Today 1997;18(10):478-82.
Szereday L, Varga P, Szekeres-Bartho J. Cytokine production by lymphocytes
in pregnancy. Am J Reprod Immunol 1997;38(6):418-22.
Marzi M, Vigano A, Trabattoni D, Villa ML, Salvaggio A, Clerici E, et al.
Characterization of type 1 and type 2 cytokine production profile in physiologic
and pathologic human pregnancy. Clin Exp Immunol 1996;106(1):127-33.
Ostensen M, Aune B, Husby G. Effect of pregnancy and hormonal changes on
the activity of rheumatoid arthritis. Scand J Rheumatol 1983;12(2):69-72.
Petri M, Howard D, Repke J. Frequency of lupus flare in pregnancy. The
Hopkins Lupus Pregnancy Center experience.
Arthritis Rheum
1991;34(12):1538-45.
82
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
Chaouat G. The Th1/Th2 paradigm: still important in pregnancy? Semin
Immunopathol 2007;29(2):95-113.
Chaouat G, Ledee-Bataille N, Dubanchet S, Zourbas S, Sandra O, Martal J.
TH1/TH2 paradigm in pregnancy: paradigm lost? Cytokines in pregnancy/early
abortion: reexamining the TH1/TH2 paradigm. Int Arch Allergy Immunol
2004;134(2):93-119.
Dealtry GB, O'Farrell MK, Fernandez N. The Th2 cytokine environment of the
placenta. Int Arch Allergy Immunol 2000;123(2):107-19.
Honig A, Rieger L, Kapp M, Sutterlin M, Dietl J, Kammerer U. Indoleamine
2,3-dioxygenase (IDO) expression in invasive extravillous trophoblast supports
role of the enzyme for materno-fetal tolerance. J Reprod Immunol
2004;61(2):79-86.
Kudo Y, Boyd CA, Spyropoulou I, Redman CW, Takikawa O, Katsuki T, et al.
Indoleamine 2,3-dioxygenase: distribution and function in the developing
human placenta. J Reprod Immunol 2004;61(2):87-98.
Munn DH, Zhou M, Attwood JT, Bondarev I, Conway SJ, Marshall B, et al.
Prevention of allogeneic fetal rejection by tryptophan catabolism. Science
1998;281(5380):1191-3.
Hunt JS, Vassmer D, Ferguson TA, Miller L. Fas ligand is positioned in mouse
uterus and placenta to prevent trafficking of activated leukocytes between the
mother and the conceptus. J Immunol 1997;158(9):4122-8.
Somerset DA, Zheng Y, Kilby MD, Sansom DM, Drayson MT. Normal human
pregnancy is associated with an elevation in the immune suppressive CD25+
CD4+ regulatory T-cell subset. Immunology 2004;112(1):38-43.
Sakaguchi S. Naturally arising CD4+ regulatory t cells for immunologic selftolerance and negative control of immune responses. Annu Rev Immunol
2004;22:531-62.
Heikkinen J, Mottonen M, Alanen A, Lassila O. Phenotypic characterization of
regulatory T cells in the human decidua. Clin Exp Immunol 2004;136(2):373-8.
Aluvihare VR, Kallikourdis M, Betz AG. Regulatory T cells mediate maternal
tolerance to the fetus. Nat Immunol 2004;5(3):266-71.
Straszewski-Chavez SL, Abrahams VM, Mor G. The role of apoptosis in the
regulation of trophoblast survival and differentiation during pregnancy. Endocr
Rev 2005;26(7):877-97.
Levine JS, Koh JS. The role of apoptosis in autoimmunity: immunogen,
antigen, and accelerant. Semin Nephrol 1999;19(1):34-47.
Strominger JL. Human decidual lymphocytes and the immunobiology of
pregnancy. J Reprod Immunol 2004;62(1-2):17-8.
Bulmer JN, Morrison L, Longfellow M, Ritson A, Pace D. Granulated
lymphocytes in human endometrium: histochemical and immunohistochemical
studies. Hum Reprod 1991;6(6):791-8.
Loke YW, King A. Immunology of implantation. Baillieres Best Pract Res Clin
Obstet Gynaecol 2000;14(5):827-37.
Vince GS, Johnson PM. Leucocyte populations and cytokine regulation in
human uteroplacental tissues. Biochem Soc Trans 2000;28(2):191-5.
Piccinni MP. T cells in pregnancy. Chem Immunol Allergy 2005;89:3-9.
Piccinni MP. T cells in normal pregnancy and recurrent pregnancy loss.
Reprod Biomed Online 2006;13(6):840-4.
83
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
von Rango U, Classen-Linke I, Kertschanska S, Kemp B, Beier HM. Effects of
trophoblast invasion on the distribution of leukocytes in uterine and tubal
implantation sites. Fertil Steril 2001;76(1):116-24.
Gardner L, Moffett A. Dendritic cells in the human decidua. Biol Reprod
2003;69(4):1438-46.
Kammerer U, Schoppet M, McLellan AD, Kapp M, Huppertz HI, Kampgen E,
et al. Human decidua contains potent immunostimulatory CD83(+) dendritic
cells. Am J Pathol 2000;157(1):159-69.
Kammerer U. Antigen-presenting cells in the decidua. Chem Immunol Allergy
2005;89:96-104.
Kammerer U, Eggert AO, Kapp M, McLellan AD, Geijtenbeek TB, Dietl J, et al.
Unique appearance of proliferating antigen-presenting cells expressing DCSIGN (CD209) in the decidua of early human pregnancy. Am J Pathol
2003;162(3):887-96.
Tekelioglu-Uysal M, Edwards RG, Kisnisci HA. Ultrastructural relationships
between decidua, trophoblast and lymphocytes at the beginning of human
pregnancy. J Reprod Fertil 1975;42(3):431-8.
Fearon DT, Locksley RM. The instructive role of innate immunity in the
acquired immune response. Science 1996;272(5258):50-3.
Rossi M, Young JW. Human dendritic cells: potent antigen-presenting cells at
the crossroads of innate and adaptive immunity. J Immunol 2005;175(3):1373-81.
Banchereau J, Briere F, Caux C, Davoust J, Lebecque S, Liu YJ, et al.
Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol 2000;18:767-811.
Steinman RM. Some interfaces of dendritic cell biology. APMIS 2003;111(78):675-97.
Steinman RM, Cohn ZA. Identification of a novel cell type in peripheral
lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp
Med 1973;137(5):1142-62.
Steinman RM. Dendritic cells: understanding immunogenicity. Eur J Immunol
2007;37 Suppl 1:S53-60.
Schuler G, Steinman RM. Murine epidermal Langerhans cells mature into
potent immunostimulatory dendritic cells in vitro. J Exp Med 1985;161(3):526-46.
Mason DW, Pugh CW, Webb M. The rat mixed lymphocyte reaction: roles of a
dendritic cell in intestinal lymph and T-cell subsets defined by monoclonal
antibodies. Immunology 1981;44(1):75-87.
Van Voorhis WC, Hair LS, Steinman RM, Kaplan G. Human dendritic cells.
Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med
1982;155(4):1172-87.
Lutz MB, Schuler G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells:
which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol 2002;23(9):445-9.
Wright-Browne V, McClain KL, Talpaz M, Ordonez N, Estrov Z. Physiology
and pathophysiology of dendritic cells. Hum Pathol 1997;28(5):563-79.
Hart DN. Dendritic cells: unique leukocyte populations which control the
primary immune response. Blood 1997;90(9):3245-87.
Sallusto F, Lanzavecchia A. Mobilizing dendritic cells for tolerance, priming,
and chronic inflammation. J Exp Med 1999;189(4):611-4.
Sallusto F, Cella M, Danieli C, Lanzavecchia A. Dendritic cells use
macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules
in the major histocompatibility complex class II compartment: downregulation
by cytokines and bacterial products. J Exp Med 1995;182(2):389-400.
84
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
Engering A, Geijtenbeek TB, van Vliet SJ, Wijers M, van Liempt E, Demaurex
N, et al. The dendritic cell-specific adhesion receptor DC-SIGN internalizes
antigen for presentation to T cells. J Immunol 2002;168(5):2118-26.
Jiang W, Swiggard WJ, Heufler C, Peng M, Mirza A, Steinman RM, et al. The
receptor DEC-205 expressed by dendritic cells and thymic epithelial cells is
involved in antigen processing. Nature 1995;375(6527):151-5.
Geijtenbeek TB, Torensma R, van Vliet SJ, van Duijnhoven GC, Adema GJ,
van Kooyk Y, et al. Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific
ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell
2000;100(5):575-85.
Mommaas AM, Mulder AA, Out CJ, Girolomoni G, Koerten HK, Vermeer BJ, et
al. Distribution of HLA class II molecules in epidermal Langerhans cells in situ.
Eur J Immunol 1995;25(2):520-5.
Lee MG, Borkowski TA, Udey MC. Regulation of expression of B7 by murine
Langerhans cells: a direct relationship between B7 mRNA levels and the level
of surface expression of B7 by Langerhans cells. J Invest Dermatol
1993;101(6):883-6.
Inaba K, Turley S, Yamaide F, Iyoda T, Mahnke K, Inaba M, et al. Efficient
presentation of phagocytosed cellular fragments on the major
histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med
1998;188(11):2163-73.
Pamer E, Cresswell P. Mechanisms of MHC class I--restricted antigen
processing. Annu Rev Immunol 1998;16:323-58.
Inaba K, Pack M, Inaba M, Sakuta H, Isdell F, Steinman RM. High levels of a
major histocompatibility complex II-self peptide complex on dendritic cells from
the T cell areas of lymph nodes. J Exp Med 1997;186(5):665-72.
Cumberbatch M, Kimber I. Tumour necrosis factor-alpha is required for
accumulation of dendritic cells in draining lymph nodes and for optimal contact
sensitization. Immunology 1995;84(1):31-5.
Ignatius R, Marovich M, Mehlhop E, Villamide L, Mahnke K, Cox WI, et al.
Canarypox virus-induced maturation of dendritic cells is mediated by apoptotic
cell death and tumor necrosis factor alpha secretion. J Virol
2000;74(23):11329-38.
Hawiger D, Inaba K, Dorsett Y, Guo M, Mahnke K, Rivera M, et al. Dendritic
cells induce peripheral T cell unresponsiveness under steady state conditions
in vivo. J Exp Med 2001;194(6):769-79.
Randolph GJ. Dendritic cell migration to lymph nodes: cytokines, chemokines,
and lipid mediators. Semin Immunol 2001;13(5):267-74.
Caux C, Ait-Yahia S, Chemin K, de Bouteiller O, Dieu-Nosjean MC, Homey B,
et al. Dendritic cell biology and regulation of dendritic cell trafficking by
chemokines. Springer Semin Immunopathol 2000;22(4):345-69.
Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity.
Nature 1998;392(6673):245-52.
Inaba K, Metlay JP, Crowley MT, Steinman RM. Dendritic cells pulsed with
protein antigens in vitro can prime antigen-specific, MHC-restricted T cells in
situ. J Exp Med 1990;172(2):631-40.
Larsen CP, Ritchie SC, Hendrix R, Linsley PS, Hathcock KS, Hodes RJ, et al.
Regulation of immunostimulatory function and costimulatory molecule (B7-1
and B7-2) expression on murine dendritic cells. J Immunol
1994;152(11):5208-19.
85
100.
101.
102.
103.
104.
105.
106.
107.
108.
109.
110.
111.
112.
113.
114.
Inaba K, Witmer-Pack M, Inaba M, Hathcock KS, Sakuta H, Azuma M, et al.
The tissue distribution of the B7-2 costimulator in mice: abundant expression
on dendritic cells in situ and during maturation in vitro. J Exp Med
1994;180(5):1849-60.
Schulz O, Edwards AD, Schito M, Aliberti J, Manickasingham S, Sher A, et al.
CD40 triggering of heterodimeric IL-12 p70 production by dendritic cells in vivo
requires a microbial priming signal. Immunity 2000;13(4):453-62.
Fujii S, Shimizu K, Smith C, Bonifaz L, Steinman RM. Activation of natural
killer T cells by alpha-galactosylceramide rapidly induces the full maturation of
dendritic cells in vivo and thereby acts as an adjuvant for combined CD4 and
CD8 T cell immunity to a coadministered protein. J Exp Med 2003;198(2):267-79.
Inaba K, Young JW, Steinman RM. Direct activation of CD8+ cytotoxic T
lymphocytes by dendritic cells. J Exp Med 1987;166(1):182-94.
Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity: enhancing the
efficiency of antigen presentation. Mt Sinai J Med 2001;68(3):160-6.
Bonifaz L, Bonnyay D, Mahnke K, Rivera M, Nussenzweig MC, Steinman RM.
Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in
the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility
complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med
2002;196(12):1627-38.
Liu K, Iyoda T, Saternus M, Kimura Y, Inaba K, Steinman RM. Immune
tolerance after delivery of dying cells to dendritic cells in situ. J Exp Med
2002;196(8):1091-7.
Dhodapkar MV, Steinman RM. Antigen-bearing immature dendritic cells
induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood
2002;100(1):174-7.
Akbari O, Freeman GJ, Meyer EH, Greenfield EA, Chang TT, Sharpe AH, et
al. Antigen-specific regulatory T cells develop via the ICOS-ICOS-ligand
pathway and inhibit allergen-induced airway hyperreactivity. Nat Med
2002;8(9):1024-32.
Nagler-Anderson C. Man the barrier! Strategic defences in the intestinal
mucosa. Nat Rev Immunol 2001;1(1):59-67.
Akbari O, DeKruyff RH, Umetsu DT. Pulmonary dendritic cells producing IL-10
mediate tolerance induced by respiratory exposure to antigen. Nat Immunol
2001;2(8):725-31.
Constant SL, Brogdon JL, Piggott DA, Herrick CA, Visintin I, Ruddle NH, et al.
Resident lung antigen-presenting cells have the capacity to promote Th2 T cell
differentiation in situ. J Clin Invest 2002;110(10):1441-8.
Buelens C, Willems F, Delvaux A, Pierard G, Delville JP, Velu T, et al.
Interleukin-10 differentially regulates B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86)
expression on human peripheral blood dendritic cells. Eur J Immunol
1995;25(9):2668-72.
Liu L, Rich BE, Inobe J, Chen W, Weiner HL. Induction of Th2 cell
differentiation in the primary immune response: dendritic cells isolated from
adherent cell culture treated with IL-10 prime naive CD4+ T cells to secrete IL4. Int Immunol 1998;10(8):1017-26.
Steinbrink K, Wolfl M, Jonuleit H, Knop J, Enk AH. Induction of tolerance by
IL-10-treated dendritic cells. J Immunol 1997;159(10):4772-80.
86
115.
116.
117.
118.
119.
120.
121.
122.
123.
124.
125.
126.
127.
128.
129.
130.
131.
132.
Piemonti L, Monti P, Allavena P, Sironi M, Soldini L, Leone BE, et al.
Glucocorticoids affect human dendritic cell differentiation and maturation. J
Immunol 1999;162(11):6473-81.
Jonuleit H, Schmitt E, Schuler G, Knop J, Enk AH. Induction of interleukin 10producing, nonproliferating CD4(+) T cells with regulatory properties by
repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells. J Exp
Med 2000;192(9):1213-22.
Laskarin G, Kammerer U, Rukavina D, Thomson AW, Fernandez N, Blois SM.
Antigen-presenting cells and materno-fetal tolerance: an emerging role for
dendritic cells. Am J Reprod Immunol 2007;58(3):255-67.
Dietl J, Honig A, Kammerer U, Rieger L. Natural killer cells and dendritic cells
at the human feto-maternal interface: an effective cooperation? Placenta
2006;27(4-5):341-7.
Zitvogel L. Dendritic and natural killer cells cooperate in the control/switch of
innate immunity. J Exp Med 2002;195(3):F9-14.
Rieger L, Honig A, Sutterlin M, Kapp M, Dietl J, Ruck P, et al. Antigenpresenting cells in human endometrium during the menstrual cycle compared
to early pregnancy. J Soc Gynecol Investig 2004;11(7):488-93.
Askelund K, Liddell HS, Zanderigo AM, Fernando NS, Khong TY, Stone PR, et
al. CD83(+)dendritic cells in the decidua of women with recurrent miscarriage
and normal pregnancy. Placenta 2004;25(2-3):140-5.
Bhardwaj N, Young JW, Nisanian AJ, Baggers J, Steinman RM. Small
amounts of superantigen, when presented on dendritic cells, are sufficient to
initiate T cell responses. J Exp Med 1993;178(2):633-42.
Kammerer U, Kruse A, Barrientos G, Arck PC, Blois SM. Role of dendritic cells
in the regulation of maternal immune responses to the fetus during
mammalian gestation. Immunol Invest 2008;37(5):499-533.
Bell D, Young JW, Banchereau J. Dendritic cells. Adv Immunol 1999;72:255-324.
Enk AH, Jonuleit H, Saloga J, Knop J. Dendritic cells as mediators of tumorinduced tolerance in metastatic melanoma. Int J Cancer 1997;73(3):309-16.
Steinbrink K, Jonuleit H, Muller G, Schuler G, Knop J, Enk AH. Interleukin-10treated human dendritic cells induce a melanoma-antigen-specific anergy in
CD8(+) T cells resulting in a failure to lyse tumor cells. Blood 1999;93(5):1634-42.
Enk AH, Saloga J, Becker D, Mohamadzadeh M, Knop J. Induction of haptenspecific tolerance by interleukin 10 in vivo. J Exp Med 1994;179(4):1397-402.
Harizi H, Juzan M, Pitard V, Moreau JF, Gualde N. Cyclooxygenase-2-issued
prostaglandin e(2) enhances the production of endogenous IL-10, which
down-regulates dendritic cell functions. J Immunol 2002;168(5):2255-63.
Griffin MD, Kumar R. Effects of 1alpha,25(OH)2D3 and its analogs on
dendritic cell function. J Cell Biochem 2003;88(2):323-6.
Blois SM, Alba Soto CD, Tometten M, Klapp BF, Margni RA, Arck PC.
Lineage, maturity, and phenotype of uterine murine dendritic cells throughout
gestation indicate a protective role in maintaining pregnancy. Biol Reprod
2004;70(4):1018-23.
Sugimoto J, Schust DJ. Review: human endogenous retroviruses and the
placenta. Reprod Sci 2009;16(11):1023-33.
Rote NS, Chakrabarti S, Stetzer BP. The role of human endogenous
retroviruses in trophoblast differentiation and placental development. Placenta
2004;25(8-9):673-83.
87
133.
134.
135.
136.
137.
138.
139.
140.
141.
142.
143.
144.
145.
146.
147.
148.
149.
150.
Muir A, Lever A, Moffett A. Expression and functions of human endogenous
retroviruses in the placenta: an update. Placenta 2004;25 Suppl A:S16-25.
Romanish MT, Cohen CJ, Mager DL. Potential mechanisms of endogenous
retroviral-mediated genomic instability in human cancer. Semin Cancer Biol
2010;20(4):246-53.
Buscher K, Hahn S, Hofmann M, Trefzer U, Ozel M, Sterry W, et al.
Expression of the human endogenous retrovirus-K transmembrane envelope,
Rec and Np9 proteins in melanomas and melanoma cell lines. Melanoma Res
2006;16(3):223-34.
Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC, Baldwin J, et al. Initial
sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001;409(6822):860-921.
Lower R, Lower J, Kurth R. The viruses in all of us: characteristics and
biological significance of human endogenous retrovirus sequences. Proc Natl
Acad Sci U S A 1996;93(11):5177-84.
Boeke JD, Stoye JP. Retrotransposons, Endogenous Retroviruses, and the
Evolution of Retroelements. 1997.
Ono M. Molecular cloning and long terminal repeat sequences of human
endogenous retrovirus genes related to types A and B retrovirus genes. J Virol
1986;58(3):937-44.
Jurka J. Repbase update: a database and an electronic journal of repetitive
elements. Trends Genet 2000;16(9):418-20.
Bannert N, Kurth R. Retroelements and the human genome: new perspectives
on an old relation. Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101 Suppl 2:14572-9.
Sverdlov ED. Retroviruses and primate evolution. Bioessays 2000;22(2):161-71.
Vogt VM. Retroviral Virions and Genomes. 1997.
Kim TH, Jeon YJ, Yi JM, Kim DS, Huh JW, Hur CG, et al. The distribution and
expression of HERV families in the human genome. Mol Cells 2004;18(1):87-93.
Perron H, Garson JA, Bedin F, Beseme F, Paranhos-Baccala G, KomurianPradel F, et al. Molecular identification of a novel retrovirus repeatedly isolated
from patients with multiple sclerosis. The Collaborative Research Group on
Multiple Sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A 1997;94(14):7583-8.
Karlsson H, Bachmann S, Schroder J, McArthur J, Torrey EF, Yolken RH.
Retroviral RNA identified in the cerebrospinal fluids and brains of individuals
with schizophrenia. Proc Natl Acad Sci U S A 2001;98(8):4634-9.
Kim HS, Wadekar RV, Takenaka O, Winstanley C, Mitsunaga F, Kageyama T,
et al. SINE-R.C2 (a Homo sapiens specific retroposon) is homologous to
CDNA from postmortem brain in schizophrenia and to two loci in the
Xq21.3/Yp block linked to handedness and psychosis. Am J Med Genet
1999;88(5):560-6.
Patzke S, Lindeskog M, Munthe E, Aasheim HC. Characterization of a novel
human endogenous retrovirus, HERV-H/F, expressed in human leukemia cell
lines. Virology 2002;303(1):164-73.
Blond JL, Lavillette D, Cheynet V, Bouton O, Oriol G, Chapel-Fernandes S, et
al. An envelope glycoprotein of the human endogenous retrovirus HERV-W is
expressed in the human placenta and fuses cells expressing the type D
mammalian retrovirus receptor. J Virol 2000;74(7):3321-9.
Venables PJ, Brookes SM, Griffiths D, Weiss RA, Boyd MT. Abundance of an
endogenous retroviral envelope protein in placental trophoblasts suggests a
biological function. Virology 1995;211(2):589-92.
88
151.
152.
153.
154.
155.
156.
157.
158.
159.
160.
161.
162.
163.
164.
165.
166.
Blaise S, de Parseval N, Benit L, Heidmann T. Genomewide screening for
fusogenic human endogenous retrovirus envelopes identifies syncytin 2, a
gene conserved on primate evolution. Proc Natl Acad Sci U S A
2003;100(22):13013-8.
Frendo JL, Olivier D, Cheynet V, Blond JL, Bouton O, Vidaud M, et al. Direct
involvement of HERV-W Env glycoprotein in human trophoblast cell fusion and
differentiation. Mol Cell Biol 2003;23(10):3566-74.
Kammerer U, Germeyer A, Stengel S, Kapp M, Denner J. Human endogenous
retrovirus K (HERV-K) is expressed in villous and extravillous cytotrophoblast
cells of the human placenta. J Reprod Immunol 2011.
Turner G, Barbulescu M, Su M, Jensen-Seaman MI, Kidd KK, Lenz J.
Insertional polymorphisms of full-length endogenous retroviruses in humans.
Curr Biol 2001;11(19):1531-5.
Simpson GR, Patience C, Lower R, Tonjes RR, Moore HD, Weiss RA, et al.
Endogenous D-type (HERV-K) related sequences are packaged into retroviral
particles in the placenta and possess open reading frames for reverse
transcriptase. Virology 1996;222(2):451-6.
Büscher K. Expression und biologische Funktion von humanen endogenen
Retroviren (HERVs), insbesondere von HERV-K, 2006.
Mangeney M, Renard M, Schlecht-Louf G, Bouallaga I, Heidmann O, Letzelter
C, et al. Placental syncytins: Genetic disjunction between the fusogenic and
immunosuppressive activity of retroviral envelope proteins. Proc Natl Acad Sci
U S A 2007;104(51):20534-9.
Mangeney M, de Parseval N, Thomas G, Heidmann T. The full-length
envelope
of
an
HERV-H
human
endogenous
retrovirus
has
immunosuppressive properties. J Gen Virol 2001;82(Pt 10):2515-8.
de Parseval N, Casella J, Gressin L, Heidmann T. Characterization of the
three HERV-H proviruses with an open envelope reading frame encompassing
the immunosuppressive domain and evolutionary history in primates. Virology
2001;279(2):558-69.
Mangeney M, Heidmann T. Tumor cells expressing a retroviral envelope
escape immune rejection in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A
1998;95(25):14920-5.
Cianciolo GJ, Copeland TD, Oroszlan S, Snyderman R. Inhibition of
lymphocyte proliferation by a synthetic peptide homologous to retroviral
envelope proteins. Science 1985;230(4724):453-5.
Rolland A, Jouvin-Marche E, Viret C, Faure M, Perron H, Marche PN. The
envelope protein of a human endogenous retrovirus-W family activates innate
immunity through CD14/TLR4 and promotes Th1-like responses. J Immunol
2006;176(12):7636-44.
Abbas AK, Lichtmann, A., Pillai, S. . Cellular and molecular Immunology. 6 ed:
Saunders Elsevier 2010.
Schütt B. Grundwissen Immunologie. 2. ed: Spektrum, Akademischer Verlag,
2009.
Carswell EA, Old LJ, Kassel RL, Green S, Fiore N, Williamson B. An
endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. Proc Natl
Acad Sci U S A 1975;72(9):3666-70.
Beutler B, Greenwald D, Hulmes JD, Chang M, Pan YC, Mathison J, et al.
Identity of tumour necrosis factor and the macrophage-secreted factor
cachectin. Nature 1985;316(6028):552-4.
89
167.
168.
169.
170.
171.
172.
173.
174.
175.
176.
177.
178.
179.
180.
Ammon C, Meyer SP, Schwarzfischer L, Krause SW, Andreesen R, Kreutz M.
Comparative analysis of integrin expression on monocyte-derived
macrophages
and
monocyte-derived
dendritic
cells.
Immunology
2000;100(3):364-9.
Rieser C, Bock G, Klocker H, Bartsch G, Thurnher M. Prostaglandin E2 and
tumor necrosis factor alpha cooperate to activate human dendritic cells:
synergistic activation of interleukin 12 production. J Exp Med
1997;186(9):1603-8.
Sallusto F, Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by
cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage
colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor
necrosis factor alpha. J Exp Med 1994;179(4):1109-18.
Ferlazzo G, Tsang ML, Moretta L, Melioli G, Steinman RM, Munz C. Human
dendritic cells activate resting natural killer (NK) cells and are recognized via
the NKp30 receptor by activated NK cells. J Exp Med 2002;195(3):343-51.
Granucci F, Andrews DM, Degli-Esposti MA, Ricciardi-Castagnoli P. IL-2
mediates adjuvant effect of dendritic cells. Trends Immunol 2002;23(4):169-71.
Walz A, Peveri P, Aschauer H, Baggiolini M. Purification and amino acid
sequencing of NAF, a novel neutrophil-activating factor produced by
monocytes. Biochem Biophys Res Commun 1987;149(2):755-61.
Van Damme J, Van Beeumen J, Opdenakker G, Billiau A. A novel, NH2terminal sequence-characterized human monokine possessing neutrophil
chemotactic, skin-reactive, and granulocytosis-promoting activity. J Exp Med
1988;167(4):1364-76.
Gesser B, Lund M, Lohse N, Vestergaad C, Matsushima K, Sindet-Pedersen
S, et al. IL-8 induces T cell chemotaxis, suppresses IL-4, and up-regulates IL8 production by CD4+ T cells. J Leukoc Biol 1996;59(3):407-11.
Vissers JL, Hartgers FC, Lindhout E, Teunissen MB, Figdor CG, Adema GJ.
Quantitative analysis of chemokine expression by dendritic cell subsets in vitro
and in vivo. J Leukoc Biol 2001;69(5):785-93.
Bueno C, Almeida J, Alguero MC, Sanchez ML, Vaquero JM, Laso FJ, et al.
Flow cytometric analysis of cytokine production by normal human peripheral
blood dendritic cells and monocytes: comparative analysis of different stimuli,
secretion-blocking agents and incubation periods. Cytometry 2001;46(1):33-40.
Verhasselt V, Goldman M, Willems F. Oxidative stress up-regulates IL-8 and
TNF-alpha synthesis by human dendritic cells. Eur J Immunol
1998;28(11):3886-90.
Nishimoto N, Kishimoto T. Interleukin 6: from bench to bedside. Nat Clin Pract
Rheumatol 2006;2(11):619-26.
Assenmacher M, Lohning M, Scheffold A, Richter A, Miltenyi S, Schmitz J, et
al. Commitment of individual Th1-like lymphocytes to expression of IFNgamma versus IL-4 and IL-10: selective induction of IL-10 by sequential
stimulation of naive Th cells with IL-12 and IL-4. J Immunol 1998;161(6):2825-32.
de Waal Malefyt R, Haanen J, Spits H, Roncarolo MG, te Velde A, Figdor C, et
al. Interleukin 10 (IL-10) and viral IL-10 strongly reduce antigen-specific
human T cell proliferation by diminishing the antigen-presenting capacity of
monocytes via downregulation of class II major histocompatibility complex
expression. J Exp Med 1991;174(4):915-24.
90
181.
182.
183.
184.
185.
186.
187.
188.
189.
190.
191.
192.
193.
194.
195.
196.
197.
198.
Hsu DH, Moore KW, Spits H. Differential effects of IL-4 and IL-10 on IL-2induced IFN-gamma synthesis and lymphokine-activated killer activity. Int
Immunol 1992;4(5):563-9.
Groux H, Bigler M, de Vries JE, Roncarolo MG. Interleukin-10 induces a longterm antigen-specific anergic state in human CD4+ T cells. J Exp Med
1996;184(1):19-29.
Jonuleit H, Knop J, Enk AH. Cytokines and their effects on maturation,
differentiation and migration of dendritic cells. Arch Dermatol Res
1996;289(1):1-8.
Bogdan C, Vodovotz Y, Nathan C. Macrophage deactivation by interleukin 10.
J Exp Med 1991;174(6):1549-55.
Buelens C, Verhasselt V, De Groote D, Thielemans K, Goldman M, Willems F.
Human dendritic cell responses to lipopolysaccharide and CD40 ligation are
differentially regulated by interleukin-10. Eur J Immunol 1997;27(8):1848-52.
Kuhn R, Lohler J, Rennick D, Rajewsky K, Muller W. Interleukin-10-deficient
mice develop chronic enterocolitis. Cell 1993;75(2):263-74.
Vieira P, de Waal-Malefyt R, Dang MN, Johnson KE, Kastelein R, Fiorentino
DF, et al. Isolation and expression of human cytokine synthesis inhibitory
factor cDNA clones: homology to Epstein-Barr virus open reading frame
BCRFI. Proc Natl Acad Sci U S A 1991;88(4):1172-6.
Moore KW, de Waal Malefyt R, Coffman RL, O'Garra A. Interleukin-10 and the
interleukin-10 receptor. Annu Rev Immunol 2001;19:683-765.
Roth I, Corry DB, Locksley RM, Abrams JS, Litton MJ, Fisher SJ. Human
placental cytotrophoblasts produce the immunosuppressive cytokine
interleukin 10. J Exp Med 1996;184(2):539-48.
Corinti S, Albanesi C, la Sala A, Pastore S, Girolomoni G. Regulatory activity
of autocrine IL-10 on dendritic cell functions. J Immunol 2001;166(7):4312-8.
De Smedt T, Van Mechelen M, De Becker G, Urbain J, Leo O, Moser M. Effect
of interleukin-10 on dendritic cell maturation and function. Eur J Immunol
1997;27(5):1229-35.
Fiorentino DF, Zlotnik A, Vieira P, Mosmann TR, Howard M, Moore KW, et al.
IL-10 acts on the antigen-presenting cell to inhibit cytokine production by Th1
cells. J Immunol 1991;146(10):3444-51.
Groux H, Bigler M, de Vries JE, Roncarolo MG. Inhibitory and stimulatory
effects of IL-10 on human CD8+ T cells. J Immunol 1998;160(7):3188-93.
Groux H, Fournier N, Cottrez F. Role of dendritic cells in the generation of
regulatory T cells. Semin Immunol 2004;16(2):99-106.
Piccirillo CA, Shevach EM. Cutting edge: control of CD8+ T cell activation by
CD4+CD25+ immunoregulatory cells. J Immunol 2001;167(3):1137-40.
Blois SM, Kammerer U, Alba Soto C, Tometten MC, Shaikly V, Barrientos G,
et al. Dendritic cells: key to fetal tolerance? Biol Reprod 2007;77(4):590-8.
Palmer EM, van Seventer GA. Human T helper cell differentiation is regulated
by the combined action of cytokines and accessory cell-dependent
costimulatory signals. J Immunol 1997;158(6):2654-62.
Del Prete GF, De Carli M, Mastromauro C, Biagiotti R, Macchia D, Falagiani P,
et al. Purified protein derivative of Mycobacterium tuberculosis and excretorysecretory antigen(s) of Toxocara canis expand in vitro human T cells with
stable and opposite (type 1 T helper or type 2 T helper) profile of cytokine
production. J Clin Invest 1991;88(1):346-50.
91
199.
200.
201.
202.
203.
204.
205.
206.
207.
208.
209.
210.
211.
212.
213.
214.
215.
216.
Mosmann TR, Cherwinski H, Bond MW, Giedlin MA, Coffman RL. Two types
of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine
activities and secreted proteins. 1986. J Immunol 2005;175(1):5-14.
Saito S. Cytokine cross-talk between mother and the embryo/placenta. J
Reprod Immunol 2001;52(1-2):15-33.
Romani N, Gruner S, Brang D, Kampgen E, Lenz A, Trockenbacher B, et al.
Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med
1994;180(1):83-93.
Romani N, Reider D, Heuer M, Ebner S, Kampgen E, Eibl B, et al. Generation
of mature dendritic cells from human blood. An improved method with special
regard to clinical applicability. J Immunol Methods 1996;196(2):137-51.
Huck B, Steck T, Habersack M, Dietl J, Kammerer U. Pregnancy associated
hormones modulate the cytokine production but not the phenotype of PBMCderived human dendritic cells. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol
2005;122(1):85-94.
Buscher K, Trefzer U, Hofmann M, Sterry W, Kurth R, Denner J. Expression of
human endogenous retrovirus K in melanomas and melanoma cell lines.
Cancer Res 2005;65(10):4172-80.
Blois SM, Barrientos G, Garcia MG, Orsal AS, Tometten M, Cordo-Russo RI,
et al. Interaction between dendritic cells and natural killer cells during
pregnancy in mice. J Mol Med (Berl) 2008;86(7):837-52.
Denner J. Immunosuppression by retroviruses: implications for
xenotransplantation. Ann N Y Acad Sci 1998;862:75-86.
Stoye JP, Coffin JM. A provirus put to work. Nature 2000;403(6771):715, 17.
Johnson PM, Lyden TW, Mwenda JM. Endogenous retroviral expression in
the human placenta. Am J Reprod Immunol 1990;23(4):115-20.
Ponferrada VG, Mauck BS, Wooley DP. The envelope glycoprotein of human
endogenous retrovirus HERV-W induces cellular resistance to spleen necrosis
virus. Arch Virol 2003;148(4):659-75.
Best S, Le Tissier PR, Stoye JP. Endogenous retroviruses and the evolution of
resistance to retroviral infection. Trends Microbiol 1997;5(8):313-8.
Harris JR. Placental endogenous retrovirus (ERV): structural, functional, and
evolutionary significance. Bioessays 1998;20(4):307-16.
Harris DT, Cianciolo GJ, Snyderman R, Argov S, Koren HS. Inhibition of
human natural killer cell activity by a synthetic peptide homologous to a
conserved region in the retroviral protein, p15E. J Immunol 1987;138(3):88994.
Ruegg CL, Monell CR, Strand M. Inhibition of lymphoproliferation by a
synthetic peptide with sequence identity to gp41 of human immunodeficiency
virus type 1. J Virol 1989;63(8):3257-60.
Mehrotra S, Mishra KP, Yadav VS, Bhattacharya M, Pandey D, Haq W, et al.
Immunomodulation by peptide analogs of retroviral envelope protein. Peptides
2003;24(7):979-85.
Benit L, Dessen P, Heidmann T. Identification, phylogeny, and evolution of
retroviral elements based on their envelope genes. J Virol 2001;75(23):11709-19.
Kleinerman ES, Lachman LB, Knowles RD, Snyderman R, Cianciolo GJ. A
synthetic peptide homologous to the envelope proteins of retroviruses inhibits
monocyte-mediated killing by inactivating interleukin 1. J Immunol
1987;139(7):2329-37.
92
217.
218.
219.
220.
221.
222.
223.
224.
225.
226.
227.
228.
229.
230.
231.
232.
Haraguchi S, Good RA, Cianciolo GJ, Day NK. A synthetic peptide
homologous to retroviral envelope protein down-regulates TNF-alpha and IFNgamma mRNA expression. J Leukoc Biol 1992;52(4):469-72.
Haraguchi S, Good RA, James-Yarish M, Cianciolo GJ, Day NK. Differential
modulation of Th1- and Th2-related cytokine mRNA expression by a synthetic
peptide homologous to a conserved domain within retroviral envelope protein.
Proc Natl Acad Sci U S A 1995;92(8):3611-5.
Haraguchi S, Liu WT, Cianciolo GJ, Good RA, Day NK. Suppression of human
interferon-gamma production by a 17 amino acid peptide homologous to the
transmembrane envelope protein of retroviruses: evidence for a primary role
played by monocytes. Cell Immunol 1992;141(2):388-97.
Blaise S, Mangeney M, Heidmann T. The envelope of Mason-Pfizer monkey
virus has immunosuppressive properties. J Gen Virol 2001;82(Pt 7):1597-600.
Ruebner M, Strissel PL, Langbein M, Fahlbusch F, Wachter DL,
Faschingbauer F, et al. Impaired cell fusion and differentiation in placentae
from patients with intrauterine growth restriction correlate with reduced levels
of HERV envelope genes. J Mol Med 2010;88(11):1143-56.
Lee JH, Torisu-Itakara H, Cochran AJ, Kadison A, Huynh Y, Morton DL, et al.
Quantitative
analysis
of
melanoma-induced
cytokine-mediated
immunosuppression in melanoma sentinel nodes. Clin Cancer Res
2005;11(1):107-12.
Contreras-Galindo R, Kaplan MH, Leissner P, Verjat T, Ferlenghi I, Bagnoli F,
et al. Human endogenous retrovirus K (HML-2) elements in the plasma of
people with lymphoma and breast cancer. J Virol 2008;82(19):9329-36.
Ferretti C, Bruni L, Dangles-Marie V, Pecking AP, Bellet D. Molecular circuits
shared by placental and cancer cells, and their implications in the proliferative,
invasive and migratory capacities of trophoblasts. Hum Reprod Update
2007;13(2):121-41.
Soundararajan R, Rao AJ. Trophoblast 'pseudo-tumorigenesis': significance
and contributory factors. Reprod Biol Endocrinol 2004;2:15.
Wang-Johanning F, Radvanyi L, Rycaj K, Plummer JB, Yan P, Sastry KJ, et
al. Human endogenous retrovirus K triggers an antigen-specific immune
response in breast cancer patients. Cancer Res 2008;68(14):5869-77.
Dunlap KA, Palmarini M, Varela M, Burghardt RC, Hayashi K, Farmer JL, et al.
Endogenous retroviruses regulate periimplantation placental growth and
differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103(39):14390-5.
Laird SM, Tuckerman EM, Li TC. Cytokine expression in the endometrium of
women with implantation failure and recurrent miscarriage. Reprod Biomed
Online 2006;13(1):13-23.
Jasper MJ, Tremellen KP, Robertson SA. Reduced expression of IL-6 and IL1alpha mRNAs in secretory phase endometrium of women with recurrent
miscarriage. J Reprod Immunol 2007;73(1):74-84.
Trowsdale J, Betz AG. Mother's little helpers: mechanisms of maternal-fetal
tolerance. Nat Immunol 2006;7(3):241-6.
Dimitriadis E, White CA, Jones RL, Salamonsen LA. Cytokines, chemokines
and growth factors in endometrium related to implantation. Hum Reprod
Update 2005;11(6):613-30.
Fest S, Aldo PB, Abrahams VM, Visintin I, Alvero A, Chen R, et al.
Trophoblast-macrophage interactions: a regulatory network for the protection
of pregnancy. Am J Reprod Immunol 2007;57(1):55-66.
93
233.
234.
235.
236.
237.
238.
239.
240.
241.
242.
243.
244.
245.
246.
247.
248.
Wira CR, Grant-Tschudy KS, Crane-Godreau MA. Epithelial cells in the female
reproductive tract: a central role as sentinels of immune protection. Am J
Reprod Immunol 2005;53(2):65-76.
Tremellen KP, Seamark RF, Robertson SA. Seminal transforming growth
factor beta1 stimulates granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
production and inflammatory cell recruitment in the murine uterus. Biol Reprod
1998;58(5):1217-25.
Bischof P, Meisser A, Campana A. Paracrine and autocrine regulators of
trophoblast invasion--a review. Placenta 2000;21 Suppl A:S55-60.
Berkowitz RS, Hill JA, Kurtz CB, Anderson DJ. Effects of products of activated
leukocytes (lymphokines and monokines) on the growth of malignant
trophoblast cells in vitro. Am J Obstet Gynecol 1988;158(1):199-203.
Yui J, Garcia-Lloret M, Wegmann TG, Guilbert LJ. Cytotoxicity of tumour
necrosis factor-alpha and gamma-interferon against primary human placental
trophoblasts. Placenta 1994;15(8):819-35.
Todt JC, Yang Y, Lei J, Lauria MR, Sorokin Y, Cotton DB, et al. Effects of
tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility.
Am J Reprod Immunol 1996;36(2):65-71.
Haddad EK, Duclos AJ, Lapp WS, Baines MG. Early embryo loss is
associated with the prior expression of macrophage activation markers in the
decidua. J Immunol 1997;158(10):4886-92.
Tangri S, Raghupathy R. Expression of cytokines in placentas of mice
undergoing immunologically mediated spontaneous fetal resorptions. Biol
Reprod 1993;49(4):850-6.
Chaouat G, Menu E, Clark DA, Dy M, Minkowski M, Wegmann TG. Control of
fetal survival in CBA x DBA/2 mice by lymphokine therapy. J Reprod Fertil
1990;89(2):447-58.
Gorivodsky M, Zemlyak I, Orenstein H, Savion S, Fein A, Torchinsky A, et al.
TNF-alpha messenger RNA and protein expression in the uteroplacental unit
of mice with pregnancy loss. J Immunol 1998;160(9):4280-8.
Kruse C, Varming K, Christiansen OB. Prospective, serial investigations of invitro lymphocyte cytokine production, CD62L expression and proliferative
response to microbial antigens in women with recurrent miscarriage. Hum
Reprod 2003;18(11):2465-72.
Raghupathy R, Makhseed M, Azizieh F, Omu A, Gupta M, Farhat R. Cytokine
production by maternal lymphocytes during normal human pregnancy and in
unexplained recurrent spontaneous abortion. Hum Reprod 2000;15(3):713-8.
Hennessy A, Pilmore HL, Simmons LA, Painter DM. A deficiency of placental
IL-10 in preeclampsia. J Immunol 1999;163(6):3491-5.
Lockwood CJ, Matta P, Krikun G, Koopman LA, Masch R, Toti P, et al.
Regulation of monocyte chemoattractant protein-1 expression by tumor
necrosis factor-alpha and interleukin-1beta in first trimester human decidual
cells: implications for preeclampsia. Am J Pathol 2006;168(2):445-52.
Lea RG, Riley SC, Antipatis C, Hannah L, Ashworth CJ, Clark DA, et al.
Cytokines and the regulation of apoptosis in reproductive tissues: a review.
Am J Reprod Immunol 1999;42(2):100-9.
Krishnan L, Guilbert LJ, Wegmann TG, Belosevic M, Mosmann TR. T helper 1
response against Leishmania major in pregnant C57BL/6 mice increases
implantation failure and fetal resorptions. Correlation with increased IFN-
94
249.
250.
251.
252.
253.
254.
255.
256.
257.
258.
259.
260.
261.
262.
263.
264.
gamma and TNF and reduced IL-10 production by placental cells. J Immunol
1996;156(2):653-62.
Murphy SP, Fast LD, Hanna NN, Sharma S. Uterine NK cells mediate
inflammation-induced fetal demise in IL-10-null mice. J Immunol
2005;175(6):4084-90.
Robertson SA, Care AS, Skinner RJ. Interleukin 10 regulates inflammatory
cytokine synthesis to protect against lipopolysaccharide-induced abortion and
fetal growth restriction in mice. Biol Reprod 2007;76(5):738-48.
Meisser A, Chardonnens D, Campana A, Bischof P. Effects of tumour necrosis
factor-alpha, interleukin-1 alpha, macrophage colony stimulating factor and
transforming growth factor beta on trophoblastic matrix metalloproteinases.
Mol Hum Reprod 1999;5(3):252-60.
Karmakar S, Das C. Regulation of trophoblast invasion by IL-1beta and TGFbeta1. Am J Reprod Immunol 2002;48(4):210-9.
Polan ML, Simon C, Frances A, Lee BY, Prichard LE. Role of embryonic
factors in human implantation. Hum Reprod 1995;10 Suppl 2:22-9.
Simon C, Frances A, Piquette GN, el Danasouri I, Zurawski G, Dang W, et al.
Embryonic implantation in mice is blocked by interleukin-1 receptor antagonist.
Endocrinology 1994;134(2):521-8.
Huppertz B, Peeters LL. Vascular biology in implantation and placentation.
Angiogenesis 2005;8(2):157-67.
Segerer S, Kammerer U, Kapp M, Dietl J, Rieger L. Upregulation of
chemokine and cytokine production during pregnancy. Gynecol Obstet Invest
2009;67(3):145-50.
Jones RL, Hannan NJ, Kaitu'u TJ, Zhang J, Salamonsen LA. Identification of
chemokines important for leukocyte recruitment to the human endometrium at
the times of embryo implantation and menstruation. J Clin Endocrinol Metab
2004;89(12):6155-67.
Koch AE, Polverini PJ, Kunkel SL, Harlow LA, DiPietro LA, Elner VM, et al.
Interleukin-8 as a macrophage-derived mediator of angiogenesis. Science
1992;258(5089):1798-801.
Zenclussen AC, Blois S, Stumpo R, Olmos S, Arias K, Malan Borel I, et al.
Murine abortion is associated with enhanced interleukin-6 levels at the fetomaternal interface. Cytokine 2003;24(4):150-60.
Zenclussen AC, Kortebani G, Mazzolli A, Margni R, Malan Borel I. Interleukin6 and soluble interleukin-6 receptor serum levels in recurrent spontaneous
abortion women immunized with paternal white cells. Am J Reprod Immunol
2000;44(1):22-9.
Arruvito L, Billordo A, Capucchio M, Prada ME, Fainboim L. IL-6 transsignaling and the frequency of CD4+FOXP3+ cells in women with reproductive
failure. J Reprod Immunol 2009;82(2):158-65.
Diehl S, Rincon M. The two faces of IL-6 on Th1/Th2 differentiation. Mol
Immunol 2002;39(9):531-6.
Augustyniak D, Majkowska-Skrobek G, Basiewicz-Worsztynowicz B,
Jankowski A. [The role of IL-6/sIL-6R complex and its natural inhibitor sgp130
in modulation of inflammatory process]. Postepy Biochem 2006;52(2):194-203.
Jones SA. Directing transition from innate to acquired immunity: defining a role
for IL-6. J Immunol 2005;175(6):3463-8.
95
265.
266.
267.
268.
269.
270.
271.
272.
273.
274.
275.
276.
277.
278.
279.
280.
Dubinsky V, Junovich G, Gentile T, Gutierrez G. IL-6 as a regulatory factor of
the humoral response during pregnancy. Am J Reprod Immunol
2008;60(3):197-203.
Meisser A, Cameo P, Islami D, Campana A, Bischof P. Effects of interleukin-6
(IL-6) on cytotrophoblastic cells. Mol Hum Reprod 1999;5(11):1055-8.
Zoumakis E, Margioris AN, Stournaras C, Dermitzaki E, Angelakis E,
Makrigiannakis A, et al. Corticotrophin-releasing hormone (CRH) interacts with
inflammatory prostaglandins and interleukins and affects the decidualization of
human endometrial stroma. Mol Hum Reprod 2000;6(4):344-51.
Nishino E, Matsuzaki N, Masuhiro K, Kameda T, Taniguchi T, Takagi T, et al.
Trophoblast-derived interleukin-6 (IL-6) regulates human chorionic
gonadotropin release through IL-6 receptor on human trophoblasts. J Clin
Endocrinol Metab 1990;71(2):436-41.
Chaouat G, Assal Meliani A, Martal J, Raghupathy R, Elliott JF, Mosmann T,
et al. IL-10 prevents naturally occurring fetal loss in the CBA x DBA/2 mating
combination, and local defect in IL-10 production in this abortion-prone
combination is corrected by in vivo injection of IFN-tau. J Immunol
1995;154(9):4261-8.
Svensson L, Arvola M, Sallstrom MA, Holmdahl R, Mattsson R. The Th2
cytokines IL-4 and IL-10 are not crucial for the completion of allogeneic
pregnancy in mice. J Reprod Immunol 2001;51(1):3-7.
Fallon PG, Jolin HE, Smith P, Emson CL, Townsend MJ, Fallon R, et al. IL-4
induces characteristic Th2 responses even in the combined absence of IL-5,
IL-9, and IL-13. Immunity 2002;17(1):7-17.
Rivera DL, Olister SM, Liu X, Thompson JH, Zhang XJ, Pennline K, et al.
Interleukin-10 attenuates experimental fetal growth restriction and demise.
FASEB J 1998;12(2):189-97.
Roth I, Fisher SJ. IL-10 is an autocrine inhibitor of human placental
cytotrophoblast MMP-9 production and invasion. Dev Biol 1999;205(1):194-204.
White CA, Johansson M, Roberts CT, Ramsay AJ, Robertson SA. Effect of
interleukin-10 null mutation on maternal immune response and reproductive
outcome in mice. Biol Reprod 2004;70(1):123-31.
Zenclussen AC, Gerlof K, Zenclussen ML, Sollwedel A, Bertoja AZ, Ritter T, et
al. Abnormal T-cell reactivity against paternal antigens in spontaneous
abortion: adoptive transfer of pregnancy-induced CD4+CD25+ T regulatory
cells prevents fetal rejection in a murine abortion model. Am J Pathol
2005;166(3):811-22.
Schumacher A, Wafula PO, Bertoja AZ, Sollwedel A, Thuere C, Wollenberg I,
et al. Mechanisms of action of regulatory T cells specific for paternal antigens
during pregnancy. Obstet Gynecol 2007;110(5):1137-45.
Kingsley CI, Karim M, Bushell AR, Wood KJ. CD25+CD4+ regulatory T cells
prevent graft rejection: CTLA-4- and IL-10-dependent immunoregulation of
alloresponses. J Immunol 2002;168(3):1080-6.
Wakkach A, Fournier N, Brun V, Breittmayer JP, Cottrez F, Groux H.
Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell
differentiation in vivo. Immunity 2003;18(5):605-17.
Billingham RE, Brent L, Medawar PB. 'Actively acquired tolerance' of foreign
cells. 1953. J Immunol 2010;184(1):5-8.
Moffett A, Loke C. Immunology of placentation in eutherian mammals. Nat
Rev Immunol 2006;6(8):584-94.
96
97
Danksagung
Mein größter Dank gebührt Frau Prof. Dr. Ulrike Kämmerer für die Überlassung des
spannenden Themas und die Unterstützung bei der Durchführung dieser Arbeit. Ich
danke ihr für die stete Ansprechbarkeit, die konstruktive Kritik, sowie die vielfältige
Hilfestellung bei allen praktischen und theoretischen Fragen.
Herrn Prof. Dr. M. Eyrich danke ich für die Übernahme des Koreferats.
Frau Michaela Kapp danke ich für ihre Hilfsbereitschaft und Unterstützung in allen
praktischen Belangen und die rasche Hilfe bei Fragen und Problemen.
Meiner Familie und meinen Freunden danke ich für die große moralische und
liebevolle Unterstützung. Meinen Eltern danke ich zudem, dass sie mir die Freiheit
geben, meinen Weg zu gehen.
Curriculum vitae
Zur Person
Maria Elisabeth Forstner
geboren am 07. August 1983 in Landshut
Berufliche Tätigkeit
Seit 01/2012
Assistenzärztin in der Kinderklinik und Kinderpoliklinik im
Dr. von Haunerschen Kinderspital
Ausbildung
12/2010
Approbation
04/2004-11/2010
Studium der Humanmedizin an der Julius-MaximiliansUniversität Würzburg
11/2010
2. Abschnitt der ärztlichen Prüfung
03/2006
1. Abschnitt der ärztlichen Prüfung
09/1994-06/2003
Gymnasium Seligenthal Landshut
Allgemeine Hochschulreife
Stipendien
Seit 10/2006
Mitglied des Bayerischen Elitenetzwerks
10/2006-03/2011
Studienförderung durch das Max Weber-Programm der
Studienstiftung des Deutschen Volkes
E-fellows.net, Begabtenförderung
10/2004-03/2007
Förderung nach dem Bayerischen
Begabtenförderungsgesetz
Würzburg, 14.07.2013